Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ионов натрия в процессах трансформации энергии у морских цианобактерий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль ионов натрия в процессах трансформации энергии у морских цианобактерий"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ ЕЕВОВДШ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННА! УНИВЕРСИТЕТ' ям.М .5.ЛОМОНОСОВА.

На правах рукописд УДК 577.23

КИИ® Крина Игоревна

РОЛЬ ИОНОВ НАТРИЯ В ПРОЦЕССАХ ТРАНСФОЕДАШИ ЭНЕРЕШ У МОРСКИХ ЦИАНОЕАКТЗРИЙ

/ 0.3.00.02 - ЗиоЛизика /

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканиа учэной степени кандидата биологических наук

• Москва - 1990

■л ,

)

■ Работа выполнена в отделе биоэнергетики Кеяфакультетской проблемно}! научно-исследовательской лаборатории молекулярной "биологш 1 биоорганической химия им.А.Н.Белозерского Московского .'государственного университета им .М.В.Ломоносова и на кафедре ге-• ,нети"и и молекулярной биологии Одесского государственного унявер-, сито та им.И.П.Мечникова.

Научный руководитель: член-корреспондент АН СССБ,

профессор В.П.Скулачев Сфициачыше оппоненты: доктор биологических наук

В.А.Шувалов . кандидат биологических наук Ю.В.Балнокин" Будущая организация: Институт биофизики АН СССР ■Зашита состоится Х990 года в_ча-

сов на заседании специализированного совета при Московском государственном университете по адресу: 113899, г.Москва, Ленинские горы, Биологический факультет М1У.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

1990 года.

Б.А.Гуляев-

Автореферат разослан и ¿С "

Учендй секретарь / „

специализированного совета К,ОШШ кандидат биологических наук г

•. i ХАРАКТЕЙЮТИКА РАЮТЫ

. Актуальность п;х>йдс.'.:ы, Ь послэдкяе годы значительно возрос интерес исследоват&тгей к роли ионов натрия в биоэнергетических процессах. Прежде всего это обусловлено серьезными затруднениями, возникшими при пошткэ приложения классичэского протонного цикла Мятчела / Mitchell , 1966 / к энергетике иякроорга'тиз- > ¡лов, живущих в щелочной среде. У таких бактерий £]йн+ , в силу-своей незначительной величины, не мо*ет выступать в качестве конвертируемой форма энергии я обеспечить осуществление клеткой таких жиянэнноватис процессов как синтез АТ5, вторичный транспорт веществ и движение бактерий. Одним из выходов из теоретического затруднения явилась гипотеза ВЛ.Скулачева о сущестЕозанли у таких бактерий энерг тики нового типа - - тушла, согласно которой ÄjC&a+ , создаваемая первичными генераторами выступает в качестве конвертируемой формы энергии.

Б настоящее время описан целый ряд первичных генераторов . Л|й11а+ : каля -хиноя-редуктаза, -терминальная оксядаза дыхательной цепи, различные Ка+ -декарбоксояазы и "а -АТЯазы, а также описаны потребители энергии ijüiia^ : На+-АТФсилтаза, На+-мвтач болит-симпортвры и Нп"г-мотор бактерий. Показано также, ^то протонный и натриевый циклы мотут сосуществовать друг о ^ругом.п, в зависимости "от условий, мозат осуществляться протонная или натриевая энергетика / Скулачев, ISSG/. В связи с этим актуальной задачей является экспериментальное изучена как различного рода первичных 4йта* -гэнграторов, так и систем непосредственно лс-пользуидях 4j3ia+ дня совершения полезной работы.

Все исследованные в данном аспекте бактерии являлись гетеро-трофали. Ярким примером бактерия, обладающей Ьл+-эяергатик(г^аяв-ляется морская аелочеуотойчийая гетеротрофная бактерия 'Vibrio • alsiiiolytiou3 , дня которой описан полный >.Tß+-itm; /Bibrav ot

а1, 1986 /. Логично предположить, что и у морских щелочеус-тойчивых фотосинтезируюдих бактерий имеет место Ка+-энергетика. Особенный интерес с этой точки зрения, на наш взгляд, может пред^аалять энергетика цианобактерий - уникэдышх прокариот, обладающих способностью осуществлять кислородный фотосинтез и зд-вудих при щелочных рН ереды. Поэтому в качестве объекта исследования была выбрана морская щелочеустойчивая цианобактерия.

Целью настоящей работы является выяснение вопроса: могут ли ионы натрия участвовать в процессе трансформации энергии у щелгчеустойчивых бактерий-фотосинтетиков, в данном случав у морс-,ких цианобактерий. В связи с поставленной целью представлялось целесообразным:изучить роль ионов натрия ъ процессе генераци" светозависимого элвктрическо1'о потенциала на цитоплазматической мембране цианобактерий, в процессе фотосинтетического выделения киолорода; выяснить - мокет ли служить источником энергии

для движения трихомов цианобактерий; провести ингибиторный анализ генерации дУ и движения трихомов для выяснения механизмов • образования л^и11а+ на иитоплазматячеокой мембране цианобактерий.

. Науч.чая ноиизна работы. В настоящей работе впервые показано, что ноны натрия принимают участие в процессах трансформации энергии света на сопрягающих мембранах фотосинтезирувдих бактерий - морских щелочауотойчивых цианобактерий. Установлено, что в •отличие от пресноводных цианобактерий, -у которых процеосы превращения гноргии сопрякеаы с электрохимическим градиентом протонов, морская щелочеустойчивая вданоС/актерия О.Ъгеу1а обладает 1'а+ -зноргоглкой. Впервые обнаружено, что такие зкергизувше светом процессы как генерация трансмембр-днного электрического потенциалу на цитоплазматичоской мембране, дшнсенио трихомов, фотосинте-тлч*,гксо ицдалонае кислоте да .у О.Ъге\'1а зависят от Не+, уо-тойГ'Шгц г дзйст^л» пртточофороо в присутствия нв+ , чувотвитйль-'

ш к совместному воздействию моненсияа и протонофора; также впервые продемонстрировано, что движение трихомов цианобактэрий поддерживается искусственно созданным а^11!а+ .

Результаты ис чедований -,вэдэтзльствуют о том, что: на цито-плазматнческой мембрана исследуемых цианооактерай присутствует • первичный др;а+ - генератор; образование д_)йНа+ прямо чль опосредовано сопряжено с переносом электронов по ^отосянтетиче-ской электрон-транспортной цепи; а^раат роль конвергируемой

формы энергии - используется цианобактеряями для совершения механической работы - движения трихомов.

Теоретическое а практическое значение работы. Получечные результаты: открывают новые аспекты при исследовании процессов превращения энергии сьата у фотосинтезируацпх микроорганизмов, в ' частности, изучении роля натрия з сопряжении фотосттвтпчестг процессов; подтверждают гипотезу В.П.Скулачева о существовании энергетики нового типа - На+-цикла у бактерий, принадлежащих к • различным таксономическим группа,!; помогают лучше понять механизмы адаптации бактерий при изменении условий окружагдзй среды. Результаты настоящей работы могут быть использованы также в биотехнология при разработке оптяматьных условий для интенсивного куль-' тивирования галотолерантных циакобактерий. •

Апробация гзботч. Материалы диссертации докл"давались на 16-ой конференции ФЕЮ (Москва,-1980), 17-ой конференции ¿ЕЮ (Бьряян, 1986), Всесоюзном биохимическом съезде (Москва,1986), созотско-щвейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура л функции" (Рига,1933). Работл также била апроблрозана на семинарах но ■ биоэнергетике ГШД им.А.Н.БелозерскогоЛдосковского государстемного университета. '.•'•"

Публикациит По теме диссертации опубликовано 12 работ. Объем и структура ряботн. Диссертация состоим из взедеаая,

обзора литературы, экспериментальной части '(включающей разделы "Материалы и метода", "Результаты", и "Обсуждение"), заключения, вводов, и списка литзрагуры, содэр^ацего 220 работу. Диссер^л-' для илоаенэ на 130 страницах машинописного тпкста, включая Щ-рисукков и 5 таблиц.

МАТЗРШУ И МЕТОДЫ ИСОЛЕДО^АШИ

Объекта исследования и их ктаьткыгоованиэ. 3 качестве основного объекта исследования использовали нитчатую_скользящую морскую щелочеустойчивую цианобактеряю Oscillatoria'brevia. Тля провидения сравнительного анализа использовачи пресноводный вид цианобактерий того же семейства — Pfronr.idi.uni uncinatuin.

Альгологически чистые культуры цианобактерий выращивали а конических колбах в лшииостате при пост<~<ш:ом освещении 1000 люкс, при температуре 25°С. Для экспериментов отбирали трихомы цианобактерий, выросшие на границе вода-воздух в течение 2-5 дней. О.Ъгс/ic вырастали в среде ASK III ' Rippka et al, 1979 /. Эксперименты проводили в синтетической среде N , основными компонентами которой были: iigSO^- ICh.J.l, кнсо^ -IOi.i.l, Mncx2-O.OIr.'M, Трис-ЮмМ, pH 7.0-9.6. В зависимости от целей эксперимента е среду добавляли до 400t,i,! HaCl или маннита, pH доводили до саданко.й. КаОН • или КОН , в средах с рП 7.0-7.5 Трис заменяли на KOPS . Ph.unclx?tun ЬЫрашквалИ В среде BG11 / Rippka et al , 197Э /. Эксперименты проводили в среде 3011 , содержащей 5СШ КаС1 , 10 ii.l Трис-HCl .

Микроскопическое измерение скорости движения таанобактвшй процодшл на микроскопе " Univar определяя время, за которое трпхом перемещается на расстоянии 10-20 мил. Для подсчета ско-pofcTii дшиегля брали среднее из данных, полученных для 10 трихомов.

Измерение мембранного потенциала проводили по распределению проникающего «лпофилького катиона этияродамина, измеряя интенсивность флуоресценции этилродамича (1(тл) внутри отдельного тричэма я-в среде. В среду добавляли 1мкМ этилрогдч.ша. Регистрацию осуществляли на мпкро^луорииетрической установке, состоящей из микроскопа " Univer" , шжрофлусриметрическо.Н насадки ФМГ1—IX с набором специальных зс дов п фильтров, .монитора, регистратора переходных процессов L7-ICÜ0 и ".'Jova 3D". Измерение кинетики мембранного потенциала ( л¥ ) проводили в ляаэробных условиях при Т -32°С. В качестве величины брали среднее из данных для 10 т; яхомоб.

Для получения анаэробиоза в герметичных вроменчых препара-. тах цианобактерий использовали глгокозо-оксидазную систему, содержащую,как правило, 10мМ глюкозы, 0,01мг-мл~* глюкозооксидаз:, 0.2мг-мл-* каталазы.

Регистрацию (5отоси;у:етиче~:-:ого выделения кислорода в' суспензии цианобактерий проводили на полярограз;е LP-7e (Чехословакия), > используя электрод Кларка /Кондралюва,1973/.

Образование искусственной лр'1а на мембранах трихомов пнапо-бактэрий, нмекхдей такое яе направление как in vivo осуществляли путем добавки ЙСОмЫ KaCi к предварительно истощенным по Ка+ . и

■j

деэнергизован.чым трихомам, дня таких экспериментов отбиралч од-но-двухднпвше трихомы цианобактерий, которые обладали подвин-ностыз только па свету, и, соответственно, могли ^ыть деэнергизо-ваны темнотой. Процедура истощения по натрию клеток цианобактерий заключалась в следующем;o«brevis предварительно выращивали на . покровных стеклах в течение 20 часов в среде с IO.í.1 NaCl , затем» непосредственно перед экспериментом трихомы вданобактерий, прик- ■ решенные к покровным стеклам подвергались десятикратному промы-' ваниь в среде, не содержащей ионов натрия, с последующей часовой

акопозициэй на свету и повторным десятикратным промыванием срэ-- .-дой в объеме 1мл.

Определение содержания хлорофилла "а" в экспериментальных .. пробах проводили с пе к т ро-рс т ом е т рич о с кям методам количественного определения шгаентов в 80$ ацетоне / UcKíney, 1941 /.

РЕЗУЛЬТАТЫ И 0КОД2НИБ-I.I. Уровень atj и старость движения трихомовo.brevisв зависимости от содержания натрия во внешней среде. Одним из доказательств того, что энергия лр:1а+ используется для движения бактерий может служит^ выявление зависимости подвижности трихомов 0.bravia' от концентрации натрия во внешней среде. Согласно гипотезе о механизме работы На+-мотора бактерий, для осуцестЕлаиия движения искы натрул выступают в к' честЕе "рабочего тела"срганел-лы движения и абсолютно необходимы для поддержания подвижности клоток. Если трансмембранный потенциал ( ¿У) генерируется в ре- • зультате работы üjüi!a+ генератора, то его уровень также должен зависеть от наличия ионов натрия. В связи с этим в первой серии исследований изучали влияние Ка+ на скорость движения и генерацию" лU у O.brevis.

На рис. I представлены зависимости одновременно измеренных ' уровня ¿у и скорости движения трихомов o.brevis от концентрации Мосд. в среде .инкубации в анаэробных уоловиях при рН 9.6. Можно видеть, что максимальные значения уровня 'дУ и скорости движения . наблюдаются прч внеклеточной • концентрации Nací 50-50СШ. При уменьшении концентрации На"* происходит снижение скорости движгчия и Уровш ¿y у o.brevis . При исключена!" ионов натрия из' среды инкубе' уш трихомы практически неподвижны, интенсивность флуоресценции. змлродамина тчутри трихомов 0.bravia снижается на 50/Ó, кропи того, существенно увеличивается время генерации ду. На рио.2 иокрзаио ^¡ияндд аопоь натрия на время генерации дУ. да цитоолаз-

о

F:ic. I. Влиянлэ Had на дт? .движение и йотосинтетическов внделе1шв Og 0.Previa . Срэда N ,рН 9.6. I- движояие; 2-дрчжение ч присутствии 5мкМ ХКФ; 3- ьЧ ; 4-л У в присутствии 5мкМ лКФ: 5- выделение 02;---при добавке KCl.

I

Ряс. 2. Влияние Had на кякьгшсу генерации сзетоиядуциро-ванного 4'i у O.brevis , среда N , pH 9.6 I- в присутствии ЮСШ KaCl ; Z- 1СШ NaCl ; Зг в. отсутствие UaCl.

магической мембр.чяе o.brcvie Для того, чтобы яслзе показать разницу в- кинетике процессов э^ект нормирован по максимуму. Можно выдать, что в отсутствие ионов натрия время генерации ¿Л' увеличивается в 5 раз по сравнению с образованием aU в присутствие IQOt/U Iic-Cl .Таким образом, Генерация &V ^ отсутствие ионов нат-'рчя затруднена,- мембрана частично разоощена. Добавка KCl (ГТШ) но приводит к появлению подвлшюстя и улучшению гена рации л У у O.brevi.s ( рис.2 ).

1.2. Действие протоноТюрг. п мпненсина на уровень мембранного потенциала и .■лияыние тг.чхомоч Q.brevls . Как известно, на мембранах бактерий может быть образован либо в результате работы первичного лjulla"1-генератора, либо - ¿^"""-зависимого.;Ва+'/ч+-антипортэра. Дискриминировать пут. генерация д ¡¡ozi '■> добавив в сро^у npotokoiop. 3 том случае, осле на мембранах бактерий присутствует первичный генератор ajüi;r+ , генерация электрического потенциала и движение бактер"й долкны быть устойчивы к протоно-фору, добавка которого приводит к рассеива;шю tjuH+ . Примером " тому может служить устойчивость к ДКФ мембралюго потенциала л движения морской гетеротрсфноГ. бактерии v.alcinalyticun , обладающей пьрзлчнкм &jlsa.+ -генератором - ллш-хинонредуктазой дыхательной цапи /lokuda, Unemoto, 1SS?| Dibrov et al, /,а так-г.в подвижность алкалофильних бащшШЫ / Hirota.et al,1931/.Нам чгяга удалось показать, что ДЕитсение трихомов O.brsvis и генерация 'лУ достаточно устойчивы к пронофорам ХКФ и TT¿Б при наличия .\juXa+ на цитоплазматической мембране.

■ UroroHoJop ЖЗ, добавленный в ко дентрации 5мкм не оказывает существенного влияния на уровень дУ и скорость движения трихомов o.biwis в присутствии в среде инкубация I0-500w£Ä HaCl (рио.1) Ücw-пченав лоаов натрия из среды инкубации потыкает чувствительность «?л«эряакых параметров к лротоно^ору. Добавка XKä? в стсутст-

X 3 я á ÎJ У n H д til

о 41 о о о . ¡=1 . o •d g f

3 ra G ti u о. ш Я " а>

• о я р н o 0 о

о •tí м с s о о ш .—

я: Я о á •¿3 Ö CD -d ta о

о о и •< s •el ta fe: 3

о т; ш p СХ. о ►3 3

й •d о •cl г» •ö о ►1 a

? CD •ti а- s и •tí а> Я 'Н

из s И hj о о О a Ё Я я

Sc o I О • о ?» o 1-3 Я да

o. < со CD о 4< я Ü о

w о у- ■ a 33 CD СХ - • -"-I

rj • и я (о . • о Х 1—; О. <1> о

р о сл •tí œ -л« ÍB О D ti 0) §

H Cü » vj я о s 71 о Й

U 43 ta s в M я ^3 &> я

s bu о о a » 1> CJ о •tí

§ .ai о и •-3 ►3 р о у '4 M •о У i р g

о •tí w ^ w X £ о. a •tí о к й со о

о а о ' m р о н> о й го о я и •а tí s -3 -tí p о о ¿1 со §

sc 5 КЗ CD M ¡я CJ ё SS А >13*

i? 2=1 a Я V« о J3 (Г CD к

я . œ V.1 со о I.* о p о а Я X

*-з я *d ? S ч' ^ s я я

n о tr •ö ti б . ■ о я о о (3 ш и •tí

CJ i-í — g о Г'. ь< о » G о

3 о о a a m Со

Ю í? >- л -э S ?» » CD А ä X и CD ч ►tí о •s p

л f о ' о *-3 с а H О г* + Ï3 о -3 a сх й П а;

а ' ч • U о w о s о

• а g HI о • tf > ' S3 CD в СХ о » CD и ч CD i

♦-i a ci S3 t> Я о S ¡3 •и

s •tí •сi о «-¡ ы О а 5з ta ►J

>--Ч кЭ SI CD о CD

б в о a Л U о. О ■ Я

s Î3 •Ö & ti сх в я С»

►з й о N О p и а СJ

о >-3 я Сх Й ta M Ы g

o ►з > о t- о CD о

-o й t* - <л •g ta CD ^ и Не S да g

5 ,-3 О о 2 о S S

•-3 а •►з О •tí >

5 W S3 о ' Я •й В Р 3 CD g р> С

o o r-3 ñ и а> 31 id а >( a R S o o. *ы S S Я о +- в ta

tr" tí о со fe p Й Ö о

о. Я • Od >-3 . р о ь

•X' р • о to ^ ч О у о

ÏT» 333 íS g tr< _ .я + о

tr* о 5 ■в NE

tr- и о я X я •о и ¡и

a Я; s РЗ ZJ ra. (В •j •tí œ 1 р CD О 0 1

3 1 s 1 В

g р fcj

•а? а о

¡■3

1 м (Ü CJ

у 1 cd <0

Si > О

■л <ЕЗ о'

с H

я » • 4 J

Q !Ч

tu м 1 ч и. а>

.яг Е> а п

•3 >£3 о Ъ

'Ö >-з

аэ о

о M

я СО о 'г*

о •а И о

I-Î

(я о » №

's

s -3 U1

о Р

о ы ja. О

к

го со

р

о Р О о

и h* s

я Я. ж

ai й>

& ö

X СО ш » я о 1 о -

. S а>

» Ь ». р

СО и

' 'S'

Í* го

1Т,- этилродамяна, усл.ад.

Р—

скорость двизенля, мш"с

«

3

300

2С0

100

120 , С,

Рис.4. Действие протоно^ора и' моненсина на кинетику образования ду па свету у О.Ьгсуз-е .Среда :: , 4001.;,1 ГаС1 ,рЦ 9.6. I- контроль; в присутствие 10гж4 лКФ; 3- в гписутстьии 6?лкМ моненсина; 4- ь присутствии и моненси!;а.

объяснить неэффективностью ХКО, поскольку в присутствии моненсина ингибирование движения и генерации дУ наблюдается при гораздо мэнщих концентрациях протонофора ( рис.3,4 ). Так, например, при 5мкМ ХКЗ в присутствии моненсина не наблюдается движения трихомов

0.вгеу1в и существенно снижается уровень дУ , в отсутствие ■ монепзина скорость движения и уровень дУ такие яе как в контроле. Моненскн, добавленный в такой же концентрации в отсутствие протонофора практически не влиял на скорость движения и даже увеличивал уровень генерируемого ду . В присутствии моненсина изменялся характер зависимости *У от концентрации добавляемого ХКФ. Увеличение концентрации протонофора в среде в присутствии моненсина приводило к резкому паденио уровня лИ.

Наблюдаемое существенно уменьшение скорости .движения трихомов и уровня дУ в диапазоне концентраций щтонойора-ЕО-ХООмкМ, поли дииому, связано с кнгибируицим эффектом ХКФ на процесо переноса электронов по фотооинтетячеокой электрон-транопор>тной цепа

(ФЭТЦ). Аналогичные результаты по влияшсо ХМ и моненсина были получены я при рН среды 'Л5.

При повышении концентрации внеклеточного натр:н до 400;,;.! п. большем закелачиванил среды до 9.6 эфТвкт совместного действия моненсина и лтотонс^ора на д V становится более выражении,(ряс.4). Прогонорар, добавленный в концентрации 10мкМ но измен/, ¿т ветчины мембранного потенциала, но существенно увеличивает время ого генерации, что свидетельствует об увелпчерш проницаемости цито-плазматичэской мембраны для протоков. Добавка моненсина на -;онэ протоноЗора приводит к полному- рассеиЕгтлю мембранного потенциала на цитоплазматичес1<Ой мембране трихомов 0.Ъ:.-сг/1з, тогда как моненсин в отсутствие' ХКФ ьыэызает да:хэ увеличение дУ -Гтуорэс-ценция этилродачина внутри клеток О.Ьгеу1а возрастает в-4 ра-'за по сравнению с контролем.

Таким образом, результаты, полученные при изучении генерг ;ии мембранного потошшаяа и движения трихомов О.Ьгег1з свядегельсг-. вуют о том, что в отсутствие рассеиваемой протонофорами •

но при наличии др.'а1" на цитоплазматической мембран'э, трихомы исследуемых морских щелочеустокчивых цланобактерий находятся в -энергизованном состоянии. Е пользу данного предположения свиде—.' тельствувт следущие фактц: во-первкх, генерация мембранного потенциала н движЬнио О.Ъгеу1з можно наблюдать в присутствии лро-тонофора в довольно больших концентрациях ( 16 мк..). Такое влияние нельзя объяснить неэффективностью протонотора в этих условиях, так как в присутствии моненсина или при исключении ионов натрия из среды интубация гораздо мвхаше концентрации протснобо-ра рассеивают мембранный потенциал и идгябпруют движение тркхо- . моз, во-вторых, градиент-ионов натрия (низкая'ко¡шентрацгч Ыа+. внутри клеток и высокая снаружи) необхода для поддержания движения и ьЧ на высоком уровне. Действительно, исключение натрия

кз среди как в присутствии, так и в отсутствие протопофора парализует трихомы цианобактерий и сникает уровень мембранного потенциала (в присутствие протопофора ду на свету на генерируется) . ( рнс.1 ). С другой стороны, совместная добавка моненсина и про-'Тонофора, обуславл^алцая, по-видимому, полное рассеивание лрх:а+ приводит к полному «одавленяп движения трихомс.3 о.Ьгеу1з и практически полному рассеиванию дУ . Полученные результаты можно легко объяснить, если принять предположение о существовании на гитоплазматической мембране о.ьгеу1в первичного, энерглзуемого

на свгту генератора д|йНа+.

1.3.-Действие протьнспотча и моненсина на движение пресноводной цпанобактзрии

У'.чпсЗ.г^чд_1_ •

Для того, ч^обы проиллюстрировать отличие энергетики морских щелочеустойчивых цианобактерий от пресноводных форл, растущих при нейтральных и слабощелочных рН, были проведены эксперименты по влиянию про-тонофора и моненсина

Рис.5.-Действие протонофора и моненоине на движение ?ь.1шс1шЛия. .Среда БС11 , ЬСШ Ий01 , "рН С.О I- без дс бавок; 2-в'присутствии ЗмкМ моненсина.

на движение пресноводной 'культуры Р11.цпс1па*ил: ( рио.5 ). Можно видеть, что эффект ингибярования движения трихомов ?Ь.ш1с1па-1ип обусловлен лишь воздействием пригонофора. Добавка моненсина в присутствии протонофо-га йрактичеоки не изменяет окорости движения цианобактерий. Движение полностью ингийируетоя добавкой 20мкМ ХКФ. Полученные результаты свидетельствуют о -чом, что РЬ.ипо1иа-Ьуа и при рН 9.0 об-

Рис.6, Движение трихомов о.brevis .поддерживаемое искусственно созданной plia .рН 9.Ù. I- без добавок; 2- в присутствии 8мкЫ моненсина. ,

ладает протонной энергетикой, а такие, что в случad морской щело--чеустойч^.йой цианобактерии o.brevia совместный э^ект протонофора и моненсина обусловлен не химическим взаимодействием используемых веществ, а рассеиванием djüía+ днгоплазматической мембране. Это еще раз подтверждает тот Факт, что использование совместной добавки протонофора и моненскла может служить тестом для выявления наличия первичного AjûHa+-генератора на сопрягающих мембранах.

1.4. Двиябнкв трихомов O.brevia . потметаяваомое искусственно созданной рУа . Наиболее пряпш способом продемонстрировать роль л г в энергизацки движения баотрий можно при ясгпа-довашш движения в условие лскуоственно созданной pila. ( а не в результате работы естественного генератора ). Согласно предположению о механизме работы бактериального Иа+-мотора, основным условием, при котором найлюдается вращение доагелл бактерий является наличие постоянного потока иэнов натрия через мотор из внешней среды в цитоплазму. Движущей силой такого транспорта Уа+ выступает ijüna+ /Скулачев,1983/. Для того,чтобы эноргязсьагь деидакгг трихомов o.brevia искусственнуюдрНа создавали путем

добавки 20СмМ iSinCl -о- безнатриекую среду инкубации бактерий. Чтобы исключать энергизацию светом фотосинте-нческих процессов наблюдение вели при слабей'свете, подобранны'' таким образом, чтобы трихомы npa.4Tii4dCKH не двигались, в начале эксперимента, цианобактерая, предварительно истощинше по иолагл натрия, как описано в разделе "Материалы и методы" томещалй В среду, не' со-деркащую ионов натрия и наолюдзли движение трихомов с очень низ- • кипи скоростями как на ярком, так и на елдбом свету. П.л добавке ¿00:.i.I HaCl регистрировали появление подвгяности у трихомов, через 1-2 мин. скорость дшя.ечт цианобактерий достигала своего максимального значения затем через 8-10 к:'Н. ошша-

т

лась до С,8мкм-с . ¿31слгчзкие яркого све^а приводило к восстановлению скорости двиколг-я бактерий до обычно наблюдаемой на свету. При добавке в среду инкубации 8мкМ моненсина но наблюдал;, появ-

л.

JU шя подвижности при наведении искусственной дpi'a.

Тышл образом, эксперименты по изучению движения трихомов цианобактс-рий, поддерживаемого искусственно созданной дрИа на цитоплаз! .тичоской мембтаке являются прямым свидетельством того, что движение морских "'.елочеустойччзых цпаноба.стерпй О.Ьгет±апод-дернсивается за счет энергии, запасонной в виде üjüNa+.

2. Монк натрия и процесс пготосинтетического выделения кислорода у цианобактерий, Активизация ионами натрия фотосинтетичео-ких процессов может свидетельствовать об участии ионов натрия в фотосинтетичсских реакциях подобно тому,как в случае гетеротрофных бактерий v.alglnolytikus я У.соеисоЛ.а.обладгтцюс Ка+-энер-гетикой,на+ активизирует .дыхание / Unemoto et al, 1S77 /. Одной из характеристик, отражадцях работу ¡-интетической цели является ске*хзсть выделения кислорода. В ;"-^t;с этим изучали влияние ионсв натрия на процесс фотоизнтетического выделения кислорода. -

Каплан я другие представили данные о том, что натрий участвует ¿i транспорте HCOg а таким образом стимулирует пролапс выделения кислорода у цианобактериГ: / хар'^п ot al, 1984./. С другой стороны,Беккер и."&ранд /Becker, Brand, 19Ь5 / продемонстрировали, что ионы натрия необходимы для осуцеотвлоннч фотос;;нтетических реакций в ротосистсме II. /лтересными на нащ взгляд являются также данные, полученные Лрестоном и Хрнт"ли при исследовании процесса выделения кислорода мембранными препаратами тилакоид-ных мембран из выслях растеняй-гсло.:.итоз Sarcocorinia guingueflrjrü,

Avicermia marina / Preston, Crichley, 1936/. Анализ результатов, полученных при использовании искусственных доноров и акцепторов фотосшкгетического переноса электронов, а 'га*лв мембранных

г

препаратов фотосистемы II, позволил авторам предположить, что градиент ионов натрия, в отличие от калия повышает активность работы водораэлиающего комплекса.

J связи с изложенным мы изучали не только (Х^-зависишй процесс выделения кислорода, но и выделение 02 в реакции Хилла с искусственными акцепторами.

На ряс.1 представлена зависимость скорости выделения кислорода суспензией трихомов o.brcvis от концентрации ионов натрия при рН 9.0. Максимальная скорошл выделения кислорода наблюдается при внеклеточной концентрации Nací свыше 50мМ. Уменьшение концентрации натрия в среде инкубации приводит к сшгшкию скорости выделения 0о сусп"нзией трихомов цианобактарий, Полумаксимальная скорость выделения Og наблюдается при 5мМ. 3 табл.1 призедены дашше по влиянии Иа+ на процесс выделения кислорода в реакции Хилла о искусственными акцепторами бегиохиноном и фэррицианидом. Показано, что при исключении ионов натрия из среды инкубации добавление искусственных акцепторов из приводит к восстановлению процесса выделения кислорода суспензией o.brevis на фоне 5мМ :ccií .тогда

о,

КО уг—

50 I

Ю-7 Ю-6 Ю-5 Ю-4

[ХК5] , ?'

Гкс.7. Действие протонофора и моне..сина га фотосинтетическое видоление кислорода суспзнзяей трихомов о.ЪгеуХз .Среда н 400.зГ,! НиС1 ,рН 9.0. I- без добавок; '¿- в присутствия ЗмкМ • эненсина.

Таблица I.

Влияние КаС1 , и моненспна на фстоспнтеткческое выделение кислорода о.Ъгоу1т в реакции Хялла с ис-кусствнными акцепторами п-бензохяноном, в присутствии 5:._Л КС К.

концентрация

наличие внделенил 0.

о

НаСХ

100-400 и\1 0-0.1

+

ХКФ

ТООмМ КаСХ

5 нкМ 10 мк.4

+

+

моненсин ТООмМ 1ТаСХ

3 мк.4 В мкМ

+

моненсгн + ХКФ+ л Г»Свл?.1 ;:асх

3 5

как в присутствии IQC-ЗООмМ HaCl в сроде наблюдается госстановление выделения 02. Полученняо результата свидетели,стт;у:эт с том, что ионы натрия активизируют |Тотосянтетич&ск;'3 процессы у О.Ъге-via . Максимальные скорости выделения кислорода наблюдаются при 50-300м".1 :;а+ как при СС^-зависимом фотосинтезе, так и з реакции Хилла'-с нскусстввншг'и акцептора;«!.

Как показали эксперименты, процесс выделения кислорода у исследуемых цианебактеряй также, как генерация üV и двихэппе, устойчив к большим концентрациям протонофороа, если в среде присутствует натрий в концентрации 50-400мМ. Б отсутствие подов натрия добавка 1С;лкМ протонофора (XK>j или ТТОЪ) полностью ингибиронала процесс Еыделешш кислорода, .второй ¿ютао било восстановить добавив в среду 50-ЮСШ l'aCl , ::а?ьоА .Добавка KCl , Lisi , хо.иш-хлорида не вызывала восстановления выделения С^. На рис.7 представлена зависимость скорости выделения кислорода суспензией трихомов о. brevi3 от концентрации протокофора Xiii в среде, со дарящей 40Ui.i '>-С1 . Можно видеть, что сколоть выделения кислорода ' у исследуемых цианобагторкй практически но измэняется при добавка в сроду I0-20t.iKivi ХКО. Б тоже время одновременная добавка мононсине. и протонофора вызывает существенное уменьшение выдалекяз кислорода (на 75$). Примечательно , чте добаалентэ в среду одного монен-сина в используемой концентрация не влияло на скорость в-делення кислорода у o.brevis .Аналогичные результаты были получены при исследования процесса выделения кислорода в рзагдяи Хгшга с искусственными .акцепторами ( табл. I ).

Наблюдаемые эффекты ионов натрия на процесс фотоси..гвтичес-кого выделения кислорода у морских щелочпус.тойчивых цланобактарий О.Ьгел1а можно объяснить о одной стороны тем. что дсбаып ионпе натрия приведет к образованию плй увеличения &р.Ио.+ на сопрягавших мембранах пиаиобактеркй. С другой стороны тем, что яатря&.ко-

жат влиять на Т.отосшпттячасглс процессы цианобачтерий, активизируя процессы транспорта КОу { с и:.: порт и ПСО3 ).эксперименты по изучению аляяшш ненов натрия на фотос.штстлческое выделения кислорода в реакции лилла, в которой НСОд не играет существенной роли свидетельствуют з пользу первого предположения.

3. Ингзбитсрны?' ага'гиз лг.ккечяя к гепоранпиду у циа.обакте-т)ии о.Ъгеу!п . Тот ¿дат, что нс^лодуем'Ш памл морская аелочеус-уойчявся гчаюбакторяя использует для дагедиоя трихоиод энергпэ дает возможность по г.зме^епгао скорости движения судить о ег-ли ¡11 ш ¿¡ика"*" нз цлтоплпзматической мембр.ше. у св:;зя с этил, для выяснения способов образования диДа+ на питоглазматической мембрана о.ЬгеуЛз 64л провед н янгибкторний анализ щзикепп и генерации дУ .Результаты такого анализа представлены в табл.2,3. Можно видеть, что цианид в концентрации 0.5-1к1 ингибпрусг движение трихомов только в томнотз. Увеличение концентрации цианида евьете 1&ъ.1 прпзодит к ингибировани.» движения и на свету.Создание анаэробных условии также вызывает остановку трихомов в темноте (табл.2). Эти результаты указывают на то,' что. движете в темноте обусловлз-' но работой дпхательной цепи. Ингибитор переноса электронов по ФЭШ диоромтимохипон ( ДШИБ ) подавлял движение циа! ¿бактерий на свету, что указывает па то, что па свету движение трихомоБ поддерживается за счет работы СШЦ. добавка б среду инкубация !3-10г.ис*<Т дяурсна ( ДСП ) не влияла на двоение циаиобактерий и не препятствовала генерации ли у О.Ъгсу1з (табл.З). иго позволяет предположить, что циклический перенос элечтронсв (X I) в состоянии поддерживать движение и генерацию лУ у О.Ъгеу1в.

Из известных ингибиторов АТ\&аз било исслодовано действие И, К', диииклогексил-кврбодиамяда (ЖлД)и диэтилстильбэстрола (ДХ). ДЦКД в концентрации 1мк!Л полностью янгибпрует движение трихомов о.Ьгет±а и не алияот на уровень дУ, увеличивая тольк время его

Табл:ща 2,

Вясйб:« ксх:, '¡¿ХГЛй :: г.рсаиат . на скорость дзта'ччцд трихомов О.Ьгру1з , среда N , содерка^ая 400мМ -аС1 ,рЦ а.о

Концентрация Скорость движения

мЛ мк,М*с~^

Контроль 2.5 £ 0.2

Темнота 2.5 ± 0.2

КС1Г П. 5 2.2.1 0.2

1.0 2.0 1 0.2

5.0 0.8 ^ 0.3

Темнота 1.0 0

К. И г

ДБ,МБ Ю"2 0

Арсенат 4-23 2.5 0.3

• 50 1.С * 0.3

генерации. Добавка протонофора в данных условиях не приводит к рассеивани» . Аналогичные результаты наблюдались пра добавке в среду ДЗС. Для истощения пула ¿путряклеточяого АТЗ использовали арсонат. Кал показали эксперименты арсенат не влиял на скорость движения цианэбактерий и частично сникал уровень д1Г . Из этих экспериментов становятся ясно, чт^ двилсешЛ- не является АТФ-зави-сямш, а ДЦКД и ДЭС, видимо, влияют на мотор цаанобактера...

Таким образом, проведенный ингпбиторяый анализ пгказал, что энергизовашюо состояние цианобактерий на свету сопряжено с работой фотосянтетичаской электрон-транспортной цепи как при работе всей цепи, так я при одном циклическом переносе электронов- (¿С I). Данные Ш1гибиторного анализа но позволяют сделать вывод о существенном вкладе АТФаз в энергйзацшо цитоплазматадоокой мембраны*

Таблица 3,

Ечкчние ¿:¿V;M, ДЦЦТ, дх ла движение, урозень и _ремя г°из?ицил галбралиого потенциала ( ' tV ) у о.bravia.

Контроль Концент- Скорость w

рация движения усл.ед. с

мкМ МКМ .С-1

Контроль 2.6 - 0.2 ICC + 5 5 ¿ I

; Í..A 10 Ü.7 ± С.2 SO + 7 5 ± I

.Ш 0.2 t CÍ. 2 100 + 5 i 5

100 Ü.I i 0.1 105 + 6 30 ¿l5

Л/3 10 1.9 ± 0.3 110 + 10 15 i 5

ДДКД; ХК2 100;10 0.1 i 0.1 bO + 8 25 ¿ 3

дэс 5 1.3 ± 0.3 135 + 10 6 i- o — и

10 с 14!? + 1С. 20 t 5

i

"выводы

I. Трансмембранный электрический потенциал на цитоплазма-тической мембране Q.b-evis ( ¿У ) является "а^-зазясимЛУ// ( повышается при увеличении натрия в зроде ), устойчив к разобщителго-протонофову вплоть до концентрацгч 20 мкМ и рассеивается при сов-местном'воздейстзии ХКЭ и иа+/н+ обменника моненсина.

2 Ионы натрия стимулируют процессы выделения кислорода как в полной системе фотосинтатического переноса электронов с COg в качестве конечного акцептора, так и при работе второй фотосистемы с п -бензохиионом И'фэрр:шианидом в качестве конечных акцепторов электронов в присутствии цианида. Эти наблюдения указывает на возможное участие ионов натрия в фиуосинтетических реакциях ЗС II.

3. COg-зависимое выделенаэ кислорода и выделение 02 в реакции Хилла с л -бензохиноном и феррицианидом устойчивы к разобщи-толп-протонофору и ингибируются сочетанием протонофора и моненсина;

4. Ионы натрия необходимы для движения трихомов o.brevia.

5. Движение трихомов устойчиво к разобщителям-протоиофорам ХКО ( 20 мкМ ) и ТТФБ ( 50 мкМ ). Сочетание протонофоров и моненсина блокирует подвижность трихомов o.brevis.

6. Искусственно образованная лрЯа временно приводит в лишение трихомы o.brevis . деэнергизованшр- темнотой. Эффект чувствителен к моненсияу.

7. Движение трихомов мо;лто наблюдать в присутствии ингибитора нециклического переноса электронов ДлММ. Дибромтимохинон

( 10 мкM ) подавляя движение o.'jrevia.

8. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что а) л цдтоплазматкческой момбрапе исследуемнх бактерий имеется первичный гвнэратор д^На+ ;.б) образование ¿y3î!a+ пряма uns

опосредовано сопряжено с фотосинтетическим пороносом электронов; в) энергия ддйа+ используется бактериями дш. совершения

механической работы - движения трихомов.

СПИСОК РАЮТ, ОПУйЖОЗАННЫХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Броун И.И., Кирк:; И.И., Фадеев С.л. Роль lîa+ в фотосинтетических процесса:: у морсксй цианобактеряи o.brevis // Тез. до1. 16-ой конференции ЗЕЕО.- .Москва 1984.-С.292.

2. Кирше И .И. Электрохимический градиент ионов натрия и аюто-сшг.втическив процессы у морской цианобактерии o.brevia.

// Мат. науч. конф. мол. ученых Одес.госун-та.Сор.Биулогия,-0десса,1984.~ С. 100-109.-Деп. в УКР НИИНТИ 15.01.85, K9I Ук-85 Деп.

3. Броун И.И., Кирик И.И., Северина И.И., Фадеев С.И. Роль ионов Кат в фотоеинтетических процессах при щелочных рН у га-лотолэраитных цианобактерий // Тез. докл. У1 съезд укр.м!.лро-биол. общества,- Киев,1984,-4.1.С

4. Броун И.И., Кирш Л.И., Северина И.И., Фадеев С.И. Участие ионов натрия в трансформации энергии света у {.юрской цианобактерии O.brevis // -Тез.докл. У Всесоюзн.биохим.съезд.-МоскваДУЗб,- Т.З.-С.45-46.

5. Brown I.I., Kirik I.I., Severina I.I., Padeev S.I. Electrochemical Ife+ gradient couples processed f light energy transduction in marine cyanobacteriun 0.brevifi//l7th FEBS Meeting, Berline.-1986.-V.367.-P.145.

о. Кир;'}? ii.И., Пушенко л.'л. Влияние исков натрия на процесс выделения кислорода у морской-цианобактерии Oscillatoria 'orrvin // Тез.докл.меквуз.кон$.мол.учен., -Одесса.-198.7.4.3. -С.55.

7.' 'Кроун И.И., Ккрик Л.Н., Северина И.И.,чл.-корр. АН СССР

В.П.Скулачев. Действие ионов натрия на трансформации энергии мс.окой цианобактер.пя Oscillatoria brcvis // Докл. AK.najt: СССР.-1987.T.293. -С.994-996.

8. Броун И.И., :Сярик И.И., Пуиенко И.Я., Северина IÎ.IÎ., Фадеев С.И. Взаимосвязь мевду средой обитания и процессом трансформация энергии у морокой цианобактерии 0.brevi3

// Тез.докл. III Ьсесоюзн.конф. по морской биолохлии,-Киев,1988-4.2 -С.70.

9. Броун И.И., Кирик И.И., Северина И.И., Задрав С.К. Роль ионов iia+ в светозаьисимцх превращениях энергии у морской цианобактерии Oacillatcria brsvis // Тез.докл. сов.-швейцаро, симпозиума "Биологические-мембраны-: структура и ■"¡уякцин",-Рига.-1983.- С.146.

10. Brown I.I., Kirik I.I., Severina I.X., Fadeev'S.I., ¿jü;ía+ in

marine cyanobacterium Oscillatoria brevis: the light-dependent • generation and иэал^ in living processes// 14th international congress of biochemistry, Prague.-1988.-V.IV.-P.169.

11. Броун И.И., Гончаров H.И., Кирик I*.И., Мирочник О.Ю., Пушенко М.Я.', Север;ша И.И., Скулачев В.П. Перспективы использования соле-щалочеустойчивых циалобактерий в технической биоэнергетике // Изз. АН СССР. Серия биол.-1990.-КЗ,-0.465-469.

12. Brown I.I., Kirik I.Г ., Fadeev S.X., C¡ura3Írenico L.U., Puahen-ko M.Y., Severina I.I. Sodium ion ara ncíeseary íor growth , energy- transduction in the marine cyanobacteriun Opcillatoria brevis// Aroh. Microbiol.-1990.-V.I 53»-Р.409-411.