Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пластинка контакта ооцита сцифомедузы Aurelia aurita: структурная организация и морфодинамика
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат диссертации по теме "Пластинка контакта ооцита сцифомедузы Aurelia aurita: структурная организация и морфодинамика"
На правах рукописи
ér—
АДОНИН Леонид Сергеевич
ПЛАСТИНКА КОНТАКТА ООЦИТА СЦИФОМЕДУЗЫ AURELIA AURITA: СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МОРФОДИНАМИКА
03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
31 ЯНВ 2013
Санкт-Петербург 2013
005049069
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Подгорная Ольга Игоревна
Институт цитологии РАН
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор
Родионов Александр Викентьевич
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт
им. В.Л. Комарова РАН
доктор биологических наук Скарлато Сергей Орестович
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии РАН
Ведущая организация: Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН
Защита диссертации состоится «15» февраля 2013 г. в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, Д.4.
e-mail: cellbio@mail.cytsDb.rssi.ru Сайт: http//www.cvtspb.rssi.ru Факс: 8 (812) 297-35-41
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии
РАН
Автореферат разослан «11» января 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, ,
кандидат биологических наук Ев- Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Блестящая оболочка, или Zona Pcllucida (ZP) - внеклеточная структура, окружающая ооцит высших млекопитающих. У представителей животного царства описано большое разнообразие функциональных аналогов Zona Pellucida млекопитающих: вителтшовая оболочка у моллюсков и ракообразных, вителтшовая мембрана и хорион у некоторых насекомых из отряда Díptera, вителлиновый слой у иглокожих, хорион у костистых рыб, Zona Radiata у амфибий, а также перивителлиновый слой у птиц (Anderson, 1968; Breed et al., 1990; Hedrick et al., 1991; Mate, 1998; Tarin & Cano, 2000; Sinowatz et al., 2001; Jovine, 2005).
ZP и ее функциональные аналоги абсолютно необходимы для нормального оплодотворения. Ответственны за это ZP-доменные белки в составе ZP. Однако происхождение ZP в эволюции и развитие не исследованы. Для выбора модельного объекта важно его положение на филогенетическом древе. В последнее время возрастает интерес к объектам из различных систематических групп, внешних по отношению к группе Bilateria. Понимание сложных процессов и молекулярных каскадов при оплодотворении, роль ZP в атрактация и ориентации гамет в группе Bilateria невозможно без описания таковых у предковых форм (Finnerty et al., 2003; Ball et al., 2004; Matus et al., 2006). Хотя после разделения предков форели и мыши прошло около 400 миллионов лет, а также произошел переход от внешнего оплодотворения и развития к внутреннему, белки яйцевых оболочек у форели и мыши имеют значительное структурное сходство как между собой, так и с белками яйцевых оболочек птиц и амфибий (Litscher & Wassarman, 2007). С другой стороны, показано, что у асцидии Cierna intestinalis ZP-домен-содержащие белки, экспрессирующиеся ооцитом, значительно варьируют даже у отдельных индивидуумов, не говоря уже о разных видах, но вариации затрагивают внешний, относительно ZP-домена, аминокислотный участок (Kiirn et al., 2007а). ZP-доменные белки найдены у беспозвоночных животных сравнительно недавно, например, у моллюсков (Aagaard et al., 2006), у нематоды Caenorhabditis elegans (Sapio et al., 2005) и асцидии. С возрастанием количества аннотированных геномов беспозвоночных удается предсказать наличие ZP-домен содержащих белков, а затем подтвердить их наличие экспериментально (Kiirn et al., 2007b). Большинство выявленных экспериментально ZP-доменных белков локализуется именно в специфических структурах, обеспечивающих оплодотворение.
Среди известных и хорошо изученных функциональных аналогов ZP самым древним в эволюционном плане считалась вителлиновая оболочка, описанная у некоторых двустворчатых моллюсков (Tarin & Cano, 2005; Wong & Wessel, 2006).
В настоящей работе приведены данные, позволяющие думать, что пластинка контакта ооцита Aurelia aurita является наиболее древним аналогом Zona Pellucida, если брать за основу традиционные эволюционные
схемы. Новизна и актуальность настоящей работы состоит в том, что впервые описана морфодинамика функционального аналога Zona Pellucida у представителя внешней, по отношению к Bilateria, группе Cnidaria, а также проведен начальный молекулярно-биологический анализ компонентов пластинки контакта.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящего исследования — описание структурной организации и морфодинамики пластинки контакта на анимальном полюсе ооцита сцифомедузы Aurelia aurita на светооптическом и
электронномикроскопическом уровнях, а также определение частичной нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей ZP-доменный белок пластинки контакта.
Для этого решали следующие задачи:
1) Сбор материала во время летних сезонов 2009-2012 гг.
2) Описание пластинки контакта на светооптическом и электронномикроскопическом уровне.
3) Описание морфодинамики пластинки контакта.
4) Выявление пластинки контакта на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях с помощью антител против мезоглеина.
5) Клонирование последовательности кДНК ZP-доменного белка пластинки контакта (белка Gf_180).
6) Проведение in vitro оплодотворения для доказательства функциональной вовлеченности в процессы оплодотворения.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.Ha парафиновых срезах гонад самок A. aurita классическими методами иммуно- и гистохимии выявляется специфическая структура, локализованная на анимальном полюсе ооцита. Структура названа «пластинка контакта».
2. На основании данных светооптического анализа парафиновых срезов гонад самок A. aurita, в оогенезе удается выделить 7 последовательных стадий развития ооцита.
3. Используя метод ультраструктурного анализа, показано, что в периферической цитоплазме растущего ооцита присутствуют гранулы двух типов, материал которых на последних стадиях развития ооцита сливается и образует пластинку контакта — фибриллярную внеклеточную структуру.
4. Показано, что основная функция пластинки контакта, подобно ZP высших многоклеточных животных, — участие в процессах оплодотворения.
5. Полученая в настоящей работе частичная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок пластинки контакта Gf^l80, содержит ZP-домен.
Научная новизна работы.
В настоящей работе впервые описана новая структура - пластинка контакта ооцита медузы A. aurita, являющаяся вероятным предшественником ZP, ключевой структуры при оплодотворении у высших позвоночных. Пластинка контакта в ооцитах кишечнополостного A. aurita покрывает анимальный полюс и сходна с классической ZP по следующим признакам: (1) привлекает сперматозоиды; (2) материал пластинки контакта синтезируется ооцитом и хранится в гранулах; (3) гранулы и сама пластинка контакта содержат ZP-доменные белки; (4) дефинитивная пластинка контакта является внеклеточной структурой, сформированной фибриллами, сходными по размеру с таковыми классической ZP.
Теоретическое и практическое значение работы.
Ранее в Лаборатории морфологии клетки ИНЦ РАН (группа Некодирующей ДНК) описан новый белок мезоглеи кишечнополостного A. aurita - мезоглеин (Matveev et al., 2007). Он относится к обширному семейству ZP-доменных белков, основная функция большинства из которых - участие в процессах оплодотворения и пренатального развития у многоклеточных животных. Именно принадлежность мезоглеина к ZP-доменным белкам заставила обратить внимание на оогенез медузы. Одним из основных инструментов работы является поликлональная сыворотка против мезоглеина (AT RA47), содержащая пул AT, проявляющих аффинитет только к ZP-домену, что доказано в настоящей работе.
Результаты настоящей работы представляют собой как количественные данные о подвижности ZP-доменных белков, нуклеотидных последовательностях ZP-домена и генов самих белков, сравнение ZP-доменных белков в базах данных; так и данные классической морфологии. Работы такого типа открывают путь к созданию нового языка описания биологических процессов, где классические термины, такие как «ткань» или «зародышевые листки», дополнены новым содержанием в виде описания конкретных последовательностей генов, уровня их экспрессии, родственных отношений, выясненных по базам данных.
Описание пластинки контакта проясняет происхождение Zona Pellucida и может привести в разработке новых практических методов лечения определенных типов бесплодия у человека и животных.
Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета и могут быть использованы в общих и специальных курсах лекций биологических факультетов других университетов.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, из них 5 — статьи. Основные положения представлены и обсуждены на VII, VIII, IX, X, XI и XII Научных сессиях Морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета (2006-2011); Международной конференции Морской биологической станции Зоологического института РАН (2007); II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию ИНЦ РАН (2007); Международном молодежном научном форуме "Ломоносов" (2008); 12 и 16-й международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология — наука XXI века» (2008, 2012); XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (2008); XIII, XIV и XV Санкт-Петербургских ассамблеях молодых ученых и специалистов (2008-2010); Международной конференции «Хромосома 2012» (2012); 12th Evolutionary Biology Meeting at Marseilles (2008); Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine (2009); 2nd international simposyum «Anchialinc ecosystems» (2012).
Вклад автора.
Результаты, включенные в работу, получены лично автором. Материалы, вошедшие в диссертацию, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 144 публикаций. Работа изложена на 120 страницах и иллюстрирована 12 рисунками и 1 таблицей.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты мол а 1204-31240, №05-04-49156-а, №05-04-49828-а, №11-04-01700-а), Президиума РАН (грант "Молекулярная и клеточная биология"), Стипендии президента (№ СП-468.2012.4).
МАТЕРИАЛ и МЕТОДЫ
Сбор материала.
Объектом исследования являлись взрослые медузы Aurelia aurita (кл. Scyphozoa, отр. Semaeostomeae, сем. Ulmaridae) с диаметром зонтика не менее 10-15 см. Материал собран в двух территориально удаленных популяциях вида: акватории ББС ЗИН РАН Картеш (Белое море, пос. Чупа) и МБС ДВО РАН Восток (Японское море, г. Владивосток) в период июнь -октябрь 2008-2012.
Кариологический анализ особей из этих популяций показал: кариотип A. aurita из Белого моря представлен 8 парами субметацентрических и 11 парами акроцентрических хромосом (2п=38), в то время как кариотип медуз
б
из Японского моря представлен только 3 парами субметацентрических и 14 парами акроцентрических хромосом (2п=34). Согласно данным Доусона (Dawson & Jacobs, 2001) медузам рода Aurelia из акватории Японского моря присвоено название Aurelia spl. В кариотипе A. spl по сравнению с A. aurita утрачены довольно крупные хромосомы №№ 12 и 14 , короткие плечи хромосом №№ 6, 7,8 ,9, 12 , а также дистальные участки обоих плеч хромосомы № 1 (из-за этого она в кариотипе A. spl стала короче, чем хромосома № 2 A. aarita) и длинного плеча хромосом №№ 10 и 11 (Адонин и др., 2012в). Видовые названия идентичны таковым в статье Дусона и Якобса (Dawson & Jacobs, 2001).
После карнотипирования объектов принято решение остановиться в работе только на материале, собранном в Белом море.
Парафиновые срезы.
Кусочки гонад самок A. aurita с прилежащей мезоглеей и эпителием гастроваскулярной полости фиксировали в двух вариантах фиксатора: 1-й -4%-ный раствор ПФА на PBS (800-850 мОсм/л); 2-й готовили на фильтрованной морской воде с тем же количеством ПФА. Время фиксации составляло от 2 до 6 ч. Затем образцы отмывали в четырех сменах PBS (800850 мосм/л), время каждой отмывки 1 ч. На хранение материал оставляли в 70%-ном этаноле, до которого доводили материал через ряд возрастающих концентраций этанола (30, 50, 70%).
Фиксированный материал обезвоживали и заключали в парафин по следующей схеме: 70, 85, 96%-ный этанол; 96%-ный этанол/изобутанол (1:1); изобутанол; изобутанол/хлороформ (1:1); хлороформ; хлороформ/парафин (1:1); и финальные 2 смены парафина. Время каждой стадии от 20 до 30 мин, пропитка парафином -2 ч.
Серийные срезы (до 5 мкм толщиной) получали на микротоме Leica SM 2000 R. Срезы депарафинировали по стандартной методике (о-ксилол; о-ксилол/изобутанол; изобутанол; изобутанол/96%-ный этанол; 96% и 70%-ный этанол; дистиллированная вода), затем производили окрашивание гистологическими красителями. Окрашенный препарат обезвоживали и заключали под покровное стекло в Dammar resin. В работе использованы классические гистологические методики окрашивания: гематоксилином-эозином; альциановым синим; толуидиновым синим; паральдегид-фуксином, а также метод трехцветной окраски по Маллори (Пирс, 1962).
Иммуногистохимия.
. Кусочки мезоглеи и гонады фиксировали, как описано в разделе «Парафиновые срезы». После депарафинирования срезы споласкивали в дистиллированной воде и двух сменах TBS-Tween. Обработку первыми и вторыми AT проводили по описанной методике (Shaposhnikova et al, 2005). Использовали первичные AT RA47 (1:5000); вторичные AT: GAR-FITC, GAR-Rhodamin (Sigma, США). Все операции проводили при комнатной температуре (до 25°С). Окрашенные срезы заключали в антифейд или глицерин (50%) и наблюдали в микроскоп (Leica DM 6000 В).
7
Полутонкие срезы.
Кусочки гонады самок A. aurita фиксировали в растворе ГА (0.5%) и ПФА (2%) на какодилатном буфере, постфиксация раствором 0s04 (1%). Фиксированный материал заливали в Эпон по методике производителя (Sigma, США). Полутонкие срезы изготавливали на ультратоме Leica ЕМ UK6. Окрашивали в растворе кислого фуксина (0.1%) на этаноле (30%) (до 2 мин при постоянном подогреве). Наблюдение и фотосъемку проводили на микроскопе Leica DM 6000 В.
Измерения.
При наблюдении парафиновых срезов (с гистологической и иммунофлуоресцентной окрасками, а также полутонких срезов) измерения проводили при помощи объект-микрометра с ценой деления 0.01 мм (ГОСТ 7513-75).
Ультратонкие срезы.
Фиксацию материала производили как описано выше. Ультратонкие срезы (толщиной до 70 нм) получены на ультратоме Leica EM UK6. Контрастирование срезов проведено по классической методике: водным раствором уранилацетата (2%) и раствором цитрата свинца (Гайер, 1974).
Иммунологический метод окрашивания золотом (Immunogold).
Кусочки гонады самок A. aurita фиксировали в растворе ПФА (2%) на какодилатном буфере. Фиксированный материал заливали LRWhite по методике, предложенной производителем (Fluka). Тонкие срезы изготавливали на ультратоме Leica EM UK6. Метод выявления локализации антигена — классический с некоторыми модификациями (Shaposhnikova et al., 2005). Использованы первичные AT RA47 (1:1000); вторичные AT: GAR-Gold (10 нм) (Sigma, США). Все операции проводили при комнатной температуре (до 25°С).
In vitro оплодотворение.
Для in vitro оплодотворения из слоя зачаткового эпителия с помощью пипетирования через широкое пропускное отверстие полиэтиленовой питетки выделяли ооциты, находящиеся на последних стадиях развития. Ооциты собирали в стерильную чашку Петри и добавляли заранее профильтрованные (через сито с ячейкой 20 мкм) сперматозоиды (500 тыс. кл./мл). После этого проводили перемешивание и через каждые 30 мин фиксировали (2%-ным ПФА). Опыт повторен 5 раз. Наблюдение и фотосъемку проводили на микроскопе Leica DM 6000В.
Электрофоретическое разделение белков в условиях SDS-электрофореза по Лэммли.
Белковый состав мезоглеи и гонад самок сравнивали, разделяя гомогенаты соответствующих образцов с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по стандартной методике (Laemmli, 1970) с некоторыми модификациями (Shaposhnikova et al., 2005). Концентрация акриламида в гелях составляла в разных вариантах от 7 до 12%.
Электрофоретическое разделение белков в условиях кислого электрофореза по Чокли.
Разделение белков гонад самок и мезоглеи проводили в полиакриламидном геле в присутствии уксусной кислоты (5.4%) и мочевины (ЗМ) (Panyim & Chalkley, 1969). Концентрация акриламида в гелях составляла в разных вариантах от 5 до 13%.
Иммуноблот (Вестернблот).
Процедура основана на опубликованной ранее (Towbin et al., 1979). Использованы первичные AT RA47 (1:5000); вторичные AT: GAR-AP (Sigma, США). Все операции проводили при комнатной температуре (до 25°С). Выявление щелочной фосфатазы проводили в системе BCIP (0.02%-ный раствор на 10%-ном димстилформамиде) и NBT (0.03%-ный водный раствор). Получение и определение специфичности антител RA47 описано ранее (Shaposhnikova et al., 2005).
Выделение РНК.
Для выделения тотальной фракции РНК использован набор реагентов Trizol (Invitrogen) согласно рекомендациям изготовителя или модифицированный протокол с использованием гуанидинтиоцианата (Chomczynski, Sacci, 1987). Чистоту выделения и сохранность РНК оценили по четкости полос 18S и 28S рибосомных РНК в УФ свете. Количество РНК измеряли спекрофотометрически по поглощению УФ света с длиной волны 260 нм (Sambrook et al., 1989). Для очистки РНК от примеси тотальной ДНК использовали преперат ДНКазы, свободной от РНКаз (RNAse free DNAse; Roche).
Обратная транскрипция.
Синтез первой цепи кДНК или обратную транскрипцию проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя обратной транскриптазы MMulV (Fermentas) с праймером M13rT12v (5' CAGGAAACAGCTATGACAAGCTTTTTTTTTTTTv) (Matveev et al., 2007).
RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ПЦР.
Мы предполагали, что в гонадах есть собственный ZP-содержащий белок (Gf_180), поскольку на иммуноблоте после SDS-электрофореза одна из зон связывает антитела RA47, полученные против ZP-домен-содержащего белка мезоглеина (вероятно, что сыворотка RA47 содержит большой пул •антител именно против иммуногенного участка белка мезоглеина - ZP-домена). Для проверки этого предположения применили метод RACE PCR, осуществленный с помощью набора для быстрой амплификации концевых фрагментов кДНК "Mint RACE cDNA amplification set" (Invitrogen). Гнездовые праймеры к ZP-домену мезоглеина использовали как генспецифические. В результате амплифицнрованы 2 фрагмента кДНК интересующего нас гена от ZP-домена в направлении 5' и З'-концов кДНК. Полученные продукты ПЦР лигированы в вектор pTZ57R/T с помощью набора TOPO ТА (Invitrogen). Лигазной смесью трансформировали Е. coli линии DH5\alpha. Вставки выделенных из бактерий плазмид секвенировали в
9
фирме Синтол (Москва). Полученные нуклеотидные последовательности сравнили с последовательностью мезоглеина, что позволило сделать вывод о степени сходства ZP-содержащих белков медузы как между собой, так и с другими описанными ZP-доменными белками.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Описание пластинки контакта на светооптическом уровне.
При окрашивании гематоксилином-эозином парафиновых срезов гонад самок A. aurita в месте прикрепления ооцита к зачатковому эпителию выявлена эозинофильная структура. Её морфологические особенности различаются на разных этапах созревания ооцита. Детальные наблюдения проводили на полутонких срезах (рис. I). Для удобства описания мы выделяем семь последовательных стадий оогенеза (одним из основных критериев разделения на стадии служил диаметр растущего ооцита): от Юмкм (I стадия) до 150-170 мкм на последних стадиях созревания (стадия VII).
На I стадии размеры ооцита не превышают 10 мкм. В его периферической цитоплазме на границе с соседними эпителиальными клетками отмечено появление отдельных оптически менее плотных гранул (рис. 1, а).
Диаметр ооцита к III стадии увеличивается до 40 мкм и ооцит погружается в прилежащую мезоглею. Начиная с этой стадии гранулы скапливаются в области анимального полюса, где ооцит сохраняет связь с зачатковым эпителием (рис. 1, Ь).
По мере увеличения объема ооцита (стадия IV, диаметр ооцита 50-70 мкм) ядро смещается к анимальному полюсу, а материал в области контакта между ооцитом и зачатковым эпителием начинает приобретать зернистую структуру (рис. 1, с). На стадии V (диаметр ооцита 80-100 мкм) еще можно различить отдельные гранулы, но большая их часть уже слилась в линейно расположенную гомогенную массу в месте контакта ооцита и эпителиального слоя, т.е. формируется пластинка контакта. На последних стадиях созревания диаметр ооцита увеличивается до 1 50 мкм на стадии VI и достигает максимального размера на стадии VII (1 50170 мкм) (Adonin et al., 2012а).
* - 9
.ДШІЇЙ
mil» Piiii
Ш^ЯШЯИ
Ж:
IК
ж-
Рис. 1. Полутонкие срезы гонад самок A. aurita,
окрашенные кислым фуксином.
І, III, IV, V, VI, VII — стадии развития ооцита;
Mes - мезоглея, О ооцит, N - ядро ооцита,
ge - зачатковый эпителий.
Гранулы и пластина контакта отмечены
стрелками.
Масштабная линейка - 10 мкм.
В цитоплазме ооцита содержатся многочисленные гранулы желтка размером до 5-7 мкм (рис. 1, 0. Зачатковый эпителий в месте прикрепления ооцита представлен тонким слоем клеток (рис.1, 0 (Адонин и др., 2009).
Гистохимический анализ.
При помощи трехцветной окраски по Маллори на парафиновых срезах выявлено, что материал специфических гранул и пластинки контакта содержит гликопротеины.
Дальнейший анализ парафиновых срезов гонад самок А. аигпа проводили с использованием гистохимических методик, направленных на исследование углеводного компонента гликопротеинов: окрашивание альциановым синим, толуидиновым синим, паральдегид-фуксином и ШИК-реакция. Результаты их применения позволяют говорить о том, что полисахариды, входящие в состав гликопротеинов, имеют кислую природу: при окрашивании 0.5%-ным раствором альцианового синего (при рН 2.8-3.0) наблюдали интенсивное связывание с материалом специфических гранул и пластинки контакта. Кислый характер углеводного компонента, вероятно, связан с присутствием большого количества ЭО^Н- и С02Н- групп.
Другие красители (паральдегид-фуксин, толуидиновый синий, ШИК-реакция) не реагировали ни со структурой, ни с материалом специфических гранул развивающихся ооцитов.
Непрямое иммунофлуоресцентное
окрашивание парафиновых срезов тканей гонад самок Д. аигНа.
В качестве основного инструмента использована поликлональная сыворотка АТ ЯА47. Показано, что на начальных стадиях созревания ооцита специфические гранулы в периферической цитоплазме связывают АТ (рис. 2). Начиная с Ш стадии, гранулы, связывающие АТ, скапливаются на анимальном полюсе. На последних же стадиях, когда происходит формирование пластинки контакта, ее материал также связывает АТ (рис. 2, VII, В), Иммуноокраска материала пластинки контакта остается дискретной, вероятно, из-за неполного слияния гранул (А<1огпп е!: а1., 2012а).
В качестве положительного контроля использованы срезы участков тела медузы, где в развитые «эластические» волокна и мезоглеальные клетки. АТ взаимодействуют с компонентами волокон и мезоглеальных клеток, как показано ранее (ЗЬаровткоуа е1 а!., 2005)
m * * *
jHHj ;— . 'a Ч;
IlSjjjÉ 'Ш- )
ШЁЛ) V \ ;
Рис. 2. Непрямое иммуномечение на парафиновых срезах гонад медузы. I, IV, VI, VII — стадии развития ооцита. А — фазовый контраст; В — иммунофлуоресценция. Mes мезоглея, О - ооцит, N - ядро ооцита, g - гранулы, CP - пластинка контакта. (RA47 1:2000;
GAR*Rhodamine 1:200 (Sigma)).
Масштабная линейка - 10 мкм.
мезоглее присутствуют
Ультраструктурная организация.
На ультраструктурном уровне отмечаются следующие особенности организации ооцита А. аигка: на начальных стадиях развития (I стадия) в центре клетки находится крупное ядро, в котором выявляется одиночное плотное фибриллярное образование, вероятно, ядрышко. Хроматин диспергирован и равномерно распределен по всему объему ядра. Вокруг ядра в периферической цитоплазме располагается большое количество митохондрий. Здесь же, в цитоплазме, отмечается появление немногочисленных гранул (окруженные мембраной цитоплазматические пузырьки размером до 3 мкм).
На ультраструктурном уровне наблюдаются гранулы двух типов. Гранулы 1-го типа - округлые мембранные пузырьки диаметром от 1.5 до 3 мкм, заполненные электронно-плотным гомогенным содержимым; гранулы 2-го типа представляют собой сферические образования (диаметр 2-3 мкм), окруженные мембраной, внутри которых находится рыхлый неоформленный материал, формирующий толстые переплетающиеся тяжи.
Начиная с III стадии по мере увеличения объема ооцита происходит его выталкивание в прилежащую к зачатковому эпителию мезоглею, связь ооцита с герминативным эпителием сохраняется только на анимальном полюсе, где отмечается скопление гранул обоих типов. При этом в остальной цитоплазме гранулы 1 и 2-го типа отсутствуют.
На IV стадии развития по мере роста ооцита (диаметр 30^40 мкм) объем ядра продолжает увеличиваться, оно еще больше смещается к анимальному полюсу. Здесь же выявляются гранулы двух типов, и общее количество гранул в области ядра увеличивается.
Диаметр ооцита к УП стадии увеличивается до 170 мкм (диаметр ядра 70 мкм). Ядро находится в непосредственной близости к анимальному полюсу клетки. Количество специфических гранул, расположенных на анимальном полюсе ооцита, значительно увеличивается на завершающих стадиях роста, они заполняют практически все узкое пространство между ядром и цитоплазматической мембраной. На последней стадии происходит слияние гранул 1 и 2-го типов. В некоторых участках цитоплазмы можно наблюдать подготовку гранул к экзоцитозу.
Полностью сформированная пластинка контакта представляет собой внеклеточную фибриллярную структуру, локализованную на анимальном полюсе. Толщина структуры в самом широком месте достигает 5-7 мкм (Ас1ошп е1а1.,2012а).
Иммунологический метод окрашивания золотом (Immunogold).
Для уточнения локализации антигенов, связывающих АТ11А47, применен метод иммуноголд на ультратонких срезах. Показано, что материал гранул обоих типов (1 и 2-го), а также материал пластинки контакта проявляет иммунореактивность и связывает антитела (Ас1отп й а1„ 2012а, Ь).
В качестве положительного контроля использованы срезы участков тела медузы, где в мезоглее присутствуют развитые «эластические» волокна и мезоглеальные клетки. AT взаимодействуют с компонентами волокон и мезоглеальных клеток.
ZP-доменные белки гонад и соматических клеток.
После разделения белкового гомогената гонад самок A. aurita в условиях SDS-электрофореза и проведения иммуноблотинга с AT RA47 в пробе обнаружены две белковые полосы, связывающие RA47. Их относительные молекулярные массы составляют 180 и 210 кДа (рис. 3, I). На рисунке положение зоны мезоглеина в пробе мезоглеи отмечено звездочкой и очевидно, что полипептиды гонад имеют большую молекулярную массу. Их
имуннореактивность говорит о том, что в их составе есть ZP-домен, но, вероятно, они могут содержать и другие функциональные домены.
Для сравнения заряда полипептидов провели разделение гомогената гонад самок в условиях кислого электрофореза по Чокли с последующим иммуноблотингом. Показано, что среди положительно заряженных белков гонад самок имеются два белка, связывающих AT RA47 против мезоглеина (рис. 3, II). При кислом электрофорезе зоны ZP-домен содержащих белков гонад также расположены выше мезоглеина. Это может быть связано как с их большей молекулярной массой, так и с более низким зарядом по сравнению с мезоглеином. Однако оба белка входят с гель и разрешаются при кислом электрофорезе. Это свидетельствует об их родстве с мезоглеином (Adonin et al., 2012a,b).
Белку гонад с молекулярной массой 180 кДа присвоено название Gf_180 (от Gonad of female) и предпринята попытка частичного клонирования его кДНК.
ZP-домен есть в кДНК гонад
Результаты иммуноблота как после денатурирующего электрофореза по Лэммли, так и после кислого электрофореза в присутствии мочевины дают основание полагать, что белковые детерминанты Gf_ 180, связывающие AT RA47, вероятно, содержат в своей аминокислотной последовательности ZP-домен. Для доказательства использовали ПЦР после обратной транскрипции с подобранными специфическими праймерами (рис. 4).
II
а
11
IE W
lii Ш
■ ' *
I МЯ*
!
I
Рис. 3. Электрофореграмма и иммуноблот мезоглеи и гонад самок А. аипш.
I — БОБ-ЭФ (а) и иммуноблот (б): 1 - мезоглея взрослых А. аипШ; 2 - гонады. Значения молекулярной массы маркерных белков в кДа указаны слева.
II — Аи-РАвЕ (а) и иммуноблот (б): 1 -мезоглея взрослых А. аипш\ 2 - гонады. Стрелка - начало разделяющего геля; звездочка - мезоглеин (ЯА47 1:5000; вАЯ*АР 1:20000 ^та)).
Праймеры подобраны на основе нуклеотидной
последо вательности мезоглеина (вепБапк:
DQ467654.1) таким образом, что часть из них специфична к участкам ZP-домена, часть - к внешним, отличным от 7Р-домена, участкам белка. В качестве матрицы для проведения ПЦР
ГГТ4Т/' Рис"4' Схематическое изображение нуклеотидной
ИСПОЛЬЗОВаНЫ КДПЛ последовательности мезоглеина, белка гонад самок А. аип!а
библиотеки, полученные С ОМ 80 и пар специфических праймеров (синие и красные
I (А)К1ЧА МеЗОГЛеаЛЬНЫХ фланкирующие участки расчетных фрагментов - праймеры).
клеток и с ро1у(А)ЯМА тканей гонад самок А. аигпа. Результаты эксперимента представлены в таблице: в эксперименте, где в качестве матрицы выбрана кДНК мезоглеальных клеток, амплифицируется продукт расчетной массы во всех комбинациях праймеров; в эксперименте, где в качестве матрицы выступает кДНК гонад самок, амплифицируются продукты, только если два праймера попадают в рамку 7Р-домена, в других же случаях продукта не образуется (см. таблица).
Таким образом, подтверждается наличие гР-домена в последовательности белка гонад самок А. аигка 0^180 (Аёошп е( а!., 2012Ь).
Таблица. Результаты ПЦР-анализа.
Используемые транскриптомы № пары праймеров
1 2 3 4 5 6 7 8
кДНК мезоглеальных клеток A. aurita + + + + + + + +
кДНК гонад самок A. aurita - + - + + - + -
+ - наличие продукта ПЦР;
- - отсутствие продукта ПЦР.
Клонирование неполной последовательности кДНК Gf_180
Следующий шаг - определение частичной нуклеотидной последовательности белка гонад самок A.aurita с помощью RACE-ПЦР. Для этого подобрали вложенные (nested) праймеры, специфичные к ZP-домену мезоглеина, направленные на «чтение» нуклеотидной последовательности к 5' и 3'-концам. В результате получена последовательность, состоящая из 1167 (открытая рамка считывания), которая кодирует белок из 389 аминокислот. При доменном анализе аминокислотной последовательности белка Gf_ 180 был обнаружен только ZP-домен, идентичный ZP-домену мезоглеина; других доменных структур обнаружено не было. Таким образом, Gf 180 не содержит DSL-домена, характерного для мезоглеина, но до завершения полного клонирования гена белка Gf_180 невозможно определить наличие других функциональных доменов.
Zona Pelluclda 1——
' 118 а И я 30 9а —IZZ..-iJ Л 660 913 )
. 3! 1300
Gf 180 420
: ? : Zona Pellucida ... v::-*...................
Рис. 5. In vitro оплодотворение созревших ооцитов A. awita. Окраска DAP1, переведено в черно-белый цвет.
Масштабная линейка 50 мкм.
In virio оплодотворение.
На последних стадиях развития ооцит очень слабо «закреплен» в зачатковом эпителии гонад, поэтому ооциты легко можно «вытрясти» из эпителия. In vitro оплодотворение проведено в морской воде с добавленными туда спермиями.
Видно, что сперматозоиды аккумулируются только в области пластинки контакта (рис. 5). Это подтверждает тот факт, что пластинка контакта вовлечена в процесс оплодотворения.
Белки, родственные ZP-доменным белкам А. а и rila, в компьютерных базах данных.
Прочитано и аннотировано большое колличество геномов как позвоночных, так и безпозвоночных животных. Провели поиск наиболее схожих с мезоглеином ZP-доменных белков беспозвоночных. Все, кроме
мезоглеина, оказались
предсказанными как ORF (open reading frame) и информация об их вовлеченности в те или иные структуры в организме отсутствует.
Для поиска схожих с мезоглеином белков
использовали базу NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geno mes/leuks.cgi) и ряд стандартных программ (Blast, ClustalX; Philyp-3,69 , GSview 4,6); при начальном поиске были отобраны только ZP-домен содержащие белки (SMART), а также введен фильтр (е-Value < е-10) для того, чтобы отрезать ложно позитивные результаты. После обработки набора секвинированных
последовательностей построена неукорененная кладограмма, включающая 52 белка (рис. 6). Близким родственником
мезоглеина оказался белок Hydra такой же длины и не содержащий никаких других функциональных
Heliocidazis
Н.tubererculata
i.l.üii ЛВХ4Ь0ЬЗ
Oikopleura dioica
). d і о 1 CUYO8?96
>.dio2 CRY 189'/!»
). d ¡ o i CBY21031
>.dií>4 CRY?03í>4
XP 00?I?6369 XP~00?I30186 XP_0D2122971 XP 00?. 124664
S tzonqylocentro tus purpura tus
XP_'/B4!>37 XP_/9/6 90 XP_00!197b04 XP_001 1 9.7 9 h 8 XP_00lI84068 XP_ /80929
0 ЛВХ4!»0!>!»
1 XP_/Н0Н67 J XP_79626b 3 XP 787 1 Ofj
pur 14 ХР 00 11830!) pur 11. XP 00119918 pur I6 XP_00l1862/ pur I / ХР_00І 18/! purl 8 ХР_/9Ы 69 purl 9 ХР_ '981 'і і
>8?
Рис. 6.
21 ХР_0011970/6
А. Неукорененная кладограмма ZP-домен содержащих белков беспозвоночных животных (e-Value меньше 1 ). В. Список 52 белков, вошедших в анализ, с номерами NCBI.
Мезоглеин и 4 наиболее схожие с ним белка выделены серым цветом.
доменов кроме ZP.
Три белка Nematostella показывают самые низкие значения е-Value (ED036481-2e 36, 385 АА; ED036482-4e 36, 849 АА; ED043456-9e 33, 1063 АА), то есть наибольшее сходство. Все они содержат С-концевой трансмембранный домен, и два из них обладают N-концевым сигнальным пептидом, который обеспечивает внеклеточную локализацию (Chamoy et al., 2000). Их предсказанное сходство с мезоглеином может быть предметом экспериментальной проверки.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Блестящая оболочка (Zona Pellucida), окружающая ооцит высших позвоночных животных (мышь, корова, кролик), состоит из 3 гликопротеинов, содержащих ZP-домен (Wassarman et al., 2001). Ооцит человека экспрессирует 4 ZP-доменных гликопротеина (ZPA, ZPB1, ZPB2 и ZPC), локализация которых в блестящей оболочке подтверждена экспериментально (Tarin & Сапо, 2000). Описано большое разнообразие функциональных аналогов Zona Pellucida млекопитающих и у других животных (Tarin & Сапо, 2000), основными компонентами которых являются ZP-доменные гликопротеины. Однако до сих пор у низших многоклеточных животных, в частности кишечнополостных, подобные структуры или белки описаны не были.
В настоящей работе впервые описана структура, являющаяся функциональным аналогом блестящей оболочки, но радикально отличающаяся по морфологическим критериям от подобных структур в животном царстве. Видно, что пластинка — структура, которая локализована на одном из полюсов ооцита (анимальном) и не покрывает весь ооцит в отличие от других описанных типов яйцевых оболочек. Аналогично данным о синтезе и формировании яйцевых оболочек (Tarin & Сапо, 2000; Wassarman, 2009) оказалось, что пластинка контакта является внеклеточной структурой, но синтез ее компонентов идет в цитоплазме ооцита. Об этом свидетельствует цитоплазматическая локализация гранул на ранних стадиях развития ооцита (рис. 1) и подготовка гранул к экзоцитозу на последней стадии. Внеклеточная локализация структуры доказана при описании ультраструктурной морфологии (Adonin et al., 2012а).
В области контакта ооцита с герминативным эпителием самок сцифомедузы A. aurita структуру, которую мы определяем как пластинку контакта, описывали ранее (Eckelbarger & Larson, 1988). Авторы предполагали, что это определенным образом организованный желток. Они описали клетки герминативного эпителия, находящиеся в месте прикрепления ооцита, и дали им название "трофоциты". Согласно гипотезе авторов именно эти клетки являются источником желтка, поступающего в ооцит. Подобные клетки ранее были названы "клетками-няньками" (Widersten, 1965). Однако, по нашим наблюдениям, синтетический аппарат "трофоцитов" развит недостаточно для выполнения трофической функции. Сделанное позже авторадиографическое исследование трофических функций "клеток-нянек" не подтвердило их участия в процессах передачи
16
питательных веществ и желтка ооциту (Avian et al., 1987). Гистохимические данные с использованием дифференциального окрашивания свидетельствуют о том, что химический состав пластинки и гранул отличен от окружающего их желтка (Адонин и др., 2009). Отсутствие трофических функций у "клеток-нянек" также свидетельствует в пользу синтеза материала пластинки самим ооцитом. Преобразование гранул 2-го типа (укрупнение, вакуолизация), а также объединение гранул 1 и 2-го типов, вероятно, приводит к образованию видимой на парафиновых и полутонких срезах (рис. 1, f) структуры -пластинки контакта.
AT RA47 получена против мезоглеина (Shaposhnikova et al., 2005), в аминокислотной последовательности которого обнаружен ZP-домен, составляющий более половины всего белка (Matveev et al., 2007). Вероятно, сыворотка содержит значительное количество антител именно против ZP-домена. Для проверки этого предположения проведен частичный трипсинолиз мезоглеина с последующим разделением белковых фрагментов с помощью SDS-электрофореза по Лэммли. Результаты иммуноблотинга показывают: антитела связываются с протеолитическим фрагментом с молекулярной массой около 30 кДа, соответствующей расчетной массе ZP-домена мезоглеина (250 аа х 110 Да = 27500 Да, погрешность в пределах разрешающей способности метода) (Адонин и др., 2012а). Таким образом, частичный трипсинолиз вырезает из мезоглеина фрагмент с молекулярной массой, соответствующей ZP-домену, и как раз этот фрагмент связывает AT RA47. Совпадение молекулярных масс триптического фрагмента и ZP-домена не является абсолютным доказательством направленности AT RA47 против ZP-домена, но повышает вероятность этого. В дальнейшем предполагаем провести белковое секвенирование иммунореактивного фрагмента. Дополнительным доказательством аффинитета к участкам ZP-домена, проявляемого AT RA47, является их связывание с одним из белков внеклеточного матрикса гидры, который не имеет в своем составе иных доменных структур, кроме ZP (Shaposhnikova et al., 2005; Matveev et al., 2012). Аминокислотная последовательность белка предсказана на основании аннотированного генома гидры, доменный анализ проведен с помощью программы SMART.
На иммуноблотс после SDS-электрофореза гомогената гонад самок A. aurita антитела RA47 связываются двумя иммунореактивными белковыми зонами. Их относительные молекулярные массы составляют 180 и 210 кДа (Адонин и др., 2009), т.е. больше, чем мезоглеина (47 кДа) (рис. 3, I. iJj. По-видимому, белки именно из этих зон входят в состав специфических гранул ооцита и пластинки контакта. Вероятно, в пластинке контакта и гранулах-предшественниках присутствуют белки, в состав которых входит ZP-домен, но, в соответствии с их молекулярной массой, они могут содержать и другие функциональные домены.
Возможны два объяснения различий в молекулярных массах мезоглеина и белков гонад. Во-первых, для ZP-белков характерны различные посттрансляционные модификации (Jovine et al., 2005). Мезоглеин подвергается
17
модификациям при включении в мезоглею (Shaposhnikova et al., 2005). Второе возможное объяснение состоит в том, что белки гонад могут оказаться другими представителями ZP-семейства. Геномы большинства животных, представленных в базах данных, содержат более одного гена ZP-доменного белка (Рис. 6). Наличие в гонадах ZP-белков, специализированных для участия в оплодотворении, кажется более вероятным. На настоящий момент анализ доменного состава аминокислотной последовательности белка Gf_180 не выявил иных доменов кроме ZP. Вероятно, при определении полной последовательности кДНК гена Gf_180, будут описаны уже известные функциональные домены, или же, что вероятнее, это приведет к открытию (описанию) новых доменных структур, направленных на связывание сперматозоида. В неполной последовательности открытая рамка считывания кДНК Gf_180 содержит 1167 нп, в которые входит ZP-домен, идентичный домену мезоглеина.
При оплодотворении у представителей класса Scyphozoa, как и у большинства Cnidaria, сперматозоид контактирует с яйцеклеткой только на одном полюсе (Arai, 1997). Оплодотворение происходит в гонаде, а личинки растут в выводковых камерах на щупальцах медузы. Процессу оплодотворения у A. aurita предшествует уплощение клеток зачаткового эпителия в месте прикрепления ооцита (рис. 1). В месте контакта ооцита с зачатковым эпителием уплощенные клетки образуют воронкообразные углубления. Мы наблюдали в них in vivo скопления сперматозоидов, что согласуется с описаниями (Иванова-Казас, 1975). Соответственно, способ прикрепления яйцеклетки к эпителию и находящиеся в этом месте структуры имеют принципиальное значение для процесса оплодотворения. Ооцит ориентирован таким образом, что пластинка контакта экспонирована в сторону предполагаемого контакта со сперматозоидом.
Роль ZP-доменных белков в оплодотворении у млекопитающих изучена сравнительно хорошо. Они (в частности, ZP3 мыши) отвечают за первичное прикрепление сперматозоида и инициацию акросомной реакции (Jungnickel et al., 2003). Обнаруженный в составе пластинки ZP-домен содержащий белок, вероятно, играет ключевую роль в процессе контакта сперматозоида и ооцита. Пластинка маркирует и сужает область контакта; ядро находится в непосредственной близости к пластинке, которая ориентирована в просвет желудочного кармана, где происходит активация сперматозоидов. И, как видно из экспериментов по in vitro оплодотворению (рис. 5), сперматозоиды скапливаются только в месте локализации пластинки контакта, что и обеспечивает успешное оплодотворение.
выводы
1. На начальных стадиях развития ооцита сцпфомеду >ы Aurelia aurita в его периферической цитоплазме появляются эозинофильные гранулы, которые затем собираются на анимальном полюсе ооцита и формируют внеклеточную структуру - пластинку контакта.
2. Методом непрямой иммунофлуоресценции показано, что материал гранул и пластинки контакта связывает поликлональные AT против мезоглеина.
3. На основании ультраструктурного анализа, гранулы в периферической цитоплазме можно разделить на два типа по их морфологическим особенностям. Материал обоих типов гранул и сама пластинка связывает поликлональные антитела RA47; полностью сформированная пластинка контакта имеет фибриллярное строение.
4. Оплодотворение in vitro показало, что сперматозоиды скапливаются только около пластинки контакта.
5. Частичная последовательность кДНК, кодирующей белок пластинки контакта GÍM80, имеет открытую рамку считывания 1167нп (389 аа) и содержит в своем составе ZP-домен, идентичный ZP-домену мезоглеина.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи:
Matveev I.V., Adonin L.S., Shaposhnikova T.G., Podgornaya O.I. 2012. Aurelia aurita -Cnidarian with a prominent mcdusiod stage // J Exp Zool В Mol Dcv Evol. Vol. 15. №318(1). P. 1-12.
Adonin L.S., Shaposhnikova T.G., Podgornaya O.l. 2012a. Aurelia aurita (Cnidaria) oocytes' contact plate structure and development. PLoS ONE 7(1 l):c46542. doi: 10.137 l/journal.ponc.0046542.
Adonin L., Podgornaya O. 2012b. Contact plate of Aurelia aurita is a functional analogue of mammalian Zona Pcllucida // 2nd international simposyum Anchialine ecosystems. Natura Croatica, Vol. 21, № suppl. 1. P.3-6.
Адонпн Л.С., Шапошникова Т.Г. 2008. Есть ли аналог Zona Pcllucida у сцифоидной медузы Aurelia aurita? // Научный вестник «Ломоносов». Серия Естественные науки. Выпуск I. М.: «Макс-Пресс.
Адонпн Л.С., Подгорная О.И., Матвеев И.В., Шапошникова Т.Г. 2009. Пластинка в зоне контакта ооцита с зачатковым эпителием у сцифомедузы Aurelia aurita имеет иммунологическое сходство с ZP-домен-содержащим белком мезоглеином // Цитология. Т.51 (№5). С.435^441. (Adonin L.S., Podgornaya О.I., Matveev I.V., Shaposhnikova Т.О.. 2009. Plate in the zona of oocyte and germinal epithelium contact in scyphojellyfish Aurelia aurita binds antibodies to ZP-domaim protein mesoglein // Cell and Tissue Biology. №3. P.283-288).
Адонпн JI.C., Подгорная О.И., Шапошникова Т.Г. 2012а. Морфологическая структура пластинки в зоне контакта ооцита с зачатковым эпителием у сцифоидной медузы Aurelia aurita (Cnidaria: Semaeostomae)// Онтогенез. T.43 (№1).C.20-27.
Тезисы:
Шапошникова Т.Г., Адопин Л.С., Матвеев И.В., Подгорная О.И. 2006. Определение заряда мажорного белка р45/47 в чеюглее сцифомсдузы ЛшеГш aiiriui (Cnidaria) // VII Научная сессия Морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета. - Санкт-Петербург. С.78.
Ajoiiiiii Л.С., Шапошникова Т.Г., Матвеев II.В., Подгорная О.И. 2007. Синтез предшественников мезоглеина в мс-юглеальних п »пнтдермальных клетках сцифомсдузы Aurelia ¿utritii // VIII Научная сессия Морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета. - Санкт-Петербург. C.56.
Шапошникова Т.Г., Адонин Jl.С., Матвеев И.В., Подгорная 0.11. 2007. Мсзоглсин - белок внеклеточного матрикса ецифо медузы Aurelia омі ta - древней ший представитель суперссмейства ZP-дом єн-содержащих белков // Экологические исследования морских организмов. Материалы 2-ой международной конференции Морской биологической станции Зоологического института РАН. - Санкт-Петербург. С. 146-147.
Адоинн Л .С., Шапошникова Т. Г. 2007. Присоединение ооцита ецнфомедузы Aurelia an ri ta (Cnidaria) к эктодерм с обеспечивается структурой, содержащей мсзоглсин // Тезисы докладов л сообщений If Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейная конференция, посвященная 50-летию Института цитологии Российской академии наук. Цитология. - Санкт-Петербург. С.709.
Адошш Л.С., Шапошникова Т.Г. 2008. Структура анимального полюса ооцита сцифоидной медузы Aurelia au ri (а // IX научная сессия Морской Биологической Станции Санкт-Петербургского Государственного Университета. - Санкт-Петербург. С.71-72.
Адонин Л.С., Шапошникова Т.Г. 2008. Есть ли аналог Zona Pcllucida у сцифоидной медузы Aurelia aurita'? II Международный молодежный научный форум "Ломоносов". Москва. С.95-96.
Adonin L.S., Shaposhnikova T.G. 2008. Is there ап analog of mammalian Zona Pcllucida in moon jelly Aurelia aurita (Scyphozoa, Cnidaria)? // !2,h Evolutionary Biology Meeting at Marseilles. Marseille. P.56-57.
Адонин Л.С., Шапошникова Т.Г. 2008. Обнаружен самый древний аналог Zona Pcllucida у сцифоидной медузы Aurelia aurita // 12 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» -Пущино. С.6.
Адонин Л.С., Шапошникова Т.Г. 2008. Что может объединять высших многоклеточных и кишечнополостных кроме многоклеточности? // XV Школа «Актуальные проблемы биологии развития».- Звенигород. С.2—4.
Адонин Л.С. 2009. Как устроен функциональный аналог Zona Pcllucida у сцифоидной медузы Aurelia aurita (Cnidaria)? // XIII Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых п специалистов. - Санкт-Петербург. С.28-29.
Шапошникова Т.Г., Матвеев И.В., Адонин Л.С., Лазарева A.B., Подгорная 0.11. 2009. Мсзоглсин и родственные ему белки из тканей ецнфомедузы Aurelia aurita - наиболее древние представители ZP-домсн-содсржащсго семейства белков внеклеточного матрикса // X Научная сессия Морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета. - Санкт-Петербург. С.68-69.
Adonin L.S., Shaposhnikova T.G., Matvecv I.V., Podgornaya O.I. 2009. The plate in the zone of oocyte and germinal epithelium contact in scyphomcdusa Aurelia aurita binds antibodies to zp-domain-containing protein mesoglein // Modem microscopy techniques in biology and medicine. - Saint-Petersburg. P.3.
Адонин Л.С. 2009. Ультраструктур но с исследование пластинки в зоне контакта ооцита с зачатковым эпителием, функционального аналога Zona Pcllucida, у сцифоидной медузы Aurelia aurita (Cnidaria) // XIV Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. - Санкт-Петербург. С.69.
Мушннков Н.В., Адонин Л.С., Шапошникова Т.Г. 2010. Сравнение структур, связывающих антитела к мезоглсину, в гонадах двух представителей Lucernaria quailriamùs и Aurelia aurita (Cnidaria) // XI научная сессия Морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета. С.62.
Адонин Л.С., Мушннков Н.В., Подгорная О.П., Шапошникова Т.Г. 2010. Ультраструктурная организация области контакта ооцита с зачатковым эпителием (пластинки контакта) у ецнфомедузы Aurelia aurita //XI всероссийская конференция с международным участием «Проблемы изучения, рационального использования и охраны природных ресурсов Белого моря». - Санкт-Петербург, ЗИН РАН. С.9-10.
Адонин Л.С. 2010. Пластинка контакта ооцита сцифомсдузы Aurelia aurita (тип Cnidaria): І. Ультраструктурная иммуноцнтохнмия; 2. Характеристика белков пластинки контакта // XV Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. - Санкт-Петербург. С.74.
Адонин Л.С., Найден A.B., Матвеев И.В., Подгорная О.И., Шапошникова Т.Г. 2011. Иммуноцитохимнчсскос исследование пластинки контакта ооцита Aurelia aurita (Cnidaria) // XII Научная сессия Морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета. - Санкт-Петербург. С.72-73.
Адонин Л.С., Котова A.B., Матвеев И.В., Подгорная О.И. 20126. ZP-домсн содержащие белки, входящие в состав пластинки контакта ооцита сцифоидной медузы Aurelia aurita H 16 международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века. - Пущино. С.87.
Адонин Л.С., Найден A.B., Котова A.B.. Подгорная О.И., Демин С.Ю. 2012«. Кар пологи чес кий анализ Aurelia aurita из акватории Белого моря и ее криптовида (Aurelia .spi) из Японского моря // Хромосома 2012. - Новосибирск. С.28.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Гайср Г. 1974. Электронная гистохимия. М., Мир. С.488.
Иванова-Казас О.М. 1975. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных. Новосибирск, Наука, С.372
Пирс Э. Гистохимия. 1962. M., Издательство иностранной литературы. С.964.
Aagaard J.E., Y¡ X., MacCoss M.J., Swanson W.J. 2006. Rapidly evolving zona pcllucida domain proteins arc a major component of the vitelline envelope ofabalonc eggs. Proc Natl Acad Sei USA. 103(46): 17302-17307.
Arai M.N. 1997. A functional biology of Scyphozoa. Chapman and Hall. P.28-206.
Avian M., Micali F., Sciancalcporc M. 1987. Vitcllogcncsi in Pelagia noctiluca primi risultati di di cyctycpy autoradiografishc. Atti dclla Accadcmia dcllc Scinze dcll'Istituto di Bologna Classe d¡ Scicnzc Fisichc Rcndiconti. V.3. P.139-146. In Italian; English abstract.
Ball E.E., Hayward D.C., Saint R., Miller D.J. 2004. A simple plan - Cnidarians and the origin of developmental mcchanisms. Nat. Rev. Genet. 5: 567-577.
Chamoy L., Nicolai M., Qucnncdcy B., Gaill F., Dclachambrc J. 2000. Characterization of acDNA encoding RP43, a CUB-domain-containing protein from the tube of RiJ'tia pachvptila (Vcstimcntifcra), and distribution of its transcript. Biochcm J 2:421 —427.
Chomczynski P., Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phcnol-chloroform extraction. Anal Biochcm. 162(1): 156-159.
Dawson M.N, Jacobs D.K. 2001. Molccular evidence for cryptic spccics of Aurelia aurita (Cnidaria, Scyphozoa). Biol Bull. 200(1): 92-96.
Eckclbargcr K.J., Larson R.J. 1988. Ovarian morphology and oogenesis in Aurclia aurita (Scyphosoa: Scmacostomcac): ultrastructural evidence of hctcrosynthetic yolk formation in a primitive mctazoan. Mar. Biol. V.100. P. 103-115.
Finncrty J.R., Paulson D., Burton P., Pang K., Martindalc M.Q. 2003. Early evolution of a homcobox gene: the parahox gene Gsx in the Cnidaria and the Bilatcria. Evol Dcv 5:331-345.
Jovinc L., Dane C.C., Litschcr E.S., Wassarman P.M.. 2005. Zona pcllucida domain proteins. Annu. Rev. Biochcm. 74: 83-114.
Jungnickcl M.K., Sutton K.A., Flonnan H.M. 2003. In the beginning: lessons from fertilization in mice and worms. Cell 114:401-404.
Kiirn U., Somincr F., Hcmmrich G., Bosch T.C., Khalturin K. 2007a. Allorccognition in urochordatcs: identification of a highly variablccomplcmcnt rcccptor-like protein expressed in follicle cells of Ciona. DcvComp Immunol 31:360-371.
Kiirn U., Sommcr F., Bosch T.C., Khalturin K. 20076. In the urochordatc Ciona intestinalis Zona Pcllucida domain proteins vary amongindividuals. DcvComp Immunol 31:1242-1254.
Panyim S., Chalklcy R. 1969. The heterogeneity ofhistoncs. 1. A quantitative analysis of calf histoncs in very longpolyacrylamidc gels. Biochemistry, 8:3972-3979.
Lacmmlt U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the cssambly of the head of the bacteriophage T4. Nature 4: 680-682.
Litschcr E.S., Qi H., Wassarman P.M. 1999. Mouse zona pcllucida glycoproteins mZP2 and mZP3 undergo carboxy-terminal proteolytic processing in growing oocytes. Biochemistry. 38: 12280-12287.
Litschcr E.S., Wassarman P.M. 2007. Egg extracellular coat proteins: from fish to mammals. Histol Histopathol, 22:337-347
Matus D.Q., Pang K., Marlow H., Dunn C.W., Thomscn G.H., Martindalc M.Q. 2006. Molccular evidence for deep evolutionary roots of bilatcrality in animal development. PNAS 103:11195-11200.
Matvccv I.V., Shaposhnikova T.G., Podgomaya O.I. 2007. A novel Aurelia aurita protein mcsoglcin contains DSL and ZP domains. Gene. V.399. P.20-25.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molccular Cloning. A laboratory Manual (2nd Edition). New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Sapio M.R., Milliard M.A., Ccrmola M., Favrc R., Bazzicalupo P. 2005. The Zona Pcllucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alac in Caenurhabclitis elegans. Dcv Biol 282:231-245.
Shaposhnikova T., Matvccv I., Napara T., Podgomaya O. 2005. Mcsoglcal cells of the jellyfish Aurelia aurita arc involved in the formation of mcsoglcal tlbrcs. Cell Biol. Int. V.29. N.l 1. P.952-958.
Tarin J.J., Cano A. 2000. Fertilization in Protozoa and Mctazoan Animals. Springer. P.355.
Towbin H., Stacchclin T., Gordon J. 1979. Elcctrophorctic transfer of proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Nat Acad Sci USA 76: 4350-4354.
Wassarman P.M., Jovinc L., Litschcr E.S. 2001. A profile of fertilization in mammals. Nat Cell Biol 3:E59-
E64.
Wong J.L., Wcsscl G.M. 2006. Defending the Zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Current Topics in Development Biology 72:1-115.
Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам Лаборатории морфологии клетки, в особенности коллегам из Группы
Некодирующей ДНК Института цитологии РАН, а также всем сотрудникам кафедры цитологии и гистологии Санкт-Петербургского государственного университета, сотрудникам Беломорской биологической станции Картеш Зоологического института РАН за радушный прием и
помощь в работе. Отдельная благодарность научному руководителю Подгорной Ольге Игоревне за помощь в работе, понимание и поддержку.
Подписано в печать 09.01.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 10167Ь.
Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Адонин, Леонид Сергеевич
ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Объект исследования
1.1. Кишечнополостные
1.2. Гены и белки
1.3. Размер генома и кариология
1.4. Жизненный цикл медузы Aurelia aurita
1.5. Мезоглея сцифомедузы Aurelia aurita
2. Мезоглеин - белок «эластических» волокон мезоглеи
3. ZP-доменные белки: строение, разнообразие и основные функции
3.1. Строение ZP-доменных белков
3.2. ZP-домен
3.3. Функции некоторых ZP-домен-содержащих белков
4. Синтез компонентов Zona Pellucida и её аналогов в животном царстве
4.1. Структура Zona Pellucida
5. Гаметогенез и оплодотворение у представителей т. Cnidaria
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
1. Сбор материала
2. Получение метафазных пластинок
3. Окрашивание DAPI
4. Парафиновые срезы
5. Иммуногистохимия
6. Полутонкие срезы
7. Измерение
8. Ультратонкие срезы
9. Иммунологический метод окрашивания золотом (Immunogold)
10. In vitro оплодотворение
11. Электрофоретическое разделение белков в условиях SDS-электрофореза по Лэммли
12. Электрофоретическое разделение белков в условиях кислого электрофореза по Чокли
13. Иммуноблот (Вестернблот)
14. Выделение РНК
15. Обратная транскрипция
16. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ПЦР
17. Компьютерные методы анализа 65 РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Кариологический анализ Aurelia aurita и Aurelia spl из акваторий Белого и Японского морей
2. Описание пластинки контакта на светооптическом уровне. Гистохимический анализ
3. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание парафиновых срезов тканей гонад самок Amelia aurita
4. Ультраструктурная организация пластинки контакта
5. Иммунологический метод окрашивания золотом (Immunogold)
6. ZP-доменные белки гонад и соматических клеток
7. ZP-домен есть в кДНК гонад
8. Клонирование части последовательности кДНК Gf
9. In vitro оплодотворение
10. Белки, родственные ZP-доменным белкам
Aurelia auriia, в компьютерных базах данных ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Кариологический анализ Aurelia aurita и Aurelia spl из акваторий Белого и Японского морей
2. Пластинка контакта в сравнении с Zona Pellucida
3. Двухслойная организация тела представителей Cnidaria 99 ВЫВОДЫ 106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107 БЛАГОДАРНОСТИ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Пластинка контакта ооцита сцифомедузы Aurelia aurita: структурная организация и морфодинамика"
Блестящая оболочка, или Zona Pellucida (ZP) - внеклеточная структура, окружающая ооцит высших млекопитающих. У представителей животного царства описано большое разнообразие функциональных аналогов ZP млекопитающих: вителлиновая оболочка у моллюсков и ракообразных, вителлиновая мембрана и хорион у некоторых насекомых из отряда Díptera, вителлиновый слой у иглокожих, хорион у костистых рыб, Zona Radiata у амфибий, а также перивителлиновый слой у птиц (Tarin «fe Cano, 2000; Jovine, 2005).
ZP и ее функциональные аналоги необходимы для нормального оплодотворения. Ответственны за это ZP-доменные белки в составе ZP. Однако происхождение и развитие ZP в эволюции не исследованы. Для выбора модельного объекта важно его положение на филогенетическом древе. В последнее время возрастает интерес к объектам из различных систематических групп, внешних по отношению к группе Bilateria. Понимание сложных процессов и молекулярных каскадов при оплодотворении, роль ZP в объединении и ориентации гамет в группе Bilateria невозможно без описания таковых у предковых форм (Finnerty et al., 2003; Ball et al., 2004; Matus et al., 2006). После разделения предков форели и мыши прошло около 400 миллионов лет, а также произошел переход от внешнего оплодотворения и развития к внутреннему, тем не менее белки яйцевых оболочек у форели и мыши имеют значительное структурное сходство как между собой, так и с белками яйцевых оболочек птиц и амфибий (Litscher & Wassarman, 2007). С другой стороны, показано, что у асцидии Ciona intestinalis ZP-домен-содержащие белки, экспрессирующиеся ооцитом, значительно варьируют даже у отдельных индивидуумов, не говоря уже о разных видах, но вариации затрагивают внешний относительно ZP-домена аминокислотный участок (Kürn et al., 2007а). ZP-доменные белки найдены у беспозвоночных животных 5 сравнительно недавно, например, у моллюсков (Aagaard et al., 2006), у нематоды Caenorhabditis elegans (Sapio et al., 2005) и асцидии (Tarin & Cano, 2000). С возрастанием количества аннотированных геномов беспозвоночных удается предсказать наличие ZP-домен-содержащих белков, а затем подтвердить их наличие экспериментально (Kürn et al., 2007b). Большинство выявленных экспериментально ZP-доменных белков локализуется именно в специфических структурах, обеспечивающих оплодотворение.
Среди известных и хорошо изученных функциональных аналогов ZP самым древним в эволюционном плане считалась вителлиновая оболочка, описанная у некоторых двустворчатых моллюсков (Tarin & Cano, 2000; Wong & Wessel, 2006).
В настоящей работе приведены данные, позволяющие думать, что пластинка контакта ооцита A. aurita является наиболее древним аналогом ZP, если брать за основу традиционные эволюционные схемы. Новизна и актуальность настоящей работы состоит в том, что впервые описана морфодинамика функционального аналога ZP у представителя внешней по отношению к Bilateria группе Cnidaria, а также проведен начальный молекулярно-биологический анализ компонентов пластинки контакта.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель настоящего исследования — описание структурной организации и морфодинамики пластинки контакта анимального полюса ооцита сцифомедузы Aurelia aurita на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях, а также определение частичной нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей ZP-доменный белок пластинки контакта.
Для этого решали следующие задачи:
1) Сбор материала во время летних сезонов 2009—2012 гг.
2) Описание пластинки контакта на светооптическом и электронно-микроскопическом уровне.
3) Описание морфодинамики пластинки контакта.
4) Выявление пластинки контакта на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях с помощью антител против мезоглеина.
5) Клонирование последовательности кДНК ZP-доменного белка пластинки контакта (белка Gf180).
6) Проведение оплодотворения in vitro для доказательства функциональной вовлеченности пластинки контакта в процессы оплодотворения.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Адонин, Леонид Сергеевич
выводы
1. На начальных стадиях развития ооцита сцифомедузы Aurelia aurita в его периферической цитоплазме появляются эозинофильные гранулы, которые затем собираются на анимальном полюсе ооцита и формируют внеклеточную структуру - пластинку контакта.
2. Методом непрямой иммунофлуоресценции показано, что материал гранул и пластинки контакта связывает поликлональные AT (RA47) против мезоглеина.
3. На основании ультраструктурного анализа, гранулы в периферической цитоплазме можно разделить на два типа по их морфологическим особенностям. Материал обоих типов гранул и сама пластинка связывает поликлональные антитела RA47; полностью сформированная пластинка контакта имеет фибриллярное строение.
4. Оплодотворение in vitro показало, что сперматозоиды скапливаются только около пластинки контакта.
5. Частичная последовательность кДНК, кодирующей белок пластинки контакта Gf180, имеет открытую рамку считывания 1167 нп (389 аа) и содержит в своем составе ZP-домен, идентичный ZP-домену мезоглеина.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Адонин, Леонид Сергеевич, Санкт-Петербург
1. Адонин Л.С., Подгорная О.И., Шапошникова Т.Г. 2012. Морфологическая структура пластинки в зоне контакта ооцита с зачатковым эпителием у сцифоидной медузы Aurelia aurita (Cnidaria: Semaeostomae) // Онтогенез. T.43 (№1).С.20-27.
2. Алов И.А. 1972. Цитофизиология и патология митоза М.: «Медицина». С. 177-183.
3. Гайер Г. 1974. Электронная гистохимия. М., Мир. С.488.
4. Догель В. А. 1937. Тип Кишечнополостных (Coelenterata)// Руководство по зоологии. М. Л., 1.1. С.268-369.
5. Догель В.А. 1981. Зоология беспозвоночных. М.: Высшая школа.1. С.606.
6. Заварзин A.A. 1945. Очерки эволюционной гистологии крови и соединительной ткани. М: Медгиз. С.230.
7. Иванова-Казас О.М. 1975. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных. Новосибирск: Наука. С.372.
8. Кауфман З.С. 2004. О некоторых особенностях ранних стадий развития книдарий. Биология моря. Т.30. №4. С.316-319.
9. Матвеев И.В. 2007. Экспрессия гена мезоглеина в различных типах клеток медузы Aurelia aurita. Кандидатская диссертация.
10. Найден A.B. 2012. Кариотипирование беломорской сцифоидной медузы Aurelia aurita. Магистерская диссертация.
11. Напара Т.О., Оскольский A.A., Шапошникова Т.Г., Чага О.Ю. 1996. Мезоглеальные клетки сцифоидной медузы Aurelia aurita. III. Авторадиографический анализ процессов синтеза экстраклеточного матрикса мезоглеи. Цитология. Т.38, №4/5. С.465-474.
12. Ованесян И.Г. & Кузнецова В.Г. 1995. Кариотип Hydra vulgaris Pall собзором данных о кариотипах других видов семейства Hydridae (Cnidaria, Hydrozoa, Hydroideae, Hydrida). Тр. ЗИН РАН. Т.261. С.95-102.
13. Пирс Э. Гистохимия. 1962. М., Издательство иностранной литературы. С.964.
14. Родионов А.В. 1999. Эволюция дифференциальной исчерченности хромосом. Генетика. Т.33. №.3. С.277-290.
15. Aagaard J.E., Yi X., MacCoss M.J., Swanson W.J. 2006. Rapidly evolving zona pellucida domain proteins are a major component of the vitelline envelope of abalone eggs. Proc Natl Acad Sci USA. 103(46): 17302-17307.
16. Adonin L.S., Shaposhnikova T.G., Podgornaya O.l. 2012a. Aurelia aurita (Cnidaria) oocytes' contact plate structure and development. PLoS ONE 7(1 l):e46542. doi: 10.137 l/journal.pone.0046542.
17. Adonin L., Podgornaya O. 20126. Contact plate of Aurelia aurita is a functional analogue of mammalian Zona Pellucida // 2nd international simposyum Anchialine ecosystems. Natura Croatica, Vol. 21, № suppl.l. P.3-6.
18. Anokhin B. & Kuznetsova V. 1999. Chromosome morphology and banding patterns in Hydra oligactis Pallas and H. circumcincta Schultze (Hydroidea, Hydrida). Folia Biologica. Vol.47. N3-4. P.91-96.
19. Anokhin B. & Nokkala S. 2004. Characterization of C-heterochromatin in four species of Hydrozoa (Cnidaria) by sequence specific fluorochromes Chromomycin A3 and DAPI. Caryologia. Vol. 57. N.2. P. 163-166.
20. Anokhin В., Hemmrich-Stanisak G., Bosch T.C.G. 2010. Karyotyping and single-gene detection using fluorescence in situ hybridization on chromosomes of Hydra magnipapillata (Cnidaria: Hydrozoa). Comparative Cytogenetics. Vol.4. N2. P.97-110.
21. Ball, E.E., Hayward, D.C., Saint, R. and Miller, D.J. 2004. A simple plan Cnidarians and the origin of developmental mechanisms. Nat. Rev. Genet. Vol.5. P.567-577.
22. Bandyopadhyay A, Zhu Y, Malik SN, Kreisberg J, Brattain MG, Sprague
23. EA, Luo J, Lopez-Casillas F, Sun LZ. 2002. Extracellular domain of TGFbeta type III receptor inhibits angiogenesis and tumor growth in human cancer cells. Oncogene. №21(22):3541-51.
24. Boja ES, Hoodbhoy T, Fales HM, Dean J. Structural characterization of native mouse zona pellucida proteins using mass spectrometry. J Biol Chem.;278(36):34189-202.
25. Bosch T.C.G.Ancient signals: peptides and the interpretation of positional information in ancestral metazoans. 2003. Comparative Biochemistry and Physiology Part B Vol.136. P.185-196.
26. Bridge D, Cunningham CW, DeSalle R, Buss LW. 1995. Class-level relationship in the phylum Cnidaria: molecular and morphological evidence. Mol. Biol. Evol. Vol.12. N.4. P.679-689.
27. Britten, P.J., Kohne, D. 1968. Repeated nucleotide sequences. Carnegie Inst. Wash. Yearb. Vol. 66. P.73-76.
28. Brivio MF, Bassi R, Cotelli F. 1991. Identification and characterization of the major components of the Oncorhynchus mykiss egg chorion. Mol Reprod Dev. №28(l):85-93.
29. Campbell. 1974. Development. Coelenterate biology. Reviews and new perspectives. Eds. Muskatine L., Lenhoff H. Acad. Press. NY SF - London. 1974. P. 1-93.
30. Cartwright P., Halgedahl S.L., Hendricks J.R., Jarrard R.D., Marques A.C., Collins A.G., B.S.Lieberman. 2007. Exceptionally Preserved Jellyfishes from the Middle Cambrian. PLoS ONE. Vol.2. N. 10. el 121.
31. Cavallone D, Malagolini N, Serafini-Cessi F. 2001. Mechanism of release of urinary Tamm-Horsfall glycoprotein from the kidney GPI-anchored counterpart. Biochem Biophys Res Commun. № 12;280(1):110-4.
32. Chapman D.M. 1974. Cnidarian histology. Coelenterate biology. Reviews and new perspectives. Eds. Muskatine L., Lenhoff H. Acad. Press. NY SF -London. P. 1-93.
33. Chapman G. 1966. The structure and function of the mesoglea. Cnidaria and their evolution, ed. Rees. Symp. Soc. London. Vol.16. P.147-168.
34. Chen J.-Y., Oliveri P., Gao F., Dornbos S.Q., Li C.-W., Bottjer D.J., Davidson E.H. 2002. Precambrian animal life: probable developmental and adult cnidarian forms from Southwest China. Dev Biol.Vol.248. N.l. P. 182-196.
35. Choe B.L., Hongying Q., Song J.I. 2000. Karyotipes of two sea anemones (Cnidaria; Anthozoa) from Korea. Korean J. Biol. Sei. Vol.4; P. 103-104.
36. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. Vol.162. N.l. P. 156-159.
37. Claus C. 1883. Undersuchungen über die Organisation der Entwicklungder Medusen. Prag und Leipzig.
38. Collins A.G. Phylogeny of Medusozoa and the evolution of cnidarian life cycles. J. Evol. Biol. 2002. Vol.15. P.418-432.
39. Conley BA, Koleva R, Smith JD, Kacer D, Zhang D, Bemabeu C, Vary CP. 2004. Endoglin controls cell migration and composition of focal adhesions: function of the cytosolic domain. J Biol Chem. №25;279(26):27440-9.
40. Conway Morris S. 2000. The Cambrian "explosion": Slow-fuse or megatonnage? Proc. Nat. Acad. Sei USA. Vol. 97. N.9. P. 4426-4429.
41. Darie CC, Biniossek ML, Jovine L, Litscher ES, Wassarman PM. 2004. Structural characterization of fish egg vitelline envelope proteins by mass spectrometry. Biochemistry. № 15;43(23):7459-78.
42. Darling J.A., Reitzel A.R., Burton P.M., Mazza M.E., Ryan J.F., Sullivan J.C., Finnerty J.R. 2005. Rising starlet: the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. BioEssays Vol.27. P.211-221.
43. Dawson M.N, Jacobs D.K. 2001. Molecular evidence for cryptic species of Aurelia aurita (Cnidaria, Scyphozoa). Biol Bull. 200(1): 92-96.
44. Eckelbarger K.J. & Larson R.J. 1988. Ovarian morphology and oogenesisinin Aurelia aurita (Scyphozoa: Semaeostomae): ultrastructural evidence of heterosynthetic yolk formation in a primitive metazoan. Marine Biol. Vol.100. P.103—115.
45. Eichler E. & Sankoff D. 2003. Structural dynamics of eukaryotic chromosome evolution. Science. V.301. P.193-191.
46. Fautin, D. G. 2002. Reproduction of Cnidaria. Can. J. Zool. Vol.80. P.1735-1754.
47. Finnerty J.R., Paulson D., Burton P., Pang K., Martindale M.Q. 2003. Early evolution of a homeobox gene: the parahox gene Gsx in the Cnidaria and the Bilateria. Evol Dev 5:331-345.
48. Fitzgerald K. & Greenwald I. 1995. Interchangeability of Caenorhabditis elegans DSL proteins and intrinsic signalling activity of their extracellular domains in vivo. Development. Vol.121 P.4275-4282.
49. Flot J.-F., Ozouf-Costaz C., Tsuchiya M.,Van Woesik R. 2006. Comparative coral cytogenetics. Proc. of the 10th internat. coral reef symp. P.4-8.
50. Fonsatti E, Altomonte M, Nicotra MR, Natali PG, Maio M. 2003. Endoglin (CD 105): a powerful therapeutic target on tumor-associated angiogenetic blood vessels. Oncogene. № 29;22(42):6557-63.
51. Fritz BA, Poppel CS, Fei MW, Lowe AW. 2002. Processing of the major pancreatic zymogen granule membrane protein, GP2. Pancreas. №24(4):336-43.
52. Fukui Y. 1996. Karyotype of the Sea Anemone Aiptasiomorpha (Anthozoa, Actiniaria) From Japan. Biol. Bull. Vol.190. P.6-7.
53. Galliot B. & Miller D. 2000. Origin of anterior patterning how old is our head? TIG. Vol.16. N.l.
54. Goldberg R.B., Crain W. R., Ruderman J.V., Moore G.P., Barnett Th.R., Higgins R.C. , Gelfand R.A., Galau G.A., Britten R.J., Davidson E.H. 1975. DNA sequence organization in the genomes of five marine invertebrates. Chromosoma. Vol. 51. P.225-251,
55. Gregory, T.R. 2002. Genome size and developmental complexity. Genetica. Vol.115. P.131-146.
56. Gregory T.R. 2004. Insertion-deletion biases and the evolution of genome size. Gene. Vol.324. P. 15-34.
57. Guder C., Philipp I., Lengfeld T., Watanabe H., Hobmayer B., Holstein T
58. W. 2006. The Wnt code: cnidarians signal the way. Oncogene Vol. 25. P. 74507460.
59. Hadzi J. 1953. An attempt to reconstruct the system of animal classification. Syst. Zool. Vol.2. P.145-154.
60. Haeckel E.H. 1879. Das System der Medusen: Erster Theil einer Monographie der Medusen. G. Fischer, Jena.
61. Hand C. 1959. On the origin and phylogeny of the Coelenterates. Syst. Zool. Vol.8. P.191-202.
62. Heng H.H.Q., Tsui L.-Ch. 1993. Modes of DAPI banding and simultaneous in situ hybridization. Chromosoma. Vol.102. P.325-332.
63. Heyward A.J. 1985. Chromosomes of the coral Goniopora lobata (Anthozoa: Scieractinia). Heredity. Vol.55. P.269-271.
64. Hyman, L.H. 1940. The invertebrates: Protozoa through Ctenophora (Vol. I). McGraw-Hill, New York. P.726.
65. Jazwinska A, Affolter M. 2004. A family of genes encoding zona pellucida (ZP) domain proteins is expressed in various epithelial tissues during Drosophila embryogenesis. Gene Expr Patterns.№4(4):413-21.
66. Jovine L, Qi H, Williams Z, Litscher E, Wassarman PM. 2002. The ZP domain is a conserved module for polymerization of extracellular proteins. Nature Cell Biology 4:457-461.
67. Jovine L., Darie C. C., Litscher E.S., Wassarman P.M. 2005. Zona pellucida domain proteins. Annu. Rev. Biochem. Vol.74. P.83-114.
68. Kayal, E. & Lavrov, D.V. 2008. The mitochondrial genome of Hydra oligactis (Cnidaria, Hydrozoa) sheds new light on animal mtDNA evolution and cnidarian phylogeny. Gene Vol.410. P. 177-186.
69. Kenyon J.C. 1992. Chromosome Number in Ten Species of the Coral Genus Acropora. Proc. of the 7th Int. Coral Reef Symp. Vol. 1. P.471-475.
70. Kiyota T., Kinoshita T. 2002. Cystein-rich region of X-Serrate-1 is required of Notch signaling in (Xenopus) primary neurogenesis. Int. J Dev Biol. Vol.46. N.8. P.1057-1060.
71. Kortschak R.D., Samuel G., Saint R., Miller D.J. 2003. EST Analysis of the Cnidarian Acropora millepora reveals extensive gene loss and rapid sequence divergence in the model invertebrates. Current Biology. Vol. 13. P.2190-2195.
72. Kiirn U., Sommer F., Bosch T.C., Khalturin K. 2007a. In the urochordate Ciona intestinalis Zona Pellucida domain proteins vary amongindividuals. Dev Comp Immunol 31:1242-1254.
73. Kiirn U., Sommer F., Hemmrich G., Bosch T.C., Khalturin K. 2001b. Allorecognition in urochordates:identification of a highly variablecomplement receptor-like protein expressed in follicle cells of Ciona. Dev Comp Immunol 31:360371.
74. Kusserow A., Pang K., Sturm C., Hrouda M., Lentfer J.,. Schmidt H. A., Technau U., Arndt von Haeseler A., Hobmayer B., Martindale M.Q., Holstein T.W. 2005.Unexpected complexity of the Wnt gene family in a sea anemone. Nature. Vol.433. P.156-160.
75. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the essambly of the head of the bacteriophage T4. Nature 4: 680-682.
76. Lavrov D.V. 2007. Key transitions in animal evolution: a mitochondrial DNA perspective. Integr. Comp. Biol. Vol.47. P.734-743.
77. Lee P. N., Pang K., Matus D. Q. and Martindale M. Q. 2006.
78. A WNT of things to come: evolution of Wnt signaling and polarity in cnidarians. Semin.Cell Dev. Biol. Vol.17. P.157-167.
79. Li X, Chang YH. 1995. Amino-terminal protein processing in Saccharomyces cerevisiae is an essential function that requires two distinct methionine aminopeptidases. Proc Natl Acad Sci USA. 92(26): 12357-61.
80. Litscher E.S., Qi H., Wassarman P.M. 1999. Mouse zona pellucida glycoproteins mZP2 and mZP3 undergo carboxy-terminal proteolytic processing in growing oocytes. Biochemistry. 38: 12280-12287.
81. Litscher E.S., Wassarman P.M. 2007. Egg extracellular coat proteins: from fish to mammals. Histol Histopathol, 22:337-347
82. Lukhtanov V.A.,. Kandul N.P, Plotkin J., Dantchenko A.V., Haig D., Pierce N.E. 2005. Reinforcement of pre-zygotic isolation and karyotype evolution in Agrodiaetus butterflies. Nature. Vol.436. P.385-389.
83. Marques's A.C. & Collins A.G. 2004. Cladistic analysis of Medusozoa and cnidarian evolution. Inv. Biol. Vol.123. N.l. P.23-42.
84. Matus D.Q., Pang K., Marlow H., Dunn C.W., Thomsen G.H., Martindale M.Q. 2006. Molecular evidence for deep evolutionary roots of bilaterality in animal development. PN AS 103:11195-11200.
85. Matveev I.V., Shaposhnikova T.G., Podgornaya O.I. 2007. A novel Aurelia aurita protein mesoglein contains DSL and ZP domains. Gene. V.399. P.20-25.
86. Mayer A.G. Medusae of the world, III: the Scyphomedusae. 1910. Carnegie Institute, Washington в открытом доступе на http://www.2.eve.ucdavis.edu/mndawson/tS/tsPDF/ Мауег1910/ Mayerl910499.html
87. Metchnikoff I. 1893. Lectures on the comparative pathology of inflammation, delivered at the Pasteur institute in 1891. London 218p.
88. Mollenhauer D. 2000. Founder of "Archiv für Protistenkunde": Fritz Schaudinn his unfinished life. Protist. №151(3):283-7.
89. Müller W.A. & Leitz T. 2002. Metamorphosis in the Cnidaria. Can. J. Zool. Vol.80. P.1755-1771.
90. Panyim S., Chalkley R. 1969. The heterogeneity of histones. I. A quantitative analysis of calf histones in very long Polyacrylamide gels. Biochemistry,8:3972-3979.
91. Park T., Woo J. , Lee D. J. 3, Lee D.C., Lee S., Han Z., Chough S.K., Choi D.K. 2011. A stem-group cnidarian described from the mid-Cambrian of China and its significance for cnidarian evolution. Nat. Commun. Vol. 2.
92. Peterson K.J., Davidson E.H. 2000. Regulatory evolution and the origin of the bilaterians. Proc. Nat. Acad. Sci USA. Vol. 97. N.9. P. 4430-4433.
93. Peterson K.J., Eernisse D.J. 2001.Animal phylogeny and the ancestry of bilaterians: inferences from morphology and 18S rDNA gene sequences. Evolution & Development. Vol.3. N.3. P. 170-205.
94. Qi HY, Hyndman JB, Bernstein HD. 2002. DnaK promotes the selective export of outer membrane protein precursors in SecA-deficient Escherichia coli. J Biol Chem. № 27;277(52):51077-83.
95. Rahat A., Rahat M., Searle J.B. 1985. A simple method for the preparation of hydra chromosome spreads: introducing chromosome counts into hydra taxonomy. Experientia. Vol.41. P.282-283.
96. Roller RJ, Wassarman PM. 1983. Role of asparagine-linked oligosaccharides in secretion of glycoproteins of the mouse egg's extracellular coat. J Biol Chem;258(21): 13243-9.
97. Salvini-Plawen Lv. 1987. Mesopsammic Cnidaria from Plymouth (with systematic notes). J. Mar. Biol. Assoc. UK Vol.67. P.623-637.
98. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A laboratory Manual (2nd Edition). New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
99. Sapio M.R., Hilliard M.A., Cermola M., Favre R., Bazzicalupo P. 2005. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev Biol 282:231-245.
100. Podgornaya O.I., Shaposhnikova T.G. 1998. Antibodies with the celltype specificity to the morula cells of the solitary ascidians Styela rustica and Bolteniaechinata. Cell Struct Funct. № 23(6):349-55.
101. Schertan H., Eils R., Trellens-Sticken E., Dietzel S., Cremer T., Walt H., Jauch A. 1998. Aspects of three-dimensional chromosome reorganization during the onset of human male meiotic prophase. J. Cell Sci. Vol.111. P.2337-2351.
102. Schmitt D.M., Brower D.L. 2001. Intron Dynamics and the evolution of integrin b-subunit genes: maintenance of an ancestral gene structure in the coral, Acropora millepora . J. Mol. Evol. Vol.53. P.703-710.
103. Schnedl W., Mikelsaar A. V., Breitenbach M., Dann O. 1977. DIPI and DAPI: fluorescence banding with only negliglible fading. Hum. Genet. Vol.36. P. 167—172.
104. Schuchert P. 1993. Phylogenetic analysis of the Cnidaria. Z . Zool. Syst. Evol. Forsch. Vol.31 P. 16 1-173.
105. Serafini-Cessi F, Malagolini N, Cavallone D. 2003. Tamm-Horsfall glycoprotein: biology and clinical relevance. Am J Kidney Dis.№42(4):658-76.
106. Shao Z., GrafS., Chaga O.Y., Lavrov D.V. 2006.Mitochondrial genome of the moon jelly Aurelia aurita (Cnidaria, Scyphozoa): a linear DNA molecule encoding a putative DNA-dependent DNA polymerase. Gene Vol.381. P.92-101.
107. Shaposhnikova T., Matveev I., Napara T., Podgornaya O. 2005. Mesogleal cells of the jellyfish Aurelia aurita are involved in the formation of mesogleal fibres. Cell Biol. Int. V.29. N.l 1. P.952-958.
108. Shaw P.W., Beardmore J.A., Ryland J.S. 1987. Sagartia troglodytes (Anthozoa: Actiniaria) consists of two species. Mar. Ecol. Prog. Ser. Vol.41. P.21-28.
109. Shibuya N, Nishiyama T, Nakashima N. 2004. Cell-free synthesis of polypeptides lacking an amino-terminal methionine by using a dicistroviral intergenic internal ribosome entry site. National Institute of Agrobiological Sciences. 136(5):601-6
110. Sinclair C.S., Richmond R.H., Ostrander G.K. 2007. Characterization of the telomere regions of scleractinian coral, Acropora surculosa. Genetica. Vol.129. P.227-233.
111. Spring, J., Yanze, N., Josch, C., Middel, A.M., Winninger, B., Schmid, V. 2002.Conservation of Brachyury, Mef2, and Snail in the myogenic lineage of jellyfish: a connection to the mesoderm of Bilateria. Dev. Biol. Vol.244. P.372-384.
112. Steele R.E., David C.N., Technau U. 20H. A genomic view of 500 million years of cnidarian evolution. Trends in Genetics. Vol.27, N.l. P.7-13.
113. Steele R.E. 2005.Genomics of Basal Metazoans. Integr. Comp. Biol. Vol.45. P.639-648.
114. Stepanjants S.D., Anokhin B.A., Kuznetsova V.G. 2006.Cnidarian fauna of relict Lakes Baikal, Biwa and Khubsugul. Hydrobiologia. Vol.568(S). P.225-232.
115. Tarin J.J., Cano A. 2000. Fertilization in Protozoa and Metazoan Animals. Springer. P.355.
116. Technau U. & Steele R.E. 2011. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development Vol.138. P.1447-1458.
117. Towbin H., Staechelin T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Nat Acad Sci USA 76: 4350-4354.
118. Traut, W., Szczepanowski M., Vitkova M., OpitzlChr., Marec Fr. and Zrzavy J. 2007. The telomere repeat motif of basal Metazoa. Chromosome Research. Vol.15. P.371-382.
119. Vagelli A.A. 2007. New observations on the asexual reproduction of Aurelia aurita (Cnidaria, Scyphozoa) with comments on its life cycle and adaptive significance. Inv. Zool. Vol.4. N2. P.l 11-127.
120. Van-Praet M. & Colombera D. 1984.Chromosomes bivalents de deux actinies abyssales (Cnidaria, Anthozoa). Bull. Soc. Zool. Fr. Vol.109. P.227-230.
121. Visser A.E., Eils R., Jauch A., Little G., Bakker P.J.M., Cremer T., Aten J.A. 1998. Spatial distributions of early and late replicating chromatin in interphase chromosome territories. Exp. Cell Res. Vol.243. P.398-407.
122. Vitturi R., Morello A., Montagnino L., Mezzapelle G. 1994. Analysis of conventionally-stained and banded chromosomes of Pelagia noctiluca (Coelenterata,
123. Schyphomedusae): evidence for heteromorphic chromosome pair in males. Biol. Zbl. Vol.113. P.329-337.
124. Wassarman P.M., Jovine L., Litscher E.S. 2001. A profile of fertilization in mammals. Nat Cell Biol 3:E59-E64.
125. Weaver C., Kimelman D. 2004.Move it or lose it: axis specification in Xenopus. Development Vol.131. P. 3491-3499.
126. Werner B. 1975. Bau und lebensgeschichte des polypen von Tuipedalia cystophora (Cubozoa, class nov., Carybdeidae) und seine bedeutung fur die evolution der Cnidaria. Helgol. Wiss. Meer. Vol.27 P.461-504.
127. White M.J.D. 1973. Animal cytology and evolution. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K.
128. Wong J.L., Wessel G.M. 2006. Defending the Zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Current Topics in Development Biology 72:1115.
129. Zachariasa H., Anokhin B„ Khalturin K., Boschc T.C.G. 2004. Genome sizes and chromosomes in the basal metazoan Hydra. Zoology. Vol.107. P.219-227.
130. Zemach A., McDaniel I.E., Silva P., Zilberman D. 2010. Genome-Wide Evolutionary Analysis of Eukaryotic DNA Methylation. Science. Vol.328. P.916-919.1. БЛАГОДАРНОСТИ
131. Отдельная благодарность научному руководителю Подгорной Ольге Игоревне за помощь в работе, безмерное терпение, понимание и поддержку.
-
Адонин, Леонид Сергеевич
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2013
-
ВАК 03.03.04
- Экспрессия гена мезоглеина в различных типах клеток медузы Aurelia aurita
- Участие клеточных элементов тканей внутренней среды в формировании внеклеточного матрикса у медузы Aurelia aurita и асцидий Styela rustica, Boltenia echinata и Molgula citrina
- Исследование клеток и вещества мезоглеи на разных стадиях жизненного цикла AURELIA AURITA (CNIDARIA, SCYPHOZOA)
- Пространственно-временная динамика нейромедиаторных веществ и развитие нервной системы в онтогенезе стрекающих
- Электронно-микроскопическое исследование сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий
