Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка биологических препаратов для снижения техногенной и микробиологической нагрузки на организм животных и окружающую среду

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Разработка биологических препаратов для снижения техногенной и микробиологической нагрузки на организм животных и окружающую среду"

На правах рукописи

МАТРОСОВА ЛИЛИЯ ЕВГЕНЬЕВНА

РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ТЕХНОГЕННОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ НА ОРГАНИЗМ ЖИВОТНЫХ И ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ

06.02.03-ветеринарная фармакология с токсикологией

06.02.02-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

11 СЕН 2014

Казань-2014

005552338

005552338

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» («ФЦТРБ-ВНИВИ») г. Казань.

Научные консультанты: Тремасов Михаил Яковлевич -

доктор биологических наук, профессор Иванов Александр Аркадьевич -доктор биологических наук Официальные оппоненты: Софронов Владимир Георгиевич -

доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой зоогигиены ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»; Желтов Василий Алексеевич -доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории токсикологии и санитарии кормов ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии»; Васильев Дмитрий Аркадьевич -доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная " сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина»

Ведущее учреждение: ФГБОУ ВПО «Московская государственная

академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита состоится «21» октября 2014 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок-2, «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на официальных сайтах ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru; полный текст диссертации, автореферата и отзыв научных консультантов - на официальном сайте «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru

Автореферат разослан « г?» августа 2014 года.

Учёный секретарь диссертационного советй^ ^

кандидат ветеринарных наук В.И. Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Характерной особенностью современности является тенденция возрастания антропогенного воздействия на окружающую среду, приводящая к ухудшению экологического состояния. Наибольшая роль в загрязнении атмосферы, почвенных и водных объектов принадлежит промышленным предприятиям и сельскому хозяйству [13; 16]. Накопление в кормах и воде токсикантов техногенного и природного происхождения приводит к снижению резистентности, часто регистрируемым на практике отравлениям животных [3; 5; 12].

Основной и в большинстве случаях нерешенной проблемой ведения животноводства по-прежнему остается утилизация отходов. Значительное количество навоза/помета, распространяя зловонный запах на большие территории, являясь местом выплода мух, представляя эпизоотологическую опасность, остается неиспользованным в условиях агропромышленного комплекса при наблюдаемом снижении плодородия почв и дефиците органических удобрений [15]. Для решения данной проблемы предложены способы утилизации отходов, среди которых биологические методы, в силу экономичности, отсутствия дополнительного ущерба экосистемам становятся все более востребованными [1; 17; 19]. Средства микробного происхождения, применяемые в реабилитационных технологиях как при самостоятельном, так и сочетанном воздействии с другими технологическими приемами, позволяют улучшить качество субстрата в санитарно-гигиеническом отношении и получить ценный продукт в виде органического удобрения.

Микробная обсемененность навоза/помета напрямую зависит от состояния кишечного биоценоза, нарушение которого вызывается различными этиологическими факторами, в том числе и воздействием экотоксикантов. Для профилактики и лечения дисбактериозов, повышения резистентности животных широко используются пробиотические препараты [2; 8; 11].

Однако, несмотря на наличие средств утилизации отходов, широкого ассортимента пробиотиков, разработка, изучение механизма действия и внедрение новых препаратов в условиях ужесточения требований к охране окружающей среды, получения безопасной растениеводческой и животноводческой продукции, остается актуальной задачей. Их применение позволит улучшить экологическую ситуацию, поддерживать ветеринарное благополучие хозяйств, а использование пробиотиков отдельно и в комплексе лечебно-профилактических мероприятий снизит заболеваемость и повысит сохранность животных.

Степень её разработанности. В настоящее время в мире значительное внимание уделяется вопросам охраны окружающей среды. Одним из аспектов снижения негативных последствий рассматривается ограничение использования в агропромышленном комплексе химических средств и, при возможности, замена их биологическими. Разработанные на основе микроорганизмов препараты применяются для ремедиации нефтезагрязненных объектов, в ветеринарной медицине, в качестве средств защиты растений и т.д.

В литературе встречаются отдельные сообщения о разработке средств и методов утилизации органических отходов сельскохозяйственных предприятий [4; 10; 18]. Несмотря на постоянно растущий интерес исследователей к данной проблеме, научных публикаций в этом плане явно недостаточно, а имеющийся арсенал препаратов из-за больших объемов разнообразного субстрата не всегда является доступным и эффективным.

В «ФЦТРБ-ВНИВИ» проводятся научно-исследовательские работы, посвященные разработке биологических препаратов - деструкторов органических отходов, а также пробиотиков для профилактики и комплексной терапии токсикозов животных. В результате целенаправленных исследований сотрудниками Центра разработаны технологии изготовления и использования средств утилизации органических отходов (ускорителей ферментации) и пробиотика Энтероспорин. Результаты этих исследований и отражены в нашей работе.

Цели и задачи. Целью настоящей работы явилось научно-практическое обоснование способов снижения техногенной и микробиологической нагрузки на организм животных и окружающую среду с использованием средства УФ-2 для утилизации органических отходов и пробиотика Энтероспорин.

Достижение указанной цели предполагало решение следующих задач: -выделение и отбор микроорганизмов из природных биотопов с экспериментальным обоснованием выбора наиболее активных изолятов, их идентификация, создание на их основе средств утилизации органических отходов;

-оценка безопасности, толерантности к неблагоприятным воздействиям и изучение антагонистической активности отобранных микроорганизмов в условиях in vitro и in situ;

-определение показателей безопасности разработанного средства УФ-2 и изучение его деструктивной активности для утилизации органических отходов животноводства, сточных вод и их осадков в лабораторных и производственных условиях;

-изучение детоксицирующей активности отобранных микроорганизмов в отношении ксенобиотиков (карбаматные и хлорорганические пестициды: тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД), дихлордифенилтрихлорметан (ДДТ) и его метаболит ДЦЕ, гексахлоран);

-оценка эффективности применения Энтероспорина для коррекции кишечного биоценоза животных и снижения негативного влияния микотоксинов на клинические, гематологические, биохимические, микробиологические показатели и факторы неспецифической резистентности.

Научная новизна. В процессе исследований получены новые научные данные теоретического и прикладного характера.

Впервые на основе сформулированных критериев отбора проведен скрининг микроорганизмов с целью использования их для утилизации органических отходов. В результате целенаправленного поиска создана коллекция наиболее активных бактерий, мицелиальных грибов и дрожжей, способных к деструкции органического сырья. С учетом принципа

биосовместимости подобраны консорциумы эффективных, технологичных микроорганизмов и на их основе разработаны биопрепараты.

Научно аргументировано, теоретически и экспериментально обосновано применение дрожжей семейства Saccharomycetaceae для утилизации органических отходов. Изоляты, обозначенные как Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kiidriavzevii-96 (анаморфа Candida krusei) идентифицированы классическими микробиологическими методами и на; основе данных молекулярно-генетического анализа.

Оценена биологическая активность и доказано отсутствие токсического эффекта рассматриваемых микроорганизмов при длительном воздействии и отрицательного влияния на гематологические, биохимические и иммунологические показатели.

Впервые с помощью электронно-микроскопических исследований проведена оценка ультраструктурных изменений клеток патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus) под воздействием диффундирующих в агар метаболитов дрожжей.

Выявлена детоксицирующая активность отобранных микроорганизмов в отношении карбаматного и хлорорганических пестицидов.

В лабораторных и производственных условиях на птицеводческих, свиноводческих и скотоводческих комплексах, очистных сооружениях показана эффективность применения разработанного на основе Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 средства УФ-2.

Показана эффективность использования разработанного и зарегистрированного в Российской Федерации лекарственного препарата Энтероспорин. Изучено состояние микробиоценоза кишечника животных на фоне применения Энтероспорина. Использование пробиотика в период потребления кормов, содержащих микотоксины, способствует улучшению морфо-биохимических показателей крови, естественной резистентности, положительно влияет на клиническое состояние и динамику живой массы.

Результаты исследований научно обосновывают применение разработанных средств утилизации органических отходов и пробиотика Энтероспорин в животноводстве, ветеринарной медицине, позволяющих снизить техногенную и микробиологическую нагрузку на животных и окружающую среду.

Новизна исследований подтверждена патентами РФ № 2298031; 2491942; 2522523.

Теоретическая н практическая значимость работы. Настоящая работа относится к области фундаментальных и прикладных исследований. Полученные данные дополняют представления о биологических свойствах и практическом применении дрожжей и бактерий Bacillus subtilis.

На основании проведенных экспериментов теоретически и практически обоснованы, разработаны и предложены производству биологические препараты.

Результаты диссертационной работы имеют важное практическое значение для решения экологических проблем, способствуя охране окружающей среды и рациональному использованию органического сырья.

На фоне улучшения микробиоценоза применение пробиотика с лечебной и профилактической целью снижает выделение с экскрементами в окружающую среду патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что в комплексе с биопрепаратами для утилизации отходов позволит более эффективно проводить реабилитационные мероприятия, обеспечивая ветеринарное благополучие хозяйств.

Результаты проведенных исследований использованы при составлении методических рекомендаций и пособий, нормативной документации, утвержденных на федеральном уровне.

Методология и методы исследования. Для решения поставленной цели и задач в диссертационной работе использован комплекс как общенаучных, так и частнонаучных методов исследования.

Первые предусматривали применение совокупности общетеоретических и эмпирических методов исследования, таких как системный подход, моделирование, анализ, эксперимент, измерение, сравнение и т.д.

Из частнонаучных использованы токсикологические, микробиологические, хроматографические, спектрометрические, колориметрические, электронно-микроскопические, иммунологические, гистологические и другие методы исследования, выполненные на высокотехнологичном оборудовании научных подразделений «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Положения, выносимые на защиту:

-скрининг микроорганизмов - потенциальных деструкторов органического сырья;

-токсикологическая оценка и биологическая активность отобранных микроорганизмов;

-разработка средства УФ-2 для утилизации органических отходов, с изучением его безопасности для животных и отработка доз в модельных экспериментах;

-эффективность использования УФ-2 для утилизации птичьего помета, навоза крупного рогатого скота и свиней, сточных вод и их осадков;

-оценка деструктивной активности отобранных микроорганизмов в отношении карбаматных и хлорорганических пестицидов;

-эффективность использования пробиотика Энтероспорин для нормализации кишечного биоценоза и снижения негативного влияния микотоксинов у лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обусловлена значительным объемом экспериментального материала, полученного с использованием высокоинформативных методов исследования в лабораторных и производственных условиях с подтверждением данных математической статистикой.

Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на научных сессиях «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за

2006-2013 гг.; международных, межрегиональных, всероссийских научно-практических конференциях; международных конгрессах; съездах микологов, ветеринарных фармакологов и токсикологов (Казань, 2006, 2007, 2013; Воронеж, 2007; Москва, 2008-2010, 2012, 2013; Ульяновск, 2008; Махачкала, 2012; Прага, 2012, 2014; Саратов, 2013; Екатеринбург, 2013; Стамбул, 2014).

По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе 27-в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Диссертация изложена на 419 страницах стандартного компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результатов исследований, заключение, списки сокращений и условных обозначений, литературы, иллюстрированного материала, приложения. Работа иллюстрирована 88 таблицами и 52 рисунками. Список использованной литературы включает 587 источников, в том числе 182 иностранного автора.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 Обзор литературы

Представлен анализ литературных данных по изучаемой проблеме. Рассмотрено применение разнообразных методов и способов снижения техногенной и микробиологической нагрузки на окружающую среду. Показана эффективность использования бактерий, мицелиальных и дрожжевых грибов для утилизации отходов, ремедиации нефтезагрязнений, деструкции ксенобиотиков, в качестве альтернативы пестицидам. Один из параграфов посвящен пробиотическим препаратам, использование которых с вступлением России в ВТО становится все более актуальным в связи с необходимостью получения экологически чистой продукции, не содержащей антибиотики.

2.2 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в отделе токсикологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) по заданию «Токсикологическая безопасность» (№ гос. регистрации 01200202603) с 2006 по 2014 год. Производственные опыты проведены в условиях животноводческих предприятий и очистных сооружений ряда регионов РФ.

Для снижения техногенной и микробиологической нагрузки в животноводстве испытали препараты микробного происхождения: разработанные на основе выделенных микроорганизмов средства утилизации органических отходов и пробиотик Энтероспорин. Автор непосредственно принимал участие на всех этапах их производства, осуществлял контроль готовой продукции.

В экспериментах, определенных целями и задачами диссертационной работы, использовали лабораторных (белые мыши и крысы, морские свинки, кролики) и сельскохозяйственных животных (свиньи, крупный рогатый скот, цыплята-бройлеры). Опытные и контрольные группы животных формировали по принципу аналогов.

На первом этапе работы проводили поисковые исследования микроорганизмов, рассматриваемых в качестве возможных деструкторов органического сырья. Выделение микроорганизмов производили методом прямого высева из различных субстратов на питательные среды. Отдельные наиболее "характерные морфологически различающиеся колонии использовали для получения чистой культуры. Доминирующие и часто встречаемые в субстрате изоляты (бактерии, мицелиальные грибы, дрожжи) использовали для дальнейшего анализа.

Возможную вирулентность, токсичность и токсигенность изолятов определяли путем внутрибрюшинного введения белым мышам неинактивированной, инактивированной микробной суспензии и центрифугата культуральной жидкости в дозе 0,5 см3. Дополнительно, для выявления патогенных дрожжевых грибов, использовали тест на ростовые трубочки. Токсигенность микромицетов оценивали на простейших Paramecium caudatum.

Изоляты, удовлетворяющие требованиям, предъявляемым к средствам для утилизации органических отходов, идентифицировали общепринятыми в микробиологии методами путем анализа культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков. Окончательную идентификацию изолятов, являющихся основой рассматриваемого в работе средства, проводили на ДНК-амплификаторе Терцик с использованием синтетических олигонуклеотидов, производства ЗАО «Синтол» (г. Москва).

Оценку безвредности отобранных микроорганизмов проводили согласно Методическим указаниям по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм, препаратов в объектах производственной и окружающей среды (М., 1991).

Взятие крови у белых крыс осуществляли путем декапитации под предварительным эфирным наркозом, у крупного рогатого скота - из яремной вены, у свиней - из хвостовых сосудов, у цыплят - бройлеров - из подкрыльцовой вены.

Количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, СОЭ определяли общепринятыми методами. Содержание общего белка - рефрактометрическим, белковые фракции - турбидиметрическим методами. Концентрацию глюкозы, холестерина, мочевины, активность холинэстеразы, аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (AJIT) и щелочной фосфатазы определяли на анализаторе «Microlab 300».

Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по методике А.Н. Кост, М.И. Стенко [6]; лизоцимную активность - по Ю.М. Маркову [9]. Определение Т-лимфоцитов в крови проводили методом спонтанного розеткообразования (E-ROK), идентификацию В-лимфоцитов - по Г. Фримелю, Й. Броку [20].

Для оценки кишечного биоценоза проводили микробиологическое исследование фекалий, которые отбирали у телят, поросят, цыплят пластиковым зондом, у белых крыс - из кишечника после вскрытия.

Из полученного материала готовили десятикратные разведения в стерильном 0,9 %-ным растворе натрия хлорида с последующим посевом каждого разведения на элективные питательные среды.

Визуально оценивали выросшие на питательных средах колонии, типичные для определенной группы микроорганизмов, с подтверждением световой микроскопией, окрашенных по Грамму препаратов. Количество выращенных колоний умножали на степень разведения и коэффициент, обратный количеству посеянного материала. Полученное значение переводили в десятичные логарифмы. Аналогичным образом проводили микробиологическое исследование навоза/помета, сточных вод и их осадков, почвы.

Антагонистическую активность в отношении бактерий и дрожжевых грибов in vitro определяли методом отсроченного антагонизма по P. Fredericq [22]. Количественную оценку антагонистической активности проводили с использованием метода, предложенного A.B. Семеновым [14]. Определение антагонистической активности (отсроченное и одновременное культивирование) в отношении мицелиальных грибов проводили методом двойных (встречных) культур. В качестве тест-культур использовали грамотрицательные (£. coli 0142, К88, К99, А20; Sal. typhimurium 371, Sal. dublin, Sal. gallinarum, Sal. enteritidis, Klebsiella sp., Proteus vulgaris, Pseudomonas sp., Azotobacter chroococcum), грамположительные бактерии (В. cereus АТСС 11778, Staphylococcus aureus 209 P, Enterococcus faecalis), дрожжевые и мицелиальные грибы (Candida albicans, С. tropicalis, Aspergillus sp., Fusarium sp., Cladosporium sp., Mucor sp., Alternarium sp., Trichophyton sp., Microsporum sp., Trichoderma sp.). Тестировали как референтные, так и полевые штаммы микроорганизмов, обладающие типичными для своего вида морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами. Опыты in situ проводили на стерильном навозе, контаминированном патогенными эшерихиями, сальмонеллами и стафилококками.

Ультраструктуру микроорганизмов изучали с помощью электронного микроскопа JEM 100 СХ-2 («JEOL», Япония).

Образование биопленок микроорганизмов оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в 96-луночных полистироловых планшетах [21]. Измерение оптической плотности производили на фотометре микропланшетном (Multiscan FC) при длине волны 620 нм.

Противовирусную активность супернатантов исследуемых микроорганизмов оценивали на примере вируса герпеса штамм «ТК-А (ВИЭВ) В2», путем внесения их различных концентраций через 90 мин после заражения культуры клеток МДВК герпесвирусом в титре 100 ТЦД5о/см3.

Жизнеспособность микроорганизмов после воздействия различных факторов определяли путем высева микробной суспензии из ряда десятичных разведений на агаризованные среды с последующим подсчетом выросших колоний и определения колониеобразующих единиц (КОЕ).

Наличие витаминов в супернатанте культуральной жидкости исследуемых микроорганизмов определяли методом капиллярного

электрофореза (модель Р/АСЕ MDQ Capillary Electrophoresis System (США) с использованием программного обеспечения 32 Karat 8.0), качественный и количественный состав летучих жирных кислот — газожидкостным методом на хроматографе Дименшин (США). Для удаления микробных клеток культуральную жидкость центрифугировали в течение 15 мин при 6000 g, полученный супернатант стерилизовали с использованием фильтров Millipore Millex-GV (диаметр пор фильтра 0,22 цт).

Определение активности протеазы, целлюлазы, ксилазы и амилазы проводили спектрометрическим методом (Lambda 35 Perkin Elmer), используя в качестве субстратов казеин, карбоксиметилцеллюлозу, ксилан и крахмал.

Пробы навоза/помета, сточных вод и их осадков отбирали на разных этапах обработки субстрата. Физико-химический анализ проводили согласно требованиям ГОСТов.

Содержание токсичных элементов определяли атомно-абсорбционным методом на приборе «ААС Perkin Elmer на AAA lyst», ртуть - методом «холодного пара» на анализаторе «Юлия», мышьяк - методом колориметрии, пестициды и микотоксины - хроматографически.

Измерение концентрации аммиака и сероводорода в воздухе проводили сильфонным аспиратором АМ-5М.

Энтероспорин задавали белым крысам внутрижелудочно в дозе 1 см3, телятам - перорально в дозе 10 см3, поросятам - 3 см3, цыплятам-бройлерам -групповым методом.

При выполнении отдельных этапов работ принимали участие сотрудники Центра (М.М. Сальникова, Ю.В. Серова, Т.А. Шамилова), которым выражаем искреннюю благодарность.

Цифровой материал подвергали статистической обработке на персональном компьютере по общепринятым методам вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±т), критерия достоверности Стьюдента (t) и коэффициента корреляции (г) с использованием программы Microsoft Excel.

2.3 Результаты исследований

2.3.1 Разработка средств утилизации органических отходов

По результатам микробиологических исследований навоза/помета различных видов сельскохозяйственных животных, кормов растительного и животного происхождения, водоемов, сточных вод и их осадков, пищевых отходов, лиственного опада, нефтешламмов, сапропелей, почвы, гнилой древесины, вулканического туфа, содержимого кишечника свиней, крупного рогатого скота, птиц, рубцовой жидкости отобрано 76 изолятов. Из выделенных бактерий, мицелиальных грибов и дрожжей 39,5 % обладали патоген-ными/токсигенными свойствами, слабой ферментативной активностью и в последующем не рассматривались.

Установлено значительное снижение жизнеспособности, а в некоторых случаях и гибель подавляющего большинства изолятов при инокуляции их в свежий птичий помет. Токсичность для биообъектов обусловлена как

антагонизмом со стороны местной микрофлоры, так и ингибированием веществами, присутствующими в субстрате и кислотностью среды, не приемлемой для их развития.

Критериям отбора, в том числе высоким приростом биомассы на питательных средах, соответствовали только микроорганизмы рода Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Pichia, что и предопределило их выбор в качестве составных компонентов 1 средств утилизации органических отходов. Важным преимуществом отобранных микроорганизмов, является сохранение жизнеспособности при инокуляции в субстрат (на протяжении 30 сут численность не снижалась). На их основе, учитывая биосовместимость культур, подобрали консорциумы микроорганизмов и разработали: «Средство для биодеградации и обезвреживания навоза и помета (УФ-1)», препараты УФ-2 и «Экое». В состав УФ-1 входят стрептомицеты и дрожжи, «Экое» -стрегггомицеты и спорообразующие бактерии Bacillus subtilis.

Изоляты, использованные в последующем для разработки средства УФ-2, по совокупности морфологических, физиолого-биохимических признаков идентифицированы и обозначены как Saccharomyces cerevisiae-11 (выделен из компостной кучи со смесью навоза и пищевых отходов) и Pichia kudriavzevii-96 (выделен из почвы, под слоем перегнившего навоза). Видовая принадлежность подтверждена методом полимеразной цепной реакции, с использованием геноспецифических праймеров, подобранных в базе данных GenBank.

Следует отметить, что Saccharomyces cerevisiae-X 1 и Pichia kudriavzevii-96 превосходили другие тестируемые микроорганизмы по скорости роста и накоплению биомассы. Так, выход КОЕ при культивировании сахаромицета в 1,9 и 1,6 раза (Р<0,001) выше, чем у стрептомицетов и бацилл.

В настоящей работе рассматривается средство УФ-2. Характеристика, входящих в его состав микроорганизмов, представлена ниже. В отдельных опытах в качестве сравнения использовали ранее разработанные препараты.

2.3.2 Токсикологическая оценка Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96

В качестве важнейшего критерия применимости микроорганизмов в биотехнологической промышленности рассматривается их безопасность для человека и животных.

Проведенными исследованиями выявлено отсутствие вирулентных, токсичных и токсигенных свойств отобранных изолятов. Однократное внутрибрюшинное введение белым мышам неинактивированной, инактивированной микробной суспензии (108-10ю КОЕ/см3) и центрифугата культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 (105-107 КОЕ/см3) не приводило к их гибели. Многократное пероральное введение в концентрациях 108-Ю'° КОЕ/см3 также не оказывало отрицательного влияния на организм.

На протяжении всего периода наблюдения (7 сут), после окончания инъекций или перорального введения, видимых изменений в клиническом состоянии животных не отмечали.

Отрицательный результат показал и тест на ростовые трубочки. Микроскопированием препарата - «раздавленная капля» - рассматриваемых дрожжей, инкубированных при температуре 37°С 3 ч в сыворотке крови крупного рогатого скота, наблюдали одиночные и почкующие клетки. Клетки, выбрасывающие ростовые трубочки, характерные для патогенных дрожжевых грибов, не обнаруживали.

Культуральная жидкость' исследуемых микроорганизмов не оказывала раздражающего действия на слизистую оболочку глаз и кожу лабораторных животных (белые крысы, кролики). Достоверной разницы в морфологических и биохимических показателях крови, патологоанатомических изменений в гистологических препаратах внутренних органов и кожи белых крыс, при накожном нанесении не отмечали.

Многократное (30 сут) пероральное введение культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii- 96 белым мышам; внутрижелудочное (1 см3) и интраназальное (0,1 см3) введение белым крысам в концентрации 10 -10 КОЕ/см3 не оказывало отрицательного влияния на прирост живой массы. При пероральном и внутрижелудочном введении живая масса опытных животных была несколько выше, чем контрольных.

Количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, СОЭ, глюкозы, общего белка, альбуминов, а-, р- и у- глобулинов, холестерина, активность холинэстеразы, щелочной фосфатазы, ACT и AJIT у белых крыс при внутрижелудочном и интраназальном введении соответствовали физиологической норме. Не отмечено отрицательного влияния на показатели неспецифической резистентности организма, микробиоценоза кишечника, относительной массы внутренних органов. На протяжении всего опыта не наблюдали изменений количества Т- и В-лимфоцитов в сравнении с группой биологического контроля.

Следует отметить, что при многократном внутрижелудочном введении сахаромицета популяционный уровень представителей нормофлоры кишечника (бифидо- и лактобактерий) был немного выше, чем у животных биологического контроля.

Отобранные изоляты не обладают способностью к диссеминации в кровь и внутренние органы. Патологических изменений во внутренних органах при многократном их введении не отмечали.

Наблюдение за животными в течение 14 сут после длительного воздействия не показало отрицательного влияния исследуемых микроорганизмов на прирост массы тела, качественные и количественные показатели кишечного биоценоза.

Альтернативными методами исследования с использованием культур клеток (Vero, MDBK, LEK) доказано отсутствие у них цитотоксичности.

Изоляты не проявляют фитотоксического действия: при выдерживании семян в культуральной жидкости отмечено улучшение всхожести и увеличение роста тестируемых растений (овес, редис, пшеница, ячмень).

2.3.3 Оценка биологической активности Saccharomyies cerevisiae-11 и Pichia kudriavzcvii-96

2.3.3.1 Антагонистическая активность в опытах in vitro и in situ В опытах in vitro выявлен антагонизм в отношении условно-патогенных, патогенных грамотрицаггельных н грамположительных бактерий (рисунок 1).

Рисунок 1 - Антагонистическая активность Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudhavzevii-Яв

Задержки роста сапрофт-ной микрофлоры Pseudomonas putida и P. fluorescens, Azotobacter chroococcum, обладающих биологической активностью, участвующих в почвообразовательных процессах и деструкции органических веществ, не отмечалось.

При внесении клеточных компонентов Sacc/taromyces ferevisiae-Ч и Pichia kudriavzevii-96 (экзометаболиты и клеточные экстракты) в среду культивирования энтсробактерий и стафилококка наблюдали ингибирующий эффект.

Выраженность антимикробной активности зависела от тест-культур, исследованных микроорганизмов и их фазы роста.

Наибольшая активность зафиксирована при внесении экзометаболитов в стационарной фазе роста.

Прирост индикаторных штаммов Escherichia coli OI42, Е. coli А20, Е. coli К99, Salmonella typhimurium 371, Sal dublin, Sal. gallinarum, Proleus vulgaris. Klebsiella sp. Staphylococcus aureus 209 P и Enlerococcus faecalis при внесении в среду культивирования экзометаболитое Saccharomyces cerevisiae-\ 1 был ниже на 27,6 (Р<0,001); 24,2 (Р<0,01); 28.3; 36.4 (Р<0,001); 22,9; 22,6 (Р<0,01); 30,1 (Р<0,001); 15,2 (Р<0,05); 32,5 (Р<0.001) и 19,8 % (Р<0,05) относительно контрольного варианта соответственно

В сравнении с тест-культурами, выращенными в отсутствии экзометаболитов Pichia kudriavzevii-96, выраженность антагонизма в отношении Е coli 0142 составила - 20,1 (PO.Ol); Е coli А20 - 15,0; Е. coli К99 - 18.0 (Р<0,05); Sal typhimurium 371 - 21,0 (Р<0,01); Sal dublin - 17,9;

Sal gallinarum - 19,5 (P<0,05); P. vulgaris - 25,3 (Р<0,001); Klebsiella sp - 2,2; S aureus 209 P - 22,3 (P<0,01) и E.faecahs - 17,2 % (P<0,05).

Повышение антагонистической активности Saccharomyces cerevisiae-11 (7,0-19,2 %) обнаружено под воздействием метаболитов Pichia kudriavzevii-96.

При совместном культивировании Р. pulida и Р. fluorescens, A. chroococcum с экзомстаболитами и клеточными экстрактами дрожжей отмечен стимулирующий эффект.

Наибольшую стимуляцию роста тестируемых микроорганизмов наблюдали при внесении экзомстаболнтов стационарной фазы. Прирост биомассы Р. pulida, Р. fluorescens, A. chroococcum при совместном культивировании с экзомстаболитами Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 стационарной фазы был выше относительно контрольного варианта на 34,8; 43,5; 25,4 % (Р<0,001) и 24,5 (Р<0,01); 37,6 (Р<0,001); 20,4 % (Р<0,01) соответственно.

Внесение супернатанта Saccharomyces cerevisiae-\\ и Pichia kudriavzevii-96 в среду культивирования Е. coli К99, Sal typhimurium 371, S aureus 209 P снижало способность биопленкообразования нд 20,7 (Р<0,01); 25,0; 27,1 %(Р<0,001 ) и 17,1 (Р<0,05); 22,5; 23.3 %(Р<0,01) соответственно.

Установлена антагонистическая активность в отношенш токсигенных мицелиальных грибов (Aspergillus sp., Fusarium sp., Mucor sp, Alternarium sp., Cladosporium sp., Pénicillium sp.), возбудителей лерматомикозов - Trichophyton sp., Microsporum sp. и кандидоза Зона задержки роста микромицетов составила 9-30 мм; патогенных грибов рода Candida (С. albicans и С tropicalis) - 14-17 мм.

Не обнаружено подавление роста грибов рода Trichodtrma (T. viride, Т asperellum, Т. reesei), обладающих активным комплексом гудролотнческих ферментов и уменьшающих численность патогенной микрофлоры.

Установлена способность метаболитов Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 угнетать репродукцию вируса герпеса. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса с поражением 100 % клеток отмечали в контрольных вариантах (без внесения метаболитов) на 2-е сут после заражения культур. Добавление супернатантов исследуемых микроорганизмов в разведении 1:1; 1:5; 1:10; 1:20 ингнбировало ЦПД. На 3-е сут регистрировали поражение 20 и 25 % клеток при использовании низких (1:20) концентраций метаболитов Pichia kudriavzevii-96 и Saccharomyces cerevisiae-11. В разведениях 1:1 и 1:5 ЦПД не выявляли. При использовании супернатантов Pichia kudriavzevii-96 и Saccharomyces cerevisiae-II в разведении 1:1; 1:5; 1:10 и 1:20 на 4-е сут отмечали поражение 10; 15; 30; 40 и 25; 30; 40; 60 % клеток соответственно.

Полученные данные in vitro были подтверждены в опытах in situ на стерильном свином навозе. контамниированном £. coli К99, Sal typhimurium 371, 5 aureus 209 P (с исходной концентрацией 5 Ig КОЕ/г).

В зависимости от концентрации консорциума Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudria\zevii-96 обеззараживание субстрата отмечали на 20-30-е сут опыта. Выраженный обезвреживающий эффект наблюдали при использовании концентрации 6 и 7 Ig КОЕ/кг. В контрольных вариантах (без инокуляции консорциума микроорганизмов) на протяжении всего периода исследований

IS

количество эшерихий. сальмонелл и стафилококков не претерпевало значительных изменений

При электронно-микроскопических исследованиях клеток Е. coli К99 под воздействием метаболитов дрожжей (материал отбирали на границе зоны задержки роста) наблюдали увеличение извилистости клеточной стенки, локальное расширение пери плазматического пространства, просветление и коагуляцию участков цитоплазмы (рисунок 2, А). В отличие от контроля (£. coli культивированные в аналогичных условиях без испытуемых дрожжей) отмечали отсутствие включений в цитоплазме (рисунок 2, Б).

а Б

Рисунок 2 - Ультратонкий срез клеток Escherichia соЧ К99 (А-при воздействие метаболитов Saccharomyces cerevisiae-11; Б-контроль)

Исследованием клеток Sal typhimurium 371 под воздействием метаболитов дрожжей методом ультратонких срезов выявили нарушения структуры бактериальной оболочки (рисунок 3, А); увеличение на 72,8 % (Р<0,00!) наружной мембраны клеточной стенки (35,6 против 20,6 нм в контроле (рисунок 3. Б)). Наблюдали увеличение плотности мдмембранного компонента клеточной стенки, который просматривался мелюглобулярным электронно-плотным слоем на поверхности наружной мембраны (рисунок 3, В). Регистрировали расширение периплазмаггического пространства. У некоторых клеток сальмонелл отмечати только небольшие локальные изменения, у других клеток выпячивание цитоплазматической мембраны достигало глубоких участков клетки. Большая часть клеток многих сальмонелл были заполнены электронно-прозрачным содержимым периплазмагтического пространства; в этом случае клетки теряли свою форму. Цитоплазма становилось более плотной, включения не выявляются. В клетках со сплошным расширением периплазматического пространства сохраняется целостность клеточной стенки, но она становится тоньше.

Условны« обогнавши КС-клеточная стенка. НКС наружна» поверхность КС. ИМ-наружна» мембрана. ЦМ-шггоплагаатичесод мембрана. ПП-пернплазматичссаое пространство. ЦП - цитоплазма. ВК • включения

Рисунок 3 - Ультратонкий срез клеток Salmonella tyvhimurium 371 (А, В -при воздействие метаболитов Saccharomyces cerevisiae-11; Б-контроль. Маленькие стрелки показывают перетяжку деления. В-участок клетки с локальным увеличением ПП)

Воздействие метаболитов дрожжей на грамположнтельные бактерии Bacillus cereus АТСС 11778 проявлялось разрушением капсулы, изменениями Структуры клеточной стенки, перераспределением ц иго плазматических компонентов. Ультраструктурные изменения клеточной стенки характеризовались ее утолщением, наличием мелкоглобулярных и везикулярных структур и отсутствием фибриллярных компонентов на поверхности

2«3_3.2 Анализ биологически активных веществ ЯассИаготусе* сегЫ$1ае-11 и Пс А/а кш1На\?е\>Н-96

Отобранные микроорганизмы обладают высокой протсазиой активностью. У Яасс/юготусея сегехчзйн'-11 и Ри-Ыа кис1па\'2е\'И-96 активность протеазы составляет 4,66*0,07 и 3,78±0,04 и/см3 соответственно. Выявлена слабая целлюлазная и ксиланазиая активность - 0,20*0,01 и 0,31 ±0,04 Ш/см3 (ЗассНаготусез сеге\Шае-\ 1); 0,10*0,01 и 0,11 ±0,01 Ш/см' (РкЫа киЫпа\'1еу/7-96), что характерно для большинства дрожжевых грибов. Иэоляты синтезируют следовые количества амилаз.

На электрофореграммах, полученных с использованием капиллярного электрофореза, выявлено наличие в супернатанте культуральных жидкостей БассЪаготусеь сегечгз^ае-М и РгсЫа ки<Ытге\Н-96 водорастворимых витаминов: в наибольшей концентрации обнаружен рибофлавин (витамин В2) 20,10 и 10,05 мг/л соответственно.

Спектр летучих жирных кислот супернатанта культуральной жидкости Басскаготусеь сеге^'шеЛ 1 и Р'юМа кисЬ-^тгеуп-Яб представлен соответственно: уксусной (2,85±0,11 и 1,40±0,07 мг/л), пропионовой (2,63±0,04 и 1,06±0,02 мг/л), валерьяновой (1,86±0,07 и 0,18±0,01 мг/л), капроновой (2,36±0,10 и 0,35±0,02 мг/л), гептановой (2,82±0,12 и 0,73±0,04 мг/л) и каприловой (1,19±0,05 и 0,06±0,01 мг/л).

По ферментативной активности, содержанию летучих жирных кислот БассИаготусез сегегшае-П превосходят взятые в качестве объекта сравнения коммерческие хлебопекарные дрожжи БассИаготусез сегеУ15гае (изготовленные ООО «Саф-Нева», российским предприятием группы ЬеБайге, Франция). При культивировании которых в аналогичных условиях активность протеазы была в 4,2 раза (Р<0,001) ниже и составила 1,11±0,02 и/см3. Целлюлазную и ксиланазную активность не регистрировали. Уксусная, пропионовая, валерьяновая и каприловая кислоты определялись в меньших количествах (ниже в 2,4; 2,3; 1,9 и 10,8 раза (Р<0,001) соответственно). Гегттановую кислоту не обнаруживали.

В сравнении с БассЪаготусев сегех'шае-11 активность протеаз бацилл и стрептомицетов, составных компонентов ранее разработанных средств, была ниже в 2,9 и 6,8 раза (Р<0,001) соответственно.

2.3.4 Разработка и определение показателей безопасности УФ-2

Важным условием эффективного использования микробных технологий утилизации органического сырья является сохранение жизнеспособности инокулированных микроорганизмов. Зачастую обрабатываемые субстраты отличаются высоким содержанием химических соединений, имеют щелочную или кислую реакцию среды, ингибирующе влияя на биообъекты.

В связи с этим на следующем этапе исследований, имитируя различные воздействия, изучали устойчивость отобранных микроорганизмов к возможным ингибирующим факторам.

Оптимальная температура культивирования БассИаготусез сегеу151ае-\\ и РШа кийптгет7-96 составляет - 34,0±3,0°С, рН - 4-6. Рост отмечается при температуре от 4 до 45°С, рН - 3,5-9,5. Хорошо растут при содержании в среде хлорида натрия до 7 %. Рост дрожжей наблюдали при концентрации фенола в среде до 1 г/см3, кадмия хлорида - 3 мг/см3, свинца ацетата - 10 мг/см соответственно.

Снижение антагонистической активности исследуемых микроорганизмов при изменении рН среды культивирования (диапазон от 3,5 до 8,5) не наблюдали.

Учитывая факт наличия термофильной стадии при компостировании субстратов, представляло интерес выяснение устойчивости исследуемых микроорганизмов к действию высоких температур.

Значительное снижение выживаемости клеток отмечено при температуре 60 С. Однократное и двукратное температурное воздействие при экспозиции 30 мин приводило к снижению количества жизнеспособных клеток Saccharomyces cerevisiae-l 1 в 2,1 и 2,8, Pichia kudriavzevii-96 в 1,8 и 2,4 раза (Р<0,001) соответственно.

Воздействие температуры 80°С в течение 20 и более минут приводило к 100 % гибели Saccharomyces cerevisiae-l 1, при обнаружении единичных клеток Pichia kudriavzevii-96.

В условиях, имитирующих минусовые температуры, показано сохранение жизнеспособности консорциума исследуемых дрожжей. При выдерживании инокулированного консорциумом субстрата при температуре (-19,0±0,6°С) в течение 100 сут количество микроорганизмов снижалось на 28,3 % (Р<0,001) от исходных значений.

Значительных изменений ультраструктуры клеток исследуемых микроорганизмов при длительном выдерживании культуральной жидкости в условиях минусовой температуры (-19,0±0,6°С) не отмечали. В клетках обнаруживали просветление цитоплазмы, а у Pichia kudriavzevii-96 также увеличение инвагинаций цитоплазматической мембраны.

Исследуемые микроорганизмы устойчивы к действию раствора хлорамина Б с содержанием 0,15 % активного хлора; 0,25 % раствора формалина; 1,0 % раствора натрия гидроокиси и 1,5 % раствора перекиси водорода при экспозиции 60 мин, а также в отношении натрия карбоната и синтетического моющего средства.

С учетом оптимальных параметров культивирования Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 нами разработана технология производства УФ-2. Первый этап производства включает приготовление питательных сред и посевного материала. Для получения посевного материала лиофилизированные в ампулах культуры регидратировапи и засеивали на поверхность сусло-агара. Выросшие колонии микроорганизмов засеивали «штрихом» на поверхность скошенной в пробирках агаризованной среды. Культивировали в условиях термостата при температуре 37°С в течение 48 часов. По истечении этого времени с поверхности агара 0,9 %-ным раствором натрия хлорида смывали выросшие колонии микроорганизмов. Полученную суспензию разбавляли до содержания клеток 10 lg КОЕ/см3.

На втором этапе проводили поверхностное культивирование путем засева 5 % посевного материала в жидкую питательную среду (бульон Сабуро или МПБ с pH 4-6). Культивировали при температуре 37°С в течение 72 часов.

Третий этап включал внесение полученной микробной суспензии в 0,9 %-ный раствор натрия хлорида в объеме 4 %. В 1 см3 средства должно содержаться не менее 8,0 lg КОЕ.

На четвертом этапе проводили упаковку, маркировку и контроль готовой продукции.

На всех этапах производства контролировали подлинность используемых культур (соответствие морфологическим и биохимическим признакам) и отсутствие контаминации посторонней микрофлорой.

Максимальный титр Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 отмечается на 72 ч культивирования и составляет 19,28±0,47 и 16,93±0,64 Ig КОЕ/см3, при снижение рН среды продуктами метаболизма на 47,3 и 25,7 % (Р<0,001) соответственно.

В опытах на лабораторных животных оценены параметры токсичности УФ-2. При однократном внутрижелудочном введении белым мышам и крысам УФ-2 в дозе 0,5 и 5,0 см3 соответственно (максимальная вводимая доза при внутрижелудочном введении) гибели и видимых изменений в клиническом состоянии не наблюдали.

При многократном внутрижелудочном введении УФ-2 белым крысам отрицательного влияния на организм также не отмечали. Продолжительность опыта составила 24 сут, дозу брали из расчета 1/10 от максимально вводимой, с ее увеличением каждые последующие 4 сут в 1,5 раза.

В течение всего периода наблюдения за животными после внутрижелудочного введения УФ-2 видимых изменений в клиническом состоянии, морфо-биохимических показателей крови не выявляли.

Отрицательного влияния препарата на показатели неспецифической резистентности, содержания Т- и В- лимфоцитов, микробиоценоз кишечника также не установлено.

2.3.5 Утилизация органических отходов

В лабораторных условиях, путем проведения модельных экспериментов на птичьем помете, сточных водах и их осадках, подобраны оптимальные дозы использования УФ-2, позволяющие ускорить процесс деструкции, снизить микробную обсемененность и устранить неприятный запах, а также улучшить физико-химический состав сточных вод. Наиболее приемлемым является использование УФ-2 для утилизации органических отходов животноводства и осадков сточных вод в дозе 0,1 и 0,2 см3/10 кг; очистке и обезвреживании сточных вод - 0,1 см3/10 л.

Следующим этапом наших исследований было использование УФ-2 в присутствии животных с выяснением возможного отрицательного влияния на организм.

Опыты проведены на лабораторных и сельскохозяйственных животных, содержащихся в виварии Центра. Половозрелых белых крыс обоего пола, массой 180 г, разделили по принципу аналогов на 4 группы (п=3). В течение 60 сут животных содержали на несменяемой подстилке, которую один раз в 10 сут равномерно опрыскивали УФ-2 из расчета 0,1, 1,0 и 10 см3/кг, превышая рекомендуемую дозу для обработки в 10, 100 и 1000 раз. В подстилку контрольной группы препарат не вносили.

Поросят-отьёмышей крупной белой породы, содержащихся в разных корпусах, разделили по принципу аналогов на 2 группы, по 4 в каждой. Поросят первой группы (опыт) содержали в корпусе, с двукратной обработкой

навоза (через 15 сут) раствором УФ-2, который вносили путем равномерного опрыскивания из расчета 1 л/м2. Средство (8,12±0,04 lg КОЕ/см ) растворяли водой в соотношении 1:1000.

На протяжении всего периода исследований в корпусе, где содержались поросята "контрольной группы (без использования УФ-2), отмечали сильный неприятный запах, при практическом отсутствии его в помещении с обработкой навоза. Микробиологический анализ обработанного навоза, в сравнении с необработанным, показал низкую бактериальная обсемененность.

Установлено отсутствие изменений морфо-биохимических показателей крови подопытных животных при внесении УФ-2 в подстилку. Количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, СОЭ, содержание общего белка, глюкозы, холестерина, активность холинэстеразы, AJIT, ACT, щелочной фосфатазы находились на уровне аналогичным показателей контрольных животных и соответствовали физиологическим нормам.

При визуальном осмотре внутренних органов у вынужденно убитых животных патологических изменений не отмечали, их отсутствие было подтверждено и гистологическим анализом тканей.

2.3.5.1 Утилизация бесподстилочного и подстилочного птичьего помета

Опыты проведены в летний период в условиях одного из птицеводческих комплексов Республики Татарстан. На открытой площадке формировали контрольную и опытные бурты бесподстилочного птичьего помета (влажность - 76,23±3,21 %) объемом 100 тонн.

С помощью трактора-бульдозера на площадке раскладывали помет высотой 0,5 метра. Слой складированного субстрата равномерно орошали раствором УФ-2 (средство предварительно разбавляли водопроводной водой в соотношении 1:1000). Затем на обработанный слой вновь закладывали помет и повторяли процедуру полива. Общий расход препарата на 100 тонн составил 1 л, с концентрацией микробных клеток 8,00±0,07 Ig КОЕ/см3.

В качестве сравнения использовали ранее разработанные биопрепараты «Средство для биодеградации и обезвреживания навоза и помета (УФ-1)» и «Экое», а также коммерческий препарат «Тамир» (ООО «ЭМ-кооперация», г. Москва). Подготовку буртов проводили аналогичным образом. В варианте с «Тамир» согласно инструкции производителя на каждый слой перед увлажнением вносили землю и компостную кучу накрывали полиэтиленовой пленкой. Контрольный вариант орошали аналогичным объемом водопроводной воды.

Исследования санитарно-бактериологического состояния образцов нативной пометной массы, отобранных в разных точках, показали высокую степень микробной контаминации. В 1 г образца исходного помета обнаружили несколько миллионов бактерий группы кишечной палочки (БГКП), энтерококков, несколько тысяч - сальмонелл. Выделяли протей и стафилококки.

В первые сутки после использования биопрепаратов во всех образцах обработанного помета отмечали повышение уровня общей микробной

обсемененности. В вариантах с внесением УФ-1, УФ-2 и «Тамир» регистрировали также увеличение относительно контрольного субстрата численности дрожжей на 32,5 %; 2,6 раза (Р<0,001); 18,4 % (Р<0,05) соответственно.

Применение биопрепаратов позволило обезвредить субстрат от сальмонелл, стафилококков, протей, снизить до регламентированного уровня количество БГКП и энтерококков и рекомендовать использования его в

качестве органического удобрения.

Существенные изменения уровня микробной контаминации птичьего помета при применении средств наблюдали на 20-е сут опыта. Во всех образцах обработанного субстрата протей не обнаруживали. При использовании УФ-1, УФ-2 и «Экое» не выделяли сальмонелл и стафилококков. В варианте с внесением «Тамир», количество сальмонелл и стафилококков было ниже показателей неинокулированного субстрата на 63,6 (Р<0,001) и 22,2 % (Р<0,01) соответственно.

Содержание БГКП и энтерококков при внесении УФ-1, УФ-2, «Экое», «Тамир» снижалось относительно контрольного варианта на 74,1 и 64,4; 77,3 и 70,4; 72,6 и 68,3; 55,7 и 53,0 % (Р<0,001) соответственно.

На 30-е сут опыта в вариантах с инокуляцией УФ-1, УФ-2, «Экое» количество БГКП и энтерококков составило менее 1 lg КОЕ/г. Общее микробное число (ОМЧ) и количество дрожжей было ниже значений контрольного варианта на 52,7 и 73,5; 69,4 и 63,2; 31,6 и 70,6; 41,6 и 31,3 % (Р<0,001) применении УФ-1, УФ-2, «Экое», «Тамир» соответственно. При микроскопическом исследовании мазков выросших колоний на мясо-пептонном агаре (МПА) субстрата обработанном «Экое» доминировали Bacillus sp.

Следует отметить,' что при использовании препарата «Тамир» снижение БГКП и энтерококков до уровня 1 lg КОЕ/г наступает на 40-е сут опыта.

Выделенные изоляты с выросших колоний на МПА, Эндо, сусло-агаре, среде Калины со всех обработанных вариантов не обладали патогенными свойствами. Дрожжевые грибы при постановке теста «ростовые трубки» также

не показали наличия патогенности.

На протяжении всего периода исследований в образцах контрольного варианта не регистрировали значительных изменений ОМЧ, количества энтеробактерий, стафилококков и дрожжей. На 30-е сут исследования в 1 г субстрата обнаружили более 5 lg КОЕ/г БГКП, энтерококков, сальмонелл. При этом ОМЧ, уровень стафилококков и дрожжей был ниже исходных значений на 11,8; 7,7 и 4,2 % соответственно.

Во всех образцах обработанного помета яйца возбудителя аскаридоза -Ascariss galli и ооцисты эймерий не обнаруживали, при наличии единичных экземпляров в образцах контрольного и исходного вариантов.

Обработанные различными биопрепаратами субстраты представляли собой рассыпчатую массу темно-коричневого цвета, без специфического характерного запаха, с небольшим количеством посторонних включений. Образцы контрольного варианта представляли собой слипшуюся коричневого

цвета массу с характерным специфическим запахом, большим количеством неразложившегося субстрата и наличием посторонних включений.

Содержание азота при применении УФ-1, УФ-2, «Экое» и «Тамир» было выше контрольного варианта на 61,2; 63,7; 55,9 и 55,7 % (Р<0,001). Значительных изменений в содержании фосфора и калия во всех обработанных образцах не регистрировали.

Следующий эксперимент по утилизации птичьего помета с использованием УФ-2 проведен в зимнее время года. Температура воздуха в момент проведения опыта составила минус 10±1,5°С.

Аналогичным образом формировали контрольный и опытный бурт бесподстилочного птичьего помета влажностью 54,80±2,34 %.

При минусовой температуре воздуха процесс обезвреживания органических отходов был длительнее.

К концу первого месяца эксперимента отмечали снижение содержания БГКП, энтерококков, сальмонелл, стафилококков на 36,0; 30,7; 46,4 (Р<0,001); 21,2 % (Р<0,01) относительно субстрата без инокуляции средства. Количество выявленных дрожжей было выше в 3,8 раза (Р<0,001).

На 50-е сут исследования в образцах обработанного помета стафилококки не обнаруживались. В 1 г субстрата регистрировали несколько сотен БГКП и несколько десятков сальмонелл и энтерококков, единичные дрожжи.

Содержание БГКП и энтерококков на 60-е сут эксперимента было менее 1 ^ КОЕ/г при отсутствии в субстрате сальмонелл, стафилококков, дрожжей. ОМЧ было ниже значений варианта без использовании средства на 62,3 % (Р<0,001).

В контрольном варианте существенных изменений в микробной обсемененности отмечено не было. На 60-е сут исследований ОМЧ, количество выявленных БГКП, энтерококков, сальмонелл, стафилококков и дрожжей было ниже фонового показателя на 4,3; 6,8; 6,6; 8,9; 5,8 и 13,7 % соответственно.

В сравнении с необработанным субстратом при использовании УФ-2 содержание азота было выше на 44,3 % (Р<0,001).

Анализ обработанных и необработанных субстратов, проведенный с использованием атомно-абсорбционного и колорометрического метода исследований, не выявил превышение ПДК для почв по содержанию токсических элементов. Хроматографическими методами остатки пестицидов также не обнаружили.

Опыты по утилизации подстилочного помета проведены в условиях виварного помещения «ФЦТРБ-ВНИВИ». Складированный помет индеек (объем 0,5 т), влажностью 47,21±1,89 % равномерно орошали УФ-2, разведенным в водопроводной воде в соотношении 1:10000. Расход препарата составил 5 см3, с концентрацией микробных клеток 8,47±0,10 ^ КОЕ/см3. В контрольный вариант в аналогичном объеме вносили водопроводную воду.

На 20-е сут опыта в обработанном субстрате не обнаруживали энтерококков и сальмонелл, при наличии их в контрольном. Количество БГКП составило менее 1 ^ КОЕ/г, что в 4,0 раза ниже без использования средства.

В сравнении с субстратом без применения препарата содержание общего азота, фосфора и калия было выше на 12,5; 13,0 и 11,1 % соответственно. Существенной разницы в массовой доле влаги и органического вещества, кислотности обработанного и необработанного субстрата не регистрировали.

Содержание токсичных элементов обработанного и необработанного субстрата варьировало незначительно (в среднем 2 мг/кг свинца, 100 мг/кг цинка, 0,2 мг/кг кадмия, 75,0 мг/кг меди, менее 0,01 мг/кг ртути и мышьяка) и находилось на уровне ПДК.

Установлено повышение численности почвенной микрофлоры при внесении обработанного УФ-2 бесподстилочного помета. В сравнении с использованием необработанного субстрата количество нитрификаторов, аммонификаторов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов в почве было выше на 16,0 (Р<0,05); 7,0 и 15,0 % (Р<0,05).

2.3.5.2 Утилизация бесподстилочного и подстилочного свиного навоза

Проведены опыты по утилизации бесподстилочного жидкого навоза влажностью 93,70±2,68 %. Удаление навоза из помещения предусмотрено гидросмывом с поступлением жижи по системе труб в навозный коллектор (61x13 м), находящийся на прифермской территории. УФ-2 разводили чистой водопроводной водой (1:10), с помощью керхера заливали в люки коллектора из расчета 10 см3 (8,10±0,12 lg КОЕ/см3) на 1 м3.

Микробиологический анализ проб нативной навозной массы, отобранных в разных точках, показал высокую степень микробной контаминации. Количество БГКП, сальмонелл и стафилококков составило соответственно: 8,04±0,04; 6,40±0,12 и 3,10±0,05 lg КОЕ/см3. В субстрате обнаруживали микромицеты Aspergillus sp., Mucor sp., Fusarium sp., дрожжи.

Использование УФ-2 позволило значительно снизить бактериальную обсемененность субстрата. На 20-е сут опыта общее количество аэробов и анаэробов было ниже исходных значений на 55,9 и 64,0 % (Р<0,001) соответственно. Уровень БГКП снижался на 75,1 % (Р<0,001). Типичных колоний для Salmonella sp. и Staphylococcus sp. на элективных питательных средах при высеве из различных разведений обработанного субстрата не наблюдали.

Содержание БГКП и дрожжей на 30-е сут опыта было ниже исходных значений в 10,1 раза и на 27,9 % (Р<0,001) соответственно.

Внутрибрюшинное введение изолированных чистых культур колоний с питательных сред не приводило к гибели белых мышей, что свидетельствовало об отсутствии патогенных свойств.

В обработанном субстрате не обнаружили микроскопических грибов, яиц гельминтов (Ascaris suum, Trichocephalus suis), ооцист простейших, при наличии единичных экземпляров в исходном.

К концу срока наблюдения не отмечали существенных изменений в физико-химических показателях обработанного субстрата. Содержание основных питательных веществ (азот, фосфор, калий) оставалось практически на уровне фоновых значений.

Для проведения опытов по утилизации подстилочного свиного навоза (влажность 60,00±3,18 %) формировали опытные и контрольные (без внесения средства) бурты объемом около 100 тонн. Технология аналогична утилизации птичьего помета.

В 1 г исходного свиного навоза обнаружили более 6,0; 5,0; 3,0 и 2,0 ^ КОЕ БГКП, сальмонелл, стафилококков и дрожжей соответственно.

На 20-е сут после обработки в субстрате не регистрировали наличие сальмонелл и стафилококков.

Отмечали снижение ОМЧ, количества БГКП и дрожжей на 58,4; 70,0 и 29,2 % (Р<0,001) соответственно относительно варианта без инокуляции УФ-2.

На 30-е сут эксперимента уровень БГКП составил 0,80±0,01 КОЕ/г, что на 86,2 % (Р<0,001) ниже значений контрольного варианта. ОМЧ и содержание дрожжей было меньше на 67,8 и 57,1 % (Р<0,001) соответственно.

Выделенные изоляты микроорганизмов (колонии на МПА, агаре Эндо, сусло-агаре) не обладали патогенными свойствами.

Микробная обсемененность контрольных вариантов оставалась фактически на уровне исходных значений. ОМЧ, количество БКГП, сальмонелл, стафилококков и дрожжей снижалось на 4,7; 7,3; 10,0; 3,1 и 19,2 % (Р<0,05) соответственно. Причем некоторые из выявленных изолятов микроорганизмов контрольного субстрата были патогенными для лабораторных животных.

Обнаруженные в исходном и контрольном субстрате единичные яйца возбудителя трихоцефалеза (ТпсИосеркаЫз галу) в обработанном навозе отсутствовали.

В сравнении с контрольным вариантом влажность и рН обработанного субстрата была ниже на 15,8 (Р<0,05) и 5,3 % соответственно; содержание азота было выше на 35,7 %(Р<0,001).

Анализ на содержание токсичных элементов обработанного и необработанного бесподстилочного и подстилочного свиного навоза не выявил превышение уровня ПДК. Хроматографическим методом исследования во всех образцах навоза свиней остатки пестицидов не обнаруживали.

2.3.5.3 Утилизация подстилочного навоза крупного рогатого скота

На площадке раскладывали слой подстилочного навоза крупного рогатого скота (влажность 58,70±2,53 %). Формирование контрольного и опытного бурта, технология внесения средства описаны выше.

Исходный субстрат характеризовался высокой степенью микробной контаминации. В 1 г подстилочного навоза крупного рогатого скота обнаруживали более 4,0 ^ КОЕ БГКП и сальмонелл; более 3,0 ^ КОЕ дрожжей; более 1,0 ^ КОЕ стафилококков.

На 10-е сут опыта количество обнаруженных энтеробакгерий (БГКП и сальмонелл), стафилококков было ниже уровня значений необработанного субстрата на 19,6 (Р<0,01); 47,8; 27,2 % (Р<0,001) соответственно.

Бактериологическим анализом субстрата отобранного на 20-е сут опыта не регистрировали наличие сальмонелл и стафилококков, уровень БГКП был ниже на 43,1 % (Р<0,001).

К концу эксперимента (30 сут) количество обнаруженных БГКП составило менее 1 ^ КОЕ/г. ОМЧ и содержание дрожжей было ниже значений варианта без внесения средства на 52,7 и 85,4 % (Р<0,001) соответственно.

Микробная обсемененность контрольного варианта значительно не изменялась. ОМЧ, количество БГКП, сальмонелл, стафилококков и дрожжей (30 сут) было ниже фоновых показателей на 4,0; 5,1; 6,9; 4,8 и 10,7 %.

Визуально обработанный субстрат представлял собой рассыпчатую массу темно-коричневого цвета с небольшим количеством неразложившегося подстилочного материала, без специфического запаха. Контрольный и исходный субстраты имели большое количество посторонних включений, представляли собой темно-зеленую, слипшуюся массу с характерным запахом.

Физико-химическим анализом (в дополнении к бактериологическому исследованию) подтверждена возможность использования полученного субстрата в качестве удобрения.

Содержание токсичных элементов во всех исследуемых субстратах было в пределах ПДК, пестициды не обнаруживали. Содержание азота в обработанном навозе было выше относительно контрольного на 22,9 % (Р<0,01).

2.3.5.4 Изучение влияние УФ-2 на содержание аммиака и

сероводорода в воздухе

Эксперименты по оценке изменения концентрации аммиака и сероводорода в воздухе рабочей зоны при использовании УФ-2 проведены в 2 комнатах позиции откорма, в которых содержались по 475 поросят 91 сут

возраста. 3

В резервуар накопления навозных стоков (объем 800 м ) первой комнаты, через решетчатые полы секций, однократно вносили УФ-2 из расчета 10 см /м . В резервуар навозных стоков другого помещения препарат не вносили (контроль). Фоновая концентрация аммиака и сероводорода в рабочей зоне обоих помещений находилась на одинаковом уровне.

На 40-е сут, в помещении с использованием УФ-2, регистрировали снижение содержания аммиака и сероводорода на 39,3 (Р<0,001) и 20,7 % (Р<0,01) относительно контроля.

Препарат не оказывал негативного влияния на клиническое состояние животных, гематологические и биохимические показатели крови.

2.3.5.5 Утилизация осадков сточных вод

Опыты проведены в условиях очистных сооружений цеха биологической очистки (аэрации). УФ-2 вносили в приемный резервуар осадков очистных сооружений, в котором находился сырой осадок из первичных отстойников и избыточный активный ил из вторичных отстойников. Обработанный осадок наносили на слой необработанного, находящегося на площадке.

Перемешивание субстрата достигалось при подаче осадков насосами на иловую площадку (объем площадки 3700 м3). Всего обработано 2000 м3 осадков сточных вод. Расход УФ-2 составил 40 л (концентрация микробных клеток - 8,00±0,32 КОЕ/см3).

Первые сутки после внесения средства характеризовались возрастанием микробной обсемененности субстрата. ОМЧ и численность дрожжей были выше исходных значений на 13,7 % и 1,7 раза (Р<0,001) соответственно.

В результате микробиологического анализа субстрата, отобранного на 10 и 20-е сут, обнаружено снижение количества энтеробактерий и стафилококка, при повышенном значении ОМЧ и содержании дрожжей. Количество БГКП, энтерококков, сальмонелл, стафилококков на 10 и 20-е сут было ниже фоновых значений на 8,4; 12,4; 15,4 % (Р<0,05); 5,9 и 12,0; 27,4; 34,2; 40,9 % (Р<0,001) соответственно.

На 30-е сут опыта ОМЧ, количество БГКП, энтерококков, сальмонелл, стафилококков снижалось на 18,9 (Р<0,05); 23,7 (Р<0,01); 44,1; 54,6; 65,9 % (Р<0,001). Уровень дрожжей был выше исходных значений.

На 40-е сут исследования эти показатели были ниже исходных значений на 42,8; 52,1; 54,0; 72,8; 81,1 % (Р<0,001) соответственно.

Содержание БГКП, энтерококков, дрожжей на 50-е сут опыта было ниже исходных значений на 66,0; 78,5; 87,6 % (Р<0,001). В субстрате не обнаруживали сальмонелл и стафилококков (таблица).

Таблица - Микробная обсемененность осадков сточных вод при применении УФ-2_

Микроорганизм, ^ КОЕ/г Срок исследования, сут

Фон 5 10 20 30 '40 50

Общее микробное число 8,93± 0,24- 10,15± 0,34 9,74± 0,29 9,52± 0,16 7,24± 0,26* 5,11± 0,14*** 3,52± 0,13***

Бактерии группы кишечной палочки 5,24± 0,21 5,11± 0,17 4,80± 0,10 4,61± 0,07 4,00± 0,12** 2,51± 0,09*** 1,78± 0,01***

Энтерококки 4,13± 0,18 3,91± 0,19 3,62± 0,16 3,00± 0,08*** 2,31± 0,07*** 1,90± 0,07*** 0,89± 0,01***

Сальмонеллы 4,41± 0,20 4,20± 0,17 3,73± 0,12* 2,90± 0,14*** 2,00± 0,04*** 1,20± 0,03*** -

Стафилококки 3,23± 0,16 3,12± 0,14 3,04± 0,15 1,91± 0,09*** 1,10± 0,02*** 0,61± 0,01*** -

Дрожжи 4,12± 0,19 6,95± 0,31*** 6,22± 0,28*** 5,83± 0,22*** 4,34± 0,21 2,73± 0,13*** 0,51± 0,02***

*Р<0,05 **Р<0,01 ***Р<0,001

Выделенные изоляты чистых культур с выросших колоний на питательных средах (МПА, агар Эндо, сусло-агар, среда Калины) не обладали патогенными свойствами.

В обработанном субстрате не обнаруживали возбудителей инвазионных болезней, личинок и куколок синантропных мух. Массовая доля органических веществ, общего азота, фосфора и калия составила: 32,0±1,46; 3,40±0,08; 4,54±0,06; 0,24±0,01 % соответственно.

Следует отметить, что содержание токсических элементов, бенз(а)пирена в исходном и обработанном иле не превышало гигиенического норматива, что свидетельствует о безопасности субстрата для почв, растений и растениеводческой продукции. Регистрировали снижение нитратного азота на 55,3 % (Р<0,001) относительно исходного значения.

Безвредность обработанного субстрата подтверждена токсикологическими исследованиями на лабораторных животных. Однократное внутрижелудочное введение ила в виде водной суспензии (соотношение 1:1, доза 0,5 см3) не вызвало гибели белых мышей (п=10) и изменений в клиническом состоянии.

Признаков раздражающего действия при нанесении нативного раствора обработанных осадков сточных вод на кожу морских свинок (п=5) и слизистую оболочку глаз кроликов (п=5) не наблюдали. Отмеченный в опытах на кроликах незначительный блефароспазм, исчезал в течение нескольких часов.

2.3.5.6 Очистка и обезвреживание сточных вод

Препарат УФ-2 вносили в резервуар (3x12x4 м) канализационных очистных сооружений. Приблизительный объем обработанного субстрата составил 100 м , расход средства - 10 см3/м3.

Исследование исходных образцов сточных вод показало несоответствие по ряду органолептических и санитарно-гигиенических показателей. Наблюдали превышение нормативов по физико-химическому и бактериологическому составу. Количество термотолерантных и общих колиформных бактерий составило 11,52±0,18 и 11,23±0,36 1§ КОЕ/ЮО см3 соответственно.

На 30-е сут после использования средства отмечали значительное улучшение органолептических показателей (запах не более 2 баллов). Вода представляла собой жидкость серого цвета без хлопьевидного осадка и наличия плавающих примесей.

Отмечали также снижение количества аммиака на 93,3 %, сульфатов - на 60,8 %; хлоридов - на 86,5 %; фосфатов - на 98,8 %; нефтепродуктов - на 81,8 %; взвешенных веществ - на 89,4 %; сухого остатка - на 85,1 % (Р<0,001) относительно исходного уровня. Содержание нитрат-иона составило 0,06 мг/л, что ниже фонового показателя на 96,3 % (Р<0,001). Нитрит-ион в обработанных образцах сточных вод не обнаруживали. Показатели биологического и химического потребления кислорода, перманганатной окисляемости были ниже фоновых значений на 92,6; 71,4; 75,1 % (Р<0,001) соответственно.

На 30-е сут не регистрировали превышения норм СанПин 2.1.5.980-00 по содержанию общих колиформных и термотолерантных бактерий, количество которых составило 2,40±0,11 и 1,70±0,06 ^ КОЕ/ЮО см3, что на 78,6 и 85,2 % (Р<0,001) ниже аналогичных показателей исходного субстрата. ОМЧ было ниже фоновых значений на 66,4 % (Р<0,001).

В обработанном субстрате не обнаруживали патогенных микроорганизмов, возбудителей кишечных инфекций, колифагов и цист кишечных простейших.

Содержание некоторых микроэлементов и тяжелых металлов в сточной воде (до и после использования препарата) не превышало ПДК для воды хозяйственно-питьевого назначения.

' Методом биотестирования не выявлено токсического действия обработанных сточных вод на рост и развитие тестируемых растений. Отмеченное стимулирующее действие — длина проростков семян редиса, используемых в качестве тест-объектов, превышала контрольный вариант (водопроводная вода) на 45,8 % (Р<0,001). Нормируемое содержание экотоксикантов, отсутствие токсического действия на растения, позволяет использовать сточную воду для орошения. Обработанная вода не обладает ярко выраженным токсическим эффектом на дафнии и может быть сброшена в открытые водоемы, так как не представляет угрозу для гидробионгов.

2.3.6 Оценка детоксицирующей активности Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 в отношении пестицидов

В связи с тем, что карбаматные и хлорорганические пестициды обладают наибольшей устойчивостью в объектах внешней среды, следующим этапом работы рассматривалась возможность использования Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 для их деструкции. Несмотря на то, что хлорорганические пестициды запрещены для применения во многих странах мира (в том числе и России), их до сих пор обнаруживают в почвенных и водных объектах, в связи с медленным разложением в природе.

В опытах in vitro при культивировании Saccharomyces cerevisiae-l 1 и Pichia kudriavzevii-96 в жидкой питательной среде М-9, содержащей концентрацию ТМТД 0,1 мг/см3 (превышение МДУ в 10 раз) отмечено значительное снижение количества пестицида.

При тестировании Saccharomyces cerevisiae-l 1 и Pichia kudriavzevii-96 на 7-е сут регистрировали уменьшение содержания ТМТД по сравнению с контрольным вариантом на 94,3 и 93,8 % (Р<0,001) соответственно. Концентрация ТМТД в среде культивирования Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 на 14-е сут была ниже на 99,3 и 98,7 % (Р<0,001) соответственно.

Используемые в качестве объекта сравнения коммерческие хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae проявляли меньшую детоксицирующую активность, процент деструкции ТМТД на 14-е сут составил - 43,3 (Р<0,001).

Следующие опыты проводили in situ, УФ-2 в дозе 0,01 см3/кг вносили в почву, содержащую хлорорганические пестициды.

В первой серии экспериментов использовали образцы почв, отобранные с несанкционированной свалки твердых бытовых отходов и содержащие ДДТ в количестве - 0,060±0,01 мг/кг, ДДЕ - 0,034±0,01 мг/кг. Во второй -

искусственно загрязненную гексахлораном почву (1,70±0,02 мг/кг, превышение ПДК в 5 раз).

Установлено, что на 30-е сут опыта в сравнении с контрольными вариантами (без использования УФ-2) количество ДЦТ уменьшилось на 5,0 %, ДДЕ - на 2,9 %. Снижение количества ДЦТ и ДДЕ на 60-е суг опыта в сравнении с контрольными вариантами составило — 13,3 и 11,8 %, на 90-е сут — 15,0 (Р<0,05) и 14,7 %. На 120-е сут количество ДЦТ и ДДЕ в опытных вариантах было меньше на 20,0 (Р<0,001) и 14,7 %, чем в контрольных.

Содержание гексахлорана при использовании УФ-2 на 30-е сут снижалось на 34,2 % (Р<0,001) относительно контрольного варианта.

Количество пестицидов в контрольных образцах почв не менялось.

2.3.7 Эффективность Энтероспорина при желудочно-кишечных болезнях животных

В опытах на телятах, поросятах и цыплятах-бройлерах установлено положительное влияние пробиотика Энтероспорин (В. хиЫНи-93) на состояние кишечного биоценоза.

Содержание бифидо- и лактобактерий, эшерихий с нормальной ферментативной активностью на 10-е суг опыта у телят при использовании Энтероспорина в качестве лечебного средства при простой диспепсии было ниже значений биологического контроля (клинически здоровые животные) на 6,7 и 5,5; 4,1 % соответственно.

Эти показатели у животных группы сравнения (применение традиционной схемы лечения принятой в хозяйстве: временная отмена выпойки молозива, фитотерапия) были ниже на 27,0 и 30,6; 35,8 % (Р<0,001) соответственно; количество дрожжей выше на 28,7 % (Р<0,001).

Использование пробиотика после курса антибиотикотерапии при токсической диспепсии телят приводило к повышению популяционного уровня бифидо-, лактобактерий, эшерихий с нормальной ферментативной активностью на 26,3 (Р<0,001); 20,0; 22,5 % (Р<0,01) и снижению количества дрожжей на 29,4 % (Р<0,001).

На 10-е сут опыта при применении Энтероспорина (двукратно: до приема молозива и через 5 сут) с профилактической целью поросятам, наблюдали увеличение содержания бифидо- и лактобактерий, эшерихий с нормальной ферментативной активностью на 17,2 и 16,6; 15,9 % (Р<0,05) соответственно. В контрольной группе обнаруживали эшерихии, обладающие гемолитической активностью и стафилококки.

Следующая серия экспериментов проведена на трех группах цыплят-бройлеров кросса «Смена 7»:

- 1-я группа получала антибиотик Энрофлоксацин 100 с 1-5 сут возраста из расчета 0,5 см3 на 1 л питьевой воды. С 15-20 суг возраста получала левомицетин в дозе 50 мг/кг; 3

- 2-я группа получала Энтероспорин с 1-5 сут возраста в дозе 0,05 см /гол, повторный цикл применения - на 15 сут в дозе 0,1 см /гол;

- 3-я группа получала Энтероспорин с 5-9 сут возраста после применения антибиотиков в дозе 0,075 см3/гол в течение 10 суток.

Включение в рацион пробиотика способствовало улучшению привесов и конверсии корма, повышению сохранности и выхода мяса.

В сравнении с первой группой у цыплят второй, третьей групп количество бифидо- и лактобактерий было выше в 2,3 и 2,2; 1,7 и 2,1 раза (Р<0,001); дрожжей ниже на 43,1 (Р<0,001) и 24,0 % (Р<0,01) соответственно.

23.8 Профилактическая эффективность Энтероспорина при микотоксикозах животных

Опыты в лабораторных условиях проведены на 5 группах белых крыс массой 120 г (п=120). 1-я группа служила биологическим контролем. Белым крысам 2 и 3-й групп внутрижелудочно вводили водно-спиртовый раствор кристаллического Т-2 токсина в дозе 0,032 мг/кг, 4-5-й - афлатоксин В] в дозе 0,884 мг/кг (дозы токсина из расчета 1/10 ЛД50). Белым крысам 3 и 5-й групп вводили Энтероспорин в дозе 1 см3 в течение 30 суток.

При использовании пробиотика у животных отмечали менее выраженные клинические признаки токсикоза. Сохранность белых крыс составила 100 %, против 73,3 и 80,0 %, при введении Т-2 токсина и афлатоксина В).

Отмеченное на 30-е сут опыта достоверное снижение количества эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина у животных, получавших Энтероспорин 3 и 5-я группа, по сравнению с биологическим контролем, составило: 10,1; 9,4; 12,0 и 13,2; 10,0 и 14,3 % соответственно.

Проведенный биохимический анализ крови белых крыс, получавших Т-2 токсин и афлатоксин В1, показал снижение общего белка, глюкозы, альбуминов, у-глобулинов, возрастание а-, р- глобулинов, относительно группы биологического контроля. Снижение количества альбуминов, увеличение фракции Р- глобулинов у животных 3 и 5-й группы составило 15,1 (Р<0,05), 49,6 % (Р<0,001) и 16,7 (Р<0,05), 40,9 % (РОДИ); против - 18,1 (Р<0,05), 68,4 % (Р<0,001) и 19,9 (Р<0,05), 75,9 % (Р<0,001) во 2-4-й группе соответственно.

Количество холестерина у белых крыс 2, 3, 4 и 5-й групп увеличивалось на 23,0 (Р<0,01); 15,1 ¿»<0,05); 28,1 (Р<0,001) и 14,4 % соответственно. Повышение активности ферментов АЛТ, АСТ, щелочной фосфатазы у белых крыс при введении Т-2 токсина и афлатоксина В1 относительно группы биологического контроля составило: 59,0; 42,3; 30,7 и 60,5; 38,2; 38,6 % (Р<0,001) соответственно. Активность этих ферментов у животных 3 и 5-й групп была выше биологического контроля на 24,3; 22,7 (Р<0,01); 15,9 % (Р<0,05) и 31,5; 28,1 (Р<0,001); 21,1 %(Р<0,01).

У животных, получавших только Т-2 токсин и афлатоксин В], отмечено снижение количества бифидо-, лактобактерий на 59,9; 48,2 и 49,9; 32,1 % (Р<0,001) относительно группы биологического контроля соответственно. Уровень бифидо- и лактобактерий у белых крыс при введении совместно с Т-2 токсином Энтероспорина был ниже на 20,1 и 21,7 % (Р<0,01) соответственно. Достоверных изменений в этих показателях у белых крыс 5-й группы не

наблюдали. Выявленные при введении Т-2 и афлатоксина В, эшерихии, обладающие гемолитической активностью, при использовании пробиотика не обнаруживали.

Менее выраженные изменения при применении Энтероспорина отмечали в показателях, характеризующих неспецифическую резистентность организма и при патоморфологическом исследовании.

Количество обнаруженного Т-2 токсина, его метаболита НТ-2 токсина, афлатоксина В, в печени при использовании пробиотика было ниже, чем в контроле на 68,9; 70,5; 57,1 % (Р<0,001) соответственно.

Показана эффективность использования Энтероспорина при афлатоксикозе поросят-сосунов (п=40). Количество обнаруженного афлатоксина М, в молозиве составило 14,80±0,87 мкг/кг.

Среднесуточный прирост поросят при использовании Энтероспорина был

выше, чем в контроле на 13,7 %.

На 30-е сут опьгга количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, глюкозы и общего белка у животных, получавших пробиотик, было выше, чем в контрольной группе на 9,4; 4,5; 6,4; 11,6 и 12,3 % соответственно.

Содержание р- глобулинов, активность АЛТ, АСТ и щелочной фосфатазы в сыворотке крови животных опытной группы были ниже относительно группы контроля на 15,0; 18,3 (Р<0,05); 24,1 и 24,3 % (Р<0,01) соответственно.

Показатели, характеризующие неспецифическую резистентность организма при использовании Энтероспорина, были выше, чем в группе контроля.

Популяционный уровень бифидо- и лактобактерий в кишечнике поросят при использовании Энтероспорина на 30-е сут опыта был выше группы контроля на 26,5 и 26,3 % (Р<0,001); дрожжей ниже на 20,7 % (Р<0,01). У животных контрольной группы обнаруживали эшерихии, обладающие

гемолитической активностью.

Следующий опыт проведен на 30 телятах, 2-х месячного возраста, разделенных по принципу аналогов на 3 группы. В кормах, скармливаемых животным, обнаружен Т-2 токсин (0,21±0,08 мг/кг).

Телятам 1-й группы задавали Энтероспорин; 2-й - Ветом 3 (НПФ «Исследовательский центр, г. Новосибирск») из расчета 50 мг/кг, который использовали в качестве препарата сравнения. Животные 3-й группы служили контролем и получали физиологический раствор.

Использование пробиотиков положительно влияло на прирост массы телят. Среднесуточный прирост массы при использовании Энтероспорина был выше на 20,5 % (Р<0,01), Ветома 3-19,0 % (Р<0,05).

На 30-е сут опыта у телят, получавших Энтероспорин и Ветом 3, количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, глюкозы, белка было выше на 10,3; 8,5; 22,0 % (Р<0,01); 8,3; 6,0 и 6,9; 8,0;^ 18,5 (Р<0,05); 2,2; 5,5 % соответственно относительно животных контрольной группы.

Менее выраженные изменения при применении пробиотиков наблюдались при исследовании белковых фракций (рисунок 4) и активности ферментов сыворотки крови (рисунок 5)

Рисунок 4 - Содержание белковых фракций (%) сыворотки крови телят при Т-2 токсикозе и применении пробиотиков

Рисунок 5 - Активность аланин- и аспартатрансфераз сыворотки крови телят при Т-2 токсикозе и применении пробиотиков

У животных при использовании Энтероспорина фагоцитарная активность, фагоцитарное число, фагоцитарная емкость и активность лизоцима были выше, чем в группе контроля на 6,9; 7,9; 17,1 (Р<0,05) и 12,9 %, при введении Ветома 3 - 12,0; 11.4; 20,2 (Р<0,01) и 16,2 %(Р<0,05) соответственно.

Содержание бифидо-, лактобактерий, эшерихий с нормальной ферментативной активностью у животных, получавших Энтероспорин и Ветом 3, увеличивалось на 82.9; 79,1; 31,6 и 62,6; 59,4; 30,7 % (Р<0,001) соответственно. Количество стафилококков, дрожжей у животных, при введении Энтероспорина и Ветома 3, было ниже значений контрольной группы на 27,4; 29,8 и 22,5; 25,7 % (Р<0,001) соответственно.

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Постоянно растущий интерес исследователей и практических специалистов к бноремедиации объектов окружающей среды обусловливает актуальность и перспективность проведенных исследований. Потребность в разработке средств утилизации органических отходов, несмотря на наличие отечественных и зарубежных препаратов, связана со многими причинами, в том числе увеличивающейся токсичностью субстрата, изменениями условий содержания и кормления животных. При выходе помета от птицефабрики средней мощности - 40-50 тыс. в год [7], большое значение имеет и стоимость предлагаемых препаратов.

Проведенные лабораторные и производственные опыты показали эффективность использования разработанного на основе выделенных микроорганизмов средства УФ-2 для утилизации и обезвреживания навоза, помета, сточных вод и их осадков. Наряду с улучшением микробиологических параметров отмечены положительные сдвиги в физико-химических показателях сточных вод.

Стоит отметить, что используемые в экспериментах субстраты характеризовались высокой микробной контаминацией, существенно не изменяющейся длительное время, что еще раз подтверждает опасность органических отходов в ветсринарно-санитарном отношении.

Нормализация пробиотиками колонизационной резистентности организма с вытеснением условно-патогенной микрофлоры, снижает их циркуляцию и накопление в экскрементах.

Отмеченное в первые сутки после внесения средства увеличение общей микробной обсемененности связано с активацией имеющейся микрофлоры, а возрастающий уровень дрожжей свидетельствует о сохранении жизнеспособности инокулированных с биопрепаратом микроорганизмов.

На основании проведенных исследований сформулированы следующие выводы:

1. Разработаны, апробированы и внедрены в производство биологические препараты (средства утилизации органических отходов и пробиотик Энтероспорин) для снижения техногенной и микробиологической нагрузки на организм животных и окружающую среду.

2. Теоретически и экспериментально обосновано включение изолятов Saccharomyces cerevisiae-ll и Pichia kudriavzevii-96, выделенных в результате скрининга микроорганизмов различных биотопов, в качестве составных элементов средства для утилизации органических отходов - УФ-2.

3. Отобранные микроорганизмы не проявляют вирулентных, токсических и токсигенных свойств.

Многократное накожное, внутрижелудочное и интраназапьное введение Saccharomyces cerevisiae-ll и Pichia kudriavzevii-96 лабораторным животным не вызывает изменений морфологических, биохимических и иммунологических показателей крови.

Установлено отсутствие диссеминационного эффекта, раздражающего, дисбиотического, цитотоксического и фитотоксического действий.

4. В опытах in vitro выявлен антагонизм Saccharomyces cerevisiae-11 и Pichia kudriavzevii-96 в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий; мицелиальных и дрожжевых грибов, в том числе возбудителей микозов. Зона задержки роста условно-патогенных и патогенных бактерий составила 10-22 мм; мицелиальных грибов - 9-30 мм.

При внесении экзометаболитов и клеточных экстрактов исследуемых дрожжей установлено угнетение роста патогенных энтеробактерий и стафилококка; стимуляция роста Pseudomonas pulida и Р. ßuorescens, Azotobacter chroococcum.

Антимикробная активность подтверждена выявленными на электронно-микроскопическом уровне изменениями структуры клеточной стенки, расширением периплазматического пространства и деструкцией цитоплазмы клеток Е. coli и Sal. typhimurium. Морфологические изменения клеток В. cereus характеризовались нарушением структуры клеточной стенки и перераспределением цитоплазматических компонентов.

Установлено снижение способности биопленкообразования у Е. coli К99, Sal. typhimurium 371, S. aureus 209 P под воздействием метаболитов дрожжей.

Обезвреживание субстрата, искусственно контаминированного эшерихиями, сальмонеллами и стафилококками, в опытах in situ отмечено на 20-30-е сутки.

5. Показано, что БассИаготусез сегеушае-11 и Р1сЫа кис1г1тгеуИ-96 имеют высокую активность протеаз - 4,6б±0,07 и 3,78±0,04 и/см3 соответственно. По активности протеазы (в 4,2 раза выше), а также количественному (уксусная кислота в 2,4 раза выше) и качественному составу летучих жирных кислот Басскаготусез сегеушае-11 превосходят взятые в качестве сравнения коммерческие хлебопекарные дрожжи БассНаготусея

6. В лабораторных условиях на различном органическом сырье (отходы животноводства, сточные воды и их осадки) обоснованы оптимальные дозы применения УФ-2. Однократное и многократное внутрижелудочное введение УФ-2 в максимально вводимой дозе (0,5 и 5,0 см3 белым мышам и крысам); многократная обработка подстилки лабораторных (белые крысы) и сельскохозяйственных животных (поросята-отьемыши) не оказывает отрицательного влияния на клиническое состояние, морфо-биохимический анализ крови, не вызывает патологоанатомических изменений, подтвержденных гистологическим анализом тканей внутренних органов и кожи.

7. Использование УФ-2 для утилизации бесподстилочного, подстилочного птичьего помета и навоза свиней, подстилочного навоза крупного рогатого скота улучшает качество субстрата в ветеринарно-санитарном отношении. Количество бактерий группы кишечной палочки и энтерококков в обработанном субстрате составляет менее 1 ^ КОЕ/г при высокой микробной обсемененности исходного и контрольного.

8. Применение УФ-2 для утилизации коммунально-бытовых отходов (сточные воды и их осадки) снижает микробную контаминацию. Уровень общих колиформных и термотолерантных бактерий в образцах обработанной сточной воды составляет менее 2,6 и 1,8 \g КОЕ/ЮО см3. Установлено улучшение физико-химического состава сточных вод. Количество бактерий группы кишечной палочки в образцах обработанных осадков сточных вод составляет менее 2,0 ^ КОЕ/г. Показано отсутствие токсического действия обработанных сточных вод на растения и дафний; осадков - на лабораторных животных.

9. Установлена детоксицирующая активность Басскаготусея сегеугяше-11 и РгсЫа кис!пау2ел'П-96 в отношении карбаматного пестицида ТМТД (процент деструкции 99,3 и 98,7 соответственно (Р<0,001)).

Внесение УФ-2 в почву, загрязненную хлорорганическими пестицидами, снижает количество: ДДТ на 20,0 %, его метаболита ДЦЕ - на 14,7 %; гексахлорана - на 34,2 % (Р<0,001).

10. Применение пробиотика Энтероспорин животным с лечебной и профилактической целью при желудочно-кишечных болезнях, микотоксикозах, способствует нормализации кишечного биоценоза: увеличению популяционного уровня представителей нормофлоры и снижению количества условно-патогенных микроорганизмов.

В лабораторных и производственных испытаниях под влиянием Энтероспорина отмечено снижение негативного влияния микотоксинов (Т-2 токсина и афлатоксина В^ на организм животных. Использование пробиотика

снижает выраженность клинических признаков токсикоза, отрицательное действие экотоксикантов на прирост массы тела, гематологические (содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, СОЭ), биохимические (количество белка, глюкозы, холестерина, процентное содержание белковых фракций, активность ферментов) и показатели естественной резистентности организма.

Рекомендации производству

1. Предложены средства микробного происхождения, позволяющие улучшить ветеринарное благополучие животноводческих хозяйств, снизить техногенную нагрузку и получить экологически чистые продукты питания и корма для сельскохозяйственных животных.

В качестве средства утилизации органических отходов животноводства, коммунально-бытовых стоков разработано средство УФ-2, ускоряющее процесс деструкции и обезвреживания.

Рекомендуется однократное применение УФ-2 (концентрат) в следующих дозах:

- для утилизации бесподстилочного, подстилочного навоза/помета в дозе 1 л на 100 тонн; осадков сточных вод - 2 л на 100 тонн;

- для очистки и обезвреживания сточных вод в дозе 1 л/100 м .

В качестве средства профилактики, лечения дисбактериозов, повышения естественной резистентности организма животных, снижения отрицательного действия микотоксинов, разработан и широко апробирован пробиотик Энтероспорин.

С профилактической и лечебной целью рекомендуется использование Энтероспорина молодняку в дозах: телятам - 10 см , поросятам - 3 см , цыплятам-бройлерам ' - 0,05-0,075 см3, в соответствии с инструкцией по применению, утвержденной Россельхознадзором (Номер регистрационного удостоверения: 66-3-31.13-1762№ПВР-3-4.7/02130).

В период вынужденного кормления животных кормом, загрязненным микотоксинами, рекомендуется применение Энтероспорина 1 раз в сут в дозах: телятам - 10 см3, поросятам - 3 см3.

2. Полученные результаты рекомендуется использовать на курсах повышения квалификации специалистов, работающих в области ветеринарии, токсикологии, микробиологии, экологии, биотехнологии, при проведении лекционных и практических занятий со студентами, изучающими профильные дисциплины.

Перспективы дальнейших исследований. В дальнейшем планируется усовершенствование технологии изготовления биологических препаратов; повышение эффективности утилизации навозных/пометных стоков путем иммобилизации рассматриваемых микроорганизмов на сорбенты органического и минерального происхождения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Беро, И.Л. Биотехнология в решении экологических проблем / И.Л. Беро, А.Я. Самуйленко, Г.И. Воробьев [и др.] // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2010. - № 4. - С. 55-56.

2. Данилевская, Н.В. Фармакостимуляция продуктивности животных пробиотическими препаратами : автореф. дис. ... д-ра вет. наук : 16.00.04 / Данилевская Наталья Владимировна. - М., 2007. - 43 с.

3. Дорожкин, В.И. Мониторинг экотоксикантов в растениях, выращенных на загрязненных почвах / В.И. Дорожкин, Г.И. Павленко, М.Ю. Кроль [и др.] // Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации: матер. 4 съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. - М„ 2013. - С. 215-218.

4. Иванов, A.A. Создание и использование новых биопрепаратов для деструкции органических отходов и повышения сохранности животных : автореф. дис. ... д-ра биол. наук : 03.01.06 / Иванов Александр Аркадьевич. - Ульяновск, 2012. - 43 с.

5. Иванов, A.B. Отравление крупного рогатого скота гербицидами /

A.B. Иванов, М.Я. Тремасов, Н.Г. Шангараев [и др.] // Ветеринария. -2011.-№ 6.-С. 8-10.

6. Кост, А.Н. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов / А.Н. Кост, М.И. Стенко // Клиническая гематология животных. - М.: Колос, 1974. -С. 99-100.

7. Лысенко, В.П. Перспективные технологии и оборудование для реконструкции и технического перевооружения в птицеводстве /

B.П. Лысенко. - М.: ФГНУ Росинформагротех, 2002. - 540 с.

8. Малик, Е.В. Восстановление колонизационной резистентности при ■ диарейном синдроме у новорожденных телят / Е.В. Малик, Б.В. Уша, И.А. Русанов // Аграрный вестник Урала. - 2011. - № 12-1 (91). - С. 8-9.

9. Марков, Ю.М. Естественная резистентность организма животных / Ю.М. Марков. - Л.: Колос, 1979. - С. 33-35.

10. Орлова, О.В. Технология производства эффективных биоудобрений из птичьего помета с помощью микробных инокулюмов / О.В. Орлова,

B.Н. Афанасьева, И.А. Архипченко // Экология и промышленность России. - 2009. - № 11. - С. 13-15.

11. Панин, А.Н. Пробиотики в животноводстве - состояние и перспективы /

A.Н. Панин, Н.И. Малик, О.С. Илаева // Ветеринария. - 2012. - № 3. -

C. 4-6.

12. Папуниди, К.Х. Диоксины: опасность, профилактика и лечение токсикозов, перспективы исследования / К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов,

B.А. Новиков [и др.] // Ветеринарный врач. - 2010. - № 5. - С. 25-29.

13. Рахманин, Ю.А. Актуализация проблем экологии человека и гигиена окружающей среды и пути их решения / Ю.А. Рахманин // Гигиена и экология. - 2012. - № 5. - С. 4-8.

14. Семенов, А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях : дис. ... канд. биол. наук : 03.00.07 / Семенов Александр Васильевич. - Оренбург, 2009. - 156 с.

15. Смирнов, А.М. Ветеринарно-санитарные и зоогигиенические мероприятия в свиноводстве / А.М. Смирнов, В.Г. Тюрин // Ветеринария. - 2012. - № 9. -С. 3-7.

16. Смирнова, И.Р. Антропогенное воздействие отходов животноводства на окружающую среду / И.Р. Смирнова, М.Г. Киселева // Ветеринария. -2011.-№11.-С. 45-49.

17. Тремасов, М.Я. Метод ускоренной ферментации для утилизации органических отходов животноводства / М.Я. Тремасов, А.И. Сергейчев, JI.E. Матросова // «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных»: матер, междунар. науч. конф. - Владимир, 2003. - С. 143-145.

18. Тюрин, В.Г. Режимы обеззараживания навоза при ускоренном его компостировании / В.Г. Тюрин, Г.А. Мысова, К.Н. Бирюков [и др.] // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». - 2012. - № 2 (8). - С. 58-60.

19. Фисинин, В.И. Использование птичьего помета для получения микробных удобрений с полифункциональными свойствами / В.И. Фисинин, И.А. Архипченко, Э.В. Понова [и др.] // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 1999. - № 2. - С. 32-34.

20. Фримель, Г. Основы иммунологии / Г. Фримель, Й. Брок. - М.: Мир, 1986.-256 с.

21. О' Toole G. Biofilm formation as microbial development / G. O' Toole, A. Kaplan, R. Kolter // Ann. Rev. microbial. - 2000. - № 4. - P. 49-76.

22. Fredericq, P. Colicins / P. Fredericq // Ann. Rew. Microbiol. - 1957. - Vol. 11.-P. 7-22.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ

1. Матросова, JI.E. Влияние летучих метаболитов почвенных микроми-цетов на патогенные микроорганизмы / Л.Е. Матросова // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2009. - № 1 (ч.1.). - С. 63-64.

2. Матросова, Л.Е. Мониторинг микроскопических грибов в сельскохозяйственной продукции Республики Татарстан / Л.Е. Матросова, O.K. Ермолаева, А.А. Иванов // Ветеринарный врач. - 2009. - № 3. - С. 52-53.

3. Матросова, Л.Е. Профилактическая эффективность пробиотика при Т-2 токсикозе / Л.Е. Матросова // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - Изд-во «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины». - 2009. - № 4. - С. 55-56.

4. Матросова, Л.Е. Спектр применения пробиотика Энтероспорин в ветеринарии / Л.Е. Матросова, Е.Ю. Тарасова, М.Я. Тремасов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2009. - Т. 197. - С. 101-106.

5. Семенова, С.А. Антагонистические свойства микроорганизмов и почвенных микромицетов / С.А. Семенова, А.К. Галиуллин, JI.E. Матросова [и др.] // Международный научно-практический рецензируемый журнал «Иммунопатология, аллергология, инфектология». - М., 2010. - № 1. - С. 226227.

6. Матросова, JI.E. Профилактика афлатоксикоза у поросят / JI.E. Матросова, A.B.. Иванов, М.Я. Тремасов [и др.] // Свиноводство. - 2Q11. -№ 4. - С. 62-64.

7. Шамилова, Т.А. Коррекция микрофлоры кишечника поросят Энтероспорином при афлатоксикозе / Т.А. Шамилова, JI.E. Матросова, МЛ. Тремасов [и др.] // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». - 2011. - № 2 (6). - С. 60-61.

8. Бурдов, Л.Г. О результатах анализа кормов на содержание микотоксинов / Л.Г. Бурдов, Л.Е. Матросова // Ветеринарный врач. - 2011. -№ 2. - С. 7-9.

9. Иванов, A.A. Перспективы использования ускорителя ферментации для утилизации органических отходов / A.A. Иванов, Л.Е. Матросова // Ветеринарный врач. - 2012. - № 2. - С. 4.

10. Матросова, Л.Е. Антагонистическая активность микроорганизмов-деструкторов в отношении возбудителей дерматомикозов / Л.Е. Матросова // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14. - № 2. - С. 109-110.

11. Матросова, Л.Е. Влияние кислотности среды на интенсивность роста микроорганизмов-деструкторов / Л.Е. Матросова // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14. - № 2. - С. 110.

12. Иванов A.A. Биопрепарат для обезвреживания и очистки сточных вод / A.A. Иванов, Л.Е. Матросова, МЛ. Тремасов // Достижения науки и техники АПК. - 2012.-№ 3. - С. 83-84.

13. Матросова, Л.Е. Обезвреживание птичьего помета микромицетами / Л.Е. Матросова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2012. - Т. 211. - С. 95-98.

14. Матросова, Л.Е. Консорциум почвенных микроорганизмов для утилизации осадков сточных вод / Л.Е. Матросова, A.A. Иванов // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». - 2012. -№ 2 (8). - С. 46-48.

15. Матросова, Л.Е. Утилизация птичьего помета / Л.Е. Матросова, М.Я. Тремасов, A.A. Иванов // Ветеринария. - 2012. - № 10. - С. 42-43.

16. Матросова, Л.Е. Биотехнологические решения при утилизации бесподстилочного свиного навоза / Л.Е. Матросова // Вестник ветеринарии. -2013.-№ 1,-С. 45-47.

17. Матросова, Л.Е. Переработка биопрепаратом отходов птицеводства и рациональное их использование / Л.Е. Матросова, МЛ. Тремасов, A.A. Иванов И Птица и птицепродукты. - 2013. - № 1. - С. 67-68.

18. Иванов, A.A. Микробные биотехнологии в очистке окружающей среды / A.A. Иванов, Л.Е. Матросова // Ветеринарный врач. - 2013. ■ № 2. ■ С. 8-9.

19. Матросова, JI.E. Опыт утилизации свиного навоза / Л.Е. Матросова, А.А. Иванов, М.Я. Тремасов // Свиноводство. - 2013. - № 2. - С. 42-43.

20. Серова, Ю.В. Биодеградирующая способность микроорганизмов в отношении тетраметилтиурамдисульфида / Ю.В. Серова, Л.Е. Матросова // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2013. - № 3 (19). - С. 37-38.

21. Матросова, Л.Е. Продуцирование витаминов микроорганизмами-деструкторами / Л.Е. Матросова, В.В. Часов, М.Я. Тремасов [и др.] ' // Аграрный вестник Урала. - 2013. - №3 (109). - С. 10-11.

22. Иванов, А.А. Получение и применение биоудобрения на основе птичьего помета / А.А. Иванов, Л.Е. Матросова, М.Я. Тремасов // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2013. - № 4. - С. 28-30.

23. Шамилова, Т. А. Применение пробиотика Энтероспорина в свиноводстве при микотоксикозе / Т.А. Шамилова, Л.Е. Матросова, МЛ. Тремасов [и др.] // Ветеринария. - 2013. - № 5. - С. 24-26.

24. Матросова, Л.Е. Оценка антимикробной активности микроорганизмов-деструкторов / Л.Е. Матросова, Т.А. Шамилова, Ю.В. Серова [и др.] // Ветеринарный врач. - 2013. - № 5. - С. 15-17.

25. Матросова, Л.Е. Изучение обезвреживающего действия микроорганизмов-деструкторов / Л.Е. Матросова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2013. -Т. 215.-С. 221-224.

26. Матросова, Л.Е. Токсикологическая оценка дрожжевой культуры / Л.Е. Матросова, Н.М. Шамилов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана.- 2013.- Т. 215.- С. 224-228.

27. Семенов, Э.И. Сравнительная оценка адсорбирующей активности дрожжей по отношению к микотоксинам / Э.И. Семенов, Л.Е. Матросова, Е.Ю. Тарасова [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. -2013.-№ 10.-С. 195-198.

Патенты

1. Пат. 2298031 Российская Федерация. Штамм Actinomyces fradiae для переработки органических отходов животноводства и птицеводства / Апалькин В.А., Тремасов М.Я., Сергейчев А.И., Матросова Л.Е. [и др.]; заявитель и патентообладатель ФГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт. - № 2005109042; заявл. 29.03.2005; опубл. 27.04.2007 г.

2. Пат. 2491942 Российская Федерация. Способ профилактики микоток-сикозов и желудочно-кишечных заболеваний животных / Тремасов М.Я., Матросова Л.Е., Иванов А.В. [и др.]; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - № 2012106990; заявл. 27.02.2012; опубл. 10.09.2013 г.

3. Пат. 2522523 Российская Федерация. Способ микробиологической переработки птичьего помета / Тремасов М.Я., Матросова Л.Е., Иванов А.А. [и др.]; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - № 2013101084; заявл. 09.01.2013; опубл. 20.07.2014 г.

Нормативная документация, методические рекомендации и пособия

1. Иванов, A.B. Методические рекомендации по профилактике микотоксикозов животных / A.B. Иванов, М.Я. Тремасов, К.Х. Папуниди, Э.И. Семенов, В.И. Степанов, JI.E. Матросова [и др.] // Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН. - М., 2010. -114 с.

2. Иванов, A.B. Методические рекомендации по применению пробиотиков при отравлениях животных / A.B. Иванов, М.Я. Тремасов, К.Х. Папуниди, JI.E. Матросова [и др.] // Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН. - М., 2011. - 44 с.

3. Тремасов, М.Я. Методическое пособие по переработке органических отходов животноводческих и птицеводческих предприятий в экологически чистое удобрение / МЛ. Тремасов, К.Х. Папуниди, A.B. Иванов, A.A. Иванов, Л.Е. Матросова [и др.] // Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН. -М„ 2012. - 20 с.

4. Тремасов, М.Я. Методическое пособие по применению микроорганизмов для деструкции ксенобиотиков / М.Я. Тремасов, К.Х. Папуниди, A.B. Иванов, A.A. Иванов, Л.Е. Матросова [и др.] // Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН. - М., 2013. - 32 с.

5. Энтероспорин. ТУ 9384-005-00492374-2012 от 25.10.2012 (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору) - 12 с.

6. Инструкция по применению Энтероспорина для профилактики и лечения дисбактериозов и повышения естественной резистентности организма животных (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору). - М., 2013 - 3 с.

Публикации в других изданиях

1. Матросова, Л.Е. К проблеме утилизации контаминированных микотоксинами кормов / Л.Е. Матросова // «Токсикозы животных и актуальные проблемы болезней молодняка»: матер, междунар. науч. конф. -Казань, 2006. - С. 144-145.

2. Тремасов, М.Я. Пробиотик при микотоксикозах животных / МЛ. Тремасов, Л.Е. Матросова, А.И. Сергейчев [и др.] // Матер, первого съезда ветеринарных фармакологов России. - Воронеж, 2007. - С. 600-604.

3. Матросова, Л.Е. Утилизация органических отходов животноводства / Л.Е. Матросова // «Актуальные проблемы ветеринарии»: матер, науч.-практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Казань, 2007. - С. 57-59.

4. Матросова, Л.Е. Результаты переработки органического сырья с использованием ускорителя ферментации УФ-1 // «Актуальные вопросы аграрной науки и образования»: матер, междунар. науч.-практич. конф. - Ульяновск, 2008. - Т. 3. - С. 87-88.

5. Матросова, Л.Е. Микроскопические грибы для переработки органического сырья / Л.Е. Матросова, А.И. Сергейчев, A.A. Иванов [и др.] // 2 съезд микологов России. - М., 2008. - С. 373-374.

6. Матросова, JI.E. Биотехнологические аспекты переработки органических отходов животноводства / JI.E. Матросова, М.Я. Тремасов, A.B. Иванов // «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: матер, пятого московского междунар. конгресса. - М., 2009. - Ч. 1. - С. 335.

7. Матросова, JI.E. Биодеградация органического сырья консорциумом микроорганизмов / JI.E. Матросова, A.A. Иванов // «Биотехнология: Экология крупных городов»: матер, московской междунар. науч.-практич. конф. - М., 2010. - С. 265-266.

8. Иванов, А. Опыт применения пробиотика Энтероспорин / А. Иванов, JI. Матросова, JI. Бурдов [и др.] // Птицеводство. - 2011. - № 12. - С. 15-16.

9. Матросова, JI.E. Грибы рода Candida для утилизации осадков сточных вод / JI.E. Матросова, A.A. Иванов, М.Я. Тремасов // «Фармацевтические и медицинские биотехнологии»: матер, междунар. науч.-практич. конф. - М., 2012.-С. 319-320.

10. Матросова, JI.E. Пробиотик в качестве профилактического средства при Т-2 и афлатоксикозе животных / JI.E. Матросова, Т.А. Шамилова, A.M. Тремасова // «Дни науки - 2012»: матер. VIII междунар. науч.-практич. конф. - Прага, Чехия, 2012. - Т. 74 - С. 45-47.

11. Матросова, Л.Е. Оценка биотрансформирующей способности микроорганизмов в отношении афлатоксина Bi / JI.E. Матросова // «Инновации в современной фармакологии»: матер, четвертого съезда фармакологов России. - М., 2012. - С. 129-130.

12. Матросова, Л.Е. Рациональное использование отходов птицеводства / Л.Е. Матросова // «Аграрная наука: современные проблемы и перспективы развития»: матер, междунар. науч.-практич. конф. - Махачкала, 2012. -С. 381-383.

13. Матросова, Л.Е. Перспективы использования дрожжевых микроорганизмов для утилизации органических отходов / Л.Е. Матросова // «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве»: матер, междунар. науч.-практич. конф. - Саратов, 2013. - С. 261-263.

14. Матросова, Л.Е. Оценка цитотоксичности дрожжей / Л.Е. Матросова, Ю.В. Ларина, Э.М. Плотникова // «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации»: матер, четвертого съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. - М., 2013. - С. 409-411.

15. Матросова, Л.Е. Скрининг микроорганизмов-деструкторов для утилизации органических отходов / Л.Е. Матросова, A.A. Иванов // «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов»: матер, междунар. науч.-практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Казань, 2013. - С. 64-66.

16. Матросова, Л.Е. Утилизация птичьего помета биопрепаратами / JI.E. Матросова, A.A. Иванов // «Инновационные решения актуальных проблем в АПК»: матер. Всероссийской науч.-практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Екатеринбург. - 2013. - С. 316-320.

17. Valiullin, L. Application of Biological Preparation «UF-1» for Treatment and Restoration of Polluted Natural Water Bodies / L. Valiullin, A. Aymaletdinov, L. Matrosova [et al.] // IWA 6th Eastern European Young Water Professionals Conference «EAST Meets WEST»: conference proceedings. - Istanbul, 2014. -P. 352-356-..

18. Matrosova, L. Production technology of fermentation accelerator and experience in, sustainable use of organic animal waste // L. Matrosova, M. Tremasov, A. Ivanov [et al.] // «BioTech 2014 and 6th Czech-Swiss Symposium with Exhibition»: book of abstracts. - Praha, 2014. - P. 55-56.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань,ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 25.07.2014 г. Печ.л. 2,6 Заказ № К-7421. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.