Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Программируемая гибель устьичных клеток гороха

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Программируемая гибель устьичных клеток гороха"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

КИСЕЛЕВСКИЙ Дмитрий Борисович

ПРОГРАММИРУЕМАЯ ГИБЕЛЬ УСТЬИЧНЫХ КЛЕТОК ГОРОХА

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор В.Д.Самуилов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Р.А.Звягильская

кандидат биологических наук в.н.с. Б.В.Черняк

Ведущая организация:

Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Защита состоится 17 марта 2005 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан 17 февраля 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова

Актуальность проблемы. Гибель клеток может быть непрограммируемой, неконтролируемой (некроз) и программируемой (программируемая клеточная смерть - ИКС). ПКС играет важную роль в реализации программы развития в онтогенезе и поддержании тканевого го-меостаза организма. Являясь важной составляющей иммунитета, ПКС вовлечена в защитные реакции животных и растений на инфекционных возбудителей. Многое известно о механизмах ПКС у животных и человека. У растений механизмы клеточной гибели изучены в меньшей степени, однако имеющиеся данные свидетельствуют о наличии универсальных сигнальных путей и механизмов гибели клеток животных, растений и грибов. Важную роль в ПКС играют биоэнергетические структуры клетки. Дыхательная цепь митохондрий животных является одним из источников активных форм кислорода (АФК, Boveris and Chance, 1973), вызывающих клеточную гибель (Скулачев, 2000). При апоптозе у животных из митохондрий в цитоплазму переходит ряд факторов белковой природы: цитохром с, флавопротеин AIF, Smac/DIABLO, эндо-нуклеаза G (Ravagnan et al., 2002). Известна их роль в апоптозе. Актуально выяснение участия АФК, митохондрий и хлоропластов в ПКС у растений. Перед исследователями возникают разные вопросы. Оказывают ли АФК такое же губительное действие в клетках растений, как у животных? Какую роль играют митохондрии в ПКС у растений? Аналогична ли она участию митохондрий в апоптозе клеток животных? Хлоропласта, уникальные структуры, присущие только растениям, имеют структурное, функциональное и филогенетическое родство с митохондриями. Участвуют ли они в ПКС у растений?

Цель и задачи работы. Цель работы - исследование программируемой гибели устьич-ных клеток листьев гороха.

Задачи:

1. Исследовать CN" в качестве индуктора программируемой гибели устьичных клеток из листьев гороха.

2. Исследовать влияние анаэробиоза, антиоксидантов, состояния фотосинтетической и дыхательной электронтранспортных цепей, ингибиторов протеинкиназ и протеаз на CN~-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток.

3. Исследовать влияние деэнергизации клетки на состояние ядер устьичных клеток.

4. Исследовать действие ингибиторов синтеза белка на рибосомах цитоплазмы и рибосомах митохондрий и хлоропластов на состояние ядер устьичных клеток.

5. Выявить вклад различных АФК в С^индуцированное разрушение ядер устьичных клеток.

Научная новизна работы. Исследована О^нндуцированная гибель устьичных клеток в пленках эпидермиса из листьев гороха. Полученные данные позволяют идентифицировать ее как одну из форм ПКС - апоптоз. Гибель клеток стимулируется при освещении. Выявлена зависимость CN'-индуцированнош апоптоза устьичных клеток от АФК. Данные, полученные с применением различных акцепторов электронов и ингибиторов фотосинтеза и дыхания, позволяют заключить, что апоптоз устьичных клеток регулируется редокс-состоянием хинонов фотосинтетической и дыхательной электронтранспортных цепей: восстановленный пластохинон хлоропластов стимулирует, а митохондриальный убихинон, по-видимому, подавляет ПКС. Предполагается, что восстановленный пластохинон активирует протеинкиназы, инициирующие программу гибели устьичных клеток. Ингибиторы протеинкиназ и протеаз предотвращают действие CN". Деэнергизация устьичных клеток ингибитором гликолиза и разобщителем окислительного и фотосинтетического фосфорилирования индуцирует апоптоз. Уровень деэнергиза-ции способен, по-видимому, определять тип гибели устьичных клеток (апоптоз или некроз). Исследовано действие ингибиторов синтеза белка на С^индуцированное разрушение ядер. Данные показывают, что белки, синтезируемые в цитоплазме, по-видимому, предохраняют клеточное ядро от С№-индуцированного разрушения, тогда как белки, синтезируемые в митохондриях и хлоропластах, напротив, способствуют разрушению ядра. Вклад хлоропластного и ми-тохондриального белкового синтеза в ПКС устьичных клеток различается. Из исследованных нами форм активного кислорода вклад в С№-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток вносят супероксидный анион-радикал (Ог), Н2О2 и гидроксильный радикал (ОН), но не синглетный кислород ('Ог).

Практическое значение работы. Результаты работы расширяют представления об участии биоэнергетических систем клетки и активных форм кислорода в программируемой гибели клеток растений. Они могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по клеточной биологии, цитологии, биоэнергетике, физиологии растений и биохимии. В перспективе, поскольку ПКС играет важную роль в фитоиммунитете, исследования в этой области могут способствовать созданию новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам.

Апробация работы. Результаты работы доложены на международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2000), международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001), V Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2001), международных курсах «Свободные

радикалы, оксид азота и воспаление: молекулярные, биохимические и клинические аспекты» (Турция, Анталия, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), VIII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004), Ш съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на заседании Московского биоэнергетического семинара, возглавляемого академиком В.П.Скулачевым (Москва, 2004), на стендовой сессии школы-семинара «Свободные радикалы и заболевания: экспрессия генов, клеточный метаболизм и патофизиология» (Греция, о. Спетсес, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 128 страницах, иллюстрирована 30 рисунками и 3 таблицами.

В обзоре литературы изложены современные представления о ПКС у растений, роли АФК и связи процесса ПКС с биоэнергетикой клетки.

Список литературы содержит 209 источников.

Объекты и методы исследования

Объект исследования. Объект исследования - устьичные клетки листьев гороха (Pisum sativum L), сорта Альфа. Горох выращивали методом гидропоники при круглосуточном освещении люминесцентной лампой (интенсивность света -1000 лк, температура 20-24°). В экспериментах использовали 8- 17-суточные проростки гороха. С помощью пинцета отделяли нижний (абаксиальный) эпидермис листьев, состоящий из эпидермальных и устьичных клеток. Устьичные клетки, в отличие от эпидермальных, содержат не только митохондрии, но и хлоро-пласты. Пленки эпидермиса помещали в полистирольные культуральные планшеты и инкубировали в дистиллированной воде.

Инфильтрация и инкубация с реагентами. Для обеспечения быстрого проникновения реагентов в клетки использовали метод инфильтрации путем вакуумирования. Эпидермальные пленки инкубировали в растворе реагентов при 5-8 мм Hg в течение 1 мин. Дальнейшую инку-

бацию клеток проводили в темноте или на свету в зависимости от задач эксперимента. Образцы освещали люминесцентной лампой, интенсивность света ~ 1000 лк.

Анаэробные условия создавали с помощью глюкозооксидазной (1) и каталазной (2) реакций:

глюкоза + О2 -» глюконовая кислота + Н2О2, (О

Добавляли 50 мМ глюкозы, 0,06 мг/мл каталазы, на поверхность раствора наслаивали рафинированное подсолнечное масло (3-5 мм толщиной). Затем в водную фазу вносили 0,1 мг/мл глюкозооксидазы, образцы преинкубировали в этих условиях 30 мин, затем в водную фазу вносили реагенты. Тестирование, проведенное методом полярографии, показало, что данные условия приводят к быстрому исчерпанию кислорода.

Оксиметрия. Дыхание и фотосинтез измеряли оксиметрически с применением закрытого электрода Кларка. В полярографическую ячейку с 10 мМ HEPES-NaOH, рН 7,0 и 25 мМ КС1 помещали нарезки листьев гороха и инкубировали на магнитной мешалке. Напряжение на электроде - 0,65 В. Образцы освещали светом от лампы накаливания. Свет пропускали через слой воды толщиной 6 см в качестве теплового фильтра. Интенсивность действующего света составляла -0,1 Вт/см2. Электрический сигнал от электрода Кларка регистрировали на компьютере через аналого-цифровой преобразователь с помощью программы, разработанной А.В.Киташовым.

Фиксация объекта, окрашивание и оптическая микроскопия. После инкубации с реагентами эпидермальные пленки исследовали с помощью световой микроскопии. Для этого образцы обрабатывали 5 мин фиксатором Батталья (этанол, хлороформ, уксусная кислота, 40%-ный формалин в соотношении 5:5:1:1), затем отмывали от фиксатора 15 мин в этаноле и 5 мин в дистиллированной воде. Для наблюдения за состоянием ядерного аппарата клетки окрашивали ядерным красителем гематоксилином Карацци в течение 30 мин. Для приготовления красителя последовательно смешивали 0,5 г гематоксилина, 25 г KA1(S04)2'12H20, 100 мл глицерина, 400 мл Н2О, 0,1 г KJ и инкубировали при освещении в открытой колбе в течение 2 недель. После отмывки образцов от красителя водой, их исследовали на световом микроскопе Carl Zeiss LABOVAL-4. Определяли долю клеток с разрушенными ядрами. Для этого проводили подсчет не менее 300-500 клеток в каждом из вариантов опыта. Опыты проводили в 3-4 повторностях. На диаграммах представлены среднеарифметические данные (доля клеток с разрушенными ядрами по отношению к общему числу клеток) с указанием доверительных интервалов.

Флуоресцентная микроскопия. Для наблюдения за генерацией АФК в устьичных клетках использовали флуоресцентную микроскопию. Эпидермальные пленки окрашивали флуоресцентным зондом 2,7-дихлорфлуоресциндиацетатом в течение 20 мин. Этот краситель, про-

никая в клетку, деацилируется при участии внутриклеточных эстераз и окисляется АФК (преимущественно Н2О2), превращаясь в интенсивно флуоресцирующий 2,7-дихлорфлуоресцеин с максимумами возбуждения и испускания флуоресценции соответственно при 495 и 523 нм. После отмывки от красителя препараты исследовали на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss AXIOVERT200M.

Результаты и их обсуждение

CN~ как индуктор гибели клеток. CN" - индуктор апоптоза у растений (Ryerson and Heath, 1996; Wang et al., 1996). В клетках растений цианид подавляет активность цитохром с-оксидазы в митохондриях и рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы в хлоропластах. Однако фотосинтетическая и дыхательная электронтранспортные цепи (ЭТЦ) не перестают функционировать. По данным оксиметрии (рис. 1, линия 1), ротенон, ингибитор комплекса I дыхательной цепи, не оказывал влияния на поглощение кислорода. При добавлении CN" дыхание также не прекращается. В условиях подавления цианидом цитохром с-оксидазы, перенос электронов на кислород осуществлялся через альтернативную оксидазу, ингибитором которой являлся бензилгид-роксамат.

Включение света вызывало выделе-пие кислорода, которое прекращалось при добавлении CN" (рис. 1, линии 2, 3). Последующее включение реакции Хилла добавлением искусственных акцепторов электронов 'бензохи-нона в комбинации с

феррицианидом вновь приводило к фотосинтетическому выделению О2 (рис. 1, линия 2), которое подавлялось 3-(3',4'-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевиной (DCMU), ингибитором переноса

Рис. 1. Действие KCN на поглощение и выделение 02 нарезками из листьев (НЛ) гороха. Возраст проростков гороха - 10 суток, вакуумирование - 1 мин, среда инкубации - 10 мМ HEPES-NaOH, pH 7,0, 25 мМ KCl, 30 мг/1,5 мл НЛ, Вк и Вык - включение и выключение света соответственно. Добавки: 2,5 мМ KCN, 50 мкМ ротенона, 10 мМ бензилгидроксамата (БГ), 100 мкМ п-бензохинона (БХ), 3 мкМ феррицианида калия (FeCy), 10 мкМ диу-рона (DCMU), 50 мкМ пролилгаллата (ПГ). 5 мМ метилвиологена (MB)

электронов между первичным (QA) И вторичным (QB) хинонами в фотосистеме (ФС) II На фоне DCMU наблюдалось дыхание с участием альтернативной оксидазы, которое подавлялось пропил галлатом

Метилвиологен, восстанавливаясь ФС I, самопроизвольно окисляется Ог с образованием Ог, что в присутствии CN" на свету регистрируется как увеличение скорости поглощения кислорода (рис 1, линия 3) DCMU, ин-

' к

гибируя ФС И, по-давлят поглощение Ог Остаточное поглощение О2 на фоне CN" и DCMU с участием альтернативной оксидазы

Рис. 2. Данные световой микроскопии эпидермальных и устьичных клеток ли- подавлялось про-стьев гороха, после инкубации с CN" А - без добавок, Б, В - с KCN Возраст пилгаллатом Дан-проростков гороха - 12 суток вакуумирование - 1 мин инкубация 20 ч в тем- ные показывают ноте и на свету, препараты окрашивали ядерным красителем гематоксилином Добавки 2 5 мМ KCN

Ц ния CN~ ФС II, 6,/-ЦИТ0Хр0МНЫЙ комплекс и ФС I хлоропластов сохраняют способность к транспорту электронов

Таким образом, при обработке цианидом, ЭТЦ митохондрий и хлоропластов продолжают функционировать В митохондриях перенос электронов на кислород осуществляется с помощью альтернативной оксидазы В хлоропластах возможен циклический перенос электронов при участии ФС I и комплекса и псевдоцик-

лический перенос электронов (цикл «вода-вода», Asada, 1999)

центной (Б) микроскопии эпидермальных и Цианид ингибирует активность каталазы и устьичных клеток листьев гороха Возраст

что после добавле-

20 мкм

Рис. 3. Данные световой (А) и флуорес-

проростков гороха - 12 суток, препараты инкубировали с 20 мкМ 2,7-дихлорфлуо-ресциндиацетата - 20 мин

пероксидаз, ответственных за нейтрализацию Н2О2

" являющихся важнейшими компонентами анти-оксидантной защиты клеток Цианид вызывал

разрушение ядер устьичных клеток в пленках эпидермиса из листьев гороха, что является критерием клеточной гибели (рис. 2). При действии цианида в устьичных клетках наблюдалась фрагментация ядер - признак апоптоза. По данным электронной микроскопии, полученным нами совместно с Л.Е.Бакеевой и Е.В-Дзюбинской, СМ" вызывал конденсацию и маршнацию хроматина, вакуолизацию цитоплазмы и изменение ультраструктуры митохондрий и хло-ропластов. Такие изменения ультраструктуры клеток характерны для апоптоза. С помощью флуоресцентной микроскопии наблюдали за изменением флуоресценции АФК-чувствительного красителя в образце. Отмечено, что флуоресценция ЭСБ в хло-ропластсодержащих устьичных клетках была гораздо интенсивнее, чем в окружающих их эпидермаль-ных клетках, не имеющих хлоропластов (рис. 3). Это может свидетельствовать о вкладе хлоро-пластов в генерацию АФК. С>Г-Индуцированное разрушение ядер усиливалось при освещении (рис. 4).

Влияние антиоксидантов, анаэробиоза, состояния фотосинтетической и дыхательной ЭТЦ, ингибиторов протеинкиназ и протеаз на CN'-индуцированное разрушение ядер. Было исследовано действие антиоксидантов на С>Г-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток. Данные, представленные в таблице 1 показывают, что липидорастворимый антиокси-дант а-токоферол предотвращает разрушение ядер, вызванное цианидом в темноте и на свету. Маннитол, являющийся ловушкой для гидроксильного радикала, предотвращает СМ~-индуцированное разрушение ядер на свету. Сорбитол, не обладающий антиоксидантными свойствами и взятый в качестве контроля, не оказывал влияние на разрушение ядер устьичных клеток, индуцированное цианидом. Анаэробные условия эффективно предотвращают СМ~-индуцированное разрушение ядер на свету и в темноте (табл. 1). Таким образом, ОГ-индуцированная гибель устьичных клеток опосредована АФК.

Подобно метилвиологену, менадион способен образовывать Ог", восстанавливаясь ФС II, ¿(¡/^ЦИТОХромным комплексом и ФС I хлоропластов. Добавление этих соединений вызывает генерацию АФК, однако метилвиологен и менадион не усиливали, а предотвращали разрушение

100-

0 6 12 18 24

Время, ч

Рис. 4. СГГ-Индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, в темноте и на свету. Возраст проростков гороха - 12 суток, вакуумирование с 2,5 мМ КСЫ - 1

Таблица 1. Влияние антиоксидантов, анаэробиоза, акцепторов электронов, ингибиторов переноса электронов и ингибиторов протеинкиназ и протеаз на CN'-индуцированное разрушение ядер в устьичных клетках из листьев гороха в темноте и на свету

Условия

Разрушение ядер, % Темнота Свет

Аэробиоз 33,5 ± 3,7 84,7 ±4,5

Аэробиоз (48 ч)* 62,9 ± 9,3 100

Аэробиоз + а-токоферол 0 23,5 ± 2,3

" + маннитол - 0

+ сорбитол - 83,9 ±2,3

Анаэробиоз 0 0

Аэробиоз + метилвиологен 0 0

+ менадион 3,1 ±2,5 7,0 ±2,4

+ БХ 0* 8,5 ±1,9

" +ДАД 0* 10,0 ±3,6

+ ТМФД 1,5 ±1,3* 6,6 ±1,2

" +ДФИФ 12,4 ± 1,5* 19,5 ±3,0

Анаэробиоз + МВ 0 О

Аэробиоз + ОСМи 31,4 ±3,8 24,3 ±3,0

" +ОЫР-1ЫТ 30,7 ± 7,8 11,4 ± 1,7

" + стигмателлин (1) 31,7 ±5,5 15,0 + 3,5

" + стигмателлин (2) 31,4 ± 11,2 13,1 ± 4,4

+ стауроспорин 3,9 ±4,1 18,2 ±4,7

+ МЕМ 0 0

" + 1А - 0

" + РМ8Р _ 20,9 ±7,1

клеточных ядер, индуцированное цианидом (табл. 1). Такое же действие оказывали другие акцепторы электронов в реакции Хилла (и-бензохинон, диаминодурол,

М,М,М',М'-тетраметил-я-фенилен-диамин, 2,6-дихлорфенолиндофе-нол), которые, в отличие от метил-виологена и менадиона, не окисляются Ог самопроизвольно. Ме-тилвиологен не оказывал эффекта на предотвращение СК~-инду-цированного разрушения ядер в условиях анаэробиоза (табл. 1).

DCMU предотвращал С^-индуцированное разрушение ядер на свету и не оказывал влияния в темноте (табл. 1). Разрушение ядер на свету также предотвращалось динитрофениловым эфиром йод-нитротимола и стигмателлином, ингибиторами окисления пласто-хинона Бе8-протеином Риске в Ь$/~ цитохромном комплексе хлоропла-стов.

Возраст проростков 8-16 суток, образцы преинкубировали со стауроспорином, Ы-этилмалеимидом (ЫЕМ), йодацетамидом (1А) и фенилметилсульфонилфторидом (РМБР) 1 ч до добавки СЫ", с другими соединениями - 20-30 мин. Инкубация 21-23 ч или 48 ч (*). Преинкубация в анаэробных условиях (до добавки СЫ") -1ч. Знак (-) показывает, что эксперимент не проводился. Все испытанные соединения и анаэробиоз не вызывали разрушения ядер в отсутствие СЫ~. Добавки: 2,5 мМ ЫаСЫ или КСЫ, 0,1 мМ а-токоферола, 125 мМ маннитола и сорбитола, 5 мМ метилвиологена, 0,1 мМ менадиона, л-бензохинона (БХ), диаминодурола (ДАД), МДМ'.КГ-тетраметил-л-фенилендиамина (ТМФД), и 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДФИФ), 0,01 мМ 0СМ11 и ЭИР-ИМТ, 0,005 мМ стигмателлина (1), 0,02 мМ стигмателлина (2), 0,0025 мМ стауроспорина, 1 мМ ЫЕМ, 10 мМ 1А, 0,5 мМ РМЭР

Известно, что ПКС у животных и растений, как и многие другие процессы в клетках, регулируется протеинкиназами (Ren et al., 2002). Протеазы часто играют роль основных исполнителей программы клеточной гибели, разрушая белковые компоненты клеток. Важную функцию в апоптозе клеток животных выполняет особое семейство цистеиновых протеаз - каспазы (Chang and Yang, 2000). Показано, что ферменты, подобные каспазам, участвуют в ПКС у растений (Chichkova et al., 2004). Ингибитор протеинкиназ стауроспорин, ингибиторы цистеино-вых протеаз N-этилмалеимид и йодацетамид, ингибитор сериновых протеаз фенилметилсуль-фонилфторид, хотя и не обладают высокой специфичностью, тем не менее подавляли разрушение ядер устьичных клеток (табл. 1). Это свидетельствует об участии протеаз и протеинкиназ в программируемой гибели устьичных клеток.

По результатам, представленным в таблице 1, сопоставлены данные о возможности образования АФК, предполагаемом состоянии пластохинона ЭТЦ хлоропластов и наблюдаемом разрушении ядер (табл. 2). Эти данные показывают, что программируемая гибель устьичных клеток зависит от АФК и редокс-состояния пластохинона на участке о 6/-цитохромного комплекса. При совместном действии этих факторов (АФК + восстановленный пластохинон) ПКС реализуется с максимальной эффективностью (табл. 2).

Таблица 2. Условия, необходимые для CN'-индуцированного разрушения ядер в устьичных клетках из листьев гороха на свету

Условия АФК Предполагаемое состояние PQ на участке Qo W-цитохромного комплекса Разрушение ядер

Аэробиоз + Восстановление + .

" + антиоксиданты - Восстановление -

Анаэробиоз - Восстановление -

Аэробиоз + акцепторы электронов + Окисление -

Анаэробиоз + метилвиологен - Окисление -

Аэробиоз + 0СМ11 + Окисление -

+ ОЫР-И«" + Вытеснение -

" + стигмателлин + Вытеснение -

Данные о разрушении ядер взяты из табл 1

Как редокс-состояние пластохинона хлоропластов может регулировать ПКС? По данным литературы известно, что в клетках растений есть протеинкиназы, активирующиеся на свету (^эИтап, 2001). Их активатором является восстановленный пластохинон. При подавлении цианидом 1,5-рибулозобисфосфаткарбоксилазы, компоненты фотосинтетической ЭТЦ, включая

100

80

£ а а>

к 60

а

3 40

20

Ш Темнота □ Свет

пластохинон, переходят в восстановленное состояние. Предполагается следующая регуляция ПКС пластохиноном (Рр) хлоропластов: свет + СЫ" —> Р(2Нг активация протеинкиназ -> ПКС.

Ротенон, ингибитор комплекса I дыхательной цепи митохондрий, не оказывал воздействия на СЫ~-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в темноте (рис. 5). Митохондрии

растений обладают способностью использовать в качестве донора электронов МЛО(Р)И в обход комплекса I дыхательной цепи, функционируют альтернативные дегидрогеназы, восстанавливающие уби-хинон ^еёстапё ИшЪасЬ, 1995; 2000).

Альтернативная оксидаза митохондрий растений обладает антиоксидантной функцией (МсШюбЬ е1 а1., 1998). Ее нарушение повышает уровень АФК в клетке. Было исследовано влияние ингибитора альтернативной оксидазы бензилгидроксамата и ее активатора пирувата на разрушение ядер устьичных клеток в темноте. Пируват, в отличие от бензилгид-

1

/ #

4 4

/ //

,г, > *

Рис. 5. Влияние ротенона (Рот), бензилгидроксамата (БГ) и пирувата (Пир) на СМ" -индуцированное разрушение ядер усть-

Роксшата, сам по себе вызывал небольшое разрушение ядер (рис. 5). В комбинации с СМ" бензилгидрок-1,Щ.. >Лслеток в эпидермисе, изолирован- самат снижал, а пируват усиливал деградацию ядер ном из листьев гороха, в темноте Возраст

клеток, т.е. активация альтернативной оксидазы сти-

проростков гороха - 7-17 суток, вакууми-

_ _ _, „ мулировала ПКС. Вероятно, подобный эффект сле-

рование с Рот, БГ и Пир -1 мин, преинку- ' " " ' т*

бация - 30 мин, добавление КСМ, вакуу- ДУ" связывать с переходом митохондриального уби-

мирование - 1 мин, инкубация - 18-22 ч хинона (Ир) из восстановленной формы (при дейсг-

Добавки 2,5 мМ КСМ, 50 мкМ Рот, 5 мМ вии СМ- ш дыхательную ЭТЦ) в окисленную при БГ, 5 мМ Пир

действии альтернативной оксидазы. Показано, что восстановленный убихинон является антиоксидантом (Л11еуа е1 а1., 2001), следовательно, снижение его концентрации может способствовать гибели клеток.

Деэнергизация вызывает разрушение ядер устьичных клеток. ПКС является активным процессом и требует энергетического обеспечения. Существуют данные о подавлении апоптоза в условиях энергетического дефицита. Однако нарушения в энергообеспечении (снижение внутриклеточной концентрации АТР) также могут являться причиной индукции ПКС (Ьуишот е1 а1., 2004). На протяжении 4 суток инкубации разрушение ядер устьичных клеток в контроле (без добавок) оставалось незначительным в темноте и на свету (рис. 6). Добавление

глюкозы предотвращало разрушение ядер, вызванное длительной инкубацией. 2-Дезоксиглюкоза, конкурентный ингибитор гликолиза, и разобщитель окислительного и фотосинтетического фосфорилирования л<-хлоркарбонилцианидфенилгидразон индуцировали

разрушение ядер в темноте после 2 суток инкубации и на свету после 4 суток инкубации. При совместном действии ингибитора гликолиза и разобщителя, разрушение ядер было ниже, чем при действии их, взятых отдельно.

Данные показывают, что деэнергизация растительных клеток вызывает ПКС. На свету растения имеют больше возможностей по энергообеспечению клеток, чем в темноте, поэтому, вероятно, освещение снижало действие 2-дезокси-глюкозы и .м-хлоркарбо-

100-

80'

® 5 60

Ф

3 40

20

■ Темнота □ Сеет

U

$

1 сут 2 сут 1 4 сут

Рис. 6. Влияние глюкозы (Гл), 2-дезоксиглюкозы (ДГ) и м-хлоркарбонилцианидфенилгидразона (ХКФ) на разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, в темноте и на свету Возраст проростков гороха - 11 суток, взкуумировэние - 1 мин, время инкубации указано на рисунке Добавки 10 мМ Гл, 10 мМ ДГ, 10 мкМ ХКФ

нилцианидфенилгидразона. Более низкий уровень разрушения ядер при их совместном действии, по-видимому, объясняется переключением с одного типа гибели (ПКС) на другой, непрограммируемый (некроз), при котором ядра погибших клеток остаются неразрушенными. Известно, что уровень АТР в клетках способен регулировать тип клеточной гибели. Так, при сравнительно небольшом снижении внутриклеточной концентрации АТР клетки животных погибают через апоптоз, а при более сильном понижении уровня АТР - через некроз (Leist et al., 1997; Izyumov et al., 2004).

Ингибиторы синтеза белка и разрушение ядер устьичных клеток. Программируемая гибель клеток чувствительна к ингибиторам синтеза белка. Нами были использованы циклогек-симид, ингибитор синтеза белка на цитоплазматических рибосомах эукариот, и линкомицин, ингибитор синтеза белка в митохондриях и хлоропластах.

СК"-Индуцированное разрушение ядер усиливалось циклогексимидом (рис. 7). Действие циклогексимида проявлялось как в темноте, так и на свету. Линкомицин, напротив, подавлял GST-индуцированный апоптоз. В темноте действие линкомицина было выражено в большей

степени, чем на свету. Линкомицин снижал действие СМ" и СМ" в комбинации с циклогексими-дом на свету и полностью предотвращал их действие в темноте (рис. 7).

Рисунок 8 показывает, что СК"-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в освещенных эпидермальных пленках возрастает с увеличением концентрации циклогексимида (10-500 мкМ) и снижается с увеличением концентрации линкомицина (0,05-2 мМ).

В отличие от циклогексимида, линкомицин и комбинация линкомицина и циклогексимида сами по себе (в отсутствие СМ") вызывали небольшое разрушение ядер устьичных клеток (до 10-15%) после инкубации эпидермальных пленок в течение 20 ч (рис. 7). Дальнейшая инкубация эпидермальных пленок не ведет к значительному разрушению ядер в присутствии линко-мицина или его комбинации с циклогексимидом, тогда как с циклогексимид сам по себе вызывает почти 100%-ное разрушение ядер через 48 ч на свету и через 72 ч в темноте (рис. 9).

Данные показывают, что ингибиторы синтеза белка в цитоплазме, митохондриях и хлоропластах оказывают различное действие на апоптоз клеток растений: цикло-гексимид усиливал, а линкомицин подавлял СМ~-индуцированное разрушение ядер в устьичных клетках гороха. Это свидетельствует о том, что программируемая гибель устьичных клеток зависит от комбинированного действия белков, синтезируемых как в цитоплазме, так и в митохондриях или хлоропластах. Белки, синтезируемые в цитоплазме, по-видимому, предохраняют клеточное ядро от СМ~-индуцированного разрушения, тогда как белки, синтезируемые в митохондриях и хлоропластах, напротив, способствуют разрушению ядра.

100

80-

о к 60

3.40 £

20-

■ Темнота □ Свет

и ш.

а

24ч 48ч 72ч

Рис. 9. Разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, в зависимости от времени инкубации с циклогексимидом (ЦГИ) и линкомицином (ЛМ) в темноте и на свету. Возраст проростков гороха - 14 суток, вакуумирование - 1 мин, время инкубации указано на рисунке. Добавки: 0,2 мМ ЦГИ, 2 мМ ЛМ

Линкомицин снижал действие циклогексимида на свету и полностью предотвращал его действие в темноте (рис. 7), что свидетельствует о различном вкладе митохондриального и хло-ропластного синтеза белка в ПКС устьичных клеток.

Вклад различных АФК в разрушение ядер устьичных клеток. Полученные данные (табл. 1) показывают, что программируемая гибель устьичных клеток гороха, индуцированная СЖ~, зависит от АФК. Какие АФК наиболее губительны, вносят наибольший вклад в разрушение ядра? Каковы источники образования АФК? Были испытаны различные соединения стимулирующие или подавляющие образование различных форм активного кислорода: Ог', Н2О2, ОН' и синглетный кислород ('СЬ).

Как уже отмечалось, метилвиологен и менадион являются индукторами образования 01 в клетках. Скорость образования Ог' в клетках после добавления этих соединений довольно высока (для метилвиологена об этом можно судить из рис. 1, линия 3). Однако метилвиологен и менадион, в отличие от цианида, не являлись индукторами гибели устьичных клеток в темноте и на свету. Метилвиологен и менадион предотвращали разрушение ядер, вызванное СЫ~ (табл. 1 ирис. 10).

Рис. 10. Влияние метилвиологена (МВ) и мена-диона на С1\Г-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, в темноте и на свету Возраст проростков гороха - 12 суток, вакуумирование с МВ и менадионом - 1 мин, преинкубация - 30 мин, добавление КСЫ, вакуумирование — 1 мин, инкубация - 22 ч Добавки 2,5 мМ КСЫ, 5 мМ МВ, 100 мкМ менадиона

Рис. 11. Влияние нитросинего тетразолия (НСТ) на CN'-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, на свету Возраст проростков гороха - 14 суток, ваку-умирование с НСТ - 1 мин, преинкубация - 30 мин, добавление KCN, вакуумирование - 1 мин, инкубация - 23 ч Добавки 2,5 мМ KCN, 0,5 мМ НСТ НСТ

Рис. 12. Влияние пероксида водорода (Н2О2) на С"-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, в темноте Возраст проростков гороха - 8 суток, вакуумирование с Н2О2 - 1 мин, преинкубация с Н2О2 - 30 мин, добавление КСЫ, инкубация -17 ч Добавки 2,5 мМ КСЫ, Н2О2

Рис. 13. Влияние пероксида водорода (Н2О2) на СЫ'-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, на свету Возраст проростков гороха - 18 суток, вакуумирование с Н2О2 - 1 мин, преинкубация с Н2О2 - 30 мин, добавление КСЫ, инкубация -14 ч Добавки 2,5 мМ КСЫ, Н2О2

Нитросиний тетразолий является ловушкой для (V, восстанавливается им до формазана. Сам по себе он не вызывал заметной деградации ядер и предотвращал СЬГ-индуцированное разрушение ядер на свету (рис. 11).

Было испытано действие Н2О2 на CШ'-индуцированное разрушение ядер в устьичных клетках в темноте (рис. 12) и на свету (рис. 13). Сам по себе пероксид водорода не вызывал разрушения ядер даже в концентрациях 10-50 мМ. В комбинации с цианидом Н2О2 в низких концентрациях (10 мкМ и выше) значительно стимулировал С>Г-индуцированное разрушение ядер

в темноте и на свету. 1001

ВО'

э 40-

го-

гЬ

Свет

У

/ /

> г*

Маннитол использовали в качестве ловушки гидроксильного радикала. На свету маннитол предотвращал СК"-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток (рис. 14). Еще одной ловушкой для ОН' является этиловый спирт. Как и маннитол, этанол предотвращал разрушение ядер, вызванное CN" на свету (рис. 14). Был испытан диметилсуль-фоксид в качестве ловушки для ОН', однако это соединение в качестве антиоксиданта оказалось малоэффективным. В концентрации до 700 мМ диме-тилсульфоксид снижал ОГ-индуцированное разрушение ядер на 5-15% (данные не представлены). Данные показывают, что разрушение ядер устьич-

Рис. 14, Влияние маннитола и этанола на СЫ'-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, на свету. Возраст ных клеток зависит от ОН', проростков гороха - 9-14 суток, вакуумиро-вание с маннитолом и этанолом - 1 мин, преинкубация - 30 мин, добавление МаСЫ, вакуумирование - 1 мин, инкубация 23-24 ч. Добавки: 2,5 мМ №СМ, 125 мМ маннитола, 870 мМ (5%) этанола

Одним из тушителей синглетного кислорода является N3". Азид, как и цианид, является также ингибитором гемопротеинов и ингибирует в клетках те же ферменты, что и CN". Сам по себе Щ как и цианид, вызывал разрушение ядер устьичных клеток (рис. 15). При совместном действии азида и цианида наблюдалось наложение их эффектов. Краситель бенгальский розовый обладает свойством генерировать *Ог на свету. Бенгальский розовый вызывал небольшое разрушение ядер в темноте, но не на свету (рис. 16). В темноте краситель не оказывал влияния на 0№~-индуцированное разрушение ядер, а на свету предотвращал этот процесс. Оксиметрические данные показывают, что преинкубация нарезок листьев гороха с бенгальским розовым в течение 1ч на свету значительно снижала скорость фотосинтетического выделения Ог (рис. 17).

Рис. 15. Влияние МаМ3 на СМТ-инцуцированное Рис. 16. Влияние бенгальского розового (БР) на СИ" разрушение яцер устьичных клеток в эпицерми- -индуцированное разрушение яцер устьичных кле-се, изолированном из листьев гороха, в темно- ток в эпидермисе, изолированном из листьев горо-

те. Возраст проростков гороха - 7 суток, вакуу-мирование - 1 мин, инкубация -18 ч. Добавки-2,5 мМ КСМ, 5 мМ МаМ3

Рис. 17. Влияние красителя бенгальского розового (БР) на фотосинтетическое выделение О2 в насечках из листьев (НЛ) гороха (1, 2). Для сравнения кривых, кривая 2 нормирована по дыханию кривой 1 (3). Возраст проростков гороха - 10 суток, вакуумирование - 1 мин, преинкубация в Н2О без БР (1) и с 100 мкМ БР на свету (2) - 1 ч, среда инкубации - 10 мМ НЕРЕБ-МаОН, рН 7,0, 25 мМ КС1, 30 мг НЛ, Вк и Вык- включение и выключение света соответственно. Добавки: 100 мкМ бр, юмкмэСми

ха, в темноте и на свету. Возраст проростков гороха - 9 суток, вакуумирование - 1 мин, инкубация - 16 ч. Добавки: 2,5 мМ КСМ, БР

Подобный эффект описан в литературе. Он связан с тем, что синг-лстный кислород, генерируемый красителем, вызывает деградацию белка D1 фотосистемы II хлоро-пластов (Okada et э1., 1996). При этом нарушается функция ФС II хлоропластов, и исчезает ее вклад в ПКС. Вероятно, с этим связано предотвращение бенгальским розовым действия CN". Блокирование ФС II посредством DCMU тоже предотвращало индуцированный апоптоз устьич-ных клеток (табл. 1). DCMU не оказывал такого эффекта у мутанта гороха с деффективной ФС П (Самуилов и др., 2003).

100

80'

* %

$ 60

¡•40-

20'

nh

J

«г

У

i1, #

100

80

; 60

40

20'

■ Темнота □ Свет

Ж

4-°

Рис. 18. Влияние гистидина (His) на CN"-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, на свету Возраст проростков гороха -12 суток, вакуумирование с His - 1 мин, преин-кубация - 20 мин, добавление KCN, вакуумирование - 1 мин, инкубация - 23 ч Добавки 2,5 мМ KCN, His

Рис. 19. Влияние хинакрина на СЫТ-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе, изолированном из листьев гороха, в темноте и на свету Возраст проростков гороха - 10 суток, вакуумирование с хинакрином - 1мин, пре-инкубация - 30 мин, добавление КСЫ, вакуумирование - 1 мин, инкубация - 22 ч Добавки 2,5 мМ КСЫ, хинакрин

Гистидин обладает свойствами антиоксиданта, специфичного к 'Ог- Сам по себе гистидин не вызывал разрушения ядер (рис. 18) и не оказывал влияния на СМ~-индуцированную деградацию ядер устьичных клеток на свету. Таким образом, основываясь на данных о действии азида, бенгальского розового и гистидина, можно предполагать, что Ог не оказывает значительного влияния на индукцию разрушения ядер в устьичных клетках гороха цианидом.

Полученные данные показывают, что О2', Н2О2 и ОН', в отличие от *Ог стимулируют СгГ-индуцированное разрушение ядер.

АФК в клетке генерируются структурами, осуществляющими окислительно-восстановительные реакции. Источниками АФК в клетках животных являются митохондрии, а в клетках растений - хлоропласта и митохондрии. Известна также антиоксидантная функция ЭТЦ митохондрий растений: нарушение работы альтернативной оксидазы приводит к увеличению уровня Н2О2 в клетках (Mcintosh et al, 1998).

В ответ на заражение инфекционными возбудителями у растений развивается реакция, называемая гиперчувствительным ответом (ГО). При ГО происходит программируемая гибель клеток в месте внедрения патогена, образующаяся при этом зона погибших клеток препятствует дальнейшему распространению патогена вглубь тканей растения (Greenberg and Yao, 2004).

При ГО происходит генерация АФК при действии МЛЭРИ-оксидазы плазматической мембраны. Мы испытали хинакрин, ингибитор этого фермента. Рисунок 19 показывает, что хинакрин в темноте и на свету значительно подавляет СМГ-индуцированное разрушение ядер. Данные подтверждают предположение об участии МЛЭРИ-оксидазы плазматической мембраны в ПКС, индуцированной цианидом.

Основываясь на полученных данных (по всем разделам настоящей работы) предложена гипотетическая схема индукции ПКС у растений (рис. 20). Митохондрии, хлоропласта и

МЛЭРИ-оксидаза плазматической мембраны являются источниками АФК в клетках растений. ОТ стимулирует накопление АФК, которые, в комбинации с восстановленным пластохиноном на участке о Ъ$-цитохромного комплекса, предположительно активирующим протеин-киназы, вызывают ПКС. Белки, синтезируемые в митохондриях и, вероятно, в хлоропластах, способствуют программируемой гибели клеток растений.

1. СМ" вызывает гибель устьичных клеток в пленках эпидермиса из листьев гороха, которая по признакам фрагментации и последующего исчезновения клеточных ядер, данным ультраструктурных изменений клеток, чувствительности процесса к ряду биохимических воздействий соответствует апоптозу. Процесс стимулировался при освещении. Программируемая клеточная смерть (ПКС) устьичных клеток зависит от активных форм кислорода (АФК), подавлялась ан-тиоксидантами и предотвращалась анаэробиозом.

2. Данные, полученные с применением различных акцепторов электронов и ингибиторов фотосинтеза и дыхания, позволяют заключить, что апоптоз устьичных клеток, по-видимому, регулируется редокс-состоянием пластохинона в центре о йЛцитохромного комплекса хлоро-пластов. Условия, способствующие восстановлению убихинона митохондрий, подавляли ПКС, что связано, вероятно, с антиоксидантным действием митохондриалыюго убихинола.

Выводы

3. Ингибитор протеинкиназ стауроспорин и ингибиторы протеаз N-этилмалеимид, йодаце-тамид и фенилметилсульфонилфторид, хотя и не обладают высокой субстратной специфичностью, предотвращали С>Г-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток, что может свидетельствовать об участии протеинкиназ и протеаз в ПКС.

4. Деэнергизация устьичных клеток ингибитором гликолиза 2-дезоксигаокозой или разобщителем окислительного и фотосинтетического фосфорилирования м-хлоркарбонилцианидфенилгидразоном вызывала апоптозное разрушение ядер устьичных клеток гороха. Их эффект проявлялся в большей степени в темноте, чем на свету. Совместное действие 2-дезоксиглюкозы и л-хлоркарбонилцианидфенилгидразона не вызывало значительного разрушения ядер, что может быть обусловлено развитием гибели клеток в этих условиях по сценарию некроза.

5. Циклогексимид, ингибитор синтеза белка в цитоплазме, усиливал, а линкомицин, ингибитор синтеза белка в хлоропластах и митохондриях, подавлял СЫ~-индуцированное разрушение ядер. Это свидетельствует о том, что ПКС устьичных клеток зависит от комбинированного действия белков, синтезируемых как в цитоплазме, так и в митохондриях и хлоропластах. Белки, синтезируемые в цитоплазме, по-видимому, предохраняют клеточное ядро от CN~-индуцированного разрушения, тогда как белки, синтезируемые в митохондриях и хлоропластах, напротив, способствуют разрушению ядра. Вклад хлоропластного и митохондриального белкового синтеза в ПКС устьичных клеток различается.

6. О2, Н2О2 И ОН', но не синглетный кислород, усиливали СЫ~-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток. При этом основными источниками АФК в устьичных клетках являются, по-видимому, NADPH-оксидаза плазматической мембраны и электронтранспортные системы хлоропластов и митохондрий.

7. В целом, полученные результаты свидетельствуют об участии хлоропластов в ПКС у растений.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Лагунова Е.М., Изюмов Д.С., Киселевский Д.Б., Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть у микроорганизмов и высших растений. Материалы Международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы», МГУ им. М.ВЛомоносова, Москва, «МАКС Пресс», 2000, с. 113-114.

2. Lagunova E.M, Izyumov D.S, Kiselevsky D.B, Samuilov V.D. Programmed cell death in plants: effects of light, electron acceptors and inhibitors of the photosynthetic redox chain ofchloroplasts. Ad-

vanced course: free radicals, nitric oxide, and inflammation: molecular, biochemical, and clinical aspects. Programm and Abstract Book, Antalya, Turkey, 2001, p. 80.

3. Киселевский Д.Б., Лагунова Е.М. Влияние метилвиологена на С>Г-индуцированное разрушение ядер в клетках из листьев гороха. Сборник тезисов V Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21 ого века", Пущино, 2001, с. 133.

4. Лагунова Е.М., Изюмов Д.С., Киселевский Д.Б., Самуилов В.Д. Устойчивость растений к патогенным возбудителям и апоптоз: роль хлоропластов. Материалы Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», Саранск, 2001, с. 108-110.

5. Самуилов В.Д., Лагунова Е.М., Дзюбинская Е.В., Изюмов Д.С., Киселевский Д.Б., Макарова Я.В. (2002) Участие хлоропластов в программируемой гибели клеток у растений. Биохимия, 67,757-765.

6. Киселевский Д.Б. Программированная клеточная смерть у растений и состояние дыхательной цепи переноса электронов. Тезисы докладов III съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, с. 247-248.

7. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б. Апоптоз у растений: роль фотосинтетической и дыхательной электронтранспортной цепи. Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков», Ярославль, 2003, с. 49-50.

8. Дзюбинская Е.В., Лагунова Е.М., Киселевский Д.Б., Самуилов В.Д. Свет и апоптоз у растений.

Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков», Ярославль, 2003, с. 26.

9. Samuilov V.D., Lagunova E.M., Kiselevsky D.B., Dzyubinskaya E.V., Makarova Ya.V., Gusev M.V. (2003) Participation ofchloroplasts in plant apoptosis. Bioscience Reports, 23,103-117.

10. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Лагунова Е.М. Эффекты НгСЬ на СЫ~-индуцированный апоптоз у растений. Тезисы научных докладов Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2003, с. 296-299.

11. Кузнецова Ю.Е., Киселевский Д.Б. Участие продуктов одно-, двух- и трехэлектронного восстановления О2 в апоптозе устьичных клеток гороха. Тезисы докладов XI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», Москва, 2004, с. 80.

12. Киселевский Д.Б., Синицын СВ., Федоренко ТА., Самуилов В.Д. Мембранные НгОг-каналы? Материалы VIII Молодежной конференции ботаников, Санкт-Петербург, 2004, с. 126-127.

13. Киселевский Д Б, Ковалева О В., Кузнецова Ю.Е., Самуилов В.Д. Действие ингибиторов синтеза белка на СЫ~-индуцированный апоптоз устьичных клеток гороха. Тезисы докладов III съезда биофизиков России, Воронеж, 2004, с. 227-228.

Подписано в печать 16.02.2005 Объем 1.75 усл.пл. Тираж 100 экз. Заказ № 174 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

I ' * * '

22 ДПР 2005 • ' /Ю43

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киселевский, Дмитрий Борисович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Цель и задачи работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Клеточная смерть. Общая характеристика.

2.1.1. Краткая история вопроса.

2.1.2. Формы клеточной гибели.

2.1.3. Модели для изучения ПКС.

2.2. ПКС у растений.

2.2.1. Особенности ПКС у растений.

2.2.2. ПКС в онтогенезе растений.

2.2.3. Гиперчувствительный ответ.

2.3. Механизмы программируемой гибели.

2.3.1. Регуляция ПКС у растений.

2.3.2. Деградация компонентов клеток растений.

2.4. АФК и их роль в программируемой гибели клеток.

2.5. Участие митохондрий и хлоропластов в ПКС.

2.5.1. Роль митохондрий в ПКС у растений.

2.5.1. Возможное участие хлоропластов в ПКС у растений.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Объекты и методы исследования.

3.1.1. Объект исследования.

3.1.2. Инфильтрация и инкубация с реагентами.

3.1.3. Оксиметрия.

3.1.4. Анаэробные условия.

3.1.5. Фиксация объекта, окрашивание и световая микроскопия.

3.1.6. Флуоресцентная микроскопия.

3.2. Результаты исследования.

3.2.1. CN" как индуктор гибели клеток.

3.2.2. Влияние антиоксидантов, анаэробных условий, состояния фотосинтетической и дыхательной ЭТЦ, ингибиторов протеинкиназ и протеаз на CN'-индуцированное разрушение ядер.

3.2.3. Деэнергизация вызывает разрушение ядер устьичных клеток

3.2.4. Ингибиторы синтеза белка и разрушение ядер устьичных клеток

3.2.5. Вклад различных АФК в разрушение ядер устьичных клеток

3.3. Обсуждение результатов.

3.4. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Программируемая гибель устьичных клеток гороха"

Гибель клеток может быть непрограммируемой, неконтролируемой (некроз) и программируемой (программируемая клеточная смерть - ПКС). ПКС играет важную роль в реализации программы развития в онтогенезе и поддержании тканевого гомеоетаза организма. Являясь важной составляющей иммунитета, ПКС вовлечена в защитные реакции животных и растений на инфекционных возбудителей.

Многое становится известным о механизмах ПКС у животных и человека. У растений механизмы клеточной гибели изучены в меньшей степени, однако имеющиеся данные свидетельствуют о наличии универсальных сигнальных путей и механизмов гибели клеток животных, растений и грибов. Важную роль в ПКС играют биоэнергетические структуры клетки. Дыхательная цепь митохондрий животных является одним из источников активных форм кислорода (АФК, Boveris and Chance, 1973), вызывающих клеточную гибель (Скулачев, 2000). При апоптозе у животных из митохондрий в цитоплазму переходит ряд факторов белковой природы: цитохром с, флавопротеин AIF, Smac/DIABLO, эндонуклеаза G (Ravagnan et al., 2002). Известна их роль в апоптозе.

Актуально выяснение участия АФК, митохондрий и хлоропластов в ПКС у растений. Перед исследователями возникают разные вопросы. Оказывают ли АФК такое же губительное действие в клетках растений, как у животных? Какую роль играют митохондрии в ПКС у растений? Аналогична ли она участию митохондрий в апоптозе клеток животных? Хлоропласты, уникальные структуры, присущие только растениям, имеют структурное, функциональное и филогенетическое родство с митохондриями. Участвуют ли они в ПКС у растений?

Фундаментальные исследования, направленные на изучение ПКС у растений расширяют представления о роли биоэнергетических систем клетки и АФК в программируемой гибели клеток растений и, в перспективе, поскольку ПКС играет важную роль в фитоиммунитете, могут дать ключ к созданию новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Киселевский, Дмитрий Борисович

3.4. Выводы

1. CIST вызывает гибель устьичных клеток в пленках эпидермиса из листьев гороха, которая по признакам фрагментации и последующего исчезновения клеточных ядер, данным ультраструктурных изменений клеток, чувствительности процесса к ряду биохимических воздействий соответствует апоптозу. Процесс стимулировался при освещении. Программируемая клеточная смерть (ПКС) устьичных клеток зависит от активных форм кислорода (АФК), подавлялась антиоксидантами и предотвращалась анаэробиозом.

2. Данные, полученные с применением различных акцепторов электронов и ингибиторов фотосинтеза и дыхания, позволяют заключить, что апоптоз устьичных клеток, по-видимому, регулируется редокс-состоянием пластохинона в центре о б^цитохромного комплекса хлоропластов. Условия, способствующие восстановлению убихинона митохондрий, подавляли ПКС, что связано, вероятно, с антиоксидантным действием митохондриального убихинола.

3. Ингибитор протеинкиназ стауроспорин и ингибиторы протеаз N-этилмалеимид, йодацетамид и фенилметилсульфонилфторид, хотя и не обладают высокой субстратной специфичностью, предотвращали CN~-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток, что может свидетельствовать об участии протеинкиназ и протеаз в ПКС.

4. Деэнергизация устьичных клеток ингибитором гликолиза 2-дезоксиглюкозой или разобщителем окислительного и фотосинтетического фосфорилирования ;и-хлоркарбонилцианидфенилгидразоном вызывала апоптозное разрушение ядер устьичных клеток гороха. Их эффект проявлялся в большей степени в темноте, чем на свету. Совместное действие 2-дезоксиглюкозы и л/-хлоркарбонилцианидфенилгидразона не вызывало значительного разрушения ядер, что может быть обусловлено развитием гибели клеток в этих условиях по сценарию некроза.

5. Циклогексимид, ингибитор синтеза белка в цитоплазме, усиливал, а линкомицин, ингибитор синтеза белка в хлоропластах и митохондриях, подавлял CNT-индуцированное разрушение ядер. Это свидетельствует о том, что ПКС устьичных клеток зависит от комбинированного действия белков, синтезируемых как в цитоплазме, так и в митохондриях и хлоропластах. Белки, синтезируемые в цитоплазме, по-видимому, предохраняют клеточное ядро от СЫ~-индуцированного разрушения, тогда как белки, синтезируемые в митохондриях и хлоропластах, напротив, способствуют разрушению ядра. Вклад хлоропластного и митохондриального белкового синтеза в ПКС устьичных клеток различается.

6. 02', Н202 и ОН", но не синглетный кислород, усиливали разрушение ядер. При этом основными источниками АФК в устьичных клетках являются, по-видимому, NADPH-оксидаза плазматической мембраны и электронтранспортные системы хлоропластов и митохондрий.

7. В целом, полученные результаты свидетельствуют об участии хлоропластов в ПКС у растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киселевский, Дмитрий Борисович, Москва

1. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятое А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. (2000) Основы микротехнических исследований в ботанике. Справочное руководство. Москва, МГУ.

2. Виноградов А.Д., Гаврикова Э.В., Гривенникова В.Г., Жарова Т.В., Захарова Н.В. (1999) Каталитические свойства митохондриальной NADH:y6nxHHOH оксидоредуктазы (комплекса I). Биохимия, 64, 174-193.

3. Владимиров Ю.А. (2000) Свободные радикалы в биологических системах. Соросовский образовательный журнал, 6, 13—19.

4. Гордеева А.В., Лабас Ю.А., Звягильская Р.А. (2004) Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция. Биохимия, 69, 1301-1313.

5. Клейтон Р. (1984) Фотосинтез: физические механизмы и химические модели. Москва, Мир.

6. Люттге У. и Хигинботам Н. (1984) Передвижение веществ в растениях. Москва, Колос.

7. Новожилова А.П., Плужников Н.Н., Новиков B.C. (1996) В кн. Программированная клеточная гибель (под ред. Новикова B.C.), Наука, Спб, стр. 9-29.

8. Паушева З.П. (1976) Практикум по цитологии растений. Москва, Колос.

9. Проскуряков С.Я., Габай B.JI., Коноплянников А.Г. (2002) Некроз активная, управляемая форма программируемой клеточной гибели. Биохимия, 67, 467-491.

10. Самуилов В.Д. (2005) Проблемы энергетики в эволюции живого. Биохимия, 70, 302-307.

11. Самуилов В.Д., Лагунова Е.М., Бешта О.Е., Киташов А.В. (2000а) Индуцированное CN~~ разрушение ядер в клетках листьев гороха. Биохимия, 65,817-824.

12. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. (20006) Программируемая клеточная смерть. Биохимия, 65, 1029-1046.

13. Саприн А.Н., Калинина Е.В. (1999) Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов. Успехи биол. химии, 39, 289-326.

14. Скулачев В.П. (1997) Старение организма особая биологическая функция, а не результат поломки сложной живой системы: биохимическое обоснование гипотезы Вейсмана. Биохимия, 62, 1394-1399.

15. Скулачев В.П. (2000) Кислород и явления запрограммированной смерти. Первое Северинское чтение, ИБМХ РАМН.

16. Смирнова Е.Г., Любимов Ю.И., Малинина Т.Г., Любимова Е.Ю., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф., Колесова Г.М., Ягужинский Л.С. (2002) Ионол (ВНТ) продуцирует супероксид-анион. Биохимия, 67, 1539-1544.

17. Тарчевский И.А. (2002) Сигнальные системы клеток растений. Москва, Наука.

18. Хейфлик Л. (1997) Смертность и бессмертие на клеточном уровне. Биохимия, 62, 1380-1393.

19. Ченцов Ю.С. (2004) Введение в клеточную биологию. ИКЦ "Академкнига", Москва, стр. 479-486.

20. Abeliovich H. and Klionsky D.J. (2001) Autophagy in yeast: mechanistic insights and physiological function. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65, 463-479.

21. Adams J. (2003) The proteasome: structure, function, and role in the cell. Cancer Treat. Rev., 29, 3-9.

22. Affourtit C., Albury M.S., Crichton P.G., Moore A.L. (2002) Exploring the molecular nature of alternative oxidase regulation and catalysis. FEBS Lett., 510, 121-126.

23. Allan A.C., Lapidot M., Culver J.N., Fluhr R. (2001) An early tobacco mosaic virus-induced oxidative burst in tobacco indicates extracellular perception of the virus coat protein. Plant Physiol, 126, 97-108.

24. Alleva R., Tomasetti M., Andrea L., Gellert N., Borghi В., Weber C., Murphy M.P., Neuzil Ji. (2001) Coenzyme Q blocks biochemical but not receptor-induced apoptosis by increasing mitochondrial antioxidant protection. FEBS Lett., 503, 46-50.

25. Alscher R.G., Erturk N., Heath L.S. (2002) Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. J. Exp. Bot., 53, 1331-1341.

26. Aoyagi S., Sugiyama M., Fukuda H. (1998) BEN1 and ZEN1 cDNAs encoding Sl-type DNases that are associated with programmed cell death in plants. FEBS Lett., 429, 134-138.

27. Asada K. (1999) The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50, 601-639.

28. Asai Т., Stone J.M., Heard J.E., Kovtun Ye., Yorgey P., Sheen J., Ausubel M. (2000) Fumonsin В1-induced cell death in Arabidopsis protoplasts requires jasmonate-, ethylene-, and salicylate-dependent signaling pathways. Plant Cell, 12, 1823-1835.

29. Balk J., Chew S.K., Leaver C.J., McCabe P.F. (2003) The intermembrane space of plant mitochondria contains a DNase activity that may be involved in programmed cell death. Plant J., 34, 573-583.

30. Beere H.M. (2004) "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J. Cell Sci., 117, 2641-2651.

31. Beers E.P., Woffenden B.J., Zhao C. (2000) Plant proteolytic enzymes: possible roles during programmed cell death. Plant Mol. Biol., 44, 399-415.

32. Bethke P.C., Lonsdale J.E., Fath A., Jones R.L. (1999) Hormonally regulated programmed cell death in barley aleurone cells. Plant Cell, 11, 1033-1045.

33. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Ann. Bot., 91, 179-194.

34. Bolwell G.P., Butt V.S., Davies D.R., Zimmerlin A. (1995) The origin of the oxidative burst in plants. Free Rad. Res., 23, 517-532.

35. Boveris A. and Chance B. (1973) The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem. J., 134, 707-716.

36. Boyce M., Degterev A., Yuan J. (2004) Caspases: an ancient cellular sword of Damocles. Cell Death Differ., 11, 29-37.

37. Brady J.D. and Fry S.C. (1997) Formation of di-isodityrosine and loss of isodityrosine in the cell walls of tomato cell-suspension cultures treated with fungal elicitors or H202. Plant Physiol., 115, 87-92.

38. Brookes P.S., Yoon Y., Robotham J.L., Anders M.W., Sheu S.-S. (2004) Calcium, ATP and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 287, C817-C833.

39. Biirkle A. (2000) Poly(ADP-ribosyl)ation: a posttranslational protein modification linked with genome protection and mammalian longevity. Biogerontology, 1, 41-46.

40. Cardinale F., Jonak C., Ligterink W., Niehaus K., Boiler Т., Hirt H. (2000) Differential activation of four specific МАРК pathways by distinct elicitors. J. Biol. Chem., 275, 36734-36740.

41. Carimi F., Zottini M., Formentin E., Terzi M., Lo Shiavo F. (2003) Cytokinins: new apoptotic inducers in plants. Planta, 216, 413-421.

42. Carrard G., Bulteau A.-L., Petropoulos I., Friguet B. (2002) Impairment of proteasome structure and function in aging. Int. J. Biochem. Cell Biol, 34, 1461-1474.

43. Chang H.Y. and Yang X. (2000) Proteases for ccll suicidc: functions and regulation of caspases. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 821-846.

44. Chen S. and Dickman M.B. (2004) Bcl-2 family members localize to tobacco chloroplast and inhibit programmed cell death induced by chloroplast-targeted herbicides. J. Exp. Bot., 55, 2617-2623.

45. Cheong J.J. and Hahn M.G. (1991) A specific, high-affinity binding site for the hepta-beta-glucoside elicitor exists in soybean membranes. Plant Cell, 3, 137-147.

46. Chichkova N.V., Kim S.H., Titova E.S., Kalkum M., Morozov V.S., Rubtsov Yu.P., Kalinina N.O., Taliansky M.E., Vartapetian A.B. (2004) A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. Plant Cell., 16, 157-171.

47. Cikala M., Wilm В., Hobmayer E., Bottger A., David C.N. (1999) Identification of caspases and apoptosis in the simple metazoan Hydra. Curr. Biol., 9, 959-962.

48. Clarke A., Desikan R., Hurst R.D., Hancock J.T., Neill S.J. (2000) NO way back: nitric oxide and programmed cell death in Arabidopsis thaliana suspension cultures. Plant J., 24, 667-677.

49. Coffeen W.C. and Wolpert T.J. (2004) Purification and characterization of serine proteases that exhibit caspase-like activity and are associated with programmed cell death in Avena sativa. Plant Cell, 16, 857-873.

50. Cross A.R. and Jones O.T.G. (1991) Enzymic mechanisms of superoxide production. Biochim. Biophys. Acta, 1057, 281-298.

51. Dat J.F., Pellinen R., Beeckman Т., Van De Cotte В., Langebartels C., Kangasjarvi J., Inze D., Van Breusegem F. (2003) Changes in hydrogen peroxide homeostasis trigger an active cell death process in tobacco. Plant J., 33, 621-632.

52. Daugas E., Nochy D., Ravagnan L., Loeffler M., Susin S.A., Zamzami N., Kroemer G. (2000) Apoptosis-inducing factor (AIF): a ubiquitous mitochondrial oxidoreductase involved in apoptosis. FEBSLett., 476, 118-123.

53. Day I.S., Reddy V.S., Ali G.S., Reddy A.S.N. (2002) Analysis of EF-hand-containing proteins in Arabidopsis. Genome Biol., 3, 1-24.

54. Delorme V.G., McCabe P.F., Kim D.J., Leaver C.J. (2000) A matrix metalloproteinase gene is expressed at the boundary of senescence and programmed cell death in cucumber. Plant Physiol., 123, 917-927.

55. Desikan R., Clarke A., Hancock J.T., Neill S.J. (1999) H202 activates a MAP kinase-like enzyme in Arabidopsis thaliana suspension cultures. J. Exp. Bot., 50, 1863-1866.

56. Drew M.C., He C.J., Morgan P.W. (2000) Programmed cell death and aerenchyma formation in roots. Trends Plant Sci., 5, 123-127.

57. Dumville J.C. and Fry S.C. (2003) Gentiobiose: a novel oligosaccharin in ripening tomato fruit. Planta, 216, 484-495.

58. Eckardt N.A. (2001) A calcium-regulated gatekeeper in phloem sieve tubes. Plant Cell, 13, 989-992.

59. Edinger A.L. and Thompson C.B. (2004) Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Curr. Opin. Cell Biol, 16, 663-669.

60. Ellis H.M. and Horvitz H.R. (1986) Genetic control of programmed cell death in nematode C. elegans. Cell, 44, 817.

61. Endo S., Demura Т., Fukuda H. (2001) Inhibition of proteasome activity by the TED4 protein in extracellular space: a novel mechanism for protection of living cells from injury caused by dying cells. Plant Cell Physiol, 42, 9-19.

62. Estelle M. (2001) Proteases and cellular regulation in plants. Curr. Opin. Plant Biol., 4, 254-260.

63. Fridinan J.S. and Lowe S.W. (2003) Control of apoptosis by p53. Oncogene, 22, 9030-9040.

64. Fukuda H. (2000) Programmed cell death of tracheary elements as a paradigm in plants. Plant Mol. Biol., 44, 245-253.

65. Godon C., Lagniel G., Lee J., Buhler J.-M., Kieffer S., Perrot M., Boucherie H., Toledano M.B., Labarre J. (1998) The H202 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 273, 22480-22489.

66. Golstein P., Aubry L., Levraud J.-P. (2003) Cell-death alternative model organisms: why and which? Mol Cell Biol, 4, 798-807.

67. Gottlieb R.A. (2000) Mitochondria: execution central. FEBSLett., 482, 6-12.

68. Grant J.J. and Loake G.J. (2000) Role of reactive oxygen intermediates and coginate redox signaling in disease resistance. Plant Physiol, 124, 21-29.

69. Gray J.C. (2003) Chloroplast-to-nucleus signalling: a role for Mg-protoporphyrin. Trends Genet., 19, 526-529.

70. Gray J., Close P.S., Briggs S.P., Johal G.S. (1997) A novel suppressor of cell death in plants encoded by the llsl gene of maize. Cell, 89, 25-31.1. К 114

71. Gray J., Janick-Buckner D., Buckner В., Close P.S., Johal G.S. (2002) Light-dependent death of maize lis 1 cells is mediated by mature chloroplasts. Plant Physiol., 130, 1894-1907.

72. Greenberg J.T. (1996) Programmed cell death: a way of life for plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12094-12097.

73. Greenberg J.T. and Yao N. (2004) The role and regulation of programmed cell death in plant-pathogen interactions. Cell. Microbiol., 6, 201-211.

74. Guimaraes С.Л. and Linden R. (2004) Programmed cell death. Apoptosis and alternative deathstyles. Eur. J. Biochem., 271, 1638-1650.

75. Gunawardena A.H.L.A.N., Pearce D.M., Jackson M.B., Hawes C.R., Evans D.E. (2001) Characterization of programmed cell death during aerenchyma formation induced by ethylene or hypoxia in roots of maize {Zea mays L.). Planta, 212, 205-214.

76. Gupta R. and Luan S. (2003) Redox control of protein tyrosine phosphatases and mitogen-activated protein kinases in plants. Plant Physiol., 132, 1149-1152.

77. Haddad J.J. (2002) Antioxidant and prooxidant mechanisms in the regulation of redox(y)-sensitive transcription factors. Cell. Signal., 14, 879-897.

78. Harding S.A., Oh S.-H., Roberts D.M. (1997) Transgenic tobacco expressing a foreign calmodulin gene shows an enhanced production of active oxygen species. EMBO J., 16, 1137-1144.

79. Hirschi K.D. (2004) The calcium conundrum. Both versatile nutrient and specific signal. Plant Physiol., 136, 2438-2442.

80. Hoeberichts F.A. and Woltering E.J. (2002) Multiple mediators of plant programmed cell death: interplay of conserved cell death mechanisms and plant-specific regulators. BioEssays, 25, 47-57.

81. Jabs T. (1999) Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals. Biochem. Pharmacol, 57, 231-245.

82. Jiang M. and Zhang J. (2003) Cross-talk between calcium and reactive oxygen species originated from NADPH oxidase in abscisic acid-induced antioxidant defense in leaves of maize seedlings. Plant Cell Environment, 26, 929-939.

83. Jones A.M. (2001) Programmed cell death in development and defense. Plant Physiol, 125, 94-97.

84. Jones A.M. and Dangl J.L. (1996) Logjam at the Styx: programmed cell death in plants. Trends Plant Sci., 1, 114-119.

85. Kawasaki Т., Henmi К., Ono E., Hatakeyama S., Iwano M., Satoh H., Shimamoto K. (1999) The small GTP-binding protein Rac is a regulator of cell death in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 10922-10926.

86. Kerr J.F.R., Wyllie A.IL, Currie A.R. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Brit. J. Cancer, 26, 239-257.

87. Ketelaar Т., Voss C., Dimmock S.A., Thumm M., Hussey P.J. (2004) Arabidopsis homologues of the autophagy protein Atg8 are a novel family of microtubule binding proteins. FEBSLett., 567, 302-306.

88. Kim M., Ahn J.-W., Jin U.-H., Choi D., Раек K.-H., Pai H.-S. (2003) Activation of the programmed cell death pathway by inhibition of proteasome function in plants. J. Biol. Chem., 278, 19406-19415.

89. Klein J.A., Longo-Guess C.M., Rossmann M.P., Serburn K.L., Hurd R.E., Frankel W.N., Bronson R.T., Ackerman S.L. (2002) The harlequin mouse mutation down-regulates apoptosis-inducing factor. Nature, 419, 367-374.

90. Klusener В., Young J.J., Murata Y., Allen G.J., Mori I.C., Hugouvieux V., Schroeder J.I. (2002) Convergence of calcium signaling pathways of pathogenic clicitors and abscisic acid in arabidopsis guard cells. Plant Physiol., 130, 2152-2163.

91. Konstantinov A.A., Peskin A.V., Popova E.Yu., Khomutov G.B., Ruuge E.K. (1987) Superoxide generation by the respiratory chain of tumor mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 894, 1-10.

92. Koppenol W.H. (1994) In: Free radical damage and its control, edited by Rice-Evans C.A. and Burdon R.H., Elsevier, New York, 3-24.

93. Koraimann G. (2003) Lytic transglycosylases in macromolecular transport systems of Gram-negative bacteria. Cell. Mol. Life Sci., 60, 2371-2388.

94. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. (1997) High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Lett., 416, 15-18.

95. Korthout H.A.A.J., Berecki G., Bruin W., van Duijn В., Wang M. (2000) The presence and subcellular localization of caspase 3-like proteinases in plant cells. FEBS Lett., 415, 139-144.

96. Kovtun Ye., Chiu W.-L., Tena G., Sheen J. (2000) Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2940-2945.

97. Kroemer G. and Reed J.C. (2000) Mitochondrial control of cell death. Nature Med., 6, 513-519.

98. Kuriyama H. (1999) Loss of tonoplast integrity programmed in tracheary element differentiation. Plant Physiol., 121, 763-774.

99. W. and Dickman M.B. (2004) Abiotic stress induces apoptotic-like features in tobacco that is inhibited by expression of human Bcl-2. Biotechnol. Lett., 26, 87-95.

100. В., Liu H.-T., Sun D.-Y., Zhou R.-G. (2004) Ca2+ and calmodulin modulate DNA-binding activity of maize heat shock transcription factor in vitro. Plant Cell Physiol., 45, 627-634.

101. Mackenzie S. and Mcintosh L. (1999) Higher plant mitochondria. Plant Cell, 11, 571-585.

102. Marty F. (1999) Plant vacuoles. Plant Cell, 11, 589-599.

103. Masuda Y., Yamada Т., Marubashi W. (2003) Time course analysis of apoptotic cell death during expression of hybrid lethality in hybrid tobacco cells (Nicotiana suaveolens xN. tabacum). Plant Cell Physiol., 44, 420-427.

104. Mattson M.P. and Furukawa K. (1997) Anti-apoptotic actions of cycloheximide: blockade of programmed cell death or induction of programmed cell life? Apoptosis, 2, 257-264.

105. Maxwell D.P., Wang Y., Mcintosh L. (1999) The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8271-8276.

106. Mikkelsen R.B. and Wardman P. (2003) Biological chemistry of reactive oxygen and nitrogen and radiation-induced signal transduction mechanisms. Oncogene, 22, 5734-5754.

107. Miramar M.D., Costantini P., Ravagnan L., Saraiva L.M., Haouzi D., Brothers G., Penninger J.M., Peleato M.L., Kroemer G., Susin S.A. (2001) NADH oxidase activity of mitochondrial apoptosis-inducing factor. J. Biol. Chem., 276, 16391-16398.

108. Mithofer A., Schulze В., Boland W. (2004) Biotic and heavy metal stress response in plants: evidence for common signals. FEBSLett., 566, 1-5.

109. Mittler R. and Lam E. (1996) Sacrifice in the face of foes: pathogen-induced programmed cell death in plants. Trends Microbiol., 4, 10-15.

110. Mori I.C. and Schroeder J.I. (2004) Reactive oxygen species activation of plant Ca2+ channels. A signaling mechanism in polar growth, hormone transduction, stress signaling, and hypothetically mechanotransduction. Plant Physiol., 135, 702-708.

111. Mullineaux P. and Karpinski S. (2002) Signal transduction in response to excess light: getting out of the chloroplast. Curr. Opin. Plant Biol., 5, 43-48.

112. Nagata S. (2000) Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell. Res., 256, 12-18.

113. Nagata S., Nagase H., Kawane K., Mukae N., Fukuyama H. (2003) Degradation of chromosomal DNA during apoptosis. Cell Death Differ., 10, 108-116.

114. Neill S.J., Desikan R., Clarke A., Hurst R.D., Hancock J.T. (2002) Hydrogen peroxide %and nitric oxide as signalling molecules in plants. J. Exp. Bot., 53, 1237-1247.

115. Ning S.-B., Wang L., Li Z.-Y., Jin W.-W., Song Y.-C. (2001) Apoptotic cell death and cellular surface negative charge increase in maize roots exposed to cytotoxic stresses. Ann. Bot., 87, 575-583.

116. Nooden L.D., Guiamet J.J., John I. (1997) Senescence mechanisms. Physiologia Plantarum, 101, 746-753.

117. Pasqualini S., Torre G.D., Ferranti F., Ederli L., Piccioni C., Reale L., Antonelli M. (2002) Salicylic acid modulates ozone-induced hypersensitive cell death in tobacco plants. Physiologia Plantarum, 115, 204-212.

118. Pedroso C.M., Magalhaes J.R., Durzan D. (2000) A nitric oxide burst precedes apoptosis in angiosperm and gymnosperm callus cells and foliar tissues. J. Exp. Bot., 51, 1027-1036.

119. Pennel R.I. and Lamb C. (1997) Programmed cell death in plants. Plant Cell, 9, 1157-1168.

120. Popov V.N., Purvis A.C., Skulachev V.P., Wagner A.M. (2001) Stress-induced changes in ubiquinone concentration and alternative oxidase in plant mitochondria. Biosci. Rep., 21, 369-379.

121. Ravagnan L., Roumier Т., Kroemer G. (2002) Mitochondria, the killer organelles and their weapons. J. Cell. Physiol, 192, 131-137.

122. Ren D., Yang H., Zhang S. (2002) Cell death mediated by МАРК is associated with hydrogen peroxide production in Arabidopsis. J. Biol Chem., 277, 559-565.

123. Rhoads D.M., Umbach A.L., Sweet C.R., Lennon A.M., Rauch G.S. Siedow J.N. (1998) Regulation of the cyanide-resistant alternative oxidase of plant mitochondria. J. Biol. Chem., 273, 30750-30756.

124. Rice K.C. and Bayles K.W. (2003) Death's toolbox: examining the molecular components of bacterial programmed cell death. Mol. Microbiol., 50, 729-738.

125. Robson C.A. and Vanlerberghe G.C. (2002) Transgenic plant cells lacking mitochondrial alternative oxidase have increased susceptibility to mitochondria-dependent and -independent pathways of programmed cell death. Plant Physiol., 129, 1908-1920.

126. Rodermel S. (2001) Pathways of plastid-to-nucleus signaling. Trends Plant Sci., 6, 471-478.

127. Ryerson D.E. and Heath M.C. (1996) Cleavage of nuclear DNA into oligonucleosomal fragments during cell death induced by fungal infection or by abiotic treatments. Plant Cell, 8, 393-402.

128. Saelens X., Festjens N., Walle L.V., van Gurp M., van Loo G., Vandenabeele P. (2004) Toxic proteins released from mitochondria in cell death. Oncogene, 23, 2861-2874.

129. Saviani E.E., Orsi C.H., Oliveira J.F.P., Pinto-Maglio C.A.F., Salgado I. (2002) Participation of the mitochondrial permeability transition pore in nitric oxide-induced plant cell death. FEBS Lett., 510, 136-140.

130. Schroda M., Vallon O., Wollman F.-A., Beck C.F. (1999) A chloroplast-targeted heat shock protein 70 (HSP70) contributes to the photoprotection and repair of photosystem II during and after photoinhibition. Plant Cell, 11, 1165-1178.

131. Sen C.K. and Packer L. (1996) Antioxidant and redox regulation of gene transcription. FASEBJ., 10, 709-720.

132. Seo S., Okamoto M., Iwai Т., Iwano M., Fukui K., Isogai A., Nakajima N., Ohashi Y. (2000) Reduced levels of chloroplast FtsH protein in tobacco mosaic virusinfected tobacco leaves accelerate the hypersensitive reaction. Plant Cell, 12, 917-932.

133. Shen В., Jensen R.G., Bohnert H.J. (1997) Mannitol protects against oxidation by hydroxy 1 radicals. Plant Physiol, 115, 527-532.

134. Shi Y. (2004) Caspase activation: revisiting the induced proximity model. Cell, 117, 855-858.

135. Shimamoto K., Takahashi A., Henmi К., Ono E., Hatakeyama S., Iwano M., Kawasaki T. (1999) Programmed cell death in plants. Plant Biotechnol., 16, 49-53.

136. Shorning B.Yu., Smirnova E.G., Yaguzhinsky L.S., Vanyushin B.F. (2000) Necessity of superoxide production for development of etiolated wheat seedlings. Biochemistry (Moscow), 65, 1357-1361.

137. Siedow J.N. and Umbach A.L. (1995) Plant mitochondrial electron transfer and molecular biology. Plant Cell, 7, 821-831.

138. Siedow J.N. and Umbach A.L. (2000) The mitochondrial cyanide-resistant oxidase structural conservation amid regulatory diversity. Biochim. Biophys. Acta, 1459, 432-439.

139. Sies H. (1993) Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem., 215, 213-219.

140. Solomon M., Belenghi В., Delledonne M., Menachem E., Levine A. (1999) The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation of programmed cell death in plants. Plant Cell, 11, 431-444.

141. Sperandio S., de Belle I., Bredesen D.E. (2000) An alternative, nonapoptotic form of programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14376-14381.

142. Stein J.C. and Hansen G. (1999) Mannose induces an endonuclease responsible for DNA laddering in plant cells. Plant Physiol., 121, 71-79.

143. Sugiyama M., Ito J., Aoyagi S., Fukuda H. (2000) Endonucleases. Plant Mol. Biol., 44, 387-397.

144. Sullivan J.A., Shirasu K., Deng X.W. (2003) The diverse roles of ubiquitin and the 26S proteasome in the life of plants. Nat. Rev. Genet., 4, 948-958.

145. Sun Y.-L., Zhao Y., Hong X., Zhai Z.-H. (1999) Cytochrome с release and caspase activation during menadione-induced apoptosis in plants. FEBS Lett., 462, 317-321.

146. Takeshige K., Baba M., Tsiboi S., Noda Т., Ohsumi Y. (1992) Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. J. Cell Biol., 119,301-311.

147. Tenhaken R. and Riibel C. (1997) Salicylic acid is needed in hypersensitive cell death in soybean but does not act as a catalase inhibitor. Plant Physiol., 115, 291-298.

148. Thannickal V.J. and Fanburg B.L. (2000) Reactive oxygen species in cell signalling. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 279, L1005-L1028.

149. Tian R.-H., Zhang G.-Y., Yan C.-H., Dai Y.-R. (2000) Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase and activation of caspase-3-like protease in heat shock-induced apoptosis in tobacco suspension cells. FEBS Lett., 474, 11-15.

150. Trebst A., Depka В., Hollander-Czytko H. (2002) A specific role for tocopherol and chemical singlet oxygen quenchers in the maintenance of photosystem II structure and function in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett., 516, 156-160.

151. Tyystjarvi E. and Aro E.-M. (1996) The rate constant of photoinhibition, measured in lincomycin-treated leaves, is directly proportional to light intensity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 2213-2218.

152. Vanlerberghe G.C., Robson C.A., Yip J.Y.H. (2002) Induction of mitochondrial alternative oxidase in response to a cell signal pathway down-regulating the cytochrome pathway prevents programmed cell death. Plant Physiol., 129, 1829-1842.

153. Verbeke P., Fonager J., Clark B.F.C., Rattan S.I.S. (2001) Heat shock response and ageing: mechanisms and applications. Cell Biol. Int., 25, 845-857.

154. Verhagen A.M., Ekert P.G., Pakusch M., Silke J., Connolly L.M., Reid G.E., Moritz R.L., Simpson R.J., Vaux D.L. (2000) Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to an antagonizing IAP proteins. Cell, 102, 43-53.

155. Vetter J. (2000) Plant cyanogenic glycosides. Toxicon, 38, 11-36.

156. Vierstra R.D. (2003) The ubiquitin/26S proteasome pathway, the complex last chapter in the life of many plant proteins. Trends Plant Sci., 8, 135-142.

157. Wan L., Xia Q., Qui X., Selvaraj G. (2002) Early stages of seed development in Brassica napus: a seed coat-specific cysteine proteinase associated with programmed cell death of the inner integument. Plant J., 30, 1-10.

158. Wang H.L.J., Bostock R.M., Gilchrist D.G. (1996a) Apoptosis: a functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked during development. Plant Cell, 8, 375-391.

159. Wang K.L.-C., Li H., Ecker J.R. (2002) Ethylene biosynthesis and signalling networks. Plant Cell, 14, SI31-S151.

160. Wang M., Oppendijk В., Lu X., Van Duijn В., Schilperoort R.A. (1996b) Apoptosis in barley aleurone during germination and its inhibition by abscisic acid. Plant Mol. Biol., 32, 1125-1134.

161. Whittle C.-A., Beardmore Т., Johnston M.O. (2001) Is G1 arrest in plant seeds induced by a p53-related pathway? Trends Plant Sci., 6, 248-251.

162. Wildermuth M.C., Dewdney Ju., Wu G., Ausubel F.M. (2001) Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature, 414, 562-565.

163. Woffenden B.J., Freeman T.B., Beers E.P. (1998) Proteasome inhibitors prevent tracheary element differentiation in zinnia mesophyll cell cultures. Plant Physiol., 118,419-430.

164. Wojcik С. (2002) Regulation of apoptosis by the ubiquitin and proteasome pathway. J. Cell. Mol. Med., 6, 25-48.

165. Wojtaszek P. (1997) Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochem. J., 322, 681-692.

166. Wollman F.-A. (2001) State transitions reveal the dynamics and flexibility of the photosynthetic apparatus. EMBOJ., 20, 3623-3630.

167. Woltering E.J., van der Bent A., Hoeberichts F.A. (2002) Do plant caspases exist? Plant Physiol., 130, 1764-1769.

168. Wu H. and Cheung Y. (2000) Programmed cell death in plant reproduction. Plant Mol. Biol., 44, 267-281.

169. Xu Y. and Hanson M.R. (2000) Programmed cell death during pollination-induced petal senescence in petunia. Plant Physiol., 122, 1323-1333.

170. Yamanishi K., Shen C.S., Mizutani H. (2004) Apoptosis in epidermis. Methods Mol Biol, 289, 171-174.

171. Zhang J.-H., Zhang Y., Herman B. (2003) Caspases, apoptosis and aging. Ageing Res. Rev., 4, 357-366.

172. Zhang S. and Klessig D.F. (2001) МАРК cascades in plant defense signaling. Trends Plant Sci., 6, 520-527.

173. Zhong W.-B., Wang C.-Y., Chang T.-C., Lee W.-S. (2003) Lovastatin induces apoptosis of anaplastic thyroid cancer cells via inhibition of proteingeranylgeranylation and de novo protein synthesis. Endocrinology, 144, 3852-3859.

174. Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю Виталию Дмитриевичу Самуилову за его заботливое отношение, ценные советы и всестороннюю поддержку.

175. Автор также выражает признательность сотрудникам и аспирантам кафедры физиологии микроорганизмов за профессиональные советы и дружеское участие.