Разработка системы генетической трансформации ряски малой (Lemna minor L.)

Гайдукова, Софья Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка системы генетической трансформации ряски малой (Lemna minor L.)
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы генетической трансформации ряски малой (Lemna minor L.)"

ГАЙДУКОВА Софья Евгеньевна

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РЯСКИ МАЛОЙ (LEMNA MINOR L.)

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.03 - молекулярная биология

4854651

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2011

2 4 ОЕЗ?

4854651

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН

Научные руководители: Доктор биологических наук

Равин Николай Викторович

Кандидат биологических наук Камионская Анастасия Михайловна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Соловьев Александр Александрович

Кандидат биологических наук Фадеев Виталий Сергеевич

Ведущая организация: Институт Цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится "С?/" 1 года в Я*

часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49 Ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева *

Автореферат разослан Ялы 2011 года, и размещен на

сайте Университета www.timacad.ru '

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.С. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Одним из наиболее ярких и убедительных достижений современной биотехнологии стало создание и бурное развитие новой области мировой экономики — биофармацевтической промышленности и промышленности биоматериалов, направленной на производство принципиально нового класса лекарств — рекомбинантных белков медицинского назначения и уникальных материалов.

Различные интерфероны, эритпропоэтины, факторы роста, антитела, вакцинные белки, промышленные ферменты, доступные ранее лишь в аналитических количествах, входят теперь в перечень жизненно-важных медицинских препаратов, производятся в объемах до нескольких тонн в год, и прочно вошли в повседневную практику современной медицины, пищевой и фармацевтической промышленности (Higo К. et al., 1993; Zhu Z. et al., 1994; Matsumoto S. et al., 1995).

Одним из перспективных направлений биотехнологии в настоящее время является создание растений - биореакторов, способных продуцировать рекомбинантные белки. Системы, производящие подобные белки, на основе растений могут быть безопасной и экономически конкурентоспособной альтернативой традиционным системам экспрессии, - культурам клеток микроорганизмов и животных. Так в отличие от бактериальных систем, в растениях возможно осуществление посттрансляционных модификаций, которые в ряде случаев являются необходимым этапом получения функционального белка (TerashimaM. et al., 1999). Кроме того, получение рекомбинантных белков в системах на основе растительных клеток являются более безопасными в виду отсутствия рисков переноса инфекционных заболеваний, поскольку растения и человек не имеют общих патогенов (SchellerJ. et al., 2004). Это является значительным преимуществом перед системами экспрессии на основе культур клеток млекопитающих.

Lemna minor (ряска малая) - однодольное покрытосеменное растение семейства Рясковые. Благодаря своей способности к быстрому, причем вегетативному размножению, позволяющему увеличивать биомассу вдвое за 36 часов и высокой доли белка в биомассе, ряска представляет интерес как потенциальная биофабрика для производства рекомбинантных белков, таких как вакцинные белки, сывороточный альбумин, гемоглобин и коллаген и др (Stomp А.М., 2005).

Растения Lemna можно выращивать в асептически закрытых емкостях с контролируемыми условиями культивирования. Для роста растениям

необходимы лишь вода, неорганические питательные вещества и СО2. (Edelman М. et al., 1998).

Таким образом, искусственная и полностью закрытая среда культивирования в сочетании с быстрым ростом, высоким содержанием белка в биомассе и преимущественно вегетативным способом размножением делают такую систему уникальной и легко контролируемой. Следовательно, система экспрессии, созданная на основе Lemna, обладает огромным потенциалом и преимуществами перед существующими системами экспрессии в связи с тем, что представляет собой новый тип эукариотической растительной высокопродуктивной системы для получения рекомбинантных белков.

Создание такой системы экспрессии возможно только с использованием методов генетической инженерии, которые для Lemna minor до сих пор остаются малоэффективными и трудоёмкими.

Все сказанное выше показывает актуальность разработки системы генетической трансформации растений ряски малой с целью создания растений-продуцентов рекомбинантных белков.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение' регенерационной и трансформационной способности растений ряски малой (Lemna minor) и разработка эффективной системы генетической трансформации. Применение данной системы позволит создать трансгенные растения ряски, экспрессирукицие рекомбинантные белки медицинского назначения.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Определить оптимальную комбинацию регуляторов роста растений и тип экспланта с целью получения регенерации с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации.

2. Подобрать условия эффективного селективного отбора трансформированной ткани.

3. Оптимизировать параметры проведения агробактериальной трансформации растений ряски малой.

4. Получить трансгенные растения ряски малой, несущие ген bar.

5. Провести молекулярный анализ полученных растений.

Научная новизна. Подобраны условия для культивирования, индукции каллусообразования и регенерации растений из каллуса для популяции Lemna minor, распространенной в водоемах Московской области. Показано, что наиболее эффективный эксплант для каллусообразования — целый интактный листец.

На основе подобранных условий была разработана система генетической трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens.

Получены трансгенные растения ряски со стабильной экспрессией гетерологичного гена bar.

Практическая значимость полученных результатов. Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений Lemna minor с генами, кодирующими терапевтически ценные белки.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 10-ой и 11-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2006, Пущино, 2007); на Российско-польском симпозиуме (Москва, 2008); на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на Международной конференции «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2008); на молодежном симпозиуме V-го Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано одиннадцать печатных работ, в том числе одна статья в ведущем рецензируемом научном журнале.

Структура и объем работы. Диссертация включает: введение; обзор литературы; описание материалов и методов исследования; результаты и их обсуждение; выводы; список литературы.

Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 14 рисунков и 201 библиографических ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для работы служили растения Lemna minor, собранные в водоемах Московской области. Растительный материал культивировали на питательных средах: Мурасиге и Скуг, Хоагланд, Шенк и Хилдебрандт, Гамборг (MurashigeT. et al., 1962; HoaglandD.R. et al., 1938; Schenk R.U. et al., 1972; Gamborg O.L. et al., 1968).

Для трансформации растений ряски использовали штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 (Helens R. et al., 2000), содержащий бинарный вектор pBar UBI. Этот вектор содержит в пределах Т-ДНК области под контролем промотора pUbil (Christensen А. et al.,1996) кукурузы ген bar (Падегимас Л. и др., 1993), обуславливающий устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина (рисунок 1).

LB Tnos BAR intron Pubi RB

к.:<з==с=д

1 i

Pstl Pstl, BamHI

Рисунок 1 — Структура т-ДНК-вектора, использованного для получения трансгенных растений ряски

В опытах по транзиетной экспрессии использовали супервирулентный штамм ЕНА105 (HoodE., 1993), содержащий векторную конструкцию pGFP (Фолимонов A.C.). Данная конструкция содержит маркерный ген gfp, находящийся под контролем 35S промотора и NOS-терминатора

В качестве эксплантов для трансформации использовали фрагменты морфогенного каллуса. Экспланты инкубировали с разведенной культурой A. tumefaciens в течение 10, 20 или 30 минут, затем переносили на стерильную фильтровальную бумагу и далее — на чашки Петри со средой Хогланд с ацетосирингоном (200 цМ) для со-культивации. Инокуляцию эксплантов с полученной агробактериальной культурой проводили в жидкой питательной среде AB, разбавленной средой MS в соотношении 1:4 с добавлением целлита (для увеличения количества поранений на единицу площади экспланта) при постоянном помешивании 160 об/мин, в течение 10, 20, 30 мин. Затем экспланты подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и перекладывали на твердую среду. Co-культивацию проводили на агаризованной среде Хоагланд в течение 3 суток в темноте.

Интеграцию гетерологичных последовательностей в геном ряски малой определяли методом ПЦР. Наличие экспрессии гена bar (фосфинотрицин-ацетил-трансфераза - ФАТ) определяли с помощью Trait LL Lateral Flow Test Kit (Strategic Diagnostics Inc.). Для проведения Саузерн блот-гибридизации (Southern, 1975) использовали одноцепочечный меченый [а-32Р] АТР зонд.

Статистическую обработку данных проводили с использованием методики подсчета стандартного отклонения и доверительного интервала (ДИ) с заданным значением достоверности 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Получение асептического материала. Наличие асептического растительного материала является необходимым условием для проведения экспериментов in vitro. Уже на первых этапах нашей работы мы столкнулись с трудностью обеззараживания растительного материала, так как используемые нами растения ряски, взятые из природных условий Московской области, были сильно загрязнены. При помещении таких растений на стерильную питательную среду наблюдали стремительный рост бактериальной и грибной

инфекций. В основе же приведенных методик асептической обработки растений и эксплантов ряски лежит использование различных концентраций гипохлорита натрия (С1огох, Ригех и др.) (НиеЬеП Б.У. ег а1.,1990). Нами были протестированы 4 варианта сочетаний и экспозиций стерилизующих агентов на предмет пригодности их для получения асептических растений ряски.

Максимальный выход асептических растений наблюдали при использовании композиции 4% гипохлорит натрия в течение 4 минуты и 70% этанол в течение 30 секунд. При обеззараживании данным способом выход асептических растений, составил в среднем 65-70%. Применение дополнительных пассажей с использованием противогрибковых компонентов (фунгицид «Топаз») или замена гипохлорита натрия на 0,002%-ый раствора мирамистина оказались неэффективными, выход асептических растений не превышал 40%. Применение предварительного культивирования листецов (за несколько дней до проведения процедуры асептизации) на минеральной питательной среде с минимальным содержанием органических веществ (лишь 0,2% сахарозы), в результате чего может быть замедлен рост микроорганизмов (НШтап \У.8. е1 а1., 1961) оказался неэффективным. На второй день после помещения растений на минеральную среду наблюдали развитие бактериальной и/или грибной инфекции, препятствующие дальнейшему росту растений.

Таблица 1 - Результаты опыта по определению оптимального варианта

обеззараживания исходного растительного материала

№ Число растений, шт. Число обеззараженных растений, шт. % обеззараженных растений

1 25x4 5,5±1,3 22,0±5,1

2 25*4 8,3±1,5 33,0±5,9

3 25x4 17,0±0,8 68,0±3,2

4 25x4 4,5±0,6 18,0±2,3

Необходимо отметить, что не все обеззараженные растения сохраняли жизнеспособность и способность к размножению. Это вероятно связано с высокой степенью чувствительности клеток эпидермального слоя ряски к различным видам стерилизующих агентов (таблица 2).

Таблица 2 - Жизнеспособность асептизированных растений

№ Число обеззараженных растений, давших потомство, шт. % обеззараженных растений, давших потомство

1 1,3±0,5 5,0±2,0

2 3,0±5,8 12,0±3,2

3 12,Ш,9 51,0±3,8

4 1,8±0,9 7,0±3,8

Таким образом, вариант стерилизации растений ряски в 4%-ном гипохлорите натрия (4 мин) и в 70%-ном спирте (30 с) оказался наиболее эффективным, так как при этом наблюдали более высокий выход обеззараженных и жизнеспособных растений, чем при использовании других композиций. Полученные обеззараженные растения были введены в культуру ш vitro и использованы в экспериментах по оптимизации параметров регенерации и трансформации.

Подбор состава питательной среды для культивирования. Эффективность проведения экспериментов in vitro зависит от подобранных условий, в том числе от используемого типа питательной среды. Были протестированы питательные среды - Мурасиге и Скуг, Гамборг, Шенк и Хилдебрандт, Хоагланд для выявления наиболее оптимального типа среды, позволяющего получать наибольший коэффициент размножения растений, который можно будет использовать в трансформационном процессе. Количественный учет вновь образующихся растений был крайне затруднён из-за высокой скорости их размножения, поэтому критерием для выбора оптимальной среды служила кратность увеличения массы растений. Через 2 недели культивирования наблюдали увеличение биомассы растений в среднем в 3 раза на средах Мурасиге и Скуг (МС), Шенк и Хилдебрандт, Гамборг и в 5 раз на среде Хоагланд (таблица 3).

Таблица 3 - Результаты опыта по подбору оптимальной питательной среды для культивирования листецов ряски__

Тип среды Исходный вес Вес растительного Коэффициент

растительного материала через 2 размножения

материала, мг недели, мг

Гамборг 75 247,5±18,0 3,30±0,24

Мурасиге и Скуг 75 253,5±12,8 3,38±0,17

Шенк и 75 211,5±13,5 2,82±0,18

Хилдебрандт

Хоагланд 75 381,0±17,3 5,08±0,23

* - отношение массы растительного материала через 14 дней культивирования к исходной массе материала.

Таким образом, наибольший коэффициент размножения растений ряски был отмечен на среде Хоагланд, состав которой отличался самым низким содержанием микро- и макроэлементов из всех тестируемых типов сред. Полученные результаты, вероятно, связаны с тем, что ряске как водному растению, привыкшему к минимальному содержанию питательных веществ в водной среде обитания, наиболее подходит среда с невысокими

концентрациями солей. В дальнейшей работе все эксперименты проводили с использованием среды Хоагланд.

Определение оптимальных концентраций селективных агентов.

Известно, что эффективность генетической трансформации растений зависит от возможности осуществления конечного этапа — получения из клеток и тканей полноценных растений. Однако сам процесс трансформации и последующее продолжительное культивирование трансгенных многоклеточных тканей в условиях клеточной селекции значительно снижает морфогенную способность клеток. Поиск оптимальной концентрации селективного агента, которая позволит избежать появления химерных растений и в то же время не будет отрицательной влиять на последующий морфогенез, является важнейшим этапом получения трансгенных растений.

Чтобы в дальнейшем иметь возможность расширить спектр использования генетических конструкций, мы использовали различные селективные агенты и определяли их рабочие концентрации.

В качестве эксплантов в опытах использовали целые интактные растения (листецы), так как в случае использования для этой цели фрагментов каллуса, статистический анализ результатов был бы затруднен.

Рисунок 2 - Листецы ряски малой на среде содержащей 8 мг/л фосцинотрицина (слева) и без селективного агента (справа) через 6 недель культивирования

Рисунок 3 - Листецы ряски малой на среде, содержащей 100 мг/л канамицина (слева), и без селективного агента (справа) через 6 недель культивирования

гиалиновая нить

Рисунок 4 - Транзиентная экспрессия гена gfp экспланта целого (слева) и половины листеца

на 3 сутки при использовании в качестве

:новой нити

через 3

недели от начала...,_________г.........

Рисунок 6 - Морфогенный каллус Lemna minor Рисунок 7 - Смесь каллусных культур (12 недель с момента индукции)

Рисунок 8 - Регенерация листецов из каллуса Рисунок 9 - Транзиентная экспрессия

маркерного гена фрагментов каллуса

Различия в действии селективных агентов проявлялись в этиолировании листецов, замедлении темпа их пролиферации и уменьшении размеров дочерних листецов (рисунок 2,3).

Учет погибших и выживших растений проводили каждые 2 недели. Оптимальными концентрациями были признаны те концентрации, при использовании которых наблюдали 100% гибель листецов в течение исследуемого периода (таблица 4).

Таблица 4 Результаты опытов по определению рабочей концентрации

селективных агентов

Селективный агент Концентрация (мг/л) % погибших растений

2 недели селекции 4 недели селекции 6 недель селекции

Глифосат ^1у) 2,0 20,0±5,5 25,0±3,3 58,0±3,4

4,0 32,0±5,5 46,0±8,0 69,0±3,3

8,0 42,0±2,3 67,0±3,3 79,0±4,3

16,0 47,0±3,8 76,0±2,8 100

Гигромицин (Ьу§) 0,2 16,8±3,7 32,0±2,0 67,0±3,3

0,5 27,8±4,6 47,1±2,2 79,0±3,3

1,0 47,1 ±2,2 63,2±2,2 86,0±2,0

2,0 52,9±2,2 76,1±2,2 100

4,0 64,1±1,9 94,2±2,8 100

8,0 72,1±2,0 100 100

Канамицин (кш) 50 34,0±2,0 53,0±3,8 81,0±3,8

100 44,0±2,8 70,0±2,3 100

200 73,3±3,3 100 100

Фосфинотрицин (РРО 0,5 0 25,0±3,8 51,0±3,8

1,0 0 33,0±2,0 61,0±3,8

2,0 0 41,0±3,8 74,0±2,3

4,0 32,0±3,2 48,0±3,2 87,0±2,0

8,0 49,0±3,8 73,0±2,0 100

Таким образом, были определены рабочие концентрации селективных агентов - 16 мг/л глифосата, 2 мг/л гигромицина, 100 мг/л канамицина и 8 мг/л фосфинотрицина. Полученные результаты по определению рабочих концентраций для различных селективных агентов были успешно применены и при работе с фрагментами каллуса.

Определение оптимального типа экспланта для агробактериальной трансформации на основе транзиентной экспрессии маркерного гена. Для подбора оптимальных параметров агробактериальной трансформации ряски был использован вектор, содержащий репортерный ген ^р, экспрессию

которого легко детектировать в трансформированных тканях. Автофлюоресценция клеток ряски нами не была выявлена, что делало возможным использование данного гена для оптимизации параметров трансформации.

Для трансформации использовали штамм A. tumefaciens ЕНА105 и экспланты двух типов — листецы с поранением в меристематической зоне и половинки листецов, так как предполагалось получить регенераты за счет прямого соматического эмбриогенеза миную каллусную культуру. Оценку наличия/отсутствия экспрессии маркерного гена проводили через 3 суток после окончания со-культивации. При этом наблюдали единичные точки свечения обоих типов эксплантов (рисунок 4), что подтверждает возможность агробактериальной трансформации ряски, однако ее эффективность была крайне низкой. К тому же, регенерация происходила не из светящихся клеток.

Компетентность к трансформации культуры in vitro растений Lemna minor была подтверждена детекцией транзиентной экспрессии гена gfp (рисунок 4).

В первой серии опытов по трансформации конструкцией pBarUBI в качестве эксплантов использовали также как и в опытах с маркерным геном gfp листецы или их половинки. Однако трансгенных растений получить не удалось, несмотря на происходящую регенерацию, что, по всей видимости, связано с низкой частотой переноса Т-ДНК из агробактерии в клетки меристемы. В связи с чем, в дальнейшем было решено использовать в качестве экспланта для трансформации каллус.

Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и регуляторов роста растений на процесс каллусообразования. Индукция каллусообразования и регенерация растений является генотип-зависимым процессом, но также зависит и от взаимодействия различных факторов, в том числе от состава питательной среды, типа экспланта и различных типов и концентраций регуляторов роста растений. Имеются сведения о влиянии условий культивирования на эффективность каллусообразования. Стефаниак и коллеги пришли к выводу, что повышенная температура (25°С) и темнота стимулируют процесс каллусообразования (StefaniakB. et al., 2002). Однако Фрик с соавторами получал каллус у L. minor при непрерывном освещении (FrickH. et al., 1994). По мнению Мун и Стомп свет - необходимый фактор формирования каллуса у L. gibba, несмотря на то, что в экспериментах лишь 10% эксплантов формировали каллус (MoonH.K. et al., 1997). Преимущество повышенных температур (25-28°С) для индукции каллуса у L. gibba также продемонстрировали Чанг и Чиу (Chang W.C. et al., 1976). В своих экспериментах по индукции каллусообразования мы тестировали интервал температур от 18°С до 27°С и различные условия освещения. В наших опытах

при отсутствии освещения наблюдалась гибель всех эксплантов. Оптимальными условиями были определены 22-25°С и фотопериод 16 ч день/8 ч ночь.

Так как ряска - одно из редуцированных покрытосеменных растений, выбор экспланта для получения каллуса довольно ограничен. По мнению Стефаниака нанесение поранения листецам необходимо для индукции каллуса у L. minor и приводит к высокому уровню формирования каллуса до 89,11% (StefaniakB. etal., 2002).

Для определения типа экспланта, наиболее компетентного к каллусообразованию, использовали: целое интактное растение, половинки листецов и разрезанные вдоль либо поперек центральной жилки (вдоль или поперек не имеет значения, так как важным фактором является повреждение меристематической зоны) листецы с поранением в меристематической зоне. Для каждого типа экспланта определяли оптимальную комбинацию ростовых регуляторов с целью получения наибольшей частоты каллусообразования.

На основе анализа литературных данных (EdelmanM. et al., 2003; Li J. et al., 2004; MoonH.K. et al., 1997) была разработана схема эксперимента, содержащая девять комбинаций наиболее эффективных для индукции образования каллуса регуляторов роста — 2,4-D и ВАР (таблица 5). Во всех вариантах была использована среда Хоагланд и три типа эксплантов.

Во всех вариантах через четыре недели культивирования вегетативное размножение прекращалось и начиналось формирование каллуса. При этом наблюдалось видоизменение листецов, которое проявлялось в увеличении их размера, изменении формы и цвета. Гиалиновая нить, связывающая дочерние растения с материнским, заметно увеличивалась в размерах через 2-3 недели, что являлось одним из визуальных критериев начала формирования каллусной ткани (рисунок 5), собственно образование каллуса наблюдалось через 1112 недель от начала культивирования.

При использовании всех типов эксплантов наблюдали образование каллуса (рисунок 6) с частотой от 12% до 83% (таблица 5). В основном образовывалась смесь каллусных культур, состоящая из образований белого неморфогенного и зеленого морфогенного каллусов (рисунок 7).

Каллусообразование морфогенного каллуса с наибольшей частотой (83%) происходило в варианте №5, при добавлении в питательную среду 2 мг/л БАП и 20мг/л 2,4-Д и при использовании в качестве экспланта целого интактного растения.

Таблица 5 Результаты эксперимента по изучению влияния состава среды и типа экспланта на эффективность каллусообразования_

Варианты опыта* Кол-во эксплантов (%), образующих каллус

целое интактное растение (листец) листец с поранением в меристематической области половинки листецов

10 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л БАП 66,0±5,1 54,0±2,3 32,0±2,0

10 мг/л 2,4-Д, 2 мг/л БАП 74,0±3,9 59,0±3,8 39,0±1,1

10 мг/л 2,4-Д, 3 мг/л БАП 54,0±2,3 45,0±2,0 21,0±1,3

20 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л БАП 69,0±4,9 60,0±3,2 32,0±2,0

20 мг/л 2,4-Д, 2 мг/л БАП 81,0±2,0 73,0±3,8 55,1±2,2

20 мг/л 2,4-Д, 3 мг/л БАП 48,0±3,2 42,0±2,3 25,0±2,5

30 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л БАП 68,0±4,5 55,5±2,0 32,0±2,0

30 мг/л 2,4-Д, 2 мг/л БАП 76,0±3,2 61,0±3,8 35,9±3,3

30 мг/л 2,4-Д, 3 мг/л БАП 50,0±2,3 42,0±1,6 14,4±2,4

Среди тестируемых эксплантов наиболее предпочтительно использование целых интактных растений.

Регенерация листецов из морфогенного каллуса. Для регенерации однодольных растений из каллуса используют различные среды, как с регуляторами роста растений, так и без них. Выбор зависит от генотипа растения и состава среды, используемого для каллусообразования. Мун и Стомп получили регенерацию растений L. gibba из каллуса на безгормональной среде (Moon Н.К. et al., 1997). Поскольку для индукции каллусообразования мы использовали среду с достаточно высоким содержанием регуляторов роста растений, для получения растений-регенерантов фрагменты каллуса поместили на среду без регуляторов роста растений. Через неделю после переноса каллуса ряски на безгормональную среду наблюдали начало регенерации многочисленных листецов (рисунок 8). На каждом фрагменте каллуса образовывалось от 2 до 8 растений.

Растения ряски, полученные нами через непрямой органогенез, не отличались по морфологическим характеристикам (цвет и размер) от контрольных растений.

Определение оптимальных параметров агробактериалыюн трансформации фрагментов каллуса на основе транзиентной экспрессии маркерных генов. Во время проведения экспериментов по трансформации фрагментов каллуса были протестированы следующие параметры агробактериалыюй трансформации: 1) влияние продолжительности пре-культивации (промежуток времени от момента поранения экспланта до инокуляции с агробактерией); 2) продолжительность инокуляции; 3) время со-культивации с агробактерией.

Таблица 6 Влияние типа экспланта, продолжительности инокуляции и со-культивации на частоту экспрессии __

Пре-культивация эксплантов Продолжительность инокуляции, мин Продолжительность со-культивации, сутки Частота транзиентной экспрессии,%

Без пре-культивации 10 2 7,0±3,8

3 7,0±4,9

4 18,0±5,1

20 2 35,0±3,8

3 43,0±8,7

4 35,0±10,3

30 2 агробактериальный зароет

Пре-культивация 24 часа 10 2 9,0±2,0

3 23,0±9,8

4 21,0±10,3

20 2 46,0±10,4

3 40,0±3,2

4 39,0±9,8

30 2 агробактериальный зароет

В данном эксперименте эффективность трансформации мы считали по частоте транзиентной экспрессии маркерного гена.

В результате экспериментов были определены оптимальные параметры для трансформации эксплантов ряски (таблица 6). Было показано, что нет

необходимости в проведении стадии пре-культивации, так как нет существенных различий в эффективности трансформации независимо от длительности инокуляции.

Была определена оптимальная продолжительность инокуляции, которая составила 20 мин (эффективность трансформации 24,7-56,4%), в то время как, при продолжительности 10 мин. эффективность варьировала от 3,2 до 31,3%, а при 30 минутах наблюдалась гибель эксплантов от агробактериального заражения. Наибольшая эффективность трансформации 51,7 % и 56,4% достигается при продолжительности со-культивации эксплантов с агробактерией в течении 3 суток и 2 суток соответственно (рисунок 9). Однако во втором случае предшествует стадия пре-культивации длящаяся сутки, что нивелирует различия в продолжительности протокола трансформации. Таким образом, разработанный протокол трансформации включает в себя собственно инокуляцию 20 минут и со-культивацию 3 суток.

Получение трансгенных растений с геном bar. Далее по разработанному протоколу были проведены эксперименты по трансформации каллуса Lemna minor конструкцией, несущей ген bar. В результате проведения опытов по трансформации, из первоначально взятых в каллусообразование 100 листецов, было получено 27 фосфинотрицин-устойчивых растений.

Устойчивые растения анализировали методом ПЦР на присутствие/отсутствие гена баг (рисунок 10). В результате анализа было показано наличие искомого гена в геноме 13 растений ряски.

Рисунок 10 - Электрофоретический анализ результатов ПЦР в 1%-м агарозном геле. 1 - маркер молекулярной массы (GeneRuler™ DNA Ladder Mix, Fermentas); 2 - ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы; 3 - в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из не трансформированного растения; 4-17 -ДНК регенерантов ряски; 18 - ДНК плазмиды pBar UBI

Полученный результат можно объяснить химерностью полученных растений, т.е. часть нетрансгенных клеток и тканей выживала за счет трансгенных, что можно объяснить диффузией фермента ФАТ.

контрольная полоса

тестовая полоса

Рисунок 11 - Анализ экспрессии гена bar фермента фосфинотрицин-1Ч-ацетил трансферазы (pat) с помощью TRAIT LL Lateral Flow Test kit. 1 - контрольное (^трансформированное) растение; 2-4 - трансформированные растения (наличие 1-ой контрольной полосы свидетельствует о корректном прохождении анализа, наличие 2 -ой тестовой полосы свидетельствует об экспрессии гена bar)

Экспрессия гетерологичного гена была подтверждена при помощи экспресс-системы Lateral Flow Test (рисунок 11) в 12 из 13 ПЦР-положительных растений. Мониторинг наличия и экспрессии гена bar в поколениях при вегетативном размножении полученных трансгенных растений показал стабильное наследование целевого гена.

А. В.

Рисунок 12. Схема Т-ДНК вектора и результаты Саузерн блот анализа. А -Структура Т-ДНК-вектора, использованного для получения трансгенных растений ряски. LB и RB - левая и правая границы Т-ДНК, соответственно; Pubi - промотор Ubil гена кукурузы; BAR - ген фосфинотрицинацетилтрансферазы из Streptomyces hygroscopicus\ Tnos - терминатор гена нопалинсинтазы; Intron -интрон Ubil гена кукурузы; PstI, BamHI - места узнавания эндонуклеаз рестрикции. Положение фрагмента, использованного для синтеза зонда,

указано черным прямоугольником. В - Результаты Саузерн блот анализа. 1-маркер молекулярного веса GeneRuler DNA Laders (Fermentas); 2 - ДНК контрольного растения, обработанная BamHI, 3 - ДНК трансгенного растения, обработанная BamHI, 4 - ДНК контрольного растения, обработанная Pstl, 5 -ДНК трансгенного растения, обработанная Pstl

Одно из полученных растений (№ 3) было проанализировано с помощью Саузерн-блоттинга. Полученные результаты (рисунок 12В) подтверждают факт интеграции целевого гена bar в геном L. minor, в проанализированном растении имеется две копии трансгенной вставки.

выводы

1. Определены оптимальные условия получения каллуса — питательная среда Хоагланд, комбинация регуляторов роста: 2,4-Д в концентрации 20 мг/л и БАП в концентрации 2 мг/л.

2. Определены рабочие концентрации четырех селективных агентов для отбора трансформированной ткани растений Lemna minor: фосфинотрицин - 8 мг/л, глифосат - 16 мг/л, канамицин - 100 мг/л, гигромицин 2 мг/л; продолжительность селективного отбора не менее 6 недель.

3. Показано, что оптимальным типом экспланта для проведения агробактериальной трансформации Lemna minor является каллус.

4. Показано, что наибольшая частота транзиентной эспрессии гена gfp (46,0±10,4%) достигается при продолжительности инокуляции эксплантов с агробактерией в течение 20 минут. Эффективность трансформации на уровне 43,0 ±8,7% была отмечена при продолжительности со-культивации фрагментов каллуса с агробактерией в течение 3 суток.

5. Используя разработанный протокол трансформации каллуса Lemna minor конструкцией, несущей ген bar, было получено 13 трансгенных растений. В ходе молекулярного анализа (ПЦР) был подтвержден трансгенный статус данных растений и экспрессия гетерологичного гена в 12 из них.

6. Определено количество копий гена bar в геноме трансгенного растения Lemna minor №3. Показано встраивание двух копий гена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гайдукова С.Е., РакитинА.Л., РавинН.В., Скрябин К.Г., Камионская A.M. Разработка системы генетической трансформации ряски малой Lemna minor. Экологическая генетика, 2008, том VI, выпуск 4, с. 20-28.

2. Гайдукова С.Е., Белоусова М.Б., Камионская A.M., Скрябин К.Г. Изучение регенеративной способности водных однодольных растений на примере Lemna minor. Материалы Третьего Московского международного конгресса «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы». Москва, 2005. С. 240-241.

3. Гайдукова С.Е., Камионская A.M. Изучение регенеративной способности ряски малой Lemna minor. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2006. С. 362-363.

4. Гайдукова С.Е., Камионская A.M. Разработка системы генетической трансформации ряски, Lemna minor. Материалы четвертого

съезда Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино, 2006. С. 51.

5. Гайдукова С.Е. Агробактериальная трансформация ряски малой, Lemna minor. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2007. С. 189.

6. Гайдукова С.Е., A.M. Камионская, К.Г. Скрябин. Разработка системы генной трансформации ряски, Lemna minor. Четвертый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы». Москва, 2007. С. 226.

7. Гайдукова С.Е., Камионская A.M. (2007) Разработка системы генной трансформации ряски, Lemna minor. VII Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2007. С. 15-16.

8. Гайдукова С.Е. Оптимизация параметров генетической трансформации растений ряски малой Lemna minor. Пятый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы». Москва, 2009. С. 312-313.

9. Гайдукова С.Е. Трансгенные растения ряски малой — биофабрики для производства лекарств. Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород, 2008. С. 88-89.

10. Гайдукова С.Е. Оптимизация протокола генетической трансформации растений ряски малой, Lemna minor. Международная конференция «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». Звенигород, 2008. С. 14.

11. Гайдукова С.Е. Оптимизация параметров генетической трансформации растений ряски малой, Lemna minor. V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 2009. Часть II. С. 368.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60x84'/ Усл.печ.л. 1,16. Тираж 100 экз. Зак. 58.

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москяа, Тимирязевская ул., 44 Тел.: 977-00- : 2,977-26-90,977-40-64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гайдукова, Софья Евгеньевна

Оглавление

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рясковые

1.1.1 Систематика, эволюция и географическое распространение

1.1.2 Ботаническое описание и особенности строения

1.1.3 Размер генома и генетический анализ

1.1.4 Биохимия и молекулярная биология

1.1.5 Возможности использования растений ряски для научных и коммерческих целей

1.2 Генетическая инженерия растений ряски

1.2.1 Виды растений Lemnaceae, используемые в культуре клеток

1.2.2 Типы эксплантов, используемые для каллусообразования и регенерации

1.2.3 Среды и условия для индукции каллусообразования и регенерации

1.2.4 Другие факторы, влияющие на регенерацию и каллусообразование

1.2.5 Пре-культивация

1.2.6 Поранение экспланта

1.2.7 Морфология листецов и каллуса

1.2.8 Генетическая инженерия

1.2.9 Воспроизводимость опытов

1.3 Растения — биофабрики: производство фармацевтических рекомбинантных белков.

1.3.1 Метаболическая инженерия растений

1.3.2 Создание растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами

1.3.3 Конструирование трансгенных растений — продуцентов целевых белков

1.3.4 Рекомбинантные белки, экспрессируемые в растениях

1.3.5 Экспрессия рекомбинантных антител в трансгенных растениях

1.3.6 Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях

1.3.7 Продукты молекулярного биофарминга

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Растительный материал

2.2 Методы ведения культуры ряски in vitro

2.2.1 Среды, использованные в работе для поддержания растений культуры in vitro и трансформационного процесса

2.2.2 Состав и методика приготовления компонентов питательных сред

2.2.3 Получение асептической культуры ряски

2.2.4 Индукция каллусообразования

2.2.5 Индукция регенерации растений из каллуса

2.3 Культура агробактерии

2.3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды

2.3.2 Состав и способ приготовления среды для агробактериальных штаммов

2.3.3 Подготовка агробактериальной культуры к трансформации

2.4 Трансформация и селективный отбор растений

2.4.1 Co-культивация эксплантов с Agrobacterium tumefciciens

2.4.2 Определение оптимальной концентрации селективного агента

2.5 Молекулярно-генетический анализ

2.5.1 Выделение ДНК из растительного материала

2.5.2 ПЦР-анализ первичных трансформантов

2.5.3 Определение экспрессии гена bar

2.5.4 Саузерн-блот анализ трансгенных растений

2.6 Статистическая обработка данных

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение асептического материала

3.2 Подбор состава питательной среды для культивирования

3.3 Определение оптимальных концентраций селективных агентов

3.4 Определение оптимальных параметров агробактериальной трансформации на основе транзиентной экспрессии маркерных генов

3.5 Получение трансгенных растений ряски с геном bar

3.5.1 Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и регуляторов роста растений на процесс каллусообразования

3.5.2 Регенерация листецов из морфогенного каллуса

3.5.3 Определение оптимальных параметров агробактериальной трансформации фрагментов каллуса на основе транзиентной экспрессии маркерных генов

3.6 Молекулярный анализ полученных трансформантов

IV Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка системы генетической трансформации ряски малой (Lemna minor L.)"

Актуальность; проблемы; Одним из наиболее ярких' и убедительных достижений современной биотехнологии стало; создание ихбурное;развитие в последние десятилетия; новой< области мировой;экономики. -— биофармацевтической промьшшенности.ишромышленностш биоматериалов;, направленной^ Haíпроизводство5 принципиально * нового ¿класса; лекарства— реком-бинантных белков медицинского назначения и уникальных материалов.

Различные: интерфсроны, эритпропоэтины, факторы роста, антитела;, вакцинные белки;: промышленные ферменты, доступные ранее: лишь,в аналитических количествах; входят, теперь в перечень жизненногважныхшеди-цинских препаратов, производятся в объемах до нескольких тонн в год, и прочновошли в: повседневную практику современной медицины, пищевой! и фармацевтической; промышленности (Higo К. et al., 1993; Zliu Z. et al., 1994; Matsumoto S. et al., 1995).

Одним из перспективных направлений биотехнологии» в настоящее: время является создание растений - биореакторов, способных продуцировать белки, широко используемые в медицине и-, фармакологии. Системы, производящие рекомбинантные белки, на основе растений являются? безопасной и чрезвычайно рентабельной; альтернативой-традиционным системам; экспрессии, - культурам клеток микроорганизмов: и млекопитающих. Так в отличие от бактериальных систем; в растениях возможно осуществление посттрансляционных модификаций; которые в ряде случаев являются необходимым этапом получения функционального белка (Terasliima М. et al., 1999). Кроме того, получение рекомбинантных белков в системах на основе растительных клеток являются более безопасными в виду отсутствия рисков переноса инфекционных заболеваний человека, поскольку растения и человек не имеют общих патогенов (SchellerJ. et al., 2004). Это является значительным преимуществом перед системами экспрессии на основе культур клеток млекопитающих.

Lemna minor (ряска малая) - однодольное покрытосеменное растение семейства Рясковые. Благодаря своей способности к быстрому, причем вегетативному размножению, позволяющему увеличивать биомассу вдвое за 36 часов, высокой доли белка в биомассе, ряска представляет интерес для изучения, как потенциальная биофабрика для производства рекомбинант-ных белков, таких как вакцинные белки, сывороточный альбумин, гемоглобин и коллаген и др (Stomp A.M., 2005).

Трансгенные растения Lemna можно выращивать в асептически закрытых емкостях с контролируемыми условиями культивирования. Для роста растениям необходимы лишь вода, неорганические питательные вещества и С02 (Edelman М. et al., 1998).

Таким образом, искусственная и полностью закрытая среда культивирования в сочетании с быстрым ростом, высоким содержанием белка в биомассе и преимущественно вегетативным способом размножением делают такую систему уникальной и легко контролируемой. Следовательно, система экспрессии, созданная на основе Lemna, обладает огромным потенциалом и многочисленными преимуществами перед существующими системами экспрессии в связи с тем, что представляет собой новый тип эукарио-тической растительной высокопродуктивной системы для получения рекомбинантного белка.

Все сказанное выше показывает необходимость разработки системы генетической трансформации растений ряски малой с целью создания растений-продуцентов рекомбинантных белков. Этой главной цели и посвящена настоящая работа.

Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось изучение регенерационной и трансформационной способности растений ряски малой (Lemna minor) и разработка эффективной системы генетической трансформации. Применение данной системы приведет к созданию растений ряски малой, экспрессирующих белки терапевтического назначения.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Определить оптимальную комбинацию регуляторов роста растений и-тип экспланта с целью получения регенерации с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации.

2. Подобрать условия эффективного селективного отбора трансформированной ткани.

3. Оптимизировать параметры проведения агробактериальной трансформации растений ряски малой.

4. Получить трансгенные растения ряски малой, несущие ген bar.

5. Провести молекулярный анализ полученных растений.

Научная новизна. Подобраны условия для культивирования, индукции каллусообразования и регенерации растений из каллуса для растений Lemna minor, популяции, распространенной в водоемах Московской области. Показано, что наиболее эффективный эксплант для каллусообразования — целый интактный листец.

Получены трансгенные растения ряски со стабильной экспрессией ге-терологичного гена bar.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на

10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006); на

11-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007); на российско-польском симпозиуме (Москва, 2008); на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на Международной конференции «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2008); на молодежном симпозиуме V-ro Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гайдукова С.Е.,. Белоусова М.Б., Камионская A.M., Скрябин К.Г. Изучение регенеративной способности водных однодольных растений на примере Lemna minor. Материалы Третьего Московского международного конгресса «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы». Москва, 2005. С. 240-241.

2. Гайдукова С.Е., Камионская A.M. Изучение регенеративной способности ряски малой Lemna minor. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2006. С. 362-363.

3. Гайдукова С.Е., Камионская A.M. Разработка системы генетической трансформации ряски, Lemna minor. Материалы четвертого съезда Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино, 2006. С. 51.

4. Гайдукова С.Е. Агробактериальная трансформация ряски малой, Lemna minor. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2007. С. 189.

5. Гайдукова^ С.Е., A.M. Камионская, К.Г. Скрябин. Разработка системы генной трансформации ряски, Lemna minor. Четвертый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы». Москва, 2007. С. 226.

6. Гайдукова С.Е., Камионская A.M. (2007) Разработка системы генной трансформации ряски, Lemna minor. VII Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2007. С. 15-16.

7. Гайдукова С.Е. Оптимизация параметров генетической трансформации растений ряски малой Lemna minor. Пятый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы». Москва, 2009. С. 312-313.

8. Гайдукова С.Е., Ракитин А.Л., Равин Н.В., Скрябин К.Г., Камионская A.M. Разработка системы генетической трансформации ряски малой Lemna minor. Экологическая генетика, 2008, том VI, выпуск 4, с. 20-28.,

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Рясковые

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Гайдукова, Софья Евгеньевна

IV Выводы

2. Определены рабочие концентрации четырех селективных агентов для отбора трансформированной ткани растений Lemna minor, фосфинотри-цин - 8 мг/л, глифосат - 16 мг/л, канамицин - 100 мг/л, гигромицин 2 мг/л; продолжительность селективного отбора не менее 6 недель.

3. Показано, что оптимальным типом экспланта для проведения аг-робактериалыюй трансформации Lemna minor является каллус.

4. Показано, что наибольшая частота транзиентной эспрессии гена gfp (46,0±10,4%) достигается при продолжительности инокуляции эксплан-тов с агробактерией в течение 20 минут. Эффективность трансформации на уровне 43,0 ±8,7% была отмечена при продолжительности со-культивации фрагментов каллуса с агробактерией в течение 3 суток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гайдукова, Софья Евгеньевна, Москва

1. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И. Повышенная устойчивость к фитоиатогенным бактериям у трансгенных растений табака с синтетическим геном антимикробного пептида цекро-пина PI //Генетика. 2005. Т. 41. С. 1445-1452.

2. Золова О.Э., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. и др. Создание трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Биотехнология. 1999. № 6. С. 42-45.

3. МаниатисТ., Фрич Э., СэмбрукДж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонировнаие. — М.: Мир, 480с. 1984.

4. Мартиросян Е.В., Рыжова H.H., Скрябин К.Г., КочиеваЕ.З. RAPD-анализ геномного полиморфизма у представителей семейства Lemnaceae (Рясковые) //Генетика. 2008. Т. 44. №3. С. 1-5.

5. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я. и др. Анализ трансгенных растении табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2003. Т. 39. С. 51-56.

6. Падегимас Д., Шульга О., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицина//Молекулярная биология. 1993. Т. 27. С. 947-951.

7. Семенюк Е.Г., Орлова И.О., Стремовский О.Г. и др. Трансгенные растения табака продуценты мини-антител к ферритину селезенки человека//Доклады РАН. 2002. Т. 384. С. 544-546.

8. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Саратов. Издательство «Слово». 2001. 256 с.

9. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Крымский М.А. и др. Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгепных растениях картофеля и его характеристика // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1422-1430.

10. Agius F., Gonzalez-Lamothe R., Caballero J.L. et al. Engineering increased vitamin С levels in plants by overexpression of a D-galacturonic acid reductase //Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 177-181.

11. Ahloowalia B.S. Forage grasses. In: Ammirato P.V., Evans D.A., Sharp W.R. et al., eds. Handbook of plant cell culture. V. 3. New York: Macmillan Publishing Co.; 1984. P. 91-125.

12. Arakawa Т., Yu J., Chong D.K. et al. A plant-based cholera toxin В subunit-insulin fusion proteinprotects against the development of autoimmune diabetes //Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 934-938.

13. Arakawa Т., Yu J., Langridge W.H. Synthesis of cholera toxin В subunit-rotavirus NSP4 fusion protein in potato // Plant Cell Rep. 2001. V. 20. P. 343-348.

14. Azzoni A.R., Kusnadi A.R., Miranda E.A., Nikolov Z.L. Recombinant apro-tinin produced in transgenic corn seed: extraction and purification studies // Biotechnol Bioeng. 2002. V. 80. P. 268-276.

15. Barta A., Sommergruber K., Thompson D. et al. The expression of a nopaline synthase human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant Mol. Biol. 1986. V. 6. P. 347357.

16. Blackburn K.B. Notes on the chromosomes of the duckweeds (Lemnaceae) introducing the question of chromosome size // Proc Univ Durham Phil Soc. 1933. V. 9. P. 84-90.

17. BlazeyE.B., McClure ZAV. The distribution and taxonomic significance in lignin in the Lemnaceae // Amer J Bot. 1968. V. 55. P. 1240-1245.

18. Boehm R., Kruse C., Voeste D., Barth S., Schnabl H. A transient transfornation system for duckweed (Wolffia columbiana) using Agrobacterium-mediated gene transfer // J Appl Bot. 2001. V. 74. P. 107-111.

19. Brennan F.R., Gilleland L.B., Staczek J., Bending M.M., Hamilton W.D., Gilleland H.E.Jr. A Chimaeric plant virus vaccine protects mice against a bacterial infection // Microbiol. 1999. V. 145. P. 2061-2067.

20. Cañizares M.K., Lomonossoff G.P., Nicholson L. Development of cowpea mosaic virus-based vectors for the production of vaccines in plants // Expert Rev. Vaccines. 2005. V. 4.

21. Cascone A., Forni C., Migliore L. Flumequine uptake and the aquatic duckweed, Lemna minor L. // Water, Air, and Soil Pollution. 2004. V. 156. P. 241-249.

22. Castanon S., Martin-Alonso J.M., Marin M.S. et al. The effect of the promoter on expression of VP60 gene from rabbit hemorrhagic disease virus in potato plants // Plant Sci. 2002. V. 162. P. 87 95.

23. Chaloupkova K., Smart C.C. The abscisic acid induction of a novel peroxidase is antagonized by cytokinin in Spirodel polyrrhiza L. // Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 497-507.

24. Chang W.C., Chin P.L. Induction of callus from fronds of duckweed (Lemna gibba L.) // Bot Bull Acad Sin. 1976. V. 17. P. 106-109.

25. Chang W.C., Chiu P.L. Regeneration of Lemna gibba G3 through callus culture//Z. Pflanzenphysiol. 1978. V. 89. P. 91-94.

26. Chang W.C., Hsing Y.I. Callus formation and regeneration of frond-like structures in Lemna perpusilla 6746 on a defined medium // Plant Sci Lett. 1978. V. 13. P. 133-136.

27. Chargelegue D., Vine N.D., Van Dolleweerd C.J. et al. A murine monoclonal antibody produced in transgenic plants with plant-specific glycans is not immunogenic in mice // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 187-194.

28. Chen C., Kong A.N. Dietary cancer-chemopreventive compounds: from signaling and gene expression to pharmacological effects // Trends Pharmacol. Sci. 2005. V. 26. P. 318-326.

29. Chikwamba R., Cunnick J., Hathaway D. et al. A functional antigen in a practical crop: LT-B producing maize protects mice against Escherichia coli heat labile enterotoxin (LT) and cholera toxin (CT) // Ibid. 2002. V. 11. P. 479-493.

30. Chikwamba R.K., Scott M.P., Mejia L.B. et al. Localization of a bacterial protein in starch granules of transgenic maize kernels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11127-11132.

31. Choi S.M., Lee O.S., Kwon S.Y., Kwak S.S., Yu D.Y., Lee H.S. High expression of a human lactoferrin in transgenic tobacco cell cultures // Bio-technol Lett. 2003. V. 25. P. 213-218.

32. Chong D.K., Langridge W.H. Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 7178.

33. Chong, D.K.X., Roberts W., Arakawa T. et al. Expression of the human milk protein p-casein in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 289-296.

34. Christenscn A., Quail P. Ubiquitin promoter-based vectors for high level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants // Transgenic Research. 1996. V. 5. P. 213-218.

35. Cleland C.F., Briggs W.S. Gibberellin and CCC effects on flowering and growth in the long-day plant Lemna gibba G3 // Plant Physiol. 1969. V. 44. P. 503-507.

36. Cole C.T. and Voskuil M.L. Population genetic structure in duckweed (Lemna minor, Lemnaceae) // Can J Bot. 1996. V. 74. P. 222-230.

37. Crawford D.J. and Landolt E. Allozyme divergence among species of Wolffia (Lemnaceae) // PI System And Evol. 1995. V. 197. P. 59-69.

38. Crawford D.J. and Landolt E. Allozyme studies in Spirodela (Lemnaceae): Variation among conspecific clones and divergence among the species // Systemstic Bot. 1993. V. 18. P. 389-394.

39. Crawford D.J., Landolt E., Les D.H. An allozyme study of two sibling species of Lemna (Lemnaceae) with comments on their morphology, ecology and distribution // Bull Torrey Bot Club. 1996. V. 123. P, 1-6.

40. Decock P.C., Cheshire M.V., Mundie C.M., Inkson R.H.E. The effect of galactose on the growth of Lemna // New Phytol. 1979. V. 82. P. 679-685.

41. De Jaeger G., Scheffer S., Jacobs A. et al. Boosting heterologous protein production in transgenic dicotyledonous seeds using Phaseolus vulgaris regulatory sequences //Nat. Biotcchnol. 2002. V. 20. P. 1265-1268.

42. De Neve M., De Loose M., Jacobs A. et al. Assembly of an antibody fragment in N. tabacum and Arabidopsis // Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 227237.

43. DieryckW., PagnierJ., Poyart C., Marden M.C., GruberV., Bournat P., Baudino S., MerotB. Human haemoglobin from transgenic tobacco // Nature. 1997. V. 386. P. 29-30.

44. Ducreux L.J.M., Morris W.L., Hedley P.E. et al. Metabolic engineering of high carotenoid potato tubers containing enhanced levels of b-carotene and lutein // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 81-89.

45. Dus Santos M.J., Wigdorovitz A., Trono K. et al. A novel methodology to develop a foot and mouth disease virus (FMDV) peptide-based vaccine in transgenic plants//Vaccine. 2002. V. 20. P. 1141-1147.

46. Edelman M., Per A., Flaishman M., Blumenthal A. Transgenic Lemnaceae // International Application Published under the Patent Cooperation Treaty (PCT) WO 99/19498. 1998. P. 1-56.

47. Edelman M., Vunsh R., Li J., Hanania U., Flaishman M., Perl A. Transgenic Spirodela: a unique, low-risk, plant biotechnology system // In plant biology 2003 program, Biotech risk assesment. Abstract 955. P. 196.

48. EhsaniP., Khabiri A., DomanskyN.N. Polypeptides of hepatitis B surface antigen produced in transgenic potato // Gene. 1997. V. 190. P. 107-111.

49. Faye L., Gomord V., Fitchette-Laine A.C., Chrispeels M.J. Affinity purification of antibodies specific for Asn-linked glycans containing alpha 1—>3 fu-cose or beta l->2 xylose // Anal. Biochem. 1993. V. 209. P. 104-108.

50. Fillatti J.J., SellmarJ., McCown B., Haissig B., Comai L. Agrobacterium mediated transformation and regeneration of Populus // Mol Gen Genet. 1987. V. 206. P. 192-199.

51. Fisher R., Budde I., Hain R. Stilbene synthase gene expression causes changes in flower color and male sterility in tobacco // Plant J. 1997. V. 11. P. 489^198.

52. FrickH. Heterotrophy in Lemnaceae // J Plant Physiol. 1994. V. 144. P. 189-193.

53. Fujioka S., Yamaguchi I., Murofushi N., Takahashi N., Kaihara S, Talcimo-to A., Cleland C.F. The influence of nicotinic acid and plant hormones on flowering in Lemna // Plant Cell Physiol. 1986. V. 27. P. 109-116.

54. FrickH. Callogenesis and carbohydrate utilization in Lemna minor // J Plant Physiol. 1991. V. 137. P. 397-401.

55. GamborgO.L., Miller R.A., OjimaK. Nutrient requirements of suspension cultures of soyabean root cells // Exp Cell Res. 1968. V. 50. P. 151-158.

56. Gasdaska J.R., Spencer D., Dickey L. Advantages of therapeutic protein production in aquatic plant Lemna // Bioprocessing J. 2003. V. 3. P. 50-56.

57. Gil F., Brun A., Wigdorovitz A. et al. High-yield expression of a viral peptide vaccine in transgenic plants // FEBS Lett. 2001. V. 488. P. 13-17.

58. Gomez N., Carrillo C., Salinas J., Parra F., Borca M.V., Escribano J.M. Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissablegastroenteritis eoronavirus in transgenic plants // Virology. 1998. V. 249. P. 352-358.

59. Gupta S and Maheshwari S.C. Growth and flowering of Lemna paucicostata. General aspects and role of chelating agents in flowering // Plant Cell Physiol. 1970. V. 11. P. 83-95.

60. Haq T.A., Clements J.D., Arnzten C.J. oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. V. 268. P. 714-716.

61. Helens R., Mullineaux P., Klee H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors // Trends in Plant Science. 2000. V. 5a. P. 446-451.

62. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants //Nature. 1989. V. 42. P. 76-78.

63. Higo K., Saito Y., Higo H. Expression of a chemically synthesized gene for human epidermal growth factor under the control of cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic tobacco // Biosci Biotech Bioch. 1993. V. 57. P. 1477-1481.

64. Hillman W.S. The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature // Bot Rev. 1961. V. 27. P. 221-287.

65. Hirahaya M. and ICadono Y. Biosystematic study of Lemna minor L sensu lato (Lemnaceae) in Japan with special reference to allozyme variation // Acta Phytotax Geobot. 1995. V. 46. P. 117-129.

66. Hoagland D.R., Arnon D.I. The water-culture method for growing plants without soil // Univ. Calif. Coll. Agrie. Exp. Sta. Circ. Berkeley, CA. 1938. P. 347-353.

67. Hood E.E., Witcher D.R., Maddock S. et al. Commercial production of avi-din from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification // Mol. Breeding. 1997. V. 3. P. 291306.

68. Hood E.E. Woodard S.L., Horn M.E. et al. monoclonal antibody manufacturing in transgenic plants myths and realities // Current Opinion Biotech-nol, 2002. V. 13. P. 630-635.

69. Horn M.E., Woodard S.L., Howard J.A. Plant molecular farming: systems and products // Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 711-720.

70. Hossain T., Rosenberg I., Selhub J. et al. Enhancement of folates in plants through metabolic engineering // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 5158-5163.

71. Hubálek T., Vosáhlova S., Mateju V., Kovácová N., Novotny C. Ecotoxicity monitoring of hydrocarbon-contaminated soil during bioremediation: a case study // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2007. V. 52. P. 1-7.

72. Huebert D.B., McIIrith A.L., Shay J.M., Robinson G.G.C. Axenic culture of Lemna trisulca L // Aquatic Botany. 1990. V. 38. P. 295-301.

73. Jain R.K., Davey M.R., Cocking E.C., Wu R. Carbohydrate and osmotic requirements for high frequency plant regeneration from protoplast derived colonies of indica and japónica rice varieties // J Exp Bot. 1997. V. 48. P. 751-758.

74. Jeanin G., Bronner R., Hahne G. Somatic embryogenesis and organogenesis induced on the immature zygotic embryo of sunflower (Helian-thus annuus L.) cultivated in vitro: the role of sugar // Plant Cell Rep. 1995. V. 15. P. 200-204.

75. Jordan W.C., Courtney M.W., Neigel J.E. Low levels of intraspecific genetic variation at a rapidly evolving chloroplast DNA locus in North American duckweeds (Lemnaceae) // Amer J Bot. 1996. V. 83. P. 430-439.

76. ICapustaJ., ModelskaA., Figlerowicz M., Pniewski T., LettelierM., Lisowa O., Yusibov V., Koprowski H., Plucienniczak A., Legocki A.B. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus // FASEB J. 1999. V. 13. P.1796-1799.

77. Kathuria S., Sriraman R., Nath R. et al. Efficacy of plant-produced recombinant antibodies against HCG // Human Reproduction. 2002. V. 17. P. 20542061.

78. Kehoe D.M., Degenhardt J., Winicov I., Tobin E.M. Two 10-bp regions are critical for phytochrome regulation of Lemna gibba Lheb gene promoter // The Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1123-1134.

79. Krajncic B., Slekovec-Golob M., Nemec J. Promotion of flowering by Mn-EDDHA in the photoperiodically neutral plant Spirodela polyrrhiza (L.) Schleiden // J Plant Physiol. 1995. V. 147. P. 397-400.

80. Kruse C., Boehm R., Voeste D., Barth S., Schnabl H. Transient transformation of Wolffia columbiana by particle borbardment // Aquatic Bot. 2002. V. 72. P. 175-181.

81. Kong Q., Richter L., Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants // Ibid. 2001. V. 98. P. 1153911544.

82. Kusnadi A.R., Evangelista R.L., Hood E.E., Howard J.A., Nikolov Z.L. Processing of transgenic corn seed and its effect on the recovery of recombinant beta-glucuronidase // Biotechnol Bioeng. 1998. V. 60. P. 44-52.

83. Lamphear B.J., J ilka J.M., ICesl L. et al. A corn-based delivery system for animal vaccines: an oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine // Vaccine. 2004. V. 22. P. 2420-2424.

84. Lamphear B.J., Streatiield S.J., Jilka J.A. et al. Delivery of subunit vaccines in maize seed // J. Control Release. 2002. V. 85. P. 169-180.

85. Landolt E., Kandeler R. The family Lemnaceae, a monographic study. Volume 2of the monograph: phytochemistry; physiology; application; bibliography. Zurich, Switzerland: Veröffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Ruebel; 1987.

86. Landolt E. The Family of Lemnaccae a Monographic Study. V. 1. Biosys-tematic Investigations in the Family of Duclwceds (Lemnaceae) (V. 2), Zürich, Veröffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel. 1986.

87. Larrick J.W., Yu L., Naftzger C. et al. Production of secretory IgA antibodies in plants // Biomol. Eng. 2001. V. 18. P. 87-94.

88. Leite A., Kemper E., da Silva M., Luchessi A., Siloto R., Bonaccorsi E., El-Dorry H., Arruda P. Expression of correctly processed human growth hormone in seeds of transgenic tobacco plants // Mol Breeding. 2000. V. 6. P. 47-53.

89. Lemos E.E.P., Baker D.E. Shoot regeneration in response to carbon source on internodal explants of Annona muricata L. // Plant Growth Regul. 1998. V. 25. P. 105-112.

90. Les D.H., Crawford D.J., Landolt E., Gabel J.D., Kimball R.T. Phylogeny and Systematics of Lemnaceae, the Duckweed Family // Systematic Botany. 2002. V. 27(2). P. 221-240.

91. Li J., JainM., VunshR., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., Edelman M. Callus induction and regeneration in Spirodela and Lemna // Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 457-464.

92. Ma J.IC., Hiatt A., Hein M., Vine N.D., Chargelegue D., Yu L., Hein M.B., Lehner T. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans // Nat Med. 1998. V. 4. P. 601-606.

93. Mackenzie S.M., Waite S., Metcalfe D.J., Joyce C.B. Landfill leachate eco-toxicity experiments using Lemna minor // Water, Air, and Soil Pollution. 2003. Focus 3. P. 171-179.

94. MagnusonN., Linzmaier P.M., Reeves R., AnG., HayGlass K., Lee J.M. Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension cultures // Protein Expres Purif. 1998. V. 13. P. 45-52.

95. Marilonnet S., Thoeringer C., Kandzia R. et al. Systemic Agrobactc-rium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants // Nat. Biotechnol. 2005. V. 23. P. 718-723.

96. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J., Jiang X., Estes M.IC., Arntzen C.J. Expression of Norwalk capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenecity in mice // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. P. 53355340.

97. Mason H.S., Haq T.A., Clements J.D., Arntzen C.J. Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene // Vaccine. 1998. V. 16. P. 1336-1343.

98. Mason H.S., Lam D.M.K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 11745-11749.

99. Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R. Characterization of human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells // Plant Mol Biol. 1995. V. 27. P. 1163-1172.

100. McClureJ.W. and AlstonR.E. A chemotaxonomic study of Lemnaceae // Amcr J Bot. 1966. V. 53. P. 849-860.

101. McClure J.W. and Alston R.E. Patterns of selected chemical components of Spirodela oligorrhiza formed under various conditions of axenic culture // Nature. 1964. V. 201. P. 311-313.

102. Tuboly T., Yu W., Bailey S. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.

103. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M., Hooper D.C., Fu Z.F., Die-tzschold B., Koprowski H., Michaels F.H. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Bio/Technol. 1995. V. 13. P. 14841487.

104. Merle C., Perret S., Lacour T. et al. Hydroxylated human homotrimeric collagen I in Agrobacterium tumefaciens-mediated transient expression and in transgenic tobacco plant // FEBS Lett. 2002. V. 515. P. 114-118.

105. Mitra A., Znahg Z. Expression of a human lactoferrin cDNA in tobacco cells produces antibacterial protein(s) // Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 997-981.

106. Mkandawire M., Taubert B., Dudel E.G. Resource manipulation in uranium and arsenic attenuation by Lemna gibba L. (duckweed) in tailing water of a former uranium mine // Water, Air, and Soil Pollution. 2005. V. 166. P. 83101.

107. Moloney M., Boothe J., Van Rooijen G. Oil bodies and associated proteins as affinity matrices // US Patent 6509453. 2003.

108. Moon H.K., Stomp A-M. Effects of medium components and light on callus induction, growth and frond regeneration in Lemna gibba (duckwced) // In Vitro. 1997. V. 33. P. 20-25.

109. Moon H-K., Yang M-S. Nodular Somatic Embryogenesis and Frond Regeneration in Duckweed, Lemna gibba G3 // Journal of Plant Biology. 2002. V. 45(3). P. 154-160.

110. Mor T.S., SternfieldM., Soreq H., Arntzen C.J., Mason H.S. Expression of recombinant human acetylcholinesterase in transgenic tomato plants // Bio-technol Bioeng. 2001. V. 75. P. 259-266.

111. MuJ.H., ChuaN.H., Ross E.M. Expression of human muscarinic cholinergic receptors in tobacco // Plant Mol Biol. 1997. V. 34. P. 357-362.

112. Murashige T., Slcoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-496.

113. Natilla A., Piazolla G., Nuzzaci M., Saldarelli P., Tortorella C., Antonaci S., Piazzolla P. Cucumber mosaic virus as a carrier of a hepatitis C virus-derived epitopr // Arch Virol. 2004. V. 149. P. 137-154.

114. Nemchinov L.G., Liang T.J., Rifaat M.M., Mazyad H.M., Hadidi A., Keith J.M. Development of a plant-derived subunit vaccine candidate against hepatitis C virus // Arch Virol. 2000. V. 145. P. 2557-2573.

115. NitschJ.P., Nitsch C. Haploid plants from pollen grains // Science. 1969. V. 163. P. 85-87.

116. Pagny S., Cabanes-Macheteau M., Gillikin J.W. et al. Protein recycling from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum in plants and its minor contribution to calreticulin retention // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 739-756.

117. Parmenter D.L., Boothe J.G., van Rooijen G.J.H. et al. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 1167-1180.

118. Perrin Y., Vaquero C., Gerrard I. et al. Transgenic pea seeds as bioreactors for the production of a single-chain Fv fragment (scFV) antibody used in cancer diagnosis and therapy // Mol. Breeding. 2000. V. 6. P. 345-352.

119. Porta C., Spall V.E., Lin T., Johnson J.E., Lomonosoff G.P. The development of cowpea mosaic virus as a potential source of novel vaccines // In-tervirology. 1996. V. 39. P. 79-84.

120. Pueyo J.J., Chrispeels M.J., Herman E.M. Degradation of transport-competent destabilized phaseolin with a signal for retention in the endoplasmic reticulum occurs in the vacuole // Planta. 1995. V. 196. P. 586-596.

121. Richter L.J., Thanavala Y., Arntzen C.J., Mason H.S. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization // Nat. Biotech-nol. 2000. V. 18. P. 1167-1171.

122. RimonD. Bud initiation in Spirodela oligorrhiza // Isr J Bot. 1964. V. 13. P. 24-39.

123. Rolfe S.A. and Tobin E.M. Deletion analysis of a phytochrome-regulated monocot rbcS promoter in a transient assay system // Proc Nat Acad Sci USA. 1991. V. 88. P. 2683-2686.

124. Ruggiero F., Exposito J-Y., BournatP., GruberV., Perret S., ComteJ., OlagnierB., Garrone R., Theisen M. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants // FEBS Lett.2000. V. 469. P. 132-136.

125. Saalbach 1, Giersberg M, Conrad U: High-level expression of a single-chain Fv fragment (scFv) antibody in transgenic pea seeds II J. Plant Physiol.2001. V. 158. P. 529-533.

126. Samyn-PetitB., GruberV., Flahaut C., Wajda-Dubos J-P., Farrer S., Pone A., Desmaizieres G., Slomianny M-C., Theisen M., Delannoy P. N-Glycosilation potential of maize: the human lactoferrin used as a model // Glucoconjugate J. 2001. V. 18. P. 519-527.

127. Schafer W., Gorz A., Kahl G. T-DNA integration and expression in monocot crop plant after induction of Agrobacterium // 1987. V. 327. P. 529-532.

128. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silkelastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation // Transgenic Res. 2004. V. 13. P. 51-57.

129. SchenkR.U., Hildebrandt A.C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Can J Bot. 1972. V. 50. P. 19-204.

130. Schunmann P.H.D., Coia G., Waterhouse P.M. Biopharming the im-pliREDTM HIV diagnostic reagent in barley, potato and tobacco // Molecular Breeding. 2002. V. 9. P. 113-121.

131. Sharpe W.R., Evans D.A., Ammirato P.V. et al, aeds. Handbook of plant cell culture. V. 2. Crop species. New York: Macmillan Publishing Co.; 1984. P. 69-136.

132. Shewmaker C.K., Sheehy J.A., Daley M. et al. Seed-specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects // Plant J. 1999. - Vol. 20. P. 401-412.

133. Shin Y.J., Hong S.Y., Kwon T.H., Jang Y.S., Yang M.S. High level of expression of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in transgenic rice cell suspension culture // Biotechnol Bioeng. 2003. V. 82. P.778-783.

134. Sijmons P.C., Dekker B.M.M., Schrammeijcr B., Verwoerd T.C., van den Elzen P.J.M., Hoekema A. Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants // Bio/Technol. 1990. V. 8. P. 217-221.

135. Slovin J.P., Cohen J.D. Generation of variant lines Lemna gibba G3 via tissue culture, for use in selecting auxin metabolism mutants // Plant Physiol Suppl Am Soc Plant Physiol. 1985. V. 77. P. 11.

136. Slovin J.P., Cohin J.D. Levels of indole-3-acetic acid in Lemna gibba G3 and in large Lemna mutant regenerated from tissue culture // Plant Physiol. 1988. V. 86. P. 522-526.

137. Smart C.C., Fleming A.J. Hormonal and environmental regulation of a plant PDR5-like ABC transporter//J Biol Chem. 1996. V. 271. P. 19351-19357.

138. Smith M.L., ICeegan M.E., Mason H.S., Shuler M.L. Factors important in the extraction, stability and in vitro assembly of the hepatitis B surface antigen derived from recombinant plant systems // Biotechnol. Prog. 2002. V. 18. P. 538-550.

139. Smith M.L., Mason H.S., Shuler M.L. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form // Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 80. P. 812822.

140. Stefaniak B., Wozny A., Budna I. Callus induction and plant regeneration in Lemna minor L. // Biologia Plantarum. 2002. V. 45(3). P. 469-472.

141. Stomp A.M. The duckweeds: a valuable plant for biomanufacturing // Biotechnol Ai.nu Rev. 2005. V. 11. P. 69-99.

142. Streatfield S.J., Jilka J.M., Hood E.E. et al. Plant-based vaccines: unique advantages //Vaccine. 2001. V. 19. P. 2742-2748.

143. Streatfield S.J., Lane J.R., Brooks C.A. et al. Corn as a production system for human and animal vaccines // Ibid. 2003. V. 21. P. 812-815.

144. Strickland G.S., Nichol J.W., McCall C.M., Stuart D.A. Effect of carbohydrate source on alfalfa somatic embryogenesisi // Plant Sci. 1987. V. 48. P. 113-121.

145. Sugiyama Y., Hamamoto H., Takemoto S., Watanabe Y., Okada Y. Systemic production of foreign peptides on the particle surface of tobacco mosaic virus // FEBS Lett. 1995. V. 359. P. 247-250.

146. SwedlundB., Locy R.D. Sorbitol as the primary carbon source for the growth of embryogenic callus of maize // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 1339-1346.

147. Tabei Y., Nishio T., Kurihara K., Kanno T. Selection of transformed callus in a liquid medium and regeneration of transgenic plants in cucumber (Cu-cumis sativus L.) // Breeding Sci. 1994. V. 44. P. 47-51.

148. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes // J. Infect. Dis. 2000. V. 182. P. 302-305.

149. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 607-609.

150. TerashimaM., Murai Y., KawamuraM., Nakanishi S.5 StoltzT., Chen L., Drohan W., Rodriguez R.L., Katoh S, Production of functional human alpha 1-antitrypsin by plant cell culture // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. V. 52. P. 516-523.

151. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S. et al. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B // Ibid. 2005. V. 102. P. 3378-3382.

152. Thanavala Y., Yang Y.F., Lyons P. et al. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 3358-3361.

153. Tillberg E., Homvall M., Ericsson T. Growth cycles in Lemna gibba cultures and their effects on growth rate and ultrastructure // Physiol Plant. 1979. V. 46. P. 5-12.

154. Tobin E.M., Turkaly E. ICinetin affects rates of degradation of mRNAs encoding two major chloroplast proteins in Lemna gibba L. G-3 // J. Plant Growth Regul. 1982. V. 1. P. 3-13.

155. Tregoning J.S., Maliga P., Dougan G., Nixon P. New advances in the production of edible plant vaccines: chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, TetC // Phyto chemistry. 2004. V. 65. P. 989-994.

156. Tregoning J.S., Nixon P., Kuroda H. et al. Expression of tetanus toxin Fragment C in tobacco chloroplasts // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1174-1179.

157. Tuboly T., Bailey A., Degrandis S., Du S., Erickson L., Nagy E. Immunoge-necity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.

158. Tuboly T., Yu W., Bailey S. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.

159. Turpén T.H., Reinl S.J., Charoenvit Y., Hoffman S.L., Fallarme V., Grill L.K. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mosaic virus // Bio/Technol. 1995. V. 13. P. 53-57.

160. Urbanslca-Worytkiewicz K. Cytological variation within the family of Lemnaceae // Veröff. Geobot. Inst. ETH, Stiftung Rübel, Zürich. 1980. V: 70. P. 30-101.

161. ValdezM., Cabrera-Ponce J.L., SudkaharD., Herrera-Estrella L., Chris-tou P. Transgenic Central American, West African and Asian elite rice varieties resulting from particle borbardment DNA in mature seeds // Anals Bot London. 1998. V. 85. P. 795-801.

162. Vandekerckhove J., Van Damme J., Van Lijsebettens M. et al. Enkephalins produced in transgenic plants using modified 2S seed storage proteins // Bio/Technology. 1989. V. 7. P. 929-932.

163. Van Eenennaam A.L., Lincoln K., Durrett T.P. et al. Engineering vitamin E content: from Arabidopsis mutant to soy oil // The Plant Cell. 2003. V. 15. P. 3007-3019.

164. Vasseur L., Aarssen L.W. and Bennett T. Allozymic variation in local apo-mictic populations of Lemna minor // Amer J Bot. 1993. V. 80. P. 974-979.

165. Vaquero C., Sack M., Chandler J. et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 11128-11133.

166. Vaquero C., Sack M., Schuster F. et al. A carcinocmbryonic antigen-specific diabody produced in tobacco // FASEB J. 2002. V. 16. P. 408-410.

167. Verch T., Hooper D.C., Kiyatlcin A., Steplewski Z., Korowski H. Immunization with a plant-produced colorectal cancer antigen // Cancer Immunol Immun. 2004. V. 53. P. 92-99.

168. Verch T., Yusibov V., Koprowski H. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector // J Immunol Methods. 1998. V. 220. P. 69-75.

169. Vunsh R., Li J., Hanania U., Edelman M., Flaishman M., Perl A., Wisniew-ski J-P., Freyssinet G. High expression of transgene protein in Spirodela // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. P. 1511-1519.

170. Walmsley A.M., Arntzen C.J. Plants for delivery of edible vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 126-129.

171. Wandelt C.I., Khan M.R., Craig S. et al. Vicilin with carboxy-terminal KDEL is retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants // Plant J. 1992. V. 2. P. 181-192.

172. Wang Y., Kandeler R. Promotion of flowering by tumor promoter // J Plant Physiol. 1994. V. 144. P. 710-713.

173. Weatherwax S.C., Ong M.S., Degenhardt J., Bray E.A., Tobin E.M. The interaction of light and abscisic acid in the regulation of plant gene expression // Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 363-370.

174. Yamamoto Y.T., Rajbhandari N., Lin X., Bergmann B.A., Nishimura Y., Stomp A-M. Genetic transformation of duckweed Lemna gibba and Lem-na minor // InVitro. 2001. V. 37. P. 349-353.

175. Yu J., Langridge W.H. A plant-based multicomponent vaccine protects mice from enteric diseases // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 548-552.

176. Yukawa I., Takimoto A. Flowering response of Lemna paucicostata in Japan // Bot Mag (Tokyo). 1976. V. 89. P. 241-250.

177. Yun D.-J., Hashimoto T., Yamada Y. Metabolic engineering of medicinal plants: Transgenic Atropa belladonna with an improved alkaloid composition//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 9. P. 1799-11803.

178. Zapata C., Park S.H., El-Zik K.M., Smith R.H. Transformation of a Texas cotton cultivars by using Agrobacterium and the shoot apex // Theor Appl Genet. 1999. V. 98. P. 252-256.

179. Zeitlin L., Olmsted S.S., Moench T.R. et al. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotection of the vagina against genital herpes//Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 1361-1364.

180. Zhang B., Yang Y.H., Lin Y.M., Rao Q., Zheng G.G., Wu K.F. Expression and expression bioactive human interleukin-18 in transgenic tobacco plants // Biotechnol Lett. 2003. V. 25. P. 1629-1635.

181. ZhuZ., Hughes K., Huang L., Sun B., Liu C., Li Y. Expression of human alpha-interferon in plants // Virology. 1994. V. 172. P. 213-222.

Информация о работе

Гайдукова, Софья Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка системы генетической трансформации ряски малой (Lemna minor L.) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы