Пути дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс

Андреева, Дина Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пути дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Пути дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс"

604603920 На правах рукописи

Андреева Дина Ивановна

ПУТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ НАТИВНЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МОНОНУКЛЕАРОВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ ПЕЧЕНИ КРЫС

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

-2 СЕН 2010

Казань-2010

004608920

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

Киясов Андрей Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Дубовая Татьяна Клеониковна доктор медицинских наук, ассистент Рагинов Иван Сергеевич

Ведущая организация: Самарский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится А, 2010г.

в часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного медицинского университета (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49, корпус Б).

Автореферат разослан «_

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Залялютдинова Л.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

По данным статистики, пять процентов взрослого населения планеты страдает хроническими гепатитами различной этиологии (вирусные, аутоиммунные, метаболические), более половины которых заканчиваются циррозом. В свою очередь цирроз печени занимает первое место среди причин смерти от болезней органов пищеварения. И хотя клетки печени обладают чрезвычайно высоким потенциалом к самообновлению, в случаях, когда пролиферация гепатоцитов подавлена вирусной инфекцией или химическими агентами, а также когда повреждение печени носит хронический характер, т.е. происходит перманентный процесс репаративной регенерации, внутритканевые источники регенерации печени могут быть исчерпаны [Wiemann, 2002]. Единственным эффективным методом лечения цирроза на сегодняшний день является трансплантация печени. Однако доступность донорских органов не соответствует реальной потребности, к тому же существует риск отторжения трансплантированного органа, и неизбежная необходимость пожизненного приёма иммуносупрессивных препаратов.

В качестве альтернативы трансплантации печени могут быть разработаны и внедрены методы регенеративной медицины и, в частности, трансплантация стволовых/прогениторных клеток. Возможность образования гепатоцитов из стволовых клеток костного мозга впервые была показана в работе Петерсена и соавторов еще в 1999 году [Petersen, 1999]. В то же время миграция, хоуминг и возможности дифференцировки клеток пуповинной крови в печени ещё не исследованы в полной мере. Безусловно, именно пуповинная кровь может стать перспективным источником стволовых клеток для трансплантации, так как обладает такими преимуществами, как абсолютно нетравматичный и безопасный как для матери, так и для ребенка способ получения, а также высокая способность клеток к пролиферации и их низкая иммуногенность [Crdoso,1994, Rocha, 2000, Barker, 2001]. Большинство

исследований, в которых изучалось участие кроветворных клеток в регенерации печени, было выполнено на моделях токсического повреждения органа, работ же, посвященных участию гемопоэтических стволовых клеток в восстановлении печени после частичной гепатэктомии, практически нет.

Механизм образования гепатоцитов из гемопоэтических стволовых клеток до сих пор является предметом бурного обсуждения. Предполагается, что возможна как прямая дифференцировка стволовых клеток [Terai, 2003, Ishikawa, 2006], так и слияние зрелых клеток миелоидной линии с резидентными гепатоцитами [Vassilopoulos, 2003, Wang, 2003, Alvarez-Dolado, 2003]. В результате слияния образуются гибридные клетки, которые экспрессируют специфические печёночные маркеры, но до конца не ясно, обладают ли они полным спектром функциональной активности гепатоцитов.

В клеточной медицине возможно применение как аллогенных, так и аутологичных клеток для лечения ряда заболеваний печени. Однако существуют болезни печени, например наследственные метаболические нарушения, такие как болезнь Вильсона-Коновалова, наследственные гликогенозы, в отношении которых применение аутологичных стволовых клеток очень ограничено. В таком случае весьма перспективным направлением станет разработка методов генетической модификации стволовых и прогениторных клеток и трансплантация генетически «вылеченных» клеток таким больным. В ходе разработки методов трансплантации генетически модифицированных клеток, необходимо выяснить, влияет ли генетическая модификация на свойства гемопоэтических стволовых клеток и их способность мигрировать в орган-мишень и дифференцироваться в клетки печени.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования стало изучение хоуминга и дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека при регенерации печени после частичной гепатэктомии у крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить активацию стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации им нативных мононуклеаров пуповинной крови человека.

2. Исследовать миграцию и пути дифференцировки нативных мононуклеаров пуповинной крови человека, трансплантированных крысам после частичной гепатэктомии.

3. Изучить возможность миофибропластической трансдифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека, трансплантированных крысам после частичной гептэктомии.

4. Определить влияние генетической модификации на жизнеспособность клеток пуповинной крови человека и их способность мигрировать в регенерирующую печень крыс после трансплантации.

5. Изучить возможность участия трансплантированных генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии.

4. Выяснить, являются ли трансплантированные нативные и генетически модифицированные мононуклеары пуповинной крови человека функционально активными в печени крыс. Объект и методы исследования

Эксперименты выполнены на 30-ти белых беспородных крысах-самцах, которым провели операцию частичной гепатэктомии по методике Хиггенса и Андерсона 1931]. Для получения результатов

исследования были использованы различные экспериментальные подходы. Генетический метод позволил провести генетическую модификацию клеток пуповинной крови человека для трансплантации. Иммуногистохимический подход позволил с помощью специфических маркеров судить о реакции различных клеточных типов печени, об их пролиферации и активации стволовых клеток в ходе регенерации печени крыс после частичной

гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека. Морфометрический подход позволил количественно оценить число С-кк-позитивных клеток.

Достоверность полученных данных и их научная новизна

Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного и представительного объёма экспериментальных исследований, конкретной постановкой и решением поставленных задач.

Автор видит новизну полученных результатов в том, что впервые:

• показано, что трансплантация мононуклеаров пуповинной крови человека меняет характер активации стволового компартмента в печени: в этом случае не происходит вовлечения в регенерацию синусоидных клеток, необходимых для её паракринной регуляции;

• установлено, что после трансплантации клеток пуповинной крови человека в печени крыс, регенерирующей после частичной гепатэктомии, появляются клетки, несущие антигены человека и имеющие фенотип гепатоцитов, холангиоцитов и синусоидных клеток печени;

• на основе иммуногистохимического анализа получены доказательства того, что трансплантированные мононуклеары пуповинной крови человека не подвергаются трансдифференцировке в миофибробласты в печени крыс;

• показано, что генетическая модификация не влияет на способность мононуклеаров пуповинной крови мигрировать, встраиваться и дифференцироваться в паренхиматозные и непаренхиматозные клеточные типы печени крыс;

• установлено, что трансплантированные нативные и генетически модифицированные клетки пуповинной крови человека являются функционально активными в печени крыс.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты работы позволили по-новому оценить и понять закономерности изменения микроструктуры железы в ходе регенерации

печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека. Проведенные исследования способствовали выявлению новых фактов как о характере, так и о последовательности клеточных реакций, возникающих в ходе регенерации печени после частичной гепатэктомии, и участии в этих процессах гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека. Результаты работы изменяют представления о возможной роли трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в развитии фиброза печени. Теоретически значимым является установление способности нативных и генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека замещать различные клеточные типы в регенерирующей печени крыс. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения проблемы регенерации печени и участия гемопоэтических стволовых клеток в этом процессе. Результаты проведенных исследований позволяют на основе разработанных методических подходов создать принципиально новую схему клеточной и гено-клеточной терапии наследственных заболеваний, связанных с нарушением экспрессии генов в печени, когда в качестве материала для трансплантации будут использованы не донорские гепатоциты с ограниченным сроком жизни, а аутологичные генетически «вылеченные» стволовые клетки. В ходе выполнения работы разработаны методические подходы для генетической модификации мононуклеаров пуповинной крови. ■ ■

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. После частичной гепатэктомии и трансплантации фракции мононуклеаров пуповинной крови человека крысам гепатоциты, синусоидные клетки и холангиоциты экспрессируют антигены человека: антиген главного комплекса гистосовместимости человека, свидетельствующий о миграции и встраивании трансплантированных клеток; специфический антиген гепатоцитов человека и альфа-фетопротеин, свидетельствующие об их функциональной активности.

2. Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови человека путем электропорации не влияет на их жизнеспособность и потенцию к слиянию или дифференцировке в клетки протоковых структур, синусоидов и паренхимы печени крыс.

Сведения об апробации результатов диссертации

Результаты исследований доложены и обсуждены на ежегодных Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008-2010), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), 167-м международном симпозиуме Фальк (Майнц, Германия, 2008), IV Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2009), Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010), 45-м Ежегодном собрании Европейской Ассоциации Изучения Печени (ЕА8Ь) (Вена, Австрия, 2010).

Сведения о публикациях по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе три статьи в ведущих научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для опубликования основных результатов диссертаций. Общий объем публикаций - 3,4 условно-печатных листа, в т.ч. авторский вклад -1,7 условно-печатных листа.

Личный вклад соискателя

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы. Соискателем составлен план, поставлены задачи, определены этапы исследования. Автор провел подбор и анализ литературы, определил и применил наиболее адекватные условия проведения эксперимента. Автором проведено 30 операций частичной гепатэктомии на

белых беспородных крысах-самцах. Им лично проведены забор материала (регенерирующая печень) и его последующая заливка в парафин, нарезаны парафиновые срезы. В ходе исследования соискатель провел 910 иммуногистохимических окрашиваний срезов, с которых им было получено 1098 фотографии. Теоретическое обобщение материалов исследования, оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций также проведены лично диссертантом.

Внедрение результатов работы

Протокол электропорации мононуклеаров пуповинной крови человека включен в работу лаборатории Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете. Результаты проведенного исследования внедрены в работу ГМУ «Республиканская клиническая больница» (г. Казань), а также включен в дополнительную образовательную программу «Молекулярная и клеточная медицина» и в учебный процесс на кафедре нормальной анатомии и кафедре гистологии Казанского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132-х страницах машинописного текста, иллюстрирована 7-ю таблицами, 37-ю рисунками. Список использованных источников включает 246 наименований, из которых 20 отечественных и 226 зарубежных источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение мононуклеаров пуповинной крови человека *'

Пуповинная кровь была забрана специально обученным персоналом роддома по инструкции Банка стволовых клеток Казанского медицинского университета (лицензия №99-01-001961 от 13.10.2005). Сразу после рождения

ребенка и отсечения пуповины кровь собирали в стандартную систему для взятия донорской крови. Выделение фракции мононуклеаров из пуповинной крови человека проводили методом седиментации в градиенте плотности фиколла [Hawley, 2004]. Подсчет количества и определение жизнеспособности ядросодержащих клеток осуществляли путем окрашивания трипановым синим. Концентрацию ядросодержащих клеток определяли по формуле (А*250*В/С, где А - число подсчитанных ядросодержащих клеток, В - разведение, С - число подсчитанных квадратов). Процент жизнеспособности рассчитывали как отношение числа жизнеспособных (неокрашенных) клеток к общему количеству ядросодержащих клеток. Во всех полученных образцах количество жизнеспособных клеток было не менее 97%.

Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови *г

Генетическую модификацию мононуклеаров пуповинной крови человека проводили методом электропорации [Von Levetzow G., 2006]. При пропускании электрического разряда через среду, содержащую смесь клеток и ДНК, происходит образование пор в клеточной стенке и транслокация генетического материала [Shigekawa, 1988]. В качестве трейсерной метки был использован усиленный зеленый флуоресцентный белок - EGFP. В работе использовали прибор Gene Pulser Xcell Total System (BioRad, USA) с фирменными кюветами с зазором электродов 0,4 см. Полученные результаты выявили наилучший результат электропорации клеток пуповинной крови человека при вольтаже 300 В, ёмкости 1500 мкФ.

Объект исследования и экспериментальная модель

Исследование проведено на 30-ти белых беспородных крысах-самцах весом 180-220 г, находящихся на стандартном рационе вивария.

'* Автор выражает благодарность Газизову И.М. и Йылмаз Т.С., совместно с которыми был выполнен данный фрагмент работы.

2* Автор выражает благодарность Ризванову A.A., совместно с которым был выполнен данный фрагмент работы.

Протокол исследования с использованием лабораторных животных соответствует требованиям, предъявляемым Республиканским Комитетом по Этическим вопросам при проведении клинических испытаний-исследований лекарственных средств при МЗ РТ (протокол № 2 от 21.02.06, № 1 от 11.02.2009).

Операция частичной гепатэктомии проведена по методике, описанной Хштенсом и Андерсоном (Higgins GM, Anderson RM. 1931). Одной опытной группе (9 крыс) проводили классическую гепатэктомию. Другой опытной группе (9 крыс) после удаления долей печени в селезенку вводили по 3 млн. ядросодержащих клеток пуповинной крови человека в 500 мкл среды RPMI. Третьей группе (9 крыс) после операции частичной гепатэктомии в селезенку вводили по 6x105 ядросодержащих клеток пуповинной крови человека, трансфецированных геном EGFP, в 500 мкл среды RPMI. Контрольной группе животных (3 крысы) после операции частичной гепатэктомии в селезенку вводили 500 мкл физиологического раствора. Удаленные во время операции доли печени использовали в качестве контроля. Объем удаленных долей составлял 68% от общей массы печени.

Методы исследования

Животных забивали под эфирным наркозом декапитацией через 2, 5, 7 суток после операции. После забоя извлекали печень для морфологического исследования. Ткань печени фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Окрашивание проводили с антителами к рецептору фактора стволовых клеток (C-kit) (клон Т595, "Novocastra", UK), антигену лейкоцитов человека (HLA-ABC) (клон W6/32, Dako, Denmark), а-гладкомышечному актину (а-ГМА) (клон 1А4, DAKO, Denmark), усиленному зеленому флуоресцентному белку (EGFP) (клон GSN24, Sigma, USA), цитокератину 19 (клон ВА17, Dako, Denmark), специфическому антигену гепатоцитов человека (HSA) (клон ОСН1Е5, Novokastra, UK), альфа-фетопротеину (AFP) (клон СЗ, Dako, Denmark). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии

C-kit и десмина (клон D33, DAKO, Denmark), EGFP и цитокератина 19. Далее гистологические срезы изучали под микроскопом (Leica, Германия) с последующим фотографированием.

Также было проведено морфометрическое исследование числа C-kit-позитивных клеток после частичной гепатэктомии и трансплантации клеток пуповинной крови человека и без таковой. Морфометрическое исследование было произведено тремя исследователями с помощью морфометрической окулярной сетки на микроскопе Микмед-5 при увеличении х400.*3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Большинство исследователей регенерации печени считает, что активации стволовых клеток после частичной гепатэктомии не происходит [Michalopoulos, 2007]. Мы проводили исследование срезов печени крыс после классической частичной гепатэктомии на экспрессию рецептора к фактору стволовых клеток C-kit, который считается наиболее удачным маркером для выделения стволовых клеток. Через двое суток после операции в печени мы обнаруживали экспрессию C-kit в синусоидных клетках, которая достигала максимума к пятым суткам и составляла 8-10 клеток в поле зрения. Слабую экспрессию C-kit наблюдали и в гепатоцитах через двое суток, далее число C-kit+ клеток увеличивалось вплоть до пятых суток и составляло 4-5 клеток в поле зрения. При этом двойное иммуногистохимическое окрашивание опытных срезов печени антителами к C-kit и десмину показало, что на всех сроках после частичной гепатэктомии экспрессирующие C-kit синусоидные клетки относятся к популяции перисинусоидальных клеток.

В образцах печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека C-kit экспрессировался гепатоцитами и мелкими клетками с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы уже на ранних экспериментальных сроках.

3 * Автор выражает благодарность Калягину М.С. и Газизову И.М., совместно с которыми был выполнен данный фрагмент работы.

Максимальное количество С-кк-позитивных гепатоцитов наблюдали через 5 суток после операции оно составляло 4-5 клеток в поле зрения, на 7 сутки происходило постепенное снижение числа этих клеток. При этом С-кк-позитивных синусоидных клеток на срезах печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации стволовых клеток пуповинной крови мы практически не наблюдали.

Очевидно, что трансплантация клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови после частичной гепатэктомии меняет характер активации стволового компартмента. Можно предложить несколько объяснений этому феномену. Во-первых, возможно, что в случае трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека нет необходимости в паракринных влияниях со стороны перисинусоидальных клеток печени для активации регенераторного ответа гепатоцитов. Достижение печенью массы, необходимой для выполнения ее функции как органа, обеспечивается в этом случае не перисинусоидальными клетками, а стволовыми клетками пуповинной крови человека, трансплантированными крысам. Во-вторых, клетки пуповинной крови человека, мигрировавшие в регенерирующую печень крысы, могут сами дифференцироваться в гепатоциты.

Распределение мононуклеаров пуповинной крови в печени крыс

Для выявления возможности миграции и распределения клеток человека в печени крыс целесообразно использовать маркеры клеток человека, например НЬА-АВС, который является антигеном главного комплекса гистосовместимости и широко представлен практически всеми ядросодержащими клетками организма человека. Уже на вторые экспериментальные сутки НЬА-АВС присутствовал в синусоидных клетках и гепатоцитах. На пятые сутки нами были обнаружены также небольшие НЬА-позитивные клетки, находящиеся в структуре портальных трактов, вблизи желчных протоков. Более того, на 7 сутки НЬА-АВС позитивные холангиоциты находились в структуре мелких новообразующихся протоков. Обнаруженные нами клетки, экспрессирующие НЬА-АВС и расположенные

в синусоидах печени, имели веретенообразную форму и по форме напоминали перисинусоидальные клетки. Ранее было показано образование миофибробластов после трансплантации клеток костного мозга, на основании чего авторами был сделан вывод о том, что такая трансплантация способствует развитию фиброза [Forbes, 2004, Russo, 2006].

Оценка возможности днфференцировки трансплантированных клеток в миофибробласты

Идеальным инструментом для выявления миофибробластов является иммуногистохимическая окраска с антителами к а-гладкомышечному актину (а-ГМА). По результатам нашего исследования экспрессия а-ГМА была обнаружена только в гладкомышечных клетках стенки сосудов на всех экспериментальных сроках. При этом ни на одном исследованном срезе нам не удалось выявить иммуногистохимическую экспрессию а-ГМА в синусоидах печени. Экспрессия а-ГМА не обнаружена также и в портальных трактах. Таким образом, нами не было обнаружено днфференцировки трансплантированных клеток в миофибробласты. А значит результаты, полученные Forbes и Russo - нельзя экстраполировать на все случаи регенерации печени на фоне стволовых/прогениторных клеток.

Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови Существующие на сегодняшний день методы генетической модификации эукариотических клеток включают в себя методы вирусной, химической и физической трансфекции. В нашем исследовании мы исключили возможность использования вирусной трансфекции, основными недостатками применения которой является возможность инфицирования [Baum, 1996, Frey, 1998]. Более того, некоторые вирусные векторы не применимы для лечения заболеваний, требующих стабильной интеграции в геном клеток-мишеней, а эффективность других векторов очень низкая [Corrías, 1998].

С целью выявления оптимальных условий для генетической модификации стволовых клеток пуповинной крови нами были оценены

следующие методы химической и физической трансфекции: трансфекционные реагенты для липофильной трансфекции Escort V (Sigma) и TransFast (Promega), и физический метод трансфекции - электропорация.

Эффективность трансфекции определяли по экспрессии трэйсерного гена - EGFP. Экспрессию выявляли как с помощью проточной цитометрии, так и по подсчету светящихся клеток при флуоресцентной микроскопии мазков клеток. Во всех проведённых методах процент выхода трансфецированных клеток находился в диапазоне от 20 до 30%, и обнаружить какую-либо разницу или преимущества какого-либо из апробированных методов нам не удалось. В то же время, мы считаем, что наиболее приемлемым для дальнейшего использования является метод электропорации. Основным преимуществом электропорации является сведение биологической вредности к минимуму по сравнению с вирус-опосредованной и химической передачей гена, а также стабильность достигнутой трансфекции.

При исследовании экспериментальных образцов печени методом флуоресцентной микроскопии установлено, что трансплантированные в селезенку генетически модифицированные клетки пуповинной крови человека довольно быстро попадают в печень крысы после частичной гепатэктомии. Уже на 2 сутки после операции было выявлено интенсивное свечение зелёного флуоресцирующего протеина в клетках экспериментальных образцов. На всех последующих исследованных сроках, т.е. на 5 и 7 сутки, интенсивность свечения EGFP в печени не исчезала и не снижалась. Для того, что бы уточнить морфологию «зелёных» клеток, обнаруженных при флуоресцентной микроскопии, мы провели иммуногистохимическое окрашивание срезов с антителами к EGFP.

По данным иммуногистохимического окрашивания в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека на всех исследованных сроках были обнаружены EGFP+ клетки. На ранних экспериментальных сроках, т.е. на вторые сутки, эти

клетки имели фенотип гепатобластов и гепатоцитов и располагались вокруг портальных трактов. В это же время были обнаружены и позитивные синусоидные клетки. Кроме того, на пятые экспериментальные сутки в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека появлялись холангиоциты, экспрессирующие ЕСРР. Эти клетки находились в структуре мелких новообразующихся протоков. Полученные результаты распределения генетически модифицированных клеток человека в регенерирующей печени крыс напрямую коррелируют с результатами иммуногистохимической окраски с антителами к НЬА-АВС.

Одним из открытых вопросов до сих пор остается вопрос о механизмах восстановления поврежденного органа трансплантированными столовыми клетками: происходит это путем слияния или прямой трансдифференцировки? Обнаруженные нами уже на вторые сутки ЕОРР+ гепатобласты, находящиеся вокруг портальных трактов и желчных протоков, навели нас на мысль о том, что эти гепатобласты являются промежуточной формой в дифференцировке гепатоцитов и холангиоцитов из гемопоэтических стволовых клеток. На более поздних сроках количество ЕвРР+ гепатобластов уменьшалось, но при этом увеличивается количество клеток с фенотипом гепатоцитов и появлялись ЕСРР+ холангиоциты. При этом результаты иммуногистохимического окрашивания антителами к СК19 выявило не только положительно окрашенные холангиоциты на всех исследованных сроках, но также и мелкие СК19+ клетки с фенотипом гепатобластов. Известно, что зрелые гепатоциты не экспрессируют СК19, но ранее была показана его экспрессия гепатобластами в ходе внутриутробного развития [Киясов, 2007].

Более того, двойное окрашивание с антителами к СК19 и ЕвРР выявило и холангиоциты, и единичные гепатобласты, экспрессирующие оба этих маркера, что свидетельствует о том, что эти клетки являются потомками трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови

человека. По-видимому, обнаруженные нами СК19+/ЕСРР+ гепатобласты трансдифференцируются в зрелые гепатоциты и холангиоциты и восстанавливают поврежденную структуру печени, повторяя процессы, происходящие в ходе внутриутробного развития печени. В некоторых исследования уже была продемонстрирована дифференцировка клеток костного мозга в гепатоциты через промежуточную форму незрелого гепатобласта [кЫка\уа,2006, Тега1,2003].

Полученные нами экспериментальные данные не оставляют сомнений, что генетически модифицированные стволовые клетки пуповинной крови человека, так же как и нативные клетки, мигрируют в печень крысы и дифференцируются в гепатобласты, гепатоциты, синусоидные клетки и холангиоциты. Открытым остается вопрос, являются ли эти клетки функционально активными или они лишь фенотипически подобны тем или иным клеткам печени крыс? Установленная нами экспрессия а-фетопротеина человека (показателя секреторной активности гепатобластов) и специфического антигена гепатоцитов человека в печени крыс обеих экспериментальных групп не только подтверждает их происхождение из трансплантированных клеток пуповинной крови человека, но и говорит о зрелости этих клеток и сохранении их функциональной активности.

Выводы

1. После частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека не происходит вовлечения синусоидных клеток печени в активацию регионального стволового компартмента в отличие от такового после классической частичной гепатэктомии.

2. Трансплантированные в селезёнку мононуклеары пуповинной крови человека мигрируют в печень крыс после частичной гепатэктомии и приобретают фенотип гепатоцитов, синусоидных клеток и холангиоцитов.

3. В печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека не происходит дифференцировки трансплантированных клеток в миофибробласты.

4. Трансфекция не влияет на способность клеток пуповинной крови человека мигрировать в печень крыс после частичной гепатэктомии и дифференцироваться в паренхиматозные и непаренхиматозные клетки печени.

5. Гепатобласты, экспрессирующие маркеры клеток человека в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека, могут быть промежуточной формой дифференцировки трансплантированных клеток в клеточные типы, регенерирующей печени крыс.

6. Гепатобласты и гепатоциты, экспрессирующие маркеры клеток человека в печени крыс после трансплантации как генетически модифицированных, так и нативных клеток, являются функционально активными.

Практические рекомендации

Рекомендовать внедрение в практику генетических лабораторий протокол электропорации мононуклеаров пуповинной крови человека. Рекомендовать проведение дополнительных доклинических испытаний на других моделях регенерации печени с трансплантацией нативных и генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека. Для выявления клеток, несущих ген EGFP, кроме иммунофлуоресцентной микроскопии рекомендуется также применение высокочувствительного метода иммуногистохимии с антителами к данному белку.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Gazizov I.M. Expression of C-kit in liver after partial hepatectomy in rats / Gazizov IM, Kaligin MS, Pevnev GO, Burganova GR, Gumerova AA, Kiassov AP.// Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Conference, Dresden (Germany), 2007. - C. 14.

2. Гумерова A.A. Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени/ A.A. Гумерова, А.П. Киясов, М.С. Калигин, И.М. Газизов, С.Р. Абдулхаков, Д.И. Андреева, М.А. Титова, Т.С. Сметанникова// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, Том 2, №4. _ 2007. - С. 39-46.

3. Андреева Д.И. Генетически модифицированные гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови человека в регенерации печени после частичной гепатэктомии у крыс/ Д.И. Андреева, И.М. Газизов // Тезисы доклада. Вестник РГМУ. -2008.-№2(61).-С. 262

4. Газизов И.М. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток C-kit в регенерирующей печени после частичной гепатэктомии/ И.М. Газизов, А. А. Гумерова, М.С. Калигин, Д.И. Андреева, Т.С. Сметанникова, М.А. Титова, Г.Р. Бурганова, А.П. Киясов // Морфологические ведомости. -2008. - №1-2. - С.23-27.

5. Калигин М.С. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток (C-kit) в ходе развития внутренних органов человека/ М.С. Калигин, А.А. Гумерова, М.А. Титова, И.М. Газизов, Т.С. Сметанникова, Д.И. Андреева, А.П. Киясов// Морфологические ведомости. - 2008. - №1-2. - С. 63-66.

6. Т.С. Йылмаз Сравнение эффективности различных методов трансфекции плазмидными векторами стволовых клеток пуповинной крови для клеточной терапии/ И.М. Газизов, Д.И. Андреева, М.С. Калигин, А.А. Ризванов// Материалы XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань. - 2008. - С. 202-203.

7. Андреева Д.И. Терапевтический эффект трансплантации генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека G93A мышам/ Д.И. Андреева, М.С. Калигин, Т.С. Йылмаз, И.М. Газизов, А.А. Ризванов// Материалы XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань. - 2008. - С. 190-191.

8. Rizvanov A. A. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF and L(1)CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neuro-trophic factors to support neuro-genesis-a novel approach in stem cell therapy/ AA. Rizvanov , A.P. Kiyasov, I.M. Gazizov , T.S. Yilmaz, M.S. Kaligin, D.I. Andreeva, A.K., Shafigullina, D.S. Guseva, S.L. Kiselev, A. Palotas, R.R. Islamov// J. Neurochem Int. - 2008. - 53(6-8). - C.3 89-394.

9. Андреева Д.И. Хоуминг и дифференцировка трансфецированных гемопоэтических клеток пуповинной крови человека в печени крыс/ Д.И. Андреева, Т.С. Йылмаз, И.М. Газизов, М.С. Калигин// Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», Самара. - 2008. - С. 13 8-140.

10. Андреева Д.И. Роль генетически модифицированных стволовых клеток пуповинной крови человека в регенерации печени на модели частичной гепатэктомии у крыс/ Д.И. Андреева, М.С. Калигин, Т.С. Йылмаз, А.А. Ризванов, А.А. Гумерова, А.П. Киясов// Материалы Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва. - 2008. -С. 26.

11. Andreeva D. Can hepatocytes originate from umbilical cord blood stem cells?/ D. Andreeva, T. Ilmaz, A. Gumerova, A. Kiassov // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Conference, Mainz, 2008. - C. 2.

12. Gazizov I.M. Perisinusoidal cells expressing stem cell properties after partial hepatectomy in rats/ I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, D.I. Andreeva, A.A.Gumerova, A.P. Kiassov // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Conference, Mainz, 2008. -C. 35.

13. Киясов А.П. Клеточная или регенеративная медицина в терапии наиболее значимой соматической патологии/ А.П. Киясов, Д.И. Т.С. Йылмаз, Андреева// Практическая медицина. - 2008. - №8 - С. 17-22.

14. Андреева Д.И. Влияние трансплантации клеток пуповинной крови человека на активацию стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии./ Д.И. Андреева, М.С. Калигин, Т.С. Йылмаз, И.М. Газизов, Г.О. Певнев// Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань. - 2009. - С. 159160.

15. Андреева Д.И. Пути дифференцировки траисфецированных мононуклеаров пуповинной крови человека в печени крыс после частичной гепатэктомии/ Д.И. Андреева, И.М. Газизов, М.С. Калигин, Т.С. Йылмаз, А.А. Гумерова// Материалы Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва. - 2009. - С. 11.

16. Газизов И.М. Активация стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации клеток пуповинной крови человека// И.М. Газфов, Д.И. Андреева, М.С. Калигин, Т.С. Йылмаз, А.А. Гумерова, А.П. Киясов// Материалы Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва. -

2009.-С.16. •

17. Gumerova А.А. Hepatic stellate cell can be livers stem cells and source of hepatocytes regeneration // Gumerova A.A., Kiassov A.P., Titova M.A., Abdulkhakov S.R., Gazizov IM, Kaligin M.S, Yilmaz T.S.// Abstracts of 44 Annual Meeting of the European Assoiation for the Study of the Liver, Copenhagen (Denmark). J. Hepatology. - 2009. - C. 307.

18. Andreeva D.I. Differentiation of transfected human umbilical cord blood cells in the regenerating liver of rats / D.I. Andreeva, I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, T.S. Yilmaz, A.A. Gumerova, A.P. Kiassov, A. A. Rizvanov// Abstracts of 45 Annual Meeting of the European Assoiation for the Study of the Liver, Vienna (Austria). J. Hepatology. - 2010. - C. 353354.

19. Gazizov I.M. Cord blood mononuclear cells can be a source of hepatocytes and Kupfer cells restoration after partial hepatectomy in rats/ I.M. Gazizov, D.I. Andreeva, A.V. Tabanakova, M.S. Kaligin, T.S. Yilmaz, A.A. Gumerova, A.P. Kiassov// Abstracts of 45 Annual Meeting of the European Assoiation for the Study of the Liver, Vienna (Austria). J. Hepatology. - 2010. - C.362.

20. Gumerova A.A. Hepatocytes and hepatic stellate cells have properties of stem/progenitor cells during prenatal development and liver regeneration/ A.A. Gumerova, A.P. Kiassov, M.C. M.S. Kaligin, I.M. Gazizov, M.A. Titova, D.I. Andreeva, S.R. Abdulkhakov, T.S. Yilmaz, M.O. Mavlikeev// Abstracts of 45 Annual Meeting of the European Assoiation for the Study of the Liver, Vienna (Austria). J. Hepatology. - 2010. -C.364.

21. Андреева Д.И. Дифференцировка траисфецированных мононуклеаров пуповинной крови человека в эпителиальные клетки регенерирующей печени крыс/ Д.И. Андреева, И.М. Газизов, М.С. Калигин, Т.С. Йылмаз, А.Р. Шайхутдинова, А.А. Гумерова, М.А. Титова// Материалы XV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань. -

2010.-С.266.

22. Андреева Д.И. Возможность дифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс/ Д.И. Андреева, И.М. Газизов, М.С. Калигин, Т.С. Йылмаз, М.А. Титова, А.А. Гумерова, А.А. Ризванов, А.П. Киясов// Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования», Уфа. — 2010. — С.483-487.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «АртПечатьСервис» ИП Мартынов М.Н. Подписано в печать 05.08.10 г. Заказ № 158. Тираж 100 экз. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Объем 1,25 п.л. 420061, г. Казань, ул. Космонавтов, 41. Тел. 295-10-19

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Андреева, Дина Ивановна

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Клеточные источники регенерации печени.

2.1.1 Эпителиальные клетки печени.

2.1.2 Тканевой резерв стволовых клеток печени.

2.1.3 Внепеченочные стволовые клетки в регенерации печени.

2.1.3.1 Клетки костного мозга.

2.1.3.1.1 Гемопоэтические стволовые клетки.

2.1.3.1.2 Мезенхимальные стволовые клетки.

2.1.3.2 Стволовые клетки пуповинной крови.

2.2 Слияние или трансдифференцировка.

2.3 Генетическая модификация стволовых клеток.

2.3.1 Вирусная трансфекция.

2.3.2 Химическая трансфекция.

2.3.3 Физическая трансфекция.

2.3.4 Трейсерный зеленый флуоресцентный белок.

2.4 Модели регенерации печени.

2.4.1 Частичная гепатэктомия.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Получение мононуклеаров пуповинной крови человека.

3.1.1 Получение концентрата клеток пуповинной крови человека.

3.1.2 Выделение фракции мононуклеаров из пуповинной крови человека.

3.1.3 Подсчет количества и определение жизнеспособности ядросодержащих клеток.

3.2 Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови человека.

3.2.1 Клонирование reHaEGFP в экспрессионные плазмидные вектора pcDNA 3.1.

3.2.2 Сравнение методов генетической модификации клеток пуповинной крови человека.

3.2.2.1 Трансфекция с использованием Escort V.

3.2.2.2 Трансфекция с использованием TransFast.

3.2.2.3 Физический метод трансфекции - электропорация.

3.3 Объекты исследования.

3.4 Гистологические и иммуногистохимические методы исследования.

3.4.1 Депарафинирование и регидратация парафиновых срезов.

3.4.2 Окрашивание гематоксилин-эозином.

3.4.3 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к а-ГМА.

3.4.4 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к альфа-фетопротеину.

3.4.5 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к HSA, СК19.

3.4.6 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к EGFP.

3.4.7 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к HLA-ABC, C-kit.

3.4.8 Двойное иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов печени антителами против

EGFP и цитокератина19, и C-kit и десмина.

3.4.9 Определение числа C-kit позитивных клеток.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Активация стволового компартмента в регенерирующей печени крыс.

4.1.1 Экспрессия C-kit в печени крыс после ЧГ.

4.1.2 Экспрессия C-kit в печени крыс после ЧГ и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека.63 4.2 Распределение мононуклеаров пуповинной крови человека в печени крыс.

4.3 Анализ возможности трансформации мононуклеаров пуповинной крови человека в миофибробласты после трансплантации в печень крыс.

4.4 Возможность генетической модификации мононуклеаров пуповинной крови человека.

4.4.1 Разработка метода генетической модификации стволовых кроветворных клеток пуповинной крови человека.

4.4.2 Сравнение эффективности выбранных методов трансфекции мононуклеарной фракции пуповинной крови человека.

4.5 Анализ распределения трансфецированных мононуклеаров пуповинной крови человека в печени крыс после ЧГ.

4.5.1 Иммунофлуоресцентная микроскопия срезов печени крыс после ЧГ и трансплантации трансфецированных мононуклеаров пуповинной крови человека.

4.5.2 Экспрессия EGFP в печени крыс после ЧГ и 1 трансплантации генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека.

4.5.3 Экспрессия СК 19 в печени крыс после ЧГ и трансплантации генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека.

4.5.4 Экспрессия EGFP и СК19 в печени крыс после ЧГ и трансплантации генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека.

4.6 Функциональная активность донорских клеток в ходе трансдифференцировки в гепатоциты.

4.6.1 Экспрессия HSA в печени крыс после ЧГ и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека.

4.6.2 Экспрессия а-фетопротеина в печени крыс после ЧГ и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пути дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс"

АКТУАЛЬНОСТЬ. По данным статистики, пять процентов взрослого населения планеты страдает хроническими гепатитами различной этиологии (вирусные, аутоиммунные, метаболические), более половины которых заканчиваются циррозом. В свою очередь цирроз печени занимает первое место среди причин смерти от болезней органов пищеварения. И хотя клетки печени обладают чрезвычайно высоким потенциалом к самообновлению, в случаях, когда пролиферация гепатоцитов подавлена вирусной инфекцией или химическими агентами, а также когда повреждение печени носит хронический характер, т.е. происходит перманентный процесс репаративной регенерации, внутритканевые источники регенерации печени могут быть исчерпаны [121]. Несмотря на огромное число исследований, направленных на изучение механизмов и клеточных источников регенерации печени, своевременная диагностика и эффективное лечение таких заболеваний все еще остается большой проблемой современной гепатологии. Единственным эффективным методом лечения цирроза на сегодняшний день является трансплантация печени. Однако доступность донорских органов не соответствует реальной потребности, к тому же существует риск отторжения трансплантированного органа, и неизбежная необходимость пожизненного приёма иммуносупрессивных препаратов.

В качестве альтернативы трансплантации печени могут быть разработаны и внедрены методы регенеративной медицины и, в частности, трансплантация стволовых/прогениторных клеток. Возможность образования гепатоцитов из стволовых клеток костного мозга впервые была показана в работе Петерсена и соавторов еще в 1999 году [40]. В то же время миграция, хоуминг и возможности дифференцировки клеток пуповинной крови в печени ещё не исследованы в полной мере. Безусловно, именно пуповинная кровь может стать перспективным источником стволовых клеток для трансплантации, так как обладает такими преимуществами, как абсолютно нетравматичный и безопасный как для матери, так и для ребенка способ получения, а также высокая способность клеток к пролиферации и их низкая иммуногенность [111, 207, 225]. Большинство исследований, в которых изучалось участие кроветворных клеток в регенерации печени, было выполнено на моделях токсического повреждения органа, работ же, посвященных участию гемопоэтических стволовых клеток в восстановлении печени после частичной гепатэктомии, практически нет.

Механизм образования гепатоцитов из гемопоэтических стволовых клеток до сих пор является предметом бурного обсуждения. Предполагается, что возможна как прямая дифференцировка стволовых клеток [35, 98], так и слияние зрелых клеток миелоидной линии с резидентными гепатоцитами [230, 103, 240]. В результате слияния образуются гибридные клетки, которые экспрессируют специфические печёночные маркеры, но до конца не ясно, обладают ли они полным спектром функциональной активности гепатоцитов.

В клеточной медицине возможно применение как аллогенных, так и аутологичных клеток для лечения ряда заболеваний печени. Однако существуют болезни печени, например наследственные метаболические нарушения, такие как болезнь Вильсона-Коновалова, наследственные гликогенозы, в отношении которых применение аутологичных стволовых клеток очень ограничено. В таком случае весьма перспективным направлением станет разработка методов генетической модификации стволовых и прогениторных клеток и трансплантация «генетически вылеченных» клеток таким больным. В ходе разработки методов трансплантации генетически модифицированных клеток, необходимо выяснить, влияет ли генетическая модификация на свойства гемопоэтических стволовых клеток и их способность мигрировать в орган-мишень и дифференцироваться в клетки печени. j

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучение хоуминга и дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека при регенерации печени после частичной гепатэктомии у крыс. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

3. Изучить возможность миофибропластической трансдифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека, трансплантированных крысам после частичной гепатэктомии.

6. Выяснить, являются ли трансплантированные нативные и генетически модифицированные мононуклеары пуповинной крови человека функционально активными в печени крыс.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые была проведена трансплантация мононуклеаров пуповинной крови человека крысам после частичной гепатэктомии. Показано, что трансплантация мононуклеаров пуповинной крови человека меняет характер активации стволового компартмента в печени: в этом случае не происходит вовлечения в регенерацию синусоидных клеток, необходимых для её паракринной регуляции. Было установлено, что после трансплантации клеток пуповинной крови человека в регенерирующей после частичной гепатэктомии печени крыс появляются клетки, несущие антигены человека и имеющие фенотип гепатоцитов, холангиоцитов и синусидных клеток. В диссертации впервые на основе иммуногистохимического анализа получены доказательства того, что трансплантированные мононуклеарные клетки человека не подвергаются трансформации в миофибробласты в печени крыс. Установлено, что возможна генетическая модификация клеток пуповинной крови человека методом электропорации. При этом генетическая модификация не изменяет способность мононуклеаров пуповинной крови мигрировать, встраиваться и дифференцироваться в паренхиматозные и непаренхиматозные клеточные типы печени крыс.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты работы позволили по новому оценить и понять закономерности изменения микроструктуры железы в ходе регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека. Проведенные исследования способствовали выявлению новых фактов, как о характере, так и о последовательности клеточных реакций, возникающих в ходе регенерации печени после частичной гепатэктомии, и участии в этих процессах клеток пуповинной крови человека. Результаты работы расширяют представления о возможной роли трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека в развитии фиброза печени. Теоретически значимым является установление способности нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека замещать различные клеточные типы в регенерирующей печени крыс.

Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения проблемы регенерации печени и участия гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в этом процессе. Результаты проведенных исследований позволяют на основе разработанных методических подходов создать принципиально новую схему клеточной и генной терапии наследственных заболеваний, связанных с нарушением экспрессии генов в печени, когда в качестве материала для трансплантации будут использованы не донорские гепатоциты с ограниченным сроком жизни, а аутологичные генетически «вылеченные» стволовые клетки пуповинной крови. В ходе выполнения работы разработаны методические подходы для генетической модификации мононуклеаров пуповинной крови. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. После частичной гепатэктомии и трансплантации фракции мононуклеаров пуповинной крови человека крысам гепатоциты, синусоидные клетки и холангиоциты экспрессируют антигены человека: антиген главного комплекса гистосовместимости человека — свидетельствующий о миграции и встраивании трансплантированных клеток; специфический антиген гепатоцитов человека и альфа-фетопротеин -свидетельствующие об их функциональной активности.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Протокол электропорации мононуклеаров пуповинной крови человека включен в работу лаборатории Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете. Результаты проведенного исследования внедрены в работу ГМУ «Республиканская клиническая больница» (г. Казань), а также включены в дополнительную образовательную программу «Молекулярная и клеточная медицина» и в учебный процесс на кафедре нормальной анатомии и кафедре гистологии Казанского государственного медицинского университета.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований доложены и обсуждены на XIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2008), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), 167-м международном симпозиуме Фальк (Майнц, Германия, 2008), IV Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2009), XIV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009), Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010), 45-м Ежегодном собрании Европейской Ассоциации Изучения Печени (EASL) (Вена, Австрия, 2010).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 132 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, заключения, выводов и библиографии. Диссертация содержит 7 таблиц и 37 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Андреева, Дина Ивановна

6 ВЫВОДЫ

2. Трансплантированные в селезенку мононуклеары пуповинной крови человека мигрируют в печень крыс после частичной гепатэктомии и приобретают фенотип гепатоцитов, синусоидных клеток и холангиоцитов.

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необычайно высокая способность к регенерации, которой обладают клетки печени, может быть утрачена при острых поражениях, чрезмерном объеме хирургической резекции, при развитии хронических заболеваний с исходом в цирроз. В настоящее время для лечения функциональной недостаточности печени, а также опухолей и врожденных дефектов метаболизма эффективно используется трансплантация печени. Трансплантация печени дает хорошие результаты пятилетней выживаемости. Однако существующая уже сегодня проблема нехватки донорских органов в ближайшее время встанет еще более остро [2]. Ежегодный рост числа хронических заболеваний печени и, как следствие, увеличение потребности в трансплантации печени, заставляют исследователей искать новые методы лечения данных заболеваний. Альтернативным направлением их терапии могут стать клеточные технологии, одной из которых является трансплантация стволовых клеток.

Стволовые клетки - это клетки, способные делиться в течение всей жизни организма. Потомки стволовых клеток под воздействием определенных сигналов делятся и превращаются во все типы специализированных клеток организма [2].

Многие годы источником гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации служил костный мозг. Клиническое применение пуповинной крови человека [131, 132, 133] стало альтернативой использованию костного мозга и мобилизированной периферической крови в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток. Преимуществами пуповинной крови как источника клеток для трансплантации являются более высокая концентрация клеток в единице объёма крови, большее количество малодифференцированных клеток и, как следствие, их меньшая иммуногенность, а также абсолютно нетравматичный и безопасный как для матери, так и для ребенка способ получения крови.

Впервые возможность образования гепатоцитов из гемопоэтической стволовой клетки была показана еще в 1999 году [40]. В настоящее время исследования по изучению возможностей применения стволовых клеток для лечения заболеваний печени ведутся в нескольких направлениях.

Во-первых, изучается влияние стволовых клеток пуповинной крови на регенерацию печени в разных экспериментальных моделях (повреждение аллиловым спиртом, четыреххлористым углеродом, облучением и т.д., во многих случаях с применением ацетоаминфлуорена, подавляющего пролиферацию гепатоцитов) у мышей [22, 23, 149, 210]. Во всех этих случаях регенерация печени сопровождается появлением так называемых овальных клеток, что обычно рассматривается как признак активации стволового компартмента в самой печени. Нами была выбрана модель частичной гепатэктомии, как вариант восстановления печени без участия овальных клеток, чтобы можно было оценить возможности дифференцировки трансплантированных стволовых клеток пуповинной крови.

Во-вторых, отрабатываются различные методы введения стволовых клеток пуповинной крови. Как правило, клетки вводят внутрибрюшинно [22] или внутривенно [210], есть единичные работы, в которых клетки вводили в селезенку и в воротную вену [132]. После детального анализа литературы, выявившего значительно более высокий уровень репопуляции гепатоцитов из стволовых клеток после их трансплантации в селезенку [149] по сравнению с внутривенным и внутрибрюшинным введением, мы пришли к заключению о необходимости адресной доставки трансплантируемых клеток к поврежденному органу, поскольку в противном случае происходит «размывание» клеток по всему организму и снижение концентрации клеток в органе-мишени. В связи с этим мы вводили клетки в селезенку, из которой они по системе воротной вены поступали в печень.

Сегодня большинство исследователей регенерации печени считает, что активации стволовых клеток при ЧГ не происходит [173]. В предыдущих исследованиях мы, основываясь на результатах исследований Fujio [102], проводили иммуногистохимическое исследование регенерирующей печени после ЧГ на экспрессию C-kit. Рецептор к фактору стволовых клеток C-kit считается одним из наиболее удачных маркеров для выделения стволовых клеток среди множества предложенных. Через сутки после операции мы обнаруживали в печени экспрессию C-kit в синусоидных клетках, через двое суток она нарастала, достигая максимума по интенсивности окрашивания и числу окрашиваемых клеток, к 3-5 суткам после ЧГ и составло 8-10 клеток в поле зрения. Через семь суток число окрашенных синусоидных клеток и интенсивность окраски уменьшались [20]. Слабую экспрессию C-kit наблюдали и в гепатоцитах через 24 часа, далее их число увеличивалось вплоть до четвертых суток и составляло 4-5 клеток в поле зрения, однако интенсивность экспрессии C-kit в гепатоцитах была всегда несколько ниже, чем в перисинусоидальных клетках. При этом двойное иммуногистохимическое окрашивание опытных срезов печени антителами к десмину и C-kit показало, что на всех сроках после частичной гепатэктомии экспрессирующие C-kit синусоидные клетки относятся к популяции перисинусоидальных клеток [20].

В образцах печени крыс после ЧГ и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека мы также наблюдали экспрессию C-kit. Данный маркер экспрессировался гепатоцитами и мелкими клетками с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы, расположенными в I зоне печеночного ацинуса уже на ранних экспериментальных сроках. В это же время в печени появлялись C-kit-позитивные гепатоциты. Максимальное количество C-kit-позитивных гепатоцитов наблюдали через 5 суток после операции, оно составило 4-5 клеток в поле зрения, на 7-е сутки происходило постепенное снижение числа этих клеток. При этом C-kit-позитивных синусоидных клеток в срезах печени крыс после ЧГ и трансплантации стволовых клеток пуповинной крови было значительно меньше, чем в срезах печени после ЧГ без трансплантации, и составляло всего 0-1 клетку в поле зрения.

Можно предположить, что трансплантация клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови после ЧГ меняет характер активации стволового компартмента. Видимо, степень активации стволового компартмента печени снижается, так как при этом не происходит вовлечения синусоидных клеток, выявляемого при классической ЧГ. Возможно несколько объяснений этого феномена. Во-первых, можно предположить, что в случае трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека нет необходимости в паракринной функции перисинусоидальных клеток для активации регенераторного ответа гепатоцитов. Достижение печенью массы, необходимой для выполнения ее функции как органа посредством гуморальных факторов интегрируется в этом случае не перисинусоидальными клетками, а стволовыми клетками пуповинной крови человека, трансплантированными крысам. Во-вторых, клетки пуповинной крови человека, мигрировавшие в регенерирующую печень крысы, сами начинают дифференцироваться в гепатоциты. В последние годы было показано, что клетки костного мозга, мигрирующие в печень, могут дифференцироваться в гепатоциты, пролиферировать и замещать поврежденные клетки печени. Для проверки этой гипотезы, в следующей части нашего исследования мы попытались выявить человеческие маркеры в печени крысы после ЧГ и трансплантации пуповинной крови человека. С этой целью были использованы антитела к HLA-ABC - антигену главного комплекса гистосовместимости, широко представленному всеми ядросодержащими клетками человека [228].

Уже на первом экспериментальном сроке (2 суток) HLA-ABC присутствовал в синусоидных клетках и гепатоцитах. Следует отметить, что позитивно окрашенные клетки были сконцентрированы в перипортальных областях печеночных ацинусов, что обусловлено, скорее всего, доставкой клеток с портальным кровотоком. Нами были выявлены также небольшие HLA-ABC позитивные клетки, находящиеся в структуре портальных трактов, вблизи желчных протоков. Более того, на 7 сутки HLA-ABC позитивные холангиоциты находились в структуре мелких новообразующихся протоков. Обнаруженные нами клетки, экспрессирующие HLA-ABC и расположенные в синусоидах печени, имели вытянутую, веретенообразную форму и по фенотипу напоминали перисинусоидальные клетки. Ранее было показано образование а-ГМА+ миофибробластов после трансплантации клеток костного мозга, на основании чего был сделан вывод о том, что такая трансплантация способствует развитию фиброза [26, 227]. Идеальным инструментом для выявления миофибробластов является иммуногистохимическая окраска антителами к а-гладкомышечному актину (а-ГМА).

По результатам нашего исследования экспрессия а-ГМА была обнаружена только в гладкомышечных клетках стенки сосудов на всех экспериментальных сроках. При этом ни на одном исследованном срезе нам не удалось выявить иммуногистохимическую экспрессию а-ГМА в перисинусоидальных клетках. Экспрессия а-ГМА не обнаружена также и в портальных трактах. Таким образом, можно сделать вывод, что трансплантированные клетки не подвергаются миофибропластической трансформации в печени крыс после ЧГ.

Несмотря на то, что эффективность начального приживления, долгосрочного выживания и механизм восстановления органа трансплантированными клетками остаются предметом обсуждения [68, 119, 172, 232, 243], известны модели массивной репопуляции летально поврежденного органа [42, 54, 205, 240], которые являются свидетельством перспективности дальнейших исследований трансплантации кроветворных клеток для коррекции патологии печени. В клеточной медицине возможно применение как аллогенных, так и аутологичных клеток. Однако в случае наследственных метаболических заболеваний печени применение аутологичных стволовых клеток очень ограничено. В таком случае весьма перспективным направлением станет разработка методов генетический модификации стволовых и прогениторных клеток для трансплантации.

Существующие на сегодняшний день методы генетической модификации эукариотических клеток включают в себя методы вирусной, химической и физической трансфекции. В нашем исследовании мы исключили возможность использования вирусной трансфекции, основными недостатками применения которой является возможность инфицирования реципиента [45, 114]. Более того, некоторые вирусные векторы не применимы для лечения заболеваний, требующих стабильной интеграции в геном клеток-мишеней, а эффективность других векторов очень низкая [115]. Так как генная терапия предполагает не только эффективный, но и безопасный метод доставки гена в клетку в последнее время началось усиленное изучение методов невирусной нуклеофекции. С целью выявления оптимальных условий для генетической модификации стволовых клеток пуповинной крови нами были оценены следующие методы химической и физической трансфекции: трансфекционные реагенты для липофильной трансфекции Escort V (Sigma) и TransFast (Promega), и физический метод трансфекции - электропорация.

Эффективность трансфекции (генетической модификации) мононуклеаров ПК мы определяли по экспрессии трэйсерного гена - EGFP. Экспрессию выявляли как с помощью проточной цитометрии, так и по подсчету светящихся клеток, используя флуоресцентную микроскопию мазков клеток. Во всех проверенных методах процент выхода трансфецированных клеток находился в диапазоне от 20 до 30%, и обнаружить какую-либо разницу или преимущества какого-либо из апробированных методов нам не удалось. В то же время, мы считаем, что наиболее приемлемым (поскольку нет разницы в эффективности трансфекции) для дальнейшего использования в клинике является метод электропорации. Электропорация - один из физических методов внедрения трансгенов внутрь клетки, когда при пропускании электрического разряда через среду, содержащую смесь клеток и ДНК, происходит образование пор в клеточной стенке и транслокация генетического материала [220]. Основным I г преимуществом электропорации является сведение биологической вредности к минимуму по сравнению с вирус-опосредованной и химической передачей гена, а также стабильность достигнутой трансфекции.

При исследовании экспериментальных образцов печени методом флуоресцентной микроскопии установлено, что трансплантированные в селезенку генетически модифицированные клетки пуповинной крови человека довольно быстро попадают в печень крысы после ЧГ, Уже на 2 сутки после операции было выявлено интенсивное свечение зеленого флуоресцирующего протеина в клетках экспериментальных образцов. На всех последующих исследованных сроках, т.е. на 5 и 7 сутки, интенсивность свечения EGFP в печени не исчезала и не снижалась. Для того, что бы уточнить морфологию «зеленых» клеток, обнаруженных по данным флуоресцентной микроскопии, мы провели иммуногистохимическое окрашивание антителами к EGFP.

По данным иммуногистохимического окрашивания в печени крыс после ЧГ и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека на всех исследованных сроках были обнаружены EGFP+ клетки. На ранних экспериментальных сроках, т.е. на вторые сутки эти клетки имели фенотип гепатобластов и гепатоцитов и располагались вокруг портальных трактов. В это же время были обнаружены и синусоидные клетки. Кроме того, на пятые экспериментальные сутки в печени крыс после ЧГ и трансплантации генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека появлялись холангиоциты экспрессирующие EGFP. Эти клетки находились в структуре мелких новообразующихся протоков. Полученные результаты распределения генетически модифицированных клеток человека в регенерирующей печени крыс напрямую коррелируют с результатами иммуногистохимической окраски антителами к HLA-ABC срезов печени крыс после трансплантации нативных мононуклеаров пуповинной крови ( человека. г f ?

Однако открытым остается вопрос о механизмах восстановления поврежденного органа трансплантированными столовыми клетками, происходит это путем слияния или прямой трансдифференцировки. Обнаруженные нами уже на вторые сутки EGFP+ гепатобласты, находящиеся вокруг портальных трактов и желчных протоков, навели нас на мысль о том, что эти гепатобласты являются промежуточной формой в дифференцировке гепатоцитов и холангиоцитов из гемопоэтических стволовых клеток. На более поздних сроках количество EGFP+ гепатобластов уменьшалось, но при этом увеличивается количество клеток с фенотипом гепатоцитов и появлялись EGFP+ холангиоциты. При этом результаты иммуногистохимического окрашивания антителами к СК19 выявило не только положительно окрашенные холангиоциты на всех исследованных сроках, но также и мелкие СК19+ клетки с фенотипом гепатобластов. Известно, что зрелые гепатоциты не экспрессируют СК19, но ранее была показана его экспрессия гепатобластами в ходе внутриутробного развития [5]. Более того, двойное окрашивание антителами к СК19 и EGFP выявило и холангиоциты и единичные гепатобласты, экспрессирующие оба этих маркера, что может быть свидетельством того, что эти клетки являются потомками трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека. Возможно, обнаруженные нами CK19+/EGFP+ гепатобласты трансдифференцируются в зрелые гепатоциты и холангиоциты и восстанавливают поврежденную структуру печени, повторяя процессы, происходящие в ходе внутриутробного развития печени. В некоторых исследования уже была продемонстрирована дифференцировка клеток КМ в гепатоциты через промежуточную форму незрелого гепатобласта [35, 98].

Полученные нами экспериментальные данные не оставляют сомнений, что генетически модифицированные стволовые клетки пуповинной крови человека, так же как и нативные клетки, мигрируют в печень крысы и дифференцируются в гепатобласты, гепатоциты, синусоидные клетки и холангиоциты. Открытым остается вопрос, являются ли эти клетки функционально активными или они лишь фенотипически подобны тем или иным клеткам печени крыс? Экспрессия специфического антигена гепатоцитов человека и АФП человека клетками печени у крыс обеих экспериментальных групп не оставляет сомнений не только в их происхождении из трансплантированных клеток пуповинной крови, но и говорит о зрелости этих клеток и сохранении их функциональной активности.

108

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Андреева, Дина Ивановна, Казань

1. Андреева Д.И. Генетически модифицированные гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови человека в регенерации печени после частичной гепатэктомии у крыс/ Д.И. Андреева, И.М. Газизов // Тезисы доклада. Вестник РГМУ.-2008.- №2(61). С. 262

2. Биология стволовых клеток и клеточные технологии / Пальцев М.А. (и др.) М.: «Медицина», «Шико», 2009. - 456с.

3. Киясов А.П. Методы иммуногистохимии // А.П. Киясов Казань: 1998.-С. 9-34: (Руководство для врачей-морфологов).

4. Киясов А.П. Экспрессия десмина и цитокератинов № 8 и 18 в некроветворных клетках печени крыс // Онтогенез.-1997.-Т. 28, № З.-С. 217222.

5. Киясов А.П. Современные технологии морфологических исследований / А.П. Киясов.- Казань: 2001.- С. 9-34: (Методическое пособие для студентов, аспирантов и врачей-патологов)

6. Мансуров Х.Х. Кардинальные вопросы алкогольной болезни печени/ Мансуров Х.Х., Мироджов Т.К.// Тер. арх. 1988. - № 7. - С. 69-72.

7. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники / Г.А. Меркулов -Л.: Медгиз, 1961.-340 с.

8. Полак Дж. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы / Дж. Полак, С. Ван Норден -М.: Мир, 1987.

9. Саркисов Д.С. Очерки истории общей патологии. /Саркисов Д.С. М.: Медицина, 1993.-512 с.10. Семченко В.В. Гистологическая техника / В.В. Семченко, С.А. Барашкова, В.И. Ноздрин - Омск-Орел: 2006.-С.78-85.

10. Семченко В.В. Гистологическая техника / В.В. Семченко, С.А. Барашкова, В.И, Ноздрин Омск-Орел: 2006.-С.78-85.

11. Серов В.В. Морфологическая диагностика заболеваний печени / В.В. Серов, К. Лапиш. М.: Медицина, 1989.-336 с.

12. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии / М.В, Угрюмов // Итоги науки и техники ВИНИТИ, серия "Морфология".-1991.-Т. 15.-115 с.

13. Урываева И.В. Фенотипические признаки стволовых клеток экспрессия мембранного транспортера Bcrpl/Abcg2 и экспорт красителя Hoechst 33342 — у гепатоцитов при регенерации печени // Доклады академии наук. - 2004, - Т. 398, №3, - С. 422-425.

14. Урываева И.В. Модель репопуляции печени, поврежденной дипином. Бюлл. экспер. биол. мед. 1997; 124(10):364-368.

15. Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени/ А.А. Гумерова и др./ Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, Том 2, №4. 2007. -С. 39-46.

16. Фактор B.M. Стволовой резерв печени / В.М. Фактор, С.А. Радаева // Онтогенез. 1991. - Т. 22, № 2. - С. 181-9.

17. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток C-kit в регенерирующей печени после частичной гепатэктомии/ И.М. Газизов и др. // Морфологические ведомости. -2008. №1-2, - С.23-27.

18. Activated hepatic stellate cells in liver cirrhosis. A morphologic and morphometrical study / G Carpino et al. // Ital J Anat Embryol. 2004. - V. 109(4).-P. 225-38.

19. A human umbilical cord stem cell rescue therapy in a murine model of toxic liver injury / Di Campli C. et al. // Digest Liver Dis. -2004. V. 36. - P. 603613.

20. Albumin-expressing hepatocyte-like cells develop in the livers of immune-deficient mice that received transplants of highly purified human hematopoietic stem cells / Wang Xiuili et al. // Blood. 2003. -V. 101. - P. 42014208.

21. A mechanism of cell survival: Sequestration of Fas by the HGF receptor Met / Wang X. et al. // Mol Cell. 2002. - V. 9. - P. 411-421.

22. A precursor relationship exists between oval cells and hepatocytes in rat liver / R.P. Evarts et al. // Carcinogenesis.- 1987.-V. 8. P. 1737-40.

23. A significant proportion of myofibroblasts are of the bone marrow origin in human liver fibrosis / Forbes S.J. et al. // Gastroenterology. 2004. - V. 126. - P. 955-63.

24. A structural analysis of gap and tight junctions in the rat liver during a dietary treatment that induces oval cell proliferation / LH. Spelman et al. // Am J Pathol. 1986. - V. 125. - P. 379-392.

25. Activation, isolation, identification and in vitro proliferation of oval cells from adult rat liver / He Z.P. et al. // Cell Prolif. 2004.-V. 37(2). - P. 177187.

26. Adult liver stem cells / Grompe M., Edz Lanza R., Gearhart G., Hogan В et al. // Handbook of Stem Cells. Vol. 2: Adult and fetal stem cells /-Burlington:Elsever Academic Press., 2004. - P. 483-495.

27. Albumin-expressing hepatocyte-like cells develop in the livers of immune-deficient mice that received transplant s of highly purified human hematopoietic stem cells / Wang Xiuili et al. //Blood. -2003. V. 101.-P. 4201-4208.

28. Alison M. Wound healing in the liver with particular reference to stem cells / M. Alison, M. Golding, N. El-Lalani // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. -1998. -V 353.-P. 877-894.

29. Alison MR Update on hepatic stem cells / MR Alison, R Poulsom, SJ Forbes // Liver. 2001. - V. 21. - P. 3 67-373.

30. Alpini G. Bile secretory function of intrahepatic biliary epithelium in the rat/Alpini G. // Am. J. Physiol. 1989. - V. 257-P. 124-33.

31. Amos DB. HLA-A central immunological agency in man/ Amos DB, Kostyu DD. // Adv Hum Genetic. 1980. - V. 10. - P. 137-208.

32. An in vivo model for monitoring trans-differentiation of bone marrow cells into functional hepatocytes / Terai S. et al. // J. Biochem. 2003. - Vol. 134. - P. 551558.

33. Arthur MJ Secretion of 72 kDa type IV collagenase/gelatinase by cultured human lipocytes. Analysis of gene expression, protein synthesis and proteinase activity / Arthur MJ // Biochem J. 1992. - V. 287 (Pt 3). - P. 701-7.

34. Asahina K. Pleiotrophin/heparin-binding growth-associated molecule as a mitogen of rat hepatocytes and its role in regeneration and development of liver / Asahina K. // Am J Pathol. 2002. - V. 160. - P. 2191-205.

35. Bing-Yuan Chen. PCR cloning protocols: second edition / Bing-Yuan Chen, Harry W. Janes Methods in molecular biology. 2002; 192.

36. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells / Petersen B.E. et al. // Science. 1999. - Vol.284. - P.l 168-1170.

37. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cells fusion / Terada N. et al. // Nature. 2002. - Vol.416. P. 542-545.

38. Bone marrow transplantation in mice leads to a minor population of hepatocytes that can be selectively amplified in vivo / Mallet V.O. et al. // Hepatology. 2002. - V. 35. - P. 799-804.

39. Bone marrow-derived fibrocytes participate in pathogenesis of liver fibrosis / Kisseleva T. et al. // J Hepatol. -2006. V. 45(3). - P. 429-38.

40. Braun K.M. Cellular Origin of Regenerating Parenchyma in a Mouse Model of Severe Hepatic Injury / Braun K.M., Sandgren E.P. // American Journal of Pathology. 2000. - V. 157. - P. 561-569.

41. Brenner M.K. Emerging application of gene transfer in the hematopoietic cancers / Brenner M.K. // J. Pediatr. Hematol. Oncol. 1997. - V. 19. - P. 1- 6.

42. Britt D.E. Cloning of the rat oval cell/bile duct antigen OC.2 / Britt D.E. et al. // FASEB J 2003. - V. 17. - P. 665- 667.

43. Bucher NLR. Regeneration of the Liver and Kidney / NLR Bucher, RA Malt // Boston: Little, Brown and Co., 1971.

44. Burt A.D. Expression of transforming growth factor alpha in human hepatocellular carcinoma / Burt A.D. // Liver. 1993. - V. 13(3). - P. 151-5.

45. Burt A.D. Morphologic investigation of sinusoidal cells / Burt A.D. // Semin. liver dis. 1993. - V. 13. - P. 21-38.

46. Camargo F.D. Hematopoietic myelomonocytic cells are the major source of hepatocyte fusion partners / Camargo F.D., Finegold M., Goodel M.A. // J. Clin. Invest. 2004. - Vol. 113. - P. 1266 - 1270.

47. Carlson B.M. Principals of regenerative biology / Carlson B.M. Burlington: Elsevier Academic Press, 2007 - 379 p.

48. Carow C.E. Human multipotential progenitor cells (CFU-GEMM) have extensive replating capacity for secondary CFU-GEMM: An effect enhanced by cord blood plasma / Carow C.E., Hangoc G., Broxmeyer H.E. // Blood. 1993. -V. 81.-P. 942-9.

49. Cell behavior in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver / Sarraf C. et al. // Am. J. Pathol. 1994. - V. 145. - P. 1114-1126.

50. Cell fusion is the principal source of bone- marrow-derived hepatocytes / Wang X. etal.//Nature.-2003.-Vol. 422.-P. 897-901.

51. Cellular and molecular changes in the early stages of chemical hepatocarcinogenesis in the rat / Evarts R.P. et al. // Cancer Res. 1990. V. 50. -P. 3439-3444.

52. Changing potency by spontaneous fusion / Ying Q.-L. et al. // Nature. 2002. -Vol.416. P.545-548.

53. Characterizations of and interactions between bile ductule cells and hepatocytes in early stages of rat hepatocarcinogenesis induced by ethionine / NovikoffPM. et al.//Am J Pathol. 1991.-V. 139.-P. 1351-1368.

54. Clement B. Cell types involved in collagen and fibronectin production in normal and fibrotic human liver / Clement B. // Hepatology. 1986. - V. 6. - P. 225-34.

55. Clinical and experimental study on therapeutic effect of umbilical cord blood transplantation on severe viral hepatitis / Tang X.P. et al. // World J Gastroenterol. 2003. - V. 9(9). - P. 1999-2003.

56. Cloning of the rat oval cell/bile duct antigen OC.2 / DE Britt et al. // FASEB J -2003.-V. 17.-P. 665-667.

57. Common antigens of mouse oval and biliary epithelial cells. Expression on newly formed hepatocytes / NV Engelhardt et al. // Differentiation. 1990. - V. 45.-P. 29-37.

58. Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood in children with acute leukemia / Rocha V. et al. // Blood. -2001. V. 97. - P. 2962-71.

59. Contribution of bone marrow cells to liver regeneration after partial hepatectomy in mice / Fujii H et al. // J Hepatol. 2002. - V. 36. - P. 653- 659.

60. Cord blood progenitor cells have greater transendothelial migratory activity and increased responses to SDF-1 and MIP-3P compared with mobilized adult progenitor cells / Yong K. et al. // Br J Haematol. 1999. - V. 107. - P. 441-9.

61. Crosby H.A. Human hepatic stem-like cells isolated using c-kit or CD34 can differentiate into biliary epithelium / Crosby H.A., Kelly D.A., Strain A.J.// Gastroenterology. 2001. - V. 120(2). - P. 534-44.

62. Current status of cord blood banking and transplantation in the United States and Europe / Ballen K. et al. // Biol Bone Marrow Transplant. 2001. - V. 7. - P. 635-45.

63. Dabeva M.D. Activation, proliferation, and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liver regeneration / M.D. Dabeva, D.A. Shafritz // Am. J. Pathol.-1993.-V. 143, № 6.-P. 1606-1620.

64. Dabeva M.D. Hepatic stem cells and liver repopulation / Dabeva M.D., Shafritz D.A. // Semin. Liver Dis. 2003 - Vol. 23. - P. 349-361.

65. David T. The stem-cell niche as an entity of action / David Т., Scadden. // Nature. 2006. - V. 441 (7097). - P. 1075-79.

66. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation / Theise N.D. et al. // Hepatology. 2000. - Vol. 31. - P. 235-240.

67. Desmet V.J. Intrahepatic bile ducts under the lens / Desmet V.J. // J. Hepatol. -1985.-V. l.-P. 545-559.

68. Diehl A.M. Regulation of signal transduction during liver regeneration / Diehl A.M., Rai R.M. //FASEB J. 1996. - V. 10. - P. 215-27.

69. Diel A.M. Recent events in alcoholic liver disease. Vol. Effects of ethanol on liver regeneration // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2005. - Vol. 288. - P. G1-G6.

70. Different lineages of chemically induced hepatocellular carcinoma in rats defined by monoclonal antibodies / Dunsford HA. et al. // Cancer Res. 1989. - V. 49. - P. 4894-4900.

71. Differentiation of human bone marrow-derived cells into buccal epithelial cells in vivo: a molecular analytical study / Tran SD. et al. // Lancet.- 2003. V. 361(9363).-P. 1084-8.

72. Differentiation of human umbilical cord blood stem cells into hepatocytes in vivo and in vitro / Tang XP. et al. // World J Gastroenterol. 2006. - V. 12(25). -P. 4014-9.

73. Differentiation status of rat ductal cells and ethionine-induced hepatic carcinomas defined with surface-reactive monoclonal antibodies / Hixson DC. et al.// Exp Mol Pathol. 2000. - V. 68. - P. 152-169.

74. Distribution of albumin and alpha-fetoprotein mRNAs in normal, hyperplastic, and preneoplastic rat liver / G Alpini et al.. // Am J Pathol. 1992. - V. 141. - P. 623-32

75. DuBois A.M. The embryonic liver / DuBois A.M., Rouiller C.H. Academic Press, New York, 1963.

76. Dunsford H.A. Production of monoclonal antibodies to preneoplastic liver cell populations induced by chemical carcinogens in rats and to transplantable Morris Hepatomas / H.A. Dunsford, S. Sell // Cancer Res. 1989. - V. 49. - P. 4887-93.

77. Effects of a choline-devoid diet on the emergence of gamma-glutamyltranspeptidasepositive foci in the liver of carcinogen-treated rats / Shinozuka H. et al. // Cancer Res. 1979. - V. 39. - P. 2515-2521.

78. Effects of antigen retrieval by microwave heating in formalin-fixed tissue sections on a broad panel of antibodies / Von Wasielewski R. et al. // Histochem. -1994.-V. 102.-P. 165-172.

79. Elmore L.W. Intestinal-type of adenocarcinoma preferentially induced in right/caudate liver lobes of rats treated with fiiran / Elmore L.W., Sirica A.E. // Cancer Res. 1993. - V. 53. - P. 254-9.

80. Enrichment, characterization and respectivness of single primitiv CD 34+ human umbilical cord blood hematopoietic progenitors with high prolifereative and replating potential / Lu L. et al. // Blood. 1993. - V. 81. - P. 41-48.

81. Evarts R.P. In vivo differentiation of rat liver oval cells into hepatocytes / Evarts R.P. // Cancer Res. 1989. - V. 49. - P. 1541-1547.

82. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: Loss of telomere DNA with age / Vaziri H. et al. // Proc Natl Acad Sci, USA. 1994. - V. 91.-P. 9857-60.

83. Expression of a homologously recombined erythopoietin-SV40 T antigen fusion gene in mouse liver: evidence for erythropoietin production by Ito cells / PH. Maxwell // Blood. 1994. - V. 84(6). - P. 1823-30.

84. Expression of CD44 in rat hepatic progenitor cells / J Kon et al. // J Hepatol. -2006. V. 45(1).-P. 1-4.

85. Factor V.M. Origin and fate of oval cells in dipin-induced hepatocarcinogenesis in the mouse / Factor V.M., Radaeva S.A., Thorgeirsson S.S. //Am. J. Pathol 1994;145:409-422.

86. Factor VM. Oval cells-hepatocytes relationships in dipin-induced hepatocarcinogenesis in mice / VM Factor, SA Radaeva // Exp Toxicol Pathol. -1993.-V. 45.-P. 239-244.

87. Failure of bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo / Castro R. et al. // Science. 2002. - V. 297. - P. 1299.

88. Fausto N. Hepatocyte differentiation and liver progenitor cells / N. Fausto // Curr. Opin. Cell Biol. 1990. - V. 2. - P. 1036-1042.

89. Fausto N. Liver Regeneration and Repair: Hepatocytes, Progenitor Cells, and Stem Cells // Hepatology. 2004. - V. 39. № 6.

90. Fausto N. Oval cells and liver carcinogenesis: an analysis of cell lineages in hepatic tumors using oncogene transfection techniques / Fausto N. // Prog. Clin. Biol. Res. 1990. - V. 331. - P. 325-334.

91. Feigner P.L. Cationic Liposome Mediated Transfection / Feigner P.L., Holm M., Chan H. // Proc. West. Pharmacol. Soc. 1989. - V. 32. - P. 115-121.

92. Feigner P.L. Cationic Liposome-Mediated Transfection / Feigner P.L., Ringold G.M. // Nature. 1989. - V. 337. - P. 387-388.

93. Fibroblast growth factor 2 facilitates the differentiation of transplanted bone marrow cells into hepatocytes / Ishikawa T. et al. // Cell Tissue Res. 2006. - Vol. 323.-P. 221-231.

94. Friedman S.L. Cellular sources of collagen and regulation of collagen production in liver / Friedman S.L. // Semin. Liver Dis. 1990. - V. 10. - P. 2029.

95. Friedman S.L. Hepatic fibrosis-Overview / Friedman S.L. // Toxicology. -2008.-V. 254(3).-P. 120-9.

96. Friedman S.L. Mechanisms of hepatic fibrogenesis // Liver Cirrhosis and its Development:- Dordrecht -Boston London: Kluwer Academic Publishers, 2001. - P. 30-39.

97. Fujio K. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, during liver regeneration from putative stem cells in adult rat / Fujio K. // Lab Invest. 1994. -V. 70.-P. 511-6.

98. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes / Alvarez-Dolado M. et al. // Nature. 2003. - Vol. 429. - P. 968973.

99. Geerts A. In vitro differentiation of fat-storing cells parallelsmarked increaseof collagen increase and secretion / Geerts A. // J. Hepatol. 1989. - V. 9. -P. 59-68.

100. Gentry T. Retroviral vector-mediated gene transfer into umbilical cord blood CD34brCD38-CD33- cells / Gentry Т., Smith C. //Exp Hematol. 1999; 27: 124454.

101. Germain L. Differential cytokeratin and cc-fetoprotein expression in morphologycally distinct epithelial cells emerging at the early stages of rat hepatocarcinogenesis / L. Germain, R. Goyette, N. Marceau // Cancer Res. 1985. - V. 45.-P. 673-681.

102. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation / Gluckman E. // Exp Hematol. 2000. - V. 28. - P. 1197-205.

103. Gluckman E. Hematopoietic stem cell transplants using umbilical cord blood / Gluckman E. // N Engl J Med. 2001; 344: 1860-1.

104. Gluckman E. Umbilical cord blood transplants / Gluckman E, Locatelli F. // Curr Opin Hematol. 2000. - V. 7. - P. 353-7.

105. Godbey W.T. Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery / Godbey W.T, Wu K.K., Mikos A.G. // J Control Release. 1999. - V. 60(2-3). - P. 149-60.

106. Grisham J.W. A mophologic study of deoxyribonucleic acid synthesis and cell proliferation in regenerating liver; autoradiography with thymidine-H3 / J.W. Grisham // Cancer Res. 1962. - V. 22. - P. 842-849.

107. Grompe M. Adult liver stem cells// Handbook of Stem Cells. Vol. 2: Adult and fetal stem cells / Edz Lanza R. et al. - Burlington:Elsever Academic Press., 2004.-P. 483-495.

108. Growth characteristics and expansion of human umbilical cord blood and estimation of its potential for transplantation of adults / Broxmeyer H.E. et al. // Proc Natl Acad Sci, USA. 1992. - V. 89. - P. 4109-13.

109. Growth factors increase retroviral transduction but decrease clonogenic potential of umbilical cord blood CD34+ cells / Corrias M.V. et al. // Haematologica. 1998. - V. 83. - P. 580-6.

110. Growth of human umbilical cord blood in long term haematopoietic cultures / Hows J.M. et al. // Lancet. 1992; 340: 73-6.

111. Han YP. A matrix metalloproteinase-9 activation cascade by hepatic stellate cells in trans-differentiation in the three-dimensional extracellular matrix / Han YP. // J Biol Chem. 2007. - V. 282(17). - P. 12928-39.

112. Hawley T.S. Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed. / Hawley T.S., Hawley R.G., Totowa, N.J. Humana Press Inc., 2004. - P. 434.

113. Hepatic stem cells: inside and outside the liver?/ Alison M.R. et al. // Cell Prolif. 2004 - Vol.37. - P. 1-21.

114. Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro / Oh SH. et al. // Biochem Biophys Res Commun. 2000. - V. 27. - P. 500-4.

115. Hepatocyte telomere shortening and senescence are general markers of human liver cirrhosis / Wiemann S.U. et al. // FASEB J. 2002. - Vol.l6 - P.935-942

116. Hepatocytes derived from bone marrow stem cells demonstrated polyploidization / Forbes S.J. et al. // J.Hepatology. 2001. - Vol. 34.(Suppl. 1). -P.20-21.

117. Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells / Vogel W. et al. // Haematologica. 2003.- V. 88. - P. 121.

118. Higgins GM. Experimental pathology of the liver: I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal / GM Higgins, RM Anderson // Arch Pathol.-1931.-V. 12. P. 186-202.

119. High-efficiency gene transfer into ex vivo expanded human hematopoietic progenitor and precursor cells by adenovirus vectors / Frey B.M. et al. // Blood. -1998.-V. 91.-P. 2781-92.

120. Hixson D.C. An antigenic portrrait of the liver during carcinogenesis / D.C. Hixson, R.A. Faris, N.L. Thompson // Pathobiology. 1990. - V. 58. - P. 65-77.

121. Houck К.A. Altered responses of regenerating hepatocytes to norepinephrine and transforming growth factor type beta / Houck K.A., Michalopoulos G.K. // J Cell Physiol. 1989. - V. 141. - P. 503-9.

122. Houssaint E. Differentiation of mouse hepatic primordium / E Houssaint // Cell Growth Differ. 1980. - V. 9. - P. 269-279.

123. Human cord blood CD34+CD38- cell transduction via lentivirus-based gene transfer vectors / Evans J.T. et al. // Hum Gene Ther. 1999 - V. 10. - P. 1479-89.

124. Human cord blood-derived cells can differentiate into hepatocytes in the mouse liver with no evidence of cellular fusion / Newsome P.N. et al. // Gastroenterology. 2003. - V. 124. - P. 1891-1900.

125. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hemotopoietic stem/progenitor cells / Broxmeyer H.E. et al. // Proc Natl Acad Sci, USA. 1989 - V. 86. - P. 3828-32.

126. Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells /Kakinuma S. et al. // Stem Cells. 2003. - V. 21(2). - P. 217-27.

127. Human umbilical cord blood: A clinical useful source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells / Broxmeyer H.E. et al.// Int J Cell Cloning. -1990. V. 8.-P. 76-91.

128. Hematopoietic stem cells convert into liver cells within days without fusion / Jang Y.Y. et al. // Nat Cell Biol. 2004. - V. 6. - P. 532-539.

129. Identification of adult hepatic progenitor cells capable of repopulating injured rat liver / Yovchev MI et al. // Hepatology. 2008. - V. 47(2). - P. 636-47.

130. Immature human cord blood progenitors engraft and proliferate to high levels in immune-deficient SCID mice / Vormoor J. et al. // Blood. -1994. V. 83. - P. 2489-97.

131. Immune responses against adenoviral vectors and their transgene products: a review of strategies for evasion / Schagen F.H. et al. // Crit Rev Oncol Hematol. -2004.-V. 50.-P. 51-70.

132. Immunohistochemical analysis of cytokeratin 7 expression in resting and proliferating biliary structures of rat liver / Paku S. et al.// Hepatology 2005;42(4):863-70

133. Immunohistochemical analysis of HLA (A,B,C) antigens in liver disease using a monoclonal antibody / Barbatis C. et al. // Gut. -1981. V. 22. - P. 985-91.

134. Improved retroviral vectors for hematopoietic stem cell protection and in vivo selection / Baum C. et al. // J.Hematother. 1996. - V. 5. - P. 323-9.

135. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector / Naldini L. et al. // Science. 1996. - V. 272. - P. 263-7.

136. Increased gene transfer into human hematopoietic progenitor cells by extended in vitro exposure to a pseudotyped retroviral vector / Von Kalle C. et al. // Blood. 1994. - V. 84. - P. 2890-7.

137. Increased migration of cord blood-derived CD34+ cells, as compared to bone marrow and mobilized peripheral blood CD 34+ cells across ancoated or fibronectin-coated filters / Voermans C. et al. // Exp Hematol. 1999. - V. 27. - P. 1806-14.

138. Intestinal metaplasia as a common option of oval cells in relation to cholangiofibrosis in the livers of rats exposed to 2-acetylaminofluorene / Tatematsu M. et al. // Lab. Invest. 1985. - V. 52. - P. 354-62.

139. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats / Chen J. et al. // Stroke. 2001. - V. 32. - P. 2682-8.

140. Isolation, characterisation, and transplantation of bone marrow-derived hepatocytes stem cells / Avital I. et al. // Biochem Biophys Res Commun 2001;288:156-64.

141. Kakar S. Immunoreactivity of Hep Par 1 in hepatic and extrahepatic tumors and its correlation with albumin in situ hybridization in hepatocellular carcinoma / Kakar S, Muir T, Murphy LM. // Am J Clin Pathol. 2003. - V. 119(3). - P. 3616.

142. Kashofer К. In vivo formation of unstable heterokaryons after liver damage and hematopoietic stem cell/progenitor transplantation /Kashofer K., Siapati E.K., Bonnet D. // Stem Cells. 2006. - Vol. 24. - P. 1104 - 1112.

143. Kinetics and functional assay of liver repopulation after human cord blood transplantation / Shyu M.K. et al. // Dig Liver Dis. 2007. -V. 39(5). - P. 455-65.

144. Kinetics of liver repopulation after bone marrow transplantation / Wang X., Montini E., Al-Dhalimy M. et al. // Am. J. Pathology. 2002. - Vol.161. - P.565-574.

145. Kiss A. Immunohistochemical analysis of atypical ductular reaction in the human liver, with special emphasis on the presence of growth factors and their receptors / Kiss A., Shnur J., Szabo Z., Nagy P. // Liver. 2001. - Vol. 21. -P.237-246.

146. Kon J. et al. Expression of CD44 in rat hepatic progenitor cells / Kon J. et al. // J Hepatol. 2006. - V. 45(1). - P. 1-4.

147. Kubota H. Variant forms of alpha-fetoprotein transcripts expressed in human hematopoietic progenitors. Implications for their development potential towards endoderm / Kubota H, Storms RW, Reid LM. // J Biol Chem 2002;277:27629-35.

148. Lack of a fusion requirement for development of bone marrow-derived epithelia / Harris R.G. et al. // Science. 2004. - Vol. 305. - P. 90-93.

149. Lansdorp P. Ontogeny-related changes in proliferative potential of human hematopoietic cells / Lansdorp P., Dragowska W., Mayani H. // J Exp Med. — 1993.-V. 178.-P. 787-91.

150. Latchman D.S. Herpes simplex virus-based vectors for the treatment of cancer and neurodegenerative disease / Latchman D.S. // Curr Opin Mol Ther. 2005. -V. 7.-P. 415-8.

151. Laughlin M.J. Umbilical cord blood for allogeneic transplantation in children and adults / Laughlin M.J. // Bone Marrow Transplant. 2001. - V. 27. - P. 1 -6.

152. Le Douarin NM. An experimental analysis of liver development / NM Le Douarin // Med Biol. 1975. - V. 53. - P 427-55.

153. Lee S.H. Mechanism of elongation of primed DNA by DNA polimerase delta, proliferating cell nuclear antigen, and activator 1 / S.H. Lee, J. Hurwitz // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 672-676.

154. Lemire J.M. Multiple alpha-fetoprotein RNAs in adult rat liver cell type-specific expression and differential regulation / J.M. Lemire, N. Fausto // Cancer Ret. 1991. - V. 51. - P. 4656-64.

155. Lenzi R. Histogenesis of bile duct-like cells proliferating during ethionine hepatocarcinogenesis. Evidence for a biliary epithelial nature of oval cells / Lenzi R. // Lab. Invest. 1992. - V. 66. - P. 390-402.

156. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells / Wagers AJ. et al. // Science. 2002. - V. 297. - P. 2256 -2259.

157. Little evidence of bone marrow-derived hepatocytes in the replacement of injured liver / Y Kanazawa, Verma IM. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. - V. 100.-P. 11850-53.

158. Liver expression of epidermal growth factor RNA. Rapid increases in immediate-early phase of liver regeneration / Mullhaupt B. // J Biol Chem. 1994. -V. 269(31).-P. 19667-70.

159. Liver from bone marrow in humans / Theise N.D. et al. // Hepatology. 2000. -Vol. 32.-P. 11-16.

160. Liver regeneration in a retrorsine CC14-induced acute liver failure model: do bone marrow-derived cells contribute? / Dahlke MH et al. // J Hepatol. 2003. -V. 39.-P. 365-73.

161. Liver repopulation by Bcl-x(L) transgenic hepatocytes / Mitchell C. et al. // Am J Pathol. 2002. - V. 160. - P. 31-35.

162. Liver repopulation with bone marrow cells iimprove the metabolic disorder in the Gunn rat / Muraka M. et al. // Gut. 2007. - Vol. 56. - P. 1725 - 1735.

163. Liver-specific gene expression in cultured human hematopoietic stem cells / Fiegel HC. et al. // Stem Cells. 2003. - V. 21. - P. 98-104.

164. Low molecular weight polyethylenimine for efficient transfection of human hematopoietic and umbilical cord blood-derived CD34+ cells / Shin J.Y. et al. // Biochim Biophys Acta. 2005. - V. 1725. - P. 377-84.

165. Lukita-Atmadja W. The stellate cells phenotypic transformation in the CC14-injured liver fibrosis of ICR mice: their desmin immunoreactivity and vitamin A storage / W Lukita-Atmadja, Subowo // Kobe J Med Sci. 1993. - V. 39. - P. 1533.

166. Masson S. Potential of hematopoietic stem cells therapy in hepatology: a critical review / Masson S., Harisson D.J., Plevris J.M. // Stem Cells. 2004. -Vol.22. - P.897-907.

167. Michalopoulos G.K. Liver Regeneration / Michalopoulos G.K. // J. Cell. Physiol. -2007. -V. 213. P. 286-300.

168. Michalopoulos G.K. Liver regeneration / Michalopoulos G.K., DeFrances M.C. // Science. 1997. - Vol. 276. - P.60-66.

169. Michalopoulos G.K. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury / Michalopoulos G.K., Barua I., Bowen W.C. // Hepatology. 2005. - Vol. 41. - P.535-544.

170. Milani S. Differential expression of matrix-metalloproteinase-1 and -2 genes in normal and fibrotic human liver / Milani S. // Am J.Pathol. 1994. - V. 144. -P.528-37.

171. Milani S. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis / Milani S. // Gastroenterology. 1990. - V. 98. - P. 175-84.

172. Multiorgan engraftment and differentiation of human cord blood CD34+ Lin-cells in goats assessed by gene expression profiling / Zeng F. et al. // Proc Natl Acad Sci, USA.- 2006. Vol. 103(20). - P. 7801-7806.

173. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrowderived stem cell/ Krause DS. et al.// Cell.-2001.-V. 105. P. 369-77.

174. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells / Schartz RE. et al. // J Clin Invest. 2002. - V. 109.-P. 1291-302.

175. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow / L. Zeng et al. // Stem Cells. 2006. - V. 24(11). - P. 2355-66.

176. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain / Jiang Y. et al. // Exp Haemotol. 2002.-V. 30.-P. 896-904.

177. Murine gallbladder epithelial cells can differentiate into hepatocyte like cells in vitro / Kuver R. et al. // Am. J. Physiol. Gastointest. Liver Physiol. 2007. -Vol.293. - P. G944 - G955.

178. Myelomonocytic are sufficient for therapeutic cell fusion in liver / Willebring H. et al. // Nat. Med. 2004. - Vol. 10. - P. 744-748.

179. Nakahata T. Hemopoietic colony-forming cells in umbilical cord blood with extensive capability to generate mono-and multipotential hemopoietic progenitors / Nakahata Т., Ogawa M. // J Clin Invest. 1982. - V. 70. - P. 1324-8.

180. Nucleofection, an efficient nonviral method to transfer genes into human hematopoietic stem and progenitor cells / Von Levetzow G. et al. // Stem Cells Dev. 2006. - V. 15. - P. 278-85.

181. Okumoto K. Serum levels of stem cell factor and thrombopoietin are markedly decreased in fulminant hepatic failure patients with a poor prognosis / Okumoto K. // J Gastroenterol Hepatol. 2007. - 22(8). - P. 1265-70.

182. Optimisation of transfection of CD34+ hematopoietic cells derived from human umbilical cord blood / Tomasz O. et al. // Acta Biochimica Polonica. -2002. V. 49(3). - P. 625-632.

183. Optimization of a retroviral vector for transduction of human CD34 positive cells / Szyda A. et al. // Acta Biochim Pol. 2006. - V. 53. - P. 815-23.

184. Orazi A. Immunohistochemistry represents a useful tool to study human cell engraftment in SCID mice transplantation models / Orazi A., Braun S., Broxmeyer H.E. //Blood Cells. 1994; 20: 323-30.

185. Oval cell differentiation into hepatocytes in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver / Golding M. et al. // Hepatology. 1995. - V.22. -P. 1243-53.

186. Oval cell-mediated liver regeneration: Role of cytokines and growth factors / Lowes KN. et al. // J Gastroenterol Hepatol. 2003. - V. 18. - P. 4-12.

187. Palmes D. Animal models of liver regeneration / D. Palmes, H.-U. Spiegel // Biomaterials. 2004. - V. 25. - P. 1601-1611.

188. Participation of bone marrow cells in biliary fibrosis afte bile duct ligation / AsawaS. et al. // J Gastroenterol Hepatol. 2007. - V. 22(11). - P. 2001-8.

189. Participation of small intraportal stem cells in the restitutive response of the liver to portal necrosis induced by allyl alcohol / Yavorkovsky L. et al.// Hepatology. 1995.-V. 21.-P. 1702-1712.

190. Passino M.A. Regulation of hepatic stellate cell differentiation by the neurotrophin receptor p75NTR / Passino M.A. // Science. 2007. - 315. - P. 1853-1856.

191. Perreau M. The conundrum between immunological memory to adenovirus and their use as vectors in clinical gene therapy / Perreau M., Kremer E.J. // Mol Biotechnol. 2006. - V. 34. - P. 247-56.

192. Placental blood collection: Effects on Newborns / Bertolini F. et al. // Blood. 1995.-V. 85.-P. 3361-2.

193. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult bone marrow / Jiang Y. et al. // Nature. 2002. - V. 418. - P.41-49.

194. Popper H. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury / Popper H. Kent G., Stein R. //J. Mt. Sinai Hosp. 1957. -V. 24. - P. 551-556.

195. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver deseases / Nussler A. et al. // J.Hepatology. 2006. - Vol. 45. - P. 144-159.

196. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein / Prasher D.C. et al. // Gene. 1992. - V. 111(2). - P. 229-33.

197. Promotion of growth and differentiation of rat ductular oval cells in primary culture / Germai L. et al. // Cancer Res. 1988. - V. 48. - P. 368378.

198. Purification of adult hepatic progenitor cells using green fluorescent protein (GFP) transgenic mice and fluorescence-activated cell sorting / Fujikawa T. et al. // J Hepatol. - 2003. - V. 39. - P. 162-170.

199. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo / Lagasse E. et al. // Nat. Med. 2000. - Vol. 6. - P. 1229-1234.

200. Release from quiescence of CD 34+38- human umbilical cord blood cells reveals their potentiality to engraft adults / Crdoso A.A. et al. // Proc Natl Acad Sci, USA. 1993. - V. 90. - P. 8707-11.

201. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation / JA Rhim et al. // Science. 1994. - V. 263. - P. 1149 -52.

202. Roscams T.A. Different types of liver progenitor cells and their niches / Roscams T.A. // J. Hepatology. 2006. - Vol. 45. - P. 1-4.

203. SCF modulates organ distribution and hematopoietic engraftment of CB-derived pluripotent HPC transplanted in NOD/SCID mice / Drewel D. et al. // Cytotherapy. 2006. - V. 8(1). - P. 70-8.

204. Schaefer B. Reciprocal modulation of matrix metalloproteinase-13 and type I collagen genes in hepatic stellate cells / Schaefer B. // AmJPathol.-2003.-V.162.-P.1771-80.

205. Schirmacher P. Hepatocyte growth factor/hepatopoietin A is expressed in fat-storing cells from rat liver but not myofibroblast-like cells deriveds>.from fat-storing cells / Schirmacher P. // Hepatology. 1992.-V. 15(1).-P. 5-11.

206. Sell S. Autoradiography of "oval cells" appearing rapidly in the livers of rats fed N-2-fluorenylacetamide in a choline devoid diet / S Sell, К Osborn, H Leffert // Carcinogenesis. 1981. - V. 2. - P. 7-14.

207. Sell S. Electron microscopic identification of putative liver stem cells and intermediate hepatocytes following periportal necrosis induced in rats by allyl alcohol / S Sell // Stem Cells. 1997. - V. 15. - P. 378-385.

208. Sell S. Is there a liver stem cell? / Sell S. // Cancer Res. 1990. - V. 50. - P. 3811-5.

209. Sell S. The role of progenitor cells in repair of liver injury and in liver transplantation / Sell S. // Wound Rep. Reg. 2001. - Vol. 9. - P. 467-482.

210. Serial transplantation reveals the stem-cell-like regenerative potential of adult mouse hepatocytes / Overturf K. et al. // Am J Pathol. 1997. -V. 151. - P. 127380.

211. Shigekawa K. Electroporation of Eukaryotes and Prokaryotes: A General Approach to the Introduction of Macromolecules into Cells / Shigekawa K., Dower W.J.// BioTechniques. 1988. - V. 6. - P. 742-751.

212. Shimomura O. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea /Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. // J Cell Comp Physiol. 1962. - V. 59. - P. 223-39. 211.4

213. Sigal S.H. The liver as a stem cell and lineage system / Sigal S.H. // Am. J. Physiol. 1992. - V. 263. - P. 139-148.

214. Slott P.A. Origin, pattern and mechanism of bile duct proliferation following biliary obstruction in the rat / Slott P.A., Liu M.H., Tavoloni N. // Gastroenterology. 1990. - V. 99. - P. 466-477.

215. St George J.A. Gene therapy progress and prospects: adenoviral vectors / St George J.A. // Gene Ther. 2003. - V. 10. - P. 1135-41.

216. Survival after transplantation of unrelated donor umbilical cord blood is comparable to that of human leukocyte antigen-matched unrelated donor bone marrow: Results of a matched-pair analysis / Barker J.N. et al. // Blood. 2001. — V. 97.-P. 2957-61.

217. Taub R. Liver regeneration: From myth to mechanism / R. Taub // Nat Rev Mol Cell Biol. 2004. - V. 5. - P. 836- 847.

218. The bone marrow functionally contributes to the liver fibrosis / Russo F.P. et al. // Gastroenterology. 2006. - V. 130. - P. 1807-21.

219. The detailed distribution of HLA-A, В, С antigens in normal human organs / Daar A.S. et al. // Transplantation. 1984. - V. 38. - P. 28792.

220. The expression of mesenchymal, neural andhematopoietic stem cell markers in adult hepatocytes proliferating in vitro / Koenig S. et al. // J. Hepatology. -2006. Vol. 44. - P. 1115-1124.

221. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells / Wang X. et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. - 100(Suppl 1). - P. 1188111888.

222. Thorgeirsson S.S. Early activation and expansion of hepatic stem cells / Thorgeirsson S.S., Faktor V.M., Grisham J.W. // Handbook of Stem Cells. Vol. 2: Adult and fetal stem cells // Burlington:Elsever Academic Press., 2004. - P. 497-512.

223. Thorgeirsson S.S. Hematopoietic stem cells: A critical review of the evidence / Thorgeirsson S.S., Grisham J.W. // Hepatology. 2006. - Vol. 43. -P. 2-8.

224. Thorgeirsson S.S. Hepatic stem cells in liver regeneration / Thorgeirsson S.S. // FASEB J. 1996. - Vol.10. - P.1249-1256.

225. Transplantation of human CD34+ stem cells from umbilical cord blood to rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis / Saez-Lara M.J. et.al. // Xenotransplantation. 2006. - Vol. 13(6). P. 529-535.

226. Transplanted human cord blood cells give rise to hepatocytes in engrafted mice / Ishikawa F. et al. // Ann NY Sci. 2003. - V. 996. - P. 174-185

227. Tsien R.Y. The green fluorescent protein / Tsien R.Y. // Annu Rev Biochem.- 1998. V. 67.-P. 509-44.

228. Ultrastructural localization of a-fetoprotein (AFP) in regenerating mouse liver poisoned with CC14: reexpression of AFP in differentiated hepatocytes / Engelhardt NV et al. // Histochemistry. 1984. - V. 80. - P. 401-407.

229. Umbilical cord blood hematopoietic stem and repopulating cells in human clinical transplantation / Broxmeyer H.E. et al.// Blood calls. 1991. - V. 17. - P. 313-29.

230. Van Eyken P. Cytokeratins and the liver / Van Eyken P., Desmet V. // Liver.- 1993.-V. 13.-P. 113-122.

231. Vassilopoulos G. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion / Vassilopoulos G., Wang P.R., Russel D.W. // Nature. 2003. - Vol. 422. - P. 901904.

232. Vignery A. Macrophage fusion: are somatic and cancer cells possible partners? / Vignery A. // Trends in Cell Biology. 2005. - Vol. 15. - P. 188-193.

233. Vyas SK. Rat hepatic lipocytes synthesize and secrete transin (stromelysin) in early primary culture / Vyas S.K. // Gastroenterology. 1995. - V. 109. - P. 88998.

234. Wagers A.J. Plasticity of adult stem cells / Wagers A J., Weissman 1.1. //Cell. 2004. - Vol. 116. - P. 639-648.

235. Wilson JW. Histogenesis of the liver / JW Wilson, CS Groat, EH Leduc // Ann NY Acad Sci. 1963.- V. 111.-P. 8-22.

236. Yoshino R. Epimorphin expression and stellate cell status in mouse liver injury / Yoshino R. // Hepatol Res. 2006. - 34(4). - 238-49.

Информация о работе

Андреева, Дина Ивановна
кандидата медицинских наук
Казань, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Пути дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы