Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сообщество культивируемых аэробных микроорганизмов сточных вод совместного производства стирола с окисью пропилена

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сообщество культивируемых аэробных микроорганизмов сточных вод совместного производства стирола с окисью пропилена"

На правах рукописи

ДАО ТХИ ТХУИ ЛИНЬ

СООБЩЕСТВО КУЛЬТИВИРУЕМЫХ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ СТОЧНЫХ ВОД СОВМЕСТНОГО ПРОИЗВОДСТВА СТИРОЛА С ОКИСЬЮ ПРОПИЛЕНА

03.02.03 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 НОЯ 2014

Казань-2014

005554556

Работа выполнена на кафедре микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет"

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор,

академик АН РТ

Ильинская Ольга Николаевна

доктор биологических наук, член-корреспондент Российской Академии Естествознания Дегтярева Ирина Александровна (Государственное научное учреждение Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Россельхозакадемин, заведующий лабораторией агроэкологии и микробиологии)

кандидат биологических наук, доцент

Зарипова Сания Кашафовна

(ФГБОУ ВПО «Казанский национальный

исследовательский технологический университет,

г. Казань, заведующий комплексной лабораторией

«Бионанотехнологии»)

ФГБУ Инст1ггут экологии и генетик?: микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится «25» декабря 2014 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" по адресу: г. Казань, ул. К. Марксу д. 74, Институт фундаментальной медицины и биологии в зале заседания ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" по адресу г. Казань, ул. Кремлевская д 35 ЗИ

Автореферат разослан «23» октября 2014г.

Ученый секретарь ^^Г^ч /у

диссертационного совета, У¿у ) / У

доктор биологических наук, профессор^-^7сА^^У^. И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. На сегодняшний день одной из главных экологических проблем является загрязнение окружающей среды углеводородами, которые в большей степени присутствуют в нефтехимических сточных водах (СВ) (Holliger et al., 1997; Mantis et al., 2005; Wake, 2005; Coelho et al., 2006; Das, Chandran, 2011). Одним из типичных промежуточных соединений нефтехимических производств является стирол, который, как правило, производится совместно с окисью пропилена (Кирпичников с соавт., 1986; Тимофеев, Серафимов, 2003). В ходе различных этапов производства стирола с окисью пропилена (ПСОП), таких как дегидратация, дегидрирование и окисление, образуются высоко загрязненные СВ. Данная СВ характеризуется высокой концентрированностью и содержит летучие токсичные соединения, такие как фенол, ацетофенон (АЦФ), метилфенилкарбинол (МФК) и бензол, а также нелетучие соединения, такие как монопропиленгликоль (МПГ), дипропиленгликоль (ДПГ) и пр. Следовательно, актуальной становится проблема очистки таких нефтехимических СВ перед сбросом в окружающую среду, чтобы не вызывать загрязнение рек, почв и воздуха (Stramgren et al., 1995; Chen et al., 1998b; Jerez Veguería et al., 2002; Chen et al., 2003). Биологическая очистка, как правило, является эффективным методом с низкой потребностью на операционные расходы (Shokrollahzadeh et al., 2008; Babaee et al., 2010; Chang et al., 2011). По этой причине был предложен процесс предварительной очистки СВ совместного ПСОП биологическим методом в биореакторе с использованием специализированных микроорганизмов, перед последующей очисткой активным илом. Этот подход считается наиболее перспективным для устранения вредных веществ во время предварительной обработки СВ (Erhan et al., 2004; Wasi et al., 2011; Park et al., 2013). Кроме того, на сегодняшний день данные о микробных сообществах, которые могли выдерживать экстремально высокие уровни химического потребления кислорода (ХПК) от 4000 до 16000 мг/л как в случае ПСОП, отсутствуют. Таким образом, идентификация микроорганизмов, ответственных за трансформацию углеводородов в данном биореакторе, является одной из важных задач фундаментальной микробиологии, изучающей метаболические пути, а также актуальна для практического применения.

Степень разработанности темы исследования. Исследования зарубежных ученых в области очистки СВ нефтехимических производств затрагивают микробные сообщества, развивающиеся при малых нагрузках по ХПК (Zhao et al., 2006), в большинстве проводятся в лабораторных условиях (Wang et al., 2011), а производство стирола представляет собой процесс, технологически отличный от Российского, и не являющийся совместным с производством окиси пропилена (Babaee et al., 2010). СВ совместного ПСОП открытого акционерного общества «Нижнекамскнефтехим» (ОАО «НКНХ») были исследованы только физико-химическими методами (Gayazova et al., 2013), или ограничивались интродукцией 1-2 штаммов, выдерживающих экстремально высокие уровни ХПК (Якушева с соавт., 2005). Разработка диссертационной темы начата на основе

предварительных экспериментальных данных, полученных в Казанском университете (Петров, 1995). При проведении лабораторного моделирования ранее использовали неидентифицированные микроорганизмы из различных ниш окружающей среды. В связи с этим остается актуальной задача изучения адаптированных к условиям ПСОП микробных сообществ, а также идентификации доминирующих аэробных бактерий с оценкой их потенциала в биоочистке. Эти исследования играют важную роль в оптимизации работы очистного сооружения и соблюдении экологической безопасности, которые обеспечиваются результатами настоящей работы.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в выявлении вклада микроорганизмов в снижение уровня загрязнения высококонцентрированной СВ совместного ПСОП, основанного на токсикологической характеристике системы очистки СВ, анализе структуры и функций микробного сообщества на последовательных стадиях очистки СВ.

В соответствии с поставленной целью работы решались следующие задачи:

1. Выявить степень токсичности СВ по отношению к растениям (Seeale cereale, Pisum sativum), простейшим {Paramecium caudatum) и бактериям, а также оценить генотоксичность СВ в тесте Эймса и umu-тесте;

2. Определить численность аэробных микроорганизмов на различных этапах очистки СВ совместного ПСОП, изолировать культивируемые группы аэробов и создать коллекцию выделенных микроорганизмов;

3. Выявить доминирующие изоляты бактерий в биореакторе очистки СВ совместного ПСОП и определить их видовую принадлежность, используя молекулярные методы;

4. Установить возможность использования основных компонентов СВ (гликоли, МФК, АЦФ, бензол, стирол, фенол, толуол) в качестве единственного источника углерода для роста доминирующих изолятов;

5. Охарактеризовать активность дыхания доминирующих изолятов на двухкомпонентных смесях на основе моноэтиленгликоля (МЭГ) и МПГ с другими компонентами СВ (гликоли, этанол, МФК, АЦФ, бензол, стирол, толуол).

Научная новизна. Результаты диссертационной работы впервые показали принципиальную возможность предварительной биологической очистки высоконагруженной по органике СВ совместного ПСОП. Выявлено, что не только содержание и уровень токсичности компонентов необработанной СВ но и структура сообщества культивируемых аэробных микроорганизмов определяет возможности биологической очистки данной СВ в биореакторе. Показано что численность культивируемых аэробных микроорганизмов в биореакторе достигала 6.85хК) колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл) в фазе активной деятельности микробного сообщества. Определено, что доминирующие гетеротрофные изоляты, выделенные из биореактора являются бактериями родов Citrobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Paracoccus, Stenotrophomonas, Raoultella Morganella и Lysinibacillus, и могут использовать основные компоненты данной СВ в качестве единственного источника углерода. Установлено, что гликоли и этанол могут стимулировать дыхательную активность микрофлоры биореактора,

и могут применяться в качестве косубстратов, тогда как летучие ароматические соединения оказывают ингибирующее действие на большинство изолятов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы позволяют решить насущные проблемы очистки и обезвреживания экстремально высококонцентрированных и высокотокскчных СВ, включающих экологически опасные соединения. Внедренная в ОАО «НКНХ» технология предобработки промышленной СВ совместного ПСОП обеспечивает снижение суммарной нагрузки по органике до 88%, что дает возможность поступления СВ после предобработки в общезаводскую классическую очистительную систему в аэротенках. Микрофлора биореактора является основой биологической очистки, она играет основную роль в устранении загрязнений, токсичности СВ и преодолении ряда факторов, определяющих неудовлетворительное состояние предобработки. Расшифровка структуры микробного сообщества - это ключ к созданию рациональной и функционально стабильной системы очистки, регулирование которой может осуществляться интродукцией целевых групп бактерий — компонентов сообщества. Таким образом, в случае остановки очистных сооружений или проведения профилактических мер, специалисты будут знать, какие микроорганизмы нужно выращивать в биореакторе, чтобы добиться максимальной эффективности очистки СВ. Кроме того, результаты проведенного ранжирования компонентов СВ совместного ПСОП по степени доступности и токсичности необходимо учитывать при направленном контроле над составом СВ, поступающих на установку предочистки. При этом целесообразно сокращать удельное содержание летучих компонентов, угнетающих рост и дыхательную активность микроорганизмов-деструкторов. Результаты проведенных исследований имеют значимое научное и прикладное значение и могут быть использованы при совершенствовании технологии очистки СВ нефтехимических производств.

Положения, выносимые на защиту:

1. Впервые охарактеризованы численность и таксономическая принадлежность аэробных микроорганизмов сообщества биореактора локальных очистных сооружений предварительной очистки высококонцентрированнон нефтехимической СВ совместного ПСОП;

2. Выявлена взаимосвязь между уровнем токсичности компонентов необработанной СВ совместного ПСОП, содержанием аэробных гетеротрофов и эффективностью предочистки в биореакгоре, определяемой доминирующими гетеротрофными изолятами родов Citrobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Paracoccus, Stenotrophomonas, Morganella, Raoultella, Lysinibacillus, Achromobacter, Brevi bacterium и Kocuricr,

3. В лабораторных условиях установлен синергетический эффект биотрансформации токсичных соединений СВ в двухкомпонентных смесях с использованием легкодоступного субстрата, предложены рекомендации для реализации разработки на локальных очистных сооружениях ПСОП.

Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается большим объемом многократных лабораторных экспериментов, выполненных и анализированных на современных приборах с высокой точностью;

опубликованием полученных данных в международном научном журнале спустя процесса рецензирования ведущими учеными в данной области; сопоставлением с новыми изучениями и апробированием возможности использования полученной коллекции микробного сообщества для очистки реальных СВ в полномасштабной установке в ОАО «НКНХ».

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на VI международном научном семинаре «Фундаментальные исследования и инновации» и Всероссийском молодежном научном семинаре «Наука и инновации -2011» (Йошкар-Ола, 2011); IV Международной научно-практической конференции "Европейская наука и технология" (Мюнхен, Германия, 2013); XX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2013» (Москва, 2013); XVII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Москва, 2013); Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013); I Международной научной конференции «Глобальная наука и инновация» (Чикаго, США, 2013); X Международной научно-практической конференции «Ключевые аспекты научной деятельности - 2014» (Пшемысль, Польша, 2014); XXI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2014» (Москва, 2014); Ш Всероссийской молодежной научной конференции «Естественнонаучные основы теории и методов защиты окружающей среды» (Санкт-Петербург, 2014); IV конференции молодых специалистов «Инновация и молодежь - два вектора развития отечественной нефтехимии» (Нижнекамск, 2014); VII Международной студенческой научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии» (Ульяновск, 2014) и XXIX Международной научной конференции "Research Journal of International Studies" (Екатеринбург, 2014).

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в рамках государственной Программы повышения конкурентоспособности Казанского Федерального университета и поддержана соглашением о сотрудничестве с ОАО «НКНХ». Личный вклад автора заключается в формулировке и постановке целей и задач исследований; анализе и переработке данных литературы; выборе методик экспериментов; проведении лабораторных экспериментов; обсуждении, анализе и обобщении полученных результатов и формулировке выводов; непосредственной подготовке материалов для публикаций в международном журнале и в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ; участии в зарубежных, международных и Всероссийских конференциях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, из них 1 статья в зарубежном издании, включенном в базу систем цитирования ISI Web of Science и Scopus, 7 статей в Российских изданиях, включенных в список Высшей аттестационной комиссии (ВАК), 14 материалов зарубежных, международных и Всероссийских конференций.

Общая структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах и состоит из введения, обзора литературы, разделов «Материалы и методы», «Результаты», обсуждения и заключения. Содержит 301 библиографический источник, 15 таблиц и 21 рисунок.

Благодарности. Диссертация посвящается памяти д.б.н., профессора Р.П. Наумовой, которая пробудила у автора интерес к научным исследованиям и являлась организатором совместных работ с объединением «Нижнекамскнефтехим».

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю - д.б.н., профессору, академику АН РТ О.Н. Ильинской за внимательное отношение к работе, ценные идеи, плодотворное обсуждение полученных материалов для публикаций и диссертации, и постоянную и неоценимую поддержку на всех этапах работы. Особо автор благодарит д.х.н., профессора В.З. Латыпову за рекомендацию к проведению работ на кафедре микробиологии КФУ, а также сотрудников ИФМиБ КФУ к.б.н., с.н.с. А.И. Колпакова, к.б.н., доцента Н.С. Карамову, к.б.н. Т.В. Григорьеву, к.х.н. A.B. Гарусова, к.б.н., доцента П.В. Зеленихина, к.б.н., доцента A.M. Зиганшина, к.б.н. И.В. Хиляс, к.б.н. A.A. Несмелова, аспирантов A.B. Лайкова, A.B. Макееву и P.M. Девятиярова. Автор признателен аспиранту кафедры ТСК ФГБОУ ВПО «КНИТУ» Нго Куен Куи за ценную помощь в проведении экспериментов и сотрудникам ОАО «Нижнекамскнефтехим» - к.б.н. О.И. Якушевой, Ф.М. Идрисовой и В.Н. Никоноровой за предоставление проб и плодотворное сотрудничество. Искренняя благодарность всем сотрудникам кафедры микробиологии КФУ за помощь в организации экспериментов и доброжелательную рабочую атмосферу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования, отбор и подготовка проб. В работе использовали пробы СВ совместного ПСОП при поступлении в биореактор, суспендированные и иммобилизованные микроорганизмы из биореактора, а также очищенные СВ на выходе из него. Суспендированные пробы отбирали асептично в темные стеклянные бутылки объемом 1л, а иммобилизующий материал извлекли после остановки биореактора на профилактику и доставляли на кафедру микробиолог™ Казанского федерального университета и хранили при 4°С. Анализ проводили в течение 24ч.

Химические методы анализа. Содержание и концентрацию компонентов СВ определяли методами газовой хроматограф™ (Кристалл-2000, ПИД-ЭЗД-ПФДС/Ф, колонка SE-54 (CP-Sil 8СВ-50м), газ-носитель гелий, температура детектора 300°С, испарителя - 240°С) и хромато-масс-спектрометрии (MD-800, фирма Fisons, колонка Wax 52), а также газового хроматографа «Маэстро ГХ 7820» с использованием колонки 19091N-233 HP-INNOWAX (30м * 0.25 мм * 0.50 цм) и методом ИК Фурье-спектрометрии в интервале 500-4000 см" в жидкой пленке (ИК-Фурье спектрометр VECTOR 33, фирма Bruker). Величины ХПК СВ измеряли бихроматным методом (ГОСТ Р 52708-2007). Значения pH определяли потенциометрическим способом. Значения биологического потребления кислорода

(БПК) определяли стандартным скляночным методом (Лурье, 1984; ГОСТ 27065-86). Химический анализ проводили для СВ на входе и выходе из биореактора.

Токсикологические методы анализа. Степень токсичности СВ оценивали с помощью биотестов на зоо- и фитотоксичность (Наумова с соавт., 2004), а также токсичности по отношению к тестерному штамму Salmonella typhimurium ТА98 (Ильинская с соавт., 2012). Мутагенный потенциал СВ определяли с помощью теста Эймса (Ильинская с соавт., 2012) и umu-теста (Mersch-Sundermann et al., 1991).

Микробиологические методы анализа. Пробы суспендированных и иммобилизованных микроорганизмов высевали на различные питательные среды - МПА, МПА с добавлением 5% NaCl, Кинга Б, Гаузе №1, Сабуро, Эшби и Чапека-Докса. Учет колоний проводили спустя 3-7 суток культивирования, определяли тип окраски по Граму и подвижность культур (Теппер с соавт., 1993; Нетрусов с соавт., 2005).

Молекулярно-генетические анализы. Идентификацию доминирующих изолятов из микробного сообщества проводили с помощью анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) (Maloy, 1989; Weisburg et al., 1991; Hall, 1999) и масс-спектрометрического анализа (MALDI-TOF MS) (Mount, 2004; Fox, 2006; Mellmann et al., 2008).

Методы анализа биодеградационного потенциала. Способность отдельных доминирующих штаммов к биодеградации основных компонентов СВ совместного ПСОП определяли по их росту в жидкой среде, используя один из основных компонентов данной СВ в качестве единственного источника углерода. Способность доминирующих штаммов к совместной биодеградации основных компонентов СВ совместного ПСОП оценивали в модельном биореакторе. Дыхательную активность доминирующих изолятов бактерий определяли по выделению углекислого газа на газовом хроматографе Clarus-580.

Обработка экспериментальных данных, а также оценка значимости полученных результатов были выполнены с помощью стандартных методов математической статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Снижение уровня загрязнения высококонцентрированной сточной воды совместного производства стирола с окисью пропилена

Необработанная СВ характеризуется высокой щелочностью и высокой концентрированностью: значения ее pH варьировали от 9.95 до 11.95, тогда как нагрузка по ХПК варьировала от 4173.0 до 15727.5 мг/л (Таблица 1), что значительно превышает нагрузку по ХПК бытовых СВ, которая колеблется в пределах 150-600 мг/л (Воронов, Яковлев, 2006). Нагрузка по ХПК низкозагрязненных промышленных СВ составляет меньше 1000 мг/л и высокозагрязненных вод - более 4000 мг/л (Leslie Grady Jr. et al., 1999; Chan et al., 2009). Следовательно, нефтехимическая СВ совместного ПСОП характеризуется высокой загрязненностью. За период исследований (34 месяца) на предприятии 3

раза обновляли сообщество в биореакторе, в соответствии с 3 летними остановками биореактора. В течение одной замены микробного сообщества развитие сообщества микроорганизмов проходило 3 фазы: 1 фаза (адаптационная фаза) — начальная фаза после запуска биореактора, II фаза - фаза формирования сообщества микроорганизмов в биореакторе и III фаза - фаза активной деятельности микробного сообщества.

Таблица 1. Снижение ХЛК после процесса предочистки в биореакторе

Фаза Число замен микробного сообщества в биореакторе

1 2 3

Снижение ХПК, %* ХПК поступающей СВ, мг/л Снижение ХПК, % ХПК поступающей СВ, мг/л Снижение ХПК, % ХПК поступающей СВ, мг/л

I 26.32 11067.50 11.56 8010.90 40.00 8334.40

29.55 (а) 8201.60 (а) 38.89 11193.70 38.10 11786.30

II 45.45 6634.40 51.77 7879.00 56.25 9650.00

50.00 (а. б) 7237.50 (а, б) 53.84 7783.70 52.63 10663.70

57.14 8155.00 48.15 15727.50 50.01 6031.30

III 68.28 10135.00 66.26 7211.00 54.55 13681.30

81.58 (а) 7296.00 (а) 65.63 5965.00 64.71 10571.90

88.46 8399.00 73.69 11125.00 70.00 12437.50

78.84 (г) 9740.00 (г) 76.81 6706.00 71.68 (б, в) 4173.00 (б, в)

* За 100% принято ХЛК поступающей СВ; а - точка отбора проб СВ для оценки токсичности и анализа структуры микробного сообщества; б - точка отбора проб СВ для оценки генотоксячяости; в -точка отбора проб СВ для модельного биореактора; г - точка отбора иммобилизующего материала и оценки дыхательной активности микробного сообщества в биореакторе на двухкомпонентных смесях.

В I фазе эффективность предварительной очистки была низкая. Снижение ХПК достигало максимального значения в III фазе, и составляло от 55% до 88% при начальных значениях ХПК 13681.3 и 8399.0 мг/л, соответственно (Таблица 1).

Биоразлагаемость органики отражена соотношением ХПК и БПК за 5 суток инкубации (БПК5), если это соотношение варьирует от 1:30 до 2.50:1, то компоненты СВ легко подвергаются биологическому разложению (Jern, 2005). В СВ совместного ПСОП соотношение ХПК:БПК; варьировало от 1.50:1-2.25:1, что позволяло осуществлять предочистку биологическим методом в биореакторе.

Основными компонентами СВ совместного ПСОП являются гликоли (МПГ, ДПГ, МЭГ, диэтиленгликоль (ДЭГ)) и летучие соединения (МФК, АЦФ, стирол, бензол, толуол, этанол, фенол). Все эти соединения биодеградируемые (Van Hamme et al., 2003). Среди них МПГ и МЭГ могут разлагаться различными почвенными и водными микроорганизмами (Farzadkia et al., 2010). Эффективность их трансформации в течение процесса предочистки СВ совместного ПСОП на локальных сооружениях ОАО «НКНХ» отражена на рисунке 1.

Эффективность удаления МПГ, МЭГ и этанола достигала 100% во всех фазах развития микробного сообщества в биореакторе. АЦФ был не только трудно разлагаемым, но и увеличил свою концентрацию в конце процесса предварительной очистки в I и II фазах за счет образования в качестве

промежуточного метаболита при деградации других компонентов СВ. Эффективность его удаления была относительно высока только в III фазе.

ы I фаза м II фаза и III фаза

-60 Основные компоненты СВ совместного ПСОП

Рисунок 1. Эффективность удаления основных компонентов СВ совместного ПСОП За 100% принято полное удаление компонентов в биореакторе

Процентное соотношение основных компонентов в необработанной СВ в каждой из трех фаз представлено на рисунке 2.

д ■ МПГ ■ ДПГ "МЭГ ■ ДЭГ «МФК а лиф "стирол «бензол толуол "этанол "фенол Остальные компоненты

Сумма 3162.91 мг/л

Сумма 2543.97 мг/л

24.27"/о

4.08%.

Рисунок 2. Процентное соотношение основных компонентов в составе необработанной СВ (А) I фазы, (Б) II фазы и (В) III фазы развития микробного сообщества в биореакторе

Из рисунка 2 видно, что в II и III фазах развития микробного сообщества в биореакторе большую часть необработанной СВ составлял МПГ, тогда как в I фазе его доля была намного меньше.

2. Оценка токсичности и генотоксичности сточной воды совместного производства стирола с окисью пропилена

2.1. Степень токсичности сточной воды по отношению к простейшим (,Paramecium caudatum)

При контакте с неразбавленной СВ наблюдали гибель всех особей инфузорий, что говорит о 100% токсичности, при этом показатель БКРщ-i варьировал в пределах от 7.91 до 9.45 (Рисунок 3), БКРю-i обработанной СВ варьировал от 2.78 до 6.14.

в Необработанная вода и Обработанная вода

hLL ■ ■ ■

I фаза III фаза II фаза

Фазы развития микробного сообщества в бпореакторе

Рисунок 3. Безвредная кратность разбавления, которое вызывает гибель 10% особей Paramecium caudatum после 1 часовой экспозиции

Установлено, что предобработка СВ совместного ПСОП в биореакторе снижала показатель разбавления в интервале от 1.5 до 3.3 раз. С переходом микробного сообщества в биореакторе от I до III фазы зоотоксичность значимо снижалась.

2.2. Токсичность сточной воды по отношению к растениям

(Secale cereale и Pisum sativum)

Фитотоксичность поступающей СВ по отношению ко ржи варьировала от 60% до 100% и по отношению к гороху - от 50% до 70 %. Несмотря на высокую нагрузку данной СВ. локальная предобработка в биореакторе позволяет снизить токсичность в среднем в 2 раза (Рисунок 4).

= -

I о 5

1 £ I 111

! 5-5

в я й

я а а

= " г

1. Ё г

И J в _ S 5.

1 8-S

1

а 5 4

Необработанная вода

S SO

i*

i ¿i 60

= '-1 40

II:

I фаза II фаза III фаза

Фазы развития микробного сообщества в бнореакторе

^Обработанная вода

5 5

II

S во

£ с

II N

I фаза II фаза III фаза Фазы развития микробного сообщества в биореакторе

Рисунок 4. Динамика снижения фитотоксичности по отношению к Seca/e cereale (А) и Pisum sativum (Б)

2.3. Оценка генотоксичности сточных вод

Тест на токсичность по отношению к тестерному штамму Salmonella typhimurium ТА98 и тест Эймса. При проведении теста на токсичность по отношению к тестерному штамму S. typhimurium ТА98 наблюдали слабую токсическую активность данной поступающей СВ. СВ в биореакторе и обработанной воды после биореактора. Процент выживания штамма составлял от 51 % до 96% для всех изучаемых проб, что означает допустимость исследований данных проб СВ на мутагенность.

Число колоний-ревертантов в опытах превышает негативный контроль не более чем в 2 раза. Следовательно, можно сделать заключение об отсутствии мутагенной активности данной поступающей СВ, а также СВ в биореакторе и на выходе из него в II и III фазах развития микробного сообщества в биореакторе. Хотя среди компонентов СВ совместного ПСОП есть известные мутагены, их потенциал проявляется в основном при их растворении в органических растворителях, например диметилсульфоксиде (Ohe et al., 2004). Анализ СВ, то есть водного раствора соединений, показал незначительную генотоксичность СВ, не оказывающую значимого влияния на микрофлору реактора.

Umu-тест

Поступающая СВ вызывала повышение активности ß-галактозидазы у штамма typhimurium ТА1535/рКК1002, что свидетельствует об активации SOS-оперона при повреждениях ДНК. Фактор индукции SOS ответа IF составлял 2.19 (>2) в III фазе развития микробного сообщества биореактора. Поскольку состав необработанной СВ маловариабелен, для I и II фаз ДНК-повреждающий эффект будет аналогичным. Таким образом, можно сделать вывод о наличии слабого генотоксического действия поступающей СВ совместного ПСОП предприятия ОАО «НКНХ».

3. Определение численности аэробных микроорганизмов на различных этапах очистки сточной воды

Как правило, в поступающей СВ отсутствует микрофлора; в пробе СВ биореактора взвешенные аэробные микроорганизмы составляют 107—10х КОЕ/мл. Среди полученных изолятов подавляющее большинство составили аэробные гетеротрофные бактерии, среди которых 2 изолята образовывали зеленый пигмент на среде Кинга Б. В качестве минорных изолятов получены 3 осмотолерантных штамма бактерий (на среде МПА + 5% ЫаС1), 3 изолята дрожжей (Рисунок 5А) и 3 изолята микромицетов (Рисунок 5Б). Микромицеты были обнаружены при посеве пробы иммобилизованной микрофлоры, и не характерны для сообщества взвешенной микрофлоры. Также было выделено 3 изолята предполагаемых азотфиксаторов.

Рисунок 5. Фотографии дрожжей (А) и микромицетов (Б), выделенных из биореактора локальных сооружений предочистки СВ совместного ПСОП

Актинобактерии на среде Гаузе выделены не были. Количество аэробных гетеротрофов < 107— 108 КОЕ/мл) намного превышает численность других физиологических групп (105— 106 КОЕ/мл) во всех фазах развития микробного сообщества в биореакторе (Рисунок 6), вследствие чего другие группы не были предметом отдельного изучения.

Рисунок 6. Доля аэробных микроорганизмов в биореакторе в (А) I фазе (8.06х107 КОЕ/мл), (Б) II фазе (1.90x108 КОЕ/мл) и (В) III фазе (6.85x10* КОЕ/мл) развития микробного сообщества

Численность аэробных микроорганизмов в сообществе биореактора увеличивалась от I до III фазы развития микробного сообщества. Микробное сообщество биореактора претерпевает динамические изменения в зависимости от фазы его развития, однако численность и состав микроорганизмов варьирует в пределах одного порядка.

4. Выявление доминирующих изолятов бактерий в биореакторе очистки сточной воды и определение их видовой принадлежности

Нами были определены основные культивируемые изоляты, имеющие высокую численность в биореакторе. Филогенетический анализ выявил 16 доминирующих изолятов бактерий, родовая и видовая принадлежность которых представлена на рисунке 7. По масс-спектрометрическому анализу (MALDI-TOF MS) эти штаммы достоверно подтвердили свою родовую и видовую принадлежность. Доминирующие изоляты, вносящие основной вклад в очистку СВ совместного ПСОП, относились к Alpha-, Beta- и Gammaproteobacteria, Bacilli и Actinobacteria. Wagner и Loy (2002) показали, что филум Proteobacteria в основном ответственен за удаление из СВ органических веществ, таких как азот, фосфор и ароматические соединения (Wagner, Loy, 2002).

\ GammapioHroDoctwo

Achromobacler nyloso'idans DSM 10346 Achiomobaclor ctonrtnficans DSM 30026 Acfircmobactar «p. DD75 (КСвввЭОб)

AKahgones laocahs N00 > Betapmeoboctana

DiaplKUObOCWi nilioteducens NA 106 Burkhoioena vietnamien** lmg Ю92Э Burkhotdoria cepacia 0068 (КСМ9Э02) Stanotmpttomonaa таПорЬШа DD52 (KC6883010) *\ StaooCropbomonas таПорЬШа DD73 (КС689Э0Э) Stonolrophomonas rtuzophila LD-6 Xnntbomonas cuyroe XooSTOI Acimflobactoi milieus A640 Pseudomonas luoioscens FC34 Pseudomonas aicatigenos NCIMB 9Ö6? Pseudomonas puOda D01 (KC689290) bsdieticlua coli XJALT-127-1YG2

Могдапава morgan" DD9 (KC689294)

D029 (KC88Î

006 (ксвавгвэ)

DD74 (KC689304) СПгЫжШ атакзпаОсиа DO 17b (KC689297) Citrobacter amatonaOcu* DD2 (KC8892»)

Enterobacter огугав Jx088114 Reouttella planttcola D030 (КСвввЗОО)

Raoultolla omilliinotytica CIP 103 364 J

Acelobaclei pomotum LMG 18848 Rliodoblaslus acidophilus DSM137T

Cauiobacler fusitorms ATCC 15257 Aipnap'oleoaactena

Paracoccus varautua OD4b (КСввв2в2)

Paracoccus denilrificans SDT1S8 Bacillus amylohquolacieni Zy25 Bacillus subhhs DSM 10

Bacillus megalenum IAM 13418 Bec.ni

Lystnlb«c*ua fuaJtormls DD17 (КС6802вв)

Lysinibucilius sphooneus DSM 28 Brevioactenuni hnens DSM 20425 Brevtbactertum sp. DD 14Ь (KC869295) Brembacterium permense VKM Ac-228 Arlhroboclei alkalipliiliis AB248527 Micrococcus terreus V3M1 Kocurta пжа D022 (КСвв92вв) Косила 1ЮШ1Я CMS 71

Рисунок 7. Филогенетическое древо генов 16Б рРНК, демонстрирующее таксономическую принадлежность выделенных штаммов бактерий

Доля доминирующих изолятов несколько варьирует в зависимости от фазы развития микробного сообщества, начального ХПК и состава необработанной СВ совместного ПСОП. В основном в биореакторе присутствуют бактерии родов Citrobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Burkholderia, Lysinibacillus, Morganella, Raoultella и Stenotrophomonas.

Штамм Citrobacter amalonaticus DD2 встречается в биореакторе в количестве 6-15% от общего количества суспендированных аэробных культивируемых гетеротрофов, тогда как Pseudomonas putida DD1 - 5-12%, Burkholderia cepacia DD68 - 4-7%, Paracoccus versutus DD4b - З-т-9%, Lysinibacillus fusiformis DD 17 -34-12%, Raoultella planticola DD30 - 4-h7%, Morganella morganii DD9 - 5-1%, Brevibacterium sp. DD 14b - 3-r8%, C. amalonaticus DD74 - 4-h8%, C. amalonaticus DD29 - 4-r9%, Stenotrophomonas maltophilia DD52 - 4-И0%, С. amalonaticus DD 17b - 4-г8%, C. amalonaticus DD5 - 2н-6%, Stenotrophomonas maltophilia DD73 - CM-6%, Achromobacter sp. DD75 - 1+3%, Kocuria rosea DD22 - 0+3% (Рисунок 8A, Б. В).

■ Citrobacter amalonaticus DD2 я Burkhohleria cepac ia L)LH>Ü

■ Pseudomonas /nitida DD!

• Paracoccus rersutns D04h

■ LysmilwcHlus fusiformis 1)1)17

■ Ruouliclla planticola DDHi Morganella morganii DP9

9 Brevibucterium permense DI) 14h В л Citrobacter amalonaticus Dl)74

ш Citrobacter amalonaticus DD29 ш Stenotrophomonas maltophilia 1)1)52

• Citrobacter amalonaticus DDI 7b Citrobacter nmulonaticus DD5 Stenotrophomonas maltophilia 1)1)71 Achromobacter sp. DL)75

Рисунок 8. Доля суспендированных (А, Б, В) и иммобилизованных (Г) культивируемых аэробных гетеротрофных бактерий в биореакторе в (А) I фазе (0.73x108 КОЕ/мл), (Б) II фазе (1.80x108 КОЕ/мл), (В) III фазе (6.58x10й КОЕ/мл) и (Г) III фазе (4.00х10п КОЕ/г) развития микробного сообщества. Редкие штаммы с долей менее чем 1% сгруппированы как «Остальные штаммы»

Иммобилизованная микрофлора также включает ряд доминирующих изолятов, сходных с суспендированной микрофлорой, а именно С. amalonaticus DD2 (27.5%), В. cepacia DD68 (20%), R. planticola DD30 (12.5%), P. versutus DD4b (11.25%), P. putida DDI (10%), M. morganii DD9 (3.75%) и S. maltophilia DD52 (2.5%) (Рисунок 8Г). Отметим, что доля первых четырех изолятов значительно выше, чем в составе суспендированной микрофлоры.

Родовая и видовая принадлежность минорных штаммов, составляющих менее 1% от общего количества аэробных гетеротрофов биореактора, представлена в таблице 2.

Таблица 2. Идентификация минорных изолятов в биореакторе (MALDI-TOF MS)

Штамм Название Уровень достоверности Символы

DD12 Klebsiella oxytoca 2.32 +++

DD21 Enterobacter cloacae 2.333 +++

DD27 Citrobacter amalonaticus 2.389 +++

DD47 Pseudomonas aeruginosa 2.493 +++

DD49 Micrococcus luteus 2.4 +++

DD58 Citrobacter amalonaticus 2.352 +++

DD2b Serratia liquefaciens 2.432 +++

DD5b Citrobacter amalonaticus 2.312 +++

DD 19b Aeromonas h\drophila 2.422 +++

DD6c Aeromonas hxdrophila 2.408 +++

DD9c Citrobacter amalonaticus 2.313 +++

DD13 Bacillus cereus 2.115 ++

DD10 Citrobacter amalonaticus 2.233 ++

DD16 Pseudomonas alcaliphila 2.177 ++

DD32 Citrobacter amalonaticus 2.233 ++

DD40 Achromobacter ruhlandii 2.041 ++

DD44 Citrobacter amalonaticus 2.209 ++

DD51 Kerstersia gviorum 2.23 ++

DD54 Citrobacter amalonaticus 2.079 ++

DD70 Stenotrophomonas maltophilia 2.204 ++

DD3b Alcaligenes faecalis 2.229 ++

DD21b Brevundimonas diminuta 2.251 ++

DDIc Citrobacter amalonaticus 2.048 ++

DD5c Aeromonas media 2.164 ++

DD7c Aeromonas caviae 2.26 ++

DD6' Enterobacter asburiae 2.165 ++

DDI lb Comamonas terrigena 1.977 +

DD3c Pseudomonas citronellolis 1.979 +

DD53 Achromobacter ruhlandii 1.933 +

DD71 Achromobacter xvlosoxidans 1.977 +

DD4c Achromobacter denitrificans 1.852 +

DD4' Achromobacter denitrificans 1.979 +

5. Использование основных компонентов сточной воды в качестве субстратов для роста доминирующих изолятов

5.1. Использование основных компонентов сточной воды в качестве единственного источника углерода

В данном исследовании мы показали распределение метаболической активности доминирующих культивируемых изолятов по отношению к основным компонентам СВ (Таблица 3). Показано, что оптимальными концентрациями основных компонентов СВ совместного ПСОП для роста изученных изолятов являлись 10 г/л МПГ, 10 г/л ДПГ, 2 г/л МЭГ, 2 г/л ДЭГ, 1 г/л летучих соединений (бензол, толуол, стирол, МФК, АЦФ, фенол).

Таблица 3. Метаболический потенциал доминирующих изолятов по отношению к основным компонентам СВ совместного ПСОП * _____

Доминирующие изоляты МПГ ДПГ МЭГ ДЭГ бенюл толуол стирол МФК АЦФ фенол С

Pseudomonas putida DD1 ++ ++ ++ + - - + - - + ++

Burkholderia cepacia DD68 + + + + - - + + - ++ +

Citrobacter amalonaticus DD2 ++ + + + - - - - - + +

Paracoccus versutus DD4b ++ + ++ + + -

Citrobacter amalonaticus DD5 + + ++

Citrobacter amalonaticus DD17b + + + + -

Lysinibacillus fusiformis DD17 + + + - - +

Raoultella planticola DD30 + + + + - - - - - - +

Morganella morganii DD9 ++ +

Stenotrophomonas maltophilia DD52 + + +

* П, поступающая СВ; -, видимого роста не обнаружено (оптическая плотность при длине волны бООнм (СЮбоо) <0.1); +, слабый рост (00«„=0.1-1); ++, интенсивный рост (ООбоо>1).

Далее рассматривали только оптимальные концентрации. Важно, что почти все доминирующие изоляты могут расти, пусть и незначительно, на необработанной СВ. Большинство изученных штаммов показало более высокий рост на МПГ, МЭГ и ДПГ, чем на ДЭГ или ароматических соединениях. Почти никто из изученных бактерий не мог расти на ароматических соединениях. Однако штамм С. amalonaticus DD2 показал небольшой рост на феноле, Р. putida DD1 - на стироле и феноле, Р. versutus DD4b - на феноле. Штамм В. cepacia DD68 не показал роста на ароматических соединениях, таких как бензол, толуол, АЦФ, однако рос на стироле, МФК и феноле. Бактерии родов Pseudomonas, Burkholderia, Paracoccus и Citrobacter продемонстрировали относительно высокий уровень роста. Отметим, что существуют различия в метаболической

активности внутри одного вида, как можно наблюдать у различных штаммов С. ата1опаПсщ (Таблица 3).

Изменение оптической плотности при выращивании 10 отдельных исследуемых изолятов на жидкой минеральной среде с добавлением одного из перечисленных ксенобиотиков или самой СВ позволило выявить закономерность снижения биодоступности загрязнений в ряду: МПГ, МЭГ, ДПГ, ДЭГ, поступающая СВ, фенол, стирол, МФК, АЦФ. толуол и бензол.

На основе данных газовой хроматографии показано, что пики поглощения этанола выходят при времени удерживания 3.445 мин, тогда как пики поглощения этилбензола выходят при времени удерживания 9.583 мин, стирола - от 11.929 до 12.104 мин, МПГ - 17.073 мин, АЦФ-от 17.891 до 18.092 мин, МФК-от 19.708 до 19.804 мин и фенола - от 20.802 до 21.900 мин. Эти результаты были использованы для расчета убыли исследуемых субстратов, представленной в таблице 4. Исходные данные по убыли пиков приведены только для фенола (Рисунок 9), аналогичные исходные данные по другим субстратам не представлены.

s„„ = И2ПЗ-! ел

.....

ЖИЛО: >■<>11 *>>>л

Фенол S™, - 3445825 ел

2100 71 ,0 21.70 21 30 21« 71 50 2160 71 20 21Ю 71ЧО

Рисунок 9. Снижение концентрации фенола в случае единственного источника углерода штаммом Pseudomonas putida DD1 в начале (А) и после 9 суток (Б) культивирования

При выращивании штамма P. putida DD! на необработанной СВ с добавлением биогенных элементов, эффективность удаления АЦФ и фенола за 15 суток достигала 37% и 46%, соответственно. В случае, когда фенол являлся единственным источником углерода для этого штамма, концентрация фенола уменьшалась на 54% за 9 суток (Рисунок 9), а концентрация стирола за такое же время снижалась на 82% (Таблица 4).

Штамм В. cepacia DD68 мог расти на поступающей СВ и удалял этилбензол на 89% за 9 суток, тогда как концентрация фенола, АЦФ и стирола за это время снижалась на 67%, 93% и 94%, соответственно. Если МФК являлся единственным I источником углерода, то его концентрация снижалась на 15% за 9 суток, тогда как концентрации стирола и фенола за 15 суток снижалась на 18% и 96%, соответственно (Таблица 4).

Штамм С. ата1опаПсш ВВ2 при выращивании на минеральной среде с добавлением СВ за 9 суток деградировал АЦФ и фенол на 95% и 96%, соответственно. В начале исследуемого периода обнаруживали этанол, площадь пика которого составляла 2053865 ед., однако в дальнейшем этанол полностью использовался бактериями, то есть, эффективность удаления этанола достигала 100%. Когда фенол являлся единственным источником углерода для штамма Р. уегяиШ БЭ4Ь, то его концентрация уменьшалась на 61% за 15 суток (Таблица 4).

Таблица 4. Снижение концентраций компонентов СВ совместного ПСОП по данным газовой хроматографии *_______

Штамм Образец Компоненты Площадь пика, ед. Эффективность очистки Время культивирования

Исходное содержание Конечное содержание

Pseudomonas putida DD1 П АЦФ 32539 20363 37% 15 суток

фенол 208474 112079 46%

стирол 186227 33497 82% 9 суток

( эенол 7527137 3445825 54% 9 суток

Burkholderia cepacia DD68 П этилбензол 43109 4605 89% 9 суток

стирол 266350 16122 94%

АЦФ 69668 4916 93%

фенол 175048 57429 67%

стирол 134485 110470 18% 15 суток

МФК 7732896 6557401 15% 9 суток

>енол 4974440 220284 96% 15 суток

Citrobacter amalonaticus DD2 П АЦФ 747189 37411 95% 9 суток

фенол 2250623 90692 96%

этанол 2053865 0 100%

>енол 5217223 1343874 74% 15 суток

Paracoccus versutus DD4b фенол 10974638 4232280 61% 15 суток

* П - поступающая СВ

5.2. Биодеградация основных компонентов сточной воды комбинированным сообществом доминирующих изолятов

Для оценки способности сообщества к биодеградации компонентов СВ совместного ПСОП было составлено модельное сообщество, скомбинированное из 10 доминирующих изолятов - Pseudomonas putida DDI, Burkholderia cepacia DD68, Citrobacter amalonaticus DD2, Paracoccus versutus DD4b, Citrobacter amalonaticus DD5, Citrobacter amalonaticus DD 17b, Lysinibacillus fusiformis DD 17, Raoultella planticola DD30, Morganella morganii DD9 и Stenotrophomonas maltophilia DD52 (каждый в объеме 25 мл с ODÄ,0 не менее 1). За 18 суток значение ODeoo суспензии в модельном биореакторе достигало 1.58 ед. Значение pH за 18 суток проведения эксперимента в биореакторе варьировало от 6.8 до 8.0. За 10 суток сообщество доминирующих изолятов эффективно удаляло 69% фенола и 25% МФК (рис. 10 А, Б). Снижение МФК достигало 86% за 12 суток (Рисунок ЮА, В), 92% за 15 суток (Рисунок 10А, Г) и 91% за 18 суток (Рисунок 10А, Д). После 10 суток фенола на выходе из биореактора обнаружено не было. То есть,

фенол полностью удалялся из биореактора за счет деструктивной активности доминирующих изолятов. Аналогичные данные получены для МПГ.

| Мгтизфйетпырссл:

тооосс' есоох 5СССОЭ •ССООО

эссозс

2С0000 11ХСОС

--1 "200Х! сх

- ЯЮ&ДО'еа.

. Лсегофсасп ¡|

I ¡я. |1

£ I! ¡л

1700 1750 тОСг 15» 1800 1450 2000 2X60 21.'00 2150 22-02

Аасюфсцо» | - 7^4593 «I,

м

„

, Мепетфсмгаслрбйюл'

лдаис

ЖХХКС-хооос 1СССОО

Мепщфсипмг-Згаал ч ^ -236-138 \ Ачгю^сяон \

сл. А

пг«> т.чло пгоа 19, ;

700000 еослс

1<ХХТО

•в <»ор-*млос»>.С-аи

, Адстофочом МепмфеииякярОпусл.

- »743* я! 141056 г.а \

1/АО ль! 00 I

эосоос>|

ОСЙООО!

тооах.

>состо|

С

Рисунок 10. Снижение комбинированным сообществом концентрации МПГ, АЦФ, МФК и фенола, содержащихся в необработанной СВ совместного ПСОП

(А) - состав поступающей СВ; (Б) - состав СВ на выходе из биореаюгора за 10 суток (В) - 12 суток, (Г) -15 суток и (Д) - 18 суток

За первые 10 суток концентрация АЦФ увеличивалась в 2.69 раз (Рисунок ЮА, Б), что отражает способность микроорганизмов образовывать его в качестве промежуточного метаболита при деградации других компонентов СВ. В

следующие 2 дня эффективность удаления АЦФ составила 10%, а за 15 суток достигала 62%.

Процесс очистки в модельном биореакторе с использованием 10 доминирующих штаммов был проведен для изучения эффективности совместной деградации основных компонентов СВ совместного ПСОП, таких как МПГ, МФК, АЦФ и фенол. Сравнительные результаты эффективности процесса очистки на локальных сооружениях предприятия ОАО «НКНХ» и в модельном биореакторе представлены на рисунке 11.

и Локальная установка ы Модельный бнореактор

МПГ МФК АЦФ фенол

Рисунок 11. Эффективность удаления основных компонентов СВ совместного ПСОП в условиях локальных сооружений и модельного биореактора

Из рисунка 11 видно, что снижение концентрации основных компонентов СВ совместного ПСОП в модельном биореакторе было выше, чем в локальных сооружениях. В случае модельного биореактора доминирующие изоляты предварительно выращивали на 10 г/л МПГ в жидкой минеральной среде с добавлением биогенных элементов в течение 5-и суток, а только после этого их вносили в биореактор с реальной СВ, тогда как в условиях локальных сооружений микрофлору стимулировали непосредственным внесением в биореактор дрожжевого экстракта. Выращивание комбинированного сообщества изолятов на МПГ, служащего косубстратом в системе очистки, не вызывает стресса при переносе в биореактор, поскольку в реальной СВ присутствует значительное количество МПГ. Кроме того, 10 г/л является оптимальной концентрацией МПГ для доминирующих изолятов, выделенных из биореактора. В модельном биореакторе данные доминирующие изоляты адаптируются к СВ с одинаковой нагрузкой ХПК в течение длительного времени (18 суток), тогда как нагрузка по ХПК в полномасштабном биореакторе постоянно изменяется. Указанные причины обусловливают более эффективную работу доминирующих изолятов в модельном биореакторе.

6. Дыхательная активность доминирующих изолятов на двухкомпонентных смесях

6.1. Дыхательная активность доминирующих изолятов на двухкомпонентных смесях на основе моноэтиленгликоля

Была определена скорость выделения углекислого газа доминирующими штаммами при предварительном росте на МЭГ и окислении бинарных смесей спустя 12ч роста (Рисунок 12).

При исследовании активности дыхания микроорганизмов на двухкомпонентных смесях на основе МЭГ установлено, что гликоли оказывали стимулирующее действие на микрофлору биореактора, увеличивая интенсивность дыхания на 22-54%, в особенности МПГ (на 474.8%), и могут применяться в качестве косубстратов, тогда как летучие ароматические соединения, в особенности стирол и АЦФ, ингибируют дыхательную активность большинства изолятов на 28-98%. В случае штаммов Morganella morganii DD9 и Citrobacter amalonaticus DD 5 не было обнаружено синергетического эффекта двухкомпонентных смесей на основе МЭГ.

6.2. Дыхательная активность доминирующих изолятов на двухкомпонентных смесях на основе монопропиленглнколя

Была определена скорость выделения углекислого газа доминирующими штаммами при предварительном росте на МПГ и окислении бинарных смесей спустя 12ч роста (Рисунок 13).

При исследовании активности дыхания микроорганизмов на двухкомпонентных смесях на основе МПГ установлено, что этанол оказывал стимулирующее действие на микрофлору биореактора, увеличивая интенсивность дыхания на 15-28%, и может применяться в качестве косубстрата, тогда как летучие ароматические соединения, в особенности стирол, ингибируют дыхательную активность большинства изолятов на 24-99%.

■ МЭГ ■ ДЭГ »МПГ «ДПГ «толуол ■ бензол стирол МФК АЦФ

Рисунок 12. Дыхательная активность доминирующих изолятов, предварительно выращенных на МЭГ и окисляющих бинарные смеси спустя 12ч роста

■ МПГ ■ ДПГ «МФК ■ АЦФ ■ бензол - стирол этанол глюкоза

18

5 16

О

0 14

1 .2

л

| 10

5

II

I

Ми и81.

Ц

III. Й..Й,

Микробное СИгоЬасгег ВшкИоЫет'ш Рэеийототв Рагасоссш

сообщество в ата1опаПси<, Э02 се рас ¡а 0068 рмШ БШ \enutus ВОЛЬ

биореакторе

Рисунок 13. Дыхательная активность доминирующих изолятов, предварительно выращенных на МПГ и окисляющих бинарные смеси спустя 12ч роста

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследуемая установка предочистки СВ совместного ПСОП показала принципиальную применимость биологического подхода к детоксикации экстремально загрязненной СВ и сделала обработанную СВ совместимой с простейшими в активном иле и пригодной для дальнейшей полной очистки традиционным биологическим методом в аэротенках. Мы установили, что бактерии родов Citrobacter, Burkholderia, Pseudomonas и Paracoccus 'были доминирующими в биореакторе и способными к биоразложению основных компонентов данной СВ. Полученные нами данные о структуре микробного сообщества и метаболическом потенциале отдельных изолятов перспективны для улучшения процедуры предварительной очистки СВ при увеличении спектра изолятов, которые могут разлагать более токсичные и устойчивые ксенобиотики. Следовательно, выбор доминирующих изолятов, их идентификация и внедрение во многом определяют работу очистного сооружения и экологическую безопасность производства. Расшифровка структуры микробного сообщества -это ключ к созданию рациональной и функционально стабильной системы очистки, регулирование которой может осуществляться интродукцией целевых групп бактерий - компонентов сообщества. Лучшее понимание микробных сообществ, участвующих в процессе очистки СВ, не только позволяет обеспечить стабильную работу систем очистки, но и вносит вклад в фундаментальные аспекты микробной экологии (Oerther et al, 2001; DeAngelis et al., 2011). Проведенная экспериментальная работа позволила сделать следующие основные заключения:

1. СВ совместного ПСОП обладает высокой токсичностью по отношению к растениям (Secale cereale, Pisum sativum), простейшим {Paramecium caudatum), слабой токсической активностью по отношению к тестерному штамму Salmonella typhimurium ТА98, слабым генотоксическим действием по отношению к штамму 5. typhimurium ТА1535/рКК1002, но не проявляет мутагенную активность по отношению к штамму S. typhimurium ТА98.

2. Культивируемые аэробные микроорганизмы отсутствуют в необработанной СВ, а в биореакторе их численность составляет в 107-108 КОЕ/мл суспендированной микрофлоры и 1011 КОЕ/г иммобилизованной микрофлоры; они представлены аэробными гетеротрофами, среди которых в количестве 10= КОЕ/мл суспендированной микрофлоры и 106 КОЕ/г иммобилизованной микрофлоры присутствуют дрожжи и микромицеты. Состав микробного сооощества варьирует в зависимости от концентрации компонентов поступающей СВ, нагрузки на очистное сооружение и развития микробного сообщества в оиореакторе.

3. В биореакторе локальных очистных сооружений ПСОП выявлено 60 изолятов бактерий; с использованием молекулярных методов установлена таксономическая принадлежность доминирующих изолятов к филуму Proteobactena: Paracoccus versutus (a-proteobacteria), Achromobacter sp Burkholderia cepacia (ß-proteobacteria), Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas

putida, Morganella morganii, Citrobacter amalonaticus и Raouliella planticola (>•-proteobacteria), а также филумам Bacilli: Lysinibacillus fusiformis DD 17, и Actinobacteria: Brevibacterium sp. и Kocuria rosea DD22.

4. Установлено, что отдельные доминирующие изоляты аэробных гетеротрофных бактерий могут использовать гллколи, фенол, стирол и МФК в качестве единственного источника углерода; комбинированное сообщество доминирующих изолятов в модельном биореакторе приводит к эффективному снижению концентраций фенола, МФК и АЦФ.

При исследовании активности дыхания на двухкомпонентных смесях на основе легкодоступных гликолей установлено, что гликоли и этанол оказывают стимулирующее действие на микрофлору биореактора, увеличивая интенсивность дыхания до 54%, и могут применяться в качестве косубстратов, тогда как летучие ароматические соединения, в особенности стирол и АЦФ, ингибируют дыхательную активность большинства изолятов на 24-99%.

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Dao, L. Full-scale bioreactor pretreatment of highly toxic wastewater frotn styrene and propylene oxide production / L. Dao, T. Grigoryeva, A. Laikov, R. Devjatijarov, O. Ilinskaya // Ecotoxicol. Environ. Saf. - 2014. - V. 108. - P. 195-202.

2. Дао, JL Т. Т. Оптимизация работы установки биоочистки нефтехимических сточных вод с использованием иммобилизованной микрофлоры / JT. Т. Т. Дао, Т. В. Григорьева, О. И. Якушева, В. Н. Никонорова, О. Н. Ильинская // Ученые Записки Казанского университета. — 2013. — Т. 155. — № 2. — С. 138-146.

3. Дао, JI. Т. Т. Характеристика параметров предочистки нефтехимических сточных вод в биореакторе / JI. Т. Т. Дао, Т. В. Григорьева, Р. М. Девятияров, К. К. Нго, О. И. Якушева, В. Н. Никонорова, О. Н. Ильинская // Вестник Казанского Технологического университета. - 2013. — Т. 16. — № 7. — С. 158-160.

4. Дао, JI. Т. Т. Устранение ценообразования в биореакторе установки очистки нефтехимических сточных вод / JI. Т. Т. Дао, Т. В. Григорьева, К. К. Нго, О. И. Якушева, В. Н. Никонорова, О. Н. Ильинская // Вестник Казанского Технологического университета. — 2013. - Т. 16.—№ 10. —С. 182—185.

5. Дао, JL Т. Т. Очистка отработанного воздуха в установке предварительной обработки нефтехимических сточных вод / JI. Т. Т. Дао, К. К. Нго, О. Н. Ильинская // Вестник Казанского Технологического университета. — 2013.-Т. 17.-№ 1.-С. 178-180.

6. Дао, JL Т. Т. Анализ работы установки биоочистки нефтехимических сточных вод в биореакторе / JI. Т. Т. Дао, К. К. Нго, О. Н. Ильинская // Вестник Казанского Технологического университета. — 2013. - Т. 17. - № 12. - С. 88-90.

7. Дао, JL Т. Т. Оптимизация процесса предварительной очистки сточных вод с помощью подачи биогенных добавок / JI. Т. Т. Дао, К. К. Нго, О. Н.

Ильинская // Вестник Казанского Технологического университета. - 2013 -Т 17 -№ 12.-С. 93-95.

8. Дао, Л. Т. Т. Особенности микрофлоры в установке предварительной очистки сточных вод нефтехимического производства / JI. Т. Т. Дао, К. К. Нго, О. Н. Ильинская // Вестник Казанского Технологического университета. - 2013 — Т 17.-№ 12. -С. 100-102.

Другие публикации по теме диссертации

9. Dao, Т. Т. L. Microbial Community potential for purification of specific wastewater from petrochemical production / Т. T. L. Dao, O. N. Hinskaya // Materials of the I international scientific conference "Global Science and Innovation" - Chicago USA, 2013. - V. 2. - P. 73-76.

10. Dao, Т. T. L. Pretreatment of high-concentrated petrochemical wastewaters by the combination of ozone and biological treatment / Т. T. L. Dao, Q. Q. Ngo, O. N. Ilinskaya, А. A. Petukhov, Т. V. Grigoryeva, E. I. Grigoriev, О. I. Yakusheva, V. N. Nhikonorova // Materials of the IV International research and practice conference "European Science and Technology". - Munich, Germany, 2013 - P 159162.

11. Дао, Л. Т. Т. Особенности предварительной очистки высококонцентрированных сточных вод нефтехимического производства / Л. Т. Т. Дао, К. К. Нго, О. Н. Ильинская // Материалы X Международной научно-практической конференции "Ключевые аспекты научной деятельности". -Пшемысль, Польша, 2014. - С. 21-23.

12. Дао, Л. Т. Т. Особенности микробной деградации нефтехимических поллютантов высоконагруженных промышленных сточных вод / JI. Т. Т. Дао, Р. М. Девятияров // Материалы XX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология». Ломоносов -2013. - Москва, 2013. - С. 271-272.

13. Дао, Л. Т. Т. Оценка способов иммобилизации микрофлоры для создания технологии предобработки высококонцентрированных сточных вод нефтехимической промышленности / Л. Т. Т. Дао, Т. В. Григорьева // Материалы XXI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология». Ломоносов -2014. - Москва, 2014. - С. 204-205.

14. Дао, Л. Т. Возможности биологического обезвреживания высококонцентрированных нефтехимических сточных вод производства стирола и окиси пропилена / Л. Т. Дао, Т. В. Григорьева, А. В. Макеева, О. И. Якушева, В. Н. Никонорова, Р. П. Наумова // Материалы международной научно-практической конференций молодых ученых и специалистов «Биотехнология в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов». - Казань, 2013. - С. 53-54.

15. Дао, Л. Т. Т. Характеристика структуры микробного сообщества, участвующего в предварительной очистке нефтехимических сточных вод / Л. т! Т. Дао // Материалы VII-й Международной студенческой научной конференции

«Актуальные, проблемы инфекционной патологии и биотехнологии». -Ульяновск, 2014. - С. 72-73.

16. Дао, Л. Т. Возможности предварительной биологической очистки высоконагруженных сточных вод нефтехимического производства / JT. Т. Дао, О. Н. Ильинская // Материалы III Всероссийской молодежной научной конференции «Естественнонаучные основы теории и методов защиты окружающей среды». — СПб, 2014.-С. 44-45.

17. Дао, Л. Т. Т. Особенности биологического обезвреживания высоконагруженных сточных вод нефтехимического производства / Л. Т. Т. Дао // Материалы IV конференции молодых специалистов «Инновация и молодежь -два вектора развития отечественной нефтехимии». — Нижнекамск, 2014. — С. 121.

18. Нго, К. К. Очистка водного стока узла получения стирола дегидратацией метилфенилкарбннола / К. К. Нго, Л. Т. Т. Дао, Е. И. Григорьев, А. А. Петухов // Материалы X Международной научно-практической конференции "Ключевые аспекты научной деятельное™". - Пшемыслъ, Польша, 2014. - С. 7072.

19. Нго, К. К. Pretreatment of highly polluted petrochemical wastewater / K. К. Нго, Л. Т. Т. Дао, Е. И. Григорьев, А. А. Петухов, О. Н. Ильинская // Research Journal of International Studies. 2014. - Т. 26. - № 7. - С. 54-55.

20. Девятияров, Р. М. Специализированная микрофлора, как основа локальной биологической предочистки нефтехимических сточных вод / Р. М. Девятияров, Л. Т. Дао, Я. Н. Закирова, А. В. Лайков, Р. П. Наумова // Материала: XVII Международной Путинской школы-конференции молодых ученых. -Москва, 2013.-С. 13.

21. Девятияров, Р. М. Рационализация очистки нефтехимических сточных вод с помощью азотфиксации / Р. М. Девятияров, Я. Н. Закирова, Л. Т. Дао, Т. В. Григорьева, О. И. Якушева, В. Н. Никонорова, Р. П. Наумова // Материала международной научно-практической конференций молодых ученых н специалистов «Биотехнология в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов». -Казань,2013.-С. 89-91.

22. Несмелое, А. А. Физическая гетерогенность и биоремедиация / А. А, Несмелов, Р. П. Наумова, Л. Дао // Материалы VI международного научного семинара «Фундаментальные исследования и инновации» и Всероссийскою молодежного научного семинара «Наука и инновации - 2011». - Иошкар-Ояа, 2011.-С. 387-392.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЦФ - ацетофенон

БПК - биологическое потребление кислорода

БГТК5 - биологическое потребление кислорода за 5 суток инкубации

ДНК - дезоксирибонуклеинозая кислота

ДПГ - дипропиленгликоль

ДЭГ - диэтиленгликоль

КОЕ - колониеобразующие единицы

МПГ - монопропиленгликоль

МЭГ - моноэтиленгликоль

МФК - метилфенилкарбинол

ОАО «НКНХ» - открытое акционерное общество «Нижнекамскнефтехим; ПСОП - производство стирола с окисью пропилена рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота СВ - сточная вода

ХПК - химическое потребление кислорода

ОБ600 _ оптическая плотность при длине волны бООнм

E-mail автора: linhdao.kpfu@gmail.com

Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская 18 главное здание Казанского федерального университета, отдел аттестации научно-педагогических кадров, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081 0S Абрамовой Зинаиде Ивановне, факс: (843) 238-76-01. Email: ziabramova@mail ru

Подписано в печать 20.10.2014. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,75. Тираж 100. Заказ № 2710/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ru