Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шкаева, Мария Александровна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Биологические особенности цирковируса свиней второго типа.

2.2. Методы выделения и культивирования ЦВС-2.

2.3. Патологии, обусловленные ЦВСцирковирусные болезни).

2.4. Диагностика, профилактика и меры борьбы с ЦВС-2.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.•.

4.1. Получение и характеристика рекомбинантного антигена ORF2 ЦВС-2.

4.1.1. Создание генноинженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокапсидного белка ORF

ЦВС-2 в клетках насекомых.

4.1.2. Очистка и иммунохимическая характеристика рекомбинатного нуклеокапсидного ORF2 белка.

4.2. Выбор и характеристика конъюгата.

4.3. Разработка непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа.

4.3.1. Отработка условий постановки ИФА.

4.3.2. Оптимизация условий проведения ИФА при исследовании проб в одном разведении.

4.3.3. Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы.

4.4. Разработка технологии изготовления ИФА-набора для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа («ЦИРКО-СЕРОТЕСТ»).

4.4.1. Получение и характеристика положительного и отрицательного контролей для ИФА-набора.

4.4.2. Определение стабильности специфических компонентов ИФА-набора при хранении.

4.4.3. Оптимизация комплектации ИФА-набора и разработка инструкции по его применению.

4.4.4. Контроль воспроизводимости результатов, полученных с помощью ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ».

4.5. Применение ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для эпизоотологического мониторинга цирковирусной инфекции в свиноводческих хозяйствах.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа"

Цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2) является возбудителем болезни поросят, впервые зарегистрированной в Канаде в 1991 году, и в связи с поражением различных систем организма названной «синдромом послеотъем-ного мультисистемного истощения» (СПМИ). Болезнь характеризуется проявлением комплекса клинических признаков, включающих потерю веса, отставание в росте, одышку, диарею, желтуху и пневмонию. В естественных условиях СПМИ чаще отмечают у поросят 6-15 недельного возраста, у которых регистрируют наибольший отход, при этом пик заболеваемости приходится на 10-ти недельный возраст. У инфицированных животных вирус обнаружен в клетках лимфоидной системы (макрофагах, дендритных клетках, Т- и В- лимфоцитах), являющихся клетками-мишенями для ЦВС-2 (Орлянкин Б.Г. и др., 2002; Clarck E.G., 1997; Allan G.M. et al., 1998; Mankertz A. et al., 2000; O'Connor B. et a.l, 2001 и др.). Интенсивное размножение вируса в клетках иммунной системы приводит их к гибели и развитию иммунодефицитного состояния. У таких животных создаются условия для возникновения вторичных инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами (Segales J. et al., 2004). В настоящее время ЦВС-2 широко распространен практически во всех странах мира и рассматривается как один из основных (первичных) патогенов, вызывающих поражения легких и развитие респираторных болезней свиней (Орлянкин Б.Г. и др., 2005; Halbur R.G., 1998).

ЦВС-2 представляет собой ДНК-содержащий вирус, относящийся к роду Circovirus семейства Circoviridae, к которому принадлежат вирус анемии цыплят (типовой вирус), ЦВС первого типа (ЦВС-1), являющийся нецитопато-генным контаминантом перевиваемой культуры клеток почек поросят; а также цирковирусы попугаев и голубей. В 1999 г. сообщалось о выделении от носителей из Японии и Западной Африки первого цирковируса человека (Hironori М. et al., 1999; Mushahwar I.K. et al., 1999).

Экономический ущерб, наносимый свинокомплексам болезнями, ассоциированными с ЦВС-2, может быть значительным, что связано с потерями от недополучения продукции и высокой смертностью поросят послеотъемного периода (Sato К. et al., 2001; Harding J.C., 2004). Кроме того, в связи с возрастающим интересом в плане использования свиней в качестве доноров, ЦВС-2 может также представлять собой потенциальную угрозу здоровью людей при передаче через орган, ткань или клеточную трансплантацию (Сатина Т.А., 2003).

Распространение ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах различных стран мира оценивают по обнаружению вирус-специфических антител в сыворотке крови свиней методами иммуноферментного анализа (ИФА), непрямой имму-нофлюоресценции (РИФ) и выявлению вируса, вирусного антигена или вирусной ДНК в тканях и органах поросят методами электронной микроскопии, гибридизации in situ, полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также иммуногисто-химически (Onuki A. et al., 1999; Choi С. et al., 2000; Larochelle R. et al., 2000; Sibila M. et al., 2004; Racine S. et al., 2004 и др.). В нашей стране в ЗАО «НПО НАРВАК» и в ФГУ «ВНИИЗЖ» для обнаружения ЦВС-2 разработан и используется метод ПЦР (Кукушкин С.А. и др., 2005), однако этот метод достаточно трудоемок, требует дорогостоящей аппаратуры и квалифицированного персонала. В этой связи использование ИФА представляется наиболее эффективным методом мониторинга цирковирусной инфекции в популяции свиней на территории РФ.

Известно, что одним из перспективных подходов к созданию иммуно-ферментных тест систем для серологических исследований является использование в качестве антигенов рекомбинантных белков. В геноме ЦВС-2 присутствуют две большие открытые рамки считывания ORF1 и ORF2, при этом ORF2 кодирует структурный белок вириона с молекулярной массой около 30 кД, который индуцирует синтез основной массы антител при инфицировании животных (Meehan В.М. et al., 1997; Truong С. et al., 2001). Таким образом, данный белок является самым подходящим антигеном для использования в ИФА.

В мире уже существуют аналогичные разработки иммуноферментных тест-систем (Walker I.W. et al, 2000; Nawagitgul P. et al, 2002; Blanchard P. et al., 2003; Changming L. et al., 2004), однако к началу наших исследований ни одна из них не обрела форму завершенного ИФА-набора, выпускаемого на регулярной основе.

Цель работы. Разработка иммуноферментной тест-системы и технологии производства ИФА-набора для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа в сыворотках крови животных.

Основные задачи исследований:

1. Разработать технологию, получить и охарактеризовать рекомбинантный нуклеокапсидный белок ORF2 цирковируса свиней второго типа.

2. Разработать методику постановки, учета и интерпретации результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к ЦВС-2 в сыворотках крови животных.

3. Определить диагностическую ценность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к ЦВС-2 в сравнении с методом аналогичной направленности.

4. На основе иммуноферментной тест-системы разработать технологию производства ИФА-набора. Для этого определить стабильность компонентов набора при хранении, разработать его оптимальную комплектацию и инструкцию по применению.

5. Провести испытание ИФА-набора по выявлению антител к ЦВС-2 в практических условиях с использованием сывороток крови свиней полученных от животных различных половозрастных групп.

6. Провести эпизоотологический мониторинг ЦВС-2 в отдельных свиноводческих хозяйствах РФ.

Научная новизна работы.

Разработана технология получения и очистки рекомбинантного белка ORF2 цирковируса свиней второго типа. На основе полученных и иммунохими-чески охарактеризованных специфических реагентов разработан метод непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа в сыворотке крови свиней. Оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови свиней, взятых в одном разведении. В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного теста и установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РИФ.

На основе иммуноферментной тест-системы разработана оптимальная комплектация и технология производства ИФА-набора. Установлена возможность длительного хранения компонентов ИФА-набора и его диагностическая эффективность в лабораторных исследованиях, направленных на выявление антител к ЦВС-2.

Практическая значимость исследований.

На основании результатов исследований разработан и внедрен в ветеринарную практику России диагностический ИФА-набор «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» который целесообразно использовать при проведении массовых скрининговых исследований свинопоголовья для эпизоотологического мониторинга ЦВС-2. На изготовление и применение ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» разработана нормативно-техническая документация, утвержденная в установленном порядке (ТУ 9388-010-42418073-04).

Впервые проведены серологические исследования и получены данные о распространении ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах РФ. Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты экспериментов по получению рекомбинантного белка ORF2 цирковируса свиней второго типа, разработке иммуноферментной тест-системы и созданию на ее основе ИФА-набора для выявления антител к ЦВС-2;

• результаты испытаний ИФА в экспериментальных и практических условиях;

• результаты эпизоотологического мониторинга ЦВС-2 в популяции свиней на территории Российской Федерации.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на 1-м Всероссийском совещании директоров ветеринарных лаборато-I рий субъектов Российской Федерации (г.Брянск, 2004); научно-производственных совещаниях сотрудников ЗАО «НПО НАРВАК» (г. Москва, 2003 - 2005 гг.); межлабораторном совещании сотрудников Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (г. Москва, 2006 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три научные работы и одна принята в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 118 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, щ списка цитированной литературы и приложения. Материалы диссертации ил

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Шкаева, Мария Александровна

6. выводы

1. Разработана технология получения рекомбинантного белка ORF2 цирковируса свиней второго типа. Установлено, что гены нуклеокапсидного белка ЦВС-2 эффективно экспрессировались в эукариотической системе экспрессии, при этом выход рекомбинантного продукта составил 0,05-0,11% от клеточной биомассы.

2. Установлено, что очищенный металлоаффинной хроматографией рекомбинантный белок ORP2 обладает выраженными антигенными свойствами, и может быть использован в качестве антигена в иммуноферментной тест-системе.

3. С использованием рекомбинантного белка ORP2 и моноклональных антител к у - цепям IgG свиньи разработан метод непрямого твердофазного ИФА, предназначенный для выявления антител к ЦВС-2. При исследовании сывороток крови свиней установлено, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к реакции непрямой иммунофлюо-ресценции составила 96,2%, специфичность - 95,4%. Результаты ИФА и РИФ совпадали в 95,7% случаев, коэффициент корреляции результатов составил 0,88, Р< 0,05.

4. На основе иммуноферментной тест-системы разработана технология производства ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» и Инструкция по его применению. Установлено, что указанный набор пригоден для практического применения в течение одного года при хранении в режиме 4-8°С.

5. Показана высокая эффективность разработанного ИФА-набора * «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» при проведении массовых скрининговых исследований сывороток крови свиней на наличие антител к ЦВС-2 в лабораторных и производственных условиях. Преимуществами указанного набора является экспресс-ность, воспроизводимость результатов (г = 0,9) и возможность их автоматического учета.

6. На основании серологического мониторинга в 20 свиноводческих хозяйствах различных регионов Российской Федерации, проведенного с помощью ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ», установлено широкое распространение ЦВС-2 в популяции свиней различных половозрастных групп. При этом показано, что 26% положительных проб содержали также антитела к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы исследований по разработке технологии изготовления и применения ИФА-набора вошли в следующие нормативные документы:

- Технические условия (ТУ) № 9388-010-42418073-04 «Набор реагентов для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) им-муноферментным методом "ЦИРКО-СЕРОТЕСТ"», согласованы с Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ 27.07.2005;

- Инструкция по применению набора реагентов для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) иммуноферментным методом "ЦИРКО-СЕРОТЕСТ", утверждена Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ 27.07.2005.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шкаева, Мария Александровна, Москва

1. Баландина М.В. Разработка технологии производства набора реагентов для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней им-муноферментным методом. Дисс. канд. биол. наук, М., 2006, 121 с.

2. Верховский О.А. Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных. Дисс.докт. биол. наук, М., 1998, 259 с.

3. Канынина А.В. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Автореф. дисс.канд. вет. наук, Владимир, 2004, 23с.

4. Кукушкин С.А., Байбиков Т.З., Ковалишин В.Ф., Тимина A.M., Яковлева А.С. Пролиферативно-некротизирующая пневмония свиней.// Ветеринария,- 2005.- №9.- С. 17-20

5. Мотовски А. Цирковирусни инфекции при свинетете // Веет. Мед.-2000.-Т.6, №4.-С.91-97.

6. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Современные представления о цирковирусах свиней//Сельскохозяйственная биология.-2002.-№6.-С.29-37.

7. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.Н., Непоклонов Е.А. Цирковирусная инфекция свиней. //Животноводство России.-2003.-С.24-25

8. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.Н., Непоклонов Е.А. Цирковирусная инфекция свиней.//Ветеринария, -2002. №11 .-С. 48-51.

9. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Инфекционные респираторные болезни свиней // Ветеринария, 2005.- №11. - С. 3-6.

10. Сатина Т.А. Цирковирусные инфекции свиней. Обзор литературы.// ФГУ ВНИИЗЖ, Владимир,- 2003,-С.58-71.

11. Albina Е., Truong G., Hutet Е. et al. An experimental Model of Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) in growing piglets //J.Comp.Pathol.2001.-V.125.-P.292-303.

12. Allan G., Meehan В., Todd D. et al. Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes //Vet.Rec.-1998.- V.142, №17.- P.467-468.

13. Allan G.M, McNeilly F, Cassidy J.P, et al. Pathogenesis of porcine circovi-rus experimental infection of colostrums deprived pigs and examination of pig foetal material .//Vet. Microbiol.- 1995.- V.44.-P. 49-64

14. Allan G.M. Porcine circivirus: Epidemiology and pathogenesis // Pig.J.-1996.-V.37.-P.14-19.

15. Allan G.M., Ellis J.A. Porcine circoviruses: a review // J.Vet.Diagn.Invest.-2000.-V.12, № 1.-P.13-14.

16. Allan G.M., Kennedy S., McNeilly F. et al. Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus //J.Comp.Pathol.-1999.-V.121, №1.-P. 1-11.

17. Allan G.M., Mackie D.P., McNair I. Et al. Production, priminary characterization and applicarions of monoclonal antibodies to porcine circovirus// Vet.Immunol.Immunopathol. 1994. - V.43, №4.-P. 357-371.

18. Allan G.M., McNeilly F., Cassidy J.P. et al. Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrums deprived piglets and examination of pig fetal material //Vet.Microbiol. 1995. - V.44, №1.- P.49-64.

19. Allan G.M., McNeilly F., Foster J.C. et al. Infection of leucocyte cell cul-4k tures derived from different species with pig circovirus //Vet.Microbiol-1994.1. V.41, №3 P. 267-279.

20. Allan G.M., McNeilly F., Kennedy S. et al. Immunostimulation, PCV-2 and PMWS //Vet.Rec.-2000.-V. 147, №6.-P. 170-171.

21. Allan G.M., McNeilly F., Kennedy S. et al. Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe//J.Vet.Diagn. Invest.- 1998.-V.10, № 1.-P.3-10.

22. Allan G.M., McNeilly F., Meehan B.M. et al. Isolation and characterization of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland // Vet.Microbiol.-1999.-V.66, №2.-P. 115-123.

23. Allan G.M., Phenix K.V., Todd D., et al. Some biological and physico-chemical proterties of porcine circovirus // J.Vet.Med.Ser.B.-1994. V.41, №1.-P. 17-26.

24. Bikour MH, Cornaglia E, Weber JM, Elazhary Y. Antigenic characterization of an H3N2 swine influenza virus isolated from pigs with proliferative and necrotizing pneumonia in Quebec//Can. J.Vet. Res. -1994.-V.58, №4.-P.287-90.

25. Bogdan J., West K., Clark E. et al. Association of porcine circovirus 2 with reproductive failure in pigs: a retrospective study, 1995-1998//Can.Vet.J.-2001. -V.42, №7.-P.548-550.

26. Borel N., Burgi E., Kiupel M. et al. Three cases of postwearing multisystemic wasting syndrome (PMWS) due to porcine circovirus type 2 (PCV) in Switzerland // Schweiz.Arch.Tierheild.-2001-V.143, №5. -P.249-255.

27. Bruderer U., Deusinger M., Schurch U., Lang A.B.- Analyses of affinity distributions within polyclonal populations of antigen- specific antibodies//J.Im-munol. Meth.,-1992.- V. 151.- P. 164.

28. Buhk H.J. Tischer.I., Koch M.A. Cloning and sequencing of the porcine cir-covirus PCV genom // Zbl. Bakteriol.Microbiol.Hyg.Ser.A., Meet. Abstr.-1985.-P.260-465.

29. Buhk H.J., Blab I., Tischer.I. Replication of negative stand DNA of the singe-stranded porcine circovirus genome //Abstr.Joint Meeting of Section Virol. And Virus Group of Soc.Gen.Microbiol.-1988.-P.54.

30. Chae C. A review of porcine circovirus 2- associated syndromes and diseases // Vet. Journal 2005- 169 (3).-P.326-336.

31. Carrasco L., Segales J., Bautista M. et al. Infestinal chlamydial infection concurrent with post weaning multisystemic wasting syndrome in pigs // Vet.Rec.-2000. -V.146, №1. -P.21-23.

32. Changming L., Takeshi I., Tetsuo N., Susumu U. Development of an ELISA Based on the Baculovirus-Expressed Capsid Protein of Porcine Circovirus Type 2 as Antigen //J.Vet.Med.Sci.-2004-V.66, №3. P. 237-242.

33. Choi C., Chae C. Colocalization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2 in porcine dermatitis and nefrology syndrome by doublelabeling technique // Vet. Pathol. -2001.-V.38.-P.436-441.

34. Choi C., Chae C. Distribution of porcine parvovirus in porcine circivirus 2 -infected pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome as shown by in-situ hybridization // J. Сотр. Pathol. -2000. V. 123, №4. -P.302-305.

35. Choi C., Chae C. In-situ hybridization for the detection of porcine circovirus in pigs with postwearning multisystemic wasting syndrome //J.Comp.Pathol.-1999.-V.121, №3.-P.265-270.

36. Choi C., Chae C., Clark E.G. Porcine postwearning multisystemic wasting syndrome in Korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohis-tochemistry and polymerase chain reaction. // J. Vet. Diagn. Invest.-2000. V.12, №2.-P.151-153.

37. Choi Y.K., Goyal S.M., Joo H.S. Retrospective analysis of etiologic agents associated with respiratory diseases in pigs. //Can.Vet.J. -2003.-V. 44.-P. 735-737.

38. Clark E.G. Post-weaning multisystemic wasting syndrome //Proc. Am. Assoc. Swine Proct.-1997.-P.499-501.

39. Clark E.G., Harding J.C. Circovirus-an emerging swine pathogen //ISU Swine Disease Conf.Proc.-1997.-P.63-64.

40. Cutlip B.C., Mengeling W.L. Experimentally induced infection of neonatal swine with porcine parvovirus //Am.J.Vet.Res.-1975.-V.36-P.l 179-1182.

41. Daft В., Nordhausen R.W., Latimer K.S. et al. Interstitial pneumonia and lymphadenopathy associated with circoviral infection in a six-week-oid pig// 39th Meeting of the Am.Assoc.Vet.Lab.Diagn.-1996.-P.32-39.

42. Darwich L., Segales J., Mateu E. Phathogenesis of postweaning multisystemic wasting syndrome caused by Porcine circovirus 2: an immune riddle.//Arch Virol.- 2004.-V. 149.-P. 857-874.

43. Drolet R., Thibault S., D'Allaire S. et al. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS): an overview of the disease // Swine Health Prod.-1997.-V.7-P.241-245.

44. Edwards S., Sands J.J. Evidence of circovirus infection in British pigs // Vet. Rec.-1994.-V.134, № 26.-P.680-681.

45. Ellis D., Krakowka S., Lairmore m., et al. Reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets.// J.Vet.Diagn.Invest.-1999.-V.11.-P.3-14.

46. Ellis J, Clark E, Haines D, West K, Krakowka S, Kennedy S, Allan GM. Porcine circovirus-2 and concurrent infections in the field.// Vet Microbiol. -2004.- Feb 4;98(2).-P.159-163.

47. Ellis J., Hassard L., Clark E. et al. Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome //Can.Vet.J. 1998.-V.39, № 1.-P.44-51.

48. Ellis J.A., Allan G.M. The natural history of porcine circoviruses 7/ MERIAL-PMWS Symposium. Medbourne, 2000. - P. 3-19.

49. Ellis J.A., Bratanich A., Clark E.G. et al. Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postwearning multi-systemic wasting syndrome // J. Vet. Diagn. Invest.-2000.-V.12, №l.-P.21-27.

50. Ellis JA, Krakowa S, Allan G, Clark E, Kennedy S. The clinical scope of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection has expanded since 1987: an alternative perspective.// Vet Pathol. -1999.-V.36, №3.-P. 262-265.

51. Gassmann M., Focher F., Buhk H.J. et al. Replication of single-stranded porcine circovirus DNA by DNA polimerase-alpha and polimerase-delta //Biochem.biophys.Acta.-1988.-V.951 .-P. 280-289.

52. Goryo M., Suwa Т., Matsumoto S. et al. Serial propagation and purification of chicken anaemia agent in MDCC-MSB1 cell line//Avian Pathol.-1987.- V.16.-P. 149-163.

53. Haaijman J.J., Coolen J., Deen C. et al. Monoclonal antibodies directed against human immunoglobulins: preparation and evaluation procedures.//Reviews on Immunoassay Technology, Ed. S.B.Pal.- The Macmillan Press LTD.-1988.-P. 59-93.

54. Halbur PG, Paul PS, Vaughn EM, Andrews JJ. Experimental reproduction of pneumonia in gnotobiotic pigs with porcine respiratory coronavirus isolate AR310.//J Vet Diagn Invest.-1993.-V.5, №2.-P. 184-188.

55. Hamel A.L., Lin L.L., Nayar G.P. Nucleotide sequence of porcine circovirusassociated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs // L.Virol. -1998.-V.72, № 6.-P.5262-5267.

56. Hamel A.L., Lin L.L.,Sachvie C. et al. PCR detection and characterization of type-2 porcine circovirus //Can. J.Vt. Res.-2000.-V.64, №l.-P.44-52.

57. Harding J.C. Post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS): preliminary epidemiology and clinical presentation // 28th AASP.-1997.-P503-504.

58. Harding J.C. The clinical expression and emergence of porcine circovirus 2. //Vet. Microbiol. -2004-V.98, №4, -P. 131-135.

59. Harding J.C., Clark E.G., Strokappe J.H. et al. Post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS): epidemiology and clinical presentation//Swine Health

60. Prod.-1998.-№6.-P.249-254.

61. Harding J.C.S, Clark E.G., Strokappe J.H., Willson P.I., Ellis J.A. Postweaning multisystemic wasting syndrome: Epidemiology and clinical presentation. //Swine Health Prod. -1998.- V.6.- P. 249-254.

62. Harding J.C.S. Clark E.G. Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)//Swine Health and Prod. -1987.-№5.-P.201-203.

63. Hasegawa M., Shioya H., Yuyama Y. et al. Pigs confirmed to be infected with porcine circovirus 2 as ealy as 1988//J.Japan.Vet.Med.Assn.-2001.-V.54, №10.-P. 757-760.

64. Hines R.K., Lukert P.D. Porcine circovirus as a cause of congenital tremors in newborn pigs //Proc.Am.Assoc.Swine Pract.-1994.-P.344-345.

65. Hinrichs U. et al. Klinische und pathomorphologische Erscheinungsformen des porzinen Dermatitis-Nephropathie Syndroms //Amtstierarzticher Dienst.-2000.-Bd.l.-S.553-555.

66. Huedepohl В., Thacker B. Porcine circovirus: a review //Iowa State ► Univ. Vet.-1998.-V.60.№2.-.P.92-97.

67. Hulsen J. Porcine reproductive and respiratory syndrome round table discussion //Tijgschr. Diergeneesk.-2000.-V. 125, № 14.-P. 457-459.

68. Ignjatovic J. Circoviridae: new viruses of pigs, parrots and chickens// Austral. Vet. J.-1995.-V.72, № 1.-P.40.

69. Illanes O., LopezA., Miller L. et al. Lesions associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs from Prince Edward Island, Canada // J. Vet. Diagn. Invest.-2000.-V.12, №2.- P.146-150.

70. Johnson C.S., Direksin K., Joo H.S. Pathogenicity of porcine circovirus type 2 in latetrm swine fetuses //Proc. Of the 16th IPVS Cong.-Melbourne, Australia, 2000.-P.400.

71. Khilko S. N., Kirasova M. A., Kiseleva E.K., Tikhonenko Т. I. Comparison of adenoviral hexon polypeptides (monomers) and of native hexson (trimers) by SDS-polyacrilamide gel electrophoresis.//Acta.Microbiol.Hungarica,-1990.-V. 37.-P. 233-245.

72. Kim J., Chae C. Differentiation of porcine circovirus 1 and 2 in formalin-wax-fixed paraffin-embedded tissues from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome by in situ hybridization //Res. Vet.Sci.-2001 .-V.70.-P.265-269.

73. Kiss I., Kecskemeti S., Tuboly T. et al. New pig disease in Hugary: postweaning multisystemic wasting syndrome caused by circovirus (short communication) //Acta.Vet.Hung.-2000.-V.48,№ 4.-P.469-475.

74. Kiupel M. et al. Cellular localization of porcine circovirus in postveaning pigs with chronic wasting disease // Europ.J.Vet.Pathol.-1999.-V.5.-P.77-82.

75. Kiupel M., Stevenson G.W., Mittal S.K. et al. Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana // Vet. Pathol. 1998.-V.35,№4.-P.303-307.

76. Krakowka S., Ellis J.A., McNeilly F. et all. Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2) //Vet.Pathol.-2001.-V.38, № 1.-P.31-42.

77. Kyhse-Andersen J.- Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose.// J. Biophys.Biochem.Meth.-1984.-V.10.-P. 203-209.

78. Labarqe G.G., Nauwynck H.J., Mesu A.P., Pensaert M.B. Seroprevalence of porcine circovirus types 1 and 2 in the Belgian pig population // Vet. Q.- 2000.-V.22.-P. 234-236. Erratum in: Vet Q (2001), 23:56

79. Larochelle R., Antaya M., Morin M. et al. Typing of porcine circovirus in clinical specimens by multiplex PCR //J.Virol.Methods.-1999.-V.80,№l.-P.69-75.

80. Larochelle R., Bielanski A., Muller P. Et al. PCR detection and evidence ofshedding of porcine circovirus type 2 in boar semen//J.Clin.Microbiol.-2000.-V.38, №12.- P.4629-4632.

81. Larochelle R., Morin M., Antaya M. et al. Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR // Vet. Rec.-1999.-V.145, №5.-P. 140-142.

82. LeCann P., Albina E., Madec F. et al. Piglet wasting disease //Vet.Rec.-1997.-V.141,№ 25.-P.660.

83. Liu Q., Tikoo S.K., Babiuk L.A. Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type2 //Virology.-2001.-V.285, № 1.-P.91-99.

84. Liu Q., Wang L., Willson P. et al. Quantitative, competitive PCR analysis of porcine circovirus DNA in serum from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome // J.Clin. Microbiol.-2000.-V.38, № 9.-P.3474-3477.

85. Liu Q., Willson P., Attoh-Poku S. et al. Bacterial expression of an immunologically reactive PCV2 ORF 2 fusion protein //Protein Expr.Purif.-2001.-V.21., №1.-P.l 15-120.

86. Lukert P.D., Allan G.M. Porcine Circovirus //Diseases of Swine.-8th ed.-Ames, Iowa USA, -1999.-P.119-124.

87. Magar R, Larochelle R, Thibault S, Lamontagne L. Experimental transmission of porcine circovirus type 2 (PCV2) in weaned pigs: a sequential study.// J.Comp.Pathol.-2000.-V. 123, №4.-P. 258-269.

88. Magar R, Robinson Y, Dubuc C, Larochelle R. Isolation and experimental oral transmission in pigs of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate.//Adv Exp Med Biol. -1995.-V.380.-P.139-144.

89. Mahe D., Blanchard P., Truo.ng C. et al. Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immu-norelevant epiotopes //J.Gen.Virol.-2000.-V.81, №7.- P.1815-1824.

90. Mankertz A., Blaess G., Mankertz J. et al. Analysis of transcription and replication of porcine circovirus PCV // IXth Int.Congr.Virol.-1993.-P.76.

91. Mankertz A., Domingo M.,Folch J.M. et al. Characterisation of PCV-2 isolated from Spain, Germany and France// Virus Res.-2000.-V.66, №1,- P. 65-77.

92. Mankertz A., Mankertz J., Wolf K. et al. Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus //J.Gen.Virol.-1998.-V.79, № 2.-P381-384.

93. Mankertz J., Buhk H.J., Blaess G. et al. Transcription analysis of porcine circovirus (PCV) //Virus Genes.-1998.-V. 16, №3.-P. 267-276.

94. Mankertz J., Persson F., Mankertz A., et al. Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus //J.Virol.-1997.-V.71., №3.-P. 2562-2566.

95. McNeilly F., Allan G.M., Foster J.C. et al. Effect of porcine circivirus infection on porcine alveolar macrophage function //Vet.Immunol.Immunopathol.-1996.-V.49,№4.-P.295-306

96. McNeilly F., McNair I., Mackie D.P. et al. Production, characterisation and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus 2//Arch. Virol. -2001.-V.146, № 5.- P.909-922

97. Meehan B.M., Creelan J.L., McNulty M.S. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus // J.Gen.Virol. 1997.- V.78, №1.-P.221-227.

98. Meehan B.M., McNeilly F., McNair I. Et al. Isolation and characterization of porcine circovirus 2 from cases of sow abortion and porcine dermatitis and nephropathy syndrome // Arch. Virol,-2001 .-V. 146, №4.-P.835-842.

99. Meehan B.M., McNeilly F., Todd D. et al. Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs //J.Gen.Virol.-1998.-V.79, №9-P. 2171-2179.

100. Miyata Hironori, Tsunoda Hiroaki, Kazi Aslamuzzaman et al. Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus //J.Virol.-1999.-V.73,№ 5.-P.3582-3586.

101. Morozovl., Sirinarumitr Т., Sorden S. Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome // J. Clin. Microbiol. 1998. - V.36, №9.- P. 2535-2541.

102. Mushahwar I.K., Erker J.C., Muerhoff A.S.et al. Molecular and biophysical characterization of TTR virus: evidence for a new virus family infecting humans //Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1999.-V.96, №6.-P.3177-3182.

103. Nawagitgul P., Harms P.A.„ Morozov I., Thacker В J., Sorden S.D., Chal-^ ermpol Lekcharoensuk C., Paul P.S. Modified Indirect Porcine Circovirus

104. PCV) Type 2-Based and Recombinant Capsid Protein (0RF2)-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for Detection of Antibodies to PCV//Clin. Diagn. Lab.Immunol.- 2002- V.9, №1.- P. 33^10.

105. Nawagitgul P., Morozov I., Bolin S.R. et al. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsidprotein //J.Gen.Virol.-2000.-V.81, №9.- P.2281-2287.

106. Nayar G.P., Hamel A., Lin L. Detection and characterization of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs.//Can. Vet. J.-1997.-V.3 8, №6.-P.385-386.

107. Niagro F.D., Forsthoefel A.N., Lawther R.P. et al. Beak and feather disease virus and porcine circovirus genomes; intermediates between the geminiviruses and plant circoviruses //Arch.Virol.-1998.-V.143, №9.-P.l 723-1744.

108. O'Connor В., Gauvreau H., West K. et al. Multiple porcine circovirus 2- associated abortions and reproductive failure in multisite swine production unit //Can. Vet J.-2001.-V.42,N7.-P.551-553.

109. Ohlinger V.F., Schmidt U., Pesch S. Studies on patogenetic aspects of the post weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) // Proc. Of 16th IVPS Congr. -Melborne, Australia, 2000. P.577.

110. Onuki A., Abe K., Togashi K. et al. Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan // J.Vet.Med.Sci.-1999.-V.61, №10.-P. 1119-1123.

111. Otaki Y., Nunoya Т., Tajima M. et al. Depression of vaccinal immunity to Mareks disease by infection with chicken anaemia agent//Avian Pathol.-1988.-V.17.-P.333-347.

112. Ouardani M., Wilson L., Jette R. Et al. Multiplex PCR for detection and typing of porcine circoviruses //J. Clin. Microbiol.-1999.-V.37, №12.- P. 3917-3924.

113. Pallares F.J., Halbur P.G., Opriessnig T. et al. Porcine circovirus type 2 (PCV-2) coinfections in US field cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) // J. Vet. Diagn. Invest.- 2002,-V. 14, №6.-P. 515-519.

114. Pesch S., Schmidt U., Ohlinger V.F. Proliferative necrotizing pneumonia: a result of co-infection with porcine reproductive and respiratory disease virus (PRRS) and porcine circovirus type 2 (PCV2). // Pig Progress -2000.-№9.-P.28-29.

115. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G., Metal chelate affinitychroma-tography, a new approach to protein fractionation.//Nature-1975.-V.258.-P.598-599.

116. Rodriguez-Arrioja G.M., Segales J., Balasch M, Rosell C. Quintana J., Folch J.M., Plana-Duran J., Mankertz A., Domingo M. Serum antibodies to pocine circovirus type 1 and type 2 in pigs with and without PMWS. //Vet. Rec.-2000.-V.146.-P. 762-764.

117. Rodriguez-Arrioja G.M., Segales J., Rosell C. et al. Aujeszky's disease virus infection concurrent with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs //Vet.rec.-1999.-V. 144, № 6.-P. 152-153.

118. Rosell C., Segales J., Domingo M. Hepatitis and staging of hepatic damage in pigs naturally infected with porcine circovirus type 2 //Vet.Pathol.-2000.-V.37, №6.-P.687-692.

119. Rosell С., Segales J., Domingo M. Hepatitis and staging of hepatic damage in pigs naturally infected with porcine circovirus type 2// Vet.Pathol.-2000.-V.37, № 6.- P. 687-692.

120. Rosell C., Segales J., Plana-Duran J. et al. Pathological, immunohistochemi-cal, and in-situ hybridization studies of natural cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs //J.Comp. Pathol. -1999.-V.120, №1.- P.59-78.

121. Rovira A., Balasch M., Segales J. et al. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porsine circovirus 2// J.Virol.-2002.-V.76.-P.3232-3239.

122. Sanchez R.E., Meerts P., Nauwynck H.J., Pensaert M.B., Change of porcine circovirus 2 target cells in pigs during development from fetal to early postnatal life.//Vet.Microbiol.-2003.-V. 95.- P. 15-25.

123. Sato K., Akachi S. et al. Pathological findings of pigs infected with porcine circovirus type 2 // J.Japan Vet.Med.Assn.-2001.-V.54, №1.- P. 13-17.

124. Sato K., Shibahara Т., Ishikawa et al. Evidence of porcine circovirus infection in pigs with wasring disease syndrome from 1985 to 1999 in Hokkaido, Japan// J.Vet.Med.Sci.-2000.-V.62, №6.- P.627-633.

125. Segales J. et al. Porcine circovirus is present in cases of porcine dermatitis and nephropathy syndrome//15thInt.Pig.Vet.Proc.-Birmingham, 1998.-P.215.

126. Segales J., Alonso F., Rossell C. et al. Changes in peripheral blood leukocyte population in pins with natural postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)//Vet.Immunol.Lmmunopathol.-2001.-V.30,№l-2.-P.37-44.

127. Segales J., C.Rosell and M.Domingo Pathological findings associated with naturally acquired porcine circovirus type 2 associated disease. //Vet.Microbiol.-2004.-V. 98, №4.-P. 137-149.

128. Segales J., Domingo M. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome: a porcine circovirus type 2 infection disease //MERIAL-PMWS Symposium.-Melbourne, 2000.-P.21-31.

129. Segales J., Domingo M. Postweaning multisystemik wasting syndrome (PMWS) in pigs. A review//Vet. Q 2002-V.24.- P. 109-124.

130. Segales J., Sitjar M., Domingo M. etal. First report of post-weaning multi-systemic wasting syndrome in pigs in Spain //Vet.Rec.-1997.-V.141, №23.-P.600-601.

131. Shibahara Т., Sato K., Ishikawa Y. Pprcine circovirus induces В Lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome //J.Vet.Med.Sci.-2000.-V.62, №11.-P.l 125-1131.

132. Shibahara Т., Sato K., Ishikawa Y., Kadota K. Porcine circovirus induces В lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome.// J.Vet.Med.Sci.-2000.- V.62.- P.l 125-1131.

133. Sirinarumitr Т., Sorden S.D., Morozov I. et al. Double in situ hybridization for simultaneous detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and porcine circovirus (PCV)//J.Vet.Diagn.Invert.-2001.-V.13,№ 1.-P.68-71.

134. Smith W.J., Thomson J.R., Done S. Dermatitis/nephropathy syndrome of pigs//Vet.Rec.-l 993 .-V.132.-P.47.

135. Stevenson G.W., Kiupel M., Mittal S.K. et al. Ultrastructure of porcine circovirus in persistently infected PK-15 cells //Vet.Pathol.-1999.-V.36, №5.-P. 368378.

136. Stevenson G.W., Kiupel M., Mittal S.K. et al. Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturally occurring congenital tremors//J.Vet.Diagn.Invest.-2001.-V.13,№l.-P.57-62.

137. Thomson J.R. et al. A study of paseurella multocida as a possible etiolodical agent in porcine immune complex glomerulonephritis and dermatitis syndrome //15th Int.Pig. Vet.Soc.Cong.Proc.-Birmingham,-1998.-P.396.

138. Thomson JR, Maclntyre N, Henderson LE, Meikle CS, Detection of Pas-teurella multocida in pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome.// Vet.Rec.-2001.-V.149.-P. 412-417.

139. Tischer I., Bode L., Peters D. et al. Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine population of different breeding faims//Arch.Virol.-1995.-V. 140, № 4.-P.737-743.

140. Tischer I., Buhk H.J. Viral DNA from cells infected with porcine circovirus //Zbl.Bakt.Microbiol.Hyg.Ser.A.-1988.-Bd.27.-S.280-287.

141. Tischer I., Mield W., Wolff D. et al. Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus //Arch. Virol.-1986.-V.91, № 3-4.-P.271-276.

142. Tischer I., Mields W., Wolff D. et al.: Studies on the pathogenicity of porcine circovirus.// Arch.Virol. 1986.- V. 91.- P.271-276

143. Tischer I., Peters D., Rasch R. et al. Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence //Arch.Virol.-1987.-V.96, № 1-2.-P. 39-57.

144. Tischer I., Rasch R., Tochterman G. Characterization of papovirus- and pi-cornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines // Zentralbl. Bacterid., Microbiol, und Hygiene, Reihe А,- 1974.- V. 226.-P.153-167.

145. Tischer I., Rasch R., Tochtermann G. Characterization of papovavirus and picornavirus - like particles in permanent pig kidney cell lines// Zbl.Bakteriol. Mikrobiol.Hyg.Ser. A.-1974.-Bd.226.-S. 153-167.

146. Todd D., Creelan J.L., Meehan B.M. et al. Investigation of the transfection capability of cloned tandemly-repeated chicken anaemia virus DNA fragment // Arch.Virol.-1996.-V. 141.- P.1523-1534.

147. Todd D., Niagro F.D., Ritchie B.W. et al. Comparison of three animal viruses with circular singlestranded DNA genomes //Arch.Virol.-1991-V.l 17, №1-2.-P.129-135.

148. Truong С., Mahe D., Blanchard P. et al. Identification of an immunorelevent ORF2 epitope from porcine circovirus type 2 as a serological marker for experimental and natural infection //Arch.Virol.-2001.-V. 146, №6. -P. 1197-1211.

149. Vyt P., Labargue G., Pensaert H. et al. Prevalens of porcine circovirus types ^ 1 and 2 in the Belgian pig population //Proc.of the 16th IPVS Congr.-Melboume,1. Australia, -2000.-P.627.

150. Walker I.W., Konoby C.A., Jewhurst V.A. et al. Development and application of a competitive anzyme-linked immunosorbent assay for the detection of serum antibodies to porcine circovirus type 2 //J.Vet. Diagn. Invest.-2000.-V. 12, №5,- P.400-405.

151. Wellenberg G.J., Pesch S., Berndsen F.W. et al. Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-wearning multisystemic wasting syndrome in the Netherland //Vet. Q.-2000.-V.22, №3.-P.167-172.

152. West K.W., Bystrom J., Wojnarowicz C. et al. Myocarditis and abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus-2 // J. Vet. Diagn. Invest.-1999.-V.11, № 6. P.530-532.

153. Патент Fr. 9808777. Int C17:A 61 К 39/23, A 61 P 31/12, 37/04. Vaccin circovirus et parvovirus porcine / Allan G., Meehan В., Ellis J., et al. Date de mise a la disposition du public de la demande: 21.01.00. Bulletin 00/03.