Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии получения из зернового сырья азотсодержащих компонентов для процессов ферментации

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения из зернового сырья азотсодержащих компонентов для процессов ферментации"

На правах рукописи

ФЕДОТОВА Надежда Владимировна

Разработка технологии получения из зернового сырья азотсодержащих компонентов для процессов ферментации

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2009

003492705

Диссертационная работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология».

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор Бирюков Валентин Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Корнеева Ольга Сергеевна

доктор технических наук Румянцева Галина Николаевна

Ведущая организация: Московский государственный

университет пищевых производств

Защита диссертации состоится «24» декабря 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.145.03 при Московском государственном университете инженерной экологии по адресу: 105066, г. Москва, ул. Старая Басманная, 24/1, в ауд. им. Л.А. Костандова (Л-207).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета инженерной экологии.

Автореферат разослан «21» ноября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.145.03, кандидат биологических наук

Е.С. Горшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для проведения процессов биосинтеза различных продуктов необходимы 2 основных компонента сред: источник углерода (углеводы) в качестве энергетического субстрата и источник органического азота в качестве фактора роста. В качестве источника углерода в ферментационных средах довольно часто используют ферментолизаты крахмала, получаемые непосредственно на стадии производства биопродуктов из зерна пшеницы мягких сортов.

В качестве источника органического азота при этом обычно используют специально приобретаемые источники сырья, такие как кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, гидролизаты казеина, соевую муку и др.

В то же время содержащийся в зерне пшеницы белок (глютен) в лучшем случае выделяется и реализуется как кормовой продукт, а чаще является малоценным отходом.

Учитывая, что в таких случаях система переработки зерна существует непосредственно на биотехнологическом производстве, целесообразно включить в технологию переработки зерна дополнительные стадии выделения и ферментолиза глютена, а получаемые ферментолизаты использовать в качестве ростового субстрата.

Это позволит использовать зерно как основной сырьевой ресурс биотехнологических производств. Учитывая доступность и относительно низкую стоимость зерна пшеницы, разработка технологии его дополнительной переработки является актуальной задачей для совершенствования биотехнологических производств.

Цель и чадачи исследования. Целью диссертационной работы являлась разработка технологии ферментативного гидролиза глютена для использования в качестве ростового фактора в процессах ферментации.

Основные задачи:

- модификация технологии переработки фуражного зерна пшеницы с целью получения фракции с повышенным содержанием глютена;

- выбор протеазы для ферментолиза глютена;

- изучение влияния технологических параметров (концентрации глютена, рН, концентрации фермента) на эффективность ферментолиза и выбор рациональных условий реализации периодического процесса ферментолиза;

- изучение влияния концентрации глютена и продуктов ферментолиза на кинетику процесса ферментолиза и степень утилизации белка;

- разработка математического описания кинетики процесса ферментолиза глютена;

- анализ вариантов реализации технологии ферментолиза глютена и выбор рациональной технологии;

-оценка возможности использования ферментолизатов глютена в качестве источника ростовых факторов в процессах биосинтеза для различных продуцентов.

Научная новизна:

- показано, что повторная обработка на РПА и дополнительная выдержка суспензии измельченного зерна при рН 4-5 позволяет повысить концентрацию белка в глютеновой фракции на 19-25%;

- с использованием планирования эксперимента по схеме ортогональных латинских прямоугольников найдено оптимальное соотношение режимных параметров одноступенчатого периодического процесса ферментолиза;

- найдены зависимости скорости ферментолиза глютеновой фракции от концентрации глютена и свободных аминокислот, образующихся в процессе ферментолиза;

- обнаружено ингибирование процесса продуктами ферментолиза;

на основании анализа экспериментальных данных предложена и идентифицирована кинетическая модель процесса ферментолиза, учитывающая влияние концентрации белка по уравнению Миаэлиса-Ментен и концентрации продуктов реакции по уравнению Бергтера;

- показано, что для увеличения глубины ферментолиза целесообразно либо использовать разбавленную до 40 г/л белка фракцию глютена, либо проводить дополнительные ступени ферментолиза после отделения осадка от растворимых продуктов ферментолиза;

- подтверждена возможность использования ферментолизата глютена в качестве азотсодержащих компонентов ферментационных сред для процессов биосинтеза лизина, лейцина, валина, астаксантина, нового гликопептидного антибиотика и пробиотика.

Практическая ценность работы:

- использование ферментолизата глютена, полученного по предложенной технологии, позволяет использовать зерно в качестве основного сырьевого ресурса в процессах биосинтеза на продуцентах, не имеющих протеолитической активности;

- использование технологии по месту производства биотехнологического продукта не требует сушки ферментолизата или других способов его консервирования, что позволяет снизить затраты на азотсодержащий источник питания;

- разработан лабораторный технологический регламент для предложенной технологии;

- результаты технологии использованы ООО ПКФ «Бигор» при проектировании опытно-промышленной установки для производства лизина в Чувашии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на: VII и VIII Всероссийских выставках научно-технического творчества молодежи НТТМ-2007 и 2008 (работа отмечена золотой медалью); Научных конференциях студентов и молодых ученых МГУИЭ в 2007 и 2008 годах; Международной научной конференции, посвященной 70-летию факультета прикладной химии и экологии РХТУ- 2008 «Современные тенденции развития химии и технологии полимерных материалов»; XXI Международной конференции «Математические методы в технике и технологиях ММТТ- 21»; Международной химической ассамблее «ICA-2008»; 2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008» (работа отмечена медалью).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список литературы и приложения.

Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 40 рисунков, список литературы включает 177 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Введение.

Во введении определена актуальность выбранной темы, сформулированы положения, выносимые на защиту, научная новизна, сведения о личном вкладе соискателя.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы рассмотрены основные характеристики, преимущества и недостатки различных способов использования растительного белка. Проанализированы характерные проблемы и возможные способы их решения. Определены и обоснованы направления исследований настоящей работы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования - плотен пшеницы мягких сортов.

Ферментные препараты. Использованы комплексные препараты Alcalase 2,4FG, Neutrase 0,5L, Novozyme производства фирмы Novozymes (Дания) и Протосубтилин ПОх (Сиббиофарм, Россия).

Микроорганизмы - продуценты для проверки ростового фактора при биосинтезе различных биотехнологических продуктов представлены в табл. 1.

Оборудование. Для дробления зерна использовали роторно-пульсационный аппарат (РПА-1,5) производства «ЭНА» (Россия). Отделение зерновых оболочек осуществляли на ситах с размером ячеек 0,5мм и 0,1мм производства «Евролаб» (Санкт-Петербург). Разделение фракций крахмала и глютена осуществляли на центрифуге типа «Thermo Jouan C4i» (Франция). Процесс ферментолиза глютена проводили в биореакторе АК-10, снабженном системой механического перемешивания и регулирования температуры, а также в колбах объемом 250 мл на термостатированной качалке фирмы New Brunswick Scientific (США). Процессы биосинтеза различных биотехнологических продуктов проводили в колбах, встряхиваемых на качалках фирмы New Brunswick Scientific (США) и на ферментерах Bioflo 110 вместимостью 1 л той же фирмы.

Продуценты и продукты

Микроорганизм-продуцент Синтезируемый биопродукт Температура, °С Время культивирования, час

СогупсЬас1епит £1и1аписит В1£ог 55 лизин 30 72

СогупеЬайепиш §11Дагшсшп В 1262-124-17 лейцин 30 72

СогупеЬасЮпит glutamicum В 2312-130с Авр 55 валин 30 72

РЬаГйа гЬос^ута У-2218 астаксантин 21 72

Зй^ерЮтусев ер. гликопептидный антибиотик 28 168

ВасШиБ виМИв В83-149 пробиотик 37 216

Выделение фракции глютена. После измельчения водно-зерновой смеси (гидромодуль 1:4) на РПА, суспензию пропускали через сито с размером ячеек 0,5мм. Образовавшийся фильтрат I разделяли на сепараторе с фактором разделения 750, получая при этом крахмальную фракцию. Получаемый фугат дополнительно центрифугировали с фактором разделения 3500, получая глютеновую фракцию I. Зерновые оболочки смешивали с водой в соотношении 1:1, дополнительно пропускали через РПА и образовавшуюся суспензию отстаивали при температуре 20-25°С в течение 4-6 часов. Глютеновую фракцию II, локализованную в верхнем слое, отделяли декантированием, а оставшуюся суспензию II крахмала и зерновых оболочек пропускали через сита с размером ячеек 0,1мм для отделения зерновых оболочек. Получаемый фильтрат смешивали с фильтратом I и направляли на сепарирование.

Ферментолиз глютена. Глютеновую фракцию I и II с заданными концентрациями глютена, фермента и величиной рН передавали в биореактор, в котором проводили процесс ферментолиза при интенсивном перемешивании и заданной температуре в течение заданного времени экспозиции. Значения режимных параметров задавали с использованием математических методов планирования эксперимента (схема ортогональных латинских прямоугольников с варьированием каждого фактора на 4 уровнях).

Биосинтез продуктов на средах с ферментолизатами глютена. Оценку влияния качества ферментолиза на эффективность биосинтеза проводили в колбах объемом 250 мл для продуцентов лизина, лейцина, валина и астаксантина и объемом 750 мл для продуцентов гликопептидного антибиотика и пробиотика. В качестве контроля использовали среды и режимные параметры, принятые для культивирования соответствующих продуцентов с традиционными компонентами ростовых субстратов (кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, пептон). Среды на основе ферментолизатов глютена варьировали с использованием схемы ортогональных латинских прямоугольников. Для процесса биосинтеза лизина были дополнительно проведены эксперименты в ферментёрах Bioflo 110.

Контрольно - аналитические методы. Величину рН определяли с помощью рН-метра Эксперт 001 фирмы Биос (Россия). Содержание редуцирующих веществ (РВ) определяли согласно ГОСТ 12575-2001. Содержание белка определяли по методу Къельдаля и методу Лоури. Концентрацию аминокислот в растворах определяли с помощью метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе растворителей н-бутанол/уксусная кислота/вода с окрашивающим нингидриновым реактивом. При этом общую концентрацию свободных аминокислот в растворе определяли исходя из концентрации лейцина, которая в белке глютена и его ферментолизатах составляет 12%. Степень гидролиза белка определяли по концентрации свободных аминокислот с учетом коэффициента пересчета аминокислоты/белок, равного 1,1.

Статистическая обработка данных. Дисперсию воспроизводимости процесса по выходному показателю (концентрации свободных аминокислот) определяли усредненно по схеме планирования эксперимента. Дисперсию адекватности модели определяли как сумму квадратов отклонений расчетных и экспериментальных значений, отнесенную к числу степеней свободы. Критерий Фишера определяли как отношение дисперсии адекватности к дисперсии воспроизводимости процесса. Полученное значение сравнивали с табличным при надежности оценки 95%.

3. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА И РАЗДЕЛЕНИЕ ЗЕРНОВОГО СЫРЬЯ НА ФРАКЦИИ

Использовали технологию влажного дробления зерна на роторно-пульсационном аппарате (РПА) с последующим разделением фракций крахмала, глютена и зерновых оболочек. Для повышения выхода глютена предложено использовать дополнительную стадию дробления на РПА фракции зерновых оболочек, содержащей значительное количество остаточного крахмала и глютена. Полученную суспензию отстаивали в течение 4-6 часов, в результате чего образуется глютеновая фракция II в виде поверхностного слоя, отделяемого декантированием. Зерновые оболочки отделяли от суспензии на ситах с размером ячеек 0,1мм. При такой обработке глютен не забивает мелкие ячейки сита, а выход глютеновой фракции повышается по сравнению с обычной технологией с 20 до 31% по сухим веществам. Выход крахмала также увеличивается с 36 до 40% за счет уменьшения его потерь с зерновыми оболочками.

В таблице 2 представлены сравнительные данные по составу глютеновых фракций. Из таблицы видно, что содержание белка по сухим веществам во фракции II выше на 19-25%.

Таблица 2.

Состав глютеновых фракций

Наименование фракций Содержание компонентов глютеновых фракций, г/л

Сухие вещества Крахмал Белок Пентозаны Клетчатка

Глютеновая фракция I 400-450 130-240 66-150 (15-35 %) 53-130 4-5

Глютеновая фракция II 250-280 40-90 110-146 (40-54%) 27-65 5,4-14

4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТОЛИЗА ГЛЮТЕНА

Оптимизация режимных параметров одноступенчатого периодического процесса ферментолиза. Изучали влияние режимных параметров процесса ферментолиза: рН, время экспозиции, температуру, концентрацию фермента. Изучение проводили по схеме ортогональных латинских прямоугольников. Результаты обработки данных представлены в табл. 3.

Эффекты влияния уровней факторов на степень ферментолиза глютена препаратом Л1са1а5е 2,4Рв

Наименование показателя Эффекты уровней факторов, г аминокислот/л

Время экспозиции, час Экспозиция 0,5 1,0 1,5 2,0

Эффект -8,8 -0,3 3,9 5,1

Концентрация фермента, МЕ/мл суспензии Концентрация 0,25 0,38 0,5 0,9

Эффект -6,5 -4,6 4,1 7,0

рН РН 6,5 7,5 8,5 9,5

Эффект -4,5 1,3 7,6 -4,4

Доверительный интервал для оценки значимости эффектов факторов при 95%-ной надежности оценки составил ±0,9 г/л.

На основании этих результатов выбраны следующие субоптимальные условия проведения процесса: концентрация фермента - 0,5-0,9 МЕ/мл и более, рН - 8,5, время ферментолиза - 1,5 часа и более. При этом достигнута максимальная концентрация растворимых аминокислот 40 г/л. Эти результаты были подтверждены в специально поставленных однофакторных экспериментах.

Аналогичные данные были получены для других ферментов. Общее количество ферментолизатов, приготовленных с использованием различных ферментов и режимов ферментолиза составило 58 вариантов.

Получены субогтгимальные условия проведения процесса для фермента Ncutra.se 0,5Ь: концентрация фермента-0,85 МЕ/мл и более, рН -6,1-6,7, время ферментолиза - 6 часов и более, температура процесса - 45-49 °С (табл. 4). При этом максимальная концентрация аминокислот в среде составила 29 г/л.

Выявлены субоптимальные условия проведения процесса для фермента №уо2уте: концентрация фермента - 0,85 МЕ/мл и более, рН - 6,7-7,3, время ферментолиза - от 4 часов, температура процесса - 53-56 °С (табл. 5). При этом максимальное содержание аминокислот в среде составило 32 г/л.

Эффекты влияния уровней факторов на степень ферментолиза пнотена препаратом Ксшгазе 0,5Ь

Наименование показателя Эффекты уровней факторов, г аминокислот/л

Время экспозиции, час Экспозиция 2,0 4,0 6,0 8,0

Эффект -3,92 -1,32 2,38 2,86

Концентрация фермента, МЕ/мл суспензии Концентрация 0,17 0,51 0,85 1,19

Эффект -4,84 -0,52 1,98 2,48

рн РН 5,5 6,1 6,7 -4,49

Эффект -2,07 2,13 4,43 -3,92

Температура, °С 1, °С 45 49 53 3,38

Эффект 2,48 3,76 -2,92 -3,32

Доверительный интервал для оценки значимости эффектов факторов при 95 %-ной надежности оценки составил ±1,1 г/л.

Таблица 5.

Эффекты влияния уровней факторов на степень ферментолиза глютена препаратом ГЧоУогуте

Наименование показателя Эффекты уровней факторов, г аминокислот/л

Время экспозиции, час Экспозиция 2,0 4,0 6,0 8,0

Эффект -7,17 4,42 1,00 1,75

Концентрация фермента, МЕ/мл суспензии Концентрация 0,17 0,51 0,85 1Д9

Эффект -2,83 -2,00 2,00 2,83

рН РН 5,5 6,1 6,7 7,3

Эффект -5,58 -0,67 2,58 3,67

Температура, °С 1, °С 45 49 53 56

Эффект -4,00 -3,08 5,00 2,08

Доверительный интервал для оценки значимости эффектов факторов при 95 %-ной надежности оценки составил ±0,8 г/л.

После подбора оптимальных параметров для ферментов показано, что для препаратов КешгаБе 0,5Ь и Моуогуте оптимальные значения концентрации находятся в пределах 0,85-1,19 МЕ/мл суспензии, время экспозиции - около 4-8 часов. При использовании Alcala.se 2,4Рв оптимальная концентрация фермента - 0,5-0,9 МЕ/мл, время экспозиции - от 1,5 часов.

Выбор ферментного препарата. Для выбора ферментного препарата проводили процесс ферментолиза на одной и той же суспензии при условиях, специфичных для каждого фермента. Аналогичные опыты были поставлены для обеих фракций глютена. В качестве параметра оптимизации использовали концентрацию свободных аминокислот в ферментолизате через 2 часа экспозиции. Результаты представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Концентрация свободных аминокислот в ферментолизатах глютена, полученных при использовании различных ферментных препаратов при оптимальных параметрах через 2 часа экспозиции

Ферментный препарат Параметры ферментолиза Концентрация свободных аминокислот в ферментолизате, г/л

рН Температура, °С Концентрация фермента, МЕ/мл Фракция глютена I (160 г/л СВ) Фракция глютена II (280 г/л СВ)

А1са1а5е 2,4РО 8,5 60 0,5 37 30,4

Иеисгазе 0,5Ь 6,7 49 1,19 27 20,8

№)Уогуте 6,7 49 1,19 30,1 22,5

Протосубгшшн ПОх 6,0 36 53 7,1 5,9

Из табл. 6 следует, что наилучшие результаты по концентрации свободных аминокислот имеет ферментный препарат Акакве 2,4РО. При использовании препаратов Меий-аяе 0,5Ь и Коуогуте содержание аминокислот 25-30 г/л достигается при более высоких концентрациях препарата (1,19 МЕ/мл) и более длительном времени экспозиции. Поэтому для дальнейших исследований использовали препарат А1са1азе 2,4РС.

5. КИНЕТИКА ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТОЛЮА

Влияние концентрации глютена. Проведены эксперименты по изучению влияния концентрации глютена в исходной суспензии на скорость накопления свободных аминокислот в среде (рис. 1 и 2 (кривая 1)). Из рисунка следует, что повышение концентрации белка в исходной суспензии выше 35-40 г/л практически не увеличивает максимального накопления аминокислот в ферментолизате.

Влияние продуктов ферментолиза. Высказано предположение, что это связано с ингибированием продуктами ферментолиза - свободными аминокислотами и растворимыми полипептидами. Для проверки этого предположения был проведен опыт с заменой 20 % воды в исходной суспензии глютена на ферментолизат глютена, содержащий 38 г/л свободных аминокислот. На рис. 3 представлено сравнение кривых накопления свободных аминокислот в опытах без добавки ферментолизата и с добавкой (пунктиром представлена кривая прироста концентрации аминокислот в опытах с добавкой). На рис. 2 дано сравнение зависимостей начальной скорости накопления аминокислот от концентрации глютена для этого опыта. Из опыта следует, что процесс с добавлением аминокислот протекает значительно менее интенсивно, а конечная концентрация аминокислот в обоих случаях мало различается.

Проведены также опыты по прямому изучению влияния концентрации аминокислот в исходной среде на скорость процесса ферментолиза (рис. 4). Показано, что скорость ферментолиза снижается практически до нуля в диапазоне концентраций аминокислот 35-40 г/л.

Влияние крахмала. Показано, что ни крахмал, ни его ферментолизаты не оказывают влияния на кинетику процесса ферментолиза

Двухступенчатый процесс ферментолиза. Очевидно, что предыдущие опыты подтверждают наличие ингибирования процесса ферментолиза продуктом реакции, для более полного использования белка необходимо использовать особые способы организации процесса. Для суспензий с содержанием белка более 40 г/л предложено замещать водный раствор с продуктом гидролиза на воду с эквивалентным количеством фермента после 1,5 часов экспозиции (когда прирост аминокислот останавливается, а концентрация белка в суспензии остается достаточно высокой) (рис. 5).

о ^-,-.-.-,-,

0 12 3 4 5

В рс мя фс рме нтолниа, час

Рис.1. Зависимость концентрации свободных аминокислот от времени ферментолиза в суспензии глютеновой фракции с водой при концентрации белка в исходной суспензии, г/л: 1- 66,4; 2- 53,2; 3- 39,8; 4- 26,6; 5- 13,3.

Концентрация глютена в суспензии, г/л

Рис.2. Сравнение зависимостей начальной скорости накопления аминокислот от концентрации глютена в опыте с добавлением продукта ферментолиза (2) и без него (1) за первый час ферментолиза. Начальная концентрация белка в суспензии от 13,3 до 66,4 г/л.

0 1 2 3 4 5

Вреда ферментолиза, час

Рис. 3. Сравнение кривых накопления свободных аминокислот в опытах без добавки ферменголизата (1) и с добавкой (2, 3). Начальная концентрация белка в суспензиях 39,8г/л

О 1 2 Э 4

0 12 3 4

Время, час

Рис. 4. Зависимость концентрации аминокислот и скорости образования аминокислот от времени ферментолиза при добавлении ферментолизата

глютена в концентрации, г/л аминокислот: 1- 0; 2- 3,8; 3- 15. Начальная концентрация белка с суспензиях 39,8 г/л.

50 с; 40

га о 30 о. с ь о

£ § 20

2 = 1° го

о

7 —..........

/

/ .-Г".. * ""—И^

0 2 4 6 8

Время ферментолиза, час

Рис.5. Содержание свободных аминокислот при многоступенчатом процессе. Концентрация белка, г/л: 1 - 44; 2 - 59; 3-71,5.

Время ферментолиза, час

Рис. 6. Варианты двухступенчатого ферментолиза (суспензия глютена 71,5 г/л белка). 1 - одноступенчатый процесс; 2 - двухступенчатый с заменой супернатанта водным раствором фермента; 3-е заменой супернатанта водой.

Проведение многоступенчатого процесса ферментолиза позволяет добиться большей степени гидролиза. Замедление процесса ферментолиза можно объяснить как накоплением продукта реакции в среде, так и инактивацией фермента при высоком содержании твердой фазы в суспензии. На рис. 6 показано, что добавление фермента в суспензию через 1,5 часа не повышает концентрации аминокислот, в то время как отделение супернатанта и замена его раствором фермента (кривая 2) или даже водой (кривая 3) позволяет продлить процесс ферментолиза и увеличить степень гидролиза белка.

В промышленных условиях целесообразнее проводить процесс ферментолиза сразу на разбавленной до 35-40 г/л по белку суспензии глютена.

Математическая модель процесса ферментолиза глютена. При построении математической модели процесса приняты во внимание характерные особенности кинетических зависимостей: отсутствие ингибирования повышенными концентрациями субстрата; наличие ингибирования продуктами ферментативной реакции - свободными аминокислотами.

Аппроксимирующей функцией выбрана мультипликативная модель неконкурентного торможения как сочетание кинетики Михаэлиса-Ментен по субстрату и Бергтера по продукту реакции с различными показателями степени при концентрации продукта (табл. 7). В качестве обучающего массива данных были

использованы данные, соответствующие рис. 1. В табл. 7 представлены коэффициенты различных моделей и соответствующая дисперсия адекватности, при вычислении которой учитывалось временное запаздывание данных на 9 минут. На основании полученных данных выбрана модель неконкурентного торможения № 6. Полученные данные подтверждают, что выбранная модель является адекватной по критерию Фишера при надежности оценки 95% и позволяет предсказывать результаты с точностью ±1,5 г/л.

Таблица 7.

Характеристика моделей, описывающих процесс ферментолиза

№ Структура модели Найденные коэффициенты

Ут Кз к, о2

1 5 К,+5 22,0 13,8 - 2054,0

2 5 х ' + 5 I+Р/ 5481 18 0,08 289,4

3 5 х 271 8,98 40,0 137,0

4 ^ 5 X 'з/ 173 10,4 1965,0 93,7

5 ^ 5 х *4/ 69 11,8 2,05-10л5 78,1

6 ^ ' х А 54 12,4 1-10л7 63,1

6. ИСПЫТАНИЕ ФЕРМЕНТОЛИЗАТОВ ГЛЮТЕНА КАК РОСТОВОГО ФАКТОРА В ПРОЦЕССАХ ФЕРМЕНТАЦИИ

Для этих исследований использовали фракцию глютена II. В экспериментах принимали участие препараты Акакве Оттаве 0,5Ь и Коуогуте. Проведено

89 ферментаций с использованием приготовленных ферментолизатов глютена для исследования возможности биосинтеза продуктов. При этом также использованы схемы ортогональных латинских прямоугольников. В табл. 8 представлены лучшие

результаты для различных продуцентов по отношению к полученным на контрольных средах и средах с ферментолизатом глютена в качестве азотистого субстрата.

Представленные в табл. 8 данные подтверждают, что ферментолизат глютена может успешно применяться в качестве ростового фактора для биосинтеза продуктов различными продуцентами. В работе представлены экономические расчеты для некоторых вариантов использования ферментолизатов глютена.

Таблица 8.

Биосинтез продуктов на ферментолизатах глютена

Наименование микроорганизма (синтезируемый продукт) Исходный источник аминного азота Фермент Прирост целевого продукта, % к контролю

Corynebacterium glutamicum (лизин) кукурузный экстракт Alcalase 2.4FG колбы: + 9,3 ферментер: +3,4

Corynebacterium glutamicum (лейцин) кукурузный экстракт Alcalase 2,4FG + 27,7

Corynebacterium glutamicum (валин) кукурузный экстракт Alcalase 2,4FG -29,0

Phaffia rhodozyma (астаксантин) пептон, дрожжевой экстракт Alcalase 2,4FG + 34,4

Streptomyces sp. (гликопептидный антибиотик) пептон, дрожжевой экстракт Alcalase 2,4FG + 9,0

Bacillus subtilis (пробиотик) пептон, дрожжевой экстракт Neutrase 0,5L + 16,7

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ II ВЫВОДЫ

1. Предложена модифицированная технология выделения глютена из зернового сырья, позволяющая повысить концентрацию белка в суспензии на 19-25%.

2. Проведена оптимизация одноступенчатого периодического процесса ферментолиза глютена с использованием схемы ортогональных латинских прямоугольников. Получено увеличение концентрации свободных аминокислот с 11-17 до 37-40 г/л по сравнению с рекомендуемыми производителем условиями.

3. Проведены кинетические эксперименты по изучению влияния режимных параметров на скорость ферментолиза. Показано существенное ингибирование процесса продуктом реакции ферментолиза глютена.

4. Предложена математическая модель, описывающая процесс ферментативного гидролиза глютена. Показано, что ингибирование продуктом реакции подчиняется уравнению Бергтера с показателем степени 5.

5. На основании анализа кинетических экспериментов предложены варианты технологии ферментолиза, позволяющие повысить степень трансформации глютена в аминокислоты с 53 до 95%. При этом степень утилизации белка возросла почти вдвое.

6. Проведены сравнительные испытания ферментолизата глютена и кукурузного экстракта в качестве ростовых факторов на различных биотехнологических объектах (биосинтез лизина, лейцина, валина, астаксантина, антибиотика и пробиотика). Показана возможность эффективной замены кукурузного экстракта на ферментолизат глютена.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах

1. Федотова, Н.В. Ферментолизат глютена как ростовой фактор процесса ферментации / Н.В. Федотова, В.В. Бирюков, А.Н. Поляков, JI.C. Герман // Биотехнология. - 2009. - №4. - С. 64-68.

2. Федотова, Н.В. Оптимизация процесса ферментолиза зернового белка для культивирования микроорганизмов / Н.В. Федотова, В.В. Бирюков, Л.С. Герман, А.Н. Поляков // Химагрегаты. - 2009. - №1(5). - С. 33-34.

3. Федотова, Н.В. Азотистый субстрат для процессов ферментации на основе зернового сырья / Н.В. Федотова, В.В. Бирюков // Всероссийский конкурс научно-технического творчества молодежи. Сборник материалов «Лучшие проекты VIII всероссийской выставки научно-технического творчества молодежи». М: ВВЦ. - 2008. - С. 181-183.

4. Федотова, Н.В. Новый азотистый субстрат и утилизация отходов / Н.В. Федотова, В.В. Бирюков // Международная научная конференция, посвященная 70-летию факультета прикладной химии и экологии. Спб: СПГУТД. - 2008. - С. 53-54.

5. Федотова, Н.В. Технология и опытная установка для ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих зерновых отходов / Н.В. Федотова, С.А. Корпуснова, В.В. Бирюков, Л.С. Герман, А.Н. Поляков // Материалы Научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях». - М. - 2007. - С. 257-259.

6. Федотова Н.В. Оптимизация процесса ферментолиза глютена для получения ростового субстрата в процессах ферментации / Н.В. Федотова, В.В. Бирюков, А.Н. Поляков. // Сборник трудов XXI научной конференции «Математические методы в технике и технологиях ММТТ-21».- Тамбов: ТГТУ. - 2008. - С. 54-55.

7. Баранова Е.А. Технология получения источника аминокислот для микробиологического синтеза из белковой фракции зерна / Е.А. Баранова, Н.В. Федотова. // Тезисы докладов «Научная конференция студентов и молодых ученых МГУИЭ». - М. - 2008. - С. 30-31.

8. Баранова Е.А. Влияние концентрации моно- и дисахаров в ферментолизатах крахмала на биосинтез лизина / Е.А. Баранова, Н.В. Федотова. // Тезисы докладов «Научная конференция студентов и молодых ученых МГУИЭ». - М. - 2008. - С. 31-32.

9. Федотова Н.В. Приготовление питательных сред из отходов зерна для биосинтеза лизина / Н.В. Федотова, С.М. Любимова. // Тезисы докладов «Научная конференция студентов и молодых ученых МГУИЭ». - М. - 2008. - С. 33-34.

Подписано в печать: 20.11.09 Объем: 1,5 печатного листа Тираж: 100 экз. Заказ № 148 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90 www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Федотова, Надежда Владимировна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Характеристика зерна и его использование.

1.1.1 Структура и состав зерна.

1.1.2. Белоксодержащее сырьё растительного происхождения.

1.1.3. Обзор современных технологий обработки зерна для микробиологической промышленности.

1.2. Гидролиз растительного белка.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии получения из зернового сырья азотсодержащих компонентов для процессов ферментации"

Для проведения процессов биосинтеза различных продуктов необходимы 2 основных компонента сред: источник углерода (углеводы) в качестве энергетического субстрата и источник органического азота в качестве фактора роста. В качестве источника углерода в ферментационных средах довольно часто используют ферментолизаты крахмала, получаемые непосредственно на стадии производства биопродуктов из зерна пшеницы мягких сортов.

В качестве источника органического азота при этом обычно используют специально приобретаемые источники сырья, такие как кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, гидролизаты казеина, соевую муку и др.

В то же время содержащийся в зерне пшеницы белок (глютен) в лучшем случае выделяется и реализуется как кормовой продукт, а чаще является малоценным отходом.

Учитывая, что в таких случаях система переработки зерна существует непосредственно на биотехнологическом производстве, целесообразно включить в технологию переработки зерна дополнительные стадии выделения и ферментолиза глютена, а получаемые ферментолизаты использовать в качестве ростового субстрата.

Это позволит использовать зерно как основной сырьевой ресурс биотехнологических производств. Учитывая доступность и относительно низкую стоимость зерна пшеницы, разработка технологии его дополнительной переработки является актуальной задачей для совершенствования биотехнологических производств.

Положения, выносимые на защиту:

- модифицированный способ разделения фракций зерна при влажном дроблении с получением глютеновой фракции с повышенным содержанием белка; оптимизация технологических режимов одноступенчатого периодического процесса ферментолиза глютена;

- кинетические закономерности процесса ферментолиза глютена;

- математическая модель кинетики процесса ферментолиза;

- двухступенчатая схема проведения ферментативного гидролиза с повышенным выходом свободных аминокислот;

- подтверждение возможности использования ферментолизата глютена как ростового фактора при биосинтезе различных биотехнологических продуктов.

Научная новизна

- Показано, что повторная обработка на РПА и дополнительная выдержка суспензии измельченного зерна при рН 4-5 позволяет повысить концентрацию белка в глютеновой фракции на 19-25%;

С использованием планирования эксперимента по схеме ортогональных латинских прямоугольников найдено оптимальное соотношение режимных параметров одноступенчатого периодического процесса ферментолиза;

- Найдены зависимости скорости ферментолиза глютеновой фракции от концентрации глютена и свободных аминокислот, образующихся в процессе ферментолиза. Обнаружено ингибирование процесса продуктами ферментолиза;

- На основании анализа экспериментальных данных предложена и идентифицирована кинетическая модель процесса ферментолиза, учитывающая влияние концентрации белка по уравнению Миаэлиса-Ментен и концентрации продуктов реакции по уравнению Бергтера;

- Показано, что для увеличения глубины ферментолиза целесообразно либо использовать разбавленную до 40 г/л белка фракцию глютена, либо проводить дополнительные ступени ферментолиза после отделения осадка от растворимых продуктов ферментолиза;

- Подтверждена возможность использования ферментолизата глютена в качестве азотсодержащих компонентов ферментационных сред для процессов биосинтеза лизина, лейцина, валина, астаксантина, нового гликопептидного антибиотика и пробиотика.

Практическая ценность работы использование ферментолизата глютена, полученного по предложенной технологии, позволяет использовать зерно в качестве основного сырьевого ресурса в процессах биосинтеза на продуцентах, не имеющих протеолитической активности;

- использование технологии по месту производства биотехнологического продукта не требует сушки ферментолизата или других способов его консервирования, что позволяет снизить затраты на азотсодержащий источник питания; разработан лабораторный технологический регламент для предложенной технологии;

- результаты технологии использованы ООО ПКФ «Бигор» при проектировании опытно-промышленной установки для производства лизина в Чувашии.

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи.

Личный вклад соискателя

Основные результаты представленной работы получены автором лично. Соавторы В.В. Бирюков и Л.С. Герман принимали участие в обсуждении результатов, редактировании публикаций.

Автор считает своим приятным долгом выразить благодарность коллективу кафедры Экологической и промышленной биотехнологии МГУИЭ за содействие в проведении экспериментальных исследований на опытной установке технопарка, а также к.т.н. доц. Зубову Д.В. за помощь в математическом анализе кинетических экспериментов и нахождении коэффициентов математической модели.

Существенная помощь при оценке возможности использования ферментолизатов для биосинтеза нового антибиотика и пробиотика оказана автору заведующей лаборатории Государственного научного центра по антибиотикам д.б.н., проф. Бибиковой М.В и Кураниной О.Г.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Федотова, Надежда Владимировна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Предложена модифицированная технология выделения глютена из зернового сырья, позволяющая повысить концентрацию белка в суспензии на 19-25%.

2. Проведена оптимизация одноступенчатого периодического процесса ферментолиза глютена с использованием схемы ортогональных латинских прямоугольников. Получено увеличение концентрации свободных аминокислот с 11-17 до 37-40 г/л по сравнению с рекомендуемыми производителем условиями.

3. Проведены кинетические эксперименты по изучению влияния режимных параметров на скорость ферментолиза. Показано существенное ингибирование процесса продуктом реакции ферментолиза глютена.

4. Предложена математическая модель, описывающая процесс ферментативного гидролиза глютена. Показано, что ингибирование продуктом реакции подчиняется уравнению Бергтера с показателем степени 5.

5. На основании анализа кинетических экспериментов предложены варианты технологии ферментолиза, позволяющие повысить степень трансформации глютена в аминокислоты с 53 до 95%. При этом степень утилизации белка возросла почти вдвое.

6. Проведены сравнительные испытания ферментолизата глютена и кукурузного экстракта в качестве ростовых факторов на различных биотехнологических объектах (биосинтез лизина, лейцина, валина, астаксантина, антибиотика и пробиотика). Показана возможность эффективной замены кукурузного экстракта на ферментолизат глютена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Федотова, Надежда Владимировна, Москва

1. Аиба, Ш. Биохимическая технология и аппаратура / Ш. Аиба, А. Хемфри, М. Миллис. М. : Пищевая промышленность, 1975. - 287 с.

2. Антонов, В.К. Химия протеолиза / В.К. Антонов. М. : Наука, 1991.504 с.

3. Апсите, А.Ф. Продуценты L-лизина из рода Brevibacterium / А.Ф. Апсите, Г.Р.Межиня, В.П. Осе. Рига : Зинатне, 1978. - 172 с. - С. 13.

4. Бакулина, Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus subtilis и их использование в ветеринарии / Л.Ф. Бакулина и др.. //Биотехнология. -2001. -№ 2. С. 48-56.

5. Балабышко, A.M. Гидромеханическое дисперирование / A.M. Балабышко, А.И. Зимин, В.П. Ружицкий. -М. : Наука, 1998. 330 с.

6. Безбородов, A.M. Ферментативные процессы в биокинетике / A.M. Безбородов, Н.А Загустина, В.О. Попов. М. : Наука. - 2008. - 335 с.

7. Бекер, М.Е. Введение в биотехнологию / М.Е. Бекер. М. : Пищевая промышленность, 1978.-231 с.

8. Бекер, М.Е. Микробиологический синтез лизина / М.Е. Бекер, Ю.О. Якобсон, И.Э. Эрле // Тезисы докладов конференции Рига. Рига : Зинатне. -1974, 112 с.

9. Березин, И.В. Практический курс химической и ферментативной кинетики / И.В. Березин, А.А. Клесов. М.: Изд-во МГУ, 1976. - 320 с.

10. Березин, И.В. Биокинетика / И.В. Березин, С.Д. Варфоломеев. М. : Наука, 1979.-312 с.

11. Берёзкин, В. Г. Количественная тонкослойная хроматография. Инструментальные методы / В.Г. Берёзкин, А.С. Бочков. -М. : Наука, 1980. -183 с.

12. Березов, Т.Т. Биологическая химия : учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин М. : Медицина, 2007. - 704 с.

13. Беркутова, Н.С. Технологические свойства пшеницы и качество продуктов её переработки / Н.С. Беркутова, И.А. Швецова. М. : Колос, 1984.-243 с.

14. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков -М.: КолосС, 2004.-296 с.

15. Булатова, К.М. Глютенины и глютениновые биотипы пшеницы : автореф. дис. . канд. биол. наук / К.М. Булатова. Алма-Ата, 1989. - 22 с.

16. Булдаков А.С. Пищевые добавки : справочник. / А.С. Булдаков. М. : ДеЛи принт, 2003. - 436 с.

17. Бутова, С.Н. Биотехнологическая деградация отходов растительного сырья / С.Н. Бутова. М. : Типография Россельхозакадемии, 2004. - 320 с.

18. Буцик, Ю.В. Оптимизация питательной среды для Bacillus subtilis / Ю.В. Буцик, А.Г. Кощаев, А.О. Бадякина, А.И. Петенко. Краснодар : Кубанский Государственный аграрный университет, 2004 - 18 с.

19. Бунин, М.А. Интенсификация процесса производства этилового спирта на основе целенаправленного использования протеолитического ферментного препарата : автореф. дисс. . .канд. техн. наук / М.А. Бушин. Воронеж : изд-во ВГТА, 2006. - С. 15.

20. Варфоломеев, С.Д. Биокинетика / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. — М. : Фаир-Пресс, 1999: 720 е., С. 231-245, 306-334.

21. Варфоломеев, С.Д. Кинетические методы в химических исследованиях / С.Д. Варфоломеев, С.В. Зайцев. -М. : Издво МГУ, 1982. 345 с.

22. Васильев, А.В. Гидролиз сухой пшеничной клейковины разного качества с применением экзо- и эндопротеиназ / А.В. Васильев, Л.В. Зайцева, В.В. Колпакова. // Хранение и переработка сельхозсырья. 2008. - № 8. - С. 38-39.

23. Виноградова, И.Н. Производственные питательные среды. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней / И.Н. Виноградова; под ред. Н.Н. Жукова-Вережникова. М. : Медгиз, 1962. - т. 1. -С. 339-384.

24. Витол И.С. Ферменты и их применение в пищевой промышленности / И.С. Витол, И.Б. Корелева, С.Е. Траубенберг. — М. : Издательский комплекс МГУПП, 2000.-213 с.

25. Владимирова, Е.Г. Биохимия. Методические указания к лабораторному практикуму / Е.Г. Владимирова, Г.И. Ушакова, О.П. Кушнарёва. Оренбург: ОГУ, 2004. - С. 24-25, 27-29, 37-38, 49-50.

26. Волькенштейн, М.В. Физика ферментов / М.В. Волькенштейн. М. : Наука, 1967.- 199 с.

27. Воробьева, Г.И. Технология интенсификации производства спирта с применением композиционных биостимуляторов / Г.И. Воробьева, Г.Н. Максимова, С.А. Глухих, JI.B. Римарева. // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2003. - №2. - С. 23.

28. Востриков, С.В. Исследование влияния энергии, затрачиваемой на дробление зернового сырья, на выход спирта / С.В. Востриков, Г.Г. Губрий, Е.А. Горшков. // Ш МНПК «НТП в спиртовой и ликёроводочной отрасли». -М. : Пищепромиздат, 2001. С. 94-98.

29. Волынец, М.П. Тонкослойная хроматография в неорганическом анализе / М.П. Волынец. М. : Наука, 1974. - 152 с.

30. Герхардт, Ф. Методы общей бактериологии : тт. 1-3 / Ф. Герхардт. М. : Мир, 1983.-536 с.

31. Гинсбург, М.Е. Технология крупяного производства / М.Е. Гинсбург. -М. : Колос, 1981.-208 с.

32. ГОСТ 13586.1-68 Зерно. Методы определения количества и качества клейковины пшеницы. Введ. 01.06.68. - М. : Изд-во стандартов, 1968. - С. 49-52.

33. ГОСТ 10846-91 Зерно и продукты его переработки. Метод определения белка. -Введ. 01.06.93. -М. : Изд-во стандартов, 1991. С. 18-23.

34. ГОСТ 10844-74 Зерно. Метод определения кислотности по болтушке. -Введ. 01.07.75. -М. : Изд-во стандартов, 1974. С. 10-11.

35. ГОСТ 12575-2001 Сахар. Методы определения редуцирующих веществ. Введ. 01.11.2001. — М. : Изд-во стандартов, 2001. — 15 с.

36. Грачёва, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачёва. М. : АГРОПРОМИЗДАТ, 1987. - 335 с.

37. Грузинов, Е.В. Аминокислотный состав и некоторые функциональные свойства белка глобулина, выделенного из муки зародышей пшеницы / Е.В. Грузинов, Е.В. Журавко, М.В.Иванова // Хранение и переработка сельхозсырья. 2008. - №8. - С. 47-48.

38. Гулюк, Н.Г. Крахмал и крахмалопродукты / Н.Г. Гулюк, А.И. Жушман, Т.А. Ладур, Е.А. Штыркова. -М. : Агропромиздат, 1985. -238 с.

39. Гурова, Н.В. Использование ферментативных гидролизатов в составе продуктов энтерального питания / Н.В.Гурова // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. - №4. - С. 39.

40. Данилин, А.С. Совершенствование технологических процессов на мукомольных заводах / А.С. Данилин, A.M. Братухин. М. : Колос, 1976. -304 с.

41. Диксон, М. Ферменты тт. 1-3 / М. Диксон; пер. с англ. М. : Мир, 1982. -1118с.

42. Дойловский, Э.И. Мукомольное и крупяное производство / Э.И. Дойловский. -М. : ACT, 2005. 185 с.

43. Досон, М. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Элиот. М. : Мир, 1991.-539 с.

44. Дудкин, М.С. Концентраты белка, выделенные из отрубей зерна хлебных злаков / М.С. Дудкин, Е.А. Антипина // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. - Т.29 - №5.

45. Евсичева, М.Н. Совершенствование технологии получения растительного белка из нетрадиционных видов сырья на основе использования протеаз и ксилаз микроорганизмов : дисс. . канд. техн. наук : защищена 2006 : утв. 2006 / М.Н. Евсичева. М, 2006. - 151 с.

46. Егоров, Н.С. Практикум по микробиологии / Н.С. Егоров. — М. : Изд-воМГУ, 1976.-307 с.

47. Егоров, Г.А. Управление технологическими свойствами зерна / Г.А. Егоров. Воронеж : Изд-во ВГУ, 2000. - 348 с.

48. Елинов, Н.П. Химическая микробиология / Н.П. Елинов М. : Высшая школа, 1989.-448 с.

49. Ермаков, А.И. Методы биохимического исследования растений: Сборник / Под ред. А.И. Ермакова. М.: Колос, 1986. - 325 с.

50. Жеребцов, Н.А. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности / Н.А. Жеребцов М. : Легкая и пищевая промышленность, 1984.-159 с.

51. Жислин, Я.М. Зерновые, зернобобовые и масличные культуры / Я.М. Жислин, А.К. Терещенко. М.: Изд-во стандартов, 1990. - 120 с.

52. Жислин, Я.М. Выработка муки и крупы в сельскохозяйственном мукомолье / Я.М. Жислин, А.К. Терещенко. -М. : Колос, 1969. 164 с.

53. Журба, О.С. Разработка новой технологии этанола на основе интенсивных способов переработки зерна пшеницы : автореферат дис. . канд. техн. наук /О.С. Журба. — М. : изд-во ВНИИ пищевой биотехнологии, 2004 с.

54. Заяц, Ю.А. Совершенствование технологических процессов в перерабатывающей промышленности / Ю.А. Заяц, А.Н. Прохоров, B.JI. Яров. -Киев : Урожай, 1991. 550 с.

55. Зотов, В.Н. Опыт эксплуатации нового оборудования спиртового производства / В.Н. Зотов. М. : АГРОНИИТЭИПП, 1990. - вып. 71. - 36 с.

56. Зуева, Н.В. Влияние некоторых параметров на физико-химические сбраживание зернового осветленного сусла / Н.В. Зуева, С.В. Востриков // Хранение и переработка сельхозсырья 2008. - №8. - С. 42-43.

57. Кадиева, А.Т. Разработка интенсивной технологии этанола на основе целенаправленного применения мультиэнзимных систем и новых рас спиртовых дрожжей : дис.канд. техн. наук. : защищена 2003 : утв. : 2003 / А.Т. Кадиева. М. - 208 с.

58. Калошина, Е.Н. Исследование предварительной обработки зерна пшеницы, используемого для производства этанола и кормопродукта из спиртовой барды / Е.Н. Калошина // Хранение и переработка сельхозсырья -2006. -№3.- С. 38-42.

59. Казаков, Е.Д. Биохимия зерна и зернопродуктов / Е.Д. Казаков, Г.П. Карпиленко. М. : ГИОРД, 2005 - 512 с.

60. Кислухина, О.С. Биотехнологические оснвы переработки растительного сырья / Кислухина О.С., Кюдулас И. — Каунас : Технология, 1997.-183 с.

61. Кислухина, О.С. Ферменты в производстве пищи и кормов / О.С. Кислухина. М. : ДеЛи принт, 2002. - 336 с.

62. Кислухина, О.В. Ферментативный лизис микроорганизмов / О.В. Кислухина, К.А. Калунянц, Д.Ж. Аленова. Алма-Ата : Рауан., 1990.-200 с.

63. Клесов, А.А. Биокатализ и получение пищевых продуктов из непищевого (целлюлозосодержащего) сырья / А.А. Клесов. М. : Наука, 1984.-226 с.

64. Ковальская, Л.П. Технология пищевых производств / Л.П. Ковальская. -М. : Колос, 1999.-751 с.

65. Колпакова, В.В. Дифференцированные фракции переработки зерна пшеницы на спирт новый источник пищевого белка / В.В .Колпакова, Л.Н. Крикунова, Ю.Е. Дубовицкий // Хранение и переработка сельхозсырья. -1998.-№4.-С. 39.

66. Колпакова, В.В. Дифференцированные фракции переработки зерна пшеницы на спирт новый источник пищевого белка / В.В.Колпакова, Л.Н. Крикунова, Ю.Е. Дубовицкий // Хранение и переработка сельхозсырья. -2001. -№6.~ С. 41-45.

67. Колпакова, В.В. Побочные продукты помола зерна пшеницы-источник пищевого белка : обзорная информация / В.В Колпакова, А.П. Нечаев, Л.Н. Крикунова. М. : ЦНИИТЭИ хлебопродуктов, 1993.

68. Колпакова В.В., Белок из пшеничных отрубей. Влияние технологических факторов на выход и биологическую ценность / В.В. Колпакова, А.П. Нечаев, А.В. Смирнова // Хранение и переработка сельхозсырья, 1994, №3.

69. Коренман, Я.И. Практикум по аналитической химии. Анализ пищевых продуктов. / Я.И. Коренман. Воронеж : Изд-во ВГТА, 2002. - 408 с.

70. Кощаев, А.Г. Микробный пробиотический препарат «Бацелл» для животноводства / А.Г. Кощаев, А.И. Петенко, В.Я. Ярошенко. Краснодар : Кубанский Государственный аграрный университет, 2004. - 17 с.

71. Кретов, И.Т. Технологическое оборудование предприятий бродильной промышленности / И.Т. Кретов, С.Т. Антипов. Воронеж : Изд-во Госуниверситета, 1997. - 624 с.

72. Кретович, B.JI. Биохимия зерна / В.Л. Кретович. М. : Наука, 1981. —484 с.

73. Ксенз, М.В. Применение протеиназ для повышения усвояемости пищевых белков / М.В. Ксенз // Известия вузов. Пищевая технология. — 2002. -№1.

74. Кулак, В.Г. Мукомольные заводы на комплектном оборудовании / В.Г. Кулак, Б.М. Максимчук, А.П. Чакар. -М. : Колос, 1984. 224 с.

75. Лебедев, П.Т. Методы исследования кормов, органов и тканей животных / П. Т. Лебедев, А. Т. Усович. М. : Россельхозиздат, 1969. - 386 с.

76. Леденёв, В.П. Состояние и задачи по совершенствованию технологии производства спирта из зерна на заводах РФ / В.П. Леденёв // Тезисы конференции «Ферменты в пищевой промышленности» М., 1999. - С. 2227.

77. Ленинджер, А Основы биохимии тт. 1-3 / А. Ленинджер. М. : Мир, 1985.- 1055 с.

78. Лиепинып, Г.К. Сырьё и питательные субстраты для промышленной биотехнологии / Г.К. Лиепинып, М.Э. Дунце. Рига : Зинатне, 1986. - 156 с.

79. Лиепинып, Г.К. Поиск новых видов сырья для биосинтеза лизина / Г.К. Лиепинып, Г.Р. Межиня, В.Т. Яковича И Тезисы симпозиума «Биотехнология и биоинженерия» Рига : Зинатне, 1978. - Т2. - С. 101-102.

80. Лихварь, Н.А. Сухие питательные среды из свежих и замороженных отходов рыбной промышленности. / Н.А. Лихварь // Ученые записки ДагНИВИ по производству питательных сред . 1956. — № 2.

81. Лихтенберг, Л.А. Основные направления реконструкции спиртовых заводов / Л.А. Лихтенберг, Б.А. Устинников, Б.Д. Броиловский. — М. : АГТОНИИТЭИПП, 1991.-вып. 5-С. 1-36.

82. Лобанок, А.Г. Микробный синтез на основе целлюлозы / А.Г. Лобанок, В.Г. Бабицкая. Минск : Наука и техника, 1988. - 232 с.

83. Маевская, СЛ. Оперативный учёт на зерноперерабатывающих предприятиях / СЛ. Маевская, Л.А. Полищук. М. : Агропромиздат, 1991. -191 с.

84. Максимова Е.В. Интенсификация производства биомассы с использованием биостимуляторов / Е.В. Максимова // Материалы 4 съезда общества биотехнологов России Пущино, 6-7 дек. 2006. М : Макс-пресс, 2006.

85. Межиня, Г.Р. Новые виды сырья для микробиологических производств : обзор / Г.Р. Межиня, М.Э. Дунце. М. : ОНТИТЭИмикробиопром, 1978. -72 с.-С. 35.

86. Мельников, Е.М. Технология крупяного производства / Е.М. Мельников. М. : Агропромиздат, 1991. - 207 с.

87. Мерко, И.Т. Технология мукомольного и крупяного производства / И.Т. Мерко. -М. : ВО Агропромиздат, 1985. 288 с.

88. Методы биохимического исследования растений: сборник / под ред. А.И. Ермакова. М. : Колос, 1986. - 325 с.

89. Мордвинова Е.М. Биоконверсия послеспиртовой барды в белковый кормовой продукт.: дис.канд. техн. наук: 03.00.23: защищена 12.01.09/ Е.М. Мордвинова — Москва., 2009. 166 с.

90. Мосичев, М.С. Общая технология микробиологических производств / М.С. Мосичев, А.А. Складнев, В.Б. Котов. — М. : Лёгкая и пищевая промышленность, 1982. 264 с.

91. Наумов, И.А. Совершенствование кондиционирования и измельчения пшеницы и ржи / И.А. Наумов. М. : Колос, 1975. - 312 с.

92. Нечаев, А.П. Белки из побочных продуктов переработки зерна пшеницы: технологические аспекты, функциональная роль, применение / А.П. Нечаев, В.В. Колпакова // Хранение и переработка сельхозсырья. — 1998. -№4.-С. 39-40.

93. Нечаев, А.П. Пищевая химия / А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, АА Кочеткова, ВВ Колпакова, И.С. Витол, И.Б. Кобелева : учебник. СПб. : Гиорд, 2001 - 592 с.

94. Олийничук, А.С. Технология сбраживания зернового сусла путем прямой ферментации негидролизованного крахмала / А.С. Олийничук, Л.В. Левандовский, А.Ф. Ткаченко // Производство спирта и ликероводочных изделий.-Киев-2008.-№ 1. С. 30-31.

95. Панкратов, А.Я. Техническая микробиология пищевых продуктов / А.Я. Панкратов. М. : Пищевая промышленность, 1968. - 744 с.

96. Перегудов, С.С. Производство комбикормов и кормовых добавок по альтернативной технологии / С.С. Перегудов // Мясная промышленность. — 2005.-№7.-С. 42-44.

97. Ппешков, Б.П. Практикум по биохимии растений / Б.П. Плешков. — М. : Колос, 1985.-255 с.

98. Ппоскирев, Н.В. Получение сухих питательных сред из непищевого белка для культивирования бактерий : доклад на соискание доктора биол. наук. / Н.В. Плоскирев. М. : Пищевая промышленность, 1967. - 75 с.

99. Полыгалина, Г.В. Технохимический контроль спиртового и ликероводочного производств / Г.В. Полыгалина. М : Колос, 1999. - 336 с.

100. Поляков, В.А. Влияние ферментативного катализа полисахаридов и белковых веществ на степень микробной конверсии растительного сырья в лизин / В.А. Поляков, JI.B. Римарева, Н.С. Погоржельская // Хлебопродукты. -2007.-№12.-С. 51-53.

101. Поляков, В.А. Перспективные ферментные препараты и особенности их применения в спиртовой промышленности / В.А. Поляков, JI.B. Римарева // Пиво и напитки. 2000. - №2. - С. 52-55.

102. Попелло, Н.А. Получение комбинированных белковых препаратов на основе молочного и растительного сырья / Н.А. Попелло // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. - №4. - С. 40.

103. Промтов, М.А. Пульсационные аппараты роторного типа: теория и практика / М.А. Промтов. М. : Машиностроение, 2001. - 260 с.

104. Опытно-промышленный регламент на производство L-лизина монохлоргидрата кормового кристаллического и белково-витаминной добавки (БВД). М.: ООО ПКФ «Бигор», 2007. - с.

105. Римарева, JI.B. Эффективный ферментный препарат для протеолиза растительного сырья / JI.B. Римарева // Хранение и переработка сельхозсырья. 1995. - №6. - С. 40.

106. Римарева, Л.В. Микробные ферментные препараты в спиртовом производстве. / Л.В. Римарева // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2002. - №4 - С. 27-31.

107. Римарева, Л.В. Перспективы использования протеолитических ферментных препаратов / Л.В. Римарева // Пищевая промышленность. — 1996. -№3- С. 44-45.

108. Римарева, Л.В. Микробная конверсия растительного сырья и вторичных сырьевых ресурсов АПК в высокоэффективный лизино-белковый препарат / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова // Хранение и переработка с/х сырья. 2008. - № 12. - С. 48.

109. Румянцева, Г.Н. Влияние ферментных препаратов протеолитического действия на белоксодержащее сырье / Г.Н. Румянцева, М.Н. Евсичева // Хранение и переработка с/х сырья. 2005. - № 7. - С. 31-32.

110. Рухлядева, А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов / А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгина. М. : Легкая и пищевая промышленность, 1981. -288 с.

111. Саловарова, В.П. Эколого-биотехнологические аспекты конверсии растительных субстратов / В.П. Саловарова, Ю.П. Козлов. М. : «РУ Дружбы народов», 2001. - 287 с.

112. Сидоренко, О.Д. Микробиология / О.Д. Сидоренко, Е.Г. Борисенко, Л.И. Ванькова. -М. : Инфра-М, 2005. 287с.

113. Сизенко, Е.И. Проблемы комплексной переработки сельскохозяйственного сырья и создания продуктов питания нового поколения / Е.И. Сизенко // Хранение и переработки с/х сырья. 2000. - № 11.-С. 42.

114. Ситько, В. Ефективне птах!вництво / В. Ситько, В. Рай // Ефективне nTaxiвництво та тваринництво. — 2003. — № 3. — С. 13.

115. Смирнова, Т.А. Микробиология зерна и продуктов его переработки / Т.А. Смирнова, Е.И. Кострова. М. : Агропромиздат, 1989. - 159 с.

116. Смирнова, Г.И. Состояние и перспективы развития сырьевой базы производства питательных сред / Г.А. Смирнова // ЖМЭИ. 1991. - №5. — С. 63-67.

117. Соколов, A.M. Экология и охрана окружающей среды / A.M. Соколов, В.А. Соловьев, Ю.Т. Краснова. М. : Высшая школа, 1997. -356 с.

118. Страйер, JI Биохимия тт. 1-3 / JI. Страйер. М. : Мир, 1985. - 944 с.

119. Тарасов, В.П. Технологическое оборудование зерноперерабатывающих предприятий / В.П. Тарасов. Барнаул : АлтГТУ, 2002. — 229 с.

120. Телишевская, Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение / Л.Я. Телишевская. М. : Аграрная наука, 2002. - 296 с.

121. Телишевская, Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение : автореф. дис. . .докт. биол. наук. М, 2002. - 58 с.

122. Тимощенко, А.С. Снижение потерь аминокислот при кислотном гидролизе суммарного белка зерновых хлебных злаков / А.С.Тимощенко, Л.Ю. Ракитин, Л.А. Пискунова // Физиология растений. 1990. - №4.

123. Торжинская, Л.Р. Технохимический контроль хлебопродуктов / Л.Р. Торжинская, В.А. Яковенко. М. : Агропромиздат, 1986. - 199 с.

124. Трисвятский, Л.А. Хранение и технология сельскохозяйственных продуктов / Л.А. Трисвятский, Б.В. Лесик, В.Н. Кур дина. М. : Агропромиздат, 1991. - 414 с.

125. Уильяме, Б. Методы практической биохимии / Б. Уильяме, К. Уилсон под ред. С.С. Северина и А.Д. Виноградова. М. : Мир, 1978. - 272 с.

126. Устинников, Б. А. Внедрение гидроферментативной обработки крахмалистого сырья на спиртовых заводах / Б.А. Устинников, С.И. Громов. -М. : АгроНИИТЭИПП, 1992. сер. 24. - вып. 1. - 32 с.

127. Устинников, Б.А. Опыт внедрения новой техники и технологии на предприятиях спиртовой промышленности / Б.А. Устинников. М. : АгроНИИТЭИПП, 1989. - сер. 24. - вып. 7. - С. 35-37.

128. Федосеев, К.Г. Физические основы и аппаратура микробного синтеза биологически активных соединений / К.Г. Федосеев. М. : Медицина, 1977. -304 с.

129. Фертман, Г.И. Физико-химические основы производства спирта / Г.И. Фертман, М.С. Шульман. -М. : Пищепромиздат, 1960. 259 с.

130. Филатов, В.В. Инфракрасные технологии в переработке зернового сырья. / В.В. Филатов, Ю.М. Плаксин, В.В. Кирдяшкин, P.P. Азизов, Н.В. Елькин // Хранение и переработка с/х сырья. 2008. - №8 - С. 76-78.

131. Филин, В.М. Шелушение зерна крупяных культур. Совершенствование технологического оборудования / В.М. Филин, Д.В. Филин. М. : ДеЛи принт, 2002.- 135 с.

132. Филиппович, Ю.Б. Практикум по общей биохимии / Ю.Б. Филиппович -М. : Просвещение, 1982.-311с.

133. Форгати, В.М. Микробные ферменты и биотехнология / В.М. Форгати. -М. : Агропромиздат, 1986.-317 с.

134. Фрайфелдер, Д. Физическая биохимия / Д. Фрайфелдер М. : Мир, 1980.-С. 187-188.

135. Цадзикидзе, П.Ш. Эффективность использования различных доз дрожжеванного глютена при откорме свиней : автореф. дис. . канд. с/х наук / П.Ш. Цадзикидзе. — Тбилиси, 1987. 23 с.

136. Чилёва-Филатова, JI.B. Интенсификация процессов в роторных аппаратах / JI.B. Чилёва-Филатова // Хранение и переработка с/х сырья. — 2006. -№ 1.-С. 53-55.

137. Шарова, Н.Ю. Амилолитические ферменты гриба Aspergillus niger: выделение и свойства / Н.Ю. Шарова. // Хранение и переработка сельхозсырья. 2006. - № 3. - С. 42.

138. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха. М. : Высшая школа, 2003. - 709 с.

139. Шилина, Н.М. Безглютеновая диета: проблемы лабораторного контроля / Н.М. Шилина, А.А. Милюкова, И.А. Смирнов, И.Я. Конь // Вопросы детской диетологии. 2005. - № 3.

140. Широков, Е.П. Хранение и переработка продукции растениеводства с основами стандартизации и сертификации / Е.П. Широков, В.И. Полетаев. -М. -.Колос, 1999.-253 с.

141. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. М. : Мир, 1987.566 с.

142. Яковича, В.Т. Применение пшеничных отрубей в процессе биосинтеза L-лизина / В.Т. Яковича, Э.В. Каминска, Г.Р. Межиня // Селекция и культивирование продуцентов аминокислот и ферментов. Рига : Зинатне, 1979.-С. 36-43.

143. Яровенко, В.Л. Технология спирта / В.Л. Яровенко. М. : Колос, 1999. -464 с.

144. Bridson, E.Y. Methods in microbiology. Design and formulation of microbal culture media / E.Y Bridson, A.B. Brecker. New York : Academic Press, 1970. -P. 229-295.

145. Bushuk, W. Wheat proteins: aspects of structure that determine breadmaking quality. In: Phillips RD, Finley JW (eds) Protein quality and the effects of processing / W. Bushuk, F. Mac Ritchie. Marcel Dekker, New York Basel, 1995. -P. 345-369.

146. Codex Standard fur glutenfreie Lebensmittel, Stufe 3 2. Consensus paper . Codex alimentarius-proposal for gluten-free foods CX FSDU 98. P.4.

147. Eder, J. Pro-sequence-assisted protein folding / J. Eder, A. R. Fersht // Mol. Microbiol., 1995. N16 - P.609-614.

148. Gupta RB, Paul JG, Cornish GB, Palmer GA, Bekes F, Rathjen AJ1994) Allelic variation at the glutenin subunit and gliadinloci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1, of common wheats. I. Its additiveand interaction effects on dough properties. J Cereal Sci 19:9-17.

149. Gupta, R.B. Allelic variation at the glutenin subunit and gliadin loci / R.B. Gupta, F. MacRitchie, Glu-1, Glu-3 and Gli-1, of commonwheats. II. Biochemical basis of the allelic effects on dough properties. J Cereal Sci. 1994. - P. 12-29.

150. Hartree, EF. Anal Biochem / EF Hartree 1972. - 48: 422-427.

151. Marc J. van der Maarel Yoost Vitdehaag et al. Propeties and applications of starch-converting enzymes of the a-amylase family. / Marc J. van der Maarel, Bart van der Veen // J. Biotechnol. 2002. -N 94. - P. 137-155.

152. Metakovsky EV (1991) Gliadin allele identification in common wheat. II. Catalogue of gliadin alleles in common wheat. J Genet Breed 45:325—344.

153. Nieto-Taladriz M.T. Effect of gliadin and HMW and LMW subunits of glutenin on dough properties in the F6 recombinant inbred lines from a bread wheat cross. Nieto-Taladriz MT, Perretant MR, Rousset M // Biochem. Acta. -1994.-vol. 88-P. 81-88.

154. Oostra, G.M. Anal. Biochem. / G.M. Oostra N.S. Mathewson G.N. Catravas. 1978.-89 P. 31.

155. Patent 5290749 US, Preemergence weed control using plant protein hydrolysate, Christians NE, Garbutt JT, Liu DL-Y; 1993

156. Payne PI. Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on breadmaking quality / Payne PI // Annu Rev Plant Physiol. 1987 - P. 141-153

157. Pittman, K.A. Oligopeptide uptake by Bacteroides ruminicola / K.A. Pittman, S. Laksmanan, M.R. Bryant, J. Bact. 1967. - v.93- P.l499-1508.

158. Pogna NE, Mellini F, Beretta A, Dal Belin Peruffo A. The high-molecular-weight glutenin subunits of common wheat cultivars grown in Italy. J Genet Breed, 1989-P. 17-24

159. Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology / CM Stoscheck- 1990 182: P. 50-69.

160. Sussman, A.J. Peptide transport and metabolism in bacteria. Ann. Rew. Biochem. / A.J. Sussman, C. Gilvard. 1971- v.40 - P. 397-408.

161. Vaccino P, Metakovsky EV RFLP patterns of gliadin alleles in Triticum aestivum L.: implications for analysis of the organization and evolution of complex loci. Theor Appl Genet, 1995 P. 173-181