Получение пептида-мимотопа химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов

Апалько, Светлана Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение пептида-мимотопа химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение пептида-мимотопа химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов"

Апалько Светлана Вячеславовна

Получение пептида-мимотопа химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов

03.00.03 -молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Кольцово - 2009

003488075

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии человека Сибирского отделения РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Глушков Андрей Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ильичев Александр Алексеевич

кандидат биологических наук Лунин Владимир Глебович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Защита состоится «29» декабря 2009 г. в 10 часов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел.8(383)3367428.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Автореферат разослан «23» ноября 2009 г. Ученый секретарь

диссертационного совета доктор биологических наук

Л.И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) относятся к наиболее распространенным химическим факторам окружающей среды, воздействие которых на организм человека и животных приводит к возникновению злокачественных опухолей. Индикаторным соединением ПАУ признан безусловный канцероген для человека - бензо[а]пирен (БП).

Ранее была высказана идея о возможной иммунопрофилактике рака путем индукции соответствующих специфических антител (АТ) против химических канцерогенов. Сами по себе химические канцерогены, являясь низкомолекулярными органическими соединениями, не способны индуцировать АТ. В связи с этим было предложено два основных подхода для иммунопрофилактики рака. Первый подход основан на использовании конъюгатов химических канцерогенов (или их аналогов) с макромолекулярными носителями, например, с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Однако, использование такого конъюгата в качестве антиканцерогенных вакцин неприменимо для иммунопрофилактики рака у человека, т.к. сохраняется вероятность индукции опухоли самим канцерогеном (Моокеп Б-Ь., « а1. 1984; БПЬаП Ь.К., е1 а1. 1996). Другой подход, а именно использование моноклоналышх антиидиотипических АТ (СЬа£паи<11.Ь. е1 а1. 1993), также нельзя признать оптимальным, в силу того, что их применение может приводить к большому количеству осложнений, аллергизации, требует сложных и дорогих условий культивирования гибридом для их производства.

Поэтому разработка альтернативных подходов, направленных на получение иммуногенных препаратов, не содержащих никаких органических аналогов канцерогена и, тем не менее, способных индуцировать антиканцерогенный иммунный ответ, представляет самостоятельный научный и практический интерес.

Одним из таких подходов может быть получение пептидов-мимотопов химических канцерогенов.

Цель работы: получение пептида-мимотопа химических канцерогенов.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать мАТ с заданными свойствами -высокой специфичностью к БП и низкой кросс-реактивностью с неканцерогенными ПАУ и эндогенными структурно схожими соединениями.

2. Смоделировать структуру БаЬ фрагмента полученного мАТ и определить расположение активного центра связывания соединений группы ПАУ.

3. При помощи технологии фагового дисплея получить рекомбинантные клоны бактериофагов, содержащие пептид, специфически взаимодействующий с АТ к БП.

4. Изучить иммунологические свойства пептида-мимотопа БП.

Научная новизна. Впервые в России получено мАТ к БП (мАТ В2).

По своим характеристикам мАТ В2 не уступает зарубежным аналогам, а по специфичности к БП даже превосходит. Полученное мАТ В2 обладает

высокой кросс-реактивностью к бенз[а]антрацену (БА), вероятному канцерогену для человека, и низким аффинитетом к неканцерогенным структурно схожим веществам.

Определены нуклеотидные последовательности ДНК, кодирующие вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей мАТ В2, транслированы в аминокислотные последовательности, на основе которых построена модель Fab фрагмента мАТ В2. При помощи молекулярного моделирования определена структура активного центра мАТ В2 и сила его связывания с радом химических соединений группы ПАУ.

На основе полученных моно- и поликлональных АТ к БП при помощи технологии фагового дисплея впервые удалось получить пептид-мимотоп химических канцерогенов группы ПАУ. Полученный пептид-мимотоп обладает способностью специфически связываться с мАТ В2 и моноспецифическими поликлональными АТ к БП и БА.

Пептид-мимотоп БП в составе рШ белка бактериофага обладает иммуногенными свойствами - способностью индуцировать синтез АТ к БП при иммунизации животных.

Научно-практическая значимость работы. Предложенный подход получения пептида-мимотопа химических канцерогенов группы ПАУ, способного индуцировать антиканцерогенный иммунный ответ, может быть использован в поиске пептидов-мимотопов других низкомолекулярных органических соединений, представляющих опасность для здоровья человека и животных (например, пестицидов).

Полученный пептид-мимотоп БП и БА может быть использован при разработке принципиально новой группы иммунопрепаратов антиканцерогенных вакцин, а также при создании новых диагностических тест-систем на основе иммуно-ферментного анализа (ИФА) для определения антиканцерогенных АТ. Замена в таких диагностических системах конъюгатов канцероген-белок на пептид-мимотоп исключит работу с потенциально опасными реагентами.

На полученный в данной работе пептид-мимотоп БП и БА получен патент РФ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на III Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (г. Новосибирск 2-8 сентября 2007 г), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск 11-15 мая 2008 г.), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва 1922 мая 2008 г.), П1 Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (г. Троицк 3-6 июня 2008 г.), V Северном социально-экологическом конгрессе (г. Москва 21-22 апреля 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Новые идеи и решения молодых исследователей в развитии АПК» (1-е место) (г. Волгоград 13-15 мая 2009 г.), научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (г. Новый свет, Крым, Украина, 25-30 мая 2009 г.), научной конференции, посвященной 25-летию Института химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН «Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (г. Новосибирск, 10 - 14 июня 2009 г.).

Апробация диссертации состоялась 11 ноября 2009 г. на научном семинаре ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах перечня ВАК и 1 патент РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы, содержащий ссылки на 14 отечественных и 142 иностранных источников. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 36 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Секвенирование фрагментов ДНК проводили в Межинститутском центре секвенирования СО РАН (г. Новосибирск) на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» (Applied Biosystems, США) с использованием рекомендуемого набора реактивов для секвенирования.

Синтез конъюгатов.

Конъюгаты ПАУ-белок. Конъюгаты БП, БА, антрацена, хризена, пирена («Aldrich», Германия) синтезировали методом ковалентного связывания альдегидной группы гаптена с аминогруппами белка-носителя (Glushkov A.N. et al. 2002).

Конъюгаты антиген-кБСА

Катионизация БСА (кБСА). К 0.5 мл 10 % раствора БСА («Fermentas», Литва) в 0.01 М NaOH добавляли 5 мл 2 М раствора дигидрохлорида этилендиамина и 50 мг сухого EDC («Fluka», Швейцария). Через два часа проводили диализ раствора против Н20 (1 л) в течение 24 ч. с шестикратной сменой воды.

Синтез конъюгата пептид-кБСА. К 700 мкл раствора, содержащего 2 мг кБСА, добавляли 2 мг пептида и 10 мг EDC. После двухчасовой инкубации проводили диализ как описано выше.

Синтез конъюгата БП-кБСА. К раствору, содержащему 10 мг конъюгата БП-БСА в 1.5 мл 0.03 М NaOH добавляли 0.4 мл 0.1 М HCl. Раствор центрифугировали в течение 3 мин. при 3000 об/мин и к супернатанту добавляли 2 мл 2 М дигидрохлорида этилендиамина и 10 мг EDC. Далее как описано выше.

Химический синтез пептидов LHLPHHDGVGWG (PiP) и DGVGWG (DG) был осуществлен в лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН методом активированных эфиров в растворе.

Моделирование пространственных структур и комплексов.

Оптимальные шаблоны для моделирования структуры AT по гомологии были подобраны с помощью сервера BLAST. Моделирование проводили в программе Modeller9vl.

Молекулярный докинг проводился в программе AutoDock 4.0. При всех докингах использовался шаг сетки 0.375 ангстрем, размер 126x126x126 точек, центр сетки был между третьими петлями тяжелой и легкой цепей AT,

проводилось 2000 запусков алгоритма LGA, остальные параметры были стандартные.

Для построения модели пептида в составе рШ белка использовали программу моделирования de novo Rosetta. Было построено de novo 5000 моделей, из которых выбрали ту, что имела наибольшее структурное сходство с рШ белком (pdb ID 1G3P). Структурное сходство оценивали программой СЕ.

Иммунизация животных.

Получение гибридом, продуцирующих мАТспецифичные к БП. Четырех 8-недельных самок мышей линии BALB/c иммунизировали конъюгатом БП-БСА в смеси с полным адъювантом Фрейнда (Sigma, США) в подушечки задних лап и внутрибрюшинно каждые 3 недели в течение 2 месяцев. На 10 неделе мышей иммунизировали антигеном с неполным адъювантом Фрейнда. Заключительную иммунизацию проводили антигеном в забуференном физиологическом растворе. Через четыре дня после последней иммунизации для гибридизации были использованы клетки селезенки и двух лимфоузлов лап.

Гибридомы получали посредством слияния клеток мышиной миеломы Sp2/0 и спленоцитов (и клеток лимфоузлов) иммунной мыши по известному протоколу (Kohler G., Milstein С. 1975).

Иммунизация мышей конъюгатами с кБСА. Три группы мышей линии Balb/c иммунизировали внутрибрюшинно тремя разными антигенами (PiP-кБСА, DG-кБСА, БП-кБСА) пятикратно через каждые 2 недели. Первую иммунизацию проводили антигеном в смеси с полным адъювантом Фрейнда, последующие - антигеном с неполным адъювантом Фрейнда. Количество вводимого антигена составляло 80 мг по белку-носителю. Сыворотку крови мышей тестировали на наличие специфических AT в ИФА, начиная с третьей иммунизации.

Иммунизация мышей специфическим клоном фага. Три группы мышей линии ICR иммунизировали внутрибрюшинно тремя разными антигенами (БП-БСА, интактным бактериофагом М13шр8 и специфическим клоном бактериофага) трижды через каждые 2 недели. Первую иммунизацию проводили антигеном в смеси с полным адъювантом Фрейнда, последующие - антигеном с неполным адъювантом Фрейнда. Сыворотку крови мышей тестировали на наличие специфических AT в ИФА через 3 дня после заключительной иммунизации.

Аффинная селекция (биопеннинг) фаговой пептидной библиотеки была проведена в соответствии с протоколом, прилагаемом к набору Ph.D-12™ (New England BioLabs), с использованием мАТ В2 и моноспецифических поликлональных AT к БП.

Иммунологические методы анализа

Дот-ИФА осуществляли по стандартному протоколу (Богоявленский А.П. и др. 1994), для скрининга образцов использовали сыворотки крови иммунизированных мышей и супернатант гибридом.

Вестерн-блот-анализ. Электрофоретическое разделение

рекомбинантного и интактного фагов на составляющие белки в ПААГ с SDS проводили в буферной системе Лэммли (Laemmli U. 1970) с использованием

10%, 12% и 17% разделяющих гелей, для окраски которых использовали раствор Кумасси R-250. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану для проведения иммуноблотгинга осуществляли в "полусухой" буферной системе (Towbin Н. ct al. 1979).

Неконкурентный ИФА

- на выявление специфических AT к ПАУ-БСА

Лунки полистирольных планшетов сенсибилизировали в течение 12 ч. при 4°С 100 мкл раствора ПАУ-БСА (5 мкг/мл). Участки неспецифического связывания насыщали 0.5%-ным раствором БСА в PBS (8 г NaCI, 0.2 г КС1, 2.68 г Na2HP04x7H20, 0.24 г КН2РО в 1л воды, рН 7.2 - 7.4), после чего лунки инкубировали в течение одного часа при 37 °С со 100 мкл аффиноочищенных AT или сыворотки крови иммунизированных животных, разбавленных в PBS, содержащим 0.05% Tween20 (PBST). Связавшиеся AT выявляли пероксидазным конъюгатом AT кролика против суммарных Ig мыши в разведении 1:5000 (ЗАО «БИОСАН», г. Новосибирск). После добавления ТМБ («Fluka», Швейцария) измеряли оптическую плотность (OD) при длине волны 450 нм.

- на выявление специфических AT к PiP- и DG-БСА

Лунки полистирольных планшетов сенсибилизировали в течение 12 ч. при комнатной температуре 100 мкл PiP- или DG-БСА (10 мкг/мл). Далее по протоколу, описанному для выявления специфических AT к ПАУ-БСА.

- на специфическое связывание рекомбинантных бактериофагов с мАТ

В2

В лунки полистирольных планшетов сорбировали 100 мкл моно- или поликлональных AT к БП (5 мкг/мл) в течение одного часа при комнатной температуре. В качестве анализируемых образцов использовали популяции или индивидуальные клоны бактериофагов. Связавшиеся бактериофаги выявляли пероксидазным конъюгатом AT кролика против суммарных белков бактериофага М13 в разведении 1:2000. Клоны, соответствующие лункам, интенсивность окрашивания которых в три и более раз превышала отрицательный контроль (связывание интактного бактериофага М13шр8 с мАТ В2) и контроль неспецифического связывания, отбирали как положительные. Для контроля неспецифического связывания использовали IgG интактных мыши и кролика.

Конкурентный ИФА

Лунки полистирольных планшетов сенсибилизировали раствором ПАУ-БСА. Участки неспецифического связывания насыщали 0.5%-ным раствором БСА в PBST. Затем в лунки вносили смесь мАТ В2 постоянной концентрации с разным количеством конкурента (ПАУ или синтетических пептидов). Смесь мАТ с конкурентом перед внесением в лунки инкубировали в течение 30 мин. с мягким покачиванием при 37 °С. Связавшиеся мАТ выявляли пероксидазным конъюгатом AT кролика против IgG мыши в разведении 1:10000. Оптическую плотность измеряли на микропланшетном ридере при 450 нм.

Для определения кросс-реактивности результаты конкурентного ИФА были выражены в "percent inhibition" (PI), который вычислялся по формуле (1):

Pl=(MAX - TEST)/MAX' 100%, (1)

где MAX - среднее значение показателей абсорбции в лунках, которые получены при связывании мАТ В2 с БП-БСА без добавления конкурента; TEST - показатели связывания мАТ В2 с БП-БСА с добавлением разного количества конкурента. По полученному графику зависимости процента ингибирования связывания мАТ В2 с БП-БСА от количества конкурента находили значение, соответствующее 50% ингибированию (IC50). Кросс-реактивность вычисляли по формуле (2):

СЕЫС5о(БП)/1С5о(ПАУУ100%, (2)

Значение кросс-реактивности для БП принимали за 100%. Статистическую обработку данных проводили с использованием средств Microsoft Excel.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Получение и характеристика моноклонального антитела к бензо[а]пирену.

Первый этап работы состоял в получении гибридомы, продуцирующей мАТ, высокоспецифичное к БП (мАТ В2). Всего в результате двух гибридизаций было получено и проанализировано 175 клонов, из которых 5 показали положительные результаты. МАТ этих клонов были изучены на способность перекрестного реагирования с БП, БА, антраценом, пиреном, хризеном в дот-ИФА. Оказалось, что мАТ В4 и В15 с БП реагируют хуже, чем с остальными ПАУ; мАТ В5 и В11 показали широкую специфичность по спектру, близкую поликлональным AT к БП; мАТ В2 (IgG) не взаимодействовало с антраценом, в несколько раз менее активно реагировало с пиреном и хризеном. В то же время его активность в реакции с БП и БА была сравнительно высокой, в результате чего оно было выбрано для дальнейшей работы.

Для определения чувствительности и специфичности мАТ В2 был использован конкурентный ИФА. На поверхности полистироловых планшетов для ИФА адсорбировали конъюгат БП-БСА. Вместе с мАТ В2 в лунки вносили конкурирующие соединения в концентрациях от 1 рМ до 10000 рМ. В качестве конкурентов использовали соединения группы ПАУ, входящие в список U.S. Environmental Protection Ageny, как наиболее распространенные в среде и представляющие опасность для здоровья животных и человека. Чувствительность мАТ В2 к ПАУ определяли по количеству гаптена, необходимого для 50% ингибирования связывания этого AT с конъюгатом БП-БСА. Чувствительность распознавания мАТ В 2 БП составила 6 рМ (рис. 1). На втором месте после БП по чувствительности мАТ В2 оказался БА (8 рМ), а на последнем - антрацен (700 рМ).

На основании полученных результатов возможно предположение, что особенности структуры химических соединений с низкой молекулярной массой являются определяющим фактором специфического связывания. Даже ПАУ с одинаковым количеством, но разным расположением бензольных колец (БА, хризен, пирен) имеют явно выраженные различия по силе связывания с мАТ В2.

Рисунок ]. Конкурентное ингибирование различными ПАУ связывания мАТ В2 с иммобилизованным конъюгатом БП-БСА.

На рис. 2 представлено сравнение структуры исследуемых химических соединений с БП, а также соответствующая кросс-реактивность (СЯ).

Флуорантен (I %)

Антрацен (0.9 %)

Нафталин (< 0.1 %)

Стильбен (< 0.1 %)

Бенз [а] антрацен (78 %)

11Н-бензо[Ь]флуорен (17 %)

Хризен (70 %)

Пирен (9 %)

Флуорен (< 0.1 %)

Бензо[а]нирен (100%)

11Н-бензо[а]флуорен

(31 %)

Рисунок 2. Структурные особенности исследуемых соединений по сравнению с молекулой БП. В скобках указано значение кросс-реактивности.

Таким образом, кросс-реактивность широко варьирует между исследованными соединениями и эта вариабельность носит, очевидно, структурно-зависимый характер.

Исходя из предположения о том, что одним из условии взаимодействия AT к ИЛУ с другими соединениями является наличие ароматического кольца, мАТ В2 были исследованы на возможность кросс-реакции с такими аминокислотами, как триптофан и фенилаланин. Ингибирования обнаружено не было (данные не представлены).

Принимая во внимание тот факт, что в метаболизме ПАУ и гидрофобных низкомолекулярных эндогенных соединений, таких как стероидные гормоны, принимает участие один рецептор (Ah-рецептор), было проведено исследование мАТ В2 на перекрестное реагирование с группой эстрогенов. Связывания мАТ В2 с прогестероном, прегненолоном, эстроном и эетрадиолом не выявлено (данные не представлены),

Для определения возможного механизма взаимодействия мАТ В2 с гаптенами был смоделирован Fab фрагмент данного AT и при помощи молекулярного докинга с рядом соединений группы ПАУ определена структура активного центра.

Моделирование комплексов Fab фрагмента мАТ В2 с рядом ПАУ проводили с помощью программы молекулярного докинга AutoDock. Эта программа предсказывает положение лиганда и энергию связи, которая не совпадая с реальной энергий по абсолютной величине, хорошо коррелирует с ней для соединений близкой химической природы.

Молекулярный докинг — это метод молекулярного моделирования, который позволяет предсказать наиболее выгодную для образования устойчивого комплекса ориентацию и положение одной молекулы по отношению к другой. Предсказанная методом молекулярного докинга наилучшая позиция для связывания БП и ряда других ПАУ находилась между третьими петлями легкой и тяжелой цепей мАТ В2 (данный карман условно назван К1). Именно в этом районе большинство известных AT к гаптенам связывают свои лиганды. В кармане К1 было обнаружено два положения связывания ПАУ - К1П1 и К11Т2 (рис. 3 А, В). В том случае, когда молекула ПАУ полностью погружена в карман (положение К1ГП) энергия связи комплекса для БП оказывалась минимальной. Когда молекула ПАУ лежит на поверхности кармана (положение К1П2), энергия связи комплекса для БП - выше. В то время как для других ПАУ (БА, бензо[а]флуорена, бензо[Ь]флуорена, флуорантена, стильбена) такое положение оказалось более выгодным для связывания с мАТ В2 (табл.).

ABC

Рисунок 3. Модели структур комплексов БП с активным центром Fab фрагмента мДТ В2 (Л - связывание БП в положении К1П1. В - связывание БП в положении К1П2. С - связывание БП во втором кармане (К2)).

Помимо наличия двух положений связывания ПАУ в кармане К1 в структуре Fab фрагмента мАТ В2 для большинства ПАУ, за исключением нафталина, также было предсказано связывание с большей энергией связи в районе между второй петлей легкой цепи и третьей петлей тяжелой цепи -карман К2 (табл.. рис. 3 С).

Таблица. Сравнительная характеристика энергии связи ПАУ с мДТ В2.

Энергия связи Средняя энергия в Средняя энергия в Средняя энергия

1 кармане (К1П1), 1 кармане (К1П2). во 2 кармане (К2).

кКал/моль кКал/моль кКал/мол

1. бензо[а]пирен -7.96 -7.59 -7.43

2. бенч[а]антрацен -7.39 -7.53 -6.88

3. хризен -7.50 -7.35 -6.87

4. бснзо[а]флуорен -6.88 -7.43 6.70

5. бензоЩфлуорен -6.87 -7.35 -6.35

6. флуорантен -5.7! -7.18 -6.51

7. пирен -6.83 -5.65 -6.22

8. антрацен -6.47 -6.38 -5.84

9. стильбен -6.05 -6.29 -5.24

10. флуорен -6.13 -5.75 -5.43

1!. нафталин -5.15 -4.55

Средняя энергии связывания Fab фрагмента мАТ В2 с рядом ПАУ. вычисленная программой молекулярного докинга, коррелировала с полученными экспериментальными данными кросс-реактивности мАТ В2 с этими же ПАУ (рис. 4). Коэффициент корреляции составил -0.83 для следующего ряда ПАУ: флуорантен. антрацен, пирен, бензо[Ь1флуорен. бензо[а]флуорен, хризен, БА. БГ1 (без учета соединений, для которых кросс-реактивность оказалась 0%). Это подтверждает достоверность структуры активного центра, полученной при молекулярном моделировании.

_____J

100 ■ 80 ■ БО ■ 40 ■

20 ■ О ■

9. 10.

11.

-6,5

к'КлЛ МОЛЬ

Рисунок 4. Зависимость кросс-реактивности ПАУ от энергии их связывания с мАТ В2 (порядковый номер соответствует номеру соединения в таблице).

Таким образом, данные, полученные при моделировании комплексов ПАУ с мАТ В2, согласуются с полученными результатами экспериментальных исследований кросс-реактивности АТ (рис.2). Это подтверждает правильность построенных моделей, а также раскрывает возможные механизмы межмолекулярных взаимодействий.

Комплексное исследование мАТ В2 показало, что оно действительно является высокоспецифичным к БП, что послужило основанием перейти к следующему этапу исследований.

2. Получение и характеристика пептида-мимотопа бензо[а]пирена

Поиск пептида-мимотопа БП осуществляли при помощи технологии фагового дисплея в следующей модификации. Процедура биопеннинга представляла собой инкубацию исходной библиотеки РЬ.О-12™ с моно- и поликлональными АТ к БП, отмывку несвязавшихся и элюцию связавшихся с АТ бактериофагов. Для исключения неспецифического связывания бактериофагов с консервативными участками интактных мыши и

кролика применяли перекрестное картирование АТ в третьем раунде биопеннинга. Популяцию рекомбинантных бактериофагов, полученную после второго раунда биопеннинга с мАТ В2, в третьем раунде наносили как на моно-, так и на поликлональные АТ к БП (в результате получали популяции ммЗ и мпЗ соответственно). Популяцией, элюированной с поликлональных АТ, также картировали как моно-, так и поликлональные АТ к БП (популяции пмЗ и ппЗ соответственно). Популяции рекомбинантных бактериофагов после каждого раунда аффинной селекции были протестированы в ИФА на способность связываться с мАТ В2, а также с 1й(5 интактной мыши (рис. 5). В качестве отрицательного контроля использовали исходную пептидную фаговую библиотеку (РЬ.О-12™).

амАТВ2

."7 IpG И.Ш1

ill!

->s > / / <-г ^ / пвп)ги*иит< бастарисфзго*

Рисунок 5. Связывание фаговых популяций с мАТ В2 после каждого раунда биопеннинга.

После трех раундов биопеннинга было отобрано 40 индивидуальных клонов, которые были проскринированы на способность к связыванию с мАТ В2 в неконкурентном ИФА. В качестве отрицательного контроля использовали бактериофаг М13, на основе которого была сконструирована используемая библиотека. В результате было выявлено 5 положительных клонов. Результаты секвенирования ДНК данных клонов с последующей трансляцией показали, что все 5 клонов имели идентичную аминокислотную последовательность рекомбинантного пептида - LHLPHHDGVGWG. Для дальнейших исследований пептида-мимотопа использовали один из полученных положительных клонов рекомбинантого бактериофага - клон 2мм.

Для иммунохимической характеристики пептида в составе pill белка специфического клона использовали ИФА с серийным разведением бактериофагов от 10й до 106 кое/лунке (рис. 6).

00 1

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0А 0,3 0,2 0.1 0

-М13тр8

10"

10'

10' 10' кое лунке

Рисунок 6. Дозозависимое связывание интактного бактериофага М13тр8 и специфического клона фага 2мм с мАТ В2.

Установлено, что связывание рекомбинантных бактериофагов с адсорбированными на пластике мАТ В2 значительно превышает таковое в отрицательном контроле. Наблюдается дозозависимое уменьшение способности специфического связывания клона 2мм - максимальное значение при концентрации 10" кое/лунке, а минимальное при 107 кое/лунке.'

С помощью вестерн-блот-анализа исследовали связывание искомого пептида в составе pill белка выделенного клона 2мм с мАТ В2 и моноспецифическими поликлональными AT против Г1АУ. Ни те, ни другие AT не реагировали с белком рШ бактериофага М13шр8. Кроме того, моноспецифические AT к хризену, пирену и антрацену не реагировали с исследуемым пептидом. Не выявлено связывания pill белка исследуемых бактериофагов с IgG интактных мыши и кролика.

В то же время мАТ В2 и поликлональные AT к БП и БА активно реагировали с белком рШ специфического клона бактериофага. Это подтверждает наличие искомого пептида-мимотопа в составе pill белка клона 2мм (рис. 7).

Рисунок 7. Иммуноблоттинг бактериофага М13шр8 (0) и пептида в составе pill белка специфического клона бактериофага 2мм (1) с мАТ В2 (I) и поликлональными моноспецифическими AT к БП (II) и БА (III).

Для выяснения того, способен ли пептид-мимотоп БП (PiP) специфично связываться с мАТ В2 независимо от pill белка бактериофага, был осуществлен его синтез. Исходя из предположения, что важную роль в структурной мимикрии ПАУ играет молекула триптофана за счет наличия ароматического кольца и своей гидрофобное™, была синтезирована С-половинка пептида (DG) - DGVGWG.

Специфичность полученных синтетических пептидов исследовали при помощи конкурентного ИФА. В качестве отрицательного контроля использовали триптофан (рис. 8). Выяснилось, что PiP и DG конкурировали с иммобилизованным конъюгатом БП-БСА за связывание с мАТ В2, но в значительно меньшей степени, чем БП. Вместе с тем Тгр не конкурировал вовсе. Это может говорить о том, что сама по себе эта аминокислота не является детерминантой связывания с AT к химическим канцерогенам группы Г1АУ.

им

Рисунок 8. Конкурентное ингкбирование БП (1), PiP (2), DG (3) и Тгр (4) связывания мАТ В2 с иммобилизованным конъюгатом БП-БСА.

Для изучения иммуногенных свойств PiP и DG пептидов мышей линии Balb/c иммунизировали их конъюгатами с кБСА. КБСА был выбран в качестве белка-носителя по двум причинам. Во-первых, в ряде работ было показано, что он обладает высокой иммуногенной активностью, во много раз превышающей таковую у БСА. Во-вторых, пришивка пептида к кБСА происходит направленно по С-концу (Muckerheide A. et al. 1987). Ориентирование пептида в составе конъюгата может играть ключевую роль в получении специфического иммунного ответа, т.к. изначально в фаговой пептидной библиотеке он был соединен с pill белком бактериофага именно С-концом, а N-концом экспонирован на поверхности. В качестве положительного контроля мышей иммунизировали конъюгатом БП-кБСА.

Через две недели после каждой серии иммунизации сыворотку крови исследовали на наличие AT к ПАУ. Всего было выполнено 5 введений конъюгатов PiP и DG с кБСА. Контролем иммунизации был анализ сывороток на наличие AT к исходному конъюгату.

Анализ сывороток опытной группы мышей, иммунизированных конъюгатами PiP- или DG-кБСА, показал, что все три мыши из каждой опытной группы продуцируют AT к PiP или DG в большом количестве уже после третьей иммунизации. При иммунизации мышей конъюгатом DG-кБСА имело место и образование AT к БА и антрацену, но в значительно меньшем количестве, чем к исходному антигену (данные не представлены). Слабая реверс-мимикрия может быть объяснена тем, что триптофан доступен для AT только в составе белка pill. Само по себе экспонирование гидрофобной аминокислоты триптофана на поверхности белка энергетически невыгодно, но может иметь место, если оно компенсируется энергетически выгодными взаимодействиями пептида PiP с белком pill. Такие взаимодействия могут отсутствовать в обособленном пептиде PiP, в пептиде DG и в пептиде PiP, конъюгированном с другими носителями.

С помощью программы Rosetta была построена предварительная модель пептида в составе белка pill (рис. 9). Смоделированная структура пептида в составе pill белка показывает, что триптофан в составе пептида может быть экспонированным на поверхности и доступным для AT. Такая структура оказалась возможной за счет взаимодействия пептида с белком pill, в частности, гидрофобных районов белка с гидрофобными остатками пептида.

Рисунок 9. Модель структуры пептида PiP в составе рШ белка бактериофага.

Для подтверждения участия триптофана в связывании с мАТ В2 был осуществлен докинг связывания короткого участка пептида С^'С с мАТ В2. Молекулярный докинг показал, что С^Л^в предположительно связывается так, что боковой радикал триптофана оказывается в сайте К2 (рис. 10).

Рисунок 10. Молеклярный докинг связывания мАТ В2 с БП (1) и последовательностью GWG (2).

Для определения in vivo иммуногенных свойств пептида-мимотопа БП в составе pill белка бактериофага был проведен эксперимент, в котором мышей иммунизировали: 1 - амплифицированным клоном фага 2мм, презентирующим специфический пептид; 2 - бактериофагом М13шр8 в качестве отрицательного контроля и 3 - конъюгатом БП-БСА в качестве положительного контроля. Через 3 недели после начала иммунизации был проведен анализ сыворотки крови на содержание специфических AT к БП (рис. 11).

OD 18 1.6 - 1.4 \ -иммумизацлч БП-БСА (положительный контроль)

1 \ \\ иммунизация М i Зтр8 (отрицательны й контроль)

0.8 ' 0.6 - \ \ \ \ иммунизация клоном 2мм (ОПЬГГ)

0.4 • \ \ \

0.2 •

0 ——-—б

1/10 1/100 1/1000 Рлведенич сыворотки

Рисунок 11. ИФА сыворотки крови мышей на наличие АТ к БП после иммунизации специфическим клоном бактериофага 2мм.

Выяснилось, что после иммунизации интактным бактериофагом М13тр8 АТ к БП не появляются. В то же время обнаружено наличие специфических АТ к БП в сыворотках крови мышей, иммунизированных конъюгатом БП-БСА и специфическим клоном фага 2мм. Это подтверждает

способность полученного пептида-мимотопа БП в составе pill белка индуцировать синтез AT к исходному канцерогену - БП и перспективность выбранного подхода к созданию антиканцерогенных вакцин для иммунопрофилактики рака.

ВЫВОДЫ

1. Получено мАТ В2 с высокой специфичностью к бензо[а]пирену и бенз[а]антрацену и низкой кросс-реактивностью с неканцерогенными ПАУ, которое не реагирует с эндогенными лигандами (стероидными гормонами и ароматическими аминокислотами).

2. Определены аминокислотные последовательности вариабельных фрагментов тяжелой и легкой цепей мАТ В2, по которым была смоделирована структура Fab фрагмента мАТ В2. Установлено, что активный центр связывания ПАУ расположен между третьими петлями тяжелой и легкой цепей.

3. Установлено, что экспериментально полученные значения кросс-реактивности мАТ В2 с ПАУ положительно коррелируют с рассчитанными значениями энергии связи.

4. Из пептидной фаговой библиотеки выделен клон бактериофага, содержащий в своем составе пептид-мимотоп, способный к специфическому связыванию с мАТ В2 и поликлональными антителами к бензо[а]пирену и бенз[а]антрацену.

5. Определена аминокислотная последовательность и осуществлен синтез пептида-мимотопа бензо[а]пирена, установлено, что пептид обладает слабой способностью конкурировать с бензо[а]пиреном за связывание с мАТ В2.

6. Показано, что иммунизация мышей рекомбинантным клоном бактериофага, содержащим исследуемый пептид-мимотоп, приводит к образованию AT к исходному канцерогену БП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Глушков А.Н., Апалько C.B., Филипенко МЛ., Матвеева В.А., Храпов Е.А., Костянке М.В. 2008. Новый подход к получению пептида-иммуномиметика бензо(а)пирена. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 3,32-36.

2. Глушков А.Н., Апалько C.B., Матвеева В.А., Костянко М.В., Черно C.B. 2009. Моноклональные антитела к химическим канцерогенам группы полициклических ароматических углеводородов. Российский иммунологический журнал. 3, 30-38.

3.Глущков А.Н., АпалькоС.В., Филипенко МЛ., Матвеева В.А., Храпов Е.А., Костянко М.В. 2008. Нанобиотехнология получения антиканцерогенной вакцины. Альманах клинической медицины. Том XVII, часть П, стр. 299-303

4. Апалько C.B., Филиппенко М.Л., Глушков А.Н. 2008. Использование фаговых пептидных библиотек для картирования эпитопов рецепторных молекул. Биотехнология. Теория и практика. 1, 17-28.

5. Апалько C.B., Глушков А.Н., Филипенко M.JL, Матвеева В.А., Храпов Е.А., Костянко М.В. Новые подходы к изучению гаптен-

специфических взаимодействий канцерогенных частиц с иммунной системой. // Сборник трудов научной конференции «Химическая биология -Фундаментальные проблемы бионанотехнологии». - Новосибирск, 10-14 июня 2009 г. - С. 65.

6. Апалько C.B., Глушков А.Н., Филипенко M.JL, Матвеева В.А., Храпов Е.А., Костянко М.В. Биотехнология получения пептида-иммуномиметика химических канцерогенов. // Сборник тезисов докладов участников Научно-практической конференции «Биологически-активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». - Новый свет, Крым, Украина, 25-30 мая 2009 г. - С. 11-12.

7. Апалько C.B. Иммунологические подходы к защите человека от химических канцерогенов. // Материалы III Международной научно-практической конференции молодых исследователей, посвященной 65-летию образования Волго1радской государственной сельскохозяйственной академии «Наука и молодёжыновые идеи и решения». - Волгоград, 13-15 мая 2009 г. - С. 9-10.

8. Глушков А.Н., Апалько C.B., Филипенко М.Л., Матвеева В.А., Храпов Е.А., Костянко М.В. Пептид-иммуномиметик полициклических ароматических углеводородов. // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (с международным участием). -Новосибирск, 11-15 мая 2008 г. - С. 301.

9. Апалько C.B., Глушков А.Н., Филипенко М.Л., Матвеева В.А., Храпов Е.А., Костянко М.В. Новый подход к иммунопрофилактике рака, биотехнология получения вакцин против химических канцерогенов. // Сборник тезисов докладов участников V Конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (с международным участием). - Москва, 19-22 мая 2008 г. - С. 26.

10. Апалько C.B., Глушков А.Н., Филипенко М.Л., Матвеева В.А., Храпов Е.А., Костянко М.В. Получение и характеристика пептидов-мимотопов бензо[а]пирена из библиотеки рекомбинантаых фагов. // Сборник трудов Ш Международной конференции «Фундаментальные науки-медицине». - Новосибирск, 2-8 сентября, 2007 г. - С. 14.

Патент

Глушков А.Н., Апалько C.B., Филипенко М.Л., Матвеева В.А., Храпов Е.А., Костянко М.В. Пептид-иммуномиметик химических канцерогенов, обладающий способностью специфически взаимодействовать с антителами против бензо[а]пирена и бенз[а]антрацена. Патент РФ № 2357975 отЮ июня 2009 г.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по государственному контракту № 02.512.12.2044 по теме «Получение пептида-иммуномиметика химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов для иммунопрофилактики рака».

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТ - антитела

БА - бенз[а]антрацен

БП - бензо[а]пирен

БСА - бычий сывороточный альбумин

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

ИФА — иммуноферментный анализ

кое - колонеобразующие единицы

мАТ - моноклональные антитела

ПААГ - полиакриламидный гель

СИ - кросс-реактивность

00 - оптическая плотность

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне признателен сотрудникам ИХБФМ СО РАН М.Л. Филипенко, В.А. Матвеевой и Л.Э. Матвееву, Е.А. Храпову, В.Н. Сальникову, Е.Н. Ворониной, а также сотрудникам ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Л.И. Карпенко, Т.А. Веремейко, А.Ю. Бакулиной за оказанное содействие в работе.

Выражаю глубокую благодарность и признательность академику Д.Г. Кнорре за постоянную под держку и оказываемую помощь.

Подписано к печати 21.11.2009. Формат 60х841/16. Объем 1,0 усл.печ.л. Тираж 100 экз.Редакционно-издательский отдел ИУУ СО РАН

650610, Кемерово, ГСП-610, ул. Рукавишникова, 21. Тел 210-500

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Апалько, Светлана Вячеславовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Роль антител в защите организма от химических канцерогенов.

1.1.1. Индукция и функции антиканцерогенных антител.

1.1.1.1. Индукция антиканцерогенных антител в естественных условиях.

1.1.1.2. Индукция антиканцерогенных антител в модельных экспериментах.

1.1.2. Механизмы угнетения и стимуляции канцерогенеза антителами.

1.1.3. Механизмы взаимодействия антител с полициклическими ароматическими углеводородами.

1.2. Использование технологии фагового дисплея для получения пеп- ^ тидных лигандов.

1.2.1. Использование пептидных фаговых библиотек для картирования эпитопов рецепторных молекул.

1.2.2. Получение пептидов-мимотопов непептидных соединений.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

Глава 3. Результаты и обсуждение исследований.

3.1. Получение и характеристика моноклональных антител к бен- ^ зо[а]пирену.

3.1.1. Получение и скрининг мышиных гибридом, синтезирующих моноклональные антитела к бензо[а]пирену.

3.1.2. Иммунохимическая характеристика мАТ В 2.

3.1.3. Моделирование РаЬ-фрагмента мАТ В 2.

3.2. Получение и характеристика пептида-мимотопа бензо[а]пирена.

3.2.1. Аффинная селекция специфических клонов из пептидной фаговой библиотеки.

3.2.2. Иммунологическая характеристика пептида-мимотопа бензо[а]пирена.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотные остатки

AT - антитела

Б А - бенз [а] антрацен

БП - бензо[а]пирен

БСА - бычий сывороточный альбумин

БФ - бактериофаг

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

ИФА — иммуноферментный анализ кБСА - катионизированный БСА кДНК - кодирующая ДНК кое - колонеобразующие единицы мАТ - моноклональные антитела

ПААГ — полиакриламидный гель п.н. - пары нуклеотидов

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

Ah - арил-гидрокарбон сур - цитохром

CR - кросс-реактивность

Fv -вариабельный фрагмент AT

Ig - иммуноглобулины

GST - глутатион-8-трансфераза

OD - оптическая плотность rFab - рекомбинантный Fab фрагмент AT

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение пептида-мимотопа химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов"

Актуальность проблемы. По данным Международного агентства ВОЗ по изучению рака 80% онкологической заболеваемости населения определяется воздействием на человека преимущественно химических факторов среды. Канцерогенному воздействию подвергаются большие группы населения индустриально развитых регионов не только в силу непосредственной близости канцерогенно-опасных производств, но и в следствие загрязнения окружающей среды автомобильными выбросами, широкого распространения курения табака (активного и пассивного) и т.п.

Основная канцерогенная нагрузка приходится на полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Бензо[а]пирен (БП) - одно из самых активных и распространенных в окружающей среде соединений, относящихся к безусловным канцерогенам для человека, что дало основание рассматривать его в качестве индикатора группы ПАУ [1].

Таким образом, существует насущная потребность в разработке новых эффективных методов профилактики злокачественных опухолей, основанных на защите организма от химических канцерогенов, в частности, от БП.

Ранее в модельных экспериментах было показано, что торможение канцерогенеза, а именно появления и роста химически индуцированных опухолей, достижимо за счет индукции образования соответствующих антиканцерогенных антител (АТ). Поэтому в основу профилактики рака может быть заложен принцип иммунологической защиты организма от химических канцерогенов.

Предлагаемый ранее подход иммунопрофилактики рака, основанный на использовании конъюгатов химических канцерогенов (или их аналогов) с мак-ромолекулярными носителями в качестве антиканцерогенных вакцин неприменим для иммунопрофилактики рака у человека, т.к. сохраняется вероятность индукции опухоли самим канцерогеном в составе такого конъюгата [2, 3].

Принципиально новый подход использовали Chagnaud J.L. и соавт. (Université de Bordeaux II, France) [4]. В 1992 г. они сообщили о получении ан-тиидиотипических AT к канцерогенам (вторых AT). Вторые AT несут в себе так называемый «внутренний иммунологический образ» канцерогена и способны индуцировать синтез AT, связывающих канцероген. В 1993-1995 г.г. они описали ингибирующее действие вторых AT на возникновение опухолей, индуцированных канцерогенами у животных. Однако, использование таких AT в практике имеет серьезные недостатки, такие как появление сопутствующих AT против видовых, аллогенных и изотипических эпитопов и развитие нежелательных аллергических реакций.

В данной работе предлагается новый подход к созданию антиканцерогенных вакцин, основной идеей которого является получение пептида, модулирующего иммунные функции низкомолекулярного соединения, такие как индукция антиканцерогенных AT и торможение канцерогенеза. Получение такого пептида возможно при помощи использования технологии фагового дисплея. Полученный пептид-мимотоп также как и антиидиотипические AT не будет содержать канцерогена, способного индуцировать возникновение опухоли, и в тоже время сопутствующих антигенных детерминант, вызывающих побочные патологические осложнения.

Цель работы: получение пептида-мимотопа химических канцерогенов.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать мАТ с заданными свойствами - высокой специфичностью к БП и низкой кросс-реактивностью с неканцерогенными ПАУ и эндогенными структурно схожими соединениями.

2. Смоделировать структуру Fab фрагмента полученного мАТ и определить расположение активного центра связывания соединений группы ПАУ.

3. При помощи технологии фагового дисплея получить рекомбинант-ные клоны бактериофагов, содержащие пептид, специфически взаимодействующий с AT к БП.

4. Изучить иммунологические свойства пептида-мимотопа БП.

Научная новизна. Впервые в России получено мАТ к БП (мАТ В2). По своим характеристикам мАТ В2 не уступает зарубежным аналогам, а по специфичности к БП даже превосходит. Полученное мАТ В2 обладает высокой кросс-реактивностью к бенз [а] антрацену (БА), вероятному канцерогену для человека, и низким аффинитетом к неканцерогенным структурно схожим веществам.

Определены нуклеотидные последовательности ДНК, кодирующие вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей.мАТ В2, транслированы в аминокислотные последовательности, на основе которых построена модель центра связывания мАТ В2. При помощи математического моделирования было определено место и сила связывания мАТ В2 с рядом химических соединений группы ПАУ.

На основе полученных моно- и поликлональных AT к БП при помощи технологии фагового дисплея впервые удалось получить пептид-мимотоп химических канцерогенов группы ПАУ. Полученный пептид-мимотоп, обладает способностью специфически связываться с мАТ В2 и моноспецифическими по-ликлональными AT к БП и БА.

Пептид-мимотоп бензо[а]пирена в составе pill белка бактериофага обладает иммуногенными свойствами - способностью индуцировать синтез AT к БП при иммунизации животных.

Научно-практическая значимость работы. Предложенный подход, позволяющий получать пептид-мимотоп химических канцерогенов группы ПАУ, способный индуцировать антиканцерогенный иммунный ответ, может быть использован для получения пептидов-мимотопов других низкомолекулярных органических соединений, представляющих опасность для здоровья человека и животных (например, пестицидов).

Полученный пептид-мимотоп БП и БА может быть использован при разработке принципиально новой группы иммунопрепаратов - антиканцерогенных вакцин, а также при создании новых диагностических тест-систем на основе иммуно-ферментного анализа (ИФА) для определения наличия антиканцерогенных AT. Замена в таких диагностических системах конъюгатов канцероген-белок на пептид-мимотоп исключит работу с потенциально опасными реагентами.

На полученный в данной работе пептид-мимотоп БП и Б А получен патент'

РФ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на III Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (г. Новосибирск 2-8 сентября 2007 г), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск 11-15 мая 2008 г.), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва 19-22 мая 2008 г.), III Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (г. Троицк 3-6 июня 2008 г.), V Северном социально-экологическом конгрессе (г. Москва 21-22 апреля 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Новые идеи и решения молодых исследователей в развитии АПК» (1-е место) (г. Волгоград 13-15 мая 2009 г.), научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (г. Новый свет, Крым, Украина, 25-30 мая 2009 г.), научной конференции, посвященной 25-летию Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН «Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехноло-гии» (г. Новосибирск, 10-14 июня 2009 г.).

Апробация диссертации состоялась2009 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ. По результатам работы получен 1 патент РФ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Апалько, Светлана Вячеславовна

ВЫВОДЫ

1. Получено мАТ В2 с высокой специфичностью к бензо[а]пирену и бенз[а]антрацену, и низкой кросс-реактивностью с неканцерогенными ПАУ, которое не реагирует с эндогенными лигандами (стероидными гормонами и ароматическими аминокислотами).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Апалько, Светлана Вячеславовна, Кольцово

1. Перечень веществ, продуктов, производственных процессов, бытовых и природных факторов, канцерогенных для человека. Гигиенические нормативы ГН 1.1.725-98 МЗ России. -М., 1999.

2. Moolten F.L., Schreiber В., Rizzone A. Protection of mice against 7.12-dimethylbenz(a)antracene-induced skin tumors by immunization with a fluorinated asnalog of carcinogen. Cancer Res., 1981, .41, .452-459.

3. Silbart L.K., et al. Selective induction of mucosal immune responses to 2-acetylaminofluorene. Anticancer Research, 1996, 16, 651-660.

4. Chagnaud J.L., Faiderbe S., Geffard M. Effects of a monoclonal anti-idiotypie antybody, internal image of benzo(a)pyrene, on rat sarcomas. Acad.Sci. Paris, Sciences de la vie, 1993, 316, 1266-1269.

5. Ames B.N, Gold L.S, Willett W.C. The causes and prevention of cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92, 5258-5265.

6. Перечень веществ, продуктов, производственных процессов, бытовых и природных факторов, канцерогенных для человека. Гигиенические нормативы ГН 1.1.725-98 МЗ России. -М., 1999.

7. Кошкина B.C., Анипанова Н.А., Котляр Н.Н. Мониторинг распространенности химических канцерогенов в объектах окружающей среды и биосферах у жителей города с развитой отраслью черной металлургии. Гигиена и санитария, 2006, 12-14.

8. International Agency for Recearch on Cancer Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans. Polynuclear Aromatic Compounds. Part I: International Agency for Recearch on Cancer. Lyon. France, 1983: Vol. 32.

9. Гуляева Л.Ф., Гришанова А.Ю. и др. Микросомная монооксигеназная система живых организмов в биомониторинге окружающей среды. Аналитический обзор. ГПНТБ, Новосибирск, 1994 98 с.

10. Гуляева Л.Ф., Вавилин В.А., Ляхович В.В. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков в химическом канцерогенезе. Аналитический обзор. ГПНТБ, Новосибирск, 2000 90 с.

11. Yang C.S., Brady J.F., Hong J.Y. Dietary effects on cytochromes P450, xenobiotic metabolism and toxicity. FASEB J., 1992, 6, 737-744.

12. Rendic S., Di Carlo F.J. Human cytochrome P450 enzymes: a status report summarizing their reactions, substrates, inducers and inhibitors. Drug Metab. Rev., 1997, 29,413-580.

13. Hankinson O. The aryl hydrocarbon receptor complex. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol, 1995, 35, 307-340.

14. Pelkonen O. and Nebert D.W. Metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: etiologic role in carcinogenesis. Pharmacol. Rev., 1982, 34, 189-222.

15. Jerina D.M., Sayer J.M. et al. Carcinogtnicity of polycyclic aromatic hydrocarbons: the bay-region theory. In: Pullman В., ed. Carcinogenesis: fundamental mechanisms and environmental effects, 1980, 1-12.

16. Miller K.P., Ramos K.S. Impact of cellular metabolism on the biological effects of benzoa.pyrene and related hydrocarbons. Drug Metab.Rev., 2001, 33, 135.

17. Sticha K.R., Staretz M.E., Wang M., Liang H., Kenney P.M., Hecht S.S. Effects of benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate on benzoa.pyrene metabolism and DNA adduct formation in the A/J mouse. Carcinogenesis, 2000, 21, 1711-1719.

18. Vijayalakshmi KP, Suresh CH. Theoretical studies on the carcinogenic activity of diol epoxide derivatives of PAH: proton affinity and aromaticity as decisive descriptors. Org Biomol Chem., 2008, 6, 4384-4390.

19. Autrup H, Harris C.C, Trump B.F, Jeffrey A.M. Metabolism of benzo-(a)pyrene and identification of the major benzo(a)pyrene-DNA adducts in cultured human colon. Cancer Res, 1978, 38, 3689-3696.

20. Sogawa K., Fujii-Kuriyama Y. Ah receptor, a novel ligandactivated transcription factor, J. Biochem., 1997, 122, 1075-1079.

21. Hahn Mark E. Aryl hydrocarbon receptors: diversity and evolution. Chemico-Biological Interactions, 2002, 141, 131-160.

22. Harper Patricia A., Wong Judy M.Y., Lam Maria S.M., Okey Allan B. Polymorphisms in the human AH receptor. Chemico-Biological Interactions, 2002, 141, 161-187.

23. Denison Michael S., Pandini Alessandro, Nagy Scott R., Baldwin Enoch P., Bonati Laura. Ligand binding and activation of the Ah receptor Chemico-Biological Interactions, 2002, 141, 3 -24.

24. Puga Alvaro, Xia Ying, Elferink Comelis. Role of the aryl hydrocarbon receptor in cell cycle regulation. Chemico-Biological Interactions, 2002,141, 117-130.

25. Nebert Daniel W., Dalton Timothy P., Okey Allan B., Gonzalez Frank J. Role of Aryl Hydrocarbon Receptor-mediated Induction of the CYP1 Enzymes in Environmental Toxicity and Cancer. The journal of biological chemistry, 2004, 279, 23847-23850.

26. Gonzalez F.J., Fernandez-Salguero P. The aryl hydrocarbon receptor: studies using the AHR-null mice. Drug Metab. Dispos., 1998, 12, 1194-1198.

27. Fernandez-Salgureo P.M., Hilbert D.M., Rudikoff S., Ward J.M., Gonzaler F.J. Aryl-hydrocarbon receptor-deficient mice are resistant to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced toxicity. Toxicol. Appl. Pharmacol, 1996, 140, 173-179.

28. Kazumi Sugihara et al. Aryl hydrocarbon receptor-mediated induction of microsomal drug-metabolizing enzyme activity by indirubin and indigoq. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 318, 571-578.

29. Chen S., Nguyen N., Tamura K., Karin M. and Tukey R.H. The role of the Ah receptor and p38 in benzoa.pyrene-7,8-dihydrodiol and benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide-índuced apoptosis. J. Biol. Chem., 2003, 278, 1952619533.

30. Kim J.H., Stansbury K.H., Walker N.J., Trush M.A., Strickland P.T., Sutter T.R. Metabolism of benzoa.pyrene and benzo[a]pyrene-7,8-diol by human cytochrome P450 1B1. Carcinogenesis, 1998, 19, 1847--1853.

31. Rushmore TH, Kong AN. Pharmacogenomics, regulation and signaling pathways of phase I and II drug metabolizing enzymes. Curr Drug Metab., 2002,3,481-490.

32. Ковалев И.Е., Шипулина H.B. Иммунохимические адаптации организма к окружающей химической среде. Серия биологическая, 1992, 1, 31-41.

33. Ковалев И.Е., Шипулина Н.В., Томилина Н.Ю. Индукция цитохрома Р-450 и последующая индукция иммунного ответа у крыс при хроническом введении ксенобиотиков, Фармакол. и токсикол., 1990, 53, 54-57.

34. Ковалев И.Е., Шипулина Н.В. Ковалентное связывание ксенобиотиков с белками организма как механизм адаптации. Хим.-фарм. ж-л, 1996, 12, 3-11.

35. Creech H.J., Franks W.R. Compounds synthesized from protein and carcinogenic hydrocarbons. Amer. J. Cancer, 1937, 30, 555-562.

36. Peck R.M., Peck E.B. Inhibition of chemically induced neoplasia by immunization with an antigenic carcinogen-protein conjugate. Cancer Res., 1971, 31, 1550-1554.

37. Curtis G.L., Ryan W.Z., Stenback F. Antibody simulation of benzoa.pyrene carcinogenesis. Cancer Lett., 1978, 4, 223-228.

38. Moolten F.L., Capparell N.L., Boger E. Induction of antibodies against carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons. Nature, 1978, 272, 614-616.

39. Moolten F.L„ Capparell N.L., Boger E. Protection of mice against 7.12-dimethylbenza.anthracene-induced skin tumors by immunization with a fluorinated analog of carcinogen. Cancer Res., 1981, 41, 452-459.

40. Chagnaud J.L., Faiderbe S., Geffard M. Identification and immunoshemical characterization of IgA in Sera of patients with mammary tumors. Int. J. Cancer, 1992, 50,395-401.

41. Moolten F.L., Capparell N.L., Boger E. Reduction of respiraatoty tract binding of benzoa.pyrene in mice by immunization. J. Natl. Cancer Inst., 1978, 61, 1347-1349.

42. Silbart L.K., Keren D. Reduction of intestinal carcinogen absorbtion carcinogen-specific secretory immunity. Science, 1989,243, 1462-1464.

43. Silbart L.K., McAleer F., Rasmussen M.V. Selective induction of mucosal immune responses to 2-acetilaminofluorene. Anticancer Res., 1996, 16, 651660.

44. Scheepers P.T.J, et al. Immunochemical detection of metabolites of parent and nitro poly cyclic aromatic hydrocarbons in urine samples from persons occupa-tionally exposed to diesel exhaust. Fresenius J Anal Chem, 1995, 351, 660-669.

45. Gomes M., Santella R.M. Immunologic methods for the detection of benzoa.pyrene metabolites in urine. Chem. Res. Toxicol, 1990, 3, 307-310.

46. Nording M., Haglund P. Evaluation of the structure/cross-reactivity relationship of polycyclic aromatic compounds using an enzyme-linked immunosorbent assay kit. Analytica Chimica Acta, 2003, 487, 43-50.

47. Scharnweber T., Fisher M., Suchanek M., Knopp D., Niessner R. Monoclonal antibody to polycyclic aromatic hydrocarbons based on a new benzoa.pyrene immunogen. Fresenius J Anal Chem, 2001, 371, 578-585.

48. Suchanek M., Scharnweber T., Fisher M., Knopp D., Niessner R. Monoclonal antibodies specific to polynuclear aromatic hydrocarbons. Folia Biologica, 2001,47, 106-107.

49. Buck S., Bouche F.B., Brandenburger A., Miller C.P. Modulation of the metabolism and adverse effects of benzoa.pyrene by specific antibody: novel host factor in enveromental carcinogenesis? Carcinogenesis, 2005, 26, 835-844.

50. Grubor Nenad M., Hayes John, Small Gerald J., Jankowiak Ryszard. Cross-reactivity and conformational multiplicity of an anti-polycyclic aromatic hydrocarbon mAb. PNAS, 102, 7453-7458.

51. James L.C., Roversi P., Tawfic D.S. Antibody multispecificity mediated by conformational diversity. Science, 2003, 299, 1362-1367.

52. James L.C., Tawfic D.S. The specificity of cross-reactivity: promiscuous antibody binding involves specific hydrogen bonds rather than nonspecific hydrophobic stickiness. Protein Sci, 2003, 12, 2183-2193.

53. Pellequer J.-L., Zhao B., Kao H.-I., Bell C.W., Li K., Li Q.X., Karu A.E., Roberts V.A. Stabilization of bound polycyclic aromatic hydrocarbons by a n-cation interaction. J. Mol. Biol., 2000, 302, 691-699.

54. Lommerse J.P., Tailor R. Characterising non-covalent interaction with the Cambridge Structural Database. J Enzyme Inhib, 1997, 11, 223-243.

55. Shoichet B.K., Kuntz I.D. Matching chemistry and shape in molecular docking. Protein Eng., 1993, 6, 723-732.

56. Goodsell D.S., Morris G.M., Olson A.J. Automated docking of flexible ligands: Application of AutoDock. J. Mol. Recog., 1996, 9, 1-5.

57. Model P., Russel M. Filamentous bacteriophage. The bacteriophages. Plenum Press, 1988, 2, 375-456.

58. Smith G. P., Scott J. K. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Methods Enzymol, 1993, 217, 228-257.

59. Kunkel, T., Roberts J., Zakour R. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods in Enzymology, 1987, 154, 367382.

60. Smith G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 1985, 228, 1315-1317.

61. Gailus V., Rasched I. The adsorption protein of bacteriophage fd and its neighbour minor coat protein build a structural entity. Eur. J. Biochem, 1994, 222, 927-931.

62. Felici F., Castagnoli L., Musacchio A., Jappelli R., Cesareni, G. Selection of antibody ligands from a large library of oligopeptides expressed on a multivalent exposition vector.J. Mol. Biol., 1991, 222, 301-310.

63. Luzzago A., Felici F., Tramontano A., Pessi A., Cortese R. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides. Gene, 1993, 128,51-57.

64. Greenwood J., Willis A.E., Perham R, N. Multiple display of foreign peptides on a filamentous bacteriophage. J.Mol. Biol., 1991, 220, 821-827.

65. Garrard L. J., Yang M., O'Connell M. P., Kelley R. F., Henner D. J. Fab assembly and enrichment in a monovalent phage display system. BioTechnology, 1991, 9, 1373-1377.

66. James B. Burritt, Clifford W. Bond, Kimathi W. Doss, Algirdas J. Jesaitis. Filamentous Phage Display of Oligopeptide Libraries. Analytical biochemistry, 1996, 238, 1-13

67. Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty. Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. Academic Press, NY, 1996

68. Burritt J. B., Quinn M. T., Jutila M. A., Bond C. W., Jesaitis A. J. Topological mapping of neutrophil cytochrome b epitopes with phage-display libraries. J. Biol. 1995, Chem., 270, 16974-16980.

69. Devlin J., Panganiban L., Devlin P. Random peptide libraries: a source for specific protein binding molecules. Science, 1990, 249, 404-406.

70. Renschler M. F., Bhatt R. R., Dower W. J., Levy R. Synthetic peptide ligands of the antigen binding receptor induce programmed cell death in a human B-cell lymphoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 3623-3627.

71. Scott J., Smith G. Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library. Science, 1990, 249, 386-390.

72. Cwirla S., Peters E., Barrett R., Dower W. Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 6378-6382.

73. O'Neil K. T., Hoess R. H., Jackson S. A., Ramachandran N. S., Mousa S. A., DeGrado W. F. Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage peptide library. Proteins, 1992, 14, 509-515.

74. Christian R. B., Zuckermann R. N., Kerr J. M., Wang L., Malcolm B. A. Simplified methods for construction, assessment and rapid screening of peptide libraries in bacteriophage. J. Mol. Biol., 1992, 227, 711-718.

75. Blond-Elguindi S., Cwirla S. E., Dower W. J., Lipshutz R. J., Sprang S. R., Sambrook J. F., Gething M.-J. H. Affinity panning of a library of peptides displayed on bacteriophages reveals the binding specificity of BiP. Cell, 1993, 75, 717-728.

76. Koivunen E., Wang B., Ruoslahti E. Isolation of a highly specific ligand for the alpha 5 beta 1 integrin from a phage display library. J. Cell Biol., 1994, 124, 373-380.

77. McConnell S. J., Kendall M. L., Reilly T. M., Hoess, R. H. Constrained peptide libraries as a tool for finding mimotopes. Gene, 1994, 151,115-118.

78. Hammer J., Takacs B., Sinigaglia F. Identification of a motif for HLA-DR1 binding peptides using M13 display libraries. J. Exp. Med., 1992, 176, 1007-1013.

79. Hoess R. H. (1993) Phage display of peptides and protein domains. Curr. Opin. Struct. Biol., 1993, 3, 572-579.

80. Luzzago A., Felici F., Tramontano A., Pessi A., Cortese R. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides. I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides. Gene,1993, 128, 51-57.

81. McLafferty M. A., Kent R. B., Ladner R. C., and Markland W. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides. Gene, 1993, 128, 2936.

82. Brian K. Kay, Jeremy Kasanov, Montarop Yamabhai. Screening Phage-Displayed Combinatorial Peptide Libraries. Methods, 2001, 24, 240-246.

83. Parmley S. F., Smith G. P. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene, 1988, 73, 305-318.

84. Parmley S. F., Smith G. P. Filamentous fusion phage cloning vectors for the study of epitopes and design of vaccines. Adv. Exp. Med. Biol., 1989, 251, 215— 218.

85. Cwirla S. E., Peters E. A., Barrett R. W., Dower W. J. Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, 87, 6378-6382.

86. Bluthner M., Bautz E. K., Bautz F. A. Mapping of epitopes recognized by PM/Scl autoantibodies with gene-fragment phage display libraries. J. Immunol. Methods, 1996, 198, 187-198.

87. Bluthner M., Schafer C., Schneider C., Bautz F. A. Identification of major linear epitopes on the splOO nuclear PBC autoantigen by the gene-fragment phage-display technology. Autoimmunity, 1999, 29, 33-42.

88. Du Plessis D. H., Romito M., Jordaan F. Identification of an antigenic peptide specific for bluetongue virus using phage display expression of NS1 sequences. Immunotechnology, 1995, 1, 221-230.

89. Petersen G., Song D., Hugle-Dorr B., Oldenburg I., Bautz E. K. Mapping of linear epitopes recognized by monoclonal antibodies with gene-fragment phage display libraries. Mol. Gen. Genet., 1995, 249, 425-431.

90. Wang L. F., Du Plessis D. H., White J. R., Hyatt A. D., Eaton B. T. Use of a gene-targeted phage display random epitope library to map an antigenic determinant on the bluetongue virus outer capsid protein VP5. J. Immunol. Methods, 1995, 178, 1-12.

91. Horowitz B., Bonomo R., Prince A. M., Chin S. N., Brotman B., Shulman R. W. Solvent/detergent-treated plasma: a virus-inactivated substitute for fresh frozen plasma. Blood, 1992, 79, 826-831.

92. Kouzmitcheva G.A., Petrenko V.A., Smith G.P. Identifying Diagnostic Peptides for Lyme Disease through Epitope Discovery. Clinical and diagnostic laboratory immunology, 2001, 8:1, 150-160.

93. Yu J., Smith G. Affinity maturation of phage-displayed peptide ligands. Methods Enzymol., 1996, 267, 3-27.

94. Lunder M., Bratkovic T., KreftS., B. Strukelj. Peptide inhibitor of pancreatic lipase selected by phage display using different elution strategies. Journal of Lipid Research, 2005, 46:7, 1512-1516.

95. Yu H., Dong X., Sun Y. An alternating elution strategy for screening high affinity peptides from a phage display peptide library. Biochem Eng J., 2000, 18(3): 169-175.

96. Cortese R., Monaci P., Luzzago A., Santini C., Bartoli F., Cortese I., Fortugno P., Galfre G., Nicosia A., Felici F. Selection of biologically active peptides by phage display of random peptide libraries. Curr. Opin. Biotechnol., 1996, 7, 616-621.

97. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, Изд-во Мир, Москва, 1984.

98. Thomas Stratmann, Angray S Kang. Cognate peptide-receptor ligand mapping by directed phage display. Proteome Science, 2005, 3:17.

99. Minenkova O., Amedeo De Tomassi, Francesca Bellintani, Paola Fortugno, Nicola Gargano, Franco Felici, Paolo Monaci. Colony Assay for Phage-Displayed Libraries. Analytical Biochemistry, 2000, 284, 412-415.

100. Guang Yang, Yaping Gao, Jie Dong, Chuan Liu, Yanning Xue, Ming Fan, Beifen Shen, Ningsheng Shao. A novel peptide screened by phage display can mimic TRAP antigen epitope against Staphylococcus aureus infections. J. Biol. Chem., 2005, 29, 27431-27435.

101. Novick RP, Ross HF, Projan SJ, Kornblum J, Kreiswirth B, Moghazeh S. Synthesis of staphylococcal virulence factors is controlled by a regulatory RNA molecule. EMBO J., 1993, 12,3967-3975.

102. Jin Gui, Terence Moyana, Jim Xiang. Selection of a Peptide with Affinity for the Tumor-Associated TAG72 Antigen from a Phage-Displayed Library. Biochemical and biophysical research communications, 1996, 218, 414-419.

103. Fawcett P. Т., Rose C. D., Gibney К. M. Comparative evaluation of adsorption with E. coli on ELISA tests for Lyme borreliosis. J. Rheumatol., 1995, 22, 684-688.

104. Seppala I. J., Kroneld R., Schauman K., Forsen К. O., Lassenius R. Diagnosis of Lyme borreliosis: non-specific serological reactions with Borrelia burgdorferi sonicate antigen caused by IgG2 antibodies. J. Med. Microbiol., 1994, 40, 293302.

105. Van Hoecke C, Fu D, De Grave D, Voet P, Lebacq E. Clinical and immunological assessment of a candidate Lyme disease vaccine in healthy adults: antibody persistence and effect of a booster dose at month 12. Vaccine, 1998, 16(17), 16881692.

106. Lowry F.D. Staphylococcus aureus infections. New Engl.J.Med., 1998, 339, 520-532.

107. Vieira-da-Motta O, Ribeiro PD, Dias da Silva W, Medina-Acosta E. RNAIII inhibiting peptide (RIP) inhibits agr-regulated toxin production. Peptides, 2001,22, 1621-1627.

108. Moe G. R., Granoff D. M. Molecular mimetics of Neisseria meningitidis serogroup B polysaccharide. Int. Rev. Immunol., 2001, 20, 201-220.

109. Moe G. R., Tan S., Granoff D. M. Molecular mimetics of polysaccharide epitopes as vaccine candidates for prevention of Neisseria meningitides serogroup B disease. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1999, 26, 209-226.

110. Gonzalez-Sapienza G., Cachau R. E. Identification of critical residues of an immunodominant region of Echinococcus granulosus antigen B. J. Biol. Chem., 2003,278,20179-20184.

111. Shawver L. K., Mann E., Elliger S. S., Dugger T. C., Arteaga C. L. Ligand-like effects induced by anti-c-erbB-2 antibodies do not correlate with and are not required for growth inhibition of human carcinoma cells. Cancer Res., 1994, 54, 1367-1373.

112. Pupa S. M., Menard S., Andreola S., Colnaghi M. I. Antibody response against the c-erbB-2 oncoprotein in breast carcinoma patients. Cancer Res., 1993, 53, 5864-5866.

113. Bei R., Masuelli L., Moriconi E., Visco V., Moretti A., Kraus M. H., Muraro R. Immune responses to all ErbB family receptors detectable in serum of cancer patients. Oncogene, 1999, 18,1267-1275.

114. Thor A., Ohuchi N., Szpak C., Johnston W., Schlom J. Distribution of oncofetal antigen tumor-associated glycoprotein-72 defined by monoclonal antibody B72.3. Cancer Res., 1986, 46, 3118-3124.

115. Nuti M., Teramoto Y., Mariani-Costantini R., Horan H., Schlom J. A monoclonal antibody (B72.3) defines patterns of distribution of a novel tumor-associated antigen in human mammary carcinoma cell populations. Int. J. Cancer, 1982, 29, 539-545.

116. Stramingnoni D., Bowen R., Atkinson В., Schlom J. Differential reactivity of monoclonal antibodies with human colon adenocarcinomas and adenomas. Int. J. Cancer, 1983, 31, 543-552.

117. Miraldi F., Nelson A., Kraly C., Ellery S. Diagnostic imaging of human neuroblastoma with radiolabeled antibody. Radiology, 1986, 161, 413-417.

118. Pastan I. Targeted therapy of cancer with recombinant immunotoxins. Biochim Biophys Acta., 1997, 1333(2), 1-6.

119. Jain R. Physiological barriers to delivery of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumors. Cancer Res,, 1990, 50, 814-819.

120. Yokota T, Milenic DE, Whitlow M, Schlom J. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res., 1992, 52, 3402-3408.

121. Rajotte D, Агар W, Hagerdom M, Koivunen E, Pasqualini R, Ruoslahti E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J Clin Invest., 1998, 102(2), 430-437.

122. Некрасов Б.Г., Кувшинов В. H., Ушакова Т. А., Каледин В. И., Нико-лин В. П., Туманова О. Ю., Ильичев А. А., Сандахчиев JI. С. Опухоль-адресованный пептид // Приоретет 10.05.2005. Патент РФ 2265027, 2005.

123. Некрасов Б.Г., Кувшинов В. Н., Ушакова Т. А., Каледин В. И., Нико-лин В. П., Туманова О. Ю., Ильичев А. А., Сандахчиев JI. С. Опухоль-адресованный пептид // Приоретет 20.10.2005. Патент РФ 2273644, 2006.

124. Brian К. Kay, Alexei V. Kurakin, Robin Hyde-DeRuyscher. From peptides to drugs via phage display. DDT, 1998, 3:8, 370-378.

125. Delvin J.J., Pantaganiban L.C., Delvin P.E. Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules. Science, 1990, 249, 404-406.

126. Olbenburg K.R., Loganathan D., Goldstein I.J., Schultz P.G., Gallop M.A. Peptide ligands for a sugar-binding protein isolated from a random peptide library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 5393-5397.

127. Vertesy L., Oeding В., Bender R., Zepf K., Nesemann G. Tendamistat (Hoe-467), a tight binding a-amylase inhibitor from Streptomyces ten-dae. Isolation and biochemical properties. Eur. J. Biochem., 1984, 141, 505-572.

128. Pflugroth J.W., Wiegard G., Huber R., Vertesy L. Crystal structure determination, refinement and the molecular model of the alpha-amylase inhibitor Hoe-467A. J. Mol. Biol., 1986, 189, 383-386.

129. Kline A., Braun W., Wuthrich K. Studies by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry of the solution conformation, of the alpha-amylase inhibitor tendamistat. J. Mol. Biol., 1986, 189, 377-382.

130. Hofmann O., Vertesy L., Braunitzer G. The primary structure of the a-amylase inhibitor Z-2685 from Streptomyces parvullus FH-1641.Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1985,366, 1161-1168.

131. Bottger V., Peters L.-E., Micheel B. Identification of peptide mimotopes for the fluorescein hapten binding of monoclonal antibody B13-DE1. J. Mol. Recog-nit, 1999, 12, 191-197.

132. Sellrie F., Schenk J.A., Behrsing O., Bottger V., Micheel B. A competitive immunoassay to detect a hapten using an enzyme-labelled peptide mimotope as tracer. Journal of Immunological Methods, 2002, 261, 141-144.

133. Harris Shannon 1., Park Moon K., Nahm Moon H., Diamond Betty. Peptide mimic of phosphorylcholine, a dominant epitope found on streptococcus pneumoniae. Infection and immunity, 2000, 68, 5778-5784.

134. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction. Anal .Biochem, 1987, 162, 156-159.

135. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981.

136. Костянко М.В., Глушков А.Н. Способ получения конъюгата гаптен-белок. Приоритет 16.02.1998. Патент РФ 2141114.

137. Glushkov A.N., Kostyanko^-HVl.V., Chemo S.V., Vasilchenko I.L. Synthesis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Protein Conjugates for Preparation and Immunoassay of Antibodies. Russian J.Immunology, 2002, 7, 41-46.

138. Глушков A.H., Костянко M.B., Черно C.B., Васильченко И.JI. Имму-ноферментный анализ антител к бенза.пирену. Эксперим. онкол., 1998, 20, 7476.

139. Glushkov A.N. et al. Immunological images of polycyclic aromatic hydrocarbons. Experimental oncology, 2006, 28, 93-176.

140. Скоупс P. Методы очистки белков, M., Мир, 1985.

141. Yamashita. N. et al. Anti-PAH monoclonal antibodies and cell lines producing the same. United State Patent № US 6,277,964 В1, 2001.

142. Morea V., Lesk Arthur M., Tramontano A. Antibody modeling: implications for engineering and desing. Methods, 2000, 20, 267-279.

143. Muckerheide A., Apple Raimond J., Pesce Amadeo J., Michale Gabriel J. Cationizatiom of protein antigens. I. Alteration of immunogenic properties. The Journal of Immunology, 1987, 138, 833-837.

144. Muckerheide A., Domen Patricia L., Michale Gabriel J. Cationizatiom of protein antigens. II. Alteration of regulatory properties. The Journal of Immunology, 1987, 138, 2800-2804.

145. Domen Patricia L., Muckerheide A., Michale Gabriel J. Cationizatiom of protein antigens. III. Abrogation of oral tolerance. The Journal of Immunology, 1987, 139,3195-3198.

146. Glushkov A.N. et al. Immunological images of polycyclic aromatic hydrocarbons. Experimental oncology, 2006, 28, 93-176.

147. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, 256,495-497.

Информация о работе

Апалько, Светлана Вячеславовна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Получение пептида-мимотопа химических канцерогенов группы полициклических ароматических углеводородов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы