Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протекторная и нейротоксическая роль оксида азота в моделях зрительных патологий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Протекторная и нейротоксическая роль оксида азота в моделях зрительных патологий"

На правах рукописи

КОНСТАНТИНОВА Татьяна Сергеевна

ПРОТЕКТОРНАЯ И НЕЙРОТОКСИЧЕСКАЯ РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В МОДЕЛЯХ ЗРИТЕЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЙ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 К ЮН ЮиЭ

Москва - 2009

003472796

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Каламкаров Григорий Рафаэлевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, рофессор Петренко Юрий Михайлович

доктор биологических наук Дудник Людмила Борисовна

Ведущая организация:

ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Защита состоится «01» июля 2009г. в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.039.01 в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 117977, Москва, ул. Косыгина, 4

С диссертацией мола го ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. H.H. Семенова РАН

Автореферат разослан <¿¿0» илЛЛ^ 2009г. Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 002.039.01

кандидат химических наук М. А. Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Оксид азота играет ключевую роль в регуляции самых разных биологических функций. Известно также, что оксид азота играет важную роль в развитии патологий сетчатки и зрительного нерва. В сетчатке глаза относительно высокая концентрация оксида азота обнаруживается в двух слоях - во внутренних сегментах фоторецепторного слоя и слое ганглиозных клеток. Оксид азота является регулятором синаптической передачи, одним из медиаторов которой является глутамат.

Сетчатка глаза находится в тесном контакте с ретинальными сосудами, которые проходят через все внутренние слои сетчатки и снабжают их кислородом и необходимыми метаболитами. Оксид азота, являясь сосудорасслабляющим фактором, регулирует состояние сосудов как в норме, так и при патологиях и, следовательно, оказывает значительное влияние на работу всех элементов сетчатки. Это особенно важно в условиях гипоксии, когда недостаток кислорода приводит к развитию ишемии сетчатки - причины многочисленных офтальмологических заболеваний.

С другой стороны, известно, что оксид азота может играть и нейротокси-ческую роль, приводя к апоптозу нервных клеток. Предполагаемой причиной такого действия является взаимодействие оксида азота с супероксид-анион радикалом с образованием пероксинитрита. Пероксинитрит может разлагаться с образованием гидроксильного радикала - сильного токсического агента, приводящего, среди прочего, к апоптотической гибели клеток.

В данной работе нами исследованы оба механизма действия оксида азота - как нейропротекторного фактора, защищающего сетчатку глаза от ишемии, так и нейротоксического фактора, вызывающего апоптотическую гибель клеток.

Для изучения защитных и нейротоксических свойств оксида азота нами была разработана модель ишемии сетчатки глаза на экспериментальных животных. Изучение ишемии сетчатки важно для понимания патогенеза таких связанных с сосудистой недостаточностью заболеваний, как окклюзия ретинальной артерии, глаукома, макулярная дегенерация и др. (Osborne N.N. et al., 2004). Мы создавали ишемию сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретиналь-ных сосудов. Такое воздействие, с одной стороны, позволяет резко снизить концентрацию кислорода непосредственно в сосудах и наблюдать за изменением их диаметра при действии нитритов в условиях недостатка кислорода in vivo, с другой стороны, как следствие, вызывать развитие ишемии сетчатки и по состоянию сетчатки оценить степень ее кровоснабжения. Кроме того, такая модель не затрагивает прямо нервные элементы сетчатки.

Оксид азота продуцируется в клетке ферментом NO-синтазой, основным субстратом которой является аргинин. До последнего времени аргинин считался, по существу, единственным источником оксида азота в организме. В последние

годы внимание многочисленных исследователей привлек процесс восстановления нитритов до оксида азота и таким образом нитриты также могли бы оказаться источником оксида азота. Предполагается, что нитриты могут восстанавливаться до оксида азота гемсодержащими белками. Особенно активно этот процесс будет происходить в условиях пониженной концентрации кислорода, когда образующийся оксид азота, во-первых, не окисляется до диоксида, а, во-вторых, может связываться с гемом белка, занимая сайт связывания кислорода.

В данной работе мы показали, что такой процесс может происходить в ре-тинальных сосудах in vivo, причем, за времена порядка минуты. Продемонстрировано, что восстановленный из нитрита оксид азота действует как фактор расслабления сосудов и защищает сетчатку глаза от ишемии.

Целью настоящей работы являлось установить роль и химические меха. низмы действия оксида азота как нейропротекторного и нейротоксического факторов при развитии патологий в сетчатке глаза.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создать адекватные модели зрительных патологий на экспериментальных животных (ретинальная ишемия и глутаматная интоксикация сетчатки глаза).

2. Выяснить, участвует ли оксид азота в развитии нейродегенерации при ишемии сетчатки глаза и является ли он проапоптотическим фактором.

3. Создать модель, позволяющую наблюдать изменения отдельного сосуда сетчатки при гипоксии на экспериментальных животных.

4. Выяснить возможность восстановления нитритов до оксида азота в рети-нальных сосудах при ишемии сетчатки.

5. Выяснить, может ли введение нитритов вызывать расширение сосудов и таким образом защищать сетчатку от ишемии в условиях гипоксии в разработанной нами модели ретинальной ишемии.

6. Исследовать нейротоксическое действие избытка оксида азота на клетки сетчатки глаза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции рети-нальных сосудов.

2. Введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотиче-ской гибели клеток.

3. Ингибирование NO-синтазы предотвращает развитие ano птоза при ишемии и глутаматной интоксикации сетчатки глаза.

Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планами научно-исследовательских работ Института в рамках программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Научно-практическая значимость. Результаты проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания роли оксида азота при развитии нейродегенеративного процесса, вызванного ишемией. Данные об участии оксида азота в развитии патологических заболеваний сетчатки глаза ставят вопрос о новых стратегиях лечения таких ишемических заболеваний сетчатки глаза, как глаукома, диабетическая ретинопатия и др. Нами разработана модель, позволяющая отличить патологическое действие гипоксии от патологического действия повышения внутриглазного давления, вызывающего дегенерацию нервных клеток. На этой модели показано, что оксид азота является необходимым элементом в развития апоптоза, вызванного исключительно ишемическим повреждением. Это принципиально важно для разработки лекарственных средств и понимания механизмов возникновения ряда зрительных патологий. Обнаруженный нами защитный эффект нитритов при развит™ ишемии вследствие гипоксии имеет важное значение для разработки антиишемических средств лечения глазных патологий.

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 8 печатных работах, из них 3 - статьи в отечественных журналах и 5 тезисов докладов. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: «Фундаментальные науки - медицине», Москва. Международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», Москва. «Актуальные вопросы нейроофтальмологии», Москва.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на^/^^стр., включая 21 рисунок, 1 таблицу и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, глав «Обзор литературы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов исследования», выводов, списка аббревиатур и библиографического указателя £&£?источника).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Объекты, материалы н методы исследования

Основным предметом исследования являлись NO-синтаза, оксид азота, сетчатка глаза, ишемия сетчатки глаз экспериментальных животных.

Биофизические и гистохимические методы.

Для гистологического исследования сетчатки крыс глаза фиксировали в 10% нейтральном формалине 12 часов и использовали для приготовления парафиновых срезов согласно стандартному протоколу (Sennlaub F. et al., 2002). Срезы толщиной 5 мкм приклеивали на стёкла с адгезивным покрытием (Silane-Prep Slides, Sigma) и после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином.

Для иммуногистохшшческого исследования депарафинированные срезы обрабатывали методом TUNEL (Terminal desoxynucleotidyl transferase - mediated desoxyuridine triphosphate (UTP) - nick end - labeling) для выявления апоптотиче-сих клеток (набор реактивов «Apoptag» («Chemicon», США)). Метод основан на выявлении свободных З'-ОН концевых групп ДНК путем их химического мече-ния модифицированными нуклеотидами, которые выявляются иммуноперокси-дазным методом. В качестве субстрата для пероксидазы использовали диамино-бензидин (DAB). После реакции для дополнительной прокраски ядер срезы обрабатывали 0,5% метиловым зеленым.

Электроретинограмму (ЭРГ) регистрировали с помощью установки EYE Handheld ERG Unit Mjolner (Ephios, Швеция). Выполняли регистрацию ганцфельд ЭРГ в ответ на одиночную стимуляцию и ритмическую (РЭРГ), стимуляцию с частотой 12 и 32 Гц стандартными вспышками.

Принцип метода заключается в регистрации потенциалов клеток сетчатки в ответ на освещение. Оценку электрической активности сетчатки проводили по амплитуде а- и Ь- волн ЭРГ. а-волна - негативная волна, отражающая функциональную активность фоторецепторов, b-волна - позитивная волна, отражающая электрическую активность биполяров и мюллеровских клеток с возможным вкладом горизонтальных и амакриновых клеток.

Работа с животными. В работе использовали кроликов породы Шиншилла и крыс линии Wistar, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище.

Крыс наркотизировали хлоралгидратом (250 мг/кг).

Ишемию создавали путём лазерной коагуляг/ии сосудов сетчатки глаз крыс, для этого использовали лазер Visuals Kombi II фотокоагуляционного типа (аргоновый лазер), позволяющий создавать обтурацию сосудов под офтальмоскопическим контролем. Параметры воздействия составляли: средняя мощность излучения 200-300 мВт, диаметр пятна 100-200 мкм, длительность

импульса 0,1 - 0,2 сек. Проводилась коагуляция сосудов I порядка на всем их протяжении в зоне диаметром 1/2 размера диска зрительного нерва.

Для создания ишемии сетчатки глаза кроликов проводилась лазерная коагуляция сосудов первого и второго порядка с окружающей сетчаткой. Энергия воздействия 0,4-1 Вт.

Нитрит натрия вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе (20 мг/кг массы) крысам и кроликам за 15 минут до лазерного воздействия на сосуды сетчатки или через 15 мин сразу после него.

L-NAME (N-cû-nitio-L-arginine methyl ester) вводили внутрибрюшинно в натрий-фосфатном буфере (20 мг/кг) за 15 минут до лазерной коагуляции сетчатки глаза крыс.

NMDA (N-methyl-D-aspartate) (200 нмоль/глаз) и L-NAME (0,1 мг/глаз) в натрий-фосфатном буфере вводили в стекловидное тело глаза крысы (интравит-реально) раздельно или в комбинации.

ДНК-Ж (динитрозильный комплекс железа) в натрий-фосфатном буфере вводили в стекловидное тело глаза крысы (10"7-10"4моль/глаз).

Контролем при интравитреальных инъекциях служили парные глаза, в которые вводили натрий-фосфатный буфер.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6.1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при Р<0,05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.

2. Исследование действия нитритов в сетчатке на модели ишемии сетчатки

глаза кроликов

Лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к ишемии сетчатки глаза (Zhang Y. et al., 2005).

При офтальмоскопическом исследовании глазного дна интактного кролика сосуды сетчатки в области диска зрительного нерва не извиты и соответствуют средней норме (рис. 1а).

Лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к значительным изменениям в кровенаполнении сосудов. При офтальмоскопическом исследовании того же глазного дна сразу после лазерного воздействия видно, что сосуды запустели и резко уменьшились в диаметре (рис. 16).

Для выяснения возможного действия нитритов на сетчатку глаза и рети-нальные сосуды нитрит натрия вводили животным как до, так и после проведения лазерной коагуляции.

В том случае, когда нитрит натрия вводили кролику в течение 15 минут после лазерной коагуляции в количестве 20 мг/кг массы, наблюдается восстановление кровенаполнения сосудов непосредственно за зоной лазерного воздействия (рис. 1в). В самих поврежденных сосудах начинается восстановление кровообращения. Таким образом, введение нитрита натрия на фоне гипоксии приводит к быстрому расслаблению сосудов, что свидетельствует о том, что в условиях ишемии нитрит быстро восстанавливается до оксида азота.

Рис. 1. Действие нитрита натрия на сосуды глазного дна после лазерной коагуляции.

а - фотография глазного дна кролика до лазерной коагуляции (стрелка указывает место последующего лазерного воздействия); б - то же сразу после лазерной коагуляции, в - то же, что «б» через 15 минут после введения нитрита натрия.

В контрольных экспериментах было показано, что введение нитрита животному без лазерного воздействия не приводит к значительному расширению сосудов, что свидетельствует о том, что восстановление нитрита до оксида азота может происходить, как и предполагалось, только в условиях недостатка кислорода.

В следующей серии экспериментов мы попытались выяснить, насколько предварительное введение нитритов может предотвращать сужение сосудов. В этих экспериментах животному сначала вводили нитрит натрия (20 мг/кг), а затем, через 15 минут, производили лазерную коагулящпо и наблюдали за изменением сосудов глазного дна (рис. 2).

Рис. 2. Введение нитрита натрия предотвращает развитие ишемии сетчатки при лазерной коагуляции сосудов, а - фотография глазного дна кролика после введения нитрита (до лазерной ишемии), (стрелка указывает место последующего лазерного воздействия); б - то же сразу после лазерного воздействия на фоне предварительного введения препарата.

В этом случае лазерное воздействие создавало не стойкий, а лишь кратковременный спазм сосуда с быстрым последующим восстановлением кровенаполнения и проводимости сосуда.

Таким образом, можно заключить, что нитрит натрия в условиях острой гипоксии приводит к почти мгновенному расширению сосудов, что и делает лазерную коагуляцию неэффективной. Можно предполагать, что в условиях гипоксии, когда нитриты могут связываться с гемом гемсодержащих белков, может происходить их восстановление до оксида азота в концентрациях, достаточных для быстрого и полного расслабления сосудов.

2.1. Регистрация электроретинограммы при ишемии сетчатки глаза

кроликов

Известно, что ишемия сетчатки, вызванная недостаточным кровоснабжением через ретинальные сосуды, сопровождается характерными изменениями в картине фотоэлектрической активности сетчатки - электроретинограмме. Использование ЭРГ позволило оценить действие нитритов на ретинальные сосуды по изменению электрической реакции сетчатки глаза, то есть независимым методом. Измерение выполнялось сразу после лазерной коагуляции, после введения препарата на фоне лазерного воздействия и после лазерного воздействия на фоне предварительного введения нитрита натрия.

Лазерная коагуляция сосудов сетчатки приводила к резкому снижению амплитуд а- и Ь- волн ЭРГ (рис.3). Введение нитрита натрия в количестве 20 мг/кг массы через 15 минут после лазерной коагуляции приводило к более быстрому восстановлению а- и Ь- волн ЭРГ. Наибольший положительный эффект препарата был выявлен при его введении до создания лазерной ишемии сетчатки, где не наблюдалось угнетения биопотенциалов.

Глиальный индекс Кг, рассчитываемый по отношению амплитуд Ь-волны ЭРГ и РЭРГ (12 Гц), равнялся 1,8 при норме 2,3-2,5 относительных единиц. Известно, что возрастание глиального индекса, отражающее активизацию метаболизма клеток Мюллера, является характерным признаком ретинальной ишемии. Однако, при острых нарушениях кровообращения в бассейне центральной артерии сетчатки, Ь-волна ЭРГ быстрее реагирует на гипоксию сетчатки, связанную с сосудистой катастрофой, чем низкочастотная РЭРГ. Поэтому опережающее снижение амплитуды Ь-волны ЭРГ сразу после лазерной коагуляции сосудов приводит к снижению Кг. отражая значительные нарушения в сетчатке. Действительно, клинические наблюдения свидетельствуют о развитии обтурации, кровотечения и запустения сосудов после лазерного воздействия и последующей острой ишемии сетчатки.

я

1 1- О 'СО

1 * i T 5 ВО

1 1 ¡ 1 1 4 Y// * 60 < <0 20

Я чаев 7 суток

Рис. 3. Динамика изменения амплитуд волн ЭРГ при действии нитритов, а - амплитуда а- волны ЭРГ, б - амплитуда Ь-волны ЭРГ. И - амплитуды а- и Ь- волн ЭРГ до проведения операции. □ - то же через 15 мин после проведения лазерной коагуляции. Ш - амплитуды а- и Ь- волн в том случае, когда через 15 мин после проведения лазерной коагуляции животному вводился нитрит натрия. □ - амплитуда волны в том случае, когда лазерная коагуляция проводилась через 15 мин после введения нитрита натрия.

Таким образом, полученные двумя независимыми методами (ЭРГ и офтальмоскопия) результаты показывают, что введение нитритов экспериментальным животным защищает сетчатку от острой ишемии. Такое действие, по-видимому, обусловлено тем, что при недостатке кислорода гп vivo нитрит натрия может восстанавливаться до оксида азота в концентрациях, достаточных для полного расслабления сосудов.

3. Модель ишемии сетчатки глаза на крысах

Модель ишемии сетчатки глаза на кроликах в некоторых экспериментах очень удобна, т.к. сосуды глаза хорошо видны, и для регистрации ЭРГ эти животные не требуют адаптации к темноте. Однако кровоснабжение сетчатки кролика отличается от кровоснабжения сетчатки человека. У кроликов 2/3 сетчатки питается от хориоидальных сосудов, которые снабжают наружные слои сетчатки. И всего 1/3 сетчатки питается от ретинальных сосудов, которые распадаются на капилляры в пределах ганглиозного слоя и слоя нервных волокон.

В то время как у человека, наоборот, только 1/3 сетчатки питается от хориоидальных сосудов и 2/3 - от ретинальных. Важно отметить, что основной причиной патологий человека является ишемия, вызванная нарушениями именно в ретинальных сосудах. Наиболее близким объектом является крыса, у которой кровоснабжение сетчатки осуществляется, как и у человека. Кроме того, сетчатка крысы является хорошо изученным гистологическим объектом, что позволяет использовать эту модель для применения гистологических и иммуноги-стохимических методов выявления апоптоза на ранних стадиях. Поэтому перед

нами стояла задача разработать новую модель ишемии сетчатки глаза на крысах. Ишемию создавали при помощи лазерного воздействия именно на ретинальные сосуды, так же, как и в предыдущих экспериментах.

3.1. Исследование глазного дна крыс после лазерной коагуляции.

При офтальмоскопии сразу после лазерной коагуляции отмечалось резкое сужение магистральных сосудов с полной или почти полной остановкой кровотока, сохраняющейся на протяжении нескольких минут, после чего кровоток частично восстанавливался, но просвет сосуда оставался значительно суженным.

На следующий день после коагуляции на глазном дне у некоторых крыс наблюдалась стушеванность границ диска зрительного нерва из-за отека окружающей сетчатки, суженные артерии, местами до полной их непроходимости, кровоток в них становился прерывистым. Некоторое расширение вен, по-видимому, было обусловлено одновременным нарушением венозной гемодинамики в результате распространения коагулирующего действия лазерного излучения на стенку расположенного рядом магистрального венозного сосуда.

Рис. 4. Фотография глазного дна экспериментальной крысы, а - до лазерного воздействия. Глазное дно - в норме: сосуды - нормального калибра, центральные отделы глазного дна - без изменений; б - сразу после лазерного воздействия: лазерные коагуляты почти полностью перекрыли 2 магистральных сосуда (стрелка 1), что привело к развитию периваскулярного отека сетчатки; в - через сутки после лазерного воздействия: в зоне воздействия отек сетчатки сохраняется, наблюдается сужение сосудов (стрелка 2) и компенсаторное расширение расположенных рядом ретинальных сосудов (стрелка 3).

Через сутки после лазерной коагуляции в результате тромбоза магистральных ретинальных сосудов отмечались достаточно выраженные гемодинамиче-ские нарушения в ретинальной системе микроциркуляции, приводящие к ишемии внутренних слоев сетчатки.

3.2. Регистрация электроретинограмы при ишемии сетчатки глаза

крыс

Стойкие гемодинамические нарушения в системе ретинального кровотока через сутки приводили к электрофизиологическим изменениям в сетчатке, характерным для ишемии. Для оценки степени развития ишемии сетчатки широко используется соотношение амплитуд Ь- и а- волн ЭРГ - индекс Ь/а (Нероев В.В. и др., 2004). а-волна ЭРГ характеризует функциональную активность фоторе-цепторных клеток, Ь-волна - внутренних слоев сетчатки, прежде всего, биполярных клеток. На следующий день после лазерной коагуляции сосудов амплитуда Ь-волны ЭРГ снижалась на 40-70% от исходных значений (рис. 5). Угнетение а-волны ЭРГ отмечалось через сутки не у всех животных. В тех случаях, когда амплитуда а-волны снижалась, угнетение Ь-волны было более значительным. Изменения Ь-волны развиваются, как правило, раньше угнетения а-волны и являются более выраженными из-за ухудшения трофики нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки при нарушениях ретинальной циркуляции. В нашем исследовании при развитии острой ишемии сетчатки коэффициент Ь/а резко снижался - до 1,0-2,0 отн. единиц при его нормальных значениях у крыс 3,3-4,8 ед.

Рис. 5. Запись элек-троретинограммы крысы.

а - ЭРГ интактного животного, б - ЭРГ того же глаза через 1 сутки после лазерной коагуляции ретинальных сосудов.

3.3. Гистологические и иммуногистохимические исследования сет-

чатки глаз крыс после лазерного воздействия

Данные электроретинографических исследований подтверждаются гистологическими результатами. Нарушение кровотока в ретинальных сосудах вследствие их тромбирования уже через сутки приводили к ишемическим повреждениям во внутренних слоях сетчатки глаза (рис. 6). Типичными проявлениями ишемического повреждения были кровоизлияния, микрокистовидные изменения в слое нервных волокон, отек ганглиозных клеток, локальное уменьшение плотности нейронов в слое биполярных клеток. Следствием пе-риваскулярного отека явилось истончение и микроразрывы внутренней пограничной мембраны, через которые происходила миграция мононуклеарных клеток крови из просвета сосуда в корковые отделы прилежащего стекловидного тела.

"С *

< ВСС

¡s А * - 1

ВЯС " ■ Ш . и*

111|1Я11В11ИНСС i / . -

Рис. 6. Гистологическое исследование сетчатки крысы, а — контроль; б — через сутки после лазерной коагуляции сосудов. НЯС - наружный ядерный слой, НСС - наружный синаптический слой, ВЯС - внутренний ядерный слой, ВСС - внутренний синаптический слой, ГС - ганглиозный слой. Стрелками на рисунке указаны: 1 - тромбоз ретинальной артериолы, 2 -уменьшение плотности нейронов в слое биполярных клеток, 3 - отек ганглиоз-ных клеток. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.х.400.

Таким образом, результаты наших электрофизиологических и гистологических исследований позволяют заключить, что лазерная коагуляция рети-нальных сосудов приводит к развитию характерных ишемических изменений в сетчатке.

Для подтверждения того, что гибель клеток идёт по апоптотическому пути, был применён метод TUNEL. Данным методом были выявлены TUNEL-положительные ядра в ганглиозном слое уже через 6 часов после лазерного воздействия на сосуды (рис. 7). Также наблюдался апоптоз амакриновых и гангли-озных клеток через 18 и 24 часа после лазерной коагуляции.

Рис. 7. Выявление апоптотических клеток в сетчатке при ишемии: а - контроль; 6-6 часов после лазерной коагуляции; в - 9 часов после лазерной коагуляции; г - 24 часа после лазерной коагуляции. Стрелками указаны Т1ЖЕЬ-положительные апоптотические ядра сетчатки.

При лазерной коагуляции ретинальных сосудов наибольшее количество апоптотических ядер в ганглиозном слое выявлено через 24 часа после тромби-рования сосудов (60 % от общего числа клеток) (рис. 8). Максимальное количество Т1ЖЕЬ-положительных ядер во внутреннем ядерном слое (ВЯС) было обнаружено уже через 9 часов после лазерного воздействия.

И Апоптотнческне ядра внутреннего ядерного слоя

Е] Апоптотческие ядр а ганглнозного слоя

время, часы

Рис. 8. Зависимость образования апоптотических ядер в сетчатке глаза крысы при ишемии от времени.

3.4. Действие нитритов на клетки сетчатки глаза крысы при ишемии

Понимание молекулярного механизма гибели клеток при патологии особенно важно при попытках фармакологически предотвратить их гибель. Известно, что гибель нервных клеток при развитии ишемии может идти апоптотиче-ским путем. Можно предполагать, что поскольку повышенная концентрация нитритов в сосудах защищала сетчатку от появления признаков ишемии, то этот механизм должен предотвращать и развитие апоптоза клеток сетчатки.

Нитрит натрия вводили крысам внутрибрюшинно за 15 минут до лазерного воздействия в количестве 20 мг/кг массы. При этом лазерное воздействие создавало нестойкий эффект: через сутки после лазерного воздействия на сосуды происходило их полное восстановление.

Иммуногистохимическим методом TUNEL было показано, что предварительное введение нитрита натрия животным приводило к значительному снижению количества TUNEL-положительных ядер в ганглиозном слое и защищало от апоптоза клетки внутреннего ядерного слоя (рис. 9).

НС

кяс

нее вяс

всс

ГС

и

«1Ж

Рис. 9. Защитный эффект нитритов при ишемии сетчатки: а -контроль; б - апоптоз клеток при ишемии; в - сетчатка после лазерной коагуляции на фоне предварительного введения нитрита натрия. Стрелками указаны ТиНЕЬ-положительные апоптотические ядра сетчатки.

При предварительном введении нитрита натрия до лазерной коагуляции сосудов сетчатки количество апоптотических клеток в ганглиозном слое сетчатки снижалось на 66%, а во внутреннем ядерном слое - на 50% (рис. 10).

а 40

Б

1 30

0 20

е

1 10

8

2 о

И Апоптотические ядра внутреннего ядерного слоя

□ Апоптотические ядра гзнглноэного слоя

Рис. 10. Количество апоптотических ядер в сетчатке при ишемии и введении нитрита натрия.

нитрит натрия^ишемия

Важно отметить, что изменения затрагивали, главным образом, внутренние отделы сетчатки (до внутреннего ядерного слоя), которые кровоснаб-жаются ретинальными сосудами. В наружных отделах, которые питаются из слоя хориокапилляров (слой наружных сегментов фоторецепторов, наружный ядерный слой), видимых морфологических изменений не обнаружено.

4. Роль оксида азота в механизме развития апоптоза при ишемии

сетчатки

Известно, что гибель нервных клеток мозга и сетчатки при некоторых патологиях происходит апоптотическим путем при участии оксида азота. Естественно предполагать, что и при развитии ишемии оксид азота может быть индуктором развития апоптоза. Ранее было установлено, что введение животным

конкурентного ингибитора ^ЧО-синтазы Ь-ЫАМЕ приводит к существенному снижению концентрации оксида азота в клеточных слоях сетчатки и таким образом можно предполагать, что введение этого ингибитора будет влиять на развитие апоптоза.

Для подтверждения этого экспериментальным животным вводили ингибитор >Ю-синтазы Ь-ЫАМЕ. Внутрибрюшинное введение этого препарата в количестве 20 мг/кг массы снижало концентрацию оксида азота в клетках сетчатки, и пероксинитрит не образовывался. При предварительном введении Ь-ЬТАМЕ за 15 минут до лазерного воздействия на ретинальные сосуды апоптотические клетки во внутренних слоях сетчатки не выявлялись (рис. 11).

НС НЯС НСС

вяс вес гс

Рис. 11. Защитный эффект Ь^АМЕ при ишемии сетчатки: а - контроль, б - апоптоз клеток сетчатки при ишемии, в - сетчатка после лазерной коагуляции на фоне предварительного введения Ь-ЫАМЕ. Стрелками указаны ТиКЕЬ-положительные апоптотические ядра сетчатки.

Лазерная коагуляция сосудов сетчатки глаза приводит к гибели 50% клеток ганглиозного слоя и 30% клеток внутреннего ядерного слоя (ВЯС) сетчатки. При предварительном введении препарата Ь-ЫАМЕ крысам лазерное воздействие на ретинальные сосуды приводит к гибели всего 20% ганглиозных клеток и 15% клеток ВЯС от общего числа клеток (рис. 12).

■ я 60 1*0.

| 40 ■

н 30

Я

О

в 20 -о £

Е 10' =

§ о

И Апоптотические ядря внгреннего ядерного слоя

□ Апоптотические ядра ганглиозного слоя

контроль

Ь-КАМЕ + ишемия

Рис. 12. Количество апоптотических ядер в сетчатке крысы при ишемии и при введении ингибитора N0-синтазы ЫМАМЕ.

Можно сделать вывод, что ингибитор NO-синтазы L-NAME защищает клетки сетчатки от апоптоза при ишемии. Таким образом, оксид азота является необходимым элементом развития апоптоза в клеточных слоях сетчатки.

5. Повреждение сетчатки глаза крыс при глутаматной интоксикации

Глутаматная интоксикация может являться одной из ступеней длинной цепи ишемического повреждения (Louzada-Junior et al., 1992), но может происходить и независимо от ишемии при различных дегенеративных нарушениях. В работе нами исследовалось влияние повышения концентрации глутамата на возникновение нейродегенеративных нарушений в сетчатке и роль оксида азота в этих процессах.

NMDA (агонист глутамата) вводили непосредственно в глаз экспериментальным животным в количестве 200 нмоль/глаз. И уже через сутки методом TUNEL можно было выявить апоптотические ядра во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток сетчатки (рис. 13). Введение NMDA приводит к апоптотической гибели 60% ганглиозных клеток от общего числа клеток гангли-озного слоя и 50% клеток внутреннего ядерного слоя от общего числа клеток этого слоя.

НС а б

няс > > >

нее вяс

всс ^ « „

ГС

Рис. 13. Структурные изменения клеток сетчатки после введения NMDA: а - контроль, б - через 24 часа после введение NMDA. Стрелками указаны TUNEL-положительные апоптотические ядра.

ЭРГ также ясно свидетельствует о снижении функциональной активности во внутренних слоях сетчатки: наблюдается уменьшение амплитуды b-волны на 50% от нормы (рис. 14). Известно, что передача сенсорного сигнала от фоторецепторов к последующим слоям сетчатки осуществляется посредством глутамата. Введение агониста глутамата NMDA приводит к блокированию этой передачи и увеличению концентрации глутумата в синаптической щели. Это приводит к тому, что ответы фоторецепторных клеток сохраняются, а ответы более глубоких слоев сетчатки значительно уменьшаются. Именно такая картина наблюдается и при электроретинографических исследованиях. Как видно, а-волна ЭРГ,

которая обусловлена электрической активностью фоторецепторов, практически не изменяется, а Ь-волна, основной вклад в которую вносят ответы биполярных клеток, существенно уменьшена

Рис. 14. Запись электро-ретинограммы крысы, а - ЭРГ контрольного животного, б - ЭРГ того же глаза через 1 сутки после введения ИМОА.

Введение КМГ)А приводило к развитию апоптоза в клеточных слоях сетчатки. Так, через 24 часа после введения апоптотические ядра обнаруживались во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток, то есть именно в тех слоях, где медиаторная роль глутамата установлена.

Для того чтобы выяснить, по какому пути идёт гибель клеток, в стекловидное тело глаза вместе с КМБА вводили ингибитор ИО-синтазы Ь-МАМЕ (0,1 мг/глаз). При этом количество апоптотических ядер в сетчатке резко снижалось (рис. 15).

НС

НЯС

НСС ВЯС

вес

ГС

Рис. 15. Защитный эффект Ь-ИАМЕ при глутаматной интоксикации сетчатки: а - контроль, 6-24 часа после введения ЫМОА, в - 24 часа после введения ЫМБА и Ь-ЫАМЕ. Стрелками указаны ТГЛЧЕЬ-положительные апоптотические ядра сетчатки.

Введение Ь-КАМЕ вместе с КМЭА в стекловидное тело глаза приводило к снижению количества апоптотических ядер во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток на 50% и 70%, соответственно (рис. 16).

а б

70 ■ 60

50 -40 -30 -20 -10 -

И Апоптошческне ядря внутреннего ядерного слоя

П Агтоптотические ядра гэнглночного слоя

контроль

NMDA

т.

L-NAME -\М1)А

Рис. 16. Количество апоп-тотических ядер в сетчатке глаза крысы при введении К VIО А и ингибитора N0-синтазы Ь^АМЕ.

5. Повреждение сетчатки крысы при повышении концентрации оксида

азота

(Эксперименты проводились совместно с А. Ф. Ваниным) Для подтверждения предположения, что в разработанных нами экспериментальных моделях глазных патологий именно высокая концентрация NO является токсическим фактором, нам требовалось создать 20-кратный избыток N0 в сетчатке. Для этого мы вводили в глаз донор оксида азота динитрозильный комплекс железа с глутатионом (ДНК-Ж). Динитрозильные комплексы железа в тканях животных и человека продуцируют свободные молекулы оксида азота и могут функционировать в качестве эндогенных универсальных регуляторов биохимических и физиологических процессов. ДНК-Ж обеспечивают стабилизацию и перенос N0 в биосистемах. Так как компоненты этого комплекса уже содержатся в системе, то его введение не является токсичным для клеток сетчатки. Ниже приведена структурная формула ДНК-Ж с глутатионом и распад этого соединения на составляющие компоненты с образованием оксида азота.

RS

^ Fe2' + NO + RS-NO

RS

Введение в стекловидное тело глаза крыс динитрозильного комплекса железа с глутатионом (10°-10"8 моль/глаз) через сутки приводило к появлению апоптотических ядер в сетчатке. Методом TUNEL было выявлено, что апоптозу подверглись клетки внутреннего ядерного и ганглиозного слоев сетчатки (рис. 17). При этом ano птоз был выявлен только при введении ДНК-Ж в дозах 10"7 и 10~8 моль/глаз. А при введении большего количества препарата (10~б и 10° моль/глаз) TUNEL-положительные ядра в сетчатке выявить не удалось.

GSH-

О

Fe"

GSH-S"

/ \

NO

НС

няс

нее вяс

все гс

а : : к V .. ■; , Ь4^ ' б в г 'ШШШШ д

Рис. 17. Введение ДНК-Ж в стекловидное тело глаза крысы: а - контроль, б - ДНК-Ж, 10"5 моль/глаз, в - ДНК-Ж, 10"6 моль/глаз, г - ДНК-Ж, 10"7 моль/глаз, д -ДНК-Ж, 1(Г моль/ глаз. Стрелками указаны ТЫЧЕЬ-положителъные апоптотиче-ские ядра сетчатки.

При введении ДНК-Ж в количестве 10"7 моль/глаз количество апоптотиче-ских клеток в ганглиозном слое сетчатки увеличилось на 30% от нормы (рис. 18). При введении препарата в количестве 10"8 моль/глаз апоптозу подверглось до 70% клеток ганглиозного слоя сетчатки от общего количества клеток. При этом клетки внутреннего ядерного слоя подвергались апоптозу в незначительной степени и составили всего 15% от нормы.

53 Ашттиичеш«: ядрл нпу'фешсга О Лшт'О-шчссш: йдра пцв-лиошош слоя

Копичесгао ДНК-Ж, мапЫгпзэ

Рис. 18. Количество апопто-тических ядер в сетчатке глаза крысы при введении ДНК-Ж.

Таким образом, введение донора оксида азота ДНК-Ж в низких дозах приводит к апоптозу клеток сетчатки экспериментальных животных, так как избыток N0 в ткани ведёт к образованию пероксинитрита, а, следовательно, и к гибели клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Действие оксида азота двояко: с одной стороны, он защищает сосуды от ишемии, так как он является сосудорасслабляюгцим фактором, с другой стороны, при дегенеративных нарушениях сетчатки он взаимодействует с активными формами кислорода, что приводит к образованию пероксинитрита - сильнейшего токсического фактора, который действует на митохондрии и индуцирует развитие апоптоза клеток. Поэтому нас интересовало, во-первых, участие N0 в патологии, так как он играет нейротоксическую роль, во-вторых, - защитное действие оксида азота при патологии.

Для изучения обоих свойств оксида азота нами были разработаны модели ишемии и глутаматной интоксикации сетчатки глаза на экспериментальных животных.

Существует несколько методик создания экспериментальной ишемии, из которых наиболее распространенными являются искусственное повышение внутриглазного давления (ВисЫ Е.Я. е( а1., 1991) или наложение лигатуры на сосуды в районе зрительного нерва (СКоп У. ег а1., 1997). Каждый из этих подходов имеет свои недостатки. Так, для повышения внутриглазного давления требуется жесткая фиксация иглы, через которую создается повышенное давление на длительное время (до 1 часа). Этот метод очень чувствителен к любым механическим воздействиям, что делает результаты нестабильными. Кроме того, повышение внутриглазного давления неизбежно ведет к дегенерации ганглиозных клеток, которая может быть обусловлена и не ишемией. Во втором случае, при наложении лигатуры, неизбежно повреждаются не только сосуды, но и зрительный нерв, что приводит к независимым от ишемии дополнительным патологическим изменениям в сетчатке (МаБигаша К. е! а1., 2006). Таким образом, имеющиеся модели не могут дифференцировать гибель клеток сетчатки, вызванную ишемией, от гибели клеток, обусловленной независимой от ишемии дегенерацией клеток сетчатки. Понимание отличий этих механизмов патогенеза принципиально важно как для поиска перспективных лекарственных средств, так и для выбора правильной стратегии лечения. Так, антиишемические средства могут и не предотвращать гибель нейронов, вызванную другими причинами.

Избежать этих недостатков в модели можно путем непосредственного локального воздействия лазерного излучения на магистральные ретинальные сосуды, что вполне выполнимо, поскольку они хорошо видны и доступны для лазерной коагуляции.

Эта модель является удобной, так как, с одной стороны, позволяет избежать указанных выше недостатков. С другой стороны, избирательное тром-бирование сосудов, создаваемое лазерной коагуляцией, дает возможность, выбирая различные отделы магистральных ретинальных сосудов или их ветвей и изменяя параметры лазерного излучения, создавать как локальную, так и обширную ишемию сетчатки. Предлагаемая нами модель имеет ряд пре-

имуществ. Во-первых, изменение скорости кровотока происходит не в результате длительного (1-2 часа) воздействия, а в доли секунды (время экспозиции лазерного излучения). Это позволяет изучать ишемические нарушения в остром периоде. Во-вторых, модель быстро и легко реализуема при наличии лазерного оборудования и, в-третьих, лазерная коагуляция моделирует такое офтальмологическое заболевание, как тромбоз ретинальных сосудов.

Защитное действие оксида азота от ишемических повреждений клеток сетчатки продемонстрировано нами на описанной выше модели. Показано, что введение нитрита натрия экспериментальным животным до и после лазерного воздействия на сосуды сетчатки приводит к восстановлению диаметра сосудов, и поэтому характерные ишемические повреждения в сетчатке не наблюдаются. Это можно объяснить тем, что нитриты в условиях гипоксии могут восстанавливаться гемсодержащими белками до оксида азота, что приводит к расширению сосудов.

Как уже отмечалось, восстановление нитритов рассматривается рядом авторов как альтернативный источник оксида азота в организме в условиях гипоксии. Предполагается, что восстановление неорганических нитритов до оксида азота происходит на геме гемсодержащих белков, прежде всего, гемоглобина и ксантиноксидазы, которые в условиях гипоксии могут работать как редуктазы. Наиболее убедительно это подтверждается в экспериментах in vitro на выделенных ферментах и культурах клеток. (Rifkind, J.M. 2003, Millar et al., 1998). Следует отметить, что при обсуждении механизма восстановления нитритов гемсодержащими белками основным возражением служит то, что при закислении среды восстановление нитритов до NO in vivo может происходить в результате неферментативной окислительно-восстановительной реакции. Создание гипоксии в любых органах неизбежно приводит к ацидозу. Причиной этого является переход клетки от окислительного фосфорилирова-ния к гликолизу, что сопровождается закислением. Однако этот процесс требует времени. Так, в мозге - структуре наиболее близкой к сетчатке, закисле-ние происходит лишь через 15 минут после создания экспериментальной ишемии (Shimizu et al., 1993).

Очевидно, что в наших экспериментах ацидоз никак не может быть причиной восстановления нитрита до N0, которое, судя по быстрой реакции сосуда, происходит за времена менее минуты. Так, проведение коагуляции сосудов после введения животному нитрита натрия не приводило к стойкому тромбированию сосудов, наблюдалось лишь кратковременное сужение сосуда, а затем немедленное восстановление его диаметра. Можно предположить, что при этом возникает кратковременная гипоксия, которая и является условием для быстрого восстановления присутствующего в сосуде нитрита натрия до N0.

На той же модели ишемии сетчатки глаза мы продемонстрировали нейро-токсические свойства оксида азота в нервной ткани. В данном случае наиболее адекватными являются модели ишемии сетчатки на крысах, так как у них со-

отношение ретинального и хориоидального кровоснабжения сетчатки близко к таковому у человека. В нашей работе показано, что апоптоз клеток при ише-мических повреждениях сетчатки происходит именно во внутре1ших слоях сетчатки, которые кровоснабжаются ретинальными сосудами. Отсутствие апопто-тических клеток в фоторецепторном слое объясняется тем, что фоторецепторы в значительной степени снабжаются кислородом через хориоидальные сосуды и не страдают от ишемии ретинальных сосудов.

Ранее нами было показано, что предварительное введение экспериментальным животным ингибитора 1МО-синтазы Ь-ЫАМЕ значительно снижает концентрацию эндогенного N0 в клетках сетчатки. При лазерной коагуляции ретинальных сосудов введение Ь-КАМЕ предотвращает развитие апоптоза клеток во внутренних слоях сетчатки. Важно отметить, что апоптоз в этом случае индуцирован исключительно ишемией, тогда как в других моделях дегенерация может быть обусловлена прямым воздействием на нервные клетки сетчатки.

На второй использованной нами модели нейродегенерации сетчатки глаза, вызванной глутаматной интоксикацией, мы показали, что апоптотическая гибель клеток также происходит во внутренних слоях сетчатки. Это объясняется тем, что передача сенсорного сигнала посредством глутамата осуществляется в си-наптических слоях, таким образом, избыток глутамата приводит к гибели клеток всех слоев сетчатки, исключая фоторецеторный.

Каков механизм развития апоптоза в обоих случаях? К настоящему времени накоплено немало доказательств того, что оксид азота является необходимым фактором развития апоптоза при дегенеративных нарушениях нервных клеток. Развитие ишемии, как известно, приводит к развитию окислительного стресса в клетках сетчатки и повышению содержания активных форм кислорода (Сд^осгеа сЧ а1., 2001). Именно это является, как считается, причиной развития апоптоза. Однако сам по себе супероксид анион-радикал в отсутствие N0 не приводит к развитию апоптоза. Интересно отметить, что ингибирование N0-синтазы не только не уменьшает генерацию супероксид-анион радикала, а напротив, увеличивает ее. Так, при работе 140-синтазы электрон с НАДФ-Н последовательно переносится на кислород, затем на аргинин с последующим образованием N0. В присутствии в системе аргинина 1ЧО-синтаза работает как синтаза, образуя N0, в отсутствие аргинина - как оксидаза, образуя Ог".

Предполагается, что оксид азота связывается с образовавшимся супероксид-анион радикалом, что приводит к появлению пероксинитрита (ОЖЮ"), который является проапоптотическим фактором и ведёт к гибели клеток. Сам по себе пероксинитрит развития апоптоза не вызывает, а является короткоживущим промежуточным продуктом. Дальнейшее химическое превращение ОИОО" выглядит так:

но'+о; оиоо~< "* > оыоон он'+мо;

Мы предполагаем, что при глутаматной интоксикации апоптотическая гибель клеток происходит по-другому. Известно, что действие глутамата приводит

к активации входного кальциевого тока в клетку, и внутриклеточная концентрация кальция возрастает. МО-сиитаза является кальций-зависимым ферментом, и увеличение концентрации кальция в клетке приводит к увеличению продукции оксида азота в клетке, в результате образуется большее количество пероксинит-рита, что ведет к развитию апоптоза по уже описанному механизму. Ключевым фактором в этом случае является не увеличение концентрации супероксида, а увеличение концентрации оксида азота.

Интересно отметить, что повышение активности ЫО-синтазы, опосредованное глутаматом, может происходить и при развитии ишемии. Как известно, ишемия вследствие энергодефицита приводит к изменению потенциала нервных клеток, что в свою очередь может приводить к изменению работы как метабо-тропных, так и ионотропных глутаматных рецепторов и увеличению внутриклеточной концентрации кальция. Таким образом, глутаматная интоксикация при развитии ишемии также является одним из повреждающих факторов, которые реализуются через образование пероксинитрита.

В экспериментах, когда содержание оксида азота в сетчатке глаза напрямую повышалось введением донора N0 (ДНК-Ж с глутатионом) в низких концентрациях, наблюдалось появление апоптотических клеток в сетчатке через сутки после введения препарата. При ведении ДНК-Ж в высоких концентрациях апоптоз клеток в сетчатке не наблюдался. Это можно объяснить тем, что введённый ДНК-Ж связан с глутатионом, который обладает антиоксидант-ными свойствами. И при увеличении концентрации препарата соответственно увеличивалась и концентрация глутатиона, когда токсическое действие N0 уже находилось в насыщении.

Это подтверждает наше предположение о токсичности высокой концентрации оксида азота в нервной ткани, которая возникает при различных нейродегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.

Таким образом, снижение внутриклеточной концентрации N0 могло бы предотвратить апоптотическую гибель при развитии ретинальных патологий глаза.

выводы

1. Впервые разработана оригинальная модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов.

2. Установлено, что предварительное введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотической гибели клеток.

3. Показано, что ингибирование КО-сиитазы предовтращает развитие апоп-тоза при ретинальной ишемии. Предполагается, что ключевую роль в развитии апоптоза в данной зрительной патологии играет образование перок-синитрита.

4. Показано, что ингибирование >Ю-синтазы предотвращает развитие апоптоза при глу гаматной интоксикации сетчатки глаза.

5. Показано, что введение в глаз динитрозильных комплексов железа в количестве 10"7 - 10~8 моль/глаз приводит к развитию апоптоза во внутренних слоях сетчатки.

Список сокращений:

ДНК-Ж - динитрозильный комплекс железа ЭРГ - электроретинограмма НС - наружные сегменты НЯС - наружный ядерный слой НСС - наружный синаптический слой ВЯС - внутренний ядерный слой ВСС - внутренний синаптический слой ГС — ганглиозный слой

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Г.Р. Каламкаров, И.В. Цапенко, М.В. Зуева, А.Н. Иванов, C.B. Резвых, Т.С. Константинова, Т.Ф. Шевченко. Нитриты способны расширять сосуды при гипоксии и защищать сетчатку от ишемии. Докл. Академии наук, 2007, Т. 417, № 2, С. 1-3.

2. Г.Р. Каламкаров, Т.Ф. Шевченко, Т.С. Константинова, М.А. Островский, A.B. Агеев, С.А. Кочергин, JI.K. Мошетова. Прогнозирование развития офтальмологических патологий с помощью выявления специфических антител сетчатки. Технологии живых систем. 2007, Т. 4, № 5-6, С. 11-19.

3. Г.Р. Каламкаров, И.В. Цапенко, М.В. Зуева, А.Н. Иванов, Т.С. Константинова, А.Е. Бугрова, C.B. Резвых, A.A. Федоров, Т.Ф. Шевченко. Экспериментальная модель острой ишемии сетчатки глаза у крыс. Бюлл. эксп. биологии и медицины. 2008, № 6, С. 634-638.

4. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский, А.Е. Бугрова, Т.Ф. Шевченко, Т.С. Константинова. Разработка иммунологических методов выявления глазных патологий; роль оксида азота в дегенерации сетчатки глаза. «Фундаментальные науки - медицине», Москва. Декабрь 2007, С. 60.

5. Константинова Т.С., Каламкаров Г.Р., Цапенко И.В., Зуева М.В.,. Иванов А.Н, Шевченко Т.Ф. Нитриты могут быть источником оксида азота в условиях гипоксии и защищать сетчатку глаза от ишемии. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2006 г. С. 135-136.

6. Константинова Т.С., Каламкаров Г.Р., Цапенко И.В., Зуева М.В.,. Иванов А.Н, Шевченко Т.Ф. Роль оксида азота в развитии дегенеративных заболеваний сетчатки глаза. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН -ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2007 г. С 5758.

7. Константинова Т.С., Цапенко И.В., Зуева М.В., Иванов А.Н., Бугрова А.Е., Шевченко Т.Ф., Каламкаров Г.Р. Участие оксида азота в развитии апоптоза клеток сетчатки при ишемии. Международная молодёжная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика». Сборник статей. Москва. Ноябрь. 2008, С. 109-113.

8. Каламкаров Г.Р., Бугрова А.Е., Константинова Т.С., Шевченко Т.Ф., Зуева М.В., Цапенко И.В., Иванов А.Н. Молекулярные механизмы протекторного и нейротоксического действия оксида азота при развитии ретинальных патологий. Актуальные вопросы нейроофтальмологии. Сборник статей. Москва. 2009, С. 14-15.

Подписано в печать 25 мая 2009 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,5 п.л.

Тираж 100 экз.

Заказ № 260509219

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912У772801001

Адрес: 119333, г. Москва, Университетский проспект, д. 6, кор. 3.

Тел. 740-76-47, 125-22-73.

http://www.univerprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Константинова, Татьяна Сергеевна

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение сетчатки.

1.1.2. Кровоснабжение сетчатки.

1.2. Ишемия сетчатки.

1.2.1. Модели ишемии сетчатки глаза на животных.

1.2.2 Электроретинограмма при ишемии.

1.3. Механизмы ишемии, обусловленные нейрональными медиаторами

1.3.1. Изменения концентрации глутамата в сетчатке глаза при 21 ишемии.

1.3.2. Глутаматная эксайтотоксичность in vitro и in vivo при 24 ишемии.

1.3.3. Механизм глутаматной эксайтотоксичности.

1.4. Роль свободных радикалов в ишемии сетчатки.

1.5. Ацидоз в сетчатке глаза при ишемии.

1.6. Молекулярные аспекты клеточной гибели при ишемии (апоптоз)

1.7. Оксид азота как сигнальная молекула.

1.7.1. Динитрозильные комплексы железа.

1.8. Нитриты как альтернативный источник оксида азота.

1.8.1. Содержание нитритов в органах и тканях.

1.8.2. Нитриты как терапевтический и физиологический сосудорасширяющий фактор.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Экспериментальные модели.

2.2. Гистологические и иммуногистохимические методы.

2.3. Электрофизиологический метод.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Исследование действия нитритов в сетчатке на модели ишемии ° сетчатки глаза кроликов.

3.1.1. Регистрация электроретинограммы при ишемии сетчатки глаза кроликов.

3.2. Модель ишемии сетчатки глаза на крысах.

3.2.1. Исследование глазного дна крыс после лазерной коагуляции . J

3.2.2. Регистрация электроретинограммыпри ишемии сетчатки ^ глаза крыс.

3.2.3. Гистологические иммуногистохимические исследования ^ сетчатки глаза крыс после лазерного воздействия.

3.2.4. Действие нитритов на клетки сетчатки глаза крысы при ишемии.

3.3. Роль оксида азота в механизме развития апоптоза при ишемии ^ сетчатки.

3.4. Повреждение сетчатки глаза крысы при глутуматной интоксикации ^

3.5. Повреждение сетчатки крысы при повышении концентрации оксида ^7 азота

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протекторная и нейротоксическая роль оксида азота в моделях зрительных патологий"

Оксид азота играет ключевую роль в регуляции самых разных биологических функций. Известно также, что оксид азота играет важную роль в развитии патологий сетчатки и зрительного нерва. В сетчатке глаза относительно высокая концентрация оксида азота обнаруживается' в* двух слоях - во внутренних сегментах фоторецепторного слояи слое ганглиозных клеток. Оксид азота является регулятором синаптической передачи, одним из медиаторов которой является глутамат.

Сетчатка глаза находится в,тесном контакте с ретинальными сосудами, которые проходят через все внутренние слои сетчатки и снабжают их кислородом и необходимыми метаболитами. Оксид азота, являясь сосудорасслабляющим фактором, регулирует состояние сосудов как в норме, так и при патологиях и, следовательно, оказывает значительное влияние на работу всех элементов сетчатки. Это особенно важно в условиях гипоксии, когда недостаток кислорода приводит к развитию ишемии сетчатки — причины многочисленных офтальмологических заболеваний.

С другой стороны, известно, что оксид азота может играть и нейротоксическую роль, приводя к апоптозу нервных клеток. Предполагаемой причиной такого действия является взаимодействие оксида азота с супероксид-анион радикалом с образованием пероксинитрита. Пероксинитрит может разлагаться с образованием гидроксильного радикала - сильного токсического агента, приводящего, среди прочего, к апоптотической гибели клеток.

В данной работе нами исследованы оба механизма действия оксида азота - как нейропротекторного фактора, защищающего сетчатку глаза от ишемии, так и нейротоксического фактора, вызывающего апоптотическую гибель клеток.

Для изучения защитных и нейротоксических свойств^ оксида азота нами была разработана модель ишемии сетчатки глаза на экспериментальных животных. Изучение ишемии сетчатки важно для-понимания патогенеза таких связанных с сосудистой недостаточностью заболеваний, как окклюзия ретинальной артерии, глаукома, макулярная дегенерация и др. (Osborne N.N. et al., 2004). Мы создавали ишемию сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов. Такое воздействие, с одной стороны, позволяет резко снизить концентрацию кислорода непосредственно в сосудах и наблюдать за изменением их , диаметра при действии нитритов в условиях недостатка кислорода in vivo; с другой стороны, как следствие, вызывать развитие ишемии сетчатки и по состоянию сетчатки оценить степень ее кровоснабжения. Кроме того, такая модель не затрагивает прямо нервные элементы сетчатки'.

Оксид азота продуцируется в клетке ферментом- NO-синтазой, основным субстратом которой- является аргинин. До последнего времени аргинин считался; по существу, единственным источникомг оксида азота» в организме. В» последние годы внимание многочисленных исследователей привлек процесс восстановления нитритов до оксида азота и таким образом нитриты также могли бы оказаться источником оксида азота. Предполагается, что нитриты могут восстанавливаться до- оксида азота гемсодержащими белками. Особенно активно этот процесс будет происходить в условиях пониженной концентрации^ кислорода, когда образующийся оксид азота, во-первых, не окисляется до диоксида, а, во-вторых, может связываться с гемом белка, занимая сайт связывания кислорода.

В данной работе мы показали, что такой процесс может происходить в ретинальных сосудах in vivo, причем, за времена порядка минуты. Продемонстрировано, что восстановленный из нитрита оксид азота действует как фактор расслабления сосудов и защищает сетчатку глаза от ишемии.

Целью настоящей работы являлось установить роль и химические механизмы действия оксида азота как нейропротекторного и нейротоксического факторов при развитии патологий в сетчатке глаза.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создать адекватные модели- зрительных патологий на экспериментальных животных (ретинальная ишемия и глутаматная интоксикация сетчатки глаза).

2. Выяснить, участвует ли оксид азота в развитии нейродегенерации при ишемии сетчатки глаза и является! ли он проапоптотическим фактором.

3. Создать модель, позволяющую наблюдать» изменения отдельного сосуда сетчатки при гипоксии на экспериментальных животных.

4. Выяснить возможность восстановления нитритов до оксида азота в ретинальных сосудах при ишемии'сетчатки.

5. Выяснить, может ли введение нитритов вызывать расширение сосудов и таким образом защищать сетчатку от ишемии в условиях гипоксии в разработанной нами модели ретинальной ишемии.

6. Исследовать нейротоксическое действие избытка оксида азота на клетки сетчатки глаза.

Результаты,проведенных исследований имеют важное теоретическое и •практическое значение для понимания роли оксида азота при развитии нейродегенеративного процесса, вызванного ишемией. Данные об» участии оксида азота в развитии патологических заболеваний сетчатки глаза ставят вопрос о новых стратегиях лечения таких ишемических заболеваний сетчатки глаза, как глаукома, диабетическая ретинопатия и др. Нами разработана модель, позволяющая отличить патологическое действие гипоксии от патологического действия повышения внутриглазного давления, вызывающего дегенерацию нервных клеток. На этой модели показано, что оксид азота является необходимым элементом в развития апоптоза, вызванного исключительно ишемическим повреждением. Это принципиально важно для разработки лекарственных средств и понимания механизмов возникновения ряда зрительных патологий. Обнаруженный нами защитный эффект нитритов при развитии ишемии вследствие гипоксии имеет важное значение для разработки антиишемических средств лечения глазных патологий.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов.

2. Введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотической гибели клеток.

3. Ингибирование NO-синтазы предотвращает развитие апоптоза при ишемии и глутаматной интоксикации сетчатки глаза.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Константинова, Татьяна Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана оригинальная модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов.

2. Установлено, что предварительное введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотической гибели клеток.

3. Показано, что ингибирование NO-синтазы предовтращает развитие апоптоза при ретинальной ишемии. Предполагается, что ключевую роль в развитии, апоптоза в данной зрительной патологии играет образование пероксинитрита.

4. Показано, что ингибирование NO-синтазы предотвращает развитие апоптоза при глутаматной интоксикации сетчатки глаза.

5. Показано, что введение в глаз динитрозильных комплексов железа в количестве 10"7 - 10"8 моль/глаз приводит к развитию апоптоза во внутренних слоях сетчатки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Константинова, Татьяна Сергеевна, Москва

1. Каламкаров Г.Р., Лунгина О.Г., Шевченко Т.Ф., Ванин А.Ф. Оксид азота в наружном синаптическом слое сетчатки позвоночных. Сенсорные системы. 2002. Т. 16., № 2.

2. Нероев В.В., Зуева М.В., Цапенко И.В. и др. Функциональная диагностика ретинальной ишемии. Сообщение 1. Реакция мюллеровских клеток на ранних стадиях диабетической ретинопатии. Вестник офтальмологии.2004. Т. 120, № 6. С. 11-13.

3. Реутов В.П., Ажипа Я.И., Каюшин Л.П. Кислород как ингибитор нитритредуктазной активности гемоглобина. Известия Академии наук ССР, Сер. Биол., 1983, №3, с. 408-418.

4. Реутов В.П., Сорокина Е.Г. NO-синтазная и нитритредуплектазная компоненты цикла оксида азота.//Биохимия.1998, т.63, №7., с 874—884.

5. AbuEl-Asrar, A.M., Desmet, S., Meersschaert, A., Dralands, L., Missotten, L., Geboes, K., 2001. Expression of the inducible isoform of nitric oxide synthase in the retinas of human subjects with diabetes mellitus. Am. J. Ophthalmol. 132, 551-556.

6. Agvald P, Adding C, Artlich A, Persson M, Gustafsson L. Mechanisms of nitric oxide generation from nitroglycerin and endogenous sources during hypoxia in vivo. Br J Pharmacol 2002;135:373-382.

7. Arnelle DR, Stamler JS. NO+, NO, and NO- donation by S-nitrosothiols: implications for regulation of physiological functions by S-nitrosylation and acceleration of disulfide formation. Arch Biochem Biophys. 1995 Apr 20;318(2):279-85.

8. Barbour, В. Brew, H., Attwell, D., 1991. Electrogenic uptake, of glutamate: and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina: J. PhysiolL436j 169-193: ' '

9. Barnett, N.L., Pow, DiV., Bull, N.D:,. 2001V Differential- perturbation of neuronal and glial glutamate:;. transport systems- in. retinal ischaemia. Neurocherm Int; 39, 2914299:

10. Barnett, N.E., Osborne,. NvN., 1995. Prolonged-;. bilaterall carotidC artery occlusion induces electrophysiological and iinmunohistochemical changes to the;rat retina without causing histological damage. Exp:Eye Res. .61, 83—90.

11. Beckman JS. The; double-edged role: of nitric oxide: in; brain function and superoxide-mediatedsinjury. JiDev Physiol: 199K Jan; 15(1): 53-9:

12. Beckman? J.S:, Beckman, T.W., Chen J:, Marshall; PiA., Freemam B-AC Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from-nitric oxide and; superoxide. Proc Natl* Acad Sci U Si A. 1990 Feb;87(4): 1620-1624.

13. Bednar,MMi, Kohut, JJ., Kimelberg,T£K.,.Gross,JJ., Gross; G.E., 19921 Im vitro evidence supporting two mechanisms: of action of the anion transport inhibitorL-644,711 in cerebral'ischemia. Neurol: Res. 14; 53-56:

14. Bezzi, P., Carmignoto, G., Pasti, L., Vesce, S., Rossi, D., Rizzini, B.L., Pozzan, Т., Volterra, A., 1998; Prostaglandins stimulate calcium-dependent glutamate release in astrocytes. Nature;391, 281-285.

15. Billups, В., Attwell, D., 1996. Modulation of non-vesicular glutamate release by pH. Nature 379, 171-174.

16. Block, F., Schwarz, M., 1998. The b-wave of the electroretinogram as an index of retinal ischemia. Gen. Pharmacol. 30, 281—287.

17. Block, F., Schwarz, M., Sontag, K.H., 1992. Retinal ischemia induced by occlusion of both common carotid arteries in rats as demonstrated by electroretinography. Neurosci. Lett. 144, 124-126.

18. Bonne, C., Muller, A., Villain, M., 1998. Free radicals in retinal ischemia. Gen. Pharmacol. 30, 275-280.

19. Brandstatter, J.H., Hartveit, E., Sassoe Pognetto, M., Wassle, H., 1994. Expression of NMD A and high-affinity kainate receptor subunit mRNAs in the adult rat retina. Eur. J. Neurosci. 6, 1100-1112.

20. Brown, G.C., 1991. Systemic associations of retinal arterial obstructive disease. Int. Ophthalmol. Clin. 31, 1-14.

21. Buchi, E.R., Suivaizdis, I., Fu, J., 1991. Pressure-induced retinal ischemia in rats: an experimental model for quantitative study. Ophthalmologica 203, 138— 147.

22. Buchi, E.R., Lam, T.T., Suvaizdis, I., Tso, M.O., 1994. Injuries induced by diffuse photodynamic action in retina and choroid of albino rats. Morphologic study of an experimental model. Retina 14, 370-378.

23. Cao WB, Zeng ZP, Zhu YJ, Luo WC, Cai BQ. Inhibition of nitric oxide synthesis increases the secretion of endothelin-1 in vivo and in cultured endothelial cells. Chin Med J (Engl). 1994 Nov;107(l l):822-6.

24. Celebi, S., Dilsiz, N., Yilmaz, Т., Kukner, A.S., 2002. Effects of melatonin, vitamin E and octreotide on lipid peroxidation during ischemia-reperfiision in the guinea pig retina. Eur. J. Ophthalmol. 12, 77-83.

25. Chan, P.H., 1996. Role of oxidants in ischemic brain damage. Stroke 27, 1124-1129.

26. Cheon, E.W., Park, C.H:, Kang, S.S. Cho;, G.L,:Yoo, JM>, Song; Щ., Choi, W.S -, 2003; Cliange: in; endothelial; nitric oxide synthase: in: the rat; retina following transient ischemia. Neurorepoitl4, 329-333;. "-•.' ' f'

27. Choi, D.W., Maulucci Gedde, M., Kriegstein, A.R., 1987. Glutamate neurotoxicity in,cortical cell culture.J". Neurosci; 7, 357—3681 :

28. Chidlow, G., Osborne, N.N., 2003. Rat retinal ganglion cell loss caused by kainate; NMDA and ischemia correlates. with a reduction- in mRNA and protein of Thy-1 and neurofilament light. Brain Res. 963, 298-306.

29. Coleman, P.A., Miller,: R.F., 1988. Do N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic responses in the mudpuppy retina? J. Neurosci. 8, 47284733:

30. Cringle, S.J., Yu, D.Y., Alder, V.A. Su, E.N., 1994. Intravitreal perfluorocarbon and oxygen delivery in induced retinal ischaemia. Adv. Exp. Med. Biol. 361, 303-311.

31. Cuzzocrea S, Riley DP, Caputi AP, Salvemini D. Antioxidant therapy: a new pharmacological approach in shock, inflammation, and* ischemia/reperfusion injuiy. Pharmacol Rev. 2001 Mar; 53(1): 135-59. Review. .'

32. Danton, G.H., Dietrich, W.D., 2003. Inflammatoiy mechanisms after ischemia and stroke. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 127-136.

33. David, P., Lusky, M., Teichberg, V.I., 1988. Involvement of excitatory neurotransmitters in the damage produced in chick embryo retinas by anoxia and extracellular high potassium. Exp. Eye Res. 46, 657-662.

34. Daugeliene, L., Niwa, M., Hara, A., Matsuno, H., Yamamoto, Т., Kitazawa, Y., Uematsu, Т., 2000. Transient ischemic injury in the rat retina caused by thrombotic occlusion-thrombolytic reperfusion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2743-2747.

35. Demoncheaux A, Higenbottam T, Foster P, Borland C, Smith A, Marriott H, Bee D, Akamine S, Davies M. Circulating nitrite anions are a directly acting vasodilator and are donors for nitric oxide. Clin Sci 2002;102:77-83.

36. Doly, M., Braquet, P., Bonhomme, В., Meyniel, G., 1984. Effects of lipid peroxidation on the isolated rat retina. Ophthalmic Res. 16, 292-296.

37. Drejer, J., Benveniste, H., Diemer, N.H., Schousboe, A., 1985. Cellular origin of ischemia-induced glutamate release from brain tissue in vivo and in vitro. J. Neurochem. 45, 145-151.

38. Duffy, S., Mac Vicar, B.A., 1996. In vitro ischemia promotes calcium influx and intracellular calcium release in hippocampal astrocytes. J. Neurosci. 16, 71-81.

39. Duke-Elder, S., Dobree, J.H., 1967. System of Ophthalmology, Vol. X. Diseases of the Retina. CV Mosby, St Louis.

40. Duranski MR, Greer J, Dejam A, Jaganmohan S, Hogg N, Langston W, Patel RP, Yet S, Wang Y, Kevil C, Gladwin M, Lefer D. Cytoprotective effects of nitrite during in vivo ischemia-reperfusion of the heart and liver. J Clin Invest 2005; 115:1232-1240.

41. Ettaiche, M., Fillacier, K., Widmann, C., Heurteaux, C., Lazdunski, M., 1999. Riluzole improves functional recovery after ischemia in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40; 729-736.

42. Feher, J., Antal, M., 1979. Ischemic retinal alterations in cardiac arrest. Ann. Ophthalmol. 11, 909-913.

43. Fern, R., 1998. Intracellular calcium and cell death during ischemia in neonatal rat white matter astrocytes in situ. J. Neurosci. 18; 7232-7243.

44. Flammer, J., Orgul, S., 1998. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 17, 267-289.

45. Foulds, W.S., Johnson, N.F., 1974. Rabbit electroretinogram during recovery from induced ischaemia. Trans. Ophthalmol. Soc. UK 94, 383-393.

46. Fried, E., Amorim, P., Chambers, G., Cottrell, J.E., Kass, I.S., 1995. The importance of sodium for anoxic transmission damage in rat hippocampal slices: mechanisms of protection by lidocaine. J. Physiol. 489, 557-565.

47. Furchgott R, Bhandrakom S. Reactions of strips of rabbit aorta toepin ephrine, isopropylarterenol, sodium nitrite and other drugs. J Pharmacol Exp Ther 1953;108:129-143.

48. Garthwaite, G., Garthwaite, J., 1987. Receptor-linked ionic channels mediate N-methyl-D-aspartate neurotoxicity in rat cerebellar slices. Neurosci. Lett. 83, 241-246.

49. Gaston B, Reilly J, Drazen JM, Fackler J, Ramdev P, Arnelle D, Mullins ME, Sugarbaker DJ, Chee C, Singel DJ, et al. Endogenous nitrogen oxides andbronchodilator S-nitrosothiols in human airways. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Dec 1 ;90(23): 10957-61.

50. Gautier C, van Faassen E,Mikula I,Martasek P, Slama-Schwok A. Endothelial nitric oxide synthase reduces nitrite anions to NO under, anoxia. Biochem Biophys Res Commun 2006;341:816-821.

51. Gehlbach, P., Purple, R.L., 1994. Enhancement of retinal recovery by conjugated deferoxamine after ischemia-reperfusion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 669-676.

52. Geyer, O., Almog, J., Lupu-Meiri, M., Lazar, M., Oron, Y., 1995. Nitric oxide synthase inhibitors protect rat retina against ischemic injury. FEBS Lett. 374, 399—402.

53. Gilgun Sherki, Y., Rosenbaum, Z., Melamed, E., Offen; D., 2002. Antioxidant therapy in acute central nervous system injury: current state. Pharmacol. Rev. 54, 271-284.

54. Goldstein, I.M., Ostwald, P., Roth, S., 1996. Nitric oxide: a review of its role in retinal function and disease. Vision Res. 36, 2979-2994.

55. Green A.R. The pathogenesis and management of essential thrombocythaemia. Haematologica. 1999 Jun;84 Suppl EHA-4:36-9. Review. No abstract available.

56. Green, A.R, Hainsworth, A.H., Jackson, D.M., 2000. GABA potentiation: a logical pharmacological approach for the treatment of acute ischaemic stroke. Neuropharmacology 39, 1483-1494.

57. Grozdanic, S.D., Sakaguchi, D.S., Kwon, Y.H., Kardon, R.H., Sonea, I.M., 2003. Functional characterization of retina and optic nerve after acute ocular ischemia in rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2597-2605.

58. Gwon, J.S., Ju, W.K., Park, S J., Kim, I.B., Lee, M.Y., Oh, S J., Chun, M.H., 2001. The regulatory expression of neuronal nitric oxide synthase in the ischemic rat retina. Neuroreport 12, 3385-3389.

59. Haberecht, M.F., Mitchell; C.K., Lo, G.J., Redburn, D.A., 1997Г Nmethyl-D-aspartate-mediated glutamate toxicity in' the developing rabbit retina. J. Neurosci. Res. 47, 416^26.

60. Hangai, M., Miyamoto, K., Hiroi, K., Tujikawa, A., Ogura, Y., Honda, Y., Yoshimura, N., 1999. Roles of. constitutive nitric oxide synthase in postischemic rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 450-458.

61. Hangai, M., Yoshimura, N., Hiroi, K., Mandai, M., Honda, Y., 1996a. Inducible nitric oxide synthase in retinal ischemia-reperfusion injury. Exp: Eye Res. 63, 501-509.

62. Hangai, M., Yoshimura; N., Honda, Y., 1996b. Increased cytokine gene expression in rat retina following transient ischemia. Ophthalmic Res. 28, 248254.

63. Hankins, M.W., Ikeda, H., 1993. Consequences of transient retinal hypoxia on rod "input to horizontal cells,in the rat retina. Vision Res. 33, 429^-36.

64. Heidinger, V., Dreyfus, H., Sahel, J., Christen, Y., Hicks, D., 1998. Excitotoxic damage of retinal glial cells depends upon normal neuron-glial interactions. Glia23, 146-155.

65. Hernandez, M.R., 2000. The optic nerve head in glaucoma: role of astrocytes in tissue remodeling. Prog. Retin. Eye Res. 19, 297—321.

66. Heidinger, V., Dreyfus, H., Sahel, J., Christen, Y., Hicks, D., 1998. Excitotoxic damage of retinal glial cells depends upon normal' neuron-glial interactions. Glia23, 146-155.

67. Hunter C, Dejam A, Blood A, Shields H, Kim-Shapiro D, Machade R, Tarekegn S, Mulla N, Hopper A, Schechter A, Power G, Gladwin M. Inhaled nebulized nitrite is a hypoxia selective sensitive NO-dependent pulmonary vasodilator. Nat Med 2004; 10:1122-1127.

68. Iadecola, C., 1997. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury. Trends Neurosci. 20, 132-139.

69. Ikeda, M., Nakazawa, Т., Abe, К., Kaneko, Т., Yamatsu, К., 1989. Extracellular accumulation of glutamate in the hippocampus induced by ischemia is not calcium dependent—in vitro and in vivo evidence. Neurosci. Lett. 96, 202-206.

70. Ischiropoulos H, Beckman JS. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: cause, effect, or association? J Clin Invest. 2003 Jan;l 11(2): 163-9.

71. Izumi, Y., Hammerman, S.B., Kirby, C.O., Benz, A.M., Olney, J.W., Zorumski, C.F., 2003. Involvement of glutamate in ischemic neurodegeneration in isolated retina. Vis. Neurosci. 20, 97-107.

72. Johnson, M.A., McPhee, T.J., 1993. Electroretinographic findings in iris neovascularization due to acute central retinal vein occlusion. Arch. Ophthalmol. Ill, 806-814.

73. Johnson, N.F., Grierson, I., 1976. Post-mortem changes in the rabbit retina. A study by light microscopy. Acta Ophthalmol. 54, 529-541.

74. Joo, C.K., Choi, J.S., Ко, H.W., Park, K.Y., Sohn, S., Chun, M.H., Oh, Y.J., Gwag, B.J., 1999. Necrosis and apoptosis after retinal ischemia: involvement of NMDA-mediated excitotoxicity and p53. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 713-720.

75. Ju WK, Lindsey JD, Angert M, Patel A, Weinreb RN. 2008 Glutamate receptor activation triggers OPA1 release and induces apoptotic cell death in ischemic rat retina.Mol Vis. 2008;14:2629-38.

76. Ju, W.K., Gwon, J.S., Kim, K.Y., Oh, S.J., Kim, S.Y., Chun, M.H., 2001. Up-regulated eNOS protects blood-retinal barrier in the L-arginine treated ischemic rat retina. Neuroreport 12, 2405-2409.

77. Ju, W.K., Kim, K.Y., Park, S.J., Park, D.K., Park, C.B., Oh, S.J., Chung, J.W., Chun, M.H., 2000. Nitric oxide is involved in sustained and delayed cell death of rat retina following transient ischemia. Brain Res. 881, 231—236.

78. Jung K.H., Chu К., Ко S.Y., Lee S.T.,"Sinn D.I., Park D.K., Kim J.M., Song E.C., Kim M., Roh J.K; Early intravenous infusion of sodium nitrite protects brain against in vivo ischemia-reperfusion injury. Stroke 2006; 37:2744-2750.

79. Katai, N., Yoshimura, N., 1999. Apoptotic retinal neuronal death by ischemia-reperfusion is executed by two distinct caspase family proteases. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2697-2705.

80. Kimelberg, H.K., Rutledge, E., Goderie, S., Charniga, C., 1995. Astrocytic swelling due to hypotonic or high K+ medium causes inhibition of glutamate and aspartate uptake and increases their release. J. Cereb. Blood Flow Metab. 15,409-416.

81. Kobayashi, M., Kuroiwa, Т., Shimokawa, R., Okeda, R., Tokoro, Т., 2000. Nitric oxide synthase expression in ischemic rat retinas. Jpn. J. Ophthalmol 44, 235-244.

82. Kocur, I., Resnikoff, S., 2002. Visual impairment and blindness in Europe and their prevention. Br. J. Ophthalmol. 86, 716-722.

83. Kozlov A, Constantino G, Sobhian B, Szalay L, Umar F, Nohl H, Bahrami S, Redl H. Mechanisms of vasodilation induced by nitrite instillation in intestinal lumen: Possible role of haemoglobin. Antioxid Redox Signal 2005;7:515-521.

84. Kozlov A, Staniek K, Nohl H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS Lett. 1999 Jul 2;454(l-2): 127-30.

85. Kuriyama, H., Nakagawa, M., Tsuda, M., 2001a. Intracellular Ca2+ changes induced by in vitro ischemia in rat retinal slices. Exp. Eye Res. 73, 365-374.

86. Kuroiwa, S., Katai, N., Shibuki, H., Kurokawa, Т., Umihira, J., Nikaido, Т., Kametani, K., Yoshimura, N., 1998. Expression of cell cycle-related genes in dying cells in retinal ischemic injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 610617.

87. Lam, T.T., 1997. The effect of 3-aminobenzamide, an inhibitor of poly ADP-ribose polymerase, on ischemia/reperfusion damage in rat retina. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 95, 241-252.

88. Lam, T.T., Fu, J., Hrynewycz, M., Tso, M.O., 1995. The effect of aurintricarboxylic acid, an endonuclease inhibitor, on ischemia/ reperfusion damage in rat retina. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 11, 253-259.

89. Lam, T.T., Tso, M.O., 1996. Nitric oxide synthase (NOS) inhibitors ameliorate retinal damage induced by ischemia in rats. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 92, 329-340.

90. Lee, J.Y., Kim, Y.H., Koh, J.Y., 2001. Protection by pyruvate against transient forebrain ischemia in rats. J. Neurosci. 21, 171.

91. Levi, G., Patrizio, M., 1992. Astrocyte heterogeneity: endogenous amino acid levels and release evoked by non-N-methyl-D-aspartate receptor agonists and by potassium-induced swelling in type-1 and type-2 astrocytes. J. Neurochem. 58, 1943-1952.

92. Lewden, O., Garcher, C., Morales, C., Javouhey, A., Rochette, L., Bron, A.M., 1996. Changes of catalase activity after ischemia- reperfusion in rat retina. Ophthalmic Res. 28, 331—335.

93. Li H, Samouilov A, Liu X, Zweier J. Characterization of the magnitude and kinetics of xanthineoxidase catalyzed nitrate reduction. Biochemistry 2003;42:1150-1159.

94. Lipton, P., 1999. Ischemic cell death in brain neurons. Physiol. Rev. 79, 1431-1568.

95. Liu X, MillerM, Joshi M, Thomas D, Lancaster J. Accelerated reaction of nitric oxide with 02 within the hydrophobic interior of biological membranes. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:2175-2179.

96. Lopez-Costa, J.J., Goldstein, J., Saavedra, J.P., 1997. Neuronal and macrophagic nitric oxide synthase isoforms distribution in normal rat retina. Neurosci. Lett. 232, 155-158.

97. Louzada-Junior, P., Dias, J.J., Santos, W.F., Lachat, J.J., Bradford, H.F., Coutinho-Netto, J., 1992. Glutamate release in experimental ischaemia of the retina: an approach using microdialysis. J. Neurochem. 59, 358-363.

98. Lundberg J, Weitzberg E, Benjamin N. Nitrate, bacteria and human health. Nat Rev Microbiol 2004;2:593-602.

99. Lundberg J, Weitzberg E. NO generation from nitrite and its role in vascular control. Arterioscler Thromb Vase Biol 2005;25:915-922.

100. Lundy, E.F., Luyckx, B.A., Combs, D.J., Zelenock, G.B., D'Alecy, L.G., 1984. Butanediol induced cerebral protection from ischemichypoxia in the instrumented Levine rat. Stroke 15, 547-552.

101. Madl, J.E., Burgesser, K., 1993. Adenosine triphosphate depletion reverses sodium-dependent, neuronal uptake of glutamate in rat hippocampal slices. J. Neurosci. 13,4429^444.

102. Maguire, G., Simko, H., Weinreb, R.N., Ayoub, G., 1998. Transportmediated release of endogenous glutamate in the vertebrate retina. Pflugers Arch. 436, 481-484.

103. Maher AR, Milsom AB, Gunaruwan P, Abozguia K, Ahmed I, Weaver RA, Thomas P, Ashrafian H, Born G, James P, Frenneaux M. Hypoxic modulationof exogenous nitrite-induced vasodilation in humans. Circulation 2008;117:670-677.

104. Matsubara, M., Hayashi, N., Jing, Т., Titani, K., 2003. Regulation of endothelial nitric oxide synthase by protein kinase C. J. Biochem. (Tokyo) 133, 773-781.

105. Maynard, K.I., Chen, D., Arango, P.M., Ogilvy, C.S., 1996. Nitric oxide produced during ischemia improves functional recovery in the rabbit retina. Neuroreport 8, 81-85.

106. McDonald, J.W., Silverstein, F.S., Johnston, M.V., 1988. Neurotoxicity of N-methyl-D-aspartate is markedly enhanced in developing rat central nervous system. Brain Res. 459, 200-203.

107. Melena, J., Wood, J.P.M., Osborne, N.N., 1999. Betaxolol, a bl-adrenoceptor antagonist, has an affinity for L-type Ca2+ channels. Eur. J. Pharmacol. 378, 317-322.

108. Millar T, Stevens C, Benjamin N, Eisenthal R, Harrison R, Blake D. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Lett 1998;427:225-228.

109. Mizushima, H., Zhou, С J., Dohi, K., Horai, R., Asano, M., Iwakura, Y., Hirabayashi, Т., Arata, S., Nakajo, S., et al., 2002. Reduced postischemic apoptosis in the hippocampus of mice deficient in interleukin-. J. Сотр. Neurol. 448, 203-216.

110. Mittal C, Arnold W, Murad F. Characterization of protein' inhibitors of guanylate cyclase activation from rat heart and bovine lung. J Biol Chem 1978;253:1266-1271.

111. Modin A, Bjorne H, Herulf M, Alving K, Weitzberg E, Lundberg JO. Nitrite-derived nitric oxide: A possible mediator of 'acidic-metabolic' vasodilation. Acta Physiol Scand 2001;171:9-16.

112. Morgan, I.G., 1983. Kainic acid as a tool in retinal research. In: Osborne, N.N., Chader, GJ. (Eds.), Progress in Retinal Research, Vol. 2. Pergamon Press, Oxford, pp. 249-266.

113. Morgan, J.E., 2000. Optic nerve head structure in-glaucoma: astrocytes as mediators of axonal damage. Eye 14 (Pt 3B), 437^444.

114. Muller, A., Pietri, S., Villain, M., Frejaville, C., Bonne, C., Culcas, M., 1997. Free radicals in rabbit retina under ocular hyperpressure and functional consequences. Exp. Eye Res. 64, 637-643.

115. Mulsch A, Mordvintcev P, Vanin AF, Busse R. The potent vasodilating and guanylyl cyclase activating dinitrosyl-iron(II) complex is stored in a protein-bound form in vascular tissue and is released by thiols. FEBS Lett. 1991 Dec 9;294(3):252-256.

116. Napper, G.A., Kalloniatis, M., 1999. Neurochemical changes following postmortem ischemia in the rat retina. Vis. Neurosci. 16, 1169-1180.

117. Napper, G.A., Pianta, M.J., Kalloniatis, M., 1999. Reduced glutamate uptake by retinal glial cells under ischemic/hypoxic conditions. Vis. Neurosci. 16, 149-158.

118. Nash, M.S., Osborne, N.N., 1999. Assessment of Thy-1 mRNA levels as an index of retinal ganglion cell damage. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 12931298.

119. Nayak, M.S., Kita, M., Marmor, M.F., 1993. Protection of rabbit retina from ischemic injury by superoxide dismutase and catalase. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2018-2022.

120. Neal, M.J., Cunningham, J.R., Hutson, P.H., Hogg, J., 1994. Effects of ischaemia on neurotransmitter release from the isolated retina. J. Neurochem. 62, 1025-1033.

121. Neufeld, A.H., Kawai, S., Das, S., Vora, S., Gachie, E., Connor, J.R., Manning, P.T., 2002. Loss of retinal ganglion cells following retinal ischemia: the role of inducible nitric oxide synthase. Exp. Eye Res. 75, 52 Г—528.

122. Neufeld, A.H., Sawada, A., Becker, В., 1999. Inhibition of nitric-oxide synthase 2 by aminoguanidine provides neuroprotection of retinal ganglion cells in a rat model of chronic glaucoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96,9944-9948.

123. Nishizawa, Y., 2001. Glutamate release and neuronal damage in ischemia. Life Sci. 69,369-381.

124. Ogata, Т., Nakamura, Y., Tsuji, K., Shibata, Т., Kataoka,, К., 1995. A possible mechanism for the- hypoxia-hypoglycemia-induced release of excitatory amino acids from cultured hippocampal astrocytes. Neurochem. Res. 20, 737-743.

125. Olney, J.W., Price, M.T., Salles, K.S., Labruyere, J., Ryerson, R., Mahan, K., Frierdich, G., Samson, L., 1987. L-homocysteic acid: an endogenous excitotoxic ligand of the NMDA receptor. Brain Res. Bull. 19, 597-602.

126. Olney JW, Farber NB. Efficacy of clozapine compared with other antipsychotics in preventing NMDA-antagonist neurotoxicity. J Clin Psychiatry. 1994 Sep;55 Suppl B:43-6. Review.

127. Osborne, N.N., 1999. Memantine reduces alterations to the mammalian retina, in situ, induced by ischemia. Vis. Neurosci. 16, 45-52.

128. Osborne, N.N., Block, F., Sontag, K.H., 1991. Reduction of ocular blood flow results in glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression in rat retinal muller cells. Vis. Neurosci. 7, 637-639.

129. Osborne NN, Chidlow G, Layton CJ, Wood JP, Casson RJ, Melena J. Optic nerve and neuroprotection strategies. Eye. 2004 Nov;18(l l):1075-84. Review.

130. Osborne NN, DeSantis L, Bae JH, Ugarte M, Wood JP, Nash MS, Chidlow G. 1987,Topically applied betaxolol attenuates NMDA-induced toxicity to ganglion cells and the effects of ischaemia to the retina. Exp Eye Res. 1999 Sep;69(3):331-42.

131. Osborne, N.N., Larsen, A.K., 1996. Antigens associated with specific retinal cells are affected by ischaemia caused by raised intraocular pressure: effect of glutamate antagonists. Neurochem. Int. 29, 263-270.

132. Rassaf T, Flo" gel U, Drexhage C, Hendgen-Cotta U, Kelm M, Schrader J. Nitrite reductase function of deoxymyoglobin: Oxygen sensor and regulator of cardiac energetics and function. Circ Res 2007;100:1749-1754.

133. Peachey, N.S., Green, DJ., Ripps, H., 1993. Ocular ischemia and the effects of allopurinol on functional recovery in the retina of the arterially perfused cat eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 58-65.

134. Perlman, J.I., McCole, S.M., Pulluru, P., Chang, С J., Lam, T.T., Tso, M.O., 1996. Disturbances in the distribution of neurotransmitters in the rat retina after ischemia. Curr. Eye Res. 15, 589-596.

135. Peterson, C., Neal, J.H., Cotman, C.W., 1989. Development of Nmethyl- D-aspartate excitotoxicity in cultured hippocampal neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 48, 187-195.

136. Pluta R, Dejam A, Grimes G, Gladwin M, Oldfield E. Nitrite infusions prevent delayed cerebral vasospasm in a primate model of subarachnoid hemorrhage. J Am Med Assoc 2005;293:1477-1484.

137. Poljakovic, M., Nygren, J.M., Persson, K., 2003. Signalling pathways regulating inducible nitric oxide synthase expression in human kidney epithelial cells. Eur. J. Pharmacol. 469, 21-28.

138. Rahmani, В., Tielsch, J.M., Katz, J., Gottsch, J., Quigley, H., Javitt, J., Sommer, A., 1996. The cause-specific prevalence of visual impairment in an urban population. The Baltimore Eye Survey. Ophthalmology 103, 1721-1726.

139. Rassaf T, Flo" gel U, Drexhage C, Hendgen-Cotta U, Kelm M, Schrader J. Nitrite reductase function of deoxymyoglobin: Oxygen sensor and regulator of cardiac energetics and function. Circ Res 2007;100:1749-1754.

140. Rassaf T, Preik M, Kleinbongard P, Lauer T, Heiss C, Strauer B, Feelisch M, Kelm M. Evidence for in vivo transport of bioactive nitric oxide in human plasma. J Clin Invest 2002;109:1241-1248.

141. Recchia, F.M., Brown, G.C., 2000. Systemic disorders associated with retinal vascular occlusion. Curr. Opin. Ophthalmol. 11, 462-467.

142. Rifkind J.M., Nagababu E., Ramasamy S., Ravi L.B. Hemoglobin redox reactions and oxidative stress. Redox Rep. 2003;8(5):234-7. Review.

143. Rios, L., CluzeF, J., Vennat, J.C., Menerath, J.M., Doly, M., 1999. Comparison of intraocular treatment* of DMTU and SOD following retinal ischemia in rats. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 547-556.

144. Romano, C., Price, M., Bai, H.Y., Olney, J.W., 1993. Neuroprotectants in Honghua: glucose attenuates retinal ischemic damage. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 72-80.

145. Rosenbaum, D.M., Rosenbaum; P.S., Gupta, A., Michaelson, M.D., Hall, D.H., Kessler, J.A., 1997. Retinal ischemia leads to apoptosis which is ameliorated by aurintricarboxylic acid. Vision Res. 37, 3445-3451

146. Rosenbaum, D.M., Rosenbaum, P.S., Singh, M., Gupta, G., Gupta, H., Li, В., Roth, S., 2001. Functional and morphologic comparison of two methods to produce transient retinal ischemia in the rat. J. Neuroophthalmol. 21, 62—68.

147. Rossi, D.J., Oshima, Т., Attwell, D., 2000. Glutamate release in severe brain ischaemia is mainly by reversed uptake. Nature 403, 316-321.

148. Roth, S., Osinski, J.V., Park, S.S., Ostwald, P., Moshfeghi, A.A., 1996. Measurement of purine nucleoside concentration in the intact rat retina. J. Neurosci. Methods 68, 87-90.

149. Roth, S., Park, S.S., Sikorski, C.W., Osinski, J., Chan, R., Loomis, K., 1997. Concentrations of adenosine and its metabolites in the rat retina/choroid during reperfusion after ischemia. Curr. Eye Res. 16, 875-885.

150. Rothman, S.M., Olney, J.W., 1995. Excitotoxicity and the NMDA receptor-still lethal after eight years. Trends Neurosci. 18, 57—58.

151. Sabates, R., Hirose, Т., McMeel, J.W., 1983. Electroretinography in the prognosis and classification of central retinal vein occlusion. Arch. Ophthalmol. 101,232-235.

152. Safa, R., Osborne, N.N., 2000. Retinas from albino rats are more susceptible to ischaemic damage than age-matched pigmented animals. Brain Res. 862, 36—42.

153. Sarantis, M., Attwell, D., 1990. Glutamate uptake in mammalian retinal glia is voltage- and potassium-dependent. Brain Res. 516, 322-325.

154. Schwarcz, R., Coyle, J.T., 1977. Kainic acid: neurotoxic effects after intraocular injection. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 16, 141-148.

155. Schwartz-Bloom, R.D., Sah, R., 2001. g-Amino butyric acidA neurotransmission and cerebral ischemia. J. Neurochem. 77, 353-371.

156. Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O., 2001. Inducible nitric oxide synthase mediates the change from retinal to vitreal neovascularization in ischemic retinopathy. J. Clin. Invest 107, 717-725.

157. Sennlaub F, Courtois Y, Goureau O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. J Neurosci. 2002 May 15;22(10):3987-93.

158. Shibuki, H., Katai, N., Yodoi, J., Uchida, K., Yoshimura, N., 2000. Lipid peroxidation and peroxynitrite in retinal ischemia-reperfusion injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 3607-3614.

159. Shimada, N., Graf, R., Rosner, G., Heiss, W.D., 1993. Ischemiainduced accumulation of extracellular amino acids in cerebral cortex, white matter, and cerebrospinal fluid. J. Neurochem. 60, 66-71.

160. Shin, D.H., Lee, H.Y., Kim, H.J., Lee, E., Lee, K.H., Lee, W.J., Cho, S.S., Baik, S.H., 1999. In situlocalization of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) mRNA in the rat retina. Neurosci. Lett. 270, 53-55.

161. Shiva S, Huang Z, Grubina R, Sun J, Ringwood L, MacArthur P, Xu X, Murphy E, Darley-Usmar V, Gladwin M. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circ Res 2007;100:654-661.

162. Shiva S, Wang X, Xu X, Yuditskaya S, Annavaijjhala V. Ceruloplasmin is a NO oxidase and nitrite synthase that determines endocrine NO homeostasis. Nat Chem Biol 2006;2:486-493.

163. Siesjo, B.K., Katsura, K., Kristian, Т., 1996. Acidosis-related damage. Adv. Neurol. 71,209-233.

164. Siliprandi, R., Canella, R., Carmignoto, G., Schiavo, N., Zanellato, A., Zanoni, R., Vantini, G., 1992. N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity in the adult rat retina. Vis. Neurosci. 8, 567-573.

165. Smith, G.G., Baird, C.D., 1952. Survival time of retinal cells when deprived of their blood supply by increased intraocular pressure. Am. J. Ophthalmol. 35, 133-136

166. Spertus, A.D., Slakter, J.S., Weissman, S.S., Henkind, P., 1984. Experimental carotid occlusion: funduscopic and fluorescein angiographic findings. Br. J. Ophthalmol. 68, 47-57.

167. Spiegelhalder B, Eisenbrand G, Preussmann R. Influence of dietary nitrate on nitrite content of human saliva: Possible relevance to in vivo formation of N-nitroso compounds. Food Cosmet Toxicol 1976;14:545-548.

168. Staub, F., Mackert, В., Kempski, O., Peters, J., Baethmann, A., 1993. Swelling and death of neuronal cells by lactic acid. J. Neurol. Sci. 119, 79—84.

169. Stefansson, E., Wilson, C.A., Schoen, Т., Kuwabara, Т., 1988. Experimental ischemia induces cell mitosis in the adult rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29, 1050-1055.

170. Stevens, W.D., Fortin, Т., Pappas, B.A., 2002. Retinal and optic nerve degeneration after chronic carotid ligation: time course and role of light exposure. Stroke 33, 1107—1112.

171. Swanson, R.A., Chen, J., Graham, S.H., 1994. Glucose can fuel glutamate uptake in ischemic brain. J. Cereb. Blood Flow Metab. 14, 1-6.

172. Szabo, M.E., Droy Lefaix, M.T., Doly, M., Braquet, P., 1992. Ischaemia-and reperfusion-induced Na+, K+, Ca2+ and Mg2+ shifts in rat retina: effects of two free radical scavengers SOD and EGB 761. Exp. Eye Res. 55, 39^15.

173. Szabo, M.E., Droy Lefaix, M.T., Doly, M., Carre, C., Braquet, P., 1991. Ischemia and reperfusion-induced histologic changes in the rat retina. Demonstration of a free radical-mediated mechanism. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 1471-1478.

174. Szatkowski, M., Barbour, В., Attwell, D., 1990. Non-vesicular release of glutamate from glial cells by reversed electrogenic glutamate uptake. Nature 348, 443-446.

175. Takamatsu, J., Hirano, A., Levy, D., Henkind, P., 1984. Experimental bilateral carotid artery occlusion: a study of the optic nerve in the. rat. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 10, 423^128.

176. Thoreson, W.B., Witkovsky, P., 1999. Glutamate receptors and circuits in the vertebrate retina. Prog. Retin. Eye Res. 18, 765-810.

177. Tsuchiya K, Kanematsu Y, Yoshizumi M, Ohnishi H, Kirima K, Izawa Y, Shikishima M, Ishida T, Kondo S, Kagami S, Takiguchi Y, Tamaki T. Nitrite is an alternative source of NO in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288:H2163-H2170.

178. Vanin AF. Endothelium-derived relaxing factor is a nitrosyl iron complex with thiol ligands. FEBS Lett. 1991 Sep 2;289(l):l-3.

179. Vanin AF, Malenkova IV, Serezhenkov VA. Iron catalyzes both decomposition and synthesis of S-nitrosothiols: optical and electron paramagnetic resonance studies. Nitric Oxide. 1997 Jun; 1(3): 191-203.

180. Vanin AF, Mordvintcev PI, Hauschildt S, Mtilsch A. The relationship between L-arginine-dependent nitric oxide synthesis, nitrite release and dinitrosyl-iron complex formation by activated macrophages. Biochim

181. Biophys Acta. 1993 May 8;1177(l):37-42.

182. Veriac, S., Tissie, G., Bonne, C., 1993. Oxygen free radicals adversely affect the regulation of vascular tone by nitric oxide in the rabbit retina under high intraocular pressure. Exp. Eye Res. 56, 85-88.

183. Vidal-Sanz, M., Lafuente, M.P., Mayor, S., Miralles de Imperial, J., Villegas-Perez, M.P., 2001. Retinal ganglion cell death induced by retinal ischemia, neuroprotective effects of two alpha-2 agonists. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl. 3), S261-S267.

184. Vleeming W, van de Kuil A, te Biesbeek J, Meulenbelt J, Boink A. Effect of nitrite on blood pressure in anaesthetized and free-moving rats. Food Chem Toxicol 1997;35:615-619.

185. Vorwerk, C.K., Hyman, B.T., Miller, J.W., Husain, D., Zurakowski, D., Huang, P.L., Fishman, M.C., Dreyer, E.B., 1997. The role of neuronal and endothelial nitric oxide synthase in retinal excitotoxicity. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2038-2044.

186. Vorwerk, C.K., Lipton, S.A., Zurakowski, D., Hyman, B.T., Sabel, B.A., Dreyer, E.B., 1996. Chronic low-dose glutamate is toxic to retinal ganglion cells. Toxicity blocked by memantine. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37, 16181624.

187. Wahl, F., Obrenovitch, T.P., Hardy, A.M., Plotkine, M., Boulu, R., Symon, L., 1994. Extracellular glutamate during focal cerebral ischemia in rats: time course and calcium dependency. J. Neurochem. 63, 1003-1011.

188. Wakita, H., Tomimoto, H., Akiguchi, I., Matsuo, A., Lin, J.X., Ihara, M., McGeer, P.L., 2002. Axonal damage and demyelination in the white matter after chronic cerebral hypoperfusion in the rat. Brain Res. 924, 63-70.

189. Webb A, Bond R, McLean P, Uppal R, Benjamin N, Ahluwalia A. Reduction of nitrite to nitric oxide during ischemia protects against myocardial ischemia-reperfusion damage. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:1368313688.

190. Yamamoto, F., Hiroi, K., Honda, Y., 1994. Effects of intravenous superoxide dismutase and catalase on electroretinogram in the cat postischemic retina. Ophthalmic Res. 26, 163-168.

191. Zeevalk, G.D., Bernard, L.P., Sinha, C., Ehrhart, J., Nicklas, W.J., 1998. Excitotoxicity and oxidative stress during inhibition of energy metabolism. Dev. Neurosci. 20, 444-453.

192. Zeevalk, G.D., Nicklas, W.J., 1990. Chemically induced hypoglycaemia and anoxia: relationship to glutamate receptor-mediated toxicity in retina. J. Pharmacol. Exp. Ther. 253, 1285-1292.

193. Zeevalk, G.D., Nicklas, W.J., 1991. Mechanisms underlying initiation of excitotoxicity associated with metabolic inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 257, 870-878.

194. Zhang B, Safa R, Rusciano D, Osborne NN. 2007 Epigallocatechin gallate, an active ingredient from green tea, attenuates damaging influences to the retina caused by ischemia/reperfiision.Brain Res. Jul 23;1159:40-53.

195. Zhang, H., Agardh, C.D., Agardh, E., 1995. Increased catalase levels and hypoxanthine-enhanced nitro-blue tetrazolium staining in rat retina after ischemia followed by recirculation. Curr. Eye Res. 14, 47—54.

196. Zhang Y, Yang W, Tian Z, Yao J. Control over the chirality of (R)-l,l'-bi-2-naphthol dibenzoate in nanoparticles. Talanta. 2005 Sep 15;67(3):520-4. Epub 2005 Jul 19.

197. Zhou, Y., Lindner, L.E., Chiou, G.C., Morgan, K.P., Li, Z., 2000. Transient retinal ischemia-reperfiision in rats. Chin. Med. J. 113, 461^65.

198. Zini, S., Roisin, M.P., Armengaud, C., Ben Ari, Y., 1993. Effect of potassium channel modulators on the release of glutamate induced by ischaemic-like conditions in rat hippocampal slices. Neurosci. Lett. 153, 202205.

199. Zweier JL, Samouilov A, Kuppusamy P. Non-enzymatic nitric oxide synthesis in biological systems. Biochim Biophys Acta. 1999 May 5; 1411 (2-3):250-62. Review.

200. Zweier JL, Wang P, Samouilov A, Kuppusamy P. Enzyme-independent formation of nitric oxide in biological tissues. Nat Med. 1995 Aug;l(8):804-9.