Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РОЛЬ ВИТАМИНА В12 В МЕТАБОЛИЗМЕ МЕТИОНИНА В ЖИВОТНОМ ОРГАНИЗМЕ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "РОЛЬ ВИТАМИНА В12 В МЕТАБОЛИЗМЕ МЕТИОНИНА В ЖИВОТНОМ ОРГАНИЗМЕ"

На нрааак руьаписн

АКАДЕМИЯ НАУК СССР Ордена Ленина Институт бнохнмвн им. А. Н. Баха

НИЬ5

СНЕГИРЕВА Лариса Васильевна

РОЛЬ ВИТАМИНА в1; В МЕТАБОЛИЗМЕ МЕТИОНИНА В ЖИВОТНОМ ОРГАНИЗМЕ

Специальность 03.00.04 — Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических иаук

Моема — 1975

Вишишшьс

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.БАХА

Не правах рукописи

СНЕГИРЕВА Лариса Васильевна

РОЛЬ.ШТАНИНА В12.В МЕТАБОЛИЗМЕ ИЕТИОНЙНА В ШВОТНСЫ ОРГАНИЗМЕ -

Специальносгь 03.00.04 - Биологическая гаиіия

' '■■' А в г о р е ф е р а т ' 1

диссертации» представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Аспирант Научно-исследовательского института животноводства МСХ УзССР

Работа выполнена в лаборатории витаминов Ордена Ленина Института биохимии им. А.Н. Баха АН СССР.

Научные руководители:

члеи-корреспоцдент АН СССР, Профессор

старший научный со рудник , кандидат биологических наук

Официальные ошюненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук

На официальный отзыв работа натравлена в Институт биологии АН Латвийской ССР.

Автореферат разослан " ^ аКРРс Щ 197^) г. Защита диссертации состоится .Q^iffi ОЦУр7^ г*

на заседании Ученого Совета Ордена ЛвншаИнста^табиохидши км. А.Н.Баха АН СССР (Москва, B-7I, Ленинский проспект, 33).

С диссертацией меащо ознакомиться в библиотеке Института.

В.Н.БУКИН Л.Я.АРЕШКИНА

А.Н.ПЕТРОВА С.И.КДНОПКАЙТЕ

Ученый секретарь

Института биохимии од. А.Н.Баха,

кандидат биологических наук

Н.Н. ДЬЯЧКОВ

ВВЕДЕНИЕ

1С настоящему времени в животном организме установлены две биохимические реакции, в которых витамин ßjj приникает участие (Siadimtu7, I9?ü; 0<х-гкег , 1968,1072).

В первой из этих двух реакций Выравненная ыетилтранс-фераза (А/ метил-гетрагидрофолат-гшоцистеиа-иетилгрансфе-раза) осуществляет синтез метионина, перенося кехяльную группу с метил-ТГФК на гомоцистеин , и др.,i960; 7лу^г *№еи$ёас&, 1367). Исследованию данной реакции посвящено значительное число работ. Однако интерес к дальнейшему ее изучению не ослабевает и по сей день.

Зо второй реакции метилмалонилкоэвзим А-мутаза (МИКоА-му-таэа), контролируемая витамином Bj2, участвует в изомеризации ыетилиалоната в сукцинат (ОсЯоа, ,^^4^/7,1958). Благодаря .. этой реакции ряд аминокислот с разветвленной цепочкой углеродных атомов ( ыетионин, иэолейцил, треонин, валин) включаются в цикл ди-три-карбоновых кислот (Сооп и др.,1955; Т&отль t ,1953; ватезъ и др., 1965).

Подавление активности двух указанных ферментов вследствие недостаточности витамина В12» а также при некоторых заболеваниях, связанных с нарушением усвояемости данного витамина, или Кб нарушением сингеза его коэнзимных форм, приводит к целому ряду аномалий {ЛшЫи др.,1969,1970\М<*Аоп,еу и др. 1970). Это в свою очередь является причиной нарушения белкового, углеводного, жирового и нуклеинового обмена. В частности, дефект в НШСоА-мутазе приводит к нарушению обмена упомянутых вше аминокислот, вырали^уся в метилыалоновой ацидурии (ßazneiS и др.,1963; и др. 1967,1970;Яо$епёеи др.1968).

Принятые сокращения: ТГФК-тетрагидрофолиевая кислота; КоВт;3- коэнзии витамина Вт?; ШК - метилмадоновая кислота; MMKoft -метилмапонил-коанзав А; 1Ш5 - S-метилмегионин (витамин пиа ); UU-ацидурия - метилиалоновая ацидурия; 5Ш- J-аде-нозилметионив; ЗАГ - 5-аденозилгоиоцис геин.

- г -

Описание генетических нарушений метаболизма, сопровождаемых гомоцпстинури ей, цпс татиоиинури ей, гппометионинемией и мешлмадоновой ацидурией, позволяют предположить, что при дефекте В^-зависвмой ШКоА-мутази возможны и нарушения вторичного порядка, свябанные с обменом серосодержащих аминокислот иСиЛЛ-Сео-ур-ЛО)»' Эти заболевания еще более усугубляются при обогащении диетц большие белкаш и. аминоки ело таш:вали-ноч, изолейцином, гошеершюа и треонином^ о чем свидетельствует возрастающая экскреция ШК {08егАо£г.е г и. Отмеченный факт влияшя аминокислот на экскрецию ШК используется рядом авторов, для шядлеция дефицита витамина В^в организме людей и яивотшег (дотрег^г иШ;£>а?е,/$>2). .

В отношении цетиошша как "стресс фактора" имеются противоречивые сведения. Тал, одни авторы (Си.Яву и др., 1968) не находили увеличения экскреции ШК при получения болышш метионина. Другие де (Арещкша и др., 1970), наоборот, отмечали, -значительную,«егшвлалоповую ацпдурию цри дефиците витамина В-^ с эксперименте с животными. Последние авторы показали, что витамин В^у животных контролирует не только, синтез метионина, но и его диссимиляцию, предупреждая дисбаланс данной аминокислоты цри ее избытке.

Обнаруженный факт регуляция виташномВ^ катаболизма метионина побудил : нас углубить исследования, начатые в лаборатории витаминов Шстдтут^мГ^. Н. Баха АН СССР, по изучению нарушений в обмене цетиошша вследствие дефекта 1ЕЖоА-:лутази в организме животных. .

Нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить биохимические нарушения в обмене метионина при недостаточности витамина В12 7 млекопитающих (крыс).

2. Исследовать нарушения в обмене метионина, а также валина и пропионата цри недостаточности витамина ВТ2 У птиц (цыплят).

3. Изучить некоторые метаболические пути обмена ыетилме-тионшна (витамина иа"), являющегося'активной формой метиони- ;

- з -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

I, Материалы и методы исследования

1* Постановка биологических опытов на крысах и птице

Материалом для исследования служил молодняк белых крыс вистеровского стада. Крысята брались от маток, содержащихся на диете без рыбной муки и мяса (как источников витамина

В опытах на птице использовались цыплята, вылупившиеся из яиц, взятых от кур, находившихся на рационе с нормальным содержанием витамина В12» Цнплята содержались в клетках на решетчатом полу дяя устранения возмо

Для получения экспериментально цыплят

использовались условия ведения опыта и рационы, цредложенные лабораторией витаминов Института биохимии им, ¿.Н.Баха АН СССР и Институтом биологии АН Латвийской ССР.

В течение всего опыта крысята и цыплята получали сбалансированный рацион как по аминокислотам, так и витаминам. За норму потребности в аминокислотах у крыс приняты данные Розе (1939), у цыплят - Попова (1965). Сбалансированная диета была дефицитна по шетионину (50# от нормы у крыс и 75% от нормы у цыплят), а также ло витамину Bj2.

Метионин добавляли в корм в различных количествах, доводя до нормы или ке до избытка его, т.е. до 10053 и 300& от нормы. В опк rax, где изучался обмен S -метилыетионина (витамин "ІІ") крыс, f долучали с ocj эвным рационом вместо метионкна Ш5 в эквивалентных количі лвах по молекулярному весу по отношению к метионину.

Параллельные группы, служившие контролем, в рационе по -лучали витамин B^g из расчета 150 мкг/кг диеты для крнс и 50 мкг/кг корма для цыплят.

За четыре дня до конца опыта отдельные группы животных и птиц получади дополнительно в рацион избыток (до 300& от

- 4 - . .

нормы) "стресс факторов"- валин, треонин, Пропдонаг натрия давался в количестве от I до 5%.

В конце опыта крыс помешали з обменные клетки для сбора суточной тчи. 7 цыплят суточный помет собирался через каддые десять дней. После завершения опыта крысы и цыплята забивались декапитациеи. Дня исследований брали кровь и печень. В моче крыс и экскретах цыплят определялась ШК, а в сыворотке крови ШКоА, В печени, кроме вигадана Bj^ и его коэнзима, определялась активность ферментов, участвующих в обілене ыетиошша. . v

2« Меторьг исследования

Обнее содержание витамина Bjq в печени цыплят определялось мшсробиолоїшчесішгл методом с использованием л качестве тест-организма Е. сої ¿//3-3 по методике Куце вой (XS6I).

Идя определения 5/ -дезоксиаденозилкобаламина (КоВд-о ) был применен ферментативный метод с использованием адофермен-та глицсрол-дегвдратазн, позволяющий обнаружить KoBjg в лико — молярних ісоличествах. Метод предложен сотрудниками лабораторій! эизкшлогш ц витаминов Института им. А.Н.Баха АН СССР, ( Чернядьева и др., 1970),

Активность бетапн-L -гомопиотеин-метилтрансШеразы определялась в гомогенате печени по ш дифициро ванному химическому методу иТсбвЬа.тз (1953) л шракалась в ш<г/г сырой печени/час , >

Для оцределмшя актишости АТ^-^-метиоітон-^аденозшггранс-уеразм и тосгатиотшспцт в та зп использовалась фракция белка 30-50Й насыщения сернокислым ашонием, полученная из надоса-дочиой двдкости печеночного гомогената путем дробного фракционирования*

Актишость этих ферментов определяли, используя радноизо-топиый метод Mudd и др. (IS65), цриыеняя в качестве субстрата для синтеза 3-Щ- ^С-ыетионин, а для синтеза цистатиони-на- І4С-серіщ.

Счет радиоактивных проб проводили с помощью автомата типа JS 70615 фирмы "Тёсла" (Jkvfomai Zum ffle.$sen гасісоасііоег

Рговеп )» е котором счет велся С ПОМОЩЬЮ свднтиляционного детектора или счетчика Гейгера-!йаллера. Дня метюнинактишруше-го фермента и цистатиошшсинтетазы акхизносхь выражалась в имп/мин/мг белка.

Гош с еринд е г игщатазную активность определяли в печеночном гоыогенате после тепловой обработки при 55° в течение 15 ига, Об активности данного фермента судили по количеству образованной <¿ -кетдмасляной кислоты, которую определяли яо методу Нсъопс&о Ka.isu.AL и др., (I97X).

Определение активности £ -аденозкяметионинрякотинамкг-М-метилтрансйеоазы проводили по методике Cantone (1955). Продукт реакции -/V-метилникотинамид определялся флуорометричес-ким методом по Leo-¿tas {1947). Активность выражалась в мкг/г печени.

Метод определения метшшалововой киодоты

Определение 1Ж вели по методу 0Вггпо2гег и др., (1967), принцип которого состоит в том, что при взаимодействии ШК с диазотированным пара-нитроаншшном развивается изуцрудно-зеленая окраска, замеряемая на спектрофотометре при 620 нм*

Дяя определения ШК в помете цыплят потребовалось подобрать условия для полной экстракции ММК и условия очистки от примесей, мешающих ее определению.

В результате этой работ мы остановились на нижеописанной методике экстракции, очистки и определения ШК в куриных экскретах .

Подготовка образда. Экскреты цыплят отбираются в течение суток , взвешиваются и хранятся до определения ЬШ в замороженном состоянии. Дня последующих расчетов результатов анализа на сухое вещество перед замораживанием берется навеска образца для определения влаги.

Экстракцию ШК проводили слабым раствором ЕСХ. Навеска образца заливалась десятикратным количеством 0,02-0,05 М НСХ, так чтобы рН конечного экстракта был в пределах могенизировадась 5 мин. После центрифугирования хгри 5000 об/мин. осадок удалялся, а мутная , темно-окрашенная надосадочная кид-

кость подвергалась очистке активированным углем в количестве 1% от объема. Точность метода проверялась по возврату ММ, добавленной в известной концентрации к исследуемый экстрактам ( габл.1).

Таблица I

Влияние pH и обработки активированный углем на выход Ш!К

№ об- Экстракция pH Экстракт, дооавлеио Найдено ММК

разца - мл ШК, мкг Активированный уголь, мкг %

I. 0,04 н НС1 3,5 ХО - - 216

То же ■ 3,5 10 - 1,0 205

0,05 н НСХ 2,8 10 _ - 2X7

То же 2,8 10 - 1,0 16?

г. 0,025 н НС1 5,3 10 _ - 266

То ие 5,3 10 - 1,0 253

5,3 10 30 1,0 291 101,

Водой о подведением рН 3,0 10 _ _ 291

То же 3,0 10 - 1.0 230

3,0 10 30 1,0 269 103,

Стандарт ЫМК в воде 6,0 10 100 100 100,

То же 3,3 10 100 1,0 99 99,

2,8 10 100 1.0 100 ХОО,

Описанная выше обработка возмоана лишь при высоком содержании ММК.

При низком содержании ШК вместо обработки углем образцы подвергались очистке на колонке с ионнообыевной смолой 1кЮ( 200-400 іхеш) Сі' *

Подготовка смолы и очистка экстрактов. 1x10(200-400 иеш) СҐ промывалась дистиллированной водой до отсутствия ионов хлора, переносилась на колонку 1x10 см ( толщина слоя смолы 3 см) ц снова промывалась водой, подщелоченной до pH 6,5, до тех пор пока значение стекающей с

колонки жидкости так же достигало рН 6,5. Экстракт помета ( 5 мл), подведенный до рН 6,5, вносился в колонну и промывался 100 ил воды рН 6,5. После этой промывки проводилась злюция ММК 100 ил 0,1 н НС1. Собранные элюагы, нейтрализованные I и -УаОН до рН 4-5 и соответственно разведенные или упаренные (в зависимости ог содержания ШЕС), использовались для определения в них ШК.

Результаты табл.2 показывают, что для экскретов с низким содержанием ШК очистка на колонке с является обязательной, т.к. исключает возможность завышения результатов.

Крысиная моча с содержанием Ш1С 2 иг и выше не требует дополнительной очистки, Е.к. большое разведение (1/500,1/1000) устраняет действие примесей, мешающих определению.

При анализе материала с содержанием ШК на порядок нияе указанного количества требуется очистка на колонке с 1x10(200-400 меш) С1 , как это описано выше для экскретов цыплят.

Качественное определение ШК проводили, используя бумажную и тонкослойную хроматографию на силикагеле.

Таблица 2

Влияние очистки экстрактов на колонке а 1x10(200-400 меш) С1 на выход ШК

№ Метилмалоновая кислота , мкг * 2 ог 1

л/п до очистки после очистки.

I 2

I. 2,09 0,63 30,14

2. 1,64 0,29 17,68

3. 2,97 0,90 30,30

4, 3,99 1,01 25,31

5. 31,19 30, II 93,94

е. 24,34 25,35 104,14

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Нарушение обмена метионина у крыс при недостаточности витамина

Изучая обмен метионина у крыс при недостаточности вита-шша В-£21 иы обнаружили , что с развитием дефицита^ животных, получашт корм с любым уровнем метионина, наблюдается значительное отставание в росте. Совместное применение витамина В^ в рационах с разным уровнем метионина способствовало шлопптельиону ростовому эффекту. Максимальные привесы отмечались при полной сбалансированности рациона по ыетионину и

витамину В^ (рисЛ).

дни

Рис.1, Влияние мегпошша и витамина ВТР на прпвеси крыс **

Уровень метионина "/<>. I - ЮО^+В^;

2 - 300£+В12; 3 - ЗО^+В^; 4 - 300^ 5 - ГООЙ; 6 - 50$. При дефиците метионина в рационе положительное действие витамина В^ объясняется его участием в реакции синтеза метионина. Дополнительный ростовой эффект при норме этой аминокислоты, а тагле снятые отрицательного действия избытка метионина объясняются це только участием витамина в синтезе ме-тюнипа из гомоцпстеина, но и включением его в обмен данной аминокислоты посредством второй В^-зависшой ШКоА-мутазноЙ

Реакцш* дефиците

О нарушениях в организме животных прй вйгашна В^»

помшо низких привесов, говори; ^экскреция ШК, которая не-

свойственна здоровому организму.

Результаты ( табл.3) дают представление о том как с развк-тием В12- авитаминоза у крыс нарастает экскреция ШлК. Обогащение диеты витамином снижает величину экскреции до норны. Данные этого опыта также показывают, что при кобалашшозой недостаточности резкое возрастание экскреции ШН отмечается даге у нивотных, получающих с пищей 50% нормы метионина, а при повышении метионина до нормы экскреция ШК возрастала почти вдвое. С дальнейшим повышением уровня метионина в рационе С до 300^5 ) не наблюдалось соответствия между выделением ШК и содержанием метионина в рационе.

Таблица 3

Влияние недостаточности витамина Вт? на экскрецию ИЖ при различных уровнях метионина в рационе крыс

Метионина в рационе, Метилыалоновал кислота , мг/крысу/сутки

% от нормы продолжительность оиологического опыта

14 дней 21 день 28 дней

I П Е 1У

50 15,6 23,0 38,0 26,1 36,0 35,0

100 17,3 37,0 60,0 61,9 45,0 54,0

300 28,3 34,0 70,0 34,9 48,0 56,6

юо+в12 - - 4,6 2,8 3,6 4,5

зоо+в12 — — 3,9 4,5 4,5 3,6

При. Bj.2- дефиците в условиях сбалансированности рационов по всем аминокислотам за исключением ыетионина, который shbci-ные получали только полнормы ( O.P.), моино было думать, ч?о величина экскреции ШС определяется нарушением обмена ряда аминокислот идущего через пролионат ( валина, изолейцина, треонина). Но доведение метионина до нормы в пище повышает }£1-аци-дурию в 1,5-2 раза. Поэтому можно сделать вывод, что экскреция ШК нарастает за счет нарушения обмена именно метионина.

Результаты, показывающие несоответствие между тройным уроз-нем метионина в рационе.и экскрецией ШК, не давали воз-

мощности объяснить наблюдаемую закономерность,Естественно, возникал вопрос не связано ли это с тем, что избыток метионина влияет на содержание витамина В^ в печени, как это отмечалось в работе и сотр.(1971). Так же можно было предпо-

лагать, что обнаруженный факт является результатом нарушений либо кишечной абсорбции данной аминокислоты, либо нарушением деацилирувдей активности почек превращать ЬШКоА в МЖ, которая собственно и выводится из организма. Однако все эти предположения были устранены при проведении последующих опытов.

Как видно из табл. содержание КоВ^ вдвое ниже у дефицитных животных и определяется только витамином В12 в корке, а не уровнем метионина.Говорить о'нарушениях кишечной абсорбции метионина при его избыточном поступлении в организм животных не представляется возможным, поскольку у крыс, получавших три нормы метионина, отмечались сиеЛсоны токсикоза, а в ранее проведенных опытах, отмечалось и значительное увеличение содержания свободного метионина в печени Арешкина и др. 1970).

Не подЬердилось и предположение о нарушении деацилиру-ющей способности почек превращать ММКоА в МК.

Таблица 4

Содержание ММ в моче крыс в зависимости ох разного уровня метионина при нагрузке рациона треонином, валином, пропионатом и степень обеспеченности животных КоВ|.,

Уровень метионина в рационе ОДК , иг/крысу/сугки КоВт? в митохондриях пе-

дополнительные добавки к рациону

% от нормы .ьез добавок контроль Треонин Пропио-наг _ натрия Валик чени рМ/крысу

50 35,0 57,0 72,0 - —

100 54,0 82,0 106,0 116,0 13,8

300 56,б 41,0 103,0 - 15,7

ню+в12 3,6 4,0 2,8 4,5 25,3

зоо+в12 4,5 — • - - 23,5

Как видно из таблицы 4, внесение избытка валнна или нропионовой кислоты сопровождается значитель-

но повышенной экскрецией ШК, что далеко превосходит все ВС-ЛИЧИНЫ экскреции ШК при разных уровнях метионика в корме.

Вместе с тем внесение дропионовой кислоты позволило проконтролировать обмен метионина от стадии превращения пропионата до метилмалоната (рис»2). Согласно результатам,нарушений на данном отрезке в активности ферментов не наблюдалось, за исключением нарушения активности ШКоА-мутазы.

Опыты с использованием треонина в рационе позволили обнаружить место нарушения обмена метионина, У крыс,получавших корм с избытком треотша,повышалась экскреция ШК против контрольной Группы только при содериании метионина 50 и 100% от нормы. (табл.4). При тройной норме метионина величина экскреции от добавки треонина не только не возрастала, но, наоборот, значительно снижалась. Эти результаты указалиМзЕарушения об/лена метионина до стадии образования пропжшовой кислоты.

Ме

тионіш

ХЪиоцистеин

аі-амино-бутцрат

-вС -кетобутират

Цистатггонш

-Дистеин -гомосерии -треонин

изолейдан

пропионовая кислота

Пропионил-КоА

валин------- ШКоА (а)

ШКоА (б)

3 Вд-2 - ШКоА-мутаза Сукц шил-КоА

Цикл Кребоа

рис.2. Включение продуктов обмена метионина, валина, треонина, изолейцина в общий путь обмена про-

пионовой кислоты I - шс татионинсшт е таза (і -сер ин-гвдр ол иаз а дезашнирующая К.Ф. 4,2.1.13); 2 - цистатио-наза (гошсериндегидратаза, К,Ф. 4.2,1.15): 3 - метилмалонил КоА-мутаза, К.Ф. 5.4.99.2)

Таким образом, можно было предположить, что дефект ШКоА - цутазы является причиной метаболического блокирования одного или нескольких ферментоввключающихся в обмен метионина. Если учесть, что прямым предшественником

пропионовой кислоты в обмене метионина, треонина и гомосерина является ¿С-кетомасляная кислота ( рис.2), то, судя по результатам опыта, нарушения в ферментативной активности следовало искать именно в этой части катаболизма метионина.

Известно, что крысы приспосабливаются к избыточному поступлению метионина с пищей за счет изменения активности ферментов печени, участвующих в обмене данной аминокислоты,а именно цистагионинсинтетазы и цистатионазы ( и др.

1969). Это позволило нам предположить, что подавление активности ШКоА-ыутазы при дефиците витамина В12 может сказаться Именно на активности двух указанных ферментов.

Результаты, приведенные в табл.5, характеризуют синтетическую и дезаминирующую способность печени в обмене цистатионина. Они показывают, что синтез цисгатионияа из гомоцис-теина и серила регулируется не только пищевым мегиолиноа, но и витамином В-^. Действие метионина проявляется лишь при недостаточности витамина В12. Избыток, так же как и недостаток метионина, подавляет синтез цистатионина. Это нарушение они -мается витамином В^*

Таблица 5

Активность циетатиошнсинтетазы и гомосериндегид-ратазы у крыс при дефиците витамина В12

Метионина в рационе % от нормы Цисгатионинсинтетаза Гом осериндегидра газа

г¿иинтезировано А С-цистатионина имп/ыин/мг о'елка иораэоваио «с-кето-бутирата месг/е печени

оез витамина В^ с вита -миной В<£2 оез вита- 1 мина В-^2 І с витамином

50 1360 2640 24эо 4590

100 2510 2800 2650 4530

300 1070 2850 2300 6300

Дегидрагазная активность печени, приводящая к <тС-кето-бутирату- продукту дезамшшрования гомосерина и цистатионина, не подавлялась и не индуцировалась иетионином. Однако эффек -

тивное действие витамина В^ при всех уровнях метионина является вполне очевидным (. табл.5).

Известно, что в метаболизме треонина, цистатионина и гомо-серина имеет место катабодическая репрессия, неконкурентное пк-гибирование или индукция ряда ферментов (Ксс,-6о и др. 1966; Каган, 1968) Так, треониндегидратаэа репрессируется еС-ашно,-

еС - имикобутиратом ( продуктами аыинирования аС- кетобути-рага), гсмосериндегидрагаза ( цистатионаза) индуцируется пищевым метионином, а так псе высокобелковой пищей. Пищевой цис-теин репрессирует или является неконкурентный ингибитором синтеза цистагионина.

В опытах Сг> о-сСъо о печеночными гомогенагани крыс было показано, что активность цистахионинсинтетазы подавляется цкстеиноц и оС-кегомасляной кислотой. В первом случае понижение активности было на 50%, во втором случае на 16-18% по сравнению с контролем С табл.б). Активность гомосеринде-гидратазы I цистагионазы ), дезаминирующей гомосерин и циста-тионин до оС-кегомасляной кислоты^ полностью ингибируется цис-теиноы и на 67-7% - =4-аыиномасляной кислотой ( табл.7).

Таблица 6

Влияние цистеина и кетомаоляной кислоты на активность цистагионянсинтетазы печени крыс

Уровень метионина в рационе, % от нормы Синтезировано ^С-цистатионина, имп/мин/мг белка

Контроль Добавлено в инкубационную среду % ИНГ! вания К0НТ1 ібиро-01 золя

цистеина ¿--кегоыас-ляной Кислоты настенном ОІ-КЄГ0- иас-ляной кислот ой

100 2510 1205 2108 50 16

100 + Вт~ 2800 ІВД0 22% 50 18

Таблица 7

Влияние цисгеина и «*—аминомасляноЙ кислоты на активность гомосериндегидратазы печени крыс

Уровень ыетионина в рационе, % от нормы Дезаминировано гомосерина до «¡.-кетомасляной кислоты, икг/г печени

Контроль Добавлено % шгибирования от контроля

Фісгеина .і-амино-иаеляной кислоты цистеином с(_-амино-ыасля-ной кислотой

100 1200 0 396 100 67

То же 1390 0 292 100 79

300 2120 0 518 100 77

Следовательно, дефект ЬШоА-мутазы, снижая способность печеии к дальнейшему метаболизму об- кетомасляной кислоты, приводит к накоплению ее в виде продуктов аминирования. Накопление же цисгеина, очевидно, связано с общим нарушением белкового обмена при дефиците витамина В^. Избыток этих соединений и приводит к катаболическому ингибированию активности цистатионин-синтетазы и цистатионазы, тем самым подавляя диссимиляцию метио-нина.

Полученные данные указывают на существование также и опосредованного ( непрямого) действия ММКоА-мутазы в обмене серосодержащих аминокислот: мегионина и продуктов его обмена. Восстановление активности ММКоА-мутазы при обеспеченности животных витамином Вы способствует нормализации катаболизма мегионина до сукцината, чго в свою очередь, снимает ингибирова-ниэ синтеза и распада цистагионина.

2. Недостаточность витамина В-^ и нарушения в обмене метионина, поопионата и важна у цыплят

При определении обеспеченности ПТИЦЫ ВИТаМИНОД В|2 используется весьма трудоемкий микробиологический метод определения витамина В^ с помощью Е.СоХс 113-5 в печени и сыворотке крови.

Как уже отмечалось выше, критерием обеспеченности витамином В^ для животных с однокамерный желудком служит экскреция ШК, которая связана с нарушением обмена ряда незаменимых аминокислот.

Вопрос о том, сопровождается ли недостаточность витаыи-ка В-^ у цыплят повышенным выделением ШК не был освещен в литературе. Поэтому для выявления возможных нарушений в обмене незаменимых аминокислот при дефиците витамина В^ у птицы мы специально разработали методику экстракции ШК и очистку ее от примесей для определения ШК в помете цыплят ( см.раздел "Методы").

Условия проведения опыта позволили получить экспериментально на 30-й день дефицитных по витамину В^ птиц* 0 дефиците витамина В^ свидетельствовало низкое содержание данного витамина в их печени по сравнению с нормальными цыплятами (4050 против 500-600 мкг/кг печени ).

Изучая обмен метионина при дефиците витамина У птиц по экскреции ШК, нами было обнаружено, что разный уровень метионина в пище не сказывался на экскреции ШК ( табл.8).

Таким образом, введение в качестве " стресс фактора" избытка метионина не позволило обнаружить при недостаточности витамина В12 нарушение метаболизма метионина. При всех уровнях данной аминокислоты в рационе экскреция ШК, как у дефицитных, так и обеспеченных витамином В^ птиц, колебалась в пределах от 2 до 5 мг на цыпленка в сутки.

Таблица 8

Динамика экскреции МК б зависимости от уровня метионика и Битамина в диете цыплят

Ыегионина в рационе, % от нормы ¡Ш , мг на сухой вес помета цыпленка за сутки

10-й день 20-й день 30-Й день

75 1,03 1,55 2,11

100 0,46 2,65 5,90

То ас + 0,55 1,42 4,67

300 1,06 . 1,76 5,41

То не + В12 1,46 0,89 3,23

Рис.3. Динамика экскреции Ш1К у цыплят при введении в рацион пропионата натрия.

1.-10С$метионина+ I,5% пропионата натрия;

2,- 10С$ыетионина;3 -то же+

В12; 4 ~ то жв + пропионата натрия

На рис. 3 показаны результаты опыта, в котором цыплята в течение месяца получали на фоне сбалансированного рациона 1,5%

от веса корма прошшнат натрия. Согласна данным этого опыта, у цыплят вследствие дефицита витамина В^ отмечалось нарушение обмена нропионовой кислогы, о чем свидетельствовала экскреция ММК. При том наблюдалась прямая зависимость между степенью В-^-авиташноза и количеством выделяемой ЬШК. У птиц не дефицитных по витамину В^ повышения экскреции не наблюдалось.

Результаты опытов, где испытывались добавки валина, пропионата натрия на разном уровне ыегионина в рационе, показали, что получение с пищей избытка указанных кислот в течение четырех суток, привело во всех вариантах опыта к очень высокому выведению ЫЩ при недостаточности витамина В12* с вое —

становлением обмена, при введении витамина В12в корм, экскреция МШС падает до нормы ( рис.4). Данные этого опыта показали, что валин и пролионаг натрия могут быть использованы как " стресс факторы" для установления дефицита витамина У птиц.

Полученные результаты исследований на дефицитных по витамину В^ цыплятах конкретно показывают, что нарушений Семена валына и пропионовой кислоты связанны с дефектен ыутазы. Обмен метионина таки^^йроходить через стадию образования ШК, зависимую от ШКоА-мутазы. Однако при использовании его в качестве м стресс фактора" не удается обнаружить повешенное выделение ЕШК в экскретах цыплят. Это указывает на специфику обмена ыетионина у птиц, очевидно, связанную с подавлением одного из ферментов, участвующих в реакциях до образования пропионовой кислоты.

В первую очередь мы искали эти нарушения в двух анзииа-тических реакциях, участвующих в превращении метионина фго продуктов обмена до ¿¿-кетшасляпой кислоты, т.е. ферментов цистатиопинсингетазы и цистатионазы ( гоаосериндегидрагазы).

Интересно отметить, что энзинагическая активность в синтезе и распаде цистатионина, определенная в одних и тех не условиях не тождественна у разных видов швотних и у разных органов и тканей одного а того не животного ( иХи.сСсС,

п ^еii6e.cn , 1965). Согласно нашим данным, приведенный в табл.9, печень птицы обладает высокой цистагцошшсшзтетаз-ной активностью. Действие последнего ферцента прекде всего определяется содерианиеи пищевого метионина. С повышением его содержания соответственно возрастает активность фермента синтезирующего цистатионин. Опосредованное действие витамина Ввыражающееся в подавлении синтеза цистатионина при разных уровнях метионина в корме, пока неизвестно.

Что касаетсп активности фермента, дезамйНирующего цке-. татионин и гшосерин до обткеюыасляной кислоты, то резуль -

таты свидетельствуют о чрезвычайно низкой ее активности у цыплят при использовании цистатионина в качестве субстрата. Если не субстратом являлся гомосерин, то определить активность фермента при условиях, которые были приняты нами для крыс , не представлялось возможным.-

Модифицировав метод определения,мы смогли обнаружить активность гомосериндегидратазы ( цисгатионазы), которая оказалась в 25 раз нике активности фермента печени крыс (204 против 5200 ивг/г печени в час).

Таблица 9

Влияние мегионина и витамина В12 на активность цисгагиояинсингегазы и гомосериндегидратазы (цисгатионазы) печени цыплят

Метионипа в рационе, % от нормы

100 300

юо+в12

300+В

12

Активность циста-гионинсинтегазы, имп/мин/мг белка

5152 9206 2555 3683

Активность цисгатионазы , мкг оС-кетоыасля-ной кислоты на г печени

100 178 58 170

180 166 120

82

иизкая активность фермента, разрушающего цистатионин л гомосерин у птицы , по-видимому, является причиной блокирования обмена мегионина до стадии образования пропионовой кислоты. В этом, как мы полагаем, и следует искать ответ, почему нарушение обмена метиоиина у птицы при дефекте ШКоА-мутазы яе сопровождается повышенной экскрецией ШК.

На основании проведенных опытов на цыплятах можно сделать следующее заключение. Экскреция ШК у птицы, в отличие от крыс, яе отражает нарушение обмена мегионина в связи с недостаточностью витамина В12*

Рис.4. Влияние добавок вашна, метионина и пропиоігата натрии на экскрецию ШК у птиц

Однако эхо не говорит еще о той, что не существует пути обмена аминокислот контролируемого ШКоА-мутазой. Так, в той случае, когда в рацион дефицитных по вигашшу Bj2 цшши вводится пропионат или валин, наблюдается выделение ШК, что свидетельствует о наличии реакции, контролируемой Ш1СсА-ыута-зой.

Обнврукенныс различия в катаболизш метионина у крыс и цьшлят представляют большой интерес и требуют продолжения исследований путей обмена данной аминокислоты у птиц.

3. . ^етилметионин ( витамин "Ц," ) в реакциях уранссульашрования и гиаксмегилированин в кивотном организме

Обнаруженные нарушения обмена метионина в организме авитаминозных аивстных получили свое подтверндеше в исследованиях, касаювдхсп обмена производного иетионина - UÜS .

Соли метилиетионина нашли широкое применение в клиниве в качестве противоязвенного фактора. Этот факт, ц виезге с тем далеко невыясненный иеханизм его действия побудили нас «постановке исследований метаболизма этого соединения у илекопига-щих.

Известно, что ULIS в числе ониевых соединений является донором метильной группы в метилферазной систеие, специфичной к гомоцистеину ( Klee, IS65)* Учитывая это, uosho пред -ставить, что некоторые стороны обмена Ш5 и его действие на соответствующие ферментные системы будут аналогичны метионину, поскольку участие №13 в метилферазной реакции приведет к сил-

тззу одной молекулы метионина за счет метилирования гомоцистея-па и к высвобождению из Шй второй молекулы метионша. На рис.5 отракены некоторые ферментные системы, с участием которых шкет осуществляться обмен ШЙ.

Одаоуглеродистые

Екс.5. Возможные цути обмена 5-метилметионина (витамина "Ц'Оу животных. I - Бетаин: 6 -года да с т еш- ,5 -м е тклтран сфераза (К.Ф. 2.1.1.5); 2 - АТФ: £. -метиснин-,5-Аденозал-трансфераза (К.Ф. 2.5.1.6); 3 - Ь -серин-гидро-лиаза (дезаминируишал (цистатионинсинтетаза) К.Ф. 4.2.1.13; 4 - Гоыосернн-цистатионин-дегдд-ратаза (цистатионаза ). К.Ф.4.2.1.15; 5-5 -аде-нозШЕлетшнин: нт;отинамял-/У -метилтрансфераза

(К.Ф, ;3.1,1.1). 6 -метилматнилйоА-мутаза

(К.О.5.4.99.2)

При дефиците витамина В^ добавление к нище Ш5 , как и метионина, приводило к значительной экскреции ШК, доказывая тем самшл, что катаболизм ММЭ , идущий по пропионатноцу цути (реакция 6), нарушается и контролируется ШКЬА-ддутазой (табл.II).

- 21 -

При выяснении характера действия ММS на синтез йетиони-на (реакция I) в опытах irttrctzo, где непосредственно перед определением метилферазы вносили в инкубационную среду одновременно с бетаином 'Ш5. или метионин в количестге 8 кикро.::»-лей/мл среда, было показано, что метиошш, как коїієчш.11 продукт реакции, ингибіфовап перенос CHg-группы бетаина на гс;.:о-цистеин. В противоположность действию ыетионша, Ш5. ка;; донор CHg- зсруппН; сохранял это свойство в присутствии бетаїїна, конкурируя с ним за гомоцистеин (табл.10).

Таблица 10

Влияние действия Ш5 на синтез метиокшіа в печени ( крыс

Инкубационная среда

Синтезировано иетпоиша мкг/г печени/ час

Гомоцистеин

Бетаин

+ Uttô

+мєти0нин

Ш5

Метионин

53 315. 650 127 550 0

Таблица II

Влияние метионнна и IMS на экскрецию мешлмгдо-новой кисло 1'ы у крыс, дефицитных по шташшу Bjo

Экскреция Добавки к основное рациону, % от нор:;а метионнна

метионина Ш5 '

0? [ор+50 0Р+250 ОР+50 JoP+250

Me тшшалоно вая кислота JUZ /lcpê/СУ/СУТКЦ 26,7 61,9 34,9 70,5 21,8

Исследование действия Ш5 на фермецтгше системы, чувствительные к метиошщу и его продуктам осилена (te.6jû 12) сопг.-рулшлс, что. в реакциях, активирующей метиошщ до З-аденозпл-

метионина ( реакция 2) и дезаыинирующей гоносерин и цистатио-ния до оС- кетшаслиной кислоты ( реакция 4), действие ШЛ5 аналогично действии метионина. Повышенный уровень ¡Ш5 в рационе, как и метионина, индуцирует активность ¿-метиошн-ад енозил-т ран с-феразы.

Таблица 12

Влияние метионина и Ш5 на активность метионин-аденозилгрансферазы, цисгагионинсингетазы,го-м осериндегидратазы печени крыс

Добавки к основному рациону (О.Р.), % от нормы метионина Синтезировано

14с -5АЫ (¿-кетойасля-ной кислоты ( при дезами-шаровании го-мосерина), мг/г печени за 30 мин.

имп/мин/ur белка

за 60 мин. за 135 мин.

О.Р (50%метионина) - 410 2,49

0.Р.+50^Еметионина 680 750 2,65

0.Р.+250& ыегионина 1520 630 2,30

о.р.+ 50J5 ms . 910 620 2,13

О.Р. +25^6 1460 315 2,79

Результаты опыта по изучению влияния JJ1I5 на синтез циста-гионина из гшоцистеина и серина ( реакция 3) характеризуют зависимость активности цистатионинсинтетазц от уровня метионина или ЬИ5 . Действие последнего более выражено. При его избытке в рационе синтез цистатионина падает вдвое ( табл.12). В литературе {Sieloe^ 1955) есть указания, что при замене метионина на MMS у животных появляется дополнительная потребность в цис-теине.Наии данные позволяют предположить» что эго свойство у животных связано с подавлением активности цистатионинсинтетазы при замене метионина на ШЗ . Отмеченный факт можно объяснить способностью Ж5 конкурировать не только с бетаинш , но и серивом при синтезе цистатионина из гомоцистеина.

Установление возможности участия MMS в реакциях ¿-метилирования за счет бетаин-гсмоцисгеин-иегилтрансферазы, определило дальнейшее исследование активности 1Ш5 как метияирующе-

го агента в реакциях Л'-нетшшрования С реакция 5), в частости, в метилировании никотинамида в/У-метилникотинамид. Результаты ( габл;-13) показали, что если цетиовдш в. присутствии АТФ приводит к синтезу Ы'- метилншсотииаыида, то в данных условиях Ш5 в метилировании никотинамида не участвует.Однако введение гоыоцистеина в инкубационную среду, содержащую АТФ и 11^5 , способстврвало. синтезу Ы~ ыетилникотинамида. Тем самым результаты опыта показали, что Ш5,как таковой, не активен в реакциях /V- метилирования требующих ЗАМ,и только при наличии гоыоцистеина в среде происходит реакция N-метилирования. Б этси случае в результате взаимодействия гадоцистеина с ШЙ образуются две'молекулы метионина. Последние вступают в реакцию с АТФ с образованием который и осуществляет реакции //-метилирования:

1. Иётионин + АТФ :—и-ЛШ,+ пирофосфат + ортофосфат

2. ¿-АН + .кикотипамид--- ¿-АГ + Д^-метилникотинаиид

■ 3. Ыегилметиояин + АТФ + гсмоцистеин —»■— 2 метиопин +АТФ—— и'далее по пути I и 2 реакций.

■ ■ ■ ■ Таблица 13

' Возможность участия ШЗ в реакциях метилирования, требующих 5АЫ

Инкубационная ■ среда- Донор СН*-грушш ^ Дополнительные добавки Синтезировано ЛЧлеТШШШСОГИН- амида, мкг/г печени

АТФ метиопин -

Ш5 - 0,0

гомоцнстеин 5,4- .

5 ,06 '

. 5,6

Таким образом, изучение обыеиа Ш5 показало его специфические особенности в реакциях трансметилирования и транссульфирования.

Данные в отношении метилирующей способности в синтезе метионина показали его большую активность по сравнению

с бетаином, в то время как ыетионик ингибировад свой биосин -

- 24 -

тез из готвдотеина и бетаина.

Возможно, что именно с этим и связано противоязвенное действие $-мешшетионина, в отличие от мегионина, который в этом отношении оказался неактивным.

BUBOдн

1. У млекопитающих (крыс) дефицит витамина В^, вызывает нарушение катаболизма метнонина, вследствие дефекта ШКоА-«утазш

а) прямым результатом дефекта является нарушение обмена метионина на стадии цревращенш метилмапсвшг КоА в сукцшшл КоА;

б) опосредованным (непрямым) результатом дефекта ШКоД иутазы является катаболическое ингибироеание ферментов, участвующих в синтезе и распаде цистатионина.

2. Установлено, что у птиц (цыплят) При дефиците EHT.Bjg нарушение катаболизма шлина, а также прописната идет по ме-тилмалонатному пути как п у крыс, а диссимиляция «етионина подавлена на стадии образования »¿-кетобутнрага, вследствие весьма низкой активности гомосериндегидратазы (цистатиона-зц).

3. Доказано, что некоторые пути обмена S -метшплетионина у екопитающих аналогичны метаоншу, в частности, .доказан пропионатный путь обмена -метилиетионина. На примере метилирования гомоцистеина показана высокая активность Ш5 , как донора метильной группы, что определяет его свойства как конкурентного ингибитора бетаин-гошцистеин-метнд^ансферазы.

4. Предлагается относительно простой метод диагностирования обеспеченности ПТИЦЫ витамином Bjg по ощэеделенш экскреции ШК.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Л.В.Снегирева, В.О.Бекер, Л.й.Арешкина. Роль витемикь В^ ^ обмене йетионина и валина у цыплят. Прикл.биохии. и микробиол.,У]Н,4,475,1972.

2. Л.В.Снегирева, Л.Н.Арешкина. Метод определения нетил-ыалоновой кислоты. Прикл.биохим. и ыикробиол.

363, 1972.

3. Л.В.Снегирева, Е.П.Скоробогатова, Л.Н.Арешкина. Об обмене ¡гыетидыетионина (, витамина "Ц" ) у млекопитающих. Прикл. биохим. и цикробиол. IX,2,179, 1973.

4. Л.В.Снегирева, Л.Н.Арешкина. Метод определения степени обеспеченности цыплят витамином В12- '-Тезисы докладов и сообщений Всесоюзного совещания м Фиэиолого-биохимичес-кие и генетические основы повышения эффективности использования кормов в животноводстве", 2-5 июля, 1973, г.Боровск, Калужской обл.

5. Л.Н.Арешкина, Е.П.Скоробогатова, Л.В.Снегирева. О нарушениях обмена метионина при недостаточности вигашша

у животных. Прикл. бисаош. и микробиол. X., а,1974.

Подо. к_печ.___________

Типография ХОЗО Госплана СССР