Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности и синтеза L-лизин- α-оксидазы из TRICHODERMA SP.

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности и синтеза L-лизин- α-оксидазы из TRICHODERMA SP."

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПАТРИСА ЛУМУМБЫ

На правах рукописи

ПОТАПОВА Ольга Львовна

УДК 579.222 : (577.112.385.4 f +577.158) : 582.238

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ И СИНТЕЗА Ь-ЛИЗИН-а-ОКСИДАЗЫ ИЗ ТМСНОБЕКМА БР.

(03.00.04 — биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена на кафедре биохимии Университе дружбы народов имени Патриса Лумумбы.

Научный руководитель — академик АМН СССР, докт медицинских- наук, профессор Т. Т. Березов.

Научный консультант—кандидат биологических наук, ; цент И. П. Смирнова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, nf фессор А. М. Безбородое; кандидат медицинских наук, ста ший научный сотрудник О. С. Жукова.

Ведущая организация — Московская медицинская ака; мия им. И. И. Сеченова.

Защита диссертации состоится «я ?» '*?"■>'. . .

1992 г. в »"часов на заседании специализированного coi та Д 053.22.02 в Университете дружбы народов имени Па ц са Лумумбы (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиоте Университета дружбы народов имени Патриса Лумум! (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6).

Автореферат разослан « . '¿г*-? . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, профессор

В. Э, Торбек

Общая характеристика •работы

Актуальность теш. Биохимическая те;шология то праву признана одним из наиболее приоритетных направлений научно-технического прогресса. Она подразумевает применение культур меток, метаболизм и бносянтетические возможности которых обеспечивают наработку специфических биоактивных веществ. К подобным веществам относятся и ыериенты, синтезируемые микроорганизмами. Этот класс биологически активных соединений находит все большее применение в медицинской практике з качестве лекарственных препаратов. Особое место занимает применение ферментов микробного происхождения в онкологии. Одним из перспективных противоопухолевых ферментов является' ь-лизин- ..с -окевдаза (К.у. 1.4.3.14), которая впервые была получена Бо&а и сотр. в 1980 г. Этими ке авторагж показана ее йнтнопуходевая активность в отношошш тейхоза мышей. - •

В основе биологического действия Ъ -лизин- -С -оксядазн ле~ кит реакция окислиташгого дезашнирования ь-лизина - незаме-шлой для человека к кивотных ашноюслотн, к недостатку которой опухолевые клетки вследствие особенностей обмена оказывают-;я более чувствительными, чем нормальные прототипы. Исследова-!ияш нашей лаборатории по биологическому действию Ь -лизин--жевдазн из отечественного штамма показано, что фермент наделен датотоксической, антиметастазной и анткинвазивной активностью в )тношён1Я ряда штаммов опухолей днзотных.

Ь-Лизин-Л -о'кекдаза наша, кроме того, применение при ¡оздании биоглембранн в серийно выпускаемом ферментном анализаторе 1ШАГ-11,который уже используется при определении концентрации С-лизина на производстве.

В настоящее время ъ-лизин-х-окевдаза находится на заюто-штельной стадии разработки и внедрения в производство в НПО 'Фермент" в г.Вильнюсе. На данном этапе разработки одной из ак~ ■уалькых проблем является повышение исходной активности фермен-■а методой, не поврездаидш геном продуцента и не изменяющим :труктур1 фермента, его каталитических и йтко-хгс.яческих ¡зойств. ЗЬследовачия в с том направлении проводили в сотруднл-1естве с лабораторией оксцдоредуктаз ШО "Фермент" и лаборато-мей биосинтеза аглпюююлст Трипольского биохимического завода.

¿днная работа является частью научных ::сследоБггшй нашей яфодрн' по вшюлненню програмш "онгшыгопш опухоле!'." я того

I

ее раздела, который касается решения проблемы 0.74.05 - энзи-ыотерапия опухолей.

Изучение вопросов регуляции биосинтеза и активности ока даз. ь. -аминокислот в культуре грибов представляет не только чисто практический, но и большой теоретический интерес, поск< ку полученные результаты будут способствовать выяснению тоню молекулярных механизмов действия ферментов.

Цель та задачи исследования. Основной целью настоящего и< следования было повышение исходной активности Ь -лизин- -о) сидази в культуре Гп с!ю<1епаа ар. физиолого-бшхимичесшм; методами, выделение и очистка фермента усовершенствованным с) собом с целью возможного применения полученных результатов д. улучшения технологии получения этого фермента в прошщешшх масштабах.

Б соответствии с поставленной целью в задачи исследован: входило:

1. Усовершенствование метода определения ферментативной активности 1 -лизин- £ -оксидазы.

2. Подбор индукторов органической природы, способствуют повышению исходной активности Ь -лизин- л -оксидазы в культу Тг1сЬодегша ар.

3. Исследование спектра оксйдазных активностей продуцен в отношении ряда других Ь -аминокислот, выявляющихся под дёй вием индукторов. ...

4. Выделение' и очистка 1шдудированной 1> -лизин- Л -оксц зы усовершенствованным методом. -

5. Изучение некоторых-каталитических и физико-химически параметров индуцированного фермента. ■

Научная новизна работы. Показана целесообразность испол зования ортофеннлендиамша.в качестве хромогена при спектроф тометрическом методе определения ферментативной активности , Ь -лизин- ^ -оксидазы и концентрации Ъ -лизина' по образующей в процессе реакции окислительного дезаминирования переклеи в дорода.

Установлено, что добавление в ферментационную среду' -ГгД сЬойекпа ер. стерильной культуральной. жидкости ВгеухЪас^егАг; ар. ШПИА-Ьб; ВгеуГЬас^е:г1ш1 .£1алаш ' - 32-Д; Вге\-1Ъас<;е г!иш *"1алддц ' АР-Ш - продуцентов лизина,- лейцина,. проли а их сочетаний приводит к увеличению исходной 1 -лизш- .с -о евдазной активности в 2-3 раза, ь -фенилалашш-.х; -окевдазной 2 , ■ '",■'■ ..

ктивности в II раз и ъ -мегиогаи- х -оксадазной активности в О раз, а такие к появлению новых активностей в отношении ряда -аминокислот: тирозина, аргинина, лейцина и гистидина. Вне-ение в питательную, среду, стерильных культуралышх лидкостеп рибного происхождения аналогично приводит к увеличению Ь-ли-ин~ & -оксидазной активности и расширении субстратной спецп-ичности продуцента, однако, з меньшей степени, чем под деГют-ием бактериальных биостлг.-уляторов. ■

Показано, что-для проявления оксвдазных активностей обна-уженного спектра в культуре Trichodema др. под действием костимуляторов требуется два оптимальных" значения рН шпсуба-ионной смеси (5,8 и 8,4) и различные насыщающие концентрации убстрата (от 10 до 200 м'Л). Ферглентн, ответственные за эти ак-нвностп, характеризуются-высокой гермоустойчивостаю и имеют изкле величины Km (0,04«10"у - 3,0»10~$j), свидетельствующие о исокой степени их■сродства к субстрату.

Осуществлен 3-х стадийный метод выделения и очистки L -ли-ин- jj -оксцдазы. Показано, что увеличение исходной активности -лизин- с -оксвдазы в культуре irichoderna sp. под дейст-ием"бактериальных"биостимуляторов не приводит к изменению ос-звных каталитических, физико-Х1шйчесш1х свойств фермента уделънач активность, электрофоретические п.хроматографические войства, молекулярная масса равная 120- кДа субстратная спе-яфичяость, характер рН-и терглозависимости).

В-исходной культуральной йвдкости продуцента открыты две зоформы ь-лиз:ш-л-оксвдазы, различащиеся величиной удель->й активности (3,4 JS/мг и 27,0 Е/мг), молекулярной массы , [00 и 120 kDa ), а такие по сродству к бутялсштохроод С-80 и Ь-Сейадексу.. Менее активная форма присутствует в кезначитель-ix количествах.

/Практическая ценность работы. Предложена экономичная био-мяческая технология получения противоопухолевого фермента -лизин- <£ -оксвдазы с помощью дешевых и легко доступных ин-,'кторов - продуктов микробиологического' производства бактерийной и грибной природы, ке повревдакщая геном продуцента и з изменяющая структуры. ферментаего основных йизико-хишпес-IX и каталитических свойств.'

Предложенный лабораторный регламент выделения и очистки' -лизин- -оксздазы, вклачаюцай 3 стадии очистки с конечным 1ХОДОП фермента 57/1, молот служить основой для' разработки ме-

тодов получения фермента в полупромышленных масштабах.

Газработаншй чувствительный и безопасный ортофенклендо-ашновый метод определения активности Ь -лпзш- -онсидазы и концентрации -1 -лизина может бить использован в лабораторнь и заводских условиях.

Положение, выносимое на защиту. В процессе осуществлен!« предлагаемой биохимической технологии получения Ъ-лизин- --окевдазы с использованием биостимулятора имеет место индукция биосинтеза известного антиопухолевого фермента.

Апробация работы. Результаты исследований в виде отчетов обсуздались ежегодно на научных конфзренциях кафедры биохимии УДН им.П.Лумуыбы (1988-1991). Материалы диссертации доклады-■ вались на научной конференции молодых ученых Университета (Москва, 1990), Ш-ей коншех^енции научно-учебного центра "Применение физико-химкческюс методов исследования в науке и технике" (Москва, 1990) и представлены для доклада на П-м Мевду-народном конгрессе "Аминокислоты и аналоги" (Вена, 1991).

Дубликацм. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов к методов исследования, излоке-•юш полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( /р/ ссылок).

.Работа изложена на /*<гг> страницах машинописного, текста, иллюстрирована 17 таблицами и 24 рисунками.- .

экстнмштмтя часть-

I. Материалы и методы исследований. В работе использовали шт^мм-продуцент L,-лизин-'л -окевдазы, полученный из культур. • грибов рода Триходерыа (A.C.J? 1044043, 1983). Посевным магериа лоы служил вегетативный мицелий гриба, выращенный на сусло-агаре в течение 8-10 суток при ± =28°С. В состав ферментационной среды входило: 5г пшеничный отрубей; 1,3г сульфата аммония 100 мл водопроводной воды. Ферментацию проводили глубинным методом в течение'5-6 суток. В качестве предполагает}: иицукторо L -лизин- ¡С -фкеидазной активности использовали такие физико-'химические факторы культивирования как освещенность (20 К. люкс/см^) и электростатическое Поле напряженностью lOGOD/ci-/". Биологически активными добавками к ферментационной оре-4 *

э служили фитогормоны Cyö--ивдолилуксусная кислота, 6-бензил-ишюпурин, гибберелловая кнслота-6), витамины В-j.Bg, инозит и аотш!, аминокислоты и их- сочетания ( ь-лизин, х-йенилалэдшн, ■ -метионш); а такие стерильные культуральине жидкости продуктов лизина - Brevltacteriuia sp. ШТЙА-86 (BIO), лейцина-revTbacterium flavum 32-Д, пролина- Brevibacterlum fla-ia AP-III и юс сочетания. В качестве биостимуляторов гркб-зго происхождения использовали стерильную-культуральную жвд-эсть uiocladim sp, u Trlchoderma sp . Биостимуляторы(сокра-знно обозначенные БЙО)вносили в количестве 1% к объецу фермек-зцпошюй среда непосредственно перед ее стерилизацией.

Оксидазную активность в -отношении х-аминоклслот расчиты-зли по приросту HgOg, количество которой определяли спектро-зтометрцчески ортофенилекдиашновкм и ортодианизвдиновымШ.П. шрнова и соазт. ,1984) шкрометодаш* Инкубационная смесь со-гриала 20 мкг■пероксидазы (" Веада1 Венгрия), I от орто-шилендиамина или 250 мкг ортодканизина (" Serva " »Германия). гбстрат и буфер.добавляли в определенных концентрациях в за-юимости от целей эксперимента. Реакцию инициировали введени-1 0,1 мл раствора .'х-лизкн- <£, -оксвдазы. Оптическую плотность ¡меряли при 495 вм (ОФД-метод) или при 540. ны (ОД-метод) на гектрофотометре vstj 2Р(Герлания). Sa едшпщу активности шикали количество фермента, катализирущее образование I моля Н202 за I мин.-при 37°С. Удельную активность выражали [слом единиц активности на I мг белка. Содержание бежа опре-ляли по методу Лоури и соавт.(1952).

Константы Михаэлиса вычисляли по методу двойных обратных ашчин" Лайнуивера-Бэрка (Кочетов, 1980). При определении ус-1Йчивости оксидаз к термоинактивацил пробы культуральной жадюга прогревали при 80°С в' ультрагермостате нш -4 ( Ногу-int , Польша)..Состав свободных аминокислот бактериального ¿»стимулятора изучали на аминокислотном анализаторе (АМ-Т339, гуо Чехословакия)..-

Лабораторный регламент выделения и очистки включал осанде-;е балластных белков 25? сульфатом аммония, хроматографию над-адочной жидкости на гидрофобном сорбенте бутилсилохрома C-8Ö одеряание бутиловых радиналов-80 шшоль/г, размер частиц-0,1 :) . Сорбент синтезировали из силохрош эпоксидного 5С0/80 и тилглицндяого эфира. Десорбций осуцествляли повкшшем ионной лы алюэкта. Повторную хроматографию проводили на АН-Сешарозе 43

~ 5

(" Eharmecla ïlae Chemicals Швеция). Десорбцию осущест-

вляли исходным буферным раствором с линейным градиентом NeCl от 0 до I И.

Электрофоре'тические свойства1 белков исследовали ДЦС-пол акриламидгельздектрофорезом. $дссоциацив ферментов на субъед! ницы проводили обработкой исходных растворов 1% ДЦС-натрия, t держащим 1% 2-меркаптоэтанола при Ю0°С в течение 5 мин. Беж Mil маркерами слукил набор стандартов (" Pharmacia ïiae Obemit Швеция).

Разделение изоформ Х-лизин- -оксидазы проводили на CI Сефадексе {" Pharmacia Fine Chemicala ", Швеция). Фермен? элшровали ступенчатым градиентом концентрации ацетата натрш

При изучении рН- и термозависимости, a такне субстратно] специфичности очищенного фермента ■использовали тот же состав кубационной смеси, что и при определении ферментативной актш ности.

РЕЗУЛЬТАТ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка метода определения -ферментативной активности

Ранее описанный-ортодианизидиновый (ОД) микрометод '(ЙЛ1. Смирнова и соавт., 1984) определения активности L-лизин-<£ --оксвдазы оказался неприемлимым не только из-за плохой раствс римости оргодианмзидана .-в буферных смесях 'и в воде, но в' осос ности в силу его, канцерогенного и мутагенного эффектов. • Зада^ модификации спектрофотометрического .метода была решена в резд тате выбора в качестве хромогена лероксидазной реакции,значительно более безопасного реактива - ортофеннлендаэшна (ОФД) /рю. I/. Первоначально был изучен спектр оптического поглоще ния образу кщюсся в результате реакции-продуктов окисления этс соединения /рис.2/. Как видно на рис.2 существует единственна максимум поглощения при 495 нм. Построение калибровочной кро для определения 1^2, образующейся в результате окислительког дезамшшрованиях -лизина, показало, что чувствительность пре латаемого метода вше, чем при применении ОД-метода /рис.3/.

Далее были изучены: кинетика реакции с. использованием 0Jti и ОФД- хромогенов и ь-лизин- <с -оксвдазы различных концентра ций, рН- зависимость реакции, количественное соотношение ингр диентов реакционной среды - пероксидазц,, 0.ФД и L -лизина. В р зультате были установлены оптимальные условш для инкубации р

6 I - , '

чн,

:Н2)4+02+Н20 ^-лизин-а-оксидаза^ (СН2)4^Н3+Н20:

с=о-

12и2

Д~пиперидин-2-] карбонсияат

1Ю0Н

-Шин

соон

соон

'<х~кето~£-амшюнапронован • Я-/ЯО.

о

2Н20;"6Р°~ » 2Н 0+0 -___-'—"озовое Окрашивание

ксидаэа

+ОФЛ

- Мелтое окрашивание

яс. I. Схема определении ферментативной активности ь -лизин-оксидазы спе?сгро$отометрическш методом с использованием ОД- и-(Щ-хромогенов. ... '(.'^Г

•х» )г

I

-1.

_1

0 : 300

К.2. ■

400

75 100 125 150 1?5

Н2°2

500 600 0 25 50

Л(нм) ■ Ряс. 3. гектр оптического погло- Изучение зависимости оптического !ния конечных продуктов поглощения растворов с 0Д(1) и «юления ОФД. 0ФД(2) от концентрации перекиси

водорода в реакционной смеси.

акционной смеси; показано'также, что разработанный метод от. чается от ранее известного не. только высокой чувствительное' доступностью и безопасностью для исследователя, но и быстро' проведения, анализа и хорошей воспроизводимостью результатов, макет" быть использован как для определения активности ъ -ли: - Л -оксидазы так и для определения активности оксвдаз друз X, -аминокислот.

При исследовании зависимости активности ь-лизин—£-01 дазы от концентрации ь-лизина в реакционной смеси была уст; новлена линейная зависимость в пределах концентрация субстрг от 0,5 «Ю-^ до 3,5- 10""%.'кривая в данном интервале может с использована, для определения начальных концентраций X -лизю биологических жидкостях в ему высокой субстратной и стереос цкфичностн ъ -лизин- & -оксидазы.

Подбор индуктора биосинтеза ь-лизин-<с-оксидазы в культуре Тг!сЪойегиа ер»

С этой целью изучали физиолого-биохимические эффекторы синтеза ферментов, ■ физико-химические факторы культивирована (освещенность и электростатическое поле), а также биологичес активные добавки к ферментационной среде:' фитогормоны, витш •ни, аминокислоты, стерильные культуральные жидкости бактериг ного и грибного-происхождения (см."Материалы и-методы"). Бш показано, что все исследуемые факторы в той или иной степей оказывали влияние на величину к динамику накопления ферменте культуре ШгАсЬо^егта ер, ■ однако," наибольшая активность о мента (в 2-3 раза превшиащая величины в контроле) выявлялйс при добавлении в ферментационную среду продуцента стерильной культуральной жидкости ВгеуАЪасЪехАш ар, • ШТИА-86 - про; цента ь-лизина (ЕИО) /табл.1/. БИО бактериального происходи ния вызывал не только повышение ь -лизин- токсидазной' аки ности в среднем в 2,7 раза, но и ь-фенияаланин- <с -оксидази активности в II раз,ь-метионин- ^ -оксидазной активности в раз. Под действием БИО были обнаружены новые, ранее- неизвест оксидазные. активности в отношении ьгазомеров тирозина, арги на, лейцина и гисгадина /табл.1/.

Показано, что для проявления изучаемых активностей в ку туре продуцента требуется два.оптимальных значения рН-инкуба онной смеси (5,8 и 6,4) и различные.насыщающие концентрации с^Зстрата (от 10 до 200 мМ). Установлено, что ферменты, отве

Таблица I.

Величины, оксвдазных активностей в отношении ь -аминокислот,

появляющихся, в культуре Тг1сЬо1вгта ар. под действием - •. . - биостимуляторов._|_

¡Без биостимулятора;С биостишдятором ¡Удельная)Удельная удельная ¡удельная Субстрат }актив- (активность; актив- ¡активность ■ - ¡ность ¡по отношерюсть ¡по отношению

} Е/мг ¡цшу^ бел-¡к лизину.

Í, -лизин' 3,0 100,0 8;з 100,0

¿.-фенилаланин 0,3 10,0 3,4 41,0

L -тирозин о '0 3,3 39,7

L -аргинин 0 . 0 3,2 38,5

D,X -лейцин 0 0 3,1 37,3

L -гистидон 0 ' 0 2,6 31,3

Ь -метионин 0,03. 1,0 ' 2,4 28,9

Примечание: В отношении других. Ь -аминокислот активность окси-даз не выявлена.

венные за эти активности, характеризуются высокой термостабильностью и имеют низкие величины Ка (0,04-10~4!Л - 3,0-10"%) .свидетельствующие о высокой степени их сродства к субстрату.

■Отметим также; что добавление других'биостимуляторов бактериального и грибного происхождения приводила к аналогичному эффекту, Ti е. к синтезу ферментов de aovo.

Относительно механизма действия БИО на биосинтез оксидаз . ь -аминокислот высказано предположение, что последний, вероятнее всего, имеет' комплексный характер и включает ряд биохимических и физиологических аспектов. Важное значение, ло-видимоцу, имеет~ индукция биосинтеза .ферментов ь-аминокислотами, пептидоглика-нами-и другими продуктами жизнедеятельности бактерий к грибов, . входящим^ в состав БИО. Синтезст иадулирувдий эффект при этом ' связан с удовлетворением потребностей продуцента в энергии,и .низкомолекулярных азотсодержащих соединениях, а такде с проявлением его антагонистических свойств в ответ на присутствие в питательной среде чужеродных продуктов обмена. Вызываемое биостимуляторами ускорение процессов.роста, развития и вступления гриба в фазу конидиеобразования (связанную с автолизом мицелия .й с увеличением Ъ -лизин- <& -оксидазной активности) позволяет получить фермент X -лизин- jz -оксидазу в значительных количествах .в более ранние сроки культивирования.

Наиболее важным результатом проведенных экспериментов на ... * ■ 9

данном этапе было увеличение исходной Ь-лизин-сС -оксидазной активности в 2,7 р., вызванное добавлением.недорогого и легко доступного ингредиента ферментационной среды - стерильной куль-туральной глдкости - ВхетйЬасЪегАгда ар. • НИТИА-86.

Вцделение и очистка индуцированной ь -лизин- Гс -оксвдазы из ТгЮЬоаегша ар. и изучение некоторых каталитических и тизико-хишческнх свойств гоермента

На следующем этапе работы необходимо было решить вопрос о связи мезду увеличением Ъ -ллзин-<С-оксидазной активности в культуральной жидкости продуцента под действием БИО и свойствами X -ллзш- £> -оксидазы. Для решения- этой проблемы нужно было выделить 1-ллзин-.л -оксвдазу, синтезируемую при помощи БИО, в гомогенном состоянии и изучить ее свойства. В процессе работы был применен оригинальный метод выделения и очистки фермента, включающий всего 3 стадии /табл.2/. Оказалось, что удельная активность очищенного фермента превысила исходную в 32 раза,выход фермента составил'Ы%, что в 2,5 раза превышает выход X -лизш-. - Л -оксвдазы, полученный ранее в напей лаборатории. Согласно данным гельэлектрофореза был получен высокоочищенный фермент /рис.4/. Электрофоретическке свойства не отличали полученную под действие^ БИО х -лизин-л-оксвдазу от свойств фермента с низкой исходной активностью (без добавления БИО).

Таблица 2.

Выделение и очистка индуцированной биостимулятором х -лизин-£ -оксидазы

'Абсолют-¡Удельная! ] !Степень

Белок, !ная ак- ¡актив- ! Выход¡очистки № !тивность!ность ! % !

• ! ._! Е/мг ! !

Стадия очистки

Культуральная нидкость 13683

Осаддение сульфатом аммония 5873

Хроматограйжя на бутшсилохромо- 399 вом сорбенте

Хроматография на АН-сефарозё 4-В 243

21483 . 1,57 . 100 '.. О 19850 3,38 /92,4 -2,2 15854 39,70 73,8 25,3

12224 50,40

56,9 32,1

При электрофсретическом исследовании активных фракции после второй стадии очистки было обнаружено, что если в нсход-

Рис.4. Электройюрез Ь-лизин- -оксидазы в полиакриламидном геле в присутствии ЛДС-натрия после хроматографии на бутилсклохроме С-ВО и АН-сефарозе 4В (5,6,7-номера фракций после второй- стадии очистки, 19,20-номера фршщйи после третьей стадии очистки); а,б-стандартные белки с молекулярной массой 66 и 43 кда соответственно.

ной фракции присутствуют две полосы белка с молекулярным весом 50. кДа и 60 кДа, то во фракции )6 3 при десорбции с бутилсилох-рома наблвдается макетам выхода менее активного в отношении Ь-лизина фермента с молекулярным весом' 50 кДа казкдая субъединица'. Таким образом, можно было предположить, что в исходной кульгуральной жидкости имеется две изоформы ь-лизин- л -оксидазы. Это предположение подтвердилось в результате их разделения на СП-Сефадексе./рис.5,б/. Видно /рис.5/, что изоформы X, -лизин- ¿о -оксидазы различаются величиной удельной активности - 3,4 Е/мг белка и 27 Е/мг белка. Их отличительныш характеристиками являвтея также значения молекулярного веса - 50 и 60 кДа'каядая субъединица /рис.6/-, степень сродства к бутил-склохрому С-80' и СП-Сефадексу. Однако, да субстратной специфичности они мало различаются между собой; обе изофорщ окисляют преимущественно ъ -лизин и ь -фенилаланзш. "

Таким образом, на данном этапе исследований был осуществлен новнй. препаративный метод выделения и очистки ъ -лизин- й -оксидазы из тгХсЬоЗегта вр, . Показано также, что повышение удельной активности фермента под действием БИО в 2.-3

Помер фракции

Рис. 5. Разделение изойэрм Ь -лиэик-л'-оксадазы на

СП-сефаденсе (I - белок в мг/ш; 2 - активности ь-лизин- Л-оксвдазы в Е/г.га; а - изоформа I; о - изофорыа 2).

Рис. 6. Электрофорез изоформ ь-лизин- & -оксвдазы в полиакриламвдном геле в присутствии ДЦС-натрия после хроматографии на СП-се&адексе (9, 27 - номера фракций; Л и В - стандартные белки с молекулярной массой 67 и 60 кДа соответственно ).

раза связано с индукцией его биосинтеза. Однако, необходимо бшю провести дополнительные исследования некоторых катгиитн-ческих и физико-химических свойств шщуцироганной ь -дизкн-- -оксидазы.

Изучение некоторых каталитических и йизико-химических свойств индуцированной ь -лизин- <£ -оксидазы

Сравнительное изучение субстратной специфичности полученного под действием биостимулятора фермента ь -лизин- х -оксп-дазы с ферментом, ввделешшм и очищенным зтшл ко методом, но полученным без добавления ШО, показало /табл. 3/, что оба фермента высокоспецифичны в отношении ь-лизина. В значительной. степени окислительному дезаминировашго подвергается лишь г. -фенилаланин и в меньшей степени ь-лейцин, а также семь других I -аминокислот в следовых количествах. Как следует из табл. I и табл. 3, соотношения мезду отдельными оксвдазныш активностями в культуральной жидкости (с ШО) и в очищенном ферментном препарате-различаются. Зто мокет быть объяснено тем, что неспецифический индуктор оксидазной активности - биостимулятор вызывает повышение биосинтеза других оксидаз ь -аминокислот, дезаминируицих преимущественно ь -аргинин, Ь -метионин, 1 -гиствдин, ъ -^лейцин и I -тирозин и теряющихся в процессе очистки^ ь -лизин- -оксидазы.

Наиболее важным является то, что субстратная специфичность самого фермента /табл. 3/ при' использовании БИО в качестве индуктора увеличения биосинтеза ъ -лизин-<с -оксидазы не изменяется.

Изучение рН- и гершзависимости /рис. 7, 8/ удельной активности электрофоретически чистого фермента показало, что исследованные свойства также не отличают выделенную наш ь -лизин- <£ -оксвдазу от ранее известной. Следовательно, разработанная биохимическая технология получения противоопухолевого фермента I -лизин-х -оксидазы с помощью биостимуляторов шлет быть рекомендована для применения на производстве.

ьг

л

Ен О О

£

ш £

юо

90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

' 6

ра

8

Рис. 7. рН- зависимость ферментативной.активности очищенной индуцированной ь -лизин- <г, -оксидазы (конц. фермента 0,045 Е/мгс).

* 75 170

65

60 55 50 45 40 35

О и I .. .I_I_I_I I

J_I_I_1_Л

23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45'

Температура °с Рис. 8. Зависимость ферментативной активности очищенной индуцированной Ь -лизин- <£, -оксвдазн от температуры (конц. фермента 0,045 Е/ш).

Таблица 3.

Сравнительное изучение субстратной специфичности очищенных препаратов индуцировашой и неиндуцированной Г, -лизин- Л -оксидазы из Триходермы

Относительная активность,

Субстрат

Без добавления БИО

При добавлешш БИО

X, -Лизин Ъ -Фенилаланин 1 - Орнитин Ь -Тирозин I. -Лейцин Ь -Гистидин Ъ -Метионин Ь -Аргинин , Ь -Иистеин Ь -Триптофан Ь -Аспарагин

100 6,5 1,9

1.4

2.5 0,2 0,6 0,7 О

О О

100 8,6 2,2 1,9 2,5 0,2 0,6 0,8 следы следи следи

. ВЫВОДЫ

1. Разработана модификация спектрофотометрического метода определения ферментативной активности ь-лизин- с£ -оксидазы с помощью о рт офенилендиашша, Показана возможность использования предложенного усовершенствованного ферментного метода для определения концентрации . ь-лизина в биологических жидкостях.

2. Показано индуцирующее действие биостимуляторов бактериального и грибного происхождения на синтез ряда оксидаз

1 -аминокислот в культуре йг1аНо<1епг1а ер. О 3. Приводятся доказательства ивдуцируацего синтеза фермента Ь-лизин-Л -оксидазы; добавление бактериальных биостимуляторов к культуре гриба ТгЮЬойепна зр. приводит к увеличению удельной активности в 2-3 раза.

4. Впервые показано, что под действием .биостимуляторов в культуральной жидкости продуцента открываются новые оксидазные активности по-отношению к ряду ъ-аминокислот - тирозину, лейцину, гистидйну и аргинину.

5. Изучены условия для выявления оксидазных активностей в отношении ряда аминокислот в культуре Тг:1сЬос1егта ер,

Показало существование двух оптимальных значений рН для их проявлсшш (5,8 и 8,4), вычислены насыщающие концентрации (10200 мЫ) и величшы Кт (0,04-Ю-4 - 3,0-10""%), свидетельству-щие о шсокой степени сродства к субстрату; доказана их высокая тершстабпльность.

С. Осуцествлен 3-х стадийный метод очистки L -лизин-<с --оксид;;(степень очистки - 32, выход - 57%). Показано, что увеличение исходной удельной.активности индуцированной L -лизин- л -океццазп не приводит к изменению основных каталитических и сшганко-хи.'.шческйх свойств фермента.

7. Обнаружены и выделены две формы X -лизин- л -оксвдазы, характер-!зукциесл различными хроматогоафичесними и электрофоре-тичзскимп свойствами (ЫЛ.1. 120 ада ив1Ш кДа), а такхе величиной удельном активности (2?,С Е/мг и 3,4 3/ыг).

6. Предложена окономичная.физиологически естественная биохимическая технология получения противоопухолевого фермента L -лкзпи- л -оксвдазы с помощью недорогих и легко -доступных, продуктов микробиологического производства бактериальной и грибной природы.

СПШОК РАБОТ, ОПУЪЛЖОЕАННЫЛ 110 ТЕШЗ ДИССЕРТАЦИИ

1. Потапова 0.JI. Регуляция оксидазной активности с.помощы биостимуляторов // Применение физико-химических методов исследования в науке и технике: Тез.докл. !Н конф.научно-учебного центра. - 1.1. - 1990. - С. 94.

2. Потапова О.Л., Смирнова'И.П., Краева Н.К., Березов Т.Т. Некоторые фазикс-хш-.ическта свойства оксидаз ь -амикокислот // Ьксперим.онкология. - 1991. - T.I3. - Г> I. - С. 65-68.

3. Смирнова И.П., Потапова О.Л. Индукция синтеза оксидаз L -аминокислот биостимуляторами бактериального и грибного происхождения // Биотехнология. - 1991. - ].' 2. - С,- 25-26.

4. Потапова О.Л., Смирнова И.II., Веса B.C., Быкова О.М., Лаугалене И.Ф. Изучение некоторых каталитических свойств индуцированной ь -лизин- <ь -оксидазы // Вопр. мед.химии. - 1992. -- Г 1. - С. 9-13.

5. Потапова О.Л., Смирнова И.П., Турчднский В.В., Березов Т.Т. Применение ортофекилендиашиа в определении активности L -лиз;т- & -оксидазы и концентрации L -лизина // Вопр. мед. хклгл. - 1952. - & - C.T&-S.C