Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕГУЛЯЦИЯ КИНЕТИНОМ ДВИЖУЩИХ СИЛ ТРАНСПОРТА КАЛИЯ В КЛЕТКАХ ЭПИДЕРМИСА КОРНЯ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "РЕГУЛЯЦИЯ КИНЕТИНОМ ДВИЖУЩИХ СИЛ ТРАНСПОРТА КАЛИЯ В КЛЕТКАХ ЭПИДЕРМИСА КОРНЯ"



АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БОТАНИКИ им. В. Л. КОМАРОВА

На правах рукописи

АЛИЕВА ФИРУЗА КАМИЛЬ кызы

УДК 581, 17:577.3

РЕГУЛЯЦИЯ КИНЕТИИОМ ДВИЖУЩИХ сил ТРАНСПОРТА КАЛИЯ В КЛЕТКАХ ЭПИДЕРМИСА

КОРНЯ

03.00.12 — Физиология растении

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации «а соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ь аку —

1990

Работа выполнена в лаборатории минерального питания растений Института ботаники нм, В. Л, Комарова АН Азерб. ССР.

Научные руководители:

академик АН Азерб. ССР, доктор биологических наук, профессор АБУТАЛЫБОВ мТТ.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник АЛИ-ЗАДЕ В. М.

доктор биологически?: наук ЮРИИ В. ¡4.,

кандидат биологических паук АЛЛАХВЕРДИЕВ С. Р.

Ведущая организация — Институт физиологии растении им. К. А. Тимирязева АН СССР, г. Москва.

на заседании специализированного совета К 001. 12,0! по защите кандидатских диссертаций при Институте ботаники им. В, Л. Комарова АН Азербайджанской ССР,

Адрес: 370073, Баку, Пзтамдартское шоссе, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Официальныг оппоненты:

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

1990 г.

Учены б секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Р. Г. ДЖАВАДОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAEOTU

Актуальность темы. Исследование роли гормональных факторов, изменяющих физико-химическое а структурное состояние я неточных мембран, в регуляции физиологических процессов у растений пред-отавляет собой одну из актуальных задач современной физиологии раст,екай. Данные, указывавшие на участие цитокиняаов,синтезируемых Ь меристеме корня, в регуляции распределения и транспорта ионов у растений немногочисленны ( CXeland ,1976| Максимов и др.,1979; Лбуталыбов и др.,I960: Абута лыбоа,Ахундова, 1962; воробьев и др., 1986; Тихая и др., 1968), Однако очевидно, что эффект цитонининов на элегтрогенез плаэмалеммы корневых клеток и их АЗДаэную активность связан с изменением синтеза и обновления мембранных белков, транспортных АТФаа ( Karmokcr ,1965} Тихая, Вахмистров, 1968).

Многолетний поиск регуляторных механизмов ионного транспорта привел к всеобадму признание гипотезы электрогенмих К^-насосов в их функциональной рояи в генераций мембранного -потенциала, используемого для транспорта ионов ( Мегге ,1979; Воробьев,1960; Pool r 1982) .Представляется вероятным, что именно протонный на-, сое служат универсальным энергетаческим приводом до, всем активным жоншм потокам на плазмалемме растительных клеток (Вахмистров,1965).

Вызывает интерес.вопрос о соотношении двух типов белкойых структур плазматической мембрана: электрогенных насосов, мембранных транспортных АТФаэ и селективных каналов ионной проводимости а аффекте фитогормонов на электрические параметры плаэмалемж л трансмембранный .перенос ионов (Воробьев и др.,1987). В этом направлении выделяется исследования, в которых выявлена связь полярам-цяи лонноготранспорта я растительных клетках с активацией фято-гормонами работы электрогенних «асооОв (Иодевой, Саламатова,1960). Кроме того, в некоторых работах по аналогии с ауксинами допускается актявяруадо вляяэдб цвтокшшяов на Н+-наСоон плаэмапекиы рао-тательных кдетод.(Максимов к др.,1979; Полевой,1562; Лоттге, Хмгаа-ботам,1984). Однако остается невыясненным вопрос о конкретных механизмах действия цктокяниноя на мембранный транспорт калия в клетках корневого эПкде;мяса. Одним *э ванных факторов контроля протондвикутей а И+-двн1куадх сия, связанных с генерацией мембранного потенциала, является рН среда. Моаяо было Окндвть, что вменение наружного рН я ус ловив гвнерации мвшоранного потенциала (присутствие флто^рмона и внММЙср^^ аокного транспорте, . 'i i;,?'-"-^-- - "1

. Учаотче ростовых юрмонов в регуляции внутриклеточной активности к&ляя а связь ее о процессами дифференциации к роста корневых клеток при изменений солевого состава среды (Абутаныбов и др., 1979; АйутегщОов, Лхуедова ,1962) выдвигает вида один актуальный аспект этой проблемы - вопрос о регуляция цитокнкинаии адаптации раогвнйй к солевому стрессу»

Анадяа движущих сил ионного транспорта яаяяетоя, на над взгляд, комплекс&ш* критерием как для оценки роли гормональных факторов в регуляции транспортных процессов, тан и для определения условий оптимизациифизиологических процессов.

Цель и задачи исследований Целью настоящей работы явилось изучение о помощью микроалектр одн о й техники роди наметана в регу- . ляции движунцис сия мембранного трансаорта калия в корневых клетках.

В работе били поставлены е ле душ аа задачи: ... . X, Исследование внутриклеточной активности ионов К1, н мембранного потенциала в клзтках эпидермиса корня и проведение.термодинаг иических расчетов К+-движущей силы корневых клеток различных ростовых вон при действия кинетина и ингибиторов белкового синтеза хло-рамфашкола и щшлогексимнда. :

... 2. Айаяаа протон движущей я Н+-двикущей сил в клетках при действия кинетяна я ингибитора протонной АИаэы дицикяогексилкарбода-нмида в широком диапазоне рН питательного раотвора от 4,0 до 6,0. ...... 3. Определение влияния кинетика на влектрокимическве характеристики и движущие силы транспорта ионов К4* в клетках корневого »иадермкоа при введения хлоридов я среду.

Научна^ ^дри^напаботы. Впервые установлены следующие ректоры. На основе измерения внутриклеточной активности ионов л мвм<3ран-вихаотенцхаййв произведена оценка электрохимического состояния ионов, кадия и водорода я исследован характер распределения мхм виду клетками риэодеринса растения и средой при действия ингибиторов мадюгексишща» диодкдогвм*Л|«рбодниыида и их сочетания с *ин«а-ясш, Выявлены существенные различия в действия кинетика на генерацию К+'-двигущей сила при изменении катевоавлост* белкового синтеза в аависнмоота от концентрации, продолжительности воздействия цаКло-гекояшда а корневых воюакахррзяэго возраста* доказано* что при реакции среды рН-6,6 пабякиздвтсл оптимум раэаатад вротоадвкиуэдей а К*-двя*ущей сил под ялшяитм к ¿не тина а блокирование алектроге-^эадицлкАйГвйвийкарЙодйЬдадо«^

следования суйдастаеннк Для чойишиА ыехаяизмов гормональной роту-

яяцяя транспорта калия в корневых клетках высшего растения я могут быть использованы в научно-исследовательских лабораториях для выявление физико-химических, основ поступления калия в растительные «летки в неблагоприятных: условиях среда (при варьировании рН, соотношения хлоридов в среде), а такта при разработка приемов оптимизации цитоклнинамя питания растений калием.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на республиканской конференции "Растительность и пути регуляции ов жизнедеятельности" (Баку,1906); на Всесоюзной конференции "Водно-«ояевой режим раотений и физиология корня" (Москва,1989); на X Национальном симпозиуме по физиологии растений в НРБ (София,1969).

Объем диссестации. Диссертация язложена на У^Зограницах я постоит из введения, обзора литературы, методики, результатов * обсуждения, выводов, иллюстрирована ц - рисунками, оодержит 9 Таблиц я U3 ссылки на литературные источники» из них 62 на

русском языке и /91 на иностранных языках* ♦

- ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ОБЪЕКТ И МЕТОДИКА ИССШСЁАНИЙ

Объектом исследования служило высшее водное растение Trlenee bogotensia Karst .. Растения выращивали £ факторостат-иой хамере о пюминиоцентнык освещением (15 тыо,лк 16 часов в сутки) при 25°С, Средой выращивания служил питательный раствор (ПР) 0,25 норм Хогланда-Аряона I (Х-А), & котором содержалось (ы!Д): кно^ - I,25t КН2Р04 - 0,25; Се(НОз)2 - 1*25; МебО^ - 0,25, . железо и микроэлементы. Походный рН оредц доводили до 6*0. Попользовали также растворы с рН от 4,0 до 8,0: кислые значения рН получали при помощи 0,1 М HCI, щелочные - 100 (А5 триса("йеепв1" , Венгрия).

В серия экспериментов растения выращивали 5 оуток на оредв о кинетнном (4,6*10~7М) я в той se концентрация явнетин вносили в питательную среду Х-л после выхода мембранного потенциала (МП) на стационарный уровень и установления плато (величина МП поддерживается о точностью ¿ ЗДВ в течение 30 минут). Опытные растворы о добавление» кинетяна, хлорамфенякола (ИО, циклогекоимида (ЦТ) и дяциялогвксилкарбодиимида. (ДЩ) получали разведением соответствующего объема концентрированного раствора их ПР 0,25 норш Х-А до получения используемых в опытах концентраций. Лишь в раст-

вор о ДЩ (Sigma" ¡CBIAJ в концентрация их поиещчм н*

30 минут перед опытом.

Введение хлоридов в ПР проводили путем: XJ замени KNOj tut »явяваявятное количество №1 с добавлением для «ооцшМ-

ВЯя постоянства мо^'» 2,5 мМ; 2) дополнительного введашив Ш. 0»Э? в 0»Б# раствора NeCL . Одновременно о введением ионов СГ*в BP в специальных опытах яносняя 4,6- 1СГ7М кянвтяя. Сопостаяляиюь результаты острых (в omrte} в длительных (выдерживание не нейее 8 суток) воздействий.

Исследовали корневое клетки ояедувщях тяпов: сформировавшиеся, растущие корневые вояосии с отноввнием длявв - диаметр ЮН (•она раопокоженнае поояв иод одах, только яачаявих роат «оряе-вмх волосков» я старые, закончившие рост корневые вояосяя о отио-«еяяем длине - диаметр Э0:1 (зона 2).

MR измеряли обычными мяярбвлвитродами солевыми мостиками о диаметром кончина одоло Z мкм, катяонная функция киорих онкяа- ; шЬа% ьведением ЗМ КСI + 0,3 MgCL2 , * Кончик вводного Мяировхвктро-да t воносновых клеток аредполоянтеяьно был локализован в into-пяаамв 4 Дня измерения Внутриклеточной актяяяоотя калия (А^ ввиевь-ВОВвяИ К4, - ^СТ»»ТВЯЬНМЙ МЧв«|Я111Ы1ЖрОВЯе1«рОД М(иОЧЯОГО мм«

описанный ранее (Воробьев*!975). Уотамовм для микровлектродяих измерений была Смонтировав« на базе мянромаяяйулятора IM-I я микроскопа МЕИ-э о ЕОО-кратныи увеличением, Подросло методика микро-вявятродни* иэмеревяй onясака в работе (Мельников я др,,1974).

Движущую сидуиояой ямил» It*" - эяектрохямНчеокяй градиент t ) раобЧйтыяаля но формула! 8^-1,,+, где В^ - мевбраяянй

потенциал! Еи - равновесный погвнйяал яойов каля/* (потенциал Hep-eta) a idsi

V"®8^!^-'******

Явижуиую силу H4 - Яоной, Н* - электрохимический градиент

(Ajt(w+) определяли Ьо $ер*цуяв* Е^ - Ей+ , где Вя+ - lit - рмво-в ее ныв потенциал!

V 3 58 [jgk - 58 (рНйА - рнср) пря 22°

Бнз^ряйяетачгшй рй (fJ^/ рассчитывали по эмпярщзсяоЯ йер-муяв Уояяера-Смктв (с-Й.ёг;!ООьзв,1580):

рНйЛ * 5,?.- ; 0,22 iHcp

В работе приведены средние значения и их стандартные ошибки, в скобках - числе определений.

результаты и ошщеше

I. Регуляция мембранного транспорта кадия при действии ингибиторов белкового синтеза и кннетина

физиологическое значение цитокинезов в регуляции активности кэдля в клетках корня описано ранее (Абуталыбов.к др.,1961; Абутв-лыбов,Ахундова,1962). Показано, что кинетин и его активные аналоги вызывают значительную т; эр п о ля р изашю, повышают Ак+ я рост корневых клеток.

Предполагалось, что механизм дейстпия цитокининов на транспорт кадия в корнепых волосках связан с включением имевшихся в клетках белков в состав циюплаэматичесних мембран и сопутствующим изменением деятельности ионных насоссв.

Нам представлялось интересным выявить закономерности в генерации Шив накоплении калия корневыми клетками кинетикой при изменении интенсивности белкового синтеза ингибиторами XX и ЦТ,

При концентрации Х£ 3• наблюдались достоверные изменения МП на +16+6(8) мВ, а при концентрации з>10~гН - резкое падение МП, замедление движения цитоплазмы и гибель растения.

Важно отметить, что лаг-перкод между внесением КЬ к изменение» МП корневых волосков отсутствовал и деполяризация эсщдериаяъ-н^х клеток наступала сразу же после введения К в ПР. Действие ХФ (3- КГ3!.') оказалось оОратамш: при исключения его из среды МЛ корневых волосков^воестанавлявал, а прд внесения в ПР раствора кинетика (4,6*10"%) даже несколько превышая исходный уровень -/150*12 (?) иВ/ (рис Л). При этом МП корневых волоояо», обработанных Я, при введении кинетика в ПР.увеличивался на -22 ± 6{?), а в безвоЛесковых клетках - «а -13 ± 4(5)мВ ог уровня ингибировяния. Эффект ккнатина соответственно составляет -17 г 12;17) и 2+7(7) от исходного уровня (Абуталыбов, Ахундова, 1982).

, Рас ,1. Изыедекав мемйрайного потенцадяа (Ец.мВ) корневых клеток при замене хлорамфенихола (3*10'в питательном растворе на кинетлн (4;6*10~"(1)« А - корнеяой яоеосок; Б - безиолосяоваяклетиа; Стрела - н^меях ввевевия веа'.аства в среду.

Аиапогйчкая картина а азмененип МП корневых клеток бы да подучена при введении я ПР ЦТ. Наийолее эффективная концентрация его в ПР 3,5*10"% вызывала уменьшение НО кораевкх волосков йа +4? ± 11(10) мВ, а в беэяолоскоаых метках - на +12 * Э(8> мВ от доходного уровня. Однако, а отлкчяе от И, МП депошсрязован-шрс ЦТ 13,5* КГ^м) клеток не восстанягяявался на при исключения его аз ПР, вн при замене его (4,6*10"'й> киив!адом (рвс,2). Из приведенных кривых видаю, что, во-первых, деполяризация плеток ври взеденид Щ' в ПР происходит без лаг-периода я* во-вторых, еффекг кинетика в восстановления деполяризованных ЦТ иеик отсутствует.

Сочетание »лектрогеяных Н+-яасосов « каналов утечка, образо-. аашшх мтегреяышми бешсамя мембраны о оставляет современную ¿иктрохвмйчеояув иоде ль растительно а хлетяа (Воробьев, 1966;, с . помощью которой ш попымаиеь антерпретяровать пожученные аффекта.

1Г

I

30 (0 « ио ®

1 Ряс.2. Изменена« мембранного потенциала (Е^.мВ) корневах клетоя при замене циклогелсшвда {3,5* ВТ5!!) а питательней рдетворе на кияетин (4,6*Ю~7М). А - корвевые волос«и; В - безволосновие клетки; Стрелка - момент введения вещаатэа в среду*

Можно Лло предположить« что при остановке белкового' синтеза цак-догвксамидом происходит, прежде всего, распад короткоконущах алектрогвнннх каналов {деполяризация МП), а затем уже деградация каналов утечки, обеспечивающих пассивную ионную проницаемость мембраны (Яялин,1980).

Анализ данных таблиш I показывает, что во пах"вариантах, кроме ИГ Э,5'10~5Нв опытной среде электрохимический градиент капая направлен но среди в клетку независимо от ростовых.зон корня, концентрация и продолжительности воздействия агента.

Деполяризаций-клеток корневого эпидермиса при длительной ■ едепозиции в ЦТ низкой концентрации (3,5*10-%) в орадв выращивания и отсутствие эффекта при кратковременной экспозиции (3,5-ЯГ%!) в опыте, а так» изменение Ай+в этих вариантах может свидетельствовать, по-видимому, об изменении соотношения проводимости н1*- нааосоа й к+- канаков казна леммы.

При кратковременном воздействии высокой концентрации ЦТ ( 3,, & ■ 10"%) с опт к ошекиэ адгябироваяйя МП и Ак+ веравнозначно, что

подтверждает, возможно, допущение о снижении отношения числа электрогенньх каналов к числу каналов утечки (Ляпин,Ахмедов,1578). По-видимому, переход к состояний К* электрохимического равновесия о уменьшением ^ может быть следствием выключения электрогенных насосов.

Таблица I

Зависимость измеренного Мембранного потенциала (Е^.мВ), внутриклеточное активности К* (А^иМ) рассчитанного равновесного потенциала по калию (Ек+,мВ) и К^-движущей силы ( ,«£) растущих (I зона) я закончивших рост

(8 зона) корневых волосков от присутствия в среде цикло-гекоимида

Характе- 0,25 н.Х-А Концентрация ЦТ. в 24 часа в

ривтияа контроль опытной среде> М среде выращ.

Э,5'Х0~5 3,5'Ю"6 З^Ю"6

, Зона I

V мВ -I50±I5(I0) -103*15(10) -148^9(5) -Кб^С?)

А^.Ш 102^5(14) 8I¿6(5) 86^(6) 49t6(5)

jS„+,ie -112 -107 -106 -92

, -38 +4 -41 -34

. Зона 2

V» m 63*10(7) 62±I6(7) 60*9(5) 37±7(7)

B-+, »© —99 -97 -96 -84

Ajk t & -51 -6 -53 -42

Приведенные давние позволяют заключить, что при кратковременном действия высоких концентраций ЦТ вклад его в ингибкрование меятрогенной составляющей больше, чем при длительном действии вязких концентраций ингибитора, сопутствующим, по-видамому,уменьшению содержания в них цятшлазматическях белков, образующие каналы проводимости,

В случае о введением в среду выращивания клиетина помимо прямого поступденяя калия из окружающей среда по градиенту злек-грохаипческого потзгщЕана, монет происходить его пряток в старые корневые волос кя из «осй.адих растущих норлэвых волагков (Абу?аля-боз, АхундоваЛ36£>»

Представляется важным отметить, что последовательное я параллельное введение в среду кинетина и ЦТ [тайл.2) оказыэяет неравнозначный эффект на распределение К+в корневых клетках. 2 л«рвом случае (варианты ЦГ на Зоне 5-суточного выдер!кизания в кадет^не), независимо от концентрации и продолжительности БозлеГ.схз.'^ иы-и-Оитора сохраняется э^^кт кинетика: скиженае накопления К"* в растущих я повышение - в старых, закончивших рост корках волосках по сравнению с контролем 0,25 и Х-А (см.табл.1). УЫтареоно, чю изменению Ан п этих вариантах не сопутствуют изменений т.^ичаи" К*-двшкущеа силы: о Она ружпваутс а кнлидирование ЦГ ^, ;Ц"' 3,5*10"% в опнге) до величины - 29 мВ к -13 глВ и I и 2 зонт,,' =о-огвегстаенно и при ЦГ - 3,5* ГО-0;»! 24 часа в средо выроа^ан/.« до величины -50 и -37 мВ по сравнению с вариантом 0,25 к, У.-Х + ¿ине-тин 5 суток. Таким образом, обнаруживается уменьшение деноларлаа-ции, вызванной ЦГ nf.it действии обеих ьго конценгргши? на ки-неткна (5 сутоку (сн.табл.3 и 4}. Однако в формировании л/ч^ электрогеннал компонента играет большую роль пса концентра^;« ЦГ 3,5*КГ®М 24 часа в средо наращивания, Во втором случае (варианты ЦГ + кинетг.н на фоне 5-еуточного выдерживания в кшштине* при параллельном действии ЦТ и кинетина нарушается распределение К* по зонам по сравнению с предыдущими вариантами; увеличивается Ак+ в растущих (зона I) и не изменяется в старых корневых волосках (зона Накопление К+ в этом варианте при уменьшения происходи?, по-вадимому, за счуг ус и тоаил кинетином синтеза балков, образующих К+-каналы. Следовательно, совместное действие обоих агентов, как показывает анализ движущих сил транспорта К*, уменьшает вклад электрогенного насоса и увеличивает проводимость К+-камэлэв.

При удлинении срока воздействия обоих агентов (ЦГ +■ кин^тин 48 часов) наблюдалась лишь незначительная тенденция к снижению накопления К*, хотя К+-двнгу.цая сиди, к + -57 мЕ и -54 мВ соответственно в I и 2 зонах) возрастает, что возможно, связано о • ослаблением действия ЦГ во времени.

Таким образом, как показываит наши данные, регуляция мембранного транспорта ионов калия в корне растений кннетином связана о ростом и белковым синтезом, что отчетливо проявляется у растущих корневых волосков, в которых происходит интенсивный синтез бехка.

. . Табшша 2

. Зависимость язиереввого мембранного потенциала (Е^мВ), внутриклеточной активности' К*(А£,мМ} ж рассчитанного равновесного потенциала со калию (Е^.мВ) я К^-двияуией силы {¿/¿х* ,мВ) корневых волосков (I я 2 зоны) от концентрации в продолжительности воздействия циклогедсимида в присутствия вянетдна в среде

Кинетив (5 суток)

Характеристика -

0,25 В 1-А ЦГ -3,5-10"5 ЦГ-3,5'10"6 ЦТ - 3,5'ИГ6 ЦТ - 3.5-1СГ6 (в опытной <24 часа в + кянетин + шшетин среде) среде вира- (24 часа в (48 часов в щивания) среде вира- среде выращи-щивания) ваная)

Зона!

V кЕ -180±15(10) -223±Ю£?) -14%И(9) -127^8(6) -15В±17(6)

V'1"* 56±13(7) ¿$±6(5) 5В±5(5) в2±8(7) 70±8(7)

ЕК+,«В -95 -94 -96 -106 -101

й ^ „„«в -85 -29 -ж -21 -5?

3 о в а 2

Ак+, 41 82±13(7) ' 96±4(6) 90±7(8) 86±4(8) 77±7(7)

Ек+, Мб -106 -ПО . -109 -107 -104

-74 -13 * -37 -20 -54

2. Роль кинетика £ регуляции движущих сил

транспорта калия в клетках эпидермиса корня .

Уместно было предположить, что активное выделение Н* из клетки, связанное с генерацией электрогенной компоненты МП, осуществляется локализованной в плазмалемме Н+ АТФазой. Для установления участия данного фермента а этом процессе использовали ДЩ,

Результаты проведенных экспериментов показывают выраженною зависимость изменений МЛ и Ак+ клеток корневого эпидермиса при дейотвии ккнетяна и ДЦКД от кислотности среда (рис.3). Как видно из приведенного рисунка, величины Ак+ растущих корневых волосков (зона I) контрольных растений при варьировании рН питательного раствора от 4,0 до 6,5 статистически не отличались друг от друга. Лишь в щелочной области (рН 8,0) наблюдалось.достоверное снижение Ад+ (рис.3,А). Присутствие кинетина в среде не изменяло Ак+ этой ростовой зоны и данные статистичеоки не отличались от контрольных (рис.З(Б), а янгдбирующее действие ДЩ на Ак+ было наиболее заметным в отличие от предыдущих вариантов в среде о рН 6,5 (рис.3, В). Выдерживание в кинетике не влияло на блокирующий эффект ДЩ, а напротив, усиливало этот процесс (рис.3,Г).

Из анализа полученных данных следует, что в растворах о рН 5,5 и 6,5 в соеде с кинетином и без него (рис.3,А,Б) измеренный МП по абсолютной величине вше К* равновесного потенциала (Ек+), ■ Это указывает на то, что электрохимический градиент К* направлен внутрь клетки и накопление этого катиона происходит за очет его пассивного поступления из среды. При рН 4,0 и 8,0, напротив, Ек+ близок к измеренному потенциалу, что свидетельствует о том, что К+ может находиться в электрохимическом равновесии. Итак, мы видим, что изменение рН как в кислую, так и щелочную сторону снижает электрогенную активность.

Оказалось также, что ДЩ вызывает значительное ингибирова-нив измеренных параметров (рис.3,Б), что является.по-видимому, свидетельством инактивирования Н+-адектрогвнкого насоса, локализованного на плазмалемме.

Полученные нами данные находятся н соответствии с предполо-нениями друтих авторов о существовании электрогенной компоненты МП у высших растений (Зрэпз'«1с5с ,1972; Н1£1пЪо№ат , Аь<1егэов 1974;' Зрвпз»1ск: et а1 ,1982; Опритов, Пятыгак,1Э85) и частичном Еягибированли ЖКД потока К1" внутрь растительной метка (Сйееее-иэп еь а1 ,1980). Кроме того, результаты опытов с ДЩ подтверж-

?ио,3* Влияние кинетипа.ДШД а их сочетания на мембранный

потенциал (I), активность ионов калия (2) и К>- -равновесный потенциал (3) растущих корневых волосков (зона I) пра различных рН среда,

А - контроль 0,25 нормы Х-А (выращивание и опыт) ¡Б - 0,25

нормы Х-А + киаетин 4,Б-10-'?М (выцащаванде и опыт);В - 0,25

нормы Х-А (выращивание) ,Д!КД б'КГ^М (выдерживание ЭО мин до

опыта),0,25 нормы Х-А (опит); Г - 0,25 нормы Х-А + кикетян

4,5-10"% (выращивание) ,ДШД 5* ХСГ^М (выдерживание 30 мд'н до

опыта), 0,25 нормы Х-А + канетин 4,С-10"7Н (опыт).

дают даяние об оптимуме функционирования Н*-АТФазы плазматических мембран растительных клеток около рН 6,0 ( Relier , apanswick , 1978; Ахмедов и др.,1966). Совпадение рН оптимумов транспортных характеристик я АТфазной активности является на наш взгляд, дополнительным косвенным доказательством наличия в плазматической мем- '• бране растительных клеток tf^-cтиму лируeyir о электрогенного насоса и участия его в активном транспорте ионов К4".

Результаты опытов по влиянию кинетина на электрогенез корневых клеток, обработанных ДЩ, показали качественные изменения направления К^-элечтрохишчес ког о градиента в области рН 5,5-6,5, приводящие к потоку ионов калия из клеток (рис.З,Г).

Обращает на себя внимание действие кинетина на изменение различных росгоных зон корня (табл.3).

Таблица 3

Влияние кинетина и ДЩ на внутриклеточную активность (Ak+,nM) и движущую силу ионов налия ( ,мЭ)

растущих (зона I) и закончивших рост (зона 2) корневых волосков

V и

Характеристика

Контроль

Кинетин

ДЩ

ДЩ+кинетия

Ак+, Ш

мВ

92±2,2(14) -57

92±Э,5(8) -59

Зона I

95*2,3(10)

' . -69 ' ■

Зона 2

11С±3,4(7) -75

57±1,8(8) +32

50+1,8(8)' +2В

37*1(8) +26

48*2,6(7) +34

Примечание: X - контроль; 0,25 дорш Х-А (выращивание и опыт; 2 - 0,25 норм Х-А + кинетин 4,6'10"7М (выращивание и опыт); 3 - 0,25 нормы Х-А (чнращивание), ДЩ 5'10_5М (выдермшаше 30 мин до опыта), 0,25 нормы Х-А (опыт); 4 - 0,25 нормы Х-А+ яинетин 4,6* Ю-"^! (выращйЕаляе), ДЩ 5*10"% (выдерживание 30 мин до опыта), 0,25 нормы Х-А + кинетин 4,6'10~г'и (опыт). рН среда 6,5.

При выдерживании растений в среде с канетином Ан+ почти не аэмэкялось в растущих корневых волосках, тогда как в старых, эа-коячлнших рост - достоверно повивалось. Кроме того, при перэходе

от 1-Я ко 2-Й ростовой зоне изменение Ак+ под влиянием кннётина почта не затрагивало состояние движущей силы ионов калия (лД^ + ), На фоне последействия Д1КД кинетин не индуцировал Ъи гиперполяри-зацил корневых клеток, на повышение Ак+ в старых закончивших рост корневых волосках. Полученные данные свидетельствуют, по-видимому о том, что в старых корневых волосках увеличение Ак+ под влиянием кшзетлна связано не столько о притоком калия из среды в'клетку, акогаько с распределением его между зонами.

Стабулирующее действие кинетика и блокирование ДШД движущих сил ионов калия увеличирались с ростом рН, хотя в щелочных условиях наблюдалось обращение этих эффектов, В области рН-оптимума Н+~АТФазы Д1КД блокировал развитие кинетинон движущих сил Н* и К1".

Интересно отметить, что движущая сила ионов калия С >

яая в контроле, так и в варианте с нинетинок резко увеличивается с повышением рН, достигая максимального значения при рН 6,5 (рис, 4,А). Наименьшая величина и обнаруживается при

рН 8,0, во при повышенной кислотности среды изменения электрохи- 1 мнчеслого потенциала ионов К* и Н*, как мы видим, характеризуются различными кривыми (рис.4,А;4,Б). Ниже рН 6,5 величина вновь падает и при рН 4,0 это значение приближается к своему минимуму, В этих же условиях по мере повышения кислотности среды до значения рН 4,0 увеличивается,

С другой стороны, анализ зависимости исследуемых параметров от рН среды подтверждает предположение о том, что индуцированное канетиком повышение А^к* (рис.4,А) связано с работой Н+-АТФаэы, оптимум которой приходятся на рН 6,5. Градиент рН, как известно, является основной движущей силой анионов, поступающих в симзорте с протонами (Воробьев,1980). Возможно, наблюдаемые в наших опытах изменения (рис.4,Е) связаны с резким уменьшением на-яоплевяя анионов в щелочных условиях среды и с усилением их притока в клотки при подкислении.

ряде работ установлено, что активирующее влияние юшетина на транспорт калия осуществляется через К+-стнмуляруемую АТ$аз-ную активность (Люттге, Хигшботам,1984; Максимов, Медведев,1985). Анализ литератур« в этой оОлзстп (Ладаженская, Кораблева,1985;

Кзпшэкег ,1985) допускает возможность как прямого активирования гормонами АТФазных белков мембраны, так и олосредстаенного действия на их транспорт через синтез новых АТФазшх белков.

Можно предположить, что отсутствие эффекта ишетина на элек-трогенез блокированных Д1КД мембран в наших опытах связано с не-

JO)

« 4 4 i

Рис.4. Зависимость ^-движущей силы (л/f«*) (А) я прогон-двикущвй сипы ( jxjiHi ) (Б) растущих корневых волосков (зона I) от действия кннетшш я ДЦСД прираэ-дичйых рН среды. I - контроль: 0,25 нормы I-A (выращивание я опыт); 2 - 0,36 яорш Х-А + хияетин 4,6*10"'М (выращивание и опвт);3 - 0,25 , нормы Х-А (выращивание), Д1КД -S* ДО~т1 (выдерживание 30 мая до опыта), 0,25 нормы Х-А (опыт); 4 - 0.25 яорш I-A + кинв-тш 4,6-Ю"7М (ныращявание), ДОКД 540"^ (видердяваняе 30 мин до огштп),0,25 норда Х-А + *кинетин 4,6>1(Г?М (ошт).

посредственной активацией тлеющихся в мембране АТФазных белков. Не исключено, однако, что короткого времени эксперимента после предобработки /ЦКЛ недостаточно для выявления влияния кинетина на синтез транспортних белков. Вопрос о механизме действия кинети-на требует дальнейиего изучения с учетом длительности электрофизиологического эксперимента,

3. Электрохимические характеристики клеток и леикущие ' сйш транспорта ионов К+ в присутствии хлоридов и кинетина

В последние года вызывают интерес исследования, указывающие на существенную роль фитorормонов в ответных реакциях растений на стрессовые воздействия С Hoth , Hawielore ,1987). Защитное действие цлтокининов при солевом стрессе, в частности объясняется изменением мембранных структур клетки к активности ее ферман- ■ tob (Mirzohi ,1980). Кроме того известно, что повышенное содержание ионов хлора, характерное для засоленных почв, оказывает непосредственное влияние на транспортные механизмы, локализованные да плазмалем*е. К+ градиент выступает фактором запасания энергии метаболизма, отражая одну из характерных регуляторних функций монов (Воробьев и др.,1977), с помощью которой мы понижались в нашей работе выявить закономерности действия кинетина на корневые клетки, выдержанные при избытке хлоридов а среде.

Активность калия при 5-с уточном лидер кивании в с ^сде с KCl и кинетином (табл.4) сохраняет закономерности, обнаруженные ранее для разных ростовых зон корня (Абуталыбов, Ахундова,1982). Однако 0,3i£ WeCL ,как в;;дао из таблицы, в присутствии кинетина в отличие от предыдущих вариантов вызывает увеличение накопления калия в растущих (зона I) и соответственно - снижение его в старых корневых волосках (зона 2). В то же время «äse незначительное добавление хлоридов (KCl, 1,25 &S) приводят к деполяризации клеток. Совместное введение KCl с кинетином не только восстанавливает МП, но и дает небольшую гилерполяризаци» (-10^2 мй). При 5-суточном выдерживании растений в питательной среде с KCl обнаруживается более глубокая деполяризация, снимаемая кинетином лишь после 90 минутного лаг-периода (табл.4). В остром опыте при добавлении 0.31 HeOL имеет место деполяризация клоток до II4+6(7j мВ. Одновременное добавление кинетина'также резко снижает № к лето;; о последующим ча-.угачгшм еооггзкоьл¿го в течение 50 г*инут.

Таблица 4

Зависимость мутршивточной активности ионов КЧАк+,мИ) в раступщх (I зова) я закончившие рост (2 зова) корневых водоеках, мембранного потенциала (В^.мВ), К*-равновесного потенциала (Бк+,мВ) от содержания хаорявоа л кжнетина в среде при 5-еуточном выдерживании растений

Характеристика

0,25 Х-А (контроль)

0.25 Х-А +

4,6.;Ю-7М кинетин

0,25 Х-А с . заменой кло, на КС!

0,25 Х-Л С . 0,25 Х-А заменой кво^ о,з*я«сь

на КС1+4,6.Ю"7« кинетин

0,25 Х-А 0.356 КаСЬ

4,6'Ю~7М кинетин

V

V

V

• 150*15(19) -170*10(10) .112 ■ -96 1085*25(14} 56*13(6)

Зона I

-96|*о(?) -НО 32*7(7)

-156*10(7) -98 ■ 65*5(7)

-200*10(8) -£05*16(8) -112 -106 36*8(7) 79*9(8)

3 о в а 2

»•97

63*10(6)

-107 8^*13(7)

-109 90*6(7)

-97 -96

59*6(9) 56*10(8)

Известный "аномальный" эффект Иа+ до 1,0 «М (Лядин, Ктиторова; Воробьев и др.,1977) ямел место в наших опытах при 5-суточноы ввдер-жявании растений в 0t3í KsCl .

Как видно из вышеприведенной таблицы, s последнем случае наблюдается значительная гндерполярязация клеток до -200^10(8) мВ, то *е обнаруживается в сочетании о яинетияом-205±16(8) мВ. Однако гиперполяразация не сопровождалась изменениями в накоплении калия оря добавлении KaCL в ПР я существенно повлияла на перераспределение этого иона между зонами в присутствия обоих агентов - ыась и яинетииа.

Интересно отметить, что даже при кратковременной действии более высокой концентраций NaCL (0,6$) в среде наступает глубокая деполяризация клеток, не снимаемая кинетином.

Результаты опытов с НаСЬ (0,3$), мокно думать, свидетельствуют о занятной функции плазматической мембраны при действия соли. Известно, чю поддержании ионного гомеостаэа обеспечивается нем- -бранны:/« транспортным« механизмами. Возможно, что поступающий яз среда в цитоплазму выводится из клеток в обмен на Н+ за счет энергии электрохимического градиента, который первично генерируется Н+-АИазой (Балнокян, Строгоков,Х9Ь5), что приводит к увеличению Ш до-2С0 м2.

Из обобщающей Гистограмма (рис.5) видно, что ^-электрохимических градиент Ен-Ед+ достигает максимальных веллчяя —103-109 нЭ при дополнительном введении в питательный раствор 0,1$ НаСЬ я 4,6*10 M кянетяна. При совместном введении ICI я нинвтана градя-евт также достаточно ве;ык, однако в варианте KCl без кинетика обнаруживается значительный спад К* движущей силы и даже обращение* его направления в растущих корневых волосках зоны I. Интересно, что движущая сила лонов К* в присутствии кинетяна уменьшается .в зоне старых корневых волосков (зона 2), хотя накопление калия в нвх. как отмечалось ранее (Абуталыбов,Ахундова,1982), максимально. Примерно такая ш закономерность в распределения яонов калия кежду зонами я направление ^-движущей силы у яорневых волосков атах зон сохраняется а варианте KCl ♦ кяяетая.

. Таким.обрезом, в вышеописанных опытах демонстрируется возможность.регуляция эаектрофкэкологических показателей введением хлоридов..Ионы С Г", вхоляше кзк правило, в состав природных год, могут индуцировать Н+- üfiCooiii звчикэкадэ центральное «эсто в транспорте донов л клетку (Воробьев, 1380,* üpansslcfc

1962,' Юряя я ДР«, I5SD>. K psí.-^íM К* дакудей еяли ( '

■ Ряс, 5. К* дввкущие силы (д мВ) растущих (зона I) и закончивших рост (зона 2) корневых вояоскоа при внес екав кинетана и хлоридов в среду, Т- 0,25 н X—А; 2 - 0,25 н JC-A + кинетян; 3 - 1,25 «М HCl при замене ЯМОз ; 4 - 1,25 ыЫ №1+ кя-нетан; 5 - 0,3StMaCL ; 6 - HaCL t кинетин.

в наших экспериментах с введением хлоридов позволяет также ьылвитъ определенные закономерности в распределении донов калия по ростовым зонам корня. С другой стороны стимуляция ffe+ генерации движущих сил К* и значительный приток*э корневые клетки этих ионов мо-вет быть результатом работыHVНа+ переносчика, осуществляющего . ВУиа* обмен за счет изменяющегося Н* градиента ( Магге ,1579). Дня юддержвняя К4*- электрохимического равновесия s небоаропри-.* ятных условиях при минимизации затрат метаболической энергии счи-: таегся выгодным условие, когда. ЕМ»БЙ+ (Воробьев д др., 1977), На* видно из наших данных, это условие обнаруживается при введения в среду KCl, что может объяснить сохранение процессов Яааояленяя далия, на высоком уровне, особеаяо в рас туних корневых волосках. Более того наглядное свидетельство стимуляция «явнвспособиостя в ' внутрайле-гочиой регуляции биосинтеза я'мвмбраниЬго транспорта -включение экзогенного кинетика при отрссс овых йагруэ ках. факт

уаваачгвР.я потенциала движущих сия до 100 мБ и более для К* изменение»» состноизния хлоридов в питательном растворе и внлечением экзогенного кинотина, несомненно заслуживает внимания с точки зрения регуляции ионами С Г" и Но+ мембранной проницаемости, перераспределения и накопления ионов, роста клеток корневой системы и, в конечном итоге, оптимизации физиологических процессов,

ЕШОДУ

I* Выявлена связь регуляции к и н в -тяном ^-движущей силы в клетках эпидермиса корня с ростом и синте-аом белка.

Введение в среду циклогексимада 3,5* КГ® и.3,5*10"% на фоне кинеткна приводит к снижению А.к+ в растущих (зона I) и к поашеиию - в старых, закончивших рост корневых волосках (зона 2), причем К+-движущая сила икгиОируется независимо от ростовых зон. При совместном введения в среду юшетияа и цкнлогексимида распределение калия по зоне» нарушается: увеличивается Ак+ в растущих и не изменяется в старых корневых волосках,

Из анализа комплекса эдектрофазиологичесних параметров (МП, Ак и к леток рнзодермиса следует, что в формировании ^-движуще! силы в I случав играет большую роль электрогенная компонента, а во П - вклад ее уменьшается и накопление калия может быть связано с увеличением проводимости К*-каналсв.

Сделано предположение, что действие кинетика помимо регуляции электрогенной компоненты направлено на перераспределение калия между ростовыми зонами через изменение соотношения транспортных каналов пдаэмалеммы.

2. Подучены новые данные о роли киа'втвна в регуляции движущих сил транспорта калия.

Стимулирувщев действие кинетика и блокирование ЖКД движущих сии ионов калия увеличиваются с ростом рН, хотя в щелочных условиях кабящщвтея обращение этих эффектов. В области рН оптимума Н^лтеазы (рН 6,5) Д1КЦ блокирует электрогенез и развитие кинети-ном движущих сил Н+ и к*. Заключено, что индуцированное кинетином повышение К+-двиаднвей силы связано с работой Н+-АТФазы, оптимум которой ПРИХОДИТСЯ -V.! ьН 5,5.

3. il o i a i 11 i i o i и i it о ii pif f мин д I * I Г 4 * * « ■ Л * 9 а я с n о рÍ a a a i * я я я я в -

* * я 6 я яра i в « д « н ¡а я кхорядоа в ерв-

* î»

В npacjrtCTiw 0,Э#ЖаОЬ а кяяетала'(4,6-ДО~71.;) обас;^*ана ямМопмя отямуищм »мктрогвяной йктввяоогя (-205*1;: (9) идоста-точяо ttnoRxi тромяь иакопмкая К* (да 79*9(8) а »оне j»**?..-« (вом-Ця 56*10(8) в sott« 9щих яоряввях ВОВМКОВ (Я аоваЬ . Оовимнм KVaaajniBl ваш » ИЮ MB «Biueyetoetaye? о ¿асгмятор-aoÉ реяв а (Mob шв* я работе Н*-й«вовов яорлваых кввток обоях poeto«!« воя»

Вввяняв 1,Яб Ш Ш1 вмвнвав* о#рмм(яя яапрявяввм к*-двавг-чвЯ ваян я рмтуцнж («она I) я вяяитьяоя ояяявкяв в eraptx (вояа 3) нормшх воямнвх. Пр* оомвотвои вМАВная ж ораду яяяв-ТВ1И в ИИ К^-двищущ* о ала аовмвмтоя api ««wir явватрвгяявой кам-попввтм, но происходят парераспрвдвнвм BUM квкхг вотм.

Смдеямвая»* «овмотиов ввмвяяя дяордо я яяяагжяого тявмяв гмяачвввв* поувнюмдвядпях eàà дяд яяям* сляяяо MwitMt «i$o* яяяёмяя вяяявя* Л яояйтрвцяя« вопяого в ос ma я дяятвпяоам вом«К*ввя мерядов^

Спвоок работ» оцгИаиювямих оь »t »рва вам

дяа«вр*яош* ■■',.'. *

1. ili-Mda Т.К., àefemdowi f .B., il Uva F.I. Tb* affect of eyoloh«xi«Ha »M kinatin on potsMtua la root.Abatr. 2nd later, eyapoaiueof ulnar nutrition..Bulgaria, Tana, Í9&5« P«7<

2. Abutalybov tt.a,,Qabi«v Т.Я», Banafova Т.О., Aliara F.K. Tha affekt of eoüiu* ionn on ммЪгапа potential variations in root «alla. Iatar. eyep.of minar, nutrition. Bulgaria, 190Í, p.29-34.

3.Абуадявбов И.Г.Дяа-вад* В .И. »Ахундова Т.е., Лиева Ф.К. рвгудацяя ивмбрвянвго иотеннааяа в клвтвах корнввого ашщврмаоа вра двйогвкв аягвбяторов белкового святее« а квявтжда. Двп»ВИНИТИ 16.06.84 г» Ш бвбб-04, ;

4. Апдвяа 4.К.,Аяи-®аде ВЛ.,Ахуя*ова Т.С.,Свиавва Х.Д. К вопросу о природе вдвктрогенногО насоса а корневых клетках. "Иэвестля AB АМР6.ССР*, овр.бяод,,* 6, 1986, с.24-29. -'/:.■

б. Азаевй Ф.К. Действие «нгибяторов белкового синтеза а кия«-

тина.на мембранный транспорт налил s ялетках корневого эпидермиса. В cd.t "Растительность й ее производительные .силы", Баку, 1986, с.109-110.

6. Ali-ïade ТГ.И,, Achundova Т.В., Alieva F.К. Horaonal regulation of plant cell alcctrogenesie. 2nd Inter. еу»ров!ия "Self-regulation of pleut eetebollm"( HRB, Varna, 1935, pp. 14-20.

7. All-sade T.M., Aohundova T.3., A11eve F.K. On thi nature

Of oytoklnln regulation potassium activity Is root eplderaal celle, Abat г, 4 Inter.eyepoelu*on plant growth regulation, Bulgarie, Peij-«юто, 1986, p.13.

8. Аяк-ваде B.M.,Ахундова Т.О.,Алиева Ф.Я. Гормональная регу- ' ляцяя двящуцих сия транспорта ионов калия я воасэода в клетках впядермиоа коргш. "Известия № Аэерб.ССР", сер.бяол.,* 6, 1986, 0,16-21.

S.lll-zade Т.К., Achundova T.St I Alieve Р.К. Potjaeelua die-' tridutioa in tbe cells of root epideiKia under the influence of physiologically active eubstances. Abstr, 3rd Inter.eymp. SSti^icture and function of roots;', овал filtra, 1967, p.в.

- . 10. А«ь~эала В,M. .Ахундова Т. С., А лиева Ф.К, Роль кинвтняа в регуляция движущих сял транспорта ион г в налил в клетках корня. Чязкологяя растений", J* 4, у.35, вып.4, 198«, 0.643-654.

xpJ^y

У

ФГ/íWX, Подписано к псчати/У За к. J.W. Тир. /й? . Н«ч, лист Твоографм АэИНЕФТЕХНМ» ни. М. Азмйскова. Бьку—ГСП, проопакт Леимм, 3D.

Бе сплатни

ЛЗЭРБА.1ЧЛН ССР ЕЛМЛЭР ДКАДЕМЩАСЫ В. Л. КСКАРОВ адына НЭБАТАТ ИНСТИТУТУ

Эл]азмасы Ьугугунда ЭЛЮЕВА ФИРУЗЭ КАМИЛ гызы

кек ЕПИДЕРМИСИНИН ЬУЧЕ^ЭЛЭРИИДО КАЛИУМ НЭГЛИЛАТЫНЫН ЬЭРЭКЭТЕДИЧИ КУЧУНУН КИНЕТИНЛЭ ТЭНЗИМ ОЛУНМАСЫ

03.00.12 — Битки физнолокн]асы

Биолоки]а елмлэри намкзэдн а.пигилик дэрэчэсн алмаг учун тэгдим едилмиш диссертаси]'анын

АВТОРЕФЕРАТЫ Баш — 1990