Совершенствование технологии получения инактивированных антирабических вакцин

Иванов, Игорь Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование технологии получения инактивированных антирабических вакцин
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование технологии получения инактивированных антирабических вакцин"

Иванов Игорь Викторович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННЫХ АI ГШ РАБ И Ч Е С КИХ ВАКЦИН

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

06.02.02 -ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАЙ 2011

4846114

На правах рукописи

Иванов Игорь Викторович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННЫХ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВАКЦИН

03.01.06 - биотехнология (в том числе бнонанотехнологии)

02.02 -ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Матвеева Ирина Николаевна

Научный консультант:

доктор технических наук Нежута Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Клюкина Валентина Ивановна

доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» РАСХН

Защита состоится 13 мая 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142,Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, ВНИТИБП; д. 17, e-mail: vmtibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН

Автореферат разослан 12 апреля 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХЛ l'A KT Е I' 11CTI11С А РАБОТЫ 1.1.Лктуал1,ност1, темы. Несмотря на значительный прогресс » изучении свойств возбудителя п важнейших проблем диагностики, эпизоотологии п специфической профилактики, бешенство животных, по-прежнему характеризуется глобальной распространенностью (Ведерников В. А., 19872009 гг.; Сидоров Г.Н. 1995-2004 гг.).

Использование при разработке новых и совершенствовании существующих промышленных биотехнологии производства биопрепаратов с применением современного высокопроизводительного оборудования и

высокоспецпфпческих иммунобиологических методов способствует повышению их эффективности, а следовательно, и улучшению эпизоотической, экологической и социальной обстановки в Российской Федерации (СамуГшсико А.Я., Рубан Е.А., 2000).

Повышение качества биологических препаратов к эффективности их производства с осуществлением технического и технологического перевооружения является актуальной задачей. При этом необходимо повысить надежность и экологическую безопасность работы предприятий. Внедрение новых и существующих технологий при промышленном производстве биопрепаратов требует решения не только технологических, но и экономических вопросов (Красуткин С.] 1.,2002).

Изучением проблем производства аптирабических препаратов занимались и занимаются многие исследователи как в России, так и за рубежом (Селимов М.А., 1978; Черкасский Б.Л., 1984, 1985; Бучпев K.M. и др. 1985; Кузнецова C.B., Сухарев О.И., 1991; Хрипунов Е.М.н др., 1998; Гусев A.A., Панин А.Н., 1998; Равилов А.З. и др., 1999; Кузнецов П.П., 1978-2000; Нагаеннгхе К.Д.С.,2000; Иванов B.C., 1978-2010; Макаров В.В. 2002; Гулюкпи М.И.,2002; Ботвпнкин А.Д.,2004; Рыбаков С.С., Мстлим А.Е.,2009; Сафонов Г.А.2011; Shill M., Bayncs R.D., Miller S.D., 1987; Uliaa I.J., Dato V.M., Sorliage F.E., 1982; Pastoret P.P., 2002; Brookcss V., Parsons G. et al. 2005; Hanion S.A., ICuzmin I.V., et al.2005)

Повышение эффективности производства биопрепаратов, в том числе антирабичсских вакцин является актуальной задачей XXI века.

1.2. Цель н задачи исследовании. Целью данной работы явилось совершенствование технологии производства ппакшвпровапных антирабичсских вакцин.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отработать технологический режим культивирования клеток и вируса бешенства штамм «Щслково-51» в промышленных бпорсакторах.

2. Изучить иммунобиологические свойства вируса бешенства, полученного в промышленных бпорсакторах суспензионным п псеидосуснензионпым способами.

3. Разработать технологию изготовления жидкой пиактивпрованиой антирабпческой этанол-вакцины для кошек и собак.

4. Разработать технологию изготовления сухой пиактивпрованиой антирабпческой вакцины для крупного н мелкого рогатого скота.

1.3. Научна» новизна. Впервые в РФ отработаны технологические режимы суспензионного и несвдосуснензпонпого культивирования клеток ВНК-21 и вируса бешенства штамм «Щелконо-51» для промышленного производства антирабичсских вакцин.

Впервые разработана пнактпвпровапная антпрабпчсская жидкая этанол-вакцина для кошек и собак, на основе вируса бешенства штамма «Щслково-51», репродуцированного в культуре перевиваемых клеток ВНК-21, включающая гидроокись алюминия (ГОА) и этанол (Патент РФ № 2366457 от 10 сентября 2009 г. «Вакцина антпрабпчсская для животных »).

Впервые разработана ппактпвированная антпрабпчсская сухая вакцина для крупного и мелкого -рогатого скота, на основе вируса бешенства, штамма «Щслково-51», включающая защитную среду высушивания па основе ней гона, сахарозы и желатина, гидрат окиси алюминия, а также стимулятор иммунитета сапонин (Патент РФ № 2402348 от 27 октября 2010 г. «Вакцина антпрабпчсская сухая для крупного п мелкого рогатого скота»),

1.4. Практическая значимость работы. Усовершенствована промышленная технология изготовления пиактнвпрованиых вакцин против бешенства животных in нггамма «Щелково-51».

Результаты исследований и технологические решения вошли в следующие нормативно-технические документы, которые рассмотрены и утверждены в установленном порядке:

1. Регламент на опытно-промышленное производство ннактпвнровапной ' антпрабической жидкой 'шшол-вакцнпы из штамма «Щелково-51» для

кошек н собак, утвержденный директором ВНИТИБП 20.09.2009 г.

2. Инструкция но применению инактпвпроваипоГг антнрабпческоп жидкой

уганол-вакцппы из штамма «Щелково-5 1» для кошек и собак, утвержденная директором ВНИТИБП 20.09.2009 г.

3. Лабораторный регламент на производство инактивнровапной аптпрабпческой сухой вакцины из штамма «Щелково-51» для крупного п мелкого рогатого скота, утвержденный директором ВНИТИБП 22.10.2010 г.

4. Инструкция но применению пиактивнрованнон антнрабпческоп сухой вакцины пз штамма «Щелково-51» для крупного и мелкого рогатого скота, утвержденная директором ВНИТИБП 22.10.2010 г.

1.5. Основные положен»», выносимые на защиту

-Отработка технологических режимов культивирования клеток и вируса бешенства штамм «Щелково-5 1» в промышленных реакторах. -Изучение иммунобиологических свойств вируса бешенства, полученного суспензионным и пссвдосуспепзпоипым способами.

-Разработка технологии производства инактивпронанной антпрабической жидкой этанол-вакцины пз штамма «Щелково-51» для кошек н собак. - Разработка технологии производства нпакгпннрованнон антпрабической сухой вакцины пз штамма «Щелково-51» для крупного и мелкого рогатого скота. -Оценка безвредности н иммуногеппости разработанных пнактпвпрованных вакцин.

1.6. Апробация работы. Ма териалы диссертации доложены:

- на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП, Щелково, 1998-2010 гг.;

- на Международной научно-практической конференции: «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными экзотическими п зооантропо-нозными болезнями животных», Покров, 2000 г.;

- на Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ, Покров, 2008 г.;

- на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 1998,2000,2005,2007,2009 тг.

1.7. Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикации материалов диссертаций. Получены 2 Патента РФ па изобретения.

1.8.Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 100 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы п данные о практическом использовании научных выводов, список использованной литературы включает 133 источника, в том числе 89 отечественных и 44 зарубежных. Работа содержит 13 таблиц, 4 рисунка, 6 страниц приложений.

1.9. Личный вклад. Основная часть диссертационной работы выполнена автором самостоятельно. Отдельные опыты проведены с участием специалистов ФГУ «Щелковский биокомбпнат» (Красуткпп С.П.), сотрудников отдела противовирусных препаратов ВНИТИБП (Пухова II.М., Лебедько E.H.), сотрудника ФГУ ВГНКИ (Елаков Л.Л.) - за что автор выражает им искреннюю благодарность.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена п 1998-2010 it. и отделе противовирусных препаратов ГНУ ВННТИБГ1 » рамках Российской ПТП (фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению ЛПК РФ а соответствии с планами МНР и ОКР ГПУ ВППТПБП, задание 08.06.01.03. «Разработать препараты и технологии их изготовления п применения для экстренной защиты животных от вируса бешенства па уровне центральной нервной системы»; задание 08.06.01. «Разработать новые диагностические тест-системы и комплексные лсчебно-профилактпческне препараты 'жопомпчеекп значимых инфекционных заболевании животных».

2.1. Материалы н методы 2.1.1. Вирусы. В работе использовали фиксированный вирус бешенства штамм «Щелково-51», для заражения мышеи - штамм «CVS».

2А.2.Пипшшельиые среды и растворы. Использовали стандартные культуральные среды Игла, 199, гпдролпзат лактальбумппа на растворе Эрла (ГЛАЭ) или Хснкса (ГЛАХ), полученные из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов, а также приготовленные в отделе культивирования клеток и вирусов, п в отделе питательных сред п растворов ГНУ ВНИТПБП в различных модификациях; трипсин фирм «Merk»., «Fhnca» в солевых буферных растворах разного состава; гпдролпзат лактальбумппа. Сыворотку крови крупного рогатого скота без консерванта получали с заводов медпрепаратов и мясокомбинатов (г. Москва), сыворотку телят и фетальпую сыворотку нз ООО «БИОЛОТ» (Санкт-Петербург), НПП Института полиомиелита н вирусных энцефалитов РАМП п (фирмы «Sigma». Фосфатный буферный раствор (ФБР) в различных модификациях, раствор Версеиа ¡■отопили но стандартным методикам.

2.1.3. Культуры клеток. Использовали паспортизированную культуру клеток почки серийного хомячка ВНК-21.

2.1.4. Животные. В качестве подопытных животных использовали клинически здоровый крупный рогатый скот массой 250-300 кг, овец, коз, беспородных белых мышей массой 10-12 г, собак, кошек.

2.1.5. Технологическое оборудование и технологические средства.

Использовали ферментеры емкостью 5, 25, 100, 250 л для культивирования клеток в суспензии или на микроносителях, разработанные ГНУ ВНИТИБП и НИИХиммашсм (г. Иркутск), с магнитным приводом, модулем технологическом обвязки ферментеров с механическим, электрическим и пневмоприводом клапанов, системой контроля и регулирования технологических процессов; газовый стерилизатор питательных сред ЕТО фирмы Pharmalec (Германия), еннннеры магнитного типа с блоком управления (I, pH, рСЬ, рССЬ) фирмы Bélico Biotechnology (США), установку для исследования клеточной культуры фирмы Pharmatcc (Германия), счетчик колоний клеток «Bacformic» фирмы NBS (США), сосуды Дыоара фирмы Forma Scientific, Ins (США) и микроносители Cylodcx-2,3 Щвсция, цптолар (НПО «Бполар», г. Олайнс) и ВИ-3, изготовленный во ВНИТИБП.

В процессе суспензионного культивирования клеток н вируса автоматически контролировались и регулировались основные физико-химические параметры - температура (tk), pH, рСЬ, рССЬ, сН и температура стерилизации биореактора, арматуры и трубопроводов, окислнтсльно-восстановнтельный потенциал, парциальное давление кислорода и углекислого газа в жидкости, концентрация водородных ионов, давление п вакуум.

2.1.6. Методы. На разных этапах работы применяли физико-химические,

вирусологические и иммунологические методы исследований.

Иифекциопиость определяли титрованием - внруссодсржащсго материала

на белых мышах массой 10 - 12 г. Для этого готовили 10 - кратное разведение

исследуемого материала на растворе Хенкса и заражали 5-7 белых мышеи

пнтрацсрсбрально в дозе 0,03 мл. Наблюдение за животными проводили в

течение 14 суток. Погибшими от бешенства считали тех животных, смерть

которых наступала после 5 - го дня заражения с проявлением клинических

признаков бешенства. Тигр вируса рассчитывали по методу Рида п Мсича и выражали в lg ЛД^/мл.

Иммунол'шюсшь вируееодержащего материала определяли методом N111 на мышах против стандартного вируса бешенства, штамм «CVS» и относительно международною вакцинного стандарта, полученною из лаборатории биологических стандартов, Дания, г. Копенгаген и выражалась индексом пммупогепностп плп в международных единицах (МП).

Определение иммуногеииоенш ашнираоических (¡акции. Эффективность ноствакцнналыюго иммунитета оценивали по выживаемости животных, зараженных в мозг вирусом бешенства штамм «CVS» и но уровню внруснсйтралпзующей активности антител н их крови, определяемой в реакции нейтрализации.

Определение в реакции нейтрализации (РН) вирусиейтралту/тцен активности сыворотки крови вакцинированных животных. Изучаемые образцы сыворотки прогревали 30 мни при 56° С., затем готовили ряд двукратных разведений на растворе Хенкса или па фосфатно - буферном растворе и смешивали её с равным объемом вируса бешенства штамм «CVS», с таким расчетом, чтобы в смеси его оказалось 50 - 300 ЛДзд/0,03 мл-Полученную смесь инкубировали при 37° С в течение 60 мин. и вводили нитрацерсбралыю белым мышам в объеме 0,03 мл. Для каждого разведения брали 5 - 6 мышей. Наблюдение за животными проводили в течение 21 суток. Одновременно с испытуемой сывороткой титровали антпрабичсскую рефсрсис - сыворотку с активностью 20 МЕ/мл (13ГПКН). Методом Рида и Мсича рассчитывали наивысшие разведения испытуемой и реферснс - сыворотки, обеспечивающие выживание 50 % мышей от гибели (ЭД5ц). Затем результат, полученный от деления ЭД5и испытуемой сыворотки на ЭД?о реферснс -сыворотки, умножали на показатель активности в МЕ/мл реферснс - сыворотки и получали выражение вируснейтрализующеп активности испытуемой сыворотки в МЕ/мл.

2.1.7. Статистическая обработка. Результаты исследований статистически обрабатывали в соответствии с методами, описанными в работах И.П. Ашмарина и др. (1962}, H.A. Плахинското (1970), Е.В. Гублсра (1978). Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стыодснта. Результаты считали достоверными при Р<0,05.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Отработка технологических режимов культивировании клеток в

промышленных реакторах

В настоящее время возрастает интерес к перевиваемым линиям клеток

(ПЛК), которые изучаются, прежде всего, в аспекте применения их для производства вакцин. В 1998 т. эксперты ВОЗ провели анализ материалов, касающихся использования клеточных субстратов для изготовления биологических препаратов п пришли к выводу, что наиболее полно современным требованиям безопасности п технологичности отвечает ПЛК.

Были определены наиболее важные технологические параметры суспензионного культивирования клеток в бпорсакторе, динамику их отклонения и поддержания оптимальных значений при репродукции вируса бешенства способом управляемого культивирования.

Культивирование клеток ВНК-21 проводили в бпорсакторах на микроносителях с использованием питательных сред различного состава, с добавлением сывороток крови крупного рогатого скота. Пссвдокультивироваипе проводили с использованием микроносителей в бессывороточной среде.

Концентрация цитодскса не превышала 1 мг/мл. Посевная концентрация клеток и условия культивирования на микроносителях в первые часы определяли оптимальные параметры для пролиферации и максимального накопления клеток. Было показано, что посев 105клеток/мл в уменьшенном объеме (до 1/3) ннтателыюй среды и при периодическом включении мешалки (40 об/мин) па одну минуту через каждые полчаса в течение 3 часов, с

последующим добавлением питательной среды до полного объема (до 100 л) увеличивало пролиферацию клеток и их количество по сравнению с контролем (полный объем питательной среды в момент посадки клеток п непрерывная работа мешалки).

В биореакторе при культивировании поддерживали следующие основные параметр!,I культивирования клеток: температуру инкубирования, рП, р02, pCOi, концентрацию СО: в газовой смеси, расход воздуха, ell, число оборотов н время культивирования.

Температура регулировалась при включении автоматического устройства тсрмостатнровапия и клапана термостатированной воды. Расход газовой смеси воздуха плюс углекислоты производили но одноконтурной схеме управления. Значение рН культуралыюй жидкост и регулировали изменением концентрации СОт во входящей в биореактор газовой смеси по двухкоптурнон схеме управления. Сигнал подавался на регулирующий ппевмоклапаи, установленный па трубопроводе СО?.

Включение регулирования рН осуществляли регулятором р02 либо самостоятельно в зависимости от расхода газовой смеси. Регулирование рОт культуралыюй жидкости производили переключением исполнительных механизмов.

Давление в бнорсакторс регулировалось специальными устройствами. Отработали технологические режимы, обеспечивающие максимальное выращивание клеток. При этом поддерживались следующие режимы: температура 37,5+0,5° С; рН 7,3+1; скорость перемешивания 50+10 об/мин; концентрация растворенного кислорода рО? 50+25%, концентрация растворенной углекислоты рС02 25+10% насыщения; окислительно-восстановительный потенциал еН 20+10 мВ.

В результате в суспензии концен трация клеток BI IK-21 доходила до 1,5 млн. кл. в мл, на микроносителе - 350-440 кл. па одной частице в течение 72 часов культивирования.

2.2.2. Изучение иммунобиологических свойств вируса бешенства, полученного суспензионным и нсспдосуспсизнопнмм способами

Нами проведены исследования по изучению активности вируса бешенства при культивировании в биорсакторах суспензионным и исевдосуспензионным (на микроносителях) способами с использованием культур клеток ВНК-21.

Высокие показатели активности вируса бешенства при суспензионном и пссвдоеуспспзпоппом культивировании на культуре клеток ВНК-21 в промышленных реакторах были получены при использовании различных методов, широко применяемых в вирусологии. Так, в ПФА вирус бешенства обладал активностью 1:512. Вирус бешенства имел стабильную способность накапливаться в суспензии клеток ВНК-21 до 6,8-7,0 lg ЛДед /„.„ в отдельных опытах до 7,4-8,0 lg ЛД5(Ьш.

Накопление инфекционное™ вируса бешенства зависело от инфицирующей дозы (0,1 -0,5lg ЛД50 .клетку) и количества клеток (7-8x106 клеток на 1см3 микроносителя), а также времени культивирования (4-5 суток). Сбор впруссодержащен культуральной жидкости проводили па 5 и 6 сутки культивирования. Вирус бешенства, полученный суспензионным и иссвдосуспспзпонном способами, ппактпвпроваппый р-пропнолактоном, защищал иммунизированных мышеи от заражения стандартным вирусом бешенства штамм «CVS».

Иммупогсшюсть вируса бешенства, полученного на 5-6 сутки культивирования, составила 2,7-2,9 МЕ/мл. В целом исследования показали, что разработанная технология культивирования вируса бешенства позволяла получать вакцинное сырье для изготовления ииактпвированных вакцин с нммуногенностыо более 2,5 МЕ/мл.

2.2.3. Разработка технологии изготовлении жидкой ипактнппропапной антпрабическоп этапол-вакцнпы дли кошек и собак

Нами разработана технология изготовления пнактпвпрованпой жидкой вакцины, отличительной особенностью которой является то, что в ее состав входит впруссодержащая культуральная жидкость, содержащая пнактнвпроваиный

вирус бешенства штамм «Щелково-51», репродуцированный в культуре перевиваемых клеток B1IK-2I п гидроокись алюминия (ГОА). Вакцина дополнительно содержит в своем составе этанол, при следующем соотношении компонентов (масс. %):

-вируссодержащая культуральиая жидкость, содержащая пнактнвпрованпый вирус бешенства штамм «Щелково-51» - 70-80; -этанол- 9-1 1;

-гидроокись алюминия - остальное.

Анализ данных, приведенных в таблице 1, показал, что этанол в концентрации 9-11% предохраняет жидкую вакцину от бактериального пророста в течение 14 месяцев при температуре хранения 6-10" С (табл.1). В данных условиях предлагаемая вакцина более защищена от случайных контамннантов по сравнению с известной (жидкая инактивированная вакцина из штамма «Щслково-51» с гидроокисью алюминия).

Таблица 1

Результаты исследования жидких антирабпческнх вакцин

Температурадрапспня вакцин (С1) 6-10°С 15-25"С 36-37 °С

Срок храпения ( мееяцеи) 14 6 2

11рсдлатасмая вакцина 9% этанола K-iso флаконои и оньпе 500 300 200

К-но флаконои с микробным проростом 0 1 3

1 0% этанола К-но флаконои is опыте 300 300 200

K-iso флаконои с микробным проросюм 0 0 0

11% этанола К-но флаконов >s оньпе 400 400 200

К-но флаконов е микробным пророетом 0 0 0

Ишсстпая без этанола К-но флаконов в оньпе 500 200 200

вакцина К-во флаконов е микробным пророетом 32 172 200

Вакцина безопасна в применении и обладает большей иммуногснностыо в сравнении с известной, повышает антптелонндуцирующую активность и, следовательно, защищенность животных от заболевания бешенством (таблица 2).

Таблица 2

Результаты исследования вируснейтрализующей активности сывороток крови животных

Вмруснсйтралнзующая а| мшносп» сынорогок крови сиво'шых ( МГ. мл

Иммунизация известной вакциной Иммунизация предлагаемой вакциной

Сыворотка собак Собак Сыворотка котят Сыворотка собак Сыворотка котят

№ До Через До Через До Через До Через

п/п вакци- 30 дней п/п вак- 30 дней п/п вакци- 30 дней п/п вакци- 30 дней

нации. п/в ци- ц/в нации п/в нации п/в

нации

1 0 1,4 1 0 0,63 4 0 2,5 4 0 1,8

2 0 1,24 2 - 0,37 5 - 3,4 5 0 2,2

3 - 1,07 3 - 0,41 6 0 2,7 6 - 1,7

Согласно представленным в таблице 2 данным, предлагаемая антирабическая вакцина обладала для наиболее опасных для человека животных (собак и кошек) большей антитслонндуцпрующей активностью, чем известная вакцина без этанола. Поэтому предлагаемая вакцина с большей надежностью будет защищать животных п, как следствие этого, человека от бешенства.

Таким образом, представленные результаты указывают на перспективность использования этанола в качестве консерванта жидких инактивированных антнрабичееких вакцин из штамма Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21. Включение в состав вакцины этанола исключает необходимость применения антибиотиков, тиомерсала и других не безвредных в индивидуальном и экологическом плане консервантов.

2.2.4. Разработка технологии изготовлении сухой ипактнвпровапной

лптпрабпчсскои иаккнпм дли крупного н мелкого рогатого скота

Разработка технологии изготовления вакцины включала: культивирование инфицированных вирусом бешенства, штамма «Щслково-51», клеток ВНК-21 пссвдосуепензпоипым (на микроносителях Цитодскс 2) способом. Сбор впруссодсржащей культуральной жидкости проводили через 96 и 120 часов культивирования. Было получено по три серии внруссодсржащсго материала, часть которого использовали для изготовления новой вакцины и известного состава.

Новую вакцину получали следующим образом: охлажденную до 4°С внруссодсржащую жидкость инактивировалп р-проиполактоном в 0,025% концентрации и через 2 часа добавляли 6%-иын гидрат окиси алюминия. Смесь перемешивали при 8-10°С в течение 24 часов н удаляли из нее надосадочную жидкость, а к остатку смеси добавляли стерильную среду высушивания, представляющую собой водный pací вор пеп тона (9-10%) и желатина (2,7-3,0%). В приготовленную смесь вносили 10%-ный водный раствор сапонина, адъювантная активность которого в составе аптирабичсских вакцин на крупном и мелком рогатом скоте проявлялась в пределах 1,5-3,0 мг/дозу. В результате получали серию жидкой вакцины, содержащую 1,0 мг/мл сапонина и 10% гидрата окиси алюминия 6%-ой концентрации с адсорбированным на нем вирусом бешенства штамм «Щелково-51».

Для изготовления известной вакцины использовали тот же вирус и компоненты, что п для изготовления новой вакцины, только без включения ГО А.

Приготовленные серии жидких вакцин разливали по 10 мл во флаконы объемом 20 см3 и подвергали сублимационной сушкс. Вакцины до и после высушивания исследовали по N111 с цслыо оценки их иммуногснности, которую выражали в международных единицах (ME).

В результате проведенных исследований разработали промышленную технологию изготовления вакцины антирабичеекон сухой для крупного п мелкого рогатого скота, которая в своем составе содержит антнрабнческий антиген, среду культивирования, защитную среду высушивания на основе пептона, сахарозы и желатина, а также стимулятор иммунитета сапонин, при следующем соотношении компонентов (мас.%): гидрат окиси алюминия с адсорбированным инактивированиым вирусом бешенства - 6,0-9,0; сапонин -0,75-1,5;пептон 30,0-33,0; сахароза - 35,0-37,0; желатин - 9,0-10,0; среда культивирования - остальное.

Масса сухой вакцины составляет 10% от массы жидкой вакцины, получаемой при восстановлении сухой вакцины до первоначального объема стерильной дистиллированной водой.

Сухая антнрабическая вакцина, в комплексе с адсорбированным на гидрате окиси алюминия инактивированиым вирусом бешенства, была испытана на иммуногенность в опытах на белых мышах (табл.3).

Таблица 3

Результаты исследования иммуногснностп аптпрабнчсских вакцин

№ Иммуногенность вакцин, МН/мл Сохраняемость после

серии высушивания, %

вакцин Жидкая Сухая Сухая Сухая Сухая

новая новая ичвестная новая швестная

I 3,6 3,4 2,6 94,4 72 2

2 4,2 4,05 3,5 96,4 83,3

3 4,8 4,5 3,3 93,7 68,7

Как видно из таблицы 3, вакцина нового состава обладала большей иммуногенностыо, до и после высушивания, в отличие от известной вакцины, иммуногенность которой снижалась после высушивания на 16,731,3%.

Новую вакцину с иммуногснностыо 3,4 МЕ/мл н известную вакцину с активностью - 3,5МЕ/мл использовали в опытах на крупном рогатом скоте (табл.4). Сухпс вакцины вводили телятам массой 230-260 кг однократно, подкожно в область шеи в дозе 2,0 мл.

До вакцинации, через 45 и 350 диен после нес от животных получали сыворотки крови и исследовали в реакции нейтрализации против международной стандартной рефсренс- ангнрабпческой сыворотки.

Таблица 4

Впруснснтрализующая активность сывороток крови крупного рогатого скота

Препараты № жинотпо- Активность сывороток крови, МН/мл

До вакцинации через 45 диен после вакцинации через 350 лисп после вакцинации

1 0 44,1 22,50

! 1овая вакцина 2 0 34,8 19,82

3 0 54,0 20,95

4 0 34,2 11,98

5 0 55,1 13.60

6 0 33,5 16,78

1 0 24,5 10,82

Известная вакцина 2 0 15,3 6.58

3 0 13,5 3,57

4 0 13,7 4,50

5 0 10,2 2,67

6 0 21,0 10,96

Представленные в таблице 4 данные свидетельствуют, что уровень вируснеитралпзующсн активности сывороток, взятых на 350 день после вакцинации, у животных, привитых новой вакцинами, был в 2-3 раза выше, чем у животных, вакцинированных известной.

У всех животных впруспсптралпзуютцая активность сывороток составила более 0,5 МЕ/мл, признанной ВОЗ достаточной для защиты

животных и человека от бешенства (8-й доклад экспертов ВОЗ по бешенству, Женева. 1994).

Результаты испытания новой вакцины в остром опыте на овцах и козах представлены в таблице 5.

Таблица 5

Иммуногснность новой антпрабичсской вакцины в опытах па овцах и козах

Вид животного № животного п=4 Активность сывороток крови МК/мл Результат нптрацерео-рального заражения животных фиксированным вирусом бешенства в дозе 20-30 овечьих ЛД»

до вакцниацнн через 35 дней после вакцинации, МН/мл через 14 диен после повторной вакцинации

Овцы, вакцшш-рованные подкожно в дозе 2 мл 1 0 24,2,±0,05 87,0+0,05 не заболела

2 0 33,8+0,04 65,0+0,03 не заболела

3 0 23,1+0,01 48,0+0,04 не заболела

Козы, вакцинированные подкожно в дозе 2мл 4 0 26,2+0,02 40,0+0,02 не заболела

5 0 34,5+0,01 63,0+0,03 не заболела

Как видно из представленных в таблице 5 данных, новая вакцина способна защищать животных от гибели при введении вируса бешенства в мозг в дозе 20-30 овечьих ЛДвд, значительно превышающих летальную. Невакцинированные овцы и козы (контрольная группа), при пнтрацеребралыюм заражении фиксированным вирусом бешенства в дозе 20-30 ЛД50 пали на 5-8 день.

Таким образом, гидрат окиси алюминия, включенный в состав сухой антирабичсской вакцины, в комплексе с адсорбированным на нем вирусом бешенства, повышает иммуногенные свойства препарата и удлиняет срок циркуляции в кровеносном русле животных ноствакцппальных антител с активностью 0,5 МЕ/мл, которая считается достаточной для защиты животных и человека от бешенства (8-й Доклад экспертов ВОЗ по бешенству, Женева,1994). Применение повой вакцины позволило более эффективно защищать от вируса бешенства крупный и мелкий рогатый скот.

3. ВЫВОДЫ

1. Разработан технологический режим промышленного суспензионного и пссвдосуспензионного культивирования клеток ВНК-21 в бпореакторах с поддержанием оптимальных основных параметров: температура 37,5+0,5° С; рН 7,3+1; скорость перемешивания 50+10 об/мин; концентрация растворенного кислорода р02 50+25%, концентрация растворенной углекислоты рСОг 25+10% насыщения; окислительно-восстановительный потенциал сН 20+10 мВ.

2. Методом суспензионного п пссвдоеуспснзионного культивирования вирус бешенства имел стабильную способность накапливаться до 6,8-7,0 1ц ЛД5о ли,. Накопление пнфскцнонностн вируса бешенства зависело от инфицирующей дозы, количества клеток и времени культивирования.

3. Разработанная технология культивирования вируса бешенства позволила получать вакцинное сырье для изготовления сухих ннактивнрованных вакцин с пммуногенностыо выше 2,5 МЕ/мл.

4. Разработана технология изготовления жидкой инактивирован-ной антирабичсской вакцины с содержанием геля гидроокиси алюминия и этанола. Содержание в вакцине этанола предохраняло ее от бактериальной контаминации; повышало ее аптителопидуцнрующую активность для целевых животных (собак и кошек) п, следовательно, их защищенность от заболевания бешенством.

5. Разработана технология получения сухой вакцины для крупного и мелкого рогатого скота, содержащей гидрат окиси

алюминия, защитную среду на основе пептона, сахарозы и желатина, стимулятор иммунитета сапонин. Включение в состав вакцины гидрата окиси алюминия позволило сохранять при сублимационном высушивании иммуногенную активность рабического антигена, удлинить срок циркуляции в сыворотке крови крупного рогатого скота после вакцинации вируснейтрализующих антител с активность более 0,5 МЕ/мл, признанной ВОЗ достаточной для защиты животных и человека от бешенства.

П Р АКТ И Ч ЕС К И Е П Р Е ДЛ ОЖ Е11ИЯ

Результаты исследований использованы при разработке технологии биопрепаратов и включены в следующие нормативные документы:

1. Регламент на опытно-промышленное производство инактивнрованной

антирабической жидкой этанол-вакцпны из штамма «Щелково-51» для кошек и собак, утвержденный директором ВНИТИБП 20.09.2009 г.

2. Инструкция по применению инактивнрованной антирабической жидкой

этанол-вакцины из штамма «Щелково-51» для кошек и собак, утвержденная директором ВНИТИБП 20.09.2009 г.

3. Лабораторный регламент па производство инактивнрованной антирабической сухой вакцины пз штамма «Щелково-51» для крупного и мелкого рогатого скота, утвержденный директором ВНИТИБП 22.10.2010 г.

4. Инструкция по применению инактивнрованной антирабической сухой вакцины из штамма «Щелково-51» для крупного и мелкого рогатого скота, утвержденная директором ВНИТИБП 22.10.2010 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кузнецов П.Г1. Нш нбирующее действие антирабнчсских антител на развитие посгвакцииалыюго иммунитета против бешенства / Кузнецов П.П., Пухов В.А., Иванов 11.15., Иванов B.C. // Матер. Всероссийской конф. научно-практ. конф. Ч. I «Научные основы технологии промышленного производства вст. биол. препаратов». - Щелково. -1998. -С. 29-30.

2. Тстсричсв В.II. Основные протпво'лшзоотнчсскис меры борьбы с бешенством в Тульской области / Тстсричсв В.П., Самуйлснко А.Я., Иванов II.В., Бирюков А.Г., Иванов B.C. // Доклады Вссрос. научно-нракт. конф.: 20-21 июня 2000 т.- Ставрополь.-С. 54

3. Тстсричсв В.И. Проявление нммуногенной потенции антирабнчсскон вакцины из штамма «Щслково-51» в зависимости от места се введения / Тстсричсв В.II., Самуйлснко А.Я., Иванов И.В., Иванов B.C. // Доклады Вссрос. научно-практ. конф. «Научные основы технологии промышленного производства вст. биол. препаратов». - Щелково. -2000. -С. 33-36.

4. Иванов И.В. Антпрабичсская вакцина для крупного рогатого скота «1'АБАВАК» и ее нммуногснпость / Иванов И.В. // Доклады Вссрос. научно-нракт. конф.: «Научные основы технологии промышленного производства вет. биол. препаратов». - Щелково. -2005. -С.94-96.

5. Иванов И.В. Применение специфических и нсспецнфнчсских препаратов при защите центральной нервной системы животных от вируса бешенства/ Иванов И.В., Иванов B.C., Лсбсдько Е.И.. // Мат. Межд. научно-практ. конф. (20-21 декабря 2007 г.).- Щелково 2007,- С. 90-95.

6. Лсбсдько E.H. Применение специфических и нсспецнфнчсских препаратов при защите центральной нервной системы животных от вируса бешенства /Лсбсдько Е.И., Иванов II.В., Иванов B.C., Масимов H.A. // -Ветеринарная медицина,- 2008,- №2-3- С. 17-19.

7. Самуйлснко А.Я. Псрспсктины использования этанола в качестве консерванта и ннактиватора при производстве антирабнчских вакцин/ Самуйленко А.Я., Иванов И.В., Садов Д.А., Красуткпн С.Н., Пухова Н.М., Елаков А.Л., Иванов B.C. //Труды Мсжд. научно-практ. конф. посвящ. 50-летию ВНИИВВнМ,- Покров.-2008.-С. 154-157.

8. Салов Д.А. Иммуногенность отечественной ннзкодозной жидкой антирабической вакцины, «УНИРЭВ» в процессе хранения/ Салов Д.А., Иванов B.C., Лебедько Е.И., Пухова И.М., Иванов И.В., Беро И.Л.// Мат. Межд. научно-практ. конф.: «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, посвященной 40-летшо Всероссийского научно -исследовательского и технологического института биологической промышленности». - Щелково.- 2009.- С. 175-179.

9. Иванов B.C., Патент РФ «Вакцина антирабичсская для животных » / Иванов B.C., Иванов И.В., Самуйлснко А.Я., Красуткпн С.И., Пухова Н.М., Салов Д.А., Елаков А.Л. № 2366457.10.09.2009. Бюл. № 25-С.729.

10. Иванов B.C. Патент РФ «Вакцина антирабичсская сухая для крупного и мелкого рогатого скота» / Иванов B.C., Иванов И.В., Самуйленко А.Я., Красуткин С.Н., Киш Л.К., Пухова Н.М., Беро И.Л., Боровой В.Н., Мельник П.В., Еремец Н.К. № 2402348. 27.10.2010. Бюл. № 30.-С.400.

Отпечатано в ООО "Мещёра", г. Щёлково, ул. Свирская, д. Тираж 100 экз. Заказ № 336