Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание и исследование свойств новых генетических систем на основе элементов лактозного оперона Escherichia coli
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Создание и исследование свойств новых генетических систем на основе элементов лактозного оперона Escherichia coli"
/ IIa правах рукописи
Л
Скороходова Александра Юрьевна
Создание и исследование свойств новых генетических систем на основе элементов лактозного оперона Escherichia coli
03 00 03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биолшических наук
Москва, 2005г
Работа выношена в лаборатории №4 Закрытою Акционерного общества «Научно-исследовательского института Аджиномото-Гснетика» (ЗАО «АГРИ»)
Научный руководитель:
доктор биоло! ических на>к, профессор С.В.Машко Научный консультант:
кандида! биолот ических наук И.В.Бирюкова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Р.С.Шакулов
доктор биоло! ических наук, профессор С.Л.Киселёв
Ведущая организация:
Институт молекулярной 1снетики РАН
Защита диссер 1 ации сосюится марта 2005 года в '^"часов на заседании
Диссертационного совета Д217 013 01 при ФГУП «Государственный научно-исс гедовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» но адресу 117545, г Москва, 1 -й Дорожный проезд, д 1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «1 осударственный научно-исслсдоватетьский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов)
Автореферат разослан <М> февраля 2005 \.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук
TWo
мое- Y
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Лактозный опсрои Е coli один из первых и любимых объектов современной молекулярной биологии и генетики Именно на примере изучения этой генетической структуры были установлены и впервые сформулированы основные принципы генетической регуляции транскрипции прокариот, наполнены молекулярным содержанием понятия грочотор, оператор, репрессор, оперли Не удивительно, что с момен1а начала генпо-инженерпых экспериментов по обеспечению эффективной экспрессии гомо- и гетеролог ичных генов в клетках Е coli для регулируемой транскрипции целевых цистропов широко исполмуются элементы лактозного оперона Несмотря на то, что в пракгике современных исследований по молекулярной биологии, биотехнологии, генной и метаболической инженерии для этих же целей используется достаточно большое число прокариотических промоторов с известными механизмами регуляции инициации транскрипции применение элементов лактозного оперона Е coli не потеряло своей актуальности и практической значимости Действительно, по эффективности репрессии и по специфичное!и индукции система лактозного оперона превосходит подавляющее большинство других прокариотических систем регуляции транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой Ecoh
Однако, специфические особенности регуляции транскрипции лактозного оперона дикого типа и его наиболее часто используемого мутантно1 о (UV5) варианта приводят к двум принципиальным недостаткам при практическом применении элеменюв системы для транскрипции целевых генов Уровень инициации транскрипции в условиях максимальной дерепрессии оказывается недостаточно высок по сравнению с использованием других прокариотических промоторов, и, в то же время, лактозный промотор полностью дерепрессируется уже при относительно невысоких концентрациях индуктора в среде, что в совокупности не позволяет проводить исследования влияния различной эффективности транскрипции находящихся под котпрочем лактозного промотора генов в широком диапозоне. варьируя концентрацию индукшра в средс Фактически, система лактозною оперона может быть использована для регулируемой транскрипции генов в тригерном режиме (репрессия/'дерепрессия;, и при этом максимальный уровень транскрипции относительно невысок Если в эпоху создания «ппазмидных» цпаммов-нродуцеитов биологически активных веществ последний недостаток (относительно слабая транскритщия) лактозного промотора мог быть легко компенсирован за счет использов<шия мульти-копийной рскомбинан i ной плазмиды его содержащей, то в случае создания безтшазмидных штаммов-продуцен i ов нового поколения, в которых усиление экспрессии одной копии целевот о гена, локализованного в составе бактериальной хромосомы, осуществляется заменой его промотора - ('слабость» лактозного (UV5) промотора становится весьма серьезным недостатком его практического использования
Таким образом, значительное увеличение «силы» лактозного промотора с одновременным сохранением эффективности его регуляции, а также обеспечение плавной регуляции силы промотора в широком диапазоне концентраций добавляемого индуктора, безусловно, являются актуальными направлениями современного этапа исследований этой генетической системы, а создаваемые при этом новые элементы могут пайти достаточно широкое практическое применение.
Цель и задачи работы.
Диссертационная рабсна посвяшена конструированию и исследованию свойств новых строго регулируемых генетических систем на основе хорошо извесшьгх регуляторных элементов лактеиною оперона и структурной части гена /аорепрессора Е coli, позволяющих оптимизировать экспрессию целевых генов
В процессе работы решались следующие задачи
• создание авторегулирусмой и строю репрессируемой системы, способной к плавному изменению экспрессии в зависимости от концентрации добавленною в среду индуктора;
• создание модифицированных вариантов 0/„с-содержащих промоторов, способных, при сохранении строгой регуляции, обеспечивать более л})фективную транскрипцию в условиях полной индукпии
Научная новизна и практическая значимость.
В ходе работы создан новый искусственный генетический элемент QzlVtacL\slOiac^lacl, на основе промоторно-операторной области мутантного (UV5) лактозного оперона Е coli, Oj-TVnWCW, и сгруктурной части гена latí с модифицированным участком связывания рибосом, способный осуществлять плавную регуляцию экспрессии целевых 1енов, находящихся под контролем 0;„с-содержащих промоторов и расположенных как in ач. так и in trans.
Высокий уровень репрессии нового элемента, в отсутствии индуктора, позволил с его помощью осуществить клонирование и исследовав экспрессию структурных областей некоторых генов и оперонов, которые ранее, из-за токсичности их белковых продуктов не удавалось клонировать в других 0;и1:-содержащих векторных системах.
С использованием нового генетического элемента, Епервые сконструирован вариант вектора RSF1010, обладающий регулируемой (добавлением ИП'ГГ) копийностью, не содержащий каких-либо участков ответственных за мобилизацию, а также не имеющий в своем составе генов устойчивости к антибиотикам.
Созданы и охарактеризованы новые эффективно ре/улируемые 0/ос-содержащие гибридные промоторы Pn-e-ideai 2> P»r-ideai-3 и P/rc-ideai-4, превосходящие в 4 раза по «силе» P/oíUVs и, в отличие от предшественников (Р/гс и P/rc.,de«i). не уступающие ему по уровню репрессии
Апробация paooibi.
Диссертационная работа была апробирована на семинаре ЗЛО «АГРИ» в июле 2004 г и на семинаре Секции Ученого Совета «Молекулярная Биология» ФГУП ГосНИИгснетика в декабре 2004 г Материалы диссертации были представлены на «The 2001 Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting» (University of Wisconsin-Madison, USA, 31 075 08 2001), на конференции, посвященной 50-летию кафедры «Дозиметрия и защита» Mockobckoi о Инженерно-физического Института (Москва, январь, 2002 г), на «The Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting» (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 20-25 08 2002), на «Conference for young scientists on molecular biology and genetics, dedicated to the 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine» (Ukraine, Kiev, 25-27 09 03), на Всероссийском симпозиуме «Биотехнология Микробов», посвященный 120-летию со дня рождения академика В II Шапошникова (Моеква, МГУ 21-24 10 04)
С i руктура и объем работы.
Диссертация сосюит из 6 разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы« Работа изложена на страницах, включая рисунков и 3 таблиц Список цитируемой литературы содержиU65 источников, в юм числе на русском языке
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
1. Создание и исследование свойств авто- и плавно регулируемого генетического элемента OilP¡aM iIOlílc->lacl.
IIa первом этапе работы было осуществлено конструирование и исследование свойств новой искусственной генетической плавно регулируемой системы -Оз/PiacvWOiac-^lacL основанной на хорошо известных регуляторных элементах Ldc-оперона и структурной части гена Lac-peiipeccopa Е coli
1.1. Молекулярное клонирование регуляторного элемента ,ас и
структурной части гена lacl E.coli с высокоэффективным участком связывания рибосом.
Первым элементом, для создания новой системы, являлась мутантная (UV5) промоторно-операторная область тактозио! о оперона - Оз/Рйсцу5/Ойс, которая репрессируется Lacl с высокой эффективностью, однако для максимальной дерепрсссии не требует образования специфического комплекса с CRP-cAMP для активации РНК полимеразы, находящейся на промоторе В качестве донора этого peí уляторного элемента была использована полученная и описанная ранее рскомбинантная плазмида pML-MCS-PlacUVS, б которой Оз^Р/ad была фланкирована сайтами расщеппения
рестриктазами Kpní, Bgñl и Xbai (Рис 1)
Вторым элементом, использованным в данной работе, являлся фрагмент структурной части гена lad Е coli Известно, что в составе хромосомы бактерий дикою типа этот ген транскрибируется с относительно слабого конститутивного промотора и lad мРНК имеет относительно «слабый» участок связывания рибосом (RBS) ОТО (а не наиболее эффективный ATG) в качестве инициирующею кидона и несколько отличающуюся от канонической SD-последовательность - AGGO (Рис 2) В связи с этим, клонирование структурной части этого цистрона было проведено таким образом, чтобы в его дисгальной части не содержалось функционально активной копии оператора Оз, и одновременно в проксимальной части происходила модификация RBS гена lad
Рис.1. Структура рекомбинантной плазмиды pML-MCS-PlacUV5, которая использовалась в качестве донора мутантной (UV5) промо горнооператорной области лакюзн01 о оперона - OilVlacA,ySIOiac-
Структурная часть lad была амплифицирована с использованием специально спланированных праймеров так, что новый инициирующий ATG-кодон входил в состав сайт расщепления рестриктазой Ndel, а непосредственно за терминирующим кодоном распола! алея сайт расщепления Bamlll (гем самым лишь первые 8 из 20 н п оператора Оз оказывались в составе нового гена) (Рис 2) Амплифицированный фрагмент хромосомы штамма Е coli MG1655, содержащий модифицированный таким образом ген lad, был клонирован в составе коммерчески доступной векторной плазмиды рЕТ-ЗЬ [Studier, F W et gl ,1901] ("Рис 7} Таким образом, структурный ген лактозного репрессора оказался под трапскрипциокпьи« контроле-.: про-.:стсра, узнаваемого РЧК поли""р!иой бяьтерчпфагл Т7, а и о инициирующий ATG-кодон являлся частью RBS гена 10 фага Т7
Ndel BamHí
____Клонирование^^,
(pMBl)
Рис.2. Схема клонирования структурного гена лактозного репрессора E.coli в сост аве рЕТ-ЗЬ вектора.
Рис.3. Схема опыта, подтверждающего наличие биологической активности клонированной копии гена lacl E.coli и эффективности использования модифицированною RBS гена 10 фага Т7.
Эффективность созданного RBS была оценена при использовании стандартов системы экспрессии, включающей кроме рекомбинантной плазмиды с фа! оспенифическим промотором также специальный реципиентпыи шгамм Е coli BL2HDF3), в котором ген РНК поли^еразы фа^а Т7 (под транскрипционным контролем промоторно-операторной области лактозного оперона Е coli) расположен в векторном профаге A.D69, ин1С1рированиом в состав бактериальной хромосомы Ьыло показано что в этой системе после добавления ИПТ1 (для индукции синтеза РНК полимеразы фаг а Т7) действительно достаточно быстро происходит накопление поттипептида с молекулярной массой 38 ^Да, характерной для белка Т,ас1, структурной единицы функционально активного тетрамера, обладающего молекулярной массой 152 кДа, при этом уровень синтеза составляет более 20% от суммарных поли пептидов бактериальной клетки (данные не представлены) Полученные данные свидетельствовали о создании высокоэффективного RBS перед структурной частью гена lad
Поскольку фрагмент гена получали методом ПЦР, нечьзя было исключить возможность отбора мутантною варианта Для доказательства функциональности клонированной копии lad было проведено прямое определение нуклеотидной последовательности соответствующего фратенга и сравнение экспериментально усгановленной структуры с известной Однако, первоначально нами было почучено независимое доказательство функциональности гена lacl в результате использования специально разработанной тест-системы Данная система основана на использовании в качестве репортера /мх-оперопа Photobacterium leiognalhi находящегося в составе мулыикопийной плазмиды под контролем 0/ас-содержащего промотора в штамме BL21(DE3) (Рис 3) Использованная для первичного доказательства функциональное!и клонированной части lad система, по-видимому, может с успехом применяться и для харак! еристики различных мутантных вариантов гена lad, а 1акже мутантов по lac-подобиой промоторно-операторной области, контролирующих экспрессию оперона-репортера
ВдЛ1
Xbal
Рва
EcoRV
BemHl
Acd
Рис.4. Структура рекомбинантной плазмиды рМ1,-Р1ас1\'5-1ас1, содержащая в своём составе новый генетическою элемента
1.2. Создание искусственною генетического элемента Oi!Pi„i-i\JOl„l-^lac!.
Полученный ген !ut! с высокоэффективным RBS гена 10 фата 77 бы i клонирован в рекомбинацию пм<мял\ рМТ -MCS-Placl \ 5 таким обоазохт чтобы ею транскрипция в новой плазмиле осушеслвля тась с промотора P/flci\i Объе тинепие модифицированного фра; мента ¡ена la^I П со!: и per; тяторпого "смеша О., Р;„л \ s Г)/« привело к соманию нового генетического элемента Oj P/afi\s Olac-^latJ (Рис 4) Д тя первичной характеристики ноною элемента и ызмида pML-PlacLV5-lad быта введена в илачч F coli Y1084 (А ¡ас) и бьп проведен анализ препараюв с\чмарных белков, вылеченных после добав 1ения к растущим бактериям различного кошчества ИПТ1 (Рис э) Бьпо показано, что уровень накоп гения lad в клетках пропорционально зависел ол концентрации добавленною в среду И1ПГ Поскольку в к тетках данною рскомбинаыного iiriumia Иплуцлб^ ¡г,пая транскрипция гена lad (и соответственно накопление бе тка I асГ) m i/кна приводить к достаточно хЬфекгивной репрессии собственной промоторно-операгорной области нового т енетического элемента, полученный результат свидетельствовал об авторету лир>е\шм характере экспрессии
Ml 2 1 4 <î 6 7 S M kla
94
1
-*« Mi ff ящмт «"» ».j ♦ ..
. «m M* Л4 — ™
70
Phc.S. Электрофоре гическос разделение суммарных белков клеток E.coli Y1084 (Л/ас) с плазмидой pML-Placl'V5-lacI в 10%-ном ШАГ с 0,1% SDS.
1 Y1084U/i/u ' 2 YI084(A4/c) ЧЛ1 ИПТГ
3 \ lu84(Aiut.) ipML-H ,,-lacl|
4 У1084ГД/ос.)[рМ1-Р х <-1ас1] 0 01 м VI ИП I [ î Y1084(A/„c) [pML-P „ v-.-lacF] 0 05мМ ИПТГ
6 V 1084(Л/об) [pMl -Р.„.х,-1ас1] 0 1мМ ИП i 1
7 У1084(Д/ас) [pML-P,„а ,<-lacI] 0 5чМ ИПТГ ' 8 У1084(Д/ас) [pML-P,„j ,,-!acI] 1чМ ИПТГ
ч маокес
Более детальное изучение свойств нового авторегутируемого элемента потребовало конструирования новых рекомбинантньтх илазмид и штаммов
В соответствии с этим были созданы с ¡едующие конструкции
• pMW-Placl V5-lacl - новый э 1емснт введен в состав вектора с малой копийноиыо (5-7 копии на теномный эквивиалент) имеющий репликон хорошо известной п тазмиды pSCIOl [Churchward, G et al ,1983J
• pMl-PlacíTV5-lacl - новый э течет введен в состав вектора со средней копийностью (10-20 копии на геномный лквивиаленг) имеющий репликой хорошо известной плазми ты pBR322 [Bolixai. F 1978],
• pACYC-Plact Y5-lacI - новый > течет введен а состав хшого-конийного (10-50 копий на геномный эквивалент) вектора pACYC-184 [С hang. А С Y et al 1978]
1акже.
• Оз'Р/мчх^'О/ас-Mac] был введен в одной копии в состав бактериальной хромосомы за счет использования системы репликативной транспозиции интеграции на основе фата-транспозона Mu [Gijsegem F et al Phage Mu .1987]
Эти генетические кошлрукщш Сьпи использованы дтя дальнейшего исследования свойств нового элемента как регулятора экспрессии некоторых репортеров при ею локализации in eis или т trans
1.3. Исследование свойств нового искусственного генетического элемеша.
1.3.1. Исследование свойств нового искусственного генетического элемента, с исполыованием /их-оперои Photobacterium leiognathi в качестве репортера.
В качестве репортера при исследовании свойств искусственного генетического этемента Оз/Р/„С1 vs/Ofer^/ffc/ первоначально испочыовали /их-оперон Phuiubatterium
leiOgriuikl.
Эффективность действия нового генетического элемента в зависимости от его копийности в клетке изучалась при его расположении in trans относительно penopiepHoro соперона» В качестве реципиентов. использовались клетки, в которых Оз-Т/осиу^О^-^/ас/ находился либо в одной копии в составе бактериальной хромосомы либо располш алея в составе рекомбинантной мульти-копийной плазмиды pACYC-PlacirV5-lacI (Рис 6)
Есв«1
ХИЛ
Рнс.6. Сфуктура рекомбинангной плазмиды pACYC-PlacUV5-lacl, котораи использовалась при исследовании свойств нового элемента Оj/Pfati.\'JOiac^l4ch расположенного in trans относительно репоргерного /мя-оперона.
Репортерные гены были введены в оба штамма в составе ранее описанной плазмиды pUPL22 [Птицын и др, 1990] Эга плазмида, была создана на основе вектора pUC18 и содержала структурные гены luxCDABFE-оперона под транскрипционным контролем лромоторно-операторной области OiTPiacv\sJOiai Как видно из данных, представленных в Таблице 1, относительно низкий уровень люминесценции, наблюдаемый как в одно- так и м> нли-копийном вариантах нового элемента в клетках, практически одинаков при росте бактерий в среде, не содержащей ИП ГГ
Таблица.1. Значение lux-iависимой люминесценции при жсирессии penopiepHOio /их-оперона Photobacterium leiognathi под контролем расположенного in trans нового генетического элемента.____
Эксперимент 1 Эксперимент 2
Реципиентный штамм Е.соП TG(F~, A(lac-pro)): : E.coli TG(F", A(lac-pro)) [pACYC 184-Р/лЛ, vs">/ec/l
Рскомбинантная плазмида pUPL22 (рVC-lux) pUPL22 (pUC-lux)
Lux-зависимая люминесценция -ИПТГ + ИПТГ (2ч.) -ИПТГ + ИПТГ (2ч.)
350 -1700 7000->10000 120 -1200 3500 - 7000
Э ю позволяет заключить, что даже одной копии авторегулируемого элемента 03fPiachv$IQiac~blacI достаточно д.1я обеспечения эффективной репрессии транскрипции расположенных in tram генов, транскрибирующихся с промотора лактозного оперона в составе мульти-копийной рекомбинантной плазмиды
Действие in eis созданного авторегулируемого этемента проверяли путем организации на его основе искусственных оперонов с дистально расположенным репортером Для этого, на основе рекомбинантной плазмиды pML-PlacUV5-lacI и имевшихся в нашем распоряжении гггазмид с /их-опероном, было осуществлено конструирование новой плазмиды. pML-PlacUV5-lacI-lux, в которой был создан гибридный оперон, содержащий структурные части icna lad и цистронов /шг-оперона (Рис.7) Эта плазмида была введена в клетки Ecoli Y1084(A/ac) и интенсивность люминесценции полученных бактерий исследовалась в растущей культуре после добавления в срсду различных концентраций ИПТГ (Рис 8) Наиболее интересным, было то обсюятельство, что и общая интенсивность люминесценции культуры, и достигаемое максимальное значение при нормировании на оптическую длошоегь культуры явно ^висели от коннентпаиии исходно добавленного индуктова, как и следовало предполагать для авторегулируемой системы экспрессии /шг-оперона Однако, использование /wt-оперона в качестве репортера являлось качественным тестом, так как эффективное^ люминесценции рекомбинашных бактерий, несущих соответствующий оперон, достаточно сложным образом зависит и от экспрессии генов lux, и m общего метаболического состояния клетки Для количественной оценки эффективности экспрессии гена репортера следовало определять ферментативную активность образующегося белкового продукта
1.3.2. Исследование свойств нового искусственного генетического элемента, с использованием гена lacZE.coli в качестве репортера.
Исследование свойств нового генетического элемента было продолжено с использованием в качестве репортёра гена lacZ Е coli
Рис.7. Структура рекомбинантцой плазмиды pML-PlacUV5-lacI-Iux,
коюрая использовалась при исследовании свойств нового элемента Оз/Р;а, |л расположенного in
eis относительно репортернот о lux-оперона.
Рис.8. Действие нового генетического элемента в положении т ей. А -типичный профиль ¡их-зависимой люминесценции как функции от кониенрации индуктора (ИПТГ), Б -значения /га-зависимой
люминесценции (график А) нормированы на опшческую плотность культуры.
С этой целью были сконструированы плазмиды pMW-PlacUV5-lacZ и pMW-PlacUV5-lacI-lacZ, для изучения дейевия нового генетического этемента т trans и in as. соответственно (Рис 9)
Репортерная тазмида pMW-PlacUV5-iac7 была введена в клетки следующих бактериальных ш1 аммов Е cob'
• Y1084 (Л/ас),
• TG К/ас/3) - штамм-супсрпродуцент лакгозного ренрессора,
• Y1084 (PtocLV5-»/flc/, KrnR) - пламм-интегрант, содержащий исследуемый авго-регутируемый генетический этемент в одной копии в составе бактериальной хромосомы,
• У1084(Д/ас) [рАСУС-Р1ас1Л/5-1асГ] - штамм, содержащий исследуемый авю-регушруемый генетический элемент в составе мульти-копийной плазмиды
гЫа
PIKUVS I RBST7IP
pMW-P/«cuvs-/acZ
TrniB/
lacZ
Рис.9. Структура рскомбинантных нлазмид pMW-PlacüV5-lacZ и pMW-PlacUVS-lacI-lacZ, которые использовалась при исследовании свойств нового элемента O3/P;0d;WO/ac->/ac/, расположенного in trans и in eis, соответственно, относит ельно репортерно! о гена - ß-галактозидазы.
Во всех полученных после трансформации штаммах была определена активность белкового продукта репортерного гена - ß-галактозидазы после добавления различных концентраций ИПТГ в среду культивирования бактерий Актинность опредетя iacb во всех сл>чаях через 2 часа посте добавления индуктора В клетках контрольного ЬасГ-штамма (Рис 10), как и следовало прстнотагать, активность LacZ не зависела oi концентрации добавленного индукюра В клетках TGI [pMW-PlacUV5-'acZ] зависимость уровня активности ß-галактозидазы от концентрации добавленною ИПТГ проявлялась тишь в очень узком диапазоне (от 0 до 20мкМ), посте чего, достигая максимума активное!ь 1ао7 оставалась пракшчески постоянной Качественно иная зависимость активности репортера от концентрации добавленного в среду индуктора наблюдалась для клеток, содержащие авторе1улируемый генетическии элемент Б лгих случаях актвнос^ LacZ быстро возрастала в диапазоне от 0 до 20мкМ (как и в кле1ках плазмидного штамма на основе TGI), a 3aieM увеличивалась практически прямо-пропорционально дальнейшему росту концентрации индуктора (по крайней мерс до 1 мМ) При этом, при тех же значениях концентрации ИПТГ, повышенная копийность исследуемою элемента (в случае его локализации в составе мульти-копийной пла™иды) приводила к меньшей активности LitcZ, чем R случае олной копии Оз/Pi«-! vs/Oi„r-^laclB хромосоме
Аналогичная линейная зависимость наблюдалась в наших экспериментах при действии авторегулируемого элемента m m, , которое было реализовано за счет создания искусственного оперона - 0-ii?iac\\cJQiac-$lad-lacZ в составе рекомбинантной плазмиды pMW-PlacUV5-lacI-lacZ (Рис 10) При этом относительно низкий уровень наблюдавшейся активности LacZ в клетках был обусловлен различием в эффективности имевшихся RBS в генах созданного оперона высокоэффективный RES гена 10 фага Т7 перед кодирующей частью lad и нативный RBS гена lacZ
Таким образом, результаты использования различных репортерных систем показывают, что созданный новый искусственный генетический элемент Оз/Рйлуб/Огат-^/ос/, будучи авторегулируемым, действительно, способен осущсс!ВЛять п 1авную рефляцию уровня экспрессии находящихся под контролем 0/„с-содержащих промоторов целевых генов, расположенных как т так и т Сгапч
1200Л
ЧЖ TG (pMWPIacUV5-lacZ)
j ~»-Y1084ipMWPiacUV5-lacZ) -hi 1
1 —♦— Y1084 (pACYCPIacUVS-lael, pMWPIacL>V5-lacZ) -Tk-Y1084 PlacUV5-lacl (pMWPIacUV5-lacZ) Y1084 (pMWPIacUV5-lacl-lacZ)
1000
- Активность р-галактозидазы (относительные единицы), измеренная через 2 часа после добавления ИГТТГ
Рис.10. Динамика активности р-галакюзидазы (А) при экспрессии репортерного гена lacZ E.coli под контролем нового генетического элемента, расположенного in trans и in см.
1.4. Практическое применение нового искусственного авто-регулируемого 1 енетического элемента Оз/Р/асиУ5/О;0с-^/ас/.
Совокупность свойств нового генетического элемента позволила с успехом использовать его при создании вксокоэффекшвпых штаммов продуцентов аминокислот, а также для оптимизации свойств плазмядных векторов
В частности, создание искусы венных оперонов на основе 0з/Р(асиу5/0(«->/ас/ элемента позволило осуществить молекулярное клонирование и последующую регулируемую экспрессию ряда нагивных и мутантных генов и структурных областей оперонов бактерий, которые, из-за токсичности соогве1ствующих белковых продуктов, не удавалось клонировать в дру1 их Ойс-содержащих окспрессионных векторных системах В последствии, Э1и клонированные мутантньк гены и опероны бы щ использованы при создании некоторых высокоэффективных штаммов-продуцентов аминокислот.
Кроме того, новый элемент использовался при создании модифицированной векторной плазмиды КБ! 1010-тио Оригинальный вектор ЯКПОЮ (Рис 11) обладав! рядом привлекательных свойств, таких как невысокая конийность и высокая стабильность наследования. Однако, с другой стороны, он способен к мобилизуемому переносу и имеет в своем составе 1ены устойчивое!и к антибиотикам, что исключает возможность использование этого вектора для создания индустриально значимых продуцентов Известно, что ИвРЮЮ содержит в своём составе гены как минимум грех белков вовлеченных в мобилизацию - тоЬА, тоЬВ и тоЬС Кроме того, вектор включает район опТ необходимый для инициации мобилизационной репликации Таким образом, только полное удаление из состава вектора элементов ответственных за мобилизацию мо1ло привести к получению действительно то6~-варианта плазмиды Однако (Рис 11), с участком опТ структурно перекрываются как минимум три известных промотора плазмиды, транскрипция с которых необходима для авторегулируемой экспрессии генов репликации В соответствии с этим деления всех участков ДНК. ответственных за мобилизацию, и одновременно введение в состав исходно! о вектора нового регуляторного
элемента Оя/Р,а,.[ \,5/0/„,->/ж7 мопо обеспечить не гочько образование жизнеспособного moh -варианта счет решения проблемы транскрипции генов репликации, но и возможность плавного изменения копийности плазмиды Необходимо отмешть, структура ДНК плазмиды RSF1010 такова, что стандартный метод конструирования векторов из амплифицированных фрагментов ДНК in vitro был в данном случае практически не применимым
Рис.11. Структура вектора RSF1010.
Рис.12. Структура векторов К8П010-/ио6 и ИвРЮЮ-тоА _^уА, в которых полностью удалены элементы ответственные за мобилизацию. Векпоров ИЯКШО-тоЛ _1ЬуА не содержит в своём составе 1енов устойчивости к антибиотикам.
Поэтом) бьпа предпринята попытка сопапия желаемого вектора т то с использованием Яе(1-зависимой системы рекомбинации фага ) В данном случае соответствующие энзиматические реакции лолжны бьпи пройти не с участием бактериальной хромосомы и интсгрир\емого фрагмента (ню в настоящее время разработано [Оа!5епко. К А . е* а! 2000] и широко и эффективно использу ется), а с участием исходной п 1<имщы ЯЯРЮЮ и искусственным фрагментом ДНК по ученным т \tiio Впервые используя лтя конструирования плазмит такой подход, нам улалось получить вектор \0\0-mob~ (Рис 12) который не тотько не способен к мобилизации в стандартных лабораторных экспериментах (Таблица 2). но и являе!ся тоЬ~ с формальной точки зрения Далее, совместно с сотрудниками проф \ С Миронова (ГоеГШИгенегика) в новом векторе была произведена замена генов антибиотической устойчивости на 1ен /МЛ. высылающим в данном с*учае в качестве маркера позволяющего селективно отбирать п ¡¿пмит^- в штамма* - делециоимых мстянта* по г гну //?уА и потом\ ауксотрофных по тимидину (Рис 12)
[аблица.2. КР1-2-завнсимая мобиттация нсконьииатинньп плазмид
Плазмида. вводимая в лонорный Эффективность мобилизации 11
штамм С600 (RP1-2)
RSF1010" I 2 5x10' !
1 RSFlOlOmob 10s ,
PAYC32' 3 x 10' 1
pBR322" 4 x 10й 1 1
pUC 19° 1 < 10_я 1
а Отношение чипя конкюгантон к mhciv котонин 'онопа not. ¡е ночи инкчбашш штаммча-донора и штамма LE392 (Rii") в качестве реципиента
° Эффективность чобитизаиии RSF1010 (SmK> и ей производных бьпа опредеюна на среде LB-рифампииин стрептомицин
" ЗффспIьвтл.fь чоби .изаиии Ар1 тазчмд (pAYC32 pBR322, pUCI9) бы->а опредетена на среде LB-рифамиицин-амп'щилин
В итоге был получен вектор обладающий следующими свойствами
• не способен к мобилизации и к тому же яв 1яется moh~ с формальной точки зрения что является принципиальным для возможности его практического применения для создания промышленных штаммов-проду центов,
• обладает высокой стабильностью наследования
• не солержш r своем составе генов устойчивости к антибиотикам.
его копийность зависит от присутствия в средс И11ТГ, что обусловлено использованием автореп/тируемого элемента Оз'Р/„г1 \ lud пя транскрипции генов, необхо щмых
для репликации плазмиды
Отношение копийности RSF1010-muh' к копийности RSF1010 (принятой за 1 0) состав 1яет - 0.6 при отсутствии ИГШ в среде и достигав! - 50 через два часа после добавления 1мМ ИПГГ (Рис 13)
RSF1010mob- / RSF1010
<
J
0 0,05 0 1 0 25 0 5 0 75 ИПТГ MM
Рис.13. Динамика копийности RSFIOlO-moft к копийности RSF1010
(принятой за 1,0).
2. Создание и исследование свойств новых оптимизированных вариантов гибридных 0/ас-содержащих элементов лактозного оперона.
Вторым направлением работы было создание оптимизированных вариантов гибридных O/ac-содержаших промоторов, способных при сохранении строг ой регуляции, свойственной лактозному промотору, обеспечивать более эффективный (по сравнению с Рiai) уровень транскрипции в условиях полной индукции.
2.1. Создание новых оптимизированных вариантов гибридных Oiac-содержащих промоторов.
Работы. посвященные уветичснию «силы» 0;ос-содержащих промоторов, проведенные в 80-х годах [Russell & Bennett, 1982; Brosius et al, 1985] привели к конструированию искусственных tac и Ire промоторов (Рис 14) которые широко используются в современной биотехнологии В их составе наряду с «консенсусными» областями «-10» и «-35» исходных Pfacuvs и ?trp, соответственно, в области (+1 - +2)) расположен главный оператор iCW или Oi) лактозного оперона, что позволяет использовать для индукции этих регуляторних элементов ИПТГ. Новые промоторы, действительно, были в 4-5 раз сильнее P;fltc\5 , однако, их репрессия р десятки раз менее эффективна [Oehler et al, 1990], что представляет определенные неудобства при их использовании для обеспечения транскрипции генов, белковые продукты которых потенциально токсичны для бактериальной клетки
t-rarctotaattatrôkt!
tac-ides}
54
iacàttaata-t-™ctajtataal
^ÎUL)t!
SI 5 ■
;tgacasttaata-tc£^gctcgUta5l
P 5'
/rc-ideat
92.^
irc-ide>I-2
5' -^Uceytoqgttgtqgcaaattctji
gpUacaitttcacacaggatctagi-3'
О <1
l__, lui Mral _
P/rc-ide«i-3 S'-jgt^gja^attftg^^toi^ttggitctcsigttirtggc^
P 5'
1 trc-ideaM 3
OL
O,.
60
itaatj
и.ч-
-35"
"-10" +1
Kpnl BglU
Рис.14. Первичная структура фрагментов ДНК, содержащих известные (Р/яЛ vs, Р,ф, P<n-ui«,i и P,„ ,<iroi) и новые (Ри-ь-idean, Ртяамьз и Р„ ¡,i„h) промоюро-операторные элемент ы.
Ранее в нашей лаборатории бычи сконструированы ноныс гибридные промоторы Рис ideal и P/7-c-ideab в которых идеально-симметричный искусственный оператор Ote.,dM| был введен в положения (-81 - -62) и (-92 - -73) исходных Р,и1 и Р„с, соответственно [Машко, С В . Каташкина, Ж И , Скороходова А.Ю и др , 2001] (Рис 14) По данным работ [Sadler et al, 1983, Muller et al ,1996] такое расположение операторных учас!Ков должно было обеспечить высокую коонеративность взаимодействия тетрамерной молекулы LacI одновременно с двумя операторами Было показано [Машко, С.В , Каташкина, Ж И, Скороходова А Ю и др, 2001], что новые промоторы, в условиях максимальной дерепрессии совпадали по силе со своими предшественниками Рш/т, и, в то же время, обеспечивали уровень репрессии в три раза больший Однако, они все же значительно уступали по эффективное i и репрессии природному Рйл\5
Нами были получены два новых варианта frc-промотора P(,c.,deai 2 и Рщ-ики-з (Рис 14) Они бы пи соэланы на основе промоторов Р1гс и P^oidcai- соответственно, путем введения дополни 1ельно1 о идеально-симметричного оператора 0(ас-ц1ы между консенсусными участками «-10» и «-35» (те Р,п-,<>ы-з по сравнению с Pur-ideai-î обладал третьим оператором, расположенным в 5'-концевой части) Такое расположение дополнительной копии оператора было выбрано согласно современным представлениям о структуре нромоторно-операторного комплекса лактозного оперона с LacI и РНК полимер&юй Ь colt и экспериментальными данными других авторов, исследовавших гибридные промоторы с различной локализацией лактозного оператора [Lanzer, M and Bujard, H ,1988, Oehler, S. et al, 1994] Можно было ожидав. что структура новых промоторов будет обеспечивать более эффективную репрессию генов находящихся под их контролем. Кроме шю, нуклсошдная последовательность дополнительного идеально-симметричного оператора O/ar-ideal И раССТОЯНИЯ МвЖДу Центрами 0/ai.,dtal и нативного О lac были выбраны таким образом, чюбы была обеспечена возможность кооперативного взаимодействия LacI с тандемом операторов То есть, расстояние между центрами О ¡„с и 0/ас.,ды в созданных регуляюрных элементах составляли 31,5 и 60 и и (Рис 14), обеспечивая, гем самым, расположение участков взаимодействия с LacI с одной стороны двойной спирали ДНК. находящейся в B-семействе конформаций (10,5-11,0 н п. на 1 вяток спирали)
В дополнении к новых регуляторным элементам, на основе P,rc.,dcai з был создан промотор Pirc-ideai-4, в котором удалена часть (11 нуклеогидов) основною оператора (0/ас) лактозного оперона Ecoli (Рис 14) Следует отметить, что I'irc.„<t-,i, л принципиальным ооразом отличается uj pcùicc созди.ТчЫЛ ■ шаге"доснь;;; промстсрсв, т«к ках новый регуляторный элемент не содержит функционально активной копии оператора О ¿к
2.2. Исследование свойств новых оптимизированных вариантов гибридных 0/да-содержаших промоторов.
Свойства новых гибридных промоторои изучали с помошыо ранее адаптированных идя решения подобного рода задач модельпых систем [Матпко С В , Каташкина. Ж И Скороходова А Ю и др. 2001] Данные системы основывались на создании и штаммах, обтадающих определенными свойствами, библиотек рекомбинантных пчачмид pMW-Px-lacZ и pMW-Px-kan-lacZ (Рис 15), |дс Рх в каждой из созданных плазмид соответствует изучаемому промотору После/тующий анализ активности penopiepnoro белка Lac7 позволял оценить свойства исследуемого промотора
м/в Af/a
Рис.15. Структура рекомбинантиых плазчид pMW-Px-lacZ и pMTW-Px-kan-lacZ, где Рх в каждой из созданных плазмид соо]ветегвуст изучаемому промотору.
Полученные данные Таблица.З показали, что проведенная модификация структуры исходных промоторов не привела к изменению силы в условиях максимальной дерепрессии (в клетках, не содержащих Lacl) Вместе с тем, по эффективности репрессии новые промоюры не уступали P&crv?, превосходя в 3-5 раз P„-c-,deai- При этом необходимо отметить, что репрессия Pffc-,deai-3 была настолько эффективна, что в клетках-суперпродуцентах Lacl даже в условиях добавления 1 мМ ИПТГ уровень фанскрипции репортерною гена достшал лишь 50% от максимальной дерепрессии Таблица.З Это объясняйся известным фактом остаточной репрессии CW-содержащих промоторов комплексом LacI-ИПТГ Модификация Рщ-^т-з, путем исключения из его состава 11 -ти 3 -концевых нуклеотидов основного оператора лактозного оперона (О¡ас), позволила, при сохранении эффективности репрессии полученного промотора (PfnHdeal-4)i снизить проявление данного негативного эффекта (однако не исключить его полностью!
Последний фа;;т кг снижает цгкксстп новых ярсмотсров, поскольку высокая эффективность репрессии делает их весьма перспективными кандидатами на роль управляющих элементов в рамках стратегии переключаемой экспрессии генов, разрабатываемой в нашей лаборатории В частное ш, эга страте! ия предполагает плавное снижение исходно созданной высокой внутриклеточной концентрации репрессора Lacl в öl iiu изменение условий культивирования бактерии в процессе ферментации
Таблица.З. Активность репор1срною белка - В-галактозилазы по отношению к «силе» промотора Р,г( (%).
Гснстииес^ий элемент Е со'л \aclQ Е ссЬ Л!ас (максимум И]1Д> кции) Коэффициент репрессии (максимум инд /репр)
- ¡РТО (репрессия) + 1РТО (индукция)
Р 1цс-1"<-7 0 ! 23 25 280
7 100 100 14
?!гсМЫ-1асг 3 75 | 103 34
Р(гс-Ыеа]-2-1асг 03 80 105 350
0 1 27 101 1010
Р1гЫ6саЫ-1ас/ 0 2 56 104 520
?1ас-кап-1ас7 06 23 24 40
Р (гс-кап-1ас2 17 100 100 5 6
?1гс-Ша1-кап-1асг 10 88 105 10
26 100 I 108 | 40
1 8 50 1 102 | 58
Р1гс-\йея]-4-кап-1ас2 21 80 1 106 | 52 1 1
Выводы:
1 На основе муманшой ÍUV5) промоторно-операторной области лактозного оперона Ь col' Oj/p/acLV f/Ofa и структурной части грня lacl с млдифициропаниым у«асткпи связывания рибосом осутествлено конструирование новою элемента
гл т _ п, f
1 1 он способен регулировать уровень жспрессии целевых генов, расположенных как гп пч1 так и т trans увеличивая его пропорционально добавляемому индуктору ШПТП в диапазоне концентраций от 20 мкМ до 1 мМ, 1 2 в единственной копии в хромосоме, действуя in trans, новый элемент позволяем эффективно репрессировать и плавно регу шровать транскрипцию генов с О^ содержащих промоюров, входящих в состав много-копииных рекомбинантных плазмид,
1 3 к теутстпии инлуктора новый элемент обеспечивает на столько высокий уровень
репрессии, что делает возможным клонирование на его основе i снов с токсичными продувами, которые не удавалось клонировать в составе традиционных Lacl-регулируемых систем.
2 Практическое использование Оз/P/Mtvs/CW-$lacl позволило
2 1 осуществить клонирование и исследование регулируемой экспрессии нативных и
мутантиых генов и onepoHOR биосинтеза аминокислот - созданные конструкции и полученные результаты исследований были использованы при создании высокоактивных штаммов-продуценюв, имеющих промышленное значение,
2 2 провести конструирование производных плазмиды RSH010 с регулируемой
(добавлением ИПТТ) копийностыо, с маркером 1ЪуА вместо генов устойчивости к антибиотикам, а также не содержащих каких-либо участков, существенных для мобилизации плазмиды.
3 На основе искусственных промоторов и Pr,c ,deai созданы новые регуляторные элемен i ы - Pfre.„jtti 2, Prre-idcaw и Рп-о.аеам, содержащие 0/iK.,dea] между каноническими участками «-35» и «-10» и обладающие следующими свойствами
3 1 новые промоторы пи силе аналогичны исходным Рггс и Ри-c-ideab следовательно,
примерно в 4-5 раз превосходят P/oci vs, 3 2 дос j hi ая 40-50-ти кратного уровня Lad-зависимой репрессии, тем самым новые регуляторные элементы по эффективное ш не уступают P/acivs, превосходя как минимум в 3-5 раз созданный рэиее Р^иаеа!
Основное содержание диссер1ации отражено в следующих научных статьях и докладах на научной конференциях:
1 Машко СБ, Каташкина Ж И, Скороходова А. Ю., Зименков Д В, Беневи ¡емкий МС, Бирюкова ИВ, Дебабов В Г «Новые «сильные» и эффективно регулируемые прокариогические промоторы, созданные на основе гибридных регулягорпых элементов введением в их состав идеально симметричного в качестве дополнительного оператора» //Биотехнология (2001), №5, 3-20
2 Katashkma JI Skorokhotlova A.i'u. Zunenko'v DV Biryukova IV Mashko S V «Novel Lacl-regulated Ecoh promoters created on the basic of the Pirc-l'iaciivs/CW due to insertion of the symmetrical 0/ac.ldea| as the auxiliary operator» //Abstracts of «The 2001 Molecular Genetics of Bacteria and Phage Meeting», University of Wisconsin-Madison, July 31 - August 5, 2001, Madison. Wisconsin, USA, p П4
3 Скороходова AM., Зименков Д В Гавриков А В, КшероАД, Каташкина Ж И, Дорошенко В Г, Машко С В «Оптимизация экспрессии генов в бактериальных клетках в био1ехнологических исследованиях XXI-века» //В сб МИФИ, Москва, январь, 2002. 125139
4 Sknrokhodova Л.Уи., Kataihkina JI, Michurma ТА Biryukova IV, Mashko SV « Construction and investigation of the biological properties of the artificial tightly-, auto- and smoothly-regulated E coli element - P/аЛу^1ас1» //Abstracts of «The 2002 Molecular Genetics of Bacteria and Phage Meeting», Cold Spring Harbor I aboratory, CSH, NY, USA, August 2025, 2002,p 118
5 Машко С В, Скороходова AM., Зименков ДВ, Мичурина ТА, Гавриков АВ, Беневоленский МС, Киверо АД, Каташкина Ж И, Дорошенко В Г, Бирюкова ИВ, Дебабов В Г «Использование метабочической регуляции для оптими1ации экспрессии 1 енов в бактериальных клетках - новое направление в биотехнологии ХХ1-века» //Биотехнология (2002), №4, 3-14
6 Skorokhodova A.Yu., Gulevich A Yu, Katashkina JI, Biryukova IV, Mashko SV «Construction and investigation of the biological properties of the artificial tightly-, auto- and smoothly-regulated Ecoh element - P^civs-$latb> '/Abstracts of «The conference for young scientists on molecular biology and genetics, dedicated to the 30 anniversary of the Institute of mo'ecular biology and genctirs NAS of Ukraine». Ukraine. Kiev. September 25-27, 2003, p 151
7 Скороходова AM., Каташкина Ж И, Зименков ДВ, Смирнов С В Гулевич А Ю Бирюкова ИВ Машко С В «Создание и исследование свойств авторе!улируемого и п швнорегулируемого генетическою элемента Оз/PtaiWOta-^/ac/» //Биотехнология (2004), №5, 3-21
8 Скороходова AM. Зименков Л В Каташкина Ж И, Гучевич А Ю, Бирюкова И В Машко С В «Новые прокариотические промоторы, созданные на основе l irc введением симметричного оператора CJ/«t-idcai между участками «-10» и «-35» '/В сб «Всероссийский симпозиум «Биотехнология Микробов», посвященный 120-тстию о дня рождения академика В Н Шапошникова (с международным участием)» Москва, МГУ, октябрь 2124, 2004, 82.
-43 12
РНБ Русский фонд
2006-4 7990
к исполнению 21/02/2005 Заказ № 616
Исполнено 22/02/2005 Тираж 100 экз
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скороходова, Александра Юрьевна
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цели и задачи работы
Научная новизна и практическая значимость
Структура и объем работы
Апробация работы 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Введение
1. Промоторы - сайты инициации транскрипции
2. Примеры генетических систем с регулируемой инициацией транскрипции
2.1. Система регуляции транскрипции лактозного оперона Е. coli
2.2. Особенности регуляции транскрипции арабинозного оперона
2.3. Особенности взаимодействия репрессора бактериофага "к с операторами
2.4. Использование механизмов регуляции транскрипции фага Т
3. Метаболически регулируемые системы экспрессии генов
3.1. Элементы регуляции транскрипцииpho-регулона E.coli
3.2. Элементы регуляции транскрипции генов л/г-системы 48 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы, плазмиды и среды
Олигонуклеотиды
Проведение полимеразной цепной реакции
Генно-инженерные методики
Р1 -зависимая трансдукция
Электрофорез клеточных белков 61 Определение активности р-галактозидазы в экстрактах бактериальных клеток
Измерение люминесценции бактериальной культуры
Электротрансформация клеток Е. coli 62 Проведение интеграции фрагментов ДНК в бактериальную хромосому, с использованием Red-зависимой системы рекомбинации бактериофага X
Конструирование штаммов E.coli MG1655(Ar^::CmR) и E.coli MG1655 (Д/сй: :CmR), используя метод Red-зависимой интеграции фрагментов ДНК в бактериальную хромосому
Конструирование рекомбинантных плазмид
Оценка числа копий вектора RSF1010-тоЪ~ по сравнению с RSF
Исследование эффективности мобилизации плазмид
Анализ стабильности наследования бактериальных плазмид в клетках E.coli
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Создание и исследование свойств авто- и плавно регулируемого генетического элемента 0з/Р/асиУ5/0/ос-^/ас/
1.1. Молекулярное клонирование регуляторного элемента 0з/Р/дсиу5/0/ас и структурной части гена lacl E.coli с высокоэффективным участком связывания рибосом
1.2. Создание искусственного генетического элемента 0з/Р/асиУ5/0/ас-^/ас/
1.3. Исследование свойств нового искусственного генетического элемента
1.3.1. Исследование свойств нового искусственного генетического элемента, с использованием /их-оперон Photobacterium leiognathi в качестве репортера
1.3.2. Исследование свойств нового искусственного генетического элемента, с использованием гена lacZ E.coli в качестве репортера
1.4. Практическое применение нового искусственного авторегулируемого генетического элемента Оз/Р/аС1т/0/ас"^яс/
2. Создание и исследование свойств новых оптимизированных вариантов гибридных 0/ас-содержащих элементов лактозного оперона
2.1. Создание новых оптимизированных вариантов гибридных 0/ас-содержащих промоторов
2.2. Исследование свойств новых оптимизированных вариантов гибридных Оiac-содержащих промоторов
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание и исследование свойств новых генетических систем на основе элементов лактозного оперона Escherichia coli"
Актуальность проблемы. Лактозный оперон E.coli один из первых и любимых объектов современной молекулярной биологии и генетики. Именно на примере изучения этой генетической структуры были установлены и впервые сформулированы основные принципы генетической регуляции транскрипции прокариот, наполнены молекулярным содержанием понятия промотор, оператор, репрессор, оперон. Не удивительно, что с момента начала генно-инженерных экспериментов по обеспечению эффективной экспрессии гомо- и гетерологичных генов в клетках E.coli для регулируемой транскрипции целевых цистронов широко используются элементы лактозного оперона. Несмотря на то, что в практике современных исследований по молекулярной биологии, биотехнологии, генной и метаболической инженерии для этих же целей используется достаточно большое число прокариотических промоторов с известными механизмами регуляции инициации транскрипции, применение элементов лактозного оперона E.coli не потеряло своей актуальности и практической значимости. Действительно, по эффективности репрессии и по специфичности индукции система лактозного оперона превосходит подавляющее большинство других прокариотических систем регуляции транскрипции, осуществляемой РНКП E.coli.
Однако специфические особенности регуляции транскрипции лактозного оперона дикого типа и его наиболее часто используемого мутантного (UV5) варианта приводят к двум принципиальным недостаткам при практическом применении элементов системы для транскрипции целевых генов. Уровень инициации транскрипции в условиях максимальной дерепрессии оказывается недостаточно высок по сравнению с использованием других прокариотических промоторов и, в то же время, лактозный промотор полностью дерепрессируется уже при относительно невысоких концентрациях индуктора в среде, что в совокупности не позволяет проводить исследования влияния различной эффективности транскрипции находящихся под контролем лактозного промотора генов в широком диапозоне, варьируя концентрацию индуктора в среде. Фактически, система лактозного оперона может быть использована для регулируемой транскрипции генов в тригерном режиме (репрессия/дерепрессия) и при этом максимальный уровень транскрипции относительно невысок. Если в эпоху создания «плазмидных» штаммов-продуцентов биологически активных веществ последний недостаток (относительно слабая транскрипция) лактозного промотора мог быть легко компенсирован за счет использования мульти-копийной рекомбинантной плазмиды его содержащей, то в случае создания безплазмидных штаммов-продуцентов нового поколения, в которых усиление экспрессии одной копии целевого гена, локализованного в составе бактериальной хромосомы, осуществляется заменой его промотора — «слабость» лактозного (UV5) промотора становится весьма серьезным недостатком его практического использования.
Таким образом, значительное увеличение «силы» лактозного промотора с одновременным сохранением эффективности его регуляции, а также обеспечение плавной регуляции силы промотора в широком диапазоне концентраций добавляемого индуктора, безусловно, являются актуальными направлениями современного этапа исследований этой генетической системы, а создаваемые при этом новые элементы могут найти достаточно широкое практическое применение.
Цель и задачи работы. Диссертационная работа посвящена конструированию и исследованию свойств новых строго регулируемых генетических систем на основе хорошо известных регуляторных элементов лактозного оперона и структурной части гена lac-репрессора E.coli, позволяющих оптимизировать экспрессию целевых генов.
В процессе работы решались следующие задачи:
• создание авторегулируемой и строго репрессируемой системы, способной к плавному изменению экспрессии в зависимости от концентрации добавленного в среду индуктора;
• создание модифицированных вариантов 0/ас-содержащих промоторов, способных, при сохранении строгой регуляции, обеспечивать более эффективную транскрипцию в условиях полной индукции.
Научная новизна и практическая значимость. В ходе работы создан новый искусственный генетический элемент - 0з/Р/асуу5/0/ас->lacl, на основе промоторно-операторной области мутантного (UV5) лактозного оперона E.coli, Оз/P/^uvs/CW, и структурной части гена lacl с модифицированным участком связывания рибосом, способный осуществлять плавную регуляцию экспрессии целевых генов, находящихся под контролем 0/ас-содержащих промоторов и расположенных как in cis, так и in trans.
Высокий уровень репрессии нового элемента, в отсутствии индуктора, позволил с его помощью осуществить клонирование и исследовать экспрессию структурных областей некоторых генов и оперонов, которые ранее, из-за токсичности их белковых продуктов, не удавалось клонировать в других 0/ас-содержащих векторных системах.
С использованием нового генетического элемента, впервые сконструирован вариант вектора RSF1010, обладающий регулируемой (добавлением ИПТГ) копийностью, не содержащий каких-либо участков ответственных за мобилизацию, а также не имеющий в своём составе генов устойчивости к антибиотикам.
Созданы и охарактеризованы новые эффективно регулируемые 0/ас-содержащие гибридные промоторы: P^c-ideai-2» Pfrc-ideai-з и P^c-ideaM, превосходящие в 4 раза по «силе» P/acuvs и, в отличие от предшественников (Р,гс и P^c-idcai), не уступающие ему по уровню репрессии.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 133 листах машинописного текста, включая 31 рисунок и 3 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы содержит 265 источников, в том числе 8 на русском языке.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Скороходова, Александра Юрьевна
Выводы:
1. На основе мутантной (UV5) промоторно-операторной области лактозного оперона E.coli, OiTPtacws/Otac, и структурной части гена lacl с модифицированным участком связывания рибосом осуществлено конструирование нового элемента
Ог/ViacXNslOiac^lacI:
• он способен регулировать уровень экспрессии целевых генов, расположенных как in cis, так и in trans, увеличивая его пропорционально добавляемому индуктору (ИПТГ) в диапазоне концентраций от 20 мкМ до 1 мМ;
• в единственной копии в хромосоме, действуя in trans, новый элемент позволяет эффективно репрессировать и плавно регулировать транскрипцию генов с О/ас содержащих промоторов, входящих в состав много-копийных рекомбинантных плазмид;
• в отсутствии индуктора новый элемент обеспечивает на столько высокий уровень репрессии, что делает возможным клонирование на его основе генов с токсичными продуктами, которые не удавалось клонировать в составе традиционных Lacl-регулируемых систем.
2. Практическое использование Оз/Р/асиу5/0/ас->/ас/позволило:
• осуществить клонирование и исследование регулируемой экспрессии нативных и мутантных генов и оперонов биосинтеза аминокислот - созданные конструкции и полученные результаты исследований были использованы при создании высокоактивных штаммов-продуцентов, имеющих промышленное значение;
• провести конструирование производных плазмиды RSF1010 с регулируемой (добавлением ИПТГ) копийностью, с маркером ThyA вместо генов устойчивости к антибиотикам, а также не содержащих каких-либо участков, существенных для мобилизации плазмиды.
3. На основе искусственных промоторов Vtrc и P,rc-ideai созданы новые регуляторные элементы - P,rc-ideai-2, Pft-c-ideai-3 и P/rc-ideai-4, содержащие 0/acjdeai между каноническими участками «-35» и «-10» и обладающие следующими свойствами:
• новые промоторы по «силе» аналогичны исходным Рtrc и Р,rc-ideai, и, следовательно, примерно в 4-5 раз превосходят P/acuvs;
• достигая 40-50-ти кратного уровня Ьас1-зависимой репрессии, тем самым новые регуляторные элементы по эффективности не уступают P/acuvs> превосходя как минимум в 3-5 раз созданный ранее P/rc-ideai
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скороходова, Александра Юрьевна, Москва
1. Abo Т., Inada Т., Ogcrwa К., Aiba Н. 2000. SsrA-mediated tagging and proteolysis of Lacl and its role in the regulation of lac operon. EMBO J., v. 19, p.3762-3769
2. Alting-Mees M.A., Short J.M. 1989. pBluescript II SK: gene mapping vector. Nucleic Acids Res., v.l7, p.9494
3. Ann-Hue Thi Tu, Turnbough C.L. 1997. Regulation of upp expression in Escherichia coli by UTP-sensitive selection of transcription start sites coupled with UTP-dependent reiterative transcription. J. Bacterid., v. 179, p.6665-6673
4. Atkinson M.R., Ninfa A.J. 1993. Mutation analysis of the bacterial signal-transducing protein kinase/phosphatase nitrogen regulator II (NRI or NRII). J. Bacter., v. 175, p.7016-7023
5. Backman K., Ptashne M. 1978. Maximizing gene expression on a plasmid using recombination in vitro. Cell, v. 13, p.65-71
6. Balbas P., Soberon X, Merino E., Zurita M., Lomeli H., Valle F., Flores N., Bolivar F. 1986. Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives—a review. Gene, v.50, p.3-40
7. Barry J.K., Matthews K.S. 1999.Thermodynamic analysis of unfolding and dissociation in lactose repressor protein. Biochemistry, v.38, p.6520-6528
8. Bell C.E., Lewis M. 2001. The Lac repressor: a second generation of structural and functional studies. Current Opinion in Structural Biology, v.l 1, p. 19-25
9. Benson N. Adams С., Youderian P. 1994. Genetic selection for mutations that impair the cooperative binding of the lambda repressor. Mol. Microbiol., v.l 1, p.567-579
10. Beverin S., Sheppard D.E., Park S.S. 1971. D-Fucose as a gratuitous inducer of the L-arabinose operon Escherichia coli B/r mutant in gene araC. J. Bacteriol., v. 107, p.79-86
11. Bolivar F. 1978. Construction and characterization of new cloning vehicles. III. Derivatives of plasmid pBR322 carrying unique EcoRI sites for selection of EcoRI generated recombinant DNA molecules. Gene, v.4, p.121-136
12. Borukhov S., Severinov K. 2002. Role of the RNA polymerase sigma subunit in transcription initiation. Res. Microbiol., v.153, p.557-562
13. Brosius J., Erfle M., Storella J. 1985. Spacing of the -10 and —35 regions in the tac promoter. Effect on its in vivo activity. J. Biol. Chem., v.260, p.3539-3541
14. Browning D.F., Busby S.J. 2004. The regulation of bacterial transcription initiation. Nat Rev Microbiol., v.2, p.57-65
15. Brunschwig E„ Darzins A. 1992. A two-component T7 system for the overexpression of genes in Pseudomonas aeruginosa. Gene, v.l 11, p.35-41
16. Brunell A., SchleifR. 1989. Determining residue-base interactions between AraC protein and aral DNA. J. Mol. Biol., v.209, p.607-622
17. Brzoska P., Rimmele M, Brzostek K, Boos W. 1994. The Pho regulon dependent Ugp uptake system for glycerol-3-phosphate in Escherichia coli is trans inhibited by Pi. J. Bacteriol., v. 176, p.5-20
18. Buck M„ Gallegos M.T., Studholme D.J., Guo Y., Gralla J.D. 2000. The bacterial enhancer-dependent sigma(54) (sigma(N)) transcription factor. J. Bacterid., v. 182, p.4129-4136
19. Carra J., SchleifR. 1993. Variation of half-site organization and DNA looping by AraC protein. Eur. J. Mol. Biol., v. 12, p.35-44
20. Casadaban M. 1976. Regulation of the regulatory gene for the arabinose pathway, araC. J. Mol. Biol., v.104, p.557-566
21. Chamberlin M., Ring J. 1973. Characterization of T7-specific ribonucleic acid polymerase. 1. General properties of the enzymatic reaction and the template specificity of the enzyme. J. Biol. Chem., v.248, p.2235-2244
22. Chan F.Y., Torriani A. 1996. PstB protein of the phosphate specific transport system of Escherichia coli is an ATPase. J. Bacterid., v. 178, p.3974-3977
23. Chanda P., Ono M., Kuwano M., Kung H. 1985. Cloning, sequence analysis, and expression of alteration of the mRNA stability gene (ams+) of Escherichia coli. J. Bacteriol., v. 161, p.446-449
24. Chang A.C., Cohen S.N. 1978. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the PI5A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol., v. 134, p. 1141-1156
25. Chen W., Tabor S., Struhl K. 1987. Distinguishing between mechanisms of eukaryotic transcriptional activation with bacteriophage T7 RNA polymerase. Cell, v.50, p. 10471055
26. Cheng Y., Dylla S.M., Turnbough C.L. 2001. A long T • A tract in the upp initially transcribed region is required for regulation of upp expression by UTP-dependent reiterative transcription in Escherichia coli. J. Bacteriol., v.183, №1, p.221-228
27. Cheng Y.S., Kwoh D.Y., Kwoh T. J., Soltvedt B.C., Zipser D. 1981. Stabilization of a degradable protein by its overexpression in Escherichia coli. Gene, v.14, p.121-130
28. Churchward G., binder P., Caro L. 1983. The nucleotide sequence of replication and maintenance functions encoded by plasmid pSClOl. Nucleic Acids Res., v.ll, p.5645-5659
29. Claverie-Martin F„ Diaz-Torres M.R., Yancey S.D., Kushner S.R. 1989. Cloning of the altered mRNA stability (ams) gene of Escherichia coli K-12. J. Bacterid., v. 171, p.5479-5486
30. Collier J., Binet E., Bouloc P. 2002. Competition between SsrA tagging and translational termination at weak stop codons in Escherichia coli. Mol. Microbiol., v.45, p.745-754
31. Conrad В., Savchenko R.S., Breves R., Hofemeister J. 1996. A T7 promoter-specific, inducible protein expression system for Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet., v.250, p.230-236
32. Cranenburgh R. M., Hanak J.A.J., Williams S.G., Sherratt D.J. 2001. Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration. Nucleic Acids Research, v.29, №5, p. 1203-1210
33. Datsenko K.A., Wanner B.L. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., v.97, p.6640-6645
34. Deng H., Wang C„ Acsadi G., Wolff J.A. 1991. High-efficiency protein synthesis from T7 RNA polymerase transcripts in 3T3fibroblasts. Gene, v.109, p.193-201
35. Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H. 1986. Promoters of Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J., v.5, p.2987-2994
36. Diederich L., Roth A., Meser W. 1994. A versatile plasmid vector system for the regulated expression of genes in Escherichia coli. Bio Techniques, v. 16, p.916-923
37. Dombrovski A.J. 1997. Recognition of the promoter sequence by a partial polypeptide of in vitro. J. Biol. Chem., v.272, p.3487-3494
38. Donovan R.S., Robinson C.W., Glick B.R. 1996. Review: optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter. J. Ind. Microbiol., v.16, p.145-154
39. Ellison D.W., McCleary W.R. 2000. The unphosphorylated receiver domain of PhoB silences the activity of its output domain. J. Bacterid., v. 182, № 23, p.6592-6597
40. Elroy-Stein 0., Moss B. 1990. Cytoplasmic expression system based on constitutive synthesis of bacteriophage T7 RNA polymerase in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.87, p.6743-6747
41. Elvin C.M., Thompson P.R., Argall M.E., Hendry P., Stamford N.P., Lilley P.E., Dixon N.E. 1990. Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene, v.87, p.123-126
42. Emory S.A., Belasco J.G. 1990. The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacterid., v. 172, p.4472-4481
43. Englesberg E., Irr J., Power J., Lee N. 1965. Positive control of enzyme synthesis by gene С in the L-arabinose system. J. Bacterid., v.90, p.946-957
44. Falcon C.M., Matthews K.S. 2000. Operator DNA sequence variation enhances high affinity binding by hinge helix mutants of lactose repressor protein. Biochemistry, v.39, p.l 1074-11083
45. Falcon C.M., Swint-Kruse L., Matthews K.S. 1997. Designed disulfide between N-terminal domains of lactose repressor disrupts allosteric linkage. J. Biol. Chem., v.272, p.26818-26821
46. Farmer W.R., Liao J.C. 2000. Improving lycopene production in Escherichia coli by engineering metabolic control. Nat. Biotechnol., v. 15, p.533-537
47. Fiedler U., Weiss V. 1995. A common switch in activation of the response regulators NtrC and PhoB: phosphorylation induces dimerization of the receiver modules. EMBO J., v.15, p.3696-3705
48. Finnegan J., Sherratt D. 1982. Plasmid ColEl conjugal mobility: the nature of bom, a region required in cis for transfer. Mol. Gen. Genet., v. 185, p.344-351
49. Fisher S.L., Jiang W, Wanner B.L., Walsh C.T. 1995. Cross-talk between the histidine protein kinase VanS and the response regulator PhoB: characterization of a VanS domain that inhibits activation of PhoB. J. Biol. Chem., v.270, p.23143-23149
50. Frey J., Bagdasarian M.M., Bagdasarian M. 1992. Replication and copy number of the broad-host-rangeplasmid RSF1010. Gene, v.l 13, p. 101-106
51. Fried G.F., Hudson J.M. 1996. DNA looping and Lac repressor-CAP interaction. Science, v.274, p.1930-1931
52. Friedman A.M., Fischmann Т.О., Steitz T.A. 1995. Crystal structure of the Lac repressor core tetramer and its implications for DNA looping. Science, v.268, p.1721-1727
53. GerkL.P., Leven O., Miller-Hill B. 2000. Strengthening the dimerisation interface of Lac repressor increases its thermostability by 40°C. J. Mol. Biol., v.299, p.805-812
54. Gijsegem F., Toussaint A., Casadaban M. 1987. Phage Mu, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., p.215-250
55. Gilbert W., Gralla J., Majors J., Maxam A. 1975. Lactose repressor sequences and the action of the lac repressor. In Symposium on Protein-Ligand Interaction. Sund H. and Blauer G. (eds). Berlin: Walter de Gruyter, p. 193-206
56. Goulet I., Zivanovic Y., Prunell A. 1987. Helical repeat of DNA in solution. The V curve method. Nucleic Acids Res., v.l5, p.2803-21.
57. Greenblatt J., Schleif R. 1971. Regulation of the arabinose operon in vitro. Nat. New Biol., v. 233, p.166-170
58. Guarente L., Roberts Т., Ptashne M. 1980. A technique for expressing eukaryotic genes in bacteria. Science, v.209, p.1428-1430
59. Guo H.C., Roberts J.F. 1990. Heterogeneous initiation due to slippage at the bacteriophage 82 late gene promoter in vitro. Biochemistry, v.29, p. 10702-10709
60. Hahn S„ Schleif R. 1983. In vivo regulation of the Escherichia coli araC promoter. J. Bacteriol., v.155, p.593-600
61. HanX., Turnbough C.L. 1998. Regulation of carAB expression in Escherichia coli occurs in part through UTP-dependent reiterative transcription. J. Bacteriol., v. 180, p.705-713
62. Harley C.B., Reynolds R.P. 1987. Analysis of Escherichia coli promoter DNA sequence. Nucleic Acids Research, v.15, p.2343-2361
63. Hawley D.K., Johnson A.D., McClure W. 1985. Functional and physical characterization of transcription initiation complexes in the bacteriophage XOr region. J. Biol. Chem., v.260,p.8618-8626
64. Hawley D.K., McClure W.R. 1983. Compilation and analysis of Escherichia coli promoter DNA sequence. Nucleic Acids Research, v. 11, p.2237-2256
65. Helling R., Weinberg R. 1963. Complementation studies of arabinose genes in Escherichia coli. Genetics, v.48, p.1397-1410
66. Hendrickson W., Schleif R. 1984. Regulation of the Escherichia coli L-arabinose operon studied by gel electrophoresis DNA binding assay. J. Mol. Biol., v. 178, p.611-628
67. Hendrickson W., Stoner C, Schleif R. 1990. Characterization of the Escherichia coli araFGH and araJpromoters. J. Mol. Biol., v.215, p.497-510
68. Hirsh J., Schleif R. 1973. On the mechanism of action of L-arabinose С gene activator and lactose repressor. J. Mol. Biol., v.80, p.433-444
69. Hochschild A., Irvin N., Ptashne M. 1983. Repressor structure and the mechanism of positive control. Cell, v.32, p.319-325
70. Hochschild A., Ptashne M. 1988. Interaction a distance between X repressors disrupts gene activation. Nature (London), v.336, p.353-357
71. Horazdovsky B.F., Hogg R.W. 1987. High-affinity L-arabinose transport operon. J. Mol. Biol., v.l 97, p.27-35
72. Horazdovsky B.F., Hogg R.W 1989. Genetic reconstitution of the high affinity L-arabinose transport operon. J. Bacteriol., v. 171, p.3053-3059
73. Horowitz D.S., WangJ.C. 1984. Torsional rigidity of DNA and length dependence of the free energy of DNA supercoiling. J Mol Biol., v.173, p.75-91
74. Hudson J.M., Fried G.F. 1990. Co-operative interactions between the catabolite gene activator protein and the Lac repressor at the lactose promoter. J. Mol. Biol., v.214, p.381
75. Hullet F.M. 1996. The signal-transduction network for Pho regulation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol., v.l9, p.933-939
76. Jacob F., MonodJ. 1961. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol., v.3,p.318-356
77. Jeong W., Kang C. 1994. Start site selection at lacUVS promoter affected by the sequence context around the initiation sites. Nucleic Acids Research, v.12, №22, p.4667-4672
78. Jiang P., Ninfa A.J. 1999. Regulation of the autophosphorylation of Escherichia coli nitrogen regulator II by The PII signal transduction protein. J. Bacter., v.181, p. 19061911
79. Jiang P., Peliska J.A., Ninfa A.J. 1998. Reconstitution of the signal-transduction bicyclic cascade responsible for the regulation of Ntr gene transcription in Escherichia coli. Biochemistry, v.37, p. 12795-12801
80. Jiang P., Peliska J.A., Ninfa A.J. 1998. The regulation of Escherichia coli glutamine synthetase revisited: role of 2-ketoglutarate in the regulation of glutamine synthetase adenylylation state. Biochemistry, v.37, p.12802-12810
81. Jin D.J. 1994. Slippage synthesis at the galP2 promoter of Escherichia coli and its regulation by UMP concentration and cAMP-cAMP receptor protein. J. Biol. Chemistry, v.269, №25, p.17221-17227
82. Joho K.E., Gross L.B, McGraw N.J., Raskin C., McAllister W.T. 1990. Identification of a region of the bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases that determines promoter specificity. J. Mol. Biol., v.215, p.31-39
83. Johnson A.D., Meyer B.J., Ptashne M. 1979. Interactions between DNA-bound repressor govern regulation by X phage repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.76, p.5061-5065
84. Johnson J., SchleifR. 1995. In vivo induction kinetics of the arabinose promoters in Escherichia coli. J. Bacteriol., v.177, p.3438-3442
85. Jones K.L., Kim S.-W., Keasling J.D. 2000. Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering of bacteria. Metabolic Engineering, v.2, p.328-338
86. Jordan S.R., Pabo C.O. 1988. Structure of the lambda complex at 2.5 A resolution: details of the repressor-operator interactions. Science, v.242, p.893-899
87. Kammerer W., Deuschle U., Gentz R., Bujard H. 1986. Functional dissection of Escherichia coli promoters: information in the transcribed region is involved in late steps of the overall process. EMBO J., v.5, p.2995-3000
88. Kamberov E.S., Atkinson M.R., Ninfa A.J. 1995. The Escherichia coli PII signal transduction protein is activated upon binding 2-ketoglutarate and ATP. J. Biol. Chem., v.270, p. 17797-17807
89. Kasahara M., Makino К, Amemura M., Nakata A., Shinagawa H. 1991. Dual regulation of the ugp operon by phosphate and carbon starvation at two interspaced promoters. J. Bacteriol., v. 173, p.549-558
90. Keene R.G., Luse D.S. 1999. Initially transcribed sequences strongly affect the extent of abortive initiation by RNA polymerase II. J. Biol. Chem., v.274, p.l 1526-11534
91. Khlebnikov A., Risa O, Skaug Т., Carrier T.A., Keasling J.D. 2000. Regulatable arabinose-inducible gene expression system with consistent control in all cells of a culture. J. Bacteriol., v.182, p.7029-7034
92. Kim S.K, Wilmes-Riesenberg M.R., Wanner B.L. 1996 Involvement of the sensor kinase EnvZ in the in vivo activation of the response-regulator PhoB by acetyl phosphate. Mol. Microbiol., v.22, p. 135-147
93. Kuldell N., Hochschild A. 1994. Amino acid substitution in the -35 recognitionn лmotif of ст that result in defects in phage X repressor-stimilated transcription. J. Bacterid., v. 176, p.2991-2998
94. Laemmli V.K 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v.227, p.680-685
95. Landy A. 1989. Dynamic, structural, and regulatory aspects of X site-specific recombination. Annu. Rev. Biochem., v.58, p.913-949
96. Lanzer M, Bujard H. 1988. Promoters largely determine the efficiency of repressor action. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.85, p.8973-8977
97. Law S.M., Bellomy G.R., Schlax P.J., Record M.T.Jr. 1993. In vivo thermodynamic analysis of repression with and without looping in lac constructs. J. Mol. Biol., v.230, p.161-173
98. Lebedeva M.I., Rogozkhina E. V., Tsyba N.A., Mashko S. V. 1994. A new T7 RNA polymerase-driven expression system induced via thermoamplification of a recombinant plasmid earring a T7 promoter Escherichia coli operator. Gene, v. 142, p.61-66
99. Lee J., Goldfarb A. 1991. Lac repressor acts by modifying the initial transcribing complex so that it cannot leave the promoter. Cell, v.66, p.793-798
100. Lee jV. 1980. Molecular aspects of ara regulation, p.389-410. In J.H. Miller and W.S. Reznikoff (ed.), The operon. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
101. Lehming N. Sartorius J., Genenger G., von Wilcken-Bergmann В., Muller-Hill В. 1987. The interaction of the recognition helix of Lac repressor with lac operator. EMBO J., v.6,p.3145-3153
102. Lewin B. 1997. «Genes VI». Oxford, English: University Press.
103. Lewis M. 1996. DNA looping and Lac repressor-CAP interaction. Science, v.274, p.1931
104. Lewis M., Chang G., Horton N.C., Kercher M.A., Pace H.C., Schumacher M.A., Brennan R.G., Lu P. 1996. Crystal structure of the lactose operon repressor and its complexes with DNA and inducer. Science, v.271, p. 1247-1254
105. Li M., Moyle H., Susskind M.M. 1994. Target of the transcriptional activation function of the A.cl protein. Science, v.263, p.75-77
106. Liaw S.-H., Pan C., Eisenberg D. 1993. Feedback inhibition of fully unadenylylated glutamine synthetase from Salmonella typhimurium by glycine, alanine, and serine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.90, p.4995-5000
107. Liu J., Magasanik B. 1995. Activation of the dephosphorylation of nitrogen regulator I-phosphate of Escherichia coli. J. Bacter., v. 177, p.926-931
108. Lloyd G., Landini P., Busby S. 2001. Activation and repression of transcription initiation in bacteria. Essays Biochem, v.37, p. 17-31
109. Lobell R.B., Schleif R.F. 1991. AraC-DNA looping: orientation and distance-dependent loop breaking by the cyclic AMP receptor protein. J. Mol. Biol., v.218, p.45-54
110. Lundberg U., von Gabain A., Melefors O. 1990. Cleavages in the 5' region of the ompA and bla mRNA control stability: studies with an E. coli mutant altering mRNA stability and a novel endoribonuclease. EMBO J., v.9, p.2731-2741
111. Lutz R., Bujard H. 1997. Independent and tight regulation of transcription units in Escherichia coli via the Lac/O, the TetR/O and AraC/Ij-b regulatory elements. Nucleic Acids Research, v.25, №6, p.1203-1210
112. Lutz R., Lozinski Т., Ellinger Т., Bujard H. 2001. Dissecting the functional program of Escherichia coli promoters: the combined mode of action of Lac repressor and AraC activator. Nucleic Acids Research, v.29, №18, p.3873-3881
113. Maiden M.C., Jones-Mortimer M.C., Henderson P.J.F. 1988. The cloning, DNA sequence, and overexpression of the gene araE coding for the arabinose-proton symport in Escherichia coli K12. J. Biol. Chem., v.263, p.8003-8010
114. Makino К, Amemura M., Kawamoto Т., Kimura S., Shinagawa H., Nakata A. 1996. DNA binding of PhoB and its interaction with RNA polymerase. J. Mol. Biol., v.259, p. 15-26
115. Makino K, Amemura M., Kim S.K., Nakata A., Shinagawa H. 1993. Role of sigma70 subunit of RNA polymerase in transcription activation by activator protein PhoB in Escherichia coli. Genes. Dev., v.7, p. 149-169
116. Makino K, Kim S.K., Shinagawa H., Amemura M., Nakata A. 1991. Molecular analysis of the cryptic and functional phn operons for phosphonate use in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., v.173, p.2665-2672
117. Makino K., Shinagawa //., Amemura M., Kawamoto Т., Yamada M., Nakata A. 1989. Signal transduction in the phosphate regulon of Escherichia coli involves phosphotransfer between PhoR and PhoB proteins. J. Mol. Biol., v.210, p.551-559
118. Makino K., Shinagawa H., Amemura M., Kimura S., Nakata A. 1988. Regulation of the phosphate regulon of Escherichia coli: activation of the pstS transcription by PhoB protein in vitro. J. Mol. Biol., v.203, p.85-95
119. Makino K, Shinagawa H., Amemura M., Nakata A. 1986. Nucleotide sequence of phoB gene, the positive regulatory gene for the phosphate regulon of Escherichia coli K12. J. Mol. Biol., v.l90, p.37-44
120. Makino K, Shinagawa H., Amemura M., Nakata A. 1986. Nucleotide sequence of the phoR gene, a regulatory gene for the phosphate regulon of Escherichia coli. J. Mol. Biol., v. 192, p.549-556
121. Marger M.D., Saier Jr.M.H. 1993. A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport, symport and antiport. Trends Biochem. Sci., v.l8, p. 1320
122. Matthews КС., Nichols J.C. 1998. Lactose repressor protein: functional properties and structure. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., v.58, p. 127-164
123. McCleary W.R., Stock J.B., Ninfa A.J. 1993. Is acetyl phosphate a global signal in Escherichia coli? J. Bacter., v.l75, p.2793-2798
124. McCleary W.R. 1996. The activation of PhoB by acetylphosphate. Mol. Microbiol., v.20,p.l 155-1163
125. Mecsas J., Cowing D.W., Gross C.A. 1991. Development of RNA polymerase-promoter contacts during open complex formation. J Mol Biol., v.220, p.585-597
126. Melefors 0., von Gabain A. 1988. Site-specific endonucleolytic cleavages and the regulation of stability of E. coli ompA mRNA. Cell, v.52, p.893-901
127. Merrick M., Edwards R.A. 1995. Nitrogen control in bacteria. Microbiol. Rev., v.59, p.604-622
128. Miller J.H. 1972. Experiments in molecular genetics, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor
129. Mitchell J.E., Zheng D., Busby S.J.W., Mitchin S.D. 2003. Identification and analysis of -10'promoters in Escherichia coli. Nucleic Acids Research, v.31, №16, p.4689-4695
130. Miyada C.G., Stoltzfus L„ Wilcox G. 1984. Regulation of araC gene of Escherichia coli: catabolite repression, autoregulation, and effect on araBAD expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.81, p.4120-4124
131. Mizusawa S., Ward D.F. 1982. A bacteriophage lambda vector for cloning with BamHI and Sau3A. Gene, v.20, p.317-322
132. Mossing M. C., Record M. T.Jr 1986. Upstream operators enhance repression of the lac promoter. Science, v.233, p.889-892
133. Muda M., Rao N., Torriani A. 1992. Role of PhoU in phosphate transport and alkaline phosphatase regulation. J. Bacteriol., v.l74, p.8057-8064
134. Mtiller J., Oehler S., Muller-Hill B. 1996. Repression of lac promoter as a function of distance, phase and quality of an auxiliary lac operator. J. Mol. Biol., v.257, p.21-29
135. Nichols J.C., Matthews K.S. 1997. Combinatorial mutations of the repressor. Stability of monomer-monomer interface is increased by apolar substitution at position 84. The Journal of Biological Chemistry, v.272, №30, p.l 8550-18557
136. Ninfa A. J., Atkinson M.R. 1986. Covalent modification of the glnG product, NRI, by the glnL product, NRII, regulates the transcription if the glnAGL operon in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.83, p.5909-5913
137. Ninfa A., Atkinson M.R. 2000. PII signal transduction proteins. Trends Microbiol., v.8, p. 172-179
138. Novick A., Weiner M. 1957. Enzyme induction as an all-or-none phenomenon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.43, p.553-556
139. Nudler E. 1999. Transcription elongation: structural basis and mechanisms. J Mol Biol., v.288, p.1-12
140. O'Connor C.D., Timmis K.N. 1987. Highly repressible expression system for cloning genes that specify potentially toxic protein. J. Bacteriol., v. 169, p.4457-4464
141. Oehler S„ Amouyal M„ Kolkhof P., von Wilcken-Bergmann В., Muller-Hill B. 1994. Quality and position of the lac operators of E.coli define efficiency of repression. EMBO J., v.13, p.3348-3355
142. Oehler S., Eismann E.R., Kramer H., Muller-Hill B. 1990. The three operators of the lac operon cooperative in repression. EMBO J., v.9, p.973-979
143. O'Gara F., Condon S., Ross P. Marker genes for genetic manipulation. EP00406003A1,29.06.1990
144. Okamura H., Hanaoka S., Nagadoi A., Makino K, Nishimura Y. 2000. Structural comparison of the PhoB and OmpR DNA-binding/transactivation domains and the arrangement of PhoM molecules on the phosphate box. J. Mol. Biol., v.295, № 5, p. 12251230
145. Olins P.O., Devine C.S., Rangwala S.H., Kavka, K.S. 1988. The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene, v.73, p.227-235
146. Olins P.O., Rangwala S.H. 1989. A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J. Biol. Chem., v.264, p.16973-16976
147. Pabo C.O., Lewis M. 1982. The operator-binding domain of lambda repressor: structure and DNA recognition. Nature (London), v.298, p.443-447
148. Pace H.C., Kercher M.A., Markiewicz P., Miller J.H., Chang G., Lewis M. 1997. Lac repressor genetic map in real space. Trends Biochem. Sci., v.22, p.334-339
149. Paget M.S., Helmann J.D. 2003. The sigma70 family of sigma factors. Genome Biol., v.4, p.203
150. Pal M., Luse D.S. 2002. Strong natural pausing by RNA polymerase II within 10 bases of transcription start may result in repeated slippage and reextention of the nascent RNA. Mol. Cell Biol., v.22, p.30-40
151. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. 1996. Proton-dependent multidrug efflux systems. Microbiol. Rev., v.60, p.575-608
152. Paulsen I.T., Sliwinski M.K, Saier Jr.M.H. 1998. Microbial genome analyses: global comparisons of transport capabilities based on phylogenies, bioenergetics and substrate specificities. J. Mol. Biol., v.277, p.573-592
153. Peredelchuk M.Y., Bennett G.N. 1997. A method for construction of E.coli strains with multiple DNA insertions in the chromosome. Gene, v.l87. p.231-238
154. Peros M., Steitz Т. 1996. DNA looping and Lac repressor-CAP interaction. Science, v.274, p.l929-1930
155. Poindexter K., Gayle III R.B. 1991. Induction of recombinant gene expression in Escherichia coli using an alkaline pH shift. Gene, v.97, p.125-130
156. Ptashne, M. 1992. Genetic switch. Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, Mass
157. Ptashne M., Jeffrey A., Johnson A.D., Matter R., Meyer B.J., Pabo C.O., Roberts T.M., SauerR.T. 1980. How the X repressor and Cro work. Cell, v. 19, p. 1-11
158. Ptitsyn L.R, Fatova M.A., Stepanov A.I. 1990. Expression of Photobacterium leiognathi bioluminescence system genes in Escherichia coli. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol., v.2, p.26-29
159. Qi F., Turnbough C.L. 1995. Regulation of codBA operon expression in Escherichia coli UTP-dependent reiterative transcription and UTP-sensitive transcription start site switching. J. Mol. Biol., v.254, p.552-565
160. Rao N.N., Torriani A. 1988. Utilization by Escherichia coli of a high-molecular-weight, linear polyphosphate: roles of phosphatases and pore proteins. J. Bacterid., v.170, p.5216-5223
161. Rao N.N., Torriani A. 1990. Molecular aspects of phosphate transport in Escherichia coli. Mol. Microbiol., v.7, p. 1083-1090
162. Reeder Т., Schleif R. 1991. Mapping, sequence, and apparent lack of function of araJ a gene of the Escherichia coli arabinose operon. J. Bacterid., v.173, p.7765-7771
163. Remaut E., Stanssens P., Fiers W. 1981. Plasmid vectors for high-efficiency expression controlled by the PL promoter of coliphage lambda. Gene, v. 15, p.81-93
164. Remaut E, Tsao H., Fiers W. 1983. Improved plasmid vectors with a thermoinducible expression and temperature-regulated runaway replication. Gene, v.22, p.103-113
165. Reznikoff W.S., Winter R.B., Hurley C.K. 1974. The location of the repressor binding sites in the lac operon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.71, p.2314-2318
166. Rhee S.G., Chock P.B., Stadman E.R. 1989. Regulation of Escherichia coli glutamine synthetase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., v.62, p.37-92
167. Rhodius V.A., Busby S.J.W. 1998. Positive activation of gene expression. Curr. Opin. Microbiol., v.l, p. 152-159
168. Roberts Т., Kacich R., Ptashne M. 1979. A general method for maximizing the expression of a cloned gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 76, p. 760-764
169. Rosenberg #., Gerdes R.G., Chegwidden К 1977. Two systems for the uptake of phosphate in Escherichia coli. J. Bacterid., v.131. p.505-511
170. Russell D.R., Bennett G.N. 1982. Construction and analysis of in vivo activity of E. coli promoter hybrids and promoter mutants that alter the -35 to -10 spacing. Gene, v.20, p.231-243
171. Sadler J.R., Sasmor H., Betz J.L. 1983. A perfectly symmetric lac operator binds the lac repressor very tightly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.80, p.6785-6789
172. Sambrook J., Fritsch E„ Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 1st and 2nd ed. N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press
173. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.74, p.5463-5467
174. Saviola В., Seabold R., Schleif R.F. 1998. Arm-domain interactions in AraC. J. Mol. Biol., v.278,p.539-548
175. Schickor P., Metzger W„ Werel W., Lederer H., Heumann H. 1990. Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. EMBO J., v.9, p.2215-2220
176. Schleif R. 1987. Why should DNA loop? Nature, v.327, p.369-370
177. Schleif R. 2000. Regulation of the L-arabinose Escherichia coli operon. TIG, v. 16, №12, p.559-565
178. Schmitz A., Galas D.J. 1979. The interaction of RNA polymerase and Lac repressor with the lac control region. Nucleic Acids Res., v.6, p.l 11-137
179. Scholten M., Tomassen J. 1993. Topology of the PhoR protein of E. coli and functional analysis of internal deletions. Mol. Biol., v.8, p.269-275
180. Scholz P., Haring V., Wittmann-Liebold В., Ashman K, Bahdasarian M„ Scherzinger E. 1989. Complete nucleotide sequence and gene organization of the broad host range plasmid RSF1010. Gene, v.75, p.271-288
181. Schultz S.C., Shields G.C., Steitz T.A. 1991. Crystal structure of a CAP-DNA complex: the DNA is bent by 90 degrees. Science, v.253, p.1001
182. Senior P.J. 1975. Regulation of nitrogen metabolism in Escherichia coli and Klebsiella aerogenes: studies with the continuous-culture technique. J. Bacter., v. 123, p.407-418
183. Severinov K. 2000. RNA polymerase structure-function: insights into points of transcriptional regulation. Curr. Opin. Microbiol., v.3, p.l 18-125
184. Shapiro B.M.,. Kingdon H.S., Stadtman E.R. 1967. Regulation of glutamine synthetase. VII. Adenylyl glutamine synthetase: a new form of the enzyme with altered regulatory and kinetic properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.58, p.642-649
185. Shapiro B.M. 1969. The glutamine synthetase deadenylylating enzyme system from Escherichia coli. Resolution into two components, specific nucleotide stimulation, and cofactor requirements. Biochemistry, v.8, p.659-670
186. Sheppard D., Englesberg E. 1967. Further evidence for positive control of the L-arabinose system by gene araC. J. Mol. Biol., v.25, p.443-454
187. Siegele D.A., Ни J.С. 1997. Gene expression from plasmids containing the araBAD promoter at subsaturating inducer concentrations represents mixed populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.94, p.8168-8172
188. Simons A., Tils D., von Wilcken-Bergmann В., Muller-Hill B. 1984. Possible ideal lac operator: Escherichia coli operator-like sequences from eukaryotic genomes lack the central G С pair. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.81, p.1624-1628
189. Singer B.S., Gold L. 1991. Phage T4 expression vector: protection from proteolysis. Gene, v. 106, p. 1-6
190. Sola M., Gomes-Ruth F.X., Serrano L., Gonzales A. Coll M. 1999. Three-dimensional crystal structure of the transcriptional factor PhoB receiver domain. J. Mol. Biol., v.285, № 2, p.675-687
191. Sousa R, Chung Y.J., Rose J.P., Wang B.-C. 1993. Crystal structure of bacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3 A resolution. Nature, v.364, p.593-599
192. Spronk C.A.E.M., Folkers J.E., Noordman A.-M.G. W., Wechselberger R., van der Brink N., Boelens R., Kaptein R. 1999. Hinge-helix formation and DNA bending in various lac repressor-operator complexes. EMBO J., v.22, p.6472-6480
193. Spronk C.A.E.M., Slijper M., van Boom J.H., Kaptein R„ Boelens R. 1996. Formation of the hinge-helix in the lac repressor is induced upon binding to the lac promoter. Nature Struct. Biol., v.3, p.916-919
194. Straney S.B., Crothers D.M. 1987. Lac repressor is a transient gene-activating protein. Cell, v.51, p.699-707
195. Studier F.W., Moffatt B.A. 1986. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., v.l 89, p. 113-130
196. Studier F. W., Rosenberg A.H., Dunn J. J., DubendorffJ. W. 1990. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Meth. Enzymol., v. 185, p.60-89
197. Surin B.P., Rosenberg H., Cox G.B. 1985. Phosphate-specific transport system of Escherichia coli: nucleotide sequence and gene-polypeptide relationship. J. Bacteriol, v.161, p.189-198
198. Tabor S., Richardson C.C. 1985. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Nucleic Acids Research, v.82, p.1074-1078
199. Tanhauser S.M., Jewell D.A., Tu Т.К., Silverman D.N., Laipis P.J. 1992. A T7 expression vector optimized for site-directed mutagenesis using oligodeoxyribonucleotide cassettes. Gene, v.l 17, p. 113-117
200. Tommassen J. 1987. Expression of outer membrane PhoE protein in Escherichia coli K12. Phosphate metabolism and cellular regulation in microorganisms. / Eds. Torriani-Gorini A., Yagil E., Silver S Washington, DC: Am. Soc. Microbiol., p.26-30
201. Tommassen J., De Geus P., Lugtenberg B., Hackett J., Reeves P. 1982. Regulation of the Pho regulon of Escherichia coli К12. Cloning of the regulatory genes phoB and phoR and identification of their gene products. J. Mol. Biol., v. 157, p.256-274
202. Torriani-Gorini A. 1994. Introduction: the Pho regulon of Escherichia coli. Phosphate in microorganisms: cellular and molecular biology. / Eds. Torriani-Gorini A., Yagil E., Silver S. Washington, DC: Am. Soc. Microbiol., p. 1-4
203. Tsygankov Yu.D., Chistoserdov A.Yu. 1985. Specific-purpose broad-host-range vectors. Plasmid., v.14, p.118-125
204. Uhlin В.E„ Molin S., Gustafsson P., Nordstrom K. 1979. Plasmids with temperature-dependent copy number for amplification of cloned genes and their products. Gene, v.6, p.91-106
205. Wacket L.P., Wanner B.L., Venditti C.P., Walsh C.T. 1987. Involvement of the phosphate regulon and psiD locus in the carbon-phosphorus lyase activity of Escherichia coli K12. J. Bacteriol., v.169, p.1753-1756
206. Wanner B.L. 1993. Gene regulation by phosphate in enteric bacteria. J. Biol. Chem., v.51, p.47-54
207. Wanner B.L., Wilmes-Riesenberg M.R. 1992 Involvement of phosphotransacetylase, acetate kinase, and acetyl phosphate synthesis in control of the phosphate regulon in Escherichia coli. J. Bacteriol., v. 174, p.2124-2130
208. Wright E.M., Humphreys G.O., Yarranton G.T. 1986. Dual-origin plasmids containing an amplifiable ColEl ori; temperature-controlled expression of cloned genes. Gene, v.49, p.311-321
209. Wu H.-M., Clothers D.M. 1984. The locus of sequence-directed and protein-induced DNA bending. Nature, v.308, p.509-513
210. XiongX.F., Reznikoff W.S. 1993. Transcriptional slippage during the transcription initiation process at a mutant lac promoter in vivo. J. Mol. Biol., v.231, p.569-580
211. Yamada M, Makino K., Shinagawa Я, Nakata A. 1990. Regulation of the phosphate regulon of E.coli: properties of phoR deletion mutants and subcellular localization of PhoR protein. Mol. Gen. Genet., v.220, p.366-372
212. Yanisch-Perron С., Vieira J., Messing J. 1985. Improved M13 phage cloning vector and strains: nucleotide sequences of the M13mpl8and pUC19 vectors. Gene, v.33, p.103-119
213. Zhang X., SchleifR. 1996. Transcription activation parameters at ara?bad■ J- Mol. Biol., v.258, p. 14-24
214. Zhang X. SchleifR. 1998. Catabolite gene activator protein mutations affecting activity of the araBAD promoter. J. Bacteriol., v. 180, p.l 95-200
215. Zinkel S.S., Clothers D.M. 1987. DNA bends direction by phase sensitive detection. Nature, v.328, p. 178-181
216. Zweib C., Kim J., Adhya S. 1989. DNA bending by negative regulatory proteins: Gal and Lac repressors. Genes Dev., v.3, p.606-611
217. Каташкина Ж.И. 2003. Разработка и использование методов направленной модификации целевых генетических локусов хромосомы E.coli при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот. Автореферат., Москва
218. Матыс С.В., Лауринавичюс КС., Несмеянова М.А. 1996. Катаболизм метилфосфоновой кислоты и его физиологическая регуляция у Escherichia coli. Микробиология, т.65, с.481-487
219. Машко С.В., Горовиц P.JI., Трухан М.Э., Демчук Е.Я., Лебедева М.И., Лапидус А.Л., Подковыров С.М.,Козлов Ю.И., Дебабов В.Г. 1986. Изучение относительной эффективности некоторых промоторов Escherichia coli и фага X. Докл. АН СССР, т.291, с. 1510-1513
220. Перельман А.Н., Мочульская Н.А., Миронов А.С., Магико С.В. 1995. Создание нового реципиентного штамма E.coli для термоиндуцибельной экспрессии в системе транскрипции фага X. Биотехнология, №1-2, с. 11-18
-
Скороходова, Александра Юрьевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.03
- Разработка и использование методов направленной модификации целевых генетических локусов хромосомы E. coli при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот
- Кинетическое моделирование центрального метаболизма Escherichia coli
- Математическое моделирование индуцированного мутационного процесса в клетках Escherichia coli при действии ультрафиолетового излучения
- Изучение генов, контролирующих усвоение гуанина, ксантина и гипоксантина, и их влияние на выражение Rel-контроля в клетках Escherichia coli K-12
- Природа геномных перестроек, обусловливающих усиление экспрессии гена уридинфосфорилазы у ESCHERICHIA COLI
