Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репликация и экспрессия рекомбинантных плазмид на основе SV40 в культурах клеток млекопитающих

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Репликация и экспрессия рекомбинантных плазмид на основе SV40 в культурах клеток млекопитающих"

АКАДЕМIЛ НАУК УКРА1БИ 1НСТ1ГГУТ МЭЛЕКУЛЯРНО! БЮЛОГП I ГЕНЕТИКИ

На правах рукопхсу

Удл 5757155 575. 2?Л. 4.6

ЛАНДАУ Светлана Ьлхэй.шзна

РЕЛЛ1КАЦ1Я ТА ЕКСПР2С1Я РЕКО'551 НАТГГГОИ 1ШВШД 0CH03I SV40 3 IC/ЛЬТУРЛХ lUIT^Î ССАБЦ1В

ССч?. 00. 03. - молэкулярна б i слог и )

К

Агторе/о.^т дисер'гац! i на э^.обуттч в^еного ступеня доктора еюлопчних наук.

"ИIii -

Роботу виконано в 1нетитузч молекулярно! б1олот 1 генетики Академп наук Укра!ни 0ф1Ц)йН1 опоненти -

доктор бшлопчних наук. Малюта С. С.

( 1нетитут молекулярно! б 1олог1! 1 генетики

АН Укра!ни ) академж Академп технолог¡чних наук Укради доктор бюлопчних наук, професор Кишко Я Г.

Институт М1кробюлог11 1 вирусологи АН Укра!ни ) доктор бшлопчних наук Тарантул. & 3.

( 1нотитут молекулярно! генетики РАН ) Пров¡дна уетанова : Кшвський державний университет ¡м. Т. Г. Шевченка

Захист В)дбудеться {¿{/-/Л 1994 р. о год. на

эас1данн1 Спец1ал1зовано! вчено! ради Л 016.11.01 в захисту докто-рських дисертатй в 1нститут) молекулярно! бюлогп 1 генетики АН Укра!ни ( 252143, Ки'!В, вул. академ1ка Заболотного, 150 )

3 дисертац)ею можна ознайомитись в б1бл1отец1 1нституту молекулярно! б1ологП 1 генетики -АН Укра!ни.

Автореферат роз 1 елчний " // " 1"993 р^

Бчений секретар Спец)ал130ван01 вчено! ради кандидат бюлончних наук, старший науковий сгпвроб)Тник

ГП

О

и

Л. Л. Лукаш

'О

- 1 '

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнють проблеми. Одним з актуальних завдань молеку-лярно! бюлогп та молекулярно! генетики е доел¡дження функцюна-лзно! активност1 рекомб)нантних ДНК. Тому становить ¡нтерес кон-струювання сиетеми, в як1й можна виявити активн^ть регуляторних елемент1в 1 ген1в, що входять до складу рекомб1нантних ДНК, а та-кож'н функц!онування в щлому.

1Идомо, шр таю прокарютичн1 системи вже створено 1 багато в чому вивчено. Сучасн1 усп1хи в молекулярн1й бюлогп 1 генетичн1Й ¡нженерп зробили можливою експресш в прокарютах ген1в, що коду-ють б1лки, як1 становлять значний практичний 1нтерес.

- Однак, хоча прокарютичн! системи експресп прост 1 та легко В1ДТворюван1, прокартти не здатн1 виконувати численн! посттранс-ляц1йн1 модиф1кацп, включаючи глккозування та ензиматичний про-цесйнг, що е необх!дним для продукцп багатьох зр1лих функцюна-льних 61 лк1в. Крш того, прокарюти невдатн! вилучати ¡нтрони э транскрибованих еукар^отичних ген¡в \ вимагають вилучення 1нтрон1в э ген1в на р1ВН1 ДНК для експресси функшональних б!Ж1в.

Еукаршти мояуть забезпечити мехашзм, здатний виконати иеобХ1ДН1 посттрансляц1йн! модиф1кацп, однак проблему функцюнування рекомб1нантних ДНК в еукарютичн1й систем! кл1тин багато в чому ще належить досл^джувати.

Конструювання таког • системи особливо важливе для реком-1 б1нантних ДНК, щр мютять фрагменти еукарютичн01 ДНК з генами, ям не функцюнують у прокариотах.

1стотно важливою особлив ¡стю функцюнування реком51нантних ДНК е можливють 1х репл1кацп та експресп в ■ еукарютичшй систем1 кл1тин.

Тому доел¡дження можливост! ^ндукцП репл1кацп та посад^ння транз)ентно! екопресон рекомбшантних нл^М'.д мдкрива«-' перс-пективи для одержання бюлопчно активних ;>~ч<>нин н культурах ктм-; тин.

Розробка иргдотсшлено! проблеми, а саме - досл1дження функц1-онально? активност! рекомб^нантних плазм¡д в культурах юптин

ссавц1в дасть можлив1СТЬ ц1леепрямованого пошуку еукарютичних систем, ир створюють умови для функщонування рекомб1нантних ДНК, ЯК1. мютять практично Ц1НН1 еукар^отичн! гени.

Наведет м!ркування свгдчать про актуальность теми, присвя-чен!й'репл1кац11 та експресП рекомб1нантних плазм)д в культурах ЮН тин сеавщв.

Мата 1 завдання досл1дження. Основна мета, роботи: ^Роэробка основ та створення еукарютичног системи, ¿яка слрияе ¡ндукц!I решикацп та посиленню експреси рекомб^нантних плазму, що м!стять регуляторн! диянки геному 5У40, в культурах кл1тин ссавщв.

Вектори, що реплтуються в еукар1отичн1й систем! юНтин та м1стять регуляторн1 Д1лянки геному генер у путь функционально -

¡ЧКТИЬН! КОП I I К.'К'Ь'.'Н-ЧНОI дНК, «I» I -ьи«|»'И01(.|Иун»|-М')" дЛН РЧ»>МГ|»-Н. и'

Оно«*) -^ьдання доел ¡л^мннч: 1. Дое./Лдленна осибливоетей рёшмкацп рекомб]Яантних ДНК., що М1стять як циий геном в1русу ЗУ40, так 1 лише його регуляторну диянку.

Вивч^ння можливост1 ¿ндукцп решикацп рекомб^антних ДНК, що мютять регуляторн1 елементи вирусу БУ40, в перм1сивн1й для 5У40 систем! юПтин.

3. Досл1Дження 'умов, що сприяють ¡ндукцп репл1кацп реком-01нантних ДНК, як1 М1стять регулятора елементи В)русу ЗУ40, в неперм!сивн1й для ЗУ40 систем! юптин ссавщв.

4. Вивчення можливост1 посилення транз1ентнот екопресп ген!в, що входять до складу рекомбиантних ДНК п!д промотором В1русу ЗУ40, в еукарштичних кл) тинах.

5. Досл;дження особливостей функщонування ген^в, що входять до складу рекомб1нантних ДНК шд прокар1отичним промотором, в умовах решикацп рекомбшантних ДНК в культурах клптин ссавщв.

Наукова новизна роботи. ' В процесс доел1дження функщонально! активное^ рекомб1нантних плазм^д було Остановлено можливють ¡н-дукцп репл1кацп та посилення транэинтно'! експреси реком-б1нантних плазму, що тстять регуляторн) ел^-м^нти В1русу 5У4Г), ь

еукарютичшй систем1 шптин з використанням ¡нфекшйного Bipycy 3V40.

3 шею метою одночасно э рекомб¡нантними плазм!дами, що М1стять регуляторн! фрагменти геному SV40, в nepMiCMBHy систему шитин вводиться 1 Bipyc 3V40.

Синтезований активним BipycoM Т-антиген SV40 зв'язуеться з регуляторною делянкою рекомб¡нантних плазми, 1ндукуючи ix репл!-кацш та тдсилюючи транз1ентну експресш ген!в, що мютяться шд промотором SV40.

Зараз BUOMi дв1 системи, здатш шдсилювати експресно реком-бiнантних плазми, що мютять. регуляторну Д1лянку SV40:

1. Система Берга (Berg et al. , 1972), яку було розроблено на початку 70-х poKiB i яка зараз практично не використовуеться.

2. Система COS юитин ( Gluzman, 1981).

Для першо! системи використовуються температурочутлив1 мутанти та рекомб¡нантн! BipioHH SV40.

В культури кл1тин ссавщв вводиться рекомб1нантна ДНК з пов-ною ранньою д1лянкою SV40, po3Mip яко! не набагато (не б1льше 10%) В1др1зняеться в iд розм!ру геному SV40, та температурочутливий мутант Bipycy SV40.

В npoueci ¡Hierauf конструюються рекомб!нантн1 BipioHH SV40, як1 мютять рекомб1нантну ДНК та 61ЛКИ SV40.

Шд час наступних пасаж;в сумШ1 температурочутливого мутанта 3V40 та рекомб¡нантних BipioHiB при неперм!сивн1й для температурочутливого мутанту Bipycy SV40 температур! в1дбуваеться eKcnpeciH reHiB, що знаходяться шд промотором SV40 у склад! рекомб!нантних ДНК

Зпдно з другою системою застосовуються COS кл1тини ( Gluzman, 1981 ) що продукують функшонально-активний Т-антиген SV40 (лшя кл^тин нирки африкансько! зелено! мавпи - CV1, в яку вставлено' де-фектний за оринджем геном SV40 ).

Пропонована нами система в1др!зняеться В1д системи Берга:

1. Немае необх!дност! використовувати температурочутлив! му' танти SV40.

2. Немае потреби конструювати рекомб¡нантн Г в ¡руси.

- 4 -

3. Немае обмежень на po3Mip досл^джувано! ДНК.

Наша система В1др1зняеться Bifl системи COS кл^тин Глузмана ( Gluzman, 1981 ).

1. Можна викориетовувати pi3Hi (Штини ( а не лише COS кл1-тини ), ЯК1 nepMicHBHi до SV40, включаючи первинн! юитини нирки африкансько! зеленоi мавпи, найб^льш чутливi до SV40.

2. Регшкатя рекомб1нантних плазми, шр мютять регуляторну Д1 лянку SV40,. може бути шдсилена в COS кл1тинах при додаванш SV40.

Розробка методу експресп reHiB, що може бути застосований до широкого д1аг,азону еукарютичних кл1тин становить iHiepec з точки зору ефективно1 продукт 1 функшонуючих або антигенпо гомолопчиих 61ЛК1В з иеобХ1ДНими посттранслящйними модиф!кащями.

В наших досл^женнях показано також можливють ¡ндукци реп-Л1кацп рекомб1Нантних плазму, що мютять регуляторний фрагмент SV40, в непермюивних для SV40 культурах Нер-2 шптин людини шляхом використання аденов1русу. BiflOMi роботи ( Lebkowsky et al., 1985, LewiL=;, Manley, 1985), в яких трансформован1 делянкою адено-BipycHoro геному культури -кл1тин 1ндукують репл:кащю реком-01 нантних плазму, щэ мютять тлий геном SV40. В уыовах наших до-ол)Д1В рекомб1нантн1 плазмой, ш мютять лише регуляторну дишнку 3V40, репл1куються ь непермюивних для SV40, але в пермюивних для адеков1русу культурах kjiitkh Нер-2 в присутност1 аденов'.русу 2 типу.

Використання Bipyey SV40, а також аденов1русу дае можливють эастосувати для досмпдження експресп в1дпов1дних reHiB реком-бгплнтних плазму pibHi типи литин, ЯК1 Biдрюняигьея за своею здатнютю оинтеаувати pibHi 61ЛКОВ1 продукти, що значно розширюе шляхи онтим13аци умов виралення клспоьаних еукарютичних reHiB.

За умов решпкацы виявлено здатнютъ рекомбшантних плазм1Д експрееувати прокарютичний ген JB-лактамази в культурах eyrapi-

ОТИЧНИХ КЛ1ТИН.

Ц1Кавою особлив ютю цих ДОСЛ1Д1В е те, до eKcnpecifl ji-лакта-мази епостер]гакться лише за умов решпкацп uiei плазмой. Таким чином рекомб1нантна плазм!дна ДБК, що репл1куе в культурах юптин

ccaBuiR, може експресувати прокарютичн! гени, не вбудован1 специально п i д еукар10тичний промотор.

Для досл1дження функционально! активности рекомб1нантних плаэм1Д, що Miстять фрагменти геному SV40, необХ1ДИо було вдатися до найлроет1!юго способу теетування та титрування цього Bipycy.

, Звичайно, эпдно э .штературними даними, визначають SV40 або эа бляшками, або за цитопатичною Д1ею. Ми спинились на найбыьш доступному метод i тестування Bipycy цитоморфолончним методом i на його основi запропонували новий cnoci6 титрування SV40, розроблений рашше для аденов)русу.

Цей метод дуже простий i доступний, BiH мае ряд переваг перед в1домими способами титрування Bipycy за бляшками та за цитопатичною Д1ею. Визначити титр Bipycy SV40 можна дуже швидко - протягом 2-5 дн i в, в той час як за бляшками - лише через 2-3 тижнь

На захист виносяться сл^унуи QCHOBHi положения: 1. Одночасне введения вектор1в BipycHoro походження та в1дпов1дних BipyoiB е основою для етворення еукар]отично'1 гаитинно! системи, яка еприя^ посиленню функщонапьно1 активностi рекомбжантних плазм1Д.

?. Дли поси.лення TpaHSifHTHoï eKcnpeciï рекомб;нантних плазму, що М1стять р^гуляторну Д1лянку геному SV40, nepMiCHBHi еукарютичн! клiтини ¡нфжупться BipycoM 3V40.

Я Як в перМ1СИВН1Й, так i в неперМ1еивн!Й для 3V40 еукар10ТИЧН1Й систем] кл1тин виявляеться 1ндукц1Я репл*кацП рекомб*нантних плазму, що MicTflTb peгyлятopнi елементи Bipycy SV40. 4. За умов реп.шкаци рекомб1нантних плазм!д в культурах kjiîthh ссавц)в виявля>-тьоя експрес1Я прокарштичних reHiB, що не энаходя-■ться безпооредньо пiд еукарютичним промотором.

Апроба1Ця роботи. Матер ¡али дисертац) йного досл!дження допо-вдалиеь на Всесоюзной конференцм' " Генетична iHxeHepifl" (Пущино, 1980), четвертому радянеько-Н1мецькому симпоз1ум1 " Структура та транокрипщя геному" ( бреван, 1981), Всесоюзна конференцп " Ре-комб)Нантн) ЛНК" ( Пущино, 198?), Всесоюзна конференцп " Метабо-.пiчнi п,лазм1ди бактерий " ( Таллинн, 1983 ), Всесоюзна нарад; з генетики сомнтичниУ- kjiîtmh в ky.'ihtypi С Звенигород, 1983), ч^т-

вертому радянсько-¡теипйському симлоз1ум1 " Макромолекули у функшонуюч1й кл!тиш " (Кшв, 1984), Всесоюзна конференцп " Но-Bi напрямки бютехнологп" ( Пущино, 1986, 1988), Всесоюзна конференцп з генетики соматичних (Штин в культура, присвяченШ пам'ят1 М.1.Шап1ро . ( Звенигород, 1989), Всесоюзна конференцп " Генна та (Штинна шженер1я у виршеши фундаментальних проблем бЮтехнологп" ( Тарту - Кязрику, 1989 ), десятому радянсь-ко-французькому сишкшум! " Оргашзашя та експрес^я eyKapi-отичного та прокарютичного геному " ( Кшв, 1990 ), п'ятнадцятому чикнародному конгрес1 з бюхшп ( Срусалим, 1зра!ль; 1991).

МАТЕР1АЖ I МЕТОДИ

g

В po6oTi використовували Bipyc SV40, штам 776 в титр! 10-3 х lt)? БУО /мл (бляшкоутворюкш одиницО та аденов1рус 2-го типу в титр1 108 ВУО /мл (включения утворюкш одинищ). В досл1дженнях застосовували культури кл!тин CV1, COS, Нер-2 та КХ

Для виявлення внутр1шньоядерних включень було використано метод флуорохромп заражених BipycoM кл1тин розчином акридинового оранжевого.

Для одержання ДНК SV40 !з заражених кл!тин застосовували метод Х!рта ( Hirt, 1967). Препарати ДНК SV40 центрифугували в . град!ент! CsCl з епшй бром!дом.

Препарати BipycHOi ДНК для досл1джень в електронному м!кро-скоп1 готували за методикою Кляйншм1дта, Цана (Kleinschmidt, Zahn, 1959) . Курвиметром вим^рювали довжину молекул ДНК

Для одержання рекомб1нантних ДНК, що м!стять геном Bipycy SV40, використовували бактер!альну плазм!ду рВВ 325 ( Арг , ТС ь, Cm * ).

Плазм1дн1 ДНК вид!ляли за методом Клевела та Хел^нск! (Clewell & Helinsky, 1969).

Реакшю взаемодп пол1 нуклеотидлiгази фага Т4 з обробленими рестриктазою BamHl ДНК pBR 325 та SV40 проводили за Ман1ат!сом (1984).

Трансформашю бактер!альних кл!тин плазм!дами проводили за

методикою Дагерта, Ерл1Ха ( Dagert, Erl ich, 1979).

Картування одержаних рекомб!нантних плазм iд яд|йенювали »а допомогою ендонуклеаз BaniHl, EcoRl, Hinfl.

Електрофоретичне роадлення фрагментов зд1Йонювали в 0,8-1,0" arapoai в трио-боратному бу<1*#рi.

В робот i викориетовувапи як одержан! нами рекомб!нантнi плазмой, 1цр М]Отять один чи два повних геноми Bipyey SV40, так i рекомбiнантнi плизм1ди, одержан! В1Д ¡нших авторi в:

1. pHG , шр мютить еукар!отичний ген диг! дрофолатр^-дуктази пjд paHHiM промотором 3V40 (O'Hare, 1981);

2. pKCR , що мостить регуляторну долянку 3V40 (С Нате, 1981);

3. pGA 293 - що мостить ген Jí-галактозидази ni л промотором 3V40 ( Siminovitch, 1982);

4. pJYM , ЩО MiCTHTb повний геном 3V40 та Нн Mat •" отруйних послодовностей " ( Lusky & Butchan, 1981 );

5. p3V?-CAT , що метить ген хлорамфениколацнтилтрансфнрнзи nij paHHiM промотором 3V40 ( Глов^р, 1988);

6. рАР, що мостить тканинний активатор плазмо ног^-ну под paHHiM промотором 3V40.

Для введения рекомб i нантних плазмод в культури клотин викори-стовували ДЕАЕ - декстран (" Pharneoia " ) або кальцой-фосфатний прециштат.

Для вивчення реплтацП бактероальними плазмодами в колькоот! 0,5 -1,0 мкг обробляли культури к.щтин оеавЩв. Т7лн.?м1ДН1 ДКК з кл1тин вид!ляли в динампи ¡нф^кцИ- Проводили дот-Пбридизацою видолених з культур клргин сеавцов плазмодних ДНК '^Р - SV40 або ■v< P-pBR 322. Вуло побудовано калобровочно крив! та враховано ккль-KicTb плазм! дно г ДНК.

EKcnpeeiio прокар!отичного гену хлорамфениколапетилтрано^рази в культурах еукарнугичних клггин визннчали щ.пяхом циякпнння

йН?ИМЯФИЧЧО| ЧКТИВН' ч i при i ¡..ni,,¡. ..............„."„•,;у

N « г

1 Л.М'.ЦРа^^Ь • К*, мк.нЬГ^^елЛ ^^.hiii.-í .ЧМИ í-i/1 Íjh1 hV'.-tHj/) к 1t1 к . v < - - 'ч-нн-

Ц i í lintil is4iií i ini i i.iHhi мцгцм .r,i i¿ ЛрЧМ'ТИ.Ч р^ф' ! \ ",'M ) j¡^

Для виявлення екепргии rv«y тканинооиециф!чного активатору плазм i ногену заетосовували ¡ндикаторний н1Ч1«>»ний гель, що мм-ти-гь

бичачий ф1бриноген в1тчизняного виробництва та тромбiH "Sigma ". Ф1бринол1тичну активнють, що подана в Miжнародних одиницях (IU), визначали за кал)бровочнок> кривою з використанням В1Д0М01 Kiлькое-Ti урок1Нази " Calbiochem " ( Шевелев, 1986).

Екепресш ji-лактамази визначали при використанн! чутливого до пен1цил1ну штаму стаф^локока, вис!яного на агаризоване середовище, Шр мютить 0.0175 од/мл пенидоцну.

Для визначення р!вня експресн Ji-лактамази було побудовано кал1-бровочну криву залежност! величини эони росту cTaiJi локока в i д BiflOMOi Kiлькостi введено! JJ-лактамази.

РЕЗУЛЬТАТИ I ОБГОВОРЕННЯ

Досл1дження функцюналъно'! активност1 рекомб1нантних плазм^д в культурах кл1тин сеавцхв було розпочато-на початку 80-х pokib. Як еукар^отичний фрагмент рекомб iнантноi ДНК BHpiш>-но було викори-стовувати ДНК Bipycy SV40, яку на той час вже почали застоеовувати як еукарютичний вектор, але для цього нeoбxiднo Оу.по оволод^ти методами тестування титрування Bipycy SV40.

Роздал 1. Шдб1р методу виявлення бюлопчноЧ ^ктивноотч Bipycy SV40 та його ДНК.

1. 1. Використання цитоморфолог1чного методу виявлення внутршньо-ядерних включень для тестування i титрування Bipycy 3V40.

Bipyc 3V40 репродукуеться в юПтинах нирок швп я утворенннм внутр1ищьоядерних включень. Riдомо.нр Bipyc SV40 титруоть за вирн-женютт цитопатично! дi i ибо за бляшками. Однак обидва ид методи мають ряд недолив. Тому було вивчено можливють визначення ¡нфекщйного титру Bipycy SV40 морфолопчним методом. Перш за все необхдао було эабезпечити тестувнння Bipycy шляхом виявлення ВНуТр1ШНЬОЯДерНИХ включень, ЯК1 йабмрНЛКЖП'М'я акридинпйим вим.

При люмшсцентшй мтроскопп забарвлених акридин-оранкевим препарате ¡нфтованих юитин було вид!лено два найб1льи ч1тко виявлених типи внутрипньоядерних включень: I тип - гомогенне вклк>-чення з1 слабким свтнням, обрамлене темною зоною, яке займае майке все ядро; II тип - с1тчасте, б!льш яскраве включения, що моститься на темному тл1 нуклеоплаами . В незаратених культурах кл1тин таких включень не виявлено.

Здатшсть В1русу ЗУ40 утворювати внутр1шньоядерн1 включения була використана для титрування вирусу цитоморфоло1Ччним методом.

Цитоморфолог1чний метод титрування в!русу БУ40 включае сл!-дуюч1 етапи: 1. одеркання моношару чутливих до в!русу ¡штин СУ1 в проб1рках на покривних скельцях; 2. визначення середньо! к!лько-ст1 кл1тин в пробирках; 3. внесения.доел!дхуваного в1русвмюного матер!алу; 4. ф1ксац1я препарат1в черев дв1 доби теля 1нф1кування в¡русом ЗУ40; 5. флуорохром1Я препарат¡в акридиновим оранжевим; б. визначення титру В1русу. Титр в1русу роэраховушть за формулою А - а/Ьс, де а - загальна киькють кл!тин з включениями в про-б!рц1; Ь - досл!джуване розведення в1русу; с - об'ем введеного 1нокуляту В1русу; А - число ВУО/мл .

Як в1домо, кожна заражена в1русом кл1тина в культуру вкрит1й щльним поживним середовищем, утворюе бляшку. В той же час кожна заражена шитина м!стить в!русне включения. Тому лог1чно було при-пустити, щ,о титр в1русно1 суспензп, виражений як в бляшкоутворю-вчих одннкцях (БУО), так 1 у 'включения утворюючих одиницях (ВУО) мае бути ¡дентичним. Проведен! досл1дження шдтвердили наше припу-щення.

Таким чином, ¡нфекщйний титр В1русу 5У40 може бути визначений за допомогою цитоморфологччного методу, що е, як 1 метод визначення В1русу за бляшками, специф!чним, чутливим та кшкюним. Однак цитоморфолог 1 чний метод титрування в1русу ЗУ40 мае переваги перед титруванням за бляшками, а саме: забезпечуе можливють биьш раннього обрахунку дослав, прост!ший та доступа ший в робот!. Очевидно, цитрморфолог1чний метод може бути застосований для титрування ¡нших в!рус1в, що утворюють включения.

- 10 -

1.2. Виявлення шфекщйносп ДНК SV40.

У вид1лених препаратах BipycHOi ДНК да допомогою електронного м1кроскопу було виявлено в!дкрит1 к^лыдев! та суперскручеш моле кули.

Для виявлення бюлопчно! акт ив нос Ti вид1лених препарат iB ДНК застосовували моношар кл1тин в проб1рках з покривними скельцями.

Досл1дження забарвлених культур кл1тин, 1Нф1Коваиих ДНК SV40, виявило, шр вони мютять внутрипньоядерн! включения, властив! ва-куол1зуючому Bipycy SV40. В незаражених культурах КЛ1ТИН внутрш-ньоядерних включень не виявлено. Перни окрем1 включения з'являють-ся на третю добу, основна jix маса - на 5-7 добу. При заражение моношару юитин 1 мкг ДНК SV40 к1льк1сть кл1тин з включениями складае до 6 %.. Таким чином, за описаних вище умов вдаеться простим i доступним способом виявляти ¡нфекщйшсть ДНК SV40.

Р03Д1Л 2. Конструювання рекомб1нантних плазми, що мютять повний геном Bipycy SV40.

Для дослиження в культурах küthh б10Л0пчн01 активност1 рекомбшантних ДНК, що мютять еукарютичш та прокарютичн1 фрагменти, було сконструйовано плазм;ди, що мютять повний геном Bipycy SV40. 3 шею метою було використано плазм1ду pBR 325. . 06ИДВ1 ДНК ( ДНК 3V40 1 pBR 325) MiCTHTb по одному ун1Кальному сайту для рестрикц1Йно! ендонуклеази Ваш Н1.

ДНК SV40 1 pBR 325 г^дрол^зували рестриктйною ендонуклеазою Ваш Н1 з наступним л1гуванням ДНК-Л1газою фага Т4. Одержаними препаратами трансформували культуру Е.coli, штам НВ101. Осюльки вмонтування ДНК SV40 в pBR 325 за сайтом Ват Hl веде до ¡нактива-Ш1 гену, який визначае ст1йк1еть до тетрацикл1ну, выбирали тран-сформанти Ар1, Cm* Тс*. Трансформован! кл1тини вис1вали на сере-довище з амшцшпном. Bei 1.500 колоний, що виросли, переколювали

t S

на середовище з Cm та Тс i выбирали клони Cm , Тс . Всього було вшбрано 10 таких iuiohib, позначених нами як pSVl-10.

Для шдтвердження наявност! ДНК SV40 у склад! рекомбшантних

молекул використовували метод пбридиэацп колоний, ф!ксованих на Н1троцелюлозь Показано, що 3 клони з 10 ( рЗУ2, рБУБ, рБУЭ) В1Д-пов1дають строго позитивно при Пбридиэацп э ЛР - ДНК ЗУ40 (рис.1).

Рис.1. Г1бридизац1я 5!Р-ДНК SV40 з рекомб!нантними клонами, що ви-росли п1сля трансформацд.! кокпетентних кл1тин E.coli

Анализ ДНК рекомб¡нантних молекул проводили за допомогою крупно- та др1бнорозщеплюючих рестрикц1йних ендонуклеаз. Стратег ¡я картування рекомб шантних плазм¡д :

1) Визначення юлькосп reHOMiB SV40 та ïx ор1ентацП у склад! рекомб¡нантних плазми. 3 шею метою застосовували крупнороз-щеплшч1 ендонуклеази рестрикцп Ват Н1 та Eco R1;

2) Виявлення повноти геному SV40 у складi рекомб¡нантних плазму. Для цього проводили повний Г1Дрол13~ рекомб ¡нантних плаз-Mi д за допомогою др1бнорозщеплюючо1 pecтpикц¡йнoï ендонуклеази Hinf 1, а також подв)йний г¡дpoлiз Hinf 1 та Eco R1.

2.1. Картування рекомб1нантних плазм^д pSV2, pSV5 та pSV9.

При роэщеплешн ДНК рекомб1нанта pSV2 рестрикЩйною ендонукл-еаэою Bain Н1 угворюються два фрагменти довжиною 6,0 т. п. н. , що в1дпов1дае pBR 325 та 5,2 т. п. н. - SV40.

В результат) Г1Дрол1зу ендонуклеазою Eco R1 плазм^ди pSV2 бу-ло отримано 3 фрагменти, сума яких склала 11,2 т. п. н., як i у ви-падку д1ï ендонуклеаэи Ват Н1, що в1дпов1дае мономерн^й вставц! ДНК SV40 в pBR 325 (рис.2).

BamHl [C0ri

SarnHI

Рис.2. Рестрикц1йна карта рекомб!.нантно1 плазм1ди pSV2

Для пшвердження припущення про включения повного геному Bipyca SV40 до складу молекули pSV2 эд]йснювали повний ïï г!дрол1з за допомогою др1бнорозщеплюючо1 ендонуклеази Hinri, а також по-дв1йний Г1Дрол13 Hinf 1, Eco R1. Аналог1чними методами картували рекомб1нантн1 плазмой pSV5 та pSV9.

Результати картування рекомб1нантних плаэм!д pSV5 та pSV9 показали, що вони ¡дентичм та м1стять два noBHi геноми SV40.

Boro HI

pBR325

Т-GHT. SV AO

СП

EcoRI

EcoRI ßomHI

T-o ht

ßomHI 7s--4 ori

EcoRI EcoRI

SV40

Рис.3. Рестриюийна карта реком61нантно1 ппазм1ци pSV9

В димер1 ДНК SV40 розмядена тандемно, а напрям транскрипцп Т-антигена сшвпадае э напрямком транскрипцп для гена, що кодуе амшцшнн- резистентность в геном! pBR 325 (рис.3).

Р03Д1Л 3. Досл1дження репл1кативно! активност! рекомбшантних плазм1д в культурах юл тин ссавщв.

3.1. Дослиження репл1кативно! активност! рекомб1нантних плаэм1Д, пр м1стять повний геном Bipycy SV40

В першу чергу доел¡джували репл1кативну активнють сконстру-йованих нами рекомб^нантних плазму, щр мютять повний геном Bipycy SV40. Однак виявилось, що сконструйоваШ нами рекомб1нантн1 плазм1ди не решикуються в культурах кл^тин ссавцхв.

Тим часом э'явилась робота JIacKii Батчан (Lusky and Botchan, 1981), в ЯК1Й йдеться про пригн1чення репл1кацп рекомб1нантних плазму, сконструйованих на ocHOBi pBR.

Виявилось, то рекомб1нантн1 плазм1ди, сконструйован! на основ1 рВ1? 322, мютять "отруйн1" посл1довноет! поблизу бактер1а-льного оринджу репл1кац11, щр перешкоджаюгь вияву IX бюлопчно! активном 1, зокрема, IX репл1кацп в культурах кл1тин ссавшв.

У зв'язку г цими данями ми припустили, що можна 1ндукувати решикащю рекомб1нантних ДНК шляхом введения В1русу БУ40 одно-часно з рекомб1нантними плазм!дами, щр мютять повний геном В1русу

Результати введения сконструйованих 'нами бактер!альних плавит в культури кл1тин ссавшв показали, щр вони не решикуються в пермюивних культурах кл1тин СТ1 (рис.4). ДНК плазшди рБУ2 або р5Г/9 вдалось виявити методом дот-Пбридизац1! 8 -;,1Р-рВ1?322 лише на нульов1й В1ДМ1ТЦ1 1нфекцп, тобто шд час вщцлення ДНК з культур кл1тин одразу ж пюля тх обробки.

<«••• *

3

Рис.4.Репл1кац1я рекомб1нантних плазм1д, що м1стять повний геном БУ40, в культурах кл1тин СУ1 (а,6 - г!бридизац1я з "иР-ДНК БУ40, 3x10' 1мп/мкг; в, г, д - з 32-Р - рВИ322, 10'1мп/мкг; ПОСЛ1ДОВН1С1Ь плям зл1ва направо, п3.к1в в1дпов1дних авторадЮграм - справа - нал1во ); а - ДНК вгрусу (нульова точка,1, 2, 3 -я доба); 6 - репл1кац!я плазм1ди pJ'Я■' (0,4 мкг рЛУИ, нульова точка, 1, 2, 3-я доба; в - те саме ( нульова точка, 1, 3, 4, 7 -а доба); г - репл1кац1я рекомб1нантно1 плазм1ди рЭУ2 ( нульова точка, 1, 2, 3, 4, 5-а доба ); д - репл1кац1я рекомб1нантно1 плазм1ди рБУЭ при одночасному введение з в1русом БУ40 ( нульова точка, 1, 2, 3, 4, 5-а доба).

Для того, щрб 1ндукувати решнкацио рекомб1нантних плазм!д в культурах кл1тин, вводили Ц1 плазм1ди одночасно з вiрусом SV40, з м1ркування, шр у тому випадку, коли рекомб1нантн1 молекули та •ilpycHi частки потрапляють в одну клиину, синтезований Т-антиген 31 русу зв' яжеться з оринджином SV40 рекомб1нац1йних плазм!д pSV2 чи pSV9, . идукуючи IX решивших I, д1йсно, сшльна трансфекци Blpycy SV40 8 плазм 1 дою pSV2 чи pSVQ призводила до репл1кацП цих Сактер1альних плазм1д в-культурах кл1тин ссавтв (рис.4). Репл1-кацио плазм1дно! ДНК ми спостер!гали протягом того ж часу, щр й репл1кац1ю Blpycy SV40. j На п'яту добу к1льк1сть плазм1дно! ДНК зменшилась.

Таким чином, эа допомогою Blpycy SV40 модна 1ндукувати в кл1-тинах ссавтв решикашю бактер1альних плазм1д, щр мютять геном SV40. От же було знайдено П1дх1д до досл!дження бюлопчно! акти-вност1 рекомб1нантних плазм1д, що мютять геном Blpycy SV40. Цей метод сп1льного одночасного введения рекомб1нантних плазм!д та Blpycy було використано i у подалыпих досл1дженнях.

3.3. Досл1дження р1вней решикаш 1 рекомб1нантних пла8М1д в культурах кл!тин CV1 та COS.

Становило 1нтерес вивчення р1вней решикаш I плазм1д в культурах С-^Vl та COS кл1тин в присутност1 чи за в1дсутност1 Blpycy SV40 .

Р1вень репл1каци плазмой pSV9 в COS шитинах значно нижчий> Н1ж в CV1 кл!тинах при одночасному введенн1 з BipycoM SV40 (рис.5, табл.1). Однак у випадку одночасного введения Blpycy SV40 та плаэшди pSV9 в COS юитини р1вень синтезу плазшдно! ДНК значно зростае. Максимальна и к1льк1сть виявляеться через одну добу 1 сягае 0,81 мкг, що дор1внюе 10* коп1й рекомб1нантних плазм1д на !нф1ковану кл1тину. 11лазм1да pBR322, шр застосовуеться як контроль, не репл1куеться hi в COS юитинах, hi в CV1 кл!тинах у випадку одночасного введения з BipycoM SV40.

В той же час. яга» BipycoM SV40 1нф1кувати кл1тини CV1 за одну добу до введения плазм!ди, спостер!гали низький р1вень репл1-

кацП плазм1ДН01 ДНК. Щ реаультати аналог i4Hi даним, одеряаним Шд час вивчення piBHH решикацп pSV9 в COS юл тинах (Рис.5, Табл. 1).

■ ф « ® * V- ,

S

® 8

/ г 1 ч > с

Рис.5. Пор1вняльне досл1дження решикацП рекомб1нантних плазму, то MicTHXb повний геном SV40, в культурах перм1сивних клхтин CV1 та COS (посл1довнд.сть плян зл1ва направо, a niKiB в1дпов1дних авторад1ограм -справа нал1во, плями 1-6 в1дпов1дають - 0,4 мкг pBR322, контролю ЮиТИН, НуЛЬОВ1Й ТОЧЦ1, 1-й ДОб1, 2-й ДОб1, 3-й ДОб1); л,й -репл1кац1я pSV9 в COS-iaiiTHHax в присутност1 Bipycy SV40 та за його в1дсутност1 вд.дпов1дно; в - репл1кад1я pSV9 в CV1- юитинах в лрисут-Hocri Bipycy SV40, введеного за добу до трансфекцИ плаэм1дою; г -репл1кац1я pBR322 в CV1 -клл.тинах в присутност1 Bipycy SV40 )

Таким чином, в КОЖН1Й iH$iKOBaHifl BipycoM SV40 юптин1, очевидно, синтезуеться надлигок Т-антигену, достатки для регшкацы плаам1дно1 ДНК до piBHH решпкацн Bipycnoi ДНК - 10* кошй/Чнф!-ковану кликну ( Tsui et al., 1982 ). Як видно а представлених даних, " отруйН1" посд1довност1 за цих умов практично не вшшвають на ревень решикацп плазм1дно1 ДНК.

Мэжно припустити також, щр функЩональна актившсть Т-анти-гену в юитинах через одну добу теля ¡нф^кування BipycoM SV40 аначно внижуеться i тому решнкащя плаамгдно: ДНК в1дбуваеться на С1лып низькому piBHi. Очевидно також, щр функцюнальна активность Т-антигену в COS юитинах значно нижче активности Т-антигену Шфэтпйного Bipycy SV40.

Таблиця 1. Р1вень решпкацп плазму и СУ1 та СОЭ клтшах!

Вар1анти

1. СОЭ кл1тини, 1н-ф]КОван1 5У40 1 трансф1кован1 рЗУЭ одночасно

К1льк1сть ДНК

Стандарт

0,4

Контроль

Нульова I точка I 24год

_I_

0,32

0.81

-I------

I

I 0,04 I

I

48ГОД I 72ГОД

I

0,33 I 0,2 I т

-------1------

I

0,22 I 0,06

2. СОБ Ю11ТИНИ, трансф1кован1 рБУЭ

0,4

0,36

■I------

I

I 0,03

I

I

■I------

-------1------

I

0,03 1 0,05 I I

3. СУ1 клиини, ¡к-ф1 кованг за 24 годкни до трансфера 1 рБУ9 .

0,4

0,28

-----1-----

т 1

О I О I I

4. СУ1 КЛ1ТИНИ, 1Н-ф!кован! БУ40 1 траксфтоваш рВР? 322 одночасно

0,4

0,31

3.3. Репл1кац1я рекомСИнантних плазм1д, шр тстять регуляторн/ дцинку вирусу 5У40, в культурах шатии ссавтв.

У зв'язку з тим, то для бютехнолопчного одержання продукту практично шнного еукарютичного гену, щр знаходиться Шд промотором вирусу ЗУ40, застосовуються peкoмбiнaнтнi плазм1ди, ир мютять з усього геному 5У40 лише його регуляторну делянку, важли-во було вивчити репл!кативну активность саме таких рекомб1нантних ДНК в культурах кл1тин ссавщв. Досл1дження репЛ1кативно: активное^ таких рекомбонантних ДНК давало можливють визначити функцюнальну активнють регуляторно! дцинки цих плазму та пшбрати спос1б IX ампл1ф1каци в культурах клотин ссавцов.

В робот1 було проанал1зовано плазмой: рНй, рКСЯ та р(ЗА 293.

Для створення умоз, за яких може ¿¿дбуватись репл1каЩя цих рекомб1нантних плазм1д в культурах глотки ссавщв, вводили Ц1 плазм1ди одночасно з вирусом 5У40.

Результати анал!зу ¿ндукцп решпкацп рекомб1нантних плаз-

0

О

О

о

М1Д, шр МЮТЯТЬ регуляторну Д1лянку В1РУСУ 5У40, в присутност! цього в 1 русу наведено на рис.6. У випадку регшкацн видно три П)ки рекомб1нантно$ плазм1ди. Шк 3 в1дп0в1дае ДНК рекомб1нантно! плазмой, що реплжуеться в присутност! в1русу 5У40 через одну до-бу пюля трансфекщ!. Якщо ж до культури юптин СУ1 не внесено В!рус 34АО, репл!кац!я не в!дбуваеться, немае плями на автограф! ( пляма 3) та В1ДП0В1ДН0Г0 шку на денситограми 3 рис. б видно, що вс! досл!джуван! нами плазм!ди (рН6, рКСК, рбА 293) репл^кувалися в присутност1 в¡русу ЗУ40 ( пляма 3, п!к 3).

Б той же час з даних рис.6 видно, що рекомб1нантна плазм1да рНЯ не репл1куеться за в1дсутност! вирусу 5У40. В1дп0в1дн! обчис-лення з урахуванням розм^ру П1ку реплжуючо! плазмой рНЭ св1дчать про те, шр а к1льк1сть через одну добу п!сля одночасного з в1русом БУ40 введения до культури шитин СТ1 приблизно становить 0,25 мкг на один 50 мл матрас з кл!тинами , а юлькють кошй -10* на 1нф!ковану (штину.

ф © А

• • ф

Рис.б. Репл1кац1я рекомб1нантних плаэм!л, що м!стять регуляторну д1лянку БУ40, в культурах перм!сивних кл1тин ссавц!в ( посл!довн1сть плям на автографах та п1к±в в1дпов1дних авторад1ограм справа нал!во, X - 0,1 мкг рВЕ322; 2 - ДНК з необроблених кл!гин СУ1; 3 - нульовй точка; 4 - перша доба п!сля одночасног э в1русом БУ40 трансфекцИ плазм1дос; а - репл!кац±я плазм!ди рнв в йрисутност! в1русу 5У40; б -реап1кац1я плазкйди рКСЛ в присутност1 в1русу 5740; в - репл1кац!я плазмХди рвА293 в присутност! в1русу БУ40; г - репл1кац1я плазм1ди рНв за в1дсутност! в!русу БУ40 )

Аналог iчнi роэрахунки виконано з плавки дами pKCR та pGA 293. юлькють коп: й плазму, що решикуються становить, в1дпов1дно, 10* та 10^ на ¡нф1Ковану (Штину.

Отже niflxifl, що використовуеться нами, тобто введения реком-б1нантних плазм^д одночасно з BipycoM SV40, дае можливють виявити б10Л0Пчну aKTHBHicTb регуляторноч д!лянки рекомб!нантних плазм! д та створюе умови для ix ампл|ф1кацп в культурах клгтин ссавтв.

' 3.4. Вплив а'денов!русу. на репл^кацио рекомб!нантних плазм)д, цр MiCTHTb регуляторну Д1лянку SV40 в культурах юптин ссавтв.

Дос! було дослужено репл1кац4ю рекомб1нантних плазм!д, що мютять ориджин 3V40, яка в!дбувалась у пермюивних для Bipycy SV40 культурах юптин нирки африкансько! зеленок мавпи ( CV1 та COS).

Важливим моментом в щй робот i е досл!дження можливост1 репл- • iKaui í рекомб1нантних плазму при в!дсутност1 Т-антигена 3V40 в неперм1сивних для 3V40 культурах юптин, тоПти доеЛ1Джнння можли-HooTi розширйння кеча ь-штинних Ji i н j й д.та п^гшкацП' ре ком

f/inan'i пил 1!ЛаЧМ!Д.

3 Л)тератури BiflOMi роботи (Lewis, Manley, 1985; Lebkowsky, 1985),'автори яких показали можливють реплжацп рекомбiнантних плазм)д, що М1стять повну ранню диянку SV40, в транеформованих аденов1русом 5-го типу кл¡тинах ембр1она людини, що конститутивно експресують paHHi бики аденовирусу Е1а та Е1в.

Було дослужено можливють репл1кацп рекомб!нантних плазм)д, що мютять лише регуляторну делянку Bipycy SV40, за умов 1нф1ку-вання аденов1русом 2-го типу непермюивних для SV40 культур юитин. В досл(дах эастосовували Hep -2 юнтини людини, аденовирус 2-го типу та плаэм1ду pHG. Репл^кацпо плазму визначали методом трансформащ i компетентних юптин Е. coli. Одночасно з аденов1русом nepMicHBHi до аденов1русу Нер-2 юптини трансфжували реком-б)нантною плазм1дою.

Реэультати дослав показали,що в с^редньому через одну добу у BapiaHTi э аденовирусом трансформуюча активнють введено! плаз-

мди с клад ала 291 колон!ю, тобто приблиэно 12 нг, а через одну до-бу у вар1антах з вирусом ЗУ40,■тобто у непермюивних для ЗУ40 клотиках, та у вар 1 акт 1 з плазмиою рН6 без аденов1русу трансформуюча активнють введено! плазм!ди була на один порядок меншою, н!ж у вароа'Ш з аденов!русом, .1 складала менше 1 нг. Таким чином, отримая! дан1 св1дчать про можлив!сть шдуковано! аденов1русом ре-пдокаци рекомб!нантних плазму з регуляторною делянкою ЗУ40 за Е1 дзутност! Т-антигену в непермюивних для 3740 культурах юитин.

Результати, близьк! до наших даних, було отримано також Классон (С1еезоп еЬ а1., 1987), як1 виявили можлив!сть реплхкацп рекомСНнантних плазм!д з повною ранньою донкою ЗУ40 в непер-¿лсивних для БУ40 Л1Н1ЯХ Л1мфо1дних КЛ1ТИН людини, що експресують геи с-тус.

Гоэд1л 4. Посилення транз!ентно! експрес!! гешв, що знаходяться щд промотором в!русу 5У40, в культурах кл!тин ссавц!в.

Використання 4нфекщйних в!рус1в в дослодах з вивчення .. фуккцюналъноI активност! рекомб1нантних плазми з еукарютичноп 'рггуляторною долянкою визначило П1дх!д до створення оптимальних ушь для !х репл!кацп в культурах (Штин ссавщв.

31 домо, що молекули, яко реплшуються, е найкращими матрицями для транскрипц!I. Виходячи з цих м!ркувань, природньо було почати досд!дження з виявлення експресп ген!в, як! знаходяться пхд промотором в!русу ЗУ40, в культурах (Штин ссавц!в.

^ першу чергу ми вибрали модельний ген хлорамфешколацетил-траксфзрази (САТ-ген), прокарютичний ген, що не мае еукароотичних аналог¡в, експрес!ю якого можна Ч1Тко виявити.

4.1. Шсилення експресп прокарютичного гену хлорамфен!кол-ацетилтрансферази, що знаходиться тд промотором ЗУ40.

В робот 1 було використано плазм¡ду рЗУ2-САТ, що метить ген хлорамфениколацетилтрансферази п\д раннем промоторам ь<русу ^У4П.

- ?!

В >ыу Ч~рГ'У fiyji'i моллиь ii.-Ph i-ki 'П)ч-|• i | н„у .jNiii.-u.iH-

н ¡К'Чл^^тИЛТраШ.'ферсйй Ь Щ'ОКар!О'ГИЧН 1 Й c«<-irMi nOpifviriHO s li.'ln:-i-Miдою pBR 325, ь ЯК1Й ген хлорамфен¡колацетилтрансфераэи »находиться nifl власним прокарютичним промотором.

Передовым необхдао було виявити, чи росте штамм Е.coli, що мютить плазм!ду pSV2CAT, на хлорамфен ¡коль Виявилось, що на BlflMiHy В1Д штаму Е. coli, ЯКИЙ MiCTHTb плаэм^ду pBR325, BiH не росте на хлорамфешколь Тому ми досл1джували мокливють конституiтивноi експресП гену хлорамфен!колацетилтрансфераэи про-тягом росту цього штаму на амппцшн1 (рис.7).

* ч з Ч ь-

»V

)

Рис.7. Експрес1я хлорамфениколацетилтрансферази в кл1тинах E.coli, що м!стять плазмЗ-ДИ PSV2CAT та pBR 325 ( 1, 2 - pBR325; 3,5- pSV2CAT; 4 - контроль; а, б - моноацетильован! форми уС-хлорамфеникола; в - ди-ацетильована форма ''С-хлорамфеникола )

- гг -

Прй цьому було одержано TaKi результати:

1. П>гам Е. coli, що Miстить рекомб1нантну плазмiду pSV2CAT, екс-спреоуе хлорамфен¡колацетилтрансферазу, яка мае слабку ферментати-вну aKTHBHicTb, яко!'' достатньо лише для перетворення С хлорамфен ¡колу на дв! моноацетильоваШ форми ( рис..7).

2. Диацетильована форма хлорамфен i кола не утворюеться у npoKapi-отичнiй систем! у випадку викориетання плазмда pSV2CAT на В1ДМ1ну вiд плазм1ди pBR325, при якому утворюються як flBi моноацетильо-baHi, так i диацетильована форма хлорамфен¡колу (рис.7).

Було проведено також доел¡дження експресп плазмой p3V2CAT в культурах юптин ссавцов.

Результати дослшв з вивчення експресп гену хлорамфешко-лацегилтрансферази представлено на рис. 8,9. flaHi дослшв виявили,

ЩО:

1. CAT-eKcnpeci i не виявлено в необроблених плазм^ою культурах к.гнтин ccaBHiB ( негативний контроль, BapiaHT 1,4 ).

2. САТ-експрес1Ю виявлено в шитинах, трансформованих реком-бшантною плазм1дою э САТ-геном (поэитивний контроль, BapiaHT 8).

о. САТ-екепрес1Ю не виявлено на другий день шеля транс-Ф?кц)i рекомб1нантною плазмодою эа В1Дсутност1 Bipycy SV40 ( ва-' р\ант 5).

4. САТ-експрест виявлено на другий день шеля трансфекцп в присутностi Bipycy 3V40 ( Bapiанти 6 i 7).

5. Слабку OAT-eKcnpeciio виявлено на TpeTift день шеля транс-ф-кцп плазм^ою за В1Дсутност) Bipycy SV40 ( BapiaHT 3).

6. Високий р1вень CAT-eKcnpeoi 'i спостер1гали на третей день шеля трансфекцп в присутност1 Bipycy SV40 ( BapiaHT 2).

Ki.nbKicTb ацетильованих форм хлорамфен\колу в pie-них вар-¡антах Д0ел)Ду ( piвень ПАТ-експресi i) можна пор1вняти, враховуючи 1Д1 льнici'h та posMipH плям на автограф;, 0ек)льки в проби було внесено однакову KiJbKicTb б)лка.

Користуючиеь рис. 9, можна вирахувати, що р1вень експресп САТ-1 ину в ирисутноотi Bipycy 3V40 в б pasiB ьищий, Н1ж за його

"И | Д|>уг Hl I .

1 1 i h У 6 ¡г p

Рис.8. Посилення експресИ САТ-гена рекомб!нантно1 плазм1ди pSV2CAT в культур! кл!тин CV1 в присутност! Bipycy SV40 ( екстракти приготовано э CV1 кл!тин, трансф!кованих: 3, S - самЬю лише плазм1дою pSV2 CAT; 2, 6, 7 - pSV2 CAT в присутност! Bipycy SV40; 1, 4 - э не1нф1кованих кл1тин CV1; 8-з трансформованих культур кл1тин )

' 'и! ...........................i f-\t»M ■ !1 ( • III i-tttp • II

Рис.9. Денситограма плям ацетильованих форм '^С-хлорамфениколу, одер-жаних при експресИ рекомб!наитно1 плазм!ди pSV2 CAT в культурах кл1тин CV1 в присутност1 Bipycy SV40 ( последовать niKiB зл1ва направо в!дпов1дае Рис.8 )

Таким чином, на модельному САТ-геШ вдалось покааати, що обраний нами П1дх1д до посилення транз1ентко1 експрес 11 гетв реко>,£Ннантних плазм1Д в культурах кл!тин ссаьщв виявився правильна;.

4.2. Посилення експресп гена активатора плазм1ногену в культур 1 кл 1 тин ссавц1в.

Активатори плазм1И0гена - це клас ферменпв, як1 катал1зують' перетворення плазм^ногену на плазмш - малоспецифшну с.^ринову протеазу, щр вшграе ключову роль у регуляцп позаюатинного про-теол1ау та здатну руйнувати ф1бринов1 згустки.

1£я досл1дили експрес но в культурах юптин ссавщв кДНК гена тканин0специф1чного активатору плазм1ногену, що знаходиться тд раннш промотором 5У40 в рекомб1нантн1Й плазмШ рАР.

Становило ¡нтерес саме досл1дження експресп цього гена в культурах юптин ссавщв. Значна маса цього б1лка ( до 70 кД), а такой наявнють численних дисульфцних зв'язк1в ( до 14 ) та К1Лькох сайив ( три в1роПдних ) глюкозування перешкоджають його експресп в прокарютичних системах.

В табл.2 представлено дань щр засвгдчують роль В1русу 5У40 у посиленнх експресп кДНК гена тканиноспещф чного активатора плазмшогену. Введения рекомбшантних плазму у склад1 кальще-вого прецшптату приводило до експресп тканиноспециф1чного активатора плазм1ногену ( активность 7 од/мл ) в шзн1 терм1ни п1сля трансфекцп - через 40-62 години. Введения в1русу 5У40 одночасно з трансфере» рекомб1нантлою плазм1дою приводило до експресп тка-нинного активатора плазМ1Иогену в рашп строки - через 13 годин. Максимальний р1вень фабринолнично! активност1 спостер1гали через 37-43 години, який на той час сягав 50 од/мл.

Надал! ревень експресп знижувався до 7 од/мл. В контролъних культурах юптин СУ1 та культурах юптин СУ1, ааражених в ¿русом ЭУ40, не спостер1гали ф1бринол1Тично! активность

Дан1, наведен! в табл.2, вказують на досить високий рхвень активност1 тканинного активатора плазм!ногену, одержаний в наших

досл^ах. Так, за лтратурними даними ревень синтезу активатора плаэм!Ногену, зокрема в кл^инах легенево* карциноми, еягае 9 од/мл (бгоров та 1н., 1987, Шевелев та ¡н. , 1986), В досл^женнях )Э застосуванням ретров^русних вектор1в в клонах культур кл1тин Rat секрещя активатора плазм]ногену сягае 5-15 од/мл, в той час як в юн тинах BALB/c ЗТЗ ревень його продукц»i значно вищий (HHif-лев та iH., 1992).

Таблиця 2. FKcnf-eiH гена тканиноепеци'£! чного hkthbhtoj*i (1лаэм1н0гену ь культур! кл!тин СУ1.

I Актиьнiстъ урок i на?и (од/мл )

середо&ице I ГоДИНЙ 111ПЛЙ Тр*НО<{|нКЦ1

I 13 16 19 Z2 37 40 43 47 Г,?

1 1. CV1 I - - -....... I

2. 1 SV40 I -!

а Одночлен- ы^-дення I 3V40 та тяьлттъ I 7 7 рДР (Д^Аг-ДмКо'граЮ 1 14 14 14 50 !4 Я 7 7

4. пля^м!^-» рА? I (ДКАЕ-дечет^м) I -I

5. Плазм1Дс» j»AP 1 (кяиьц^ьий I -н]*гциттат) 1 I 7 7-7

Варто В1дзначити, що ряд автор i в вкеловлювали припущеннч про те, що культури клггин нирки ( CV1 та Vero) синтезують 'нпбггор тканинного активатора n.na3Miног^ну (. Rug^r* ft а]., 1989, Алпькоь та iн. , 1991 ), як ци BsflöyBaiTbcrf,. наприкдад, в кл< гик-ix легеневих (¡пбробласччв ембр]она людини, ь яких було одержано хроматограф]чно чиетий активатор плазм^ногену.

- S6 -

4.3. Екепресмя бактер1ального гена ^-лактампьи протягом реплжацы рекомб¡нантних плазми ь культурах юитин соавщв.

Досл1Дження, щр стосуються вивчення функцюнально! активноетi рекомб1нантних .плаэм1Д, а еаме регшкацы рекомб¡нантних ДНК та експресн reHiB, що знаходяться шд еукарютичним промотором, наштовхнули на думку про вивчення можливост) вираження влаечих бактер1альних reHiB, що входять до окладу рекомГИнн"тчиу ппчйцчд. В плазм1дах групп pRR, як! >ю|у-нн»н>> ник«.>ри>"м-.*/» >• и«»»»»

СЛ!ДАЯНИЯХ, ТаКИМ iVHOM «нктнм^и. ТТ~й i >-" "■<- M-»'!<i

бактершльн) примш-ири i аавдяки сам*- гену ^З-лактнмази плазм!ди групи pBR легко виявляти та препаративно нагромаджувати в F. oolг.

EKcnpeeiio гена Ji-лактамази та юлькють ^-лактамази можна виявити завдяки чутливост1 ста$1 локона до пенщилжу та зднтноот; ^-лактамази руйнувати пенлдоин.

В CBOix дослиженнях ми зробили опробу вияснити, чи може виражатись ген ^-лактамази протягом репЛ)Кац>') рекомб)нантних плазм^д в культурах юптин есавшв.

На рис. 10 показано експрес1ю ^-лактамази при трансу кувннн i культур KJiiTHH рекомб! нантною плазм^ою pHS та одночастному i H«|)i ку-BaHHi ix вiрусом SV40. Експресп Jä-лактамази не епоотгр>гали в культуральному середовищ! з необроблених нуптин та не епостер^али ъ культуральному середовиии а юитин, трансукованих самою лише рекомб)нантною плазм1дою. Активнють JJ-лактамази виявлнли в наших досл>дах лише пiд час реплгкацп рекомб¡нантно* плазмой в культурах юп тин ccaeuiB, що видно з рис.10, тобто П1д чао транеф^юи i культур кл^тин рекомб ¡нантною п.паэм)Дою при одночаоному введенн> в ipyсу 3V40.

Розрахунки засв1дчили, що piBeHb синтеяу j}-.пактами* и оягне 35 мкг/мл через зг> годин июля т^ННои1 та мфкуьнння в ¡русом SV40.

Експрес'Ю гена ^-лактамази рекомб)нантною и.ла^до'м, що ргн-лжу^ться в культурах юитин оенвфв, можна, мнбуть, иояенити тим, що, хоч ген ^i-лактамази не «находиться безпоеередньо гид f-укар)-отичним промотором rtipycy 3V40, ане biH межу): з uiöHiM промотором

в i рус у SV40, i напрям транскрипцп з власних промотор1в jj-лакта-маэи Р1 та РЗ, що забезпечують експресно у прокарЮтичШй систем!, сп!впадае з напрямом транскрипцп з п!энього промотора Bipycy 3V40.

Рис.10. Експрес1я ^-лактамази при репл!кац1^ реком61нантно1 плазм1ди pHG в культурах кл1тин ссавц1в (1, 2 - picT St.aureus при внесенн1 чисто! лактамази; 3 - культуральне середовигае; 1 - дестильована вода; 5 - культуральне середовиде э кл1тин через 36 годин пхсля трансфекцИ плазм!дою pHG; 6 - культуральне середовище з кл1тин черет 36 годин п!сля трансфекц1Х плазм1дою pHG та одночасного з.нф1кування BipycoM SV40 )

В культурах кл!тин ссавц1в, очевидно, в!дбуваеться в1дщепл<?н-ня сигнального пол!пептиду та с'екрец!я в культуральне середовищэ функц!онально активно} ji-лактамази, здатно! пдрол!зувати JJ-лак-тамне К1льце пен!цил!ну.

Таким чином, eKcnpecira р-лактамази, як i eKcnpeciio CAT гена, можна спострр!гати як у прокар!отичн!й, так i в еукар!отичн!й системах.

Застосован! нами рекомб!нантнi плазм!ди об'еднують дв1 $iлогенетично рiэнi системи та використовують регуляторн! фраг-менти цих систем в залежност! В1д еколог!чного оточення. У прока-pioTW4Hifl еколог^чн^й систем! включаоться прокарютичн! регулято-рнi елементи, в еукар)0тичн1й еколог!чн!й систем! включаються еукарютичн) регуляторн! елементи?

Використовуючи модель Т'яна ( Myers, Robins, Tyian, 1981 ), щр описуе роль кооперативного зв'яэування Т-антигена в в1русною ДНК nifl час решпкацп BipycHoi ДНК та контрол1 транскрипцп, ми пропонуемо модель iндуьщ! i репл1кацп та посилення транз1ентно! експресп рекомб1нантних плазм1д на 0CH0Bi SV40, яка полягае в. тому, шр транз1ентна експрес1я reHiB з раннього промотора SV40 у склад 1 рекомб1нантних плазм! д зд!йснюеться в paHHi строки пюля трансфекц!i за допомогою кл1тинних регуляторних б1лк!в, а !ндукц!я репл1КЭД1 i та авторегуляц1я ранньо-Шзньр! транскрипц1 i реком-б1нантних плазм1д в1дбуваеться за участю BipycHoro регуляторного б1лка ( Т-антигена щр нагромаджуеться вирусом SV40 в npoueci л1тично1 Шфекцп.

Досл1д)кення бЮлог1чно! активност! рекомб!нантних плазм1д в культурах кл!тин ссавщв е практично важливим з огляду на HeoOxiflHiCTb препаративного нагромадження Щнних б!лк1в. I тут, природньо, становить iHTepec посилення TpaHaieHTHOi eKcnpecii reHib, щр входять до складу таких рекомбшантних плазму, репл1ка-Ц1Я яких може бути ¡ндукована в культурах щцтин ссавц1в. I,дiй-сно, адже, як про це йшлося ранше, матриця, шр репл!куеться, пе-реважае не Т1льки протягом решикаШ! ДНК, але i п!д час транскрипцп mei ж ДНК.

Для одержання максимального piBHH eKcnpecii ми пропонуемо модель 6ireHHOi конструкцп рекомб!нантних плазм!д на ochobi SV40.

Очевидно, дощльно конструювати рекомб!нантн! плазмади таким чином, щоб клонований ген дублювався та був розм1щений як шд paHHiM, так i nifl П1ЗН1М промоторами SV40 у CKJiafli OEHiei або двох piзних молекул.

I TOfli в npoueci л!тично! мфекцП Т-антиген SV40 спочатку буде посилювати експреспо гена, що знаходиться тд раннем промотором, а поим експресш цього ж гена, що знаходиться тд niSHiM промотором SV40.

Таким чином, використовуючи здатнасть регуляторних елемент1В та б1лк1в SV40 до авторегулящ i, можна, очевидно, отримати макси-мальний еих.1д практично щнного б1лку, застосовуючи рекомб1нантн1 ДНк а б!генною конструкщею та запропоновану нами еукарютичну

систему 1ндукц!I ролл1кацп та посилення транз!ентно$ експресп р'екомбшантних плазм!д на основ 1 ЗУ40.

0СК0ВН1 ВИСНОВКИ

1. Роэроблено основи та створено модельну систему еукарютичних шитин, в якШ посилюеться функщональна активнють рекомб1кантних плазм¡д на основ1 ЭУ40. Очевидно, аналог¡чн1 еукарютичш системи мокуть бути створен! 1 для ¡нших вектор1в в1русного походження.

2. Показано ¡ндукц!ю репл!кацп рекомб1нантних плазму що мютять регуляторн1 елементи ДНК в!русу ЗУ40, в культурах пермюивних

тин ссавц!в у випадку застосування ¡нфекШйного в1русу БУАО.

3. Встановлено посилення транз1ентно! експресп ген!в, як! вхсдять до складу рекомбхнантних плазмад, що мютять регуляторы 1 дишнки геному 5У40, в еукар!отичн!й систем! КЛ1ТИН у випадку одночасного введения в!русу ЗУ40.

4. Застосування методу одночасного введения а¡русу ЗУ40 та реком-б!нантних ДНК дае молшивють викориссовувати для акцШчИкаш1 рекомб!нантних ДНК, шр мютять регуляторн! д¡лянки генома ЗУ^о, широкий спектр клгтинних тишв , пермюивних до ЗУ40.

5. Показано, що аденов!руе другого типу )ндукуе peпл¡кaцiln рекоч б!нантних ДНК, як>. мютять р^гуляторну дыянку ЗУ40, в Псрмюканиу для адениВ1русу та непермЮивних для ЗУ40 культурах кжтсн ccaвц¡в.

6. За умов одночасного введения в1русу ЗУ40 та рекомб!нантнчх плазм!дн'их ДНК з регуляторною лплянкон ЗУ40 можна виявити -^кспре-с;ю прокарютичного гена ^лактамази, що не знаходиться безадп-ередньо П1Д промотором 5У40.

7. Показано можливють переключения прокарютичних та еукар 1 -отичних промотор1в при експресп гена ^-лактамаэи та САТ гена за умов прокарютично! та еукарштично! систем.

8. Запропоновано модель, що пояснюе ¡ндукщю репл1кацп та поси-лення транз1ентно5 експресп ген ¡в рекомбхнантних плазм¡д в еука-рютичшй систем! КЛ1ТИН.

9. Для одержання максимального р^вня експресп гена в еукар1-отичнгй юлтшшй систем 1 запропоновано конструкцио б1генно1 рекомб1нантно! плазм1ди, в як^й один 1 той же ген знаходиться як П1д ранн1м, так 1 шд П1зн1м промотором В1русу ЗУ40.

10. Розроблена нами система реап1защ! генетично! ¿нформащ т рекомбшантних плаэм!д, що сприяе ¡ндукцп ¡х репл^кацп та пос-иленню експресп, дае шдставу эапропонувати У\ для практичного застосування з метою нагромадження продуктов особливо щнних ген¡в, що потребують для свого дозр1вання певних еташв посттранслятйноч модкф^кацП, шр мають мюце лише в еукар1отичшй (Штинь

Список раб1т, опубл1кованих по тем! дисертацН'.

1.Ландау С.М., Носач Л.Н., Павлова Г. В. Использование морфологического метода для титрования SV40 //Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Генетическая инженерия ".- 1980.-С. 77.

2. Ландау С.М., Носач Л. Н., Павлова Г.В. Цитоморфологический метод определения, инфекционного титра вируса SV40 //Микробиол. журн.-1981.-Т.43, N З.-С. 388- 392.

3.Landau S.M., Gudz-Gorban А.P., Kostomakha L.K. Functional activity of simian virus 40 DNA //Theses of reports Fourth Symposium USSR- FRG "Structure and transcription of genome".-1981.-C. 81.

4. Ландау С.M. Использование генома SV40 в качестве вектора для эука^риотических клеток //Молекулярная биология.-1982,-

N 30.-С. 57-70.

5.Landau S.M., Nosach L.N., Pavlova G.V. Morphological nethon for estimation bf simian virus 40 infectious titer // Arch. Virol.-1982.-V. 73, N l.-P. 79-84.

6.Ландау C.M., Костомаха Л.К., Шлянкевич М А., Дриэе О.Б., Томи-лин Н.В. Получение и характеристика рекомбинантной плазмидн, содержащей ДНК SV40 // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Ре-комбинантные ДНК".-1982.-С. 25.

7. Ландау С.М., .Костомаха Л. К., Шлянкевич М.А., Дриэе-О. В., Томи-лин Н.В. Получение двурепликонной рекомбинантной плазмиды, рклк>-чающей полный геном SV40, и некоторые ^е свойства //Тезисы докладов Всесоюзной конференции " Метаболически** плазмидн бчк. рий" -i9R?.-n

8. Ляндчу С М , Гуд? с-ГорПцчь А П., Ь">.....имнх* Ь' Кшил^нцн функциональной акгивмчити ДНК "V4C //Молекулярная биология.-1983.-N 35.-С. 10-13.

Э.Ландау С.М., Костомаха Л. К., Дубровина Н.О., Чащи на Л. И., Кор-дюм В.А. Эффективность взаимодействия бактериальных плаэмид с клетками млекопитающих при разных способах их введения //Тезисы докладов 11 Всесоюзного совещания по генетике соматических клеток в культуре.-1983.-С. 101.

10. Landau S. М., Sasina L.K., Glebov О. К., Mikhai lov V.M, Abramyan D. S., Aprelikova'O. N., Kordiuro V A., Tornilin N V. Studies of expression of J3-lactamase bacterial gene in TK-transformants from Chinese hamster cells //Abstracts of

Fourth Symposium USSR-Italy " Macromolecules in the functioning cell".-1984.-P. 111.

11.Ландау C.M., Сасина Л.К., Калинина H.О., ЧащинаЛ.И., Кордюм В.А. Сравнительное исследование двух способов обработки клеток млекопитающих бактериальными плазмидами // Молекул, ге-нет., микробиол., вирусол.-1984.-'И 11 .'^С. 16-20.

12.Томилин Н.В., Глебов O.K. , Шхайлов В.М., Ландау С.М., Саси-на Л.К., Абрамян Д.С., Апреликова 0.Н., Кордюм В.А. Экспрессия в ТК-трансформантах клеток китайского хомячка бактериального гена jj-лактамаэы //Цитология.-1985.-Т. 27, N 6,- С. 13-18.

13.Ландау С.М., Сасина Л.К., Кордюм В.А. Конструирование и анализ гибридных плаэмид, содержащих геном вируса SV40 //Мэлекул генет., лиифобиол., вирусол.-1986.- N 1.-С. 26-30.

14.Ландау С.М., Носач Л.Н., Сасина Л.К. Тестирование репродукции вируса SV40 цитоморфологическим методом //В книге: Методы молекулярной биологии.-Киев: Наукова думка, 1986.-С. 133 - 136.

15. Ландау С.М., Сасина - Л. К., Чащин Н.А., ЧащинаЛ.И. Индукция репликации бактериальных плаэмид, содержащих геном SV 40, в клетках млекопитающих // Тезисы докладов Всесоюзной конференции ."Новые направления биотехнологии ".-1986,С. 144 - 145.

16.Ландау С.М., Сасина Л.К., Чащин НА., Чащина Л.И. Исследование репликации плаэмид, содержащих геном SV40, в клетках млекопитающих //Биополимеры и клетка.-1987.-Т. 3, N 3,- С. 134-136.

17. Ландау СМ., Сасина Л. К., Шлянкевич М. А., Дризе О. Б. О неко-.торых особенностях репликации плаэмид, содержащих геном SV40, в культурах клеток млекопитающих// Материалы Всесоюзной конференции "Молекулярная биология генов высших организмов".-1987.-С.13.

18. Ландау С.М., Сасина Л. К., Шлянкевич М. А., Дризе О. Б. Репликация плаэмид, содержащих геном 3V40, Q культурах пермиссивных клеток млекопитающих // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии".-1988.-С. 48:

19.Ландау С.М. Возможности использования векторов на основе ДНК 3V40 для генотерапии // Биополимеры и клетка,- 1989.-Т. 5, N2,-С.36-43

20.Ландау С М., Сасина Л.К.,Шлянкевич М.А., Дризе О.В. Изучение репликации плярмид, содержащих полный геном 3V40, к перммсси«ных