Оценка безопасности и эффективности применения метода лазерно-индуцированной флуоресценции для диагностики состояния тканей и культур клеток

Фатюхина, Ольга Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка безопасности и эффективности применения метода лазерно-индуцированной флуоресценции для диагностики состояния тканей и культур клеток
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оценка безопасности и эффективности применения метода лазерно-индуцированной флуоресценции для диагностики состояния тканей и культур клеток"

На правах рукописи

Фатюхина Ольга Евгеньевна

ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ЛАЗЕРНО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ТКАНЕЙ И КУЛЬТУР КЛЕТОК

03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2008

003452765

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

доктор биологических наук, Трошкова Г. П.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Никифорова Н.Г.

кандидат биологических наук Рыжиков А.Б.

Ведущая организация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск.

Защита состоится «28» ноября 2008 г. в У Ш часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559; тел. +7 (383) 3367428.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан октября 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Карпенко Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в медико-биологических исследованиях широко используется метод лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ). В его основе лежит известное свойство белков и входящих в их состав аминокислот люминесцировать под воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения, что позволяет определять их структуру, состав, состояние, динамические характеристики [Маслов H.A., 2004]. Метод ЛИФ может быть применен в диагностике большого числа заболеваний. В частности, по изменению спектра люминесценции удается идентифицировать ткани, пораженные раком, отличить нормальную аорту от пораженной атеросклерозом [Huang Z., 2004; Majumder S.K., 2003; Hage R. et al., 2003]. Постепенно лазерные методы диагностики заменяют многие инвазивные методы, в том числе метод биопсии, достаточно дорогостоящий хроматографический метод, а также метод высоковольтного диэлектрофореза, с помощью которого не всегда получают адекватные результаты.

Для диагностики чаще используется ультрафиолетовое излучение с длиной волны (к) более 300 нм. Однако использование коротковолнового излучения, например Х=248 нм, позволяет получать как более интенсивное возбуждение флуоресценции, так и спектры флуоресценции, специфичные для каждого вида тканей. Показана возможность применения метода ЛИФ, возбуждаемого KrF эксимерным лазером (^=248нм) в диагностике остеопороза [Петренко П.П., 2004], в определении жизнеспособности органов трансплантатов, использующихся в кардиохирургии [Потапенко М.М., 2006], в оценке изменений структуры клапаносодержащего фрагмента аорты на этапах его подготовки для трансплантации [Субботин Д. В., 2006]. Между тем, эффективность и безопасность метода, перспективность его использования для диагностики других патологических состояний изучены недостаточно.

Известно, что воздействие УФ излучения небезопасно и может приводить к различным повреждениям на органном, тканевом и клеточном уровне [Ларионов П.М., 2000]. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что потомки клеток, подвергнутых воздействию УФ излучения, характеризуются нестабильностью генома [Пелевина И.И. и др., 1994; 1996]. Однако до сих пор эффекты воздействия коротковолнового (к=248 нм) лазерного излучения на биологические объекты мало изучены.

Таким образом, интерес к анализу механизмов взаимодействия УФ излучения с биологическими объектами, оценке эффективности и безопасности применения метода ЛИФ для диагностики состояния тканей и органов продиктован запросами практической и теоретической медицины. Проведение исследований на культивируемых клетках млекопитающих, полученных из разных тканей и органов, выращиваемых in vitro, позволяет ускорить и удешевить исследования взаимодействия УФ излучения с биологическими объектами.

Цель работы - изучение эффективности и безопасности метода лазерно-индуцированной флуоресценции, возбуждаемой эксимерным лазером, на модельной системе культивируемых клеток.

Задачи исследования:

1. Создать биологические модельные системы in vitro пригодные для изучения эффективности и безопасности метода ЛИФ: определить оптимальные условия получения первичных культур клеток сердца свиньи, получить суспензии перевиваемых культур клеток разного уровня жизнеспособности.

2. Получить спектры ЛИФ первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток, находящихся в разных состояниях жизнеспособности.

3. Оценить диагностическую эффективность применения метода ЛИФ с использованием излучения коротковолнового эксимерного лазера для оценки состояния клеточных культур с разной жизнеспособностью.

4. Определить параметры коротковолнового лазерного излучения, оптимальные для диагностики состояния клеточных культур и вызывающие в них минимальные изменения.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые получены спектры ЛИФ первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток. Показано, что спектры флуоресценции специфичны для каждого вида клеток, спектры ЛИФ клеток с различной жизнеспособности несут диагностическую информацию.

Впервые изучены эффекты воздействия УФ излучения, возбуждаемого KrF эксимерным лазером, на клеточные культуры. Установлено дозозависимое влияние излучения эксимерного KrF лазера на культуральные и морфологические, пролиферативные и цитогенетические свойства диплоидных фибробластов.

Впервые для метода лазерно-индуцированной флуоресценции, возбуждаемой KrF эксимерным лазером (¡^=248 нм), определен диапазон доз (0,05-0,10 Дж/см2), позволяющий проводить многократные измерения спектров ЛИФ с целью получения достоверной

диагностической информации, и не приводящий к необратимым изменениям морфологических, функциональных, репродуктивных свойств клеток.

Проведенные исследования доказали эффективность и перспективность применения метода лазерно-индуцированной флуоресценции, возбуждаемой эксимерными лазерами, для диагностики состояния биологических объектов. Определенные в работе безопасные дозы излучения KrF эксимерного лазера (А.=248 нм) делают возможным использование метода лазерно-индуцированной флуоресценции для оценки состояния биологических объектов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанные модельные системы in vitro культур клеток с различной жизнеспособностью пригодны для изучения эффективности и безопасности метода ЛИФ.

2. Спектры ЛИФ культур клеток позволяют идентифицировать первичные, диплоидные и перевиваемые культуры клеток с различной жизнеспособностью.

3. Лазерное излучение KrF эксимерного лазера в дозах выше 0,1 Дж/см2 не безопасно для культур клеток. Излучение влияет на культуральные, морфологические, пролиферативные, цитогенетические свойства клеток.

4. Влияние лазерного излучения носит дозозависимый характер - скорость спектральных изменений зависит от интенсивности излучения.

5. Излучение KrF эксимерного лазера в дозе 0,05-0,1 Дж/см2 не приводит к изменению спектров ЛИФ, не влияет на морфологические, культуральные и пролиферативные свойства клеток, не приводит к необратимым изменениям в клетках на ультраструктурном, биохимическом, цитогенетическом уровнях.

Внедрение результатов

Полученные результаты исследования используются в лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения, в Институте Теоретической и Прикладной механики Сибирского Отделения Российской Академии Наук, при чтении лекций по медицинской экологии в Новосибирском Государственном Медицинском Университете.

XII Международной конференции по методам аэрофизических исследований «ICMAR-2004» (Новосибирск, 2004), на XII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2004), на международной конференции по биохимии «International Conference on Chemical Biology» (Новосибирск, 2005), на Международном Междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2005), на научно-практической конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск 2005), на ежегодном конкурсе-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2004», «Авиценна-2005», «Авиценна-2006» (Новосибирск, 2004; 2005; 2006). По теме диссертации опубликовано 10 тезисов и 3 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы». Работа изложена на 149 страницах, содержит 46 рисунков и 9 таблиц.

Библиография включает 211 литературных источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Культуры клеток. В работе использовали паспортизованные клеточные культуры, полученные из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Культуры клеток: клетки почки зеленой африканской мартышки (Vero), клетки фибробластов мыши (L-929), клетки почки коккер-спаниеля (MDCK), диплоидные фибробласты человека (Л-68), клетки карциномы шейки матки (HeLa), клетки эпидермоидной карциномы гортани (Нер-2), клетки эпидермоидной карциномы человека (а-431).

Лабораторные животные. В исследовании использовалось 5 самцов свиней весом около 60 кг и 4 поросенка в возрасте 1 месяц весом около 2-3 кг„ полученных из вивария Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (СО РАМН, г. Новосибирск).

Лазерно-индуцированная флуоресценция (ЛИФ). Для исследований спектров флуоресценции различных культур клеток был использован разработанный в Институте теоретической и прикладной

механики СО РАН измерительный комплекс, принципиальная схема которого приведена на рис. 3.

"X I

ФЭК

Inez

J3,

-V

[ul О м Спектрограф J

камера К]

Образец

е.

О й с;

Рис. 1. Схема многоканальной системы регистрации спектров 1 - лазер, 2 - диафрагма, 3 - фильтр, 4 - линза, 5 - полупрозрачное зеркало, 6 - зеркало, 7 - образец, 8 - собирающее зеркало, 9 - спектрометр, 10 - ФЭК, 11 - компьютер

Для изучения безопасности ЛИФ в работе использовали следующие методы: метод фотоаффинной модификации белков [Khodareva S.N. et. al., 2005], метод определения жизнеспособности клеток [Адаме Р., 1983], метод измерения уровня карбонильных соединений [Распопина Г.И. и др., 1991], методы световой и электронной микроскопии, иммуноферментный анализ цитокинов, кариологический анализ, метод диэлектрофореза.

Статистические методы исследования. Статистическая обработка данных исследования проводилась средствами интегрированной статистической системы Origin 7.0. for Windows.

1. Оценка эффективности метода ЛИФ на модели различных культур клеток in vitro

1.1. Создание биологической модели in vitro, пригодной для исследования спектров ЛИФ. Отработка метода получения и культивирования клеток, составляющих ткани сердца. Первичные культуры клеток получали из желудочков миокарда (ЖМ) и эндотелия

(ЭТ) аорты свиней в специализированном боксовом помещении с соблюдением правил асептики.

При отработке условий получения первичных культур клеток сердца и аорты свиньи применяли различные растворы диспергентов для диссоциации клеток и тканей, проводили выбор субстрата, питательных сред и сывороток для культивирования.

В результате проведенных исследований разработаны оптимальные условия получения и культивирования первичных клеток сердца свиньи. Установлено, что в качестве диспергента для выделения клеток сердца свиньи оптимально использовать 0,05 %-ный раствор коллагеназы, для роста и культивирования клеток выделенных из ЖМ свиньи целесообразно использовать среду DMEM с содержанием 10 % сыворотки плодов коровы, тогда как для роста и культивирования клеток выделенных из ЭТ аорты свиньи наиболее подходящей является среда DMEM/F12, так же с содержанием 10 % сыворотки плодов коровы.

В процессе работы получены и заложены на хранение при температуре минус 196 °С первичные культуры клеток сердца свиньи, которые в дальнейшем были использованы в экспериментах по исследованию лазерно-флуоресцентной диагностики состояния клеток сердца.

2. Использование метода ЛИФ для оценки состояния клеточной культуры

2.1. Исследование спектров ЛИФ тканей и клеток в зависимости от длины волны и дозы лазерного излучения. Для

решения этой задачи была отработана методика измерения ЛИФ, исследовано развитие флуоресценции в зависимости от полученной дозы лазерного излучения, частоты импульсов, их интенсивности и длины волны возбуждающего излучения. Совместно с к.ф.-м.н Масловым Н. А. и к.ф.-м.н. Маловым A.A. на базе института теоретической и прикладной механики был подготовлен источник возбуждающего излучения - импульсно-периодический лазер, способный работать в двух режимах. В первом режиме лазер работает как эксимерный KrF лазер с длиной волны излучения Х-248 нм. Этот лазер обеспечивает эффективное возбуждение люминесценции практически всех флуорофоров, входящих в состав биотканей. В другом режиме лазер работает как Ы2-лазер с длиной волны излучения Х=331 нм. Этот лазер используется для возбуждения тех флуорофоров, спектры флуоресценции которых принадлежат длинам волн более 337 нм.

Для получения спектров ЛИФ биологических тканей и клеток обеспечены оптические элементы, газовые системы, скорректированы системы возбуждения. Были выполнены экспериментальные исследования эффективности работы лазерных модулей используемых в качестве КгР и N2 излучателей. Определены составы и ресурсы рабочей смеси, энергетические характеристики лазеров. КгР эксимерный лазер (1=248 нм) обеспечивал энергию в импульсе в диапазоне 5-10 мДж, N2 лазер 3-5 мДж. Длительность излучения лазера составляла 7 не и

импульсная мощность -2 10^ Вт.

Для проверки возможности регистрации спектров биологических тканей были измерены спектры ЛИФ свиной аорты и миокарда при возбуждении излучением различных длин волн (рис. 2, 3). Также были получены спектры различных перевиваемых культур клеток (рис. 4, 5).

Дтоавошц ни Динвоть;ш

Рис. 2. Спектры ЛИФ тканей свиньи при возбуждении азотным лазером Х=337 нм.

Анализ спектров ЛИФ тканей сердца свиньи и различных культур клеток подтверждает, что подготовленная нами система (источник возбуждающего излучения - импульсно-периодический лазер) позволяет уверенно регистрировать флуоресценцию биологических объектов и обладает удовлетворительным соотношением сигнал/шум. Это дает возможность использовать ее в дальнейших экспериментах.

У>

Мшр

300

в н о

л н о о я

со

о X и н в

1,0

350 400 450 300 550 600 Диавзн.}ш

ЦСН

300 330 400 450 500 550 600 Диштьрм

Рис. 3. Спектры ЛИФ тканей свиньи при возбуждении КгР лазером

Я.=248нм.

400 450 500 Длина волны, нм

Рис. 4. Спектры ЛИФ культур клеток при возбуждении азотным лазером А.=337 нм.

I - т---I-'-1-'-1---1

300 350 400 450 500 550 600

Длина волны,нм

Рис. 5. Спектры ЛИФ культур клеток при возбуждении KrF лазером >.=248 нм.

Для выяснения влияния дозы лазерного излучения на спектры ЛИФ была исследована динамика изменения спектров ЛИФ тканей сердца свиньи и перевиваемой культуры клеток Vero в зависимости от количества импульсов облучения азотным (Х.=337 нм) и KrF (А.=248 нм) лазерами. В результате экспериментов было установлено, что при облучение азотным и KrF лазерами в дозе до 500 импульсов не влияет на спектр флуоресценции тканей и клеток.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что облучение культуры клеток и кусочков тканей единицами сотен импульсов излучения с длиной волны 248 нм и 337 нм и плотностью энергии порядка 1 мДж/см2 не оказывают влияние на форму спектров и могут быть использованы для диагностических целей.

2.2. Получение спектров ЛИФ первичных клеток сердца свиньи и перевиваемых культур L-929 и Vero с разной жизнеспособностью. Для снятия спектров флуоресценции культур клеток использовали KrF эксимерный лазер с длиной волны Ä,=248 нм и энергией в импульсе 5-10 мДж. Длительность излучения лазера составляла 7 не и импульсная мощность - 2*10б Вт, доза облучения клеток составляла 0,5 Дж/см2. Выбор, применения KrF-эксимерного лазера для получения спектров флуоресценции клеток с разной жизнеспособностью продиктован тем, что этот лазер обеспечивает эффективное возбуждение люминесценции практически всех флуорофоров, входящих в состав биотканей.

На рисунках 6 и 7 представлены спектры ЛИФ культур клеток L-929 (рис. 6) и Vero (рис. 7) с различной жизнеспособностью (от 0 % до

100%). Зарегистрировано, что в спектрах ЛИФ клеток фибробластов мыши и почки зеленой мартышки с уменьшением жизнеспособности культур клеток наблюдается снижение интенсивности флуоресценции в области 370-500 нм с возникновением характерного плато в области 500600 нм. Дисперсионный анализ зависимости средней интенсивности полосы 370-500 нм от жизнеспособности культур Vero и L-929 показал, что с высокой достоверностью (F = 7,62; р = 4,75-10"4) снижение жизнеспособности культур клеток влияет на интенсивность спектра ЛИФ в области 370-470 нм.

Жизнеспособность

Длина волны,нм

Рис. 6. Спектры ЛИФ культуры клеток Ь-929 различной жизнеспособности при возбуждении КгБ лазером (Х.=248 нм)

О ►о

о S m

1.0-

Жизнеспособность

-100%

65%

........ 0%

300 350 400 450 500

Длина волны,нм

550

600

Рис. 7. Спектры ЛИФ культуры клеток Vero различной жизнеспособности при возбуждении KrF лазером

Таким образом, полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что спектры ЛИФ могут характеризовать состояние перевиваемых культур клеток. Представленные рисунки (рис. 6-7) подтверждают, что снижение жизнеспособности перевиваемых культур клеток Vero и L-929 приводит к снижению интенсивности флуоресценции спектров клеток в области 370-470 нм.

Для выяснения, с какими процессами связаны изменения в спектрах тканей сердца, полного контроля над процессами деградации, происходящими во время хранения органов трансплантатов, целесообразным представлялось измерить спектры клеток свиньи различной жизнеспособности.

На рис. 8 представлены спектры ЛИФ первичных клеток сердца свиньи с жизнеспособностью 100 %; 84 %; 50 %.

Полученные нами спектры ЛИФ клеток сердца свиньи разной жизнеспособности отличаются от спектров ткани миокарда свиньи разного срока хранения, показанных в работах Маслова H.A. [2004], Потапенко М.М. [2006]. Однако, несмотря на отличие спектров тканей, и клеток сердца свиньи, в том и другом случае наблюдается общая тенденция: достоверное снижение интенсивности флуоресценции в области 450-550 нм при снижении жизнеспособности клеток и достоверное снижение интенсивности спектра ЛИФ миокарда свиньи на участке длины волны 420-500 нм в зависимости от срока хранения ткани.

Рис. 8. Спектры ЛИФ клеток сердца свиньи различной жизнеспособности при возбуждении КгБ лазером

Ж изнеспособность — 100%

о,(У

300 350 400 450 500 550 600 650

Длина волны,нм

Анализ полученных спектров клеток, позволяет сделать выводы об эффективности, высокой чувствительности метода ЛИФ с использованием коротковолнового источника излучения. Спектральные изменения ЛИФ связаны с уровнем жизнеспособности клеток и тканей [Mayevsky А. 2000; Kochevar 1.Е.,1989]. С высокой вероятностью можно предположить перспективность использования метода для оперативной (т.е. фактически за доли секунды) диагностики состояния жизнеспособности клеток и тканей различного генеза.

2.3 Влияние излучения эксимерного лазера (А,=248нм) на спектры ЛИФ культур клеток. При получении спектров ЛИФ диплоидных культур клеток Л-68 было замечено, что в зависимости от дозы облучения их спектры флуоресценции претерпевают изменения. Так на рис. 9 приведены спектры ЛИФ диплоидных фибробластов человека до, и после облучения в дозе 0,1 Дж/см2, 1,5 Дж/см2, 2,5 Дж/см2 и 5 Дж/см2.

При увеличении дозы облучения происходит заметное снижение интенсивности флуоресценции спектров в области 400-500 нм. Видно, что интенсивность полосы 400-500 нм снижается с увеличением дозы облучения, причем наиболее низкая интенсивность полосы 400-500 нм наблюдается при наибольшей дозе облучения равной 5 Дж/см2, то есть изменения связаны именно с влиянием лазера, а не с естественным развитием флуоресценции во времени.

Спектры ЛИФ культур клеток Vero (почка зеленой мартышки) и L-929 (мышиные фибробласты) также претерпевали изменения в зависимости от дозы лазерного облучения. Однако данные клеточные культуры менее чувствительные к облучению по сравнению с культурой фибробластов человека, интенсивность их спектров достоверно возрастает при дозе облучения 5 Дж/см2 и более.

Таким образом, в данной серии экспериментов было показано, что энергия излучения KrF эксимерного лазера (А.=248 нм) в дозе от 2,5 Дж/см2 является достаточно высокой для культуры Л-68, в дозе от 5 Дж/см2 - для перевиваемых культур клеток и приводит к изменению в спектрах ЛИФ клеток, что может быть связано с деструктивными изменениями в последних.

350 400 450 500 550 600 Длина волны,нм

Рис. 9. Спектры ЛИФ диплоидных фибробластов человека (Л-68) при возбуждении излучением ВОТ-лазером (Х=248 нм) в дозе 0,1 Дж/см2 (1), 1,5 Дж/см2 (2), 2,5 Дж/см2 (3) и 5 Дж/см2 (4). Отдельно дан увеличенный фрагмент спектра в области 400-550 нм.

3. Оценка безопасности метода лазерно-индуцированной флуоресценции

3.1 Исследование состояния облученных и контрольных клеток человека методом фотоаффинной модификации белков. В

настоящей работе были использованы фотоактивные ДНК-интермедиаты системы эксцизионной репарации оснований. Исследования проводили на диплоидной культуре клеток легкого человека Л-68. Из клеток, подвергшихся облучению УФ-светом с длиной волны 248 нм в дозе 1,5 и 3,5 Дж/см2 и контрольных клеток (необлученные клетки), были получены цельноклеточные экстракты по стандартной методике [В1ас1е е1. а1., 1998].

Исследуя, полученные образцы фотоаффинной модификации белков, с ДНК-дуплексами, содержащими остаток фотоактивного с!СМР 3'конце олигонуклеотида-праймера установлено, что основное влияние УФ-облучения выражается в уменьшении содержания экстрагируемых белков, что может быть следствием частичной денатурации белка при облучении клеток излучением эксимерного лазера (А.=248 нм). Результаты проведенного исследования в целом указывают на негативное влияние излучения КгБ эксимерного лазера в дозах 1,5 и 3,5 Дж/см2 на систему репарации оснований ДНК, играющую одну из

важных ролей в восстановлении облученных клеток млекопитающих и человека.

3.2 Исследование содержания продуктов перекисного окисления липидов в питательной среде облученных фибробластов человека. Известно, что действие неблагоприятных факторов на клетки в первую очередь может нарушать состояние липидов клеточных мембран и активировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Скулачев В.П., 1996]. Ускорение перекисного окисления и выброс его продуктов, карбонильных соединений (КС), является универсальной ответной реакцией клеток на действие неблагоприятных факторов внешней среды. КС, в большинстве случаев, являются достаточно устойчивыми соединениями и поэтому можно ожидать их накопление в системе клетка - питательная среда. Экспериментально доказано, что существует зависимость между состоянием клеточной культуры и уровнем карбонильных соединений в питательной среде [Распопина Г.И., 1991].

В настоящей экспериментальной работе использовали 1-2-х суточный монослой диплоидных фибробластов человека. Облучали клетки в дозах: 0,25; 0,5; 1,5; 2,5; 3,5 Дж/см2. Контроль представлял собой необлученные фибробласты.

После облучения клетки инкубировали при температуре 37 °С в течение 5-12 часов. Далее в облученной культуре фибробластов определяли количество живых и мертвых клеток, затем клетки пересевали на новые культуральные флаконы, а питательную среду использовали для определения содержания уровня КС.

Результаты по изменению жизнеспособности диплоидных фибробластов человека, подверженных лазерному облучению в разных дозах, и уровня КС в питательной среде представлены в таблице 1.

Таблица 1

Зависимость жизнеспособности диплоидных фибробластов человека и уровня КС в среде от дозы облучения _

Доза облучения, (Дж/см2) Уровень карбонильных соединений, ед. ОП, Х=505 нм, М±Бм, п=10 % жизнеспособных клеток, М±8м, п=10

контроль 0,1221 ±0,0001 92±2

0,25 0,1251±0,0011 94±2

0,5 0,1289±0,0003 81±5

1,5 0,2313±0,0016 70±6

2,5 0,3343±0,0003 54±7

3,5 0,3643±0,0014 62±8

Как видно из таблицы, культура фибробластов реагирует на облучение КгР эксимерным лазером. При этом воздействие на монослой клеток в дозе 1,5 Дж/см2 и выше индуцирует перекисное окисление липидов, причем с ростом дозы облучения в мембранах происходит увеличение концентрации КС, что свидетельствует о дозозависимом развитии процесса перекисного фотоокисления ненасыщенных жирных кислот. Доза УФ облучения мене 0,5 Дж/см2 не влияет на изменение клеточного метаболизма диплоидной культуры человека Л-68.

3.3. Влияние разных доз облучения эксимерным лазером (Х,=248 нм) на морфологические характеристики диплоидной культуры фибробластов человека. Световая микроскопия. Следующим этапом нашей работы было исследование образования монослоя, морфологии и индексов пролиферации облученных фибробластов человека, с целью изучения процессов восстановления.

Для проведения эксперимента была создана система для облучения клеток в стерильных условиях. Диплоидные фибробласты облучашследуюшимидрвами:0-гошроль,025;0^; 1,5;2£3,5 ДжЫ2.

Полученные результаты показали, что в контроле культура была представлена типичными фибробластоподобными клетками, образующими характерный для данной культуры монослой. В отличие от контрольных клеток, культура после облучения КгИ лазером в дозе 1,5 Дж/см2 и более меняла характер роста и морфологию. Так, в облученной культуре диплоидных фибробластов появились клетки округлой сжатой формы, при этом число распластанных клеток с типичной для данной культуры морфологией визуально уменьшалось по сравнению с контролем. В результате облучения клеток в две 2^5 Дж/см2 наблюдалось увеличение количества клеток округлой сжатой формы, при этом сохранялся небольшой процент клеток с выраженной поточностью роста

Дальнейшее повышение дозы облучения до 3,5 Дж/см2 приводило к уменьшению степени адгезии клеток к поверхности культурального флакона. В этом случае фибробластоподобные в норме клетки округлялись, увеличивались в объеме и не прикреплялись на поверхность флакона.

Из полученных выше данных видно, что с увеличением дозы воздействия лазерного облучения от 1.5 Дж/см2 и более растет количество необратимых повреждений, от которых клетки не восстанавливаются.

При воздействии на культуру клеток в дозе менее 0,5 Дж/см2 морфология диплоидных фибробластов не отличается от контроля.

Для изучения клеточной пролиферации диплоидную культуру клеток Л-68 культивировали по стандартной методике [Адаме Р., 1983].

Диаграмма индексов пролиферации клеточной культуры Л-68 под воздействием разных доз лазерного облучения представлена на рисунке 10.

Установлено, что время пролиферации диплоидных фибробластов, составляющее в норме 3-4 дня и индекс клеточной пролиферации фибробластов, равный в норме 2-3, сохраняется лишь у клеток, получивших дозу облучения не более 0,5 Дж/см2.

□ контроль

5 1 25 :

а ф ■ 0,25-0,5

|,5 'ф. ш г?:: _ -4! Дж/см2

1 1 гЬ _ ■ □ 1,5 Дж/см2

0.5 ™ ■ м р) - ■

1 2 3 4 5 6 7 а 9 10 й2,5-3,5

пассаж Дж/см2

Рис. 10. Индексы пролиферации фибробластов человека в зависимости от дозы лазерного облучения

Таким образом, показано, что действие лазерного излучения КгР эксимерного лазера (^=248 нм) в дозе 1,5 Дж/см2 и более неблагоприятно влияет на культуральные свойства клеток, изменяет типичные морфологические свойства фибробластов человека, уменьшает их пролиферативную активность. Все перечисленные неблагоприятные факторы лазерного излучения носят дозозависимый характер.

3.4. Влияние разных доз облучения эксимерным лазером (А.=248 нм) на морфологические характеристики диплоидной культуры фибробластов человека. Электронная микроскопия. В

предыдущих экспериментах с помощью световой микроскопии и других методов было показано, что облучение в дозе более 1,5 Дж/см2 небезопасно для клеток и вызывает изменение морфологических, культуральных и пролиферативных свойств культуры. Поэтому в настоящей работе использовали следующие дозы облучения КгР эксимерным лазером 0 -контроль, 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1; 1,5 Дж/см2.

Проведенное исследование свидетельствует, что ни один из использованных режимов облучения не остается безразличным для клеток, вызывая нарушения ионного транспорта в митохондриях и оказывая повреждающее воздействие на структуры, участвующие в синтезе белка. Однако после облучения в дозе 0,5 Дж/см2 через 48 часов после облучения происходит репарация поврежденных клеточных структур, о чем свидетельствуют признаки высокой синтетической активности. При облучении лазером в дозе 0,25 Дж/см2 основная доля клеток уже через 20 ч после облучения не имеет выраженных признаков деструкции. При снижении дозы облучения до 0,05 Дж/см2 клетки через 48 часов в основном имеют цитоплазму средней электронной плотности, без выраженных признаков патологических нарушений.

Таким образом, согласно результатам проведенных микроскопических исследований, наименее выраженное воздействие на фибробласты человека оказывает излучения КгЕ эксимерного лазера в дозе 0,05 Дж/см2. Наблюдаемые при этом режиме облучения изменения легко и быстро обратимы. Так, структура фибробластов, облученных в дозе 0,1 Дж/см2 восстанавливается через 48 ч, тогда как облученные в дозе 0,05 Дж/см2 клетки аналогичны контролю уже через 20 часов.

3.5. Использование кариологического анализа для оценки состояния клеточной культуры при облучении КгЕ эксимерным лазером. Эффекты воздействия эксимерного КгБ лазера на хромосомный аппарат клеток до сих пор не изучены. В связи с этим для выяснения, приводит ли облучение лазера к увеличению хромосомных аберраций, анеуплоидии, дестабилизации хромосом и их изменениям, передаваемым от поколения к поколению, необходимы кариологические исследования.

Нами проведены исследования по изучению функциональной активности культуры диплоидных фибробластов человека до- и после облучения лазером в дозе 0,05 и 0,1 Дж/см2.

В результате проведенных исследований было установлено, что культура клеток имеет стабильный кариотип, который соответствует нормальному кариотипу человека 2п = 46, XX. Количество полиплоидов и хромосомных нарушений в клетках, облученных лазером, сопоставимо с контролем и не выходит за пределы допустимых значений, принятых для диплоидных штаммов человека.

При анализе гомогенно окрашенных хромосом клеток из возможных хромосомных нарушений были выявлены только однохроматидные разрывы и хромосомные фрагменты. Количество однохроматидных разрывов в клетках, получивших дозу облучения 0,05 и 0,1 Дж/см2, достоверно не отличаются и составляют 3,6 % и 4,5 %

соответственно, при этом в контроле также присутствуют 2,7 % клеток с аналогичными разрывами.

Для определения хромосомного состава культур клеток и выявления в них перестроенных хромосом нами были проанализированы ОТС-дифференциально окрашенные метафазные хромосомы. При анализе ОТС-окрашенных метафазных хромосом выявлены структурные перестройки клеток до- и после облучения лазером в дозе 0,05 и 0,1 Дж/см2. Следует отметить, что с увеличением дозы облучения количество хромосомных перестроек незначительно возрастает. Так, в контроле хромосомные перестройки выявлены в 4 % случаев, а при облучении дозой 0,05 Дж/см2 и 0,1 Дж/см2 соответственно 8 % и 16 %. Структурные перестройки хромосом отличаются друг от друга и, вероятно, носят независимый характер, при этом чаще других в перестройки были вовлечены хромосомы 1 и 5. Потери большинства хромосом случайны. Однако хромосома 20 составляет исключение, так как потеря этой хромосомы встречается значительно чаще других.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что облучение диплоидных фибробластов человека эксимерным КгР лазером в дозе 0,05 и 0,1 Дж/см2 не оказывает существенного влияния на изменение доли анеуплоидных и полиплоидных клеток в культуре, однако приводит к возникновению структурных перестроек хромосом.

3.6. Электрические и вязкоупругие свойства эритроцитов после облучения КгР эксимерным лазером. Нами проведены исследования по изучению электрических и вязкоупругих свойств эритроцитов после облучения КгР эксимерным лазером в дозах 0,5; 1; 2 Дж/см2. В качестве контроля использовали необлученные эритроциты.

Установлено, что поляризуемость (в м3) облученных эритроцитов на частоте электрического поля 500 кГц достоверно выше поляризуемости контрольных клеток (2,00Е-015+1,14Е-015 против -2,00Е-015+0.42Е-015, Р<0,001), на частоте электрического поля 1000 кГц наблюдается не только достоверное отличие поляризуемости контрольных эритроцитов от облученных (-2,37Е-015+0,ЗЗЕ-015 против 6,00Е-015+2,64Е-015, Р<0,001), но и четко прослеживается изменение поляризуемости эритроцитов в зависимости от полученной дозы облучения. Поляризуемость эритроцитов получивших дозу облучения 1; 2 Дж/см2 достоверно выше поляризуемости эритроцитов облученных дозой 0,5 Дж/см2 (6ЛЕ-015+131Б015прошв2Д)Б0154029Г>015,РО,001).

Измерение электрохимических свойств эритроцитов облученных УФ- излучением, было повторно сделано через неделю, все

это время контрольные и облученные эритроциты хранились в холодильнике при температуре +4°, хранение суспензии эритроцитов в цитратном буфере при данной температуре в течение 7-ми дней не приводит к значительным изменениям их свойств. Данные измеренные с помощью диэлектрофореза и обработанные пакетом специальных программ, показали, что через неделю после облучения наблюдается тенденция изменения параметров, характеризующих состояние эритроцитов: поляризуемости, среднего радиуса, деформации мембраны у облученных клеток крови. Однако контрольных параметров достигают клетки, получивших дозу облучения не более 0,5 Дж/см2, что говорит о незначительных повреждениях в зригроиигах при две облучения 0,5 Дк/см2.

ВЫВОДЫ

1. Созданы модельные системы in vitro различных культур клеток, пригодные для изучения безопасности и эффективности метода ЛИФ.

2. Впервые получены спектры ЛИФ первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток. Показано отличие формы спектров ЛИФ различных видов культур клеток (первичной культуры клеток сердца свиньи, диплоидной культуры Л-68 и перевиваемых культур клеток MDCK, VERO, L-929, HeLa, Нер-2, а-431) при возбуждении флуоресценции коротковолновым эксимерным лазером.

3. Установлено, что спектры ЛИФ (Я.=248 нм) несут диагностическую информацию о жизнеспособности перевиваемых культур клеток VERO, L-929, а также первичной культуры клеток сердца свиньи. Выявлено снижение интенсивности спектров ЛИФ клеток VERO и L-929 в области 370-470 нм при уменьшении жизнеспособности культуры, а также изменения спектров ЛИФ в области 330 нм, 400-425 нм и 450-500 нм при различной жизнеспособности первичных клеток сердца.

4. Показано, что излучение KrF эксимерного лазера (Х=248 нм) оказывает влияние на кулътуральные, морфологические, пролиферативные, биохимические, кариологические свойства диплоидных фибробластов человека и на электрические и вязкоупругие свойства эритроцитов. Влияние лазерного излучения носит дозозависимый характер. Установлено, что облучение в дозе 1,5 Дж/см2 и более приводит к деградации клеток. При этом происходит изменения интенсивности в спектрах ЛИФ клеток.

5. Впервые определен диапазон доз (0,05-0,10 Дж/см2) излучения KrF эксимерного лазера (1=248 нм), облучение которыми, не приводит к изменениям в спектрах ЛИФ клеток, не влияет на жизнеспособность, культуральные, пролиферативные свойства культуры. Изменения в клетках, вызываемые данными дозами облучения на ультраструктурном, биохимическом, цитогенетическом уровне минимальные и имеют обратимый характер.

Список публикаций по итогам работы:

Статьи:

1. Фатюхина О.Е., Колокольцова Т.Д., Трошкова Г.П. Оценка безопасности метода лазерно-индуцированной флуоресценции на модели культуры диплоидных клеток человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 4. - С. 203-207.

2. Fatyukhina О.Е., Troshkova G.P., Kolokoltsova T.D., Malov A.N. Maslov N.A., Orishich A.M. The effect of laser uv-irradiation on a model system of cultivated cells // Biotechnology and Medicine. - Nova science publishers. - 2004. - P. 1234-1241.

3. Fatyukhina O.E., Kolokoltsova T.D., Troshkova G.P., Maslov N.A., Malov A.N., Orishich A.M., Larionov P.M. Method of laser- induced fluorescence for diagnostics of the biological objects, the study of the UV-radiation effect on native tissues and cells cultures // Methods of Aerophysical Research 12th International Conference. - Novosibirsk, 2004. - P. 115-120.

Тезисы:

1. Фатюхина O.E., Колокольцова Т.Д., Трошкова Г.П., Маслов Н. А., Малов А.Н., Оришич A.M. Действие лазерного излучения на модельную систему культивируемых клеток // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы II Московского международного конгресса. Москва, 2003. - Т. 2. - №1. - С. 322.

2. Фатюхина О.Е., Колокольцова Т.Д., Трошкова Г.П. Разработка метода экпресс-диагностики трансплантатов на основе лазерно-индуцированной флуоресценции // Тезисы ежегодной конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» - Новосибирск, 2004. - №1. -С. 365.

3. Фатюхина О.Е., Колокольцова Т.Д., Трошкова Г.П., Вдовиченко Г.В., Маслов Н. А., Малов А.Н., Оришич A.M., Ларионов П.М. Подходы к созданию нового метода контроля состояния жизнеспособности клеток

и тканей с применением лазерно-индуцированной флуоресценции // Успехи современного естествознания. - 2004. - Т.1.-№6. -С. 139-140.

4. Вдовиченко Г.В., Колокольцова Т.Д., Фатюхина O.E. Отработка условий диссоциации и культивирования клеток сердечной мыщцы и эндотелия сосудов И Успехи современного естествознания.-2004,—Т. 1. - №6. - С. 133-134.

5. Фатюхина O.E., Евланова Е.А., Ким И.И. Подбор оптимальных параметров лазерного излучения KrF-эксимерного лазера для использования в медицинской практике // Тезисы ежегодной конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» - Новосибирск, 2005. - №2. - С. 346-347.

6. Оришич A.M., Маслов Н. А., Малов А.Н., Рожин И.А., Фатюхина O.E., Колокольцова Т.Д., Ларионов П.М., Мандрик М.М., Субботин Д.В. Лазерно-индуцированная флуоресценция тканей и культур клеток различного уровня жизнеспособности, возбуждаемая излучением 248 им. Спектроскопические исследования и получения изображения. // Труды Международного Междисциплинарного Симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине». - Судак, Крым, Украина, 2005 - С. 56-57.

7. Оришич A.M., Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов Н.А, Потапенко М.М., Фатюхина O.E., Субботин Д.В., Караськов A.M. Разработка методов диагностики состояния тканей и культур клеток в режиме реального времени на основе лазерно-индуцированной флуоресценции // Тезисы научно-практической конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» - Новосибирск, 2005. - С.44-45.

8. Ryabchikova E.I., Fatyukhina O.E., Radaeva I.F., Maslov N.A., Malov A.N., Orishich A.M. Influence of UV irradiation on ultrastructure of L-68 human diploid fibroblast // Abt of "International Conference on Chemical Biology. - Novosibirsk, 2005. - P. 154.

9. Канаева О.И., Фатюхина O.E. Изучение действия УФ-лазерного излучения на молекулярно-биологические характеристики культуры клеток Л-68 // Тезисы ежегодной конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» - Новосибирск, 2006. - №2. - С. 579-580.

10. Трошкова Г.П., Фатюхина O.E., Радаева И.Ф., Колокольцова Т.Д. Оценка безопасности и эффективности применения метода лазерно-ииуиированной флуоресцгнщи в медицине на модельной осгеме культнвирушых клеток // Успехи сосремеи юго естсстшз иния. -2007. - № 12. - С. 481.

Ответственный за выпуск: Фатюхина О.Е.

Подписано в печать 09.10.2008 г. Формат 60x84 1/16

Объем 1.5 п.л., 1.8 уч. изд. л. Заказ № 192

Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО "Омега Принт" 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фатюхина, Ольга Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Применение энергии лазерного излучения в медицине

1.1.1. Флуоресцентная диагностика (основные принципы)

1.1.2. Основные хромофоры

1.2. Использование лазерно-индуцированной флуоресценции в 20 биомедицинской диагностике

1.3. Механизм действия лазерного излучения УФ-диапазона на 25 биологические объекты

1.4. Культура клеток как модель для изучения воздействия лазерного 30 излучения УФ-диапазона

1.4.1. Свойства и преимущества клеточной культуры как 31 экспериментальной модели. Область применения

1.4.2. Примеры использования культур клеток для изучения возможностей лазерной терапии и диагностики

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка безопасности и эффективности применения метода лазерно-индуцированной флуоресценции для диагностики состояния тканей и культур клеток"

Актуальность темы. В настоящее время в медико-биологических исследованиях широко используется метод лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ). В его основе лежит известное свойство белков и входящих в их состав аминокислот люминесцировать под воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения, что позволяет определять их структуру, состав, состояние, динамические характеристики. Метод ЛИФ может быть применен в диагностике большого числа заболеваний. В частности, по изменению спектра люминесценции удается идентифицировать ткани, пораженные раком, отличить нормальную аорту от пораженной атеросклерозом. Постепенно лазерные методы диагностики заменяют многие инвазивные методы, в том числе метод биопсии, достаточно дорогостоящий хроматографический метод, а также метод высоковольтного диэлектрофореза, с помощью которого не всегда получают адекватные результаты.

Для диагностики чаще используется ультрафиолетовое излучение с длиной волны (А,) более 300 нм. Однако использование коротковолнового излучения, например А,=248 нм, позволяет получать как более интенсивное возбуждение флуоресценции, так и спектры флуоресценции, специфичные для каждого вида тканей. Показана возможность применения метода ЛИФ, возбуждаемого KrF эксимерным лазером (^=248) в диагностике остеопороза [Петренко П.П., 2004], в определении жизнеспособности органов трансплантатов, использующихся в кардиохирургии [Потапенко М.М., 2006], в оценке изменений структуры клапаносодержащего фрагмента аорты на этапах его подготовки для трансплантации [Субботин Д. В., 2006]. Между тем, эффективность и безопасность метода, перспективность его использования для диагностики других патологических состояний изучены недостаточно.

Известно, что воздействие УФ излучения небезопасно и может приводить к различным повреждениям на органном, тканевом и клеточном уровне [Ларионов П.М., 2000]. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что потомки клеток, подвергнутых воздействию УФ излучения, характеризуются нестабильностью генома [Пелевина И.И. и др., 1994; 1996]. Однако до сих пор эффекты воздействия коротковолнового (А,=248 нм) лазерного излучения на биологические объекты мало изучены.

Задачи исследования:

Научная новизна полученных результатов

Впервые для метода ЛИФ, возбуждаемой KrF эксимерным лазером (k=24S нм), определен диапазон доз (0,05-0,10 Дж/см), позволяющий проводить многократные измерения спектров ЛИФ с целью получения достоверной диагностической информации, и не приводящий к необратимым изменениям морфологических, функциональных, репродуктивных свойств клеток.

Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования доказали эффективность и перспективность применения метода ЛИФ, возбуждаемой эксимерными лазерами, для диагностики состояния биологических объектов.

Определенные в работе безопасные дозы излучения KrF-эксимерного лазера (А,=248 нм) делают возможным использование метода лазерно-индуцированной флуоресценции для оценки состояния биологических объектов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модельные системы in vitro культур клеток пригодные для изучения эффективности и безопасности метода ЛИФ. Оптимальные условия получения и культивирования первичных клеток сердца свиньи.

2. Результаты измерения и анализа спектров ЛИФ первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток с разным уровнем жизнеспособности, показывающие перспективность применения метода ЛИФ для их идентификации.

4. Влияние лазерного излучения носит дозозависимый характер -скорость спектральных изменений зависит от интенсивности излучения. л

5. Излучение KrF эксимерного лазера в дозе 0,05-0,1 Дж/см не приводит к изменению спектров ЛИФ, не влияет на морфологические, культуральные и пролиферативные свойства клеток, не приводит к необратимым изменениям в клетках на ультраструктурном, биохимическом, цитогенетическом уровнях.

Внедрение результатов

Теоретической и Прикладной механики Сибирского Отделения Российской Академии Наук, при чтении лекций по медицинской экологии в Новосибирском Государственном Медицинском Университете.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на II Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), на XII Международной конференции по методам аэрофизических исследований «ICMAR-2004» (Новосибирск, 2004), на XII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2004), на международной конференции по биохимии «International Conference on Chemical Biology» (Новосибирск, 2005), на Международном Междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2005), на научно-практической конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск 2005), на ежегодном конкурсе-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2004», «Авиценна-2005», «Авиценна-2006» (Новосибирск, 2004; 2005; 2006). По теме диссертации опубликовано 10 тезисов и 3 статьи.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Фатюхина, Ольга Евгеньевна

1.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ опубликованных источников показывает, что большинство лазерных методов диагностики успешно использующихся в медицине, основаны на явлении флуоресценции. Метод лазерно-индуцированной флуоресценции (ЛИФ) успешно применяется в диагностике заболеваний разной этиологии. Для диагностики чаще используется ультрафиолетовое излучение с длиной волны больше 300 нм. Однако использование коротковолнового излучения, например А--248 нм, позволяет получать как более интенсивное возбуждение флуоресценции, так и спектры флуоресценции, специфичные для каждого вида тканей. Показано успешное применения метода ЛИФ с использованием коротковолнового излучения на примере отличия спектров ЛИФ здоровых и патологически измененных, тканей сердца, возбуждаемого эксимерным KrF лазером (А,=248 нм). Однако, с чем связано изменение спектров здоровых и патологически измененных тканей, а также эффективность метода, до конца не установлено.

В то же время известно, что воздействие УФ излучения небезопасно и может приводить к различным повреждениям на органном, тканевом и клеточном уровне. Поэтому изучение эффектов воздействия эксимерного KrF-лазера на биологические объекты приобретает особое значение.

Применение метода ЛИФ для диагностики состояния тканей и органов с использованием короткой длины возбуждающего излучения требует более глубокого исследования механизма взаимодействия УФ излучения с тканями и оценки безопасности и эффективности метода. В качестве модели для проведения исследований представляется перспективным использовать культуры клеток.

Таким образом, анализ литературных данных позволил сформулировать следующие основные направления исследования:

- получить и оценить спектры ЛИФ с использованием коротковолнового излучения для различных клеточных культур;

- изучить эффекты взаимодействия УФ-лазерного излучения с культурами клеток;

- определить параметры KrF лазерного излучения, диагностически эффективные и безопасные для биологических объектов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Культуры клеток

В работе использовали паспортизованные клеточные культуры, полученные из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Культуры клеток: клетки почки зеленой африканской мартышки (Vero), клетки фибробластов мыши (L-929), клетки почки коккер-спаниеля (MDCK), диплоидные фибробласты человека (Л-68), клетки карциномы шейки матки (HeLa), клетки эпидермоидной карциномы гортани (Нер-2), клетки эпидермоидной карциномы человека (а-431). Диплоидную культуру Л-68 и клетки Vero выращивали в среде Игла MEM, клетки линии MDCK и L-929 - в среде RPMI-1640, клетки HeLa, Нер-2, а-431 - в среде DMEM. Ростовая питательная среда состояла из 90% среды и 10% сыворотки крови плодов коровы или КРС в соответствии с паспортными характеристиками культуры. Клетки выращивали в монослое на культуральных флаконах. Посевная концентрация составляла для диплоидных клеток Л-68 1,5ТО5 кл-мл"1; Vero - 7-104 кл-мл"1; MDCK - 1,2-105 кл-мл"1; L-929 - 1-Ю5 кл-мл"1; HeLa - 1-Ю5 кл-мл"1; Нер-2 - МО5 кл-мл"1; а-431 - 1-105 кл-мл"1. Время инкубации 3-4 суток в термостате при температуре 37 0 С. Пересев клеток проводили ферментативным методом, применяя 0,25 % -ный раствор трипсина и 0,02 %-ный раствор Версена в соотношении 1:1.

Для получения спектров ЛИФ различных культур клеток использовали

7 1 суспензию клеток в концентрации 1x10 кл-мл" в растворе Хенкса.

Для изучения влияния УФ-излучения на культуру клеток Л-68 в 6 луночную планшету (стерильно) пересаживали клетки в концентрации 2x107 кл-мл"1 ростовой среды по 2 мл в каждую лунку, затем лунки герметично закрывались стеклом из высоко-очищенного, не дающего собственного спектра флуоресценции, кварца. Планшет с культурой клеток помещали в СОг - инкубатор на одни сутки, для прикрепления клеток к субстрату и образования монослоя. По истечению суток монослой клеток JI-68 облучали KrF эксимерным лазером разными дозами облучения (0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,5; 2,5; 3,5 Дж/см2).

2.2. Лабораторные животные

В качестве экспериментального материала нами были использованы ткани сердца свиньи, выбор продиктован тем, что свиное сердце в настоящее время рассматривается как наиболее вероятный объект для ксенотрансплантации человеку (Novak К. 1998). В исследовании использовалось 5 самцов свиней весом около 60 кг, полученных из вивария Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (СО РАМН, г. Новосибирск). Первичные культуры клеток выделяли из желудочков миокарда (ЖМ) и эндотелия (ЭТ) аорты 4 свиней в возрасте 1 месяц весом около 2-3 кг, которые также были получены из вивария Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (СО РАМН, г. Новосибирск).

Все эксперименты выполнены с соблюдением правил биоэтики (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, 1986 г).

2.3. Материалы

В работе использовали питательные среды: Игла MEM, RPMI-1640 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора), DMEM, DMEM/F12 (Биолот, Санкт-Петербург); диспергенты: коллагеназу IV типа (MP Biomedicals), фермент трипсин (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора), а таюке растворы солей Хенкса и Версена, (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора), антибиотик канамицин, сыворотку крови крупного рогатого скота и сыворотку крови плодов коровы (Gibco, США). Все используемые в работе химические реактивы - марки о.с.ч. или х.ч.

МЕТОДЫ

2.4.1. Лазерно-индуцированная флуоресценция

Для исследований спектров флуоресценции различных культур клеток был использован разработанный в Институте теоретической и прикладной механики СО РАН измерительный комплекс, принципиальная схема которого приведена на рис. 3.

В качестве источника облучения использован газоразрядный KrF эксимерный лазер (1) с длиной волны X = 248 нм и энергией в импульсе 5-10 мДж. Длительность излучения лазера составляла 7 не и импульсная мощность -2-10^ Вт. Набор фильтров (3) служил для ослабления зондирующего излучения. Излучение лазера с помощью линзы (4) и полупрозрачного зеркала (5) подавали на предметный столик из слабо флуоресцирующего материала (7), на который помещали кюветы из нержавеющей стали с суспензией клеток. В случае, когда требовалось облучение монослоя клеток в стерильных условиях, клетки облучали в пластиковых планшетах, плотно закрытых пластинками из высокоочищенного, не дающего собственного спектра флуоресценции кварца. Эксперименты проводились при комнатной температуре 22 0 С. Выбором размера диафрагмы (2) и месторасположением линзы (4) определялся размер исследуемой области. С помощью зеркала (8) и линз (9, 10) изображение клеток отображалось с увеличением 3:1 на входную щель спектрометра на основе электронно-оптического преобразователя (ЭОП) и ПЗС камеры (прибор с зарядовой связью). На элементах (1-5) собран спектрограф с топографической дифракционной решеткой, с дисперсией 16 нм/мм, работающий в диапазоне 300-650 нм. Входная щель спектрографа устанавливалась размером 0,05 мм, что обеспечивало разрешающую способность порядка 1нм. На входе спектрографа также ставился фильтр БС-3. Его назначение - отсечь рассеянное лазерное излучение 248 нм, которое во втором порядке перекрывается с излучением на длине волны 496 нм. На выходе спектрографа устанавливался электронно-оптический преобразователь (6) с областью спектральной чувствительности 300-900 нм и коэффициентом усиления на длине волны 555 нм - 104, временем послесвечения порядка 1 мс.

Изображение с люминофора ЭОП с помощью зеркал (7) регистрировалось ПЗС камерой и передавалось в компьютер. При обработке, для уменьшения уровня шумов, производилось усреднение по 100 строкам. Также вычитался фоновый сигнал, взятый с не засвеченного участка изображения. Чтобы учесть возможные флуктуации формы спектра от одного импульса к другому, с одного образца (суспензия или монослой различных культур клеток) спектр снимался 10 раз, а потом вычислялся средний спектр и среднеквадратичное отклонение для каждой его точки. Во всех экспериментах это отклонение в среднем составляло порядка 1 % от величины сигнала. Нормировка на чувствительность фотокатода ЭОП не проводилась. Тем не менее, хоть истинная форма спектра и искажена на приведенных графиках, относительные изменения на них можно прослеживать с высокой точностью.

Сферическое зеркало (1) располагалось так, чтобы входная щель спектрометра оказалась в его фокусе. Таким образом, оптическая система была настроена на бесконечность, и сигнал, соответственно, усреднялся по всей поверхности образца. В совокупности с высокой чувствительностью прибора данная реализация измерительной системы позволила измерять спектры ЛИФ культур клеток при плотности энергии облучения до 1 О мДж/см . Это также способствует снижению влияния излучения на образцы клеток.

--------------Ч I Л

IV Образец

-ч1 L о. о а

Рис. 3. Схема многоканальной системы регистрации спектров

1 - лазер, 2 — диафрагма, 3 - фильтр, 4 - линза, 5 - полупрозрачное зеркало, 6 - зеркало, 7 - образец, 8 - собирающее зеркало, 9 - спектрометр (см рис.19), 10-ФЭК, 11 - компьютер

2.4.2, Метод диэлектрофореза

В качестве основного метода регистрации электрофизических характеристик контрольных (без облучения) и облученных эритроцитов в работе использовали диэлектрофорез в неоднородном переменном электрическом поле (НПЭП).

Для проведения эксперимента кровь объемом 6 мл, забирали из локтевой вены донора (здоровый молодой человек без хронических заболеваний) вокутайнерами в цитратный буфер 9:1. Далее кровь облучали в специальных стальных кюветах в дозах 0,5; 1; 2 Дж/см2 KrF эксимерным лазером и переводили в 0,3 М раствор сахарозы в соотношении 1:30. Использование низкопроводящего раствора обеспечивало незначительный уровень тока, проходящего через используемую камеру, и предупреждало нагрев эритроцитов. Раствор с низкой проводимостью позволял также проводить измерения и исследования физических характеристик клетки в широком диапазоне приложенных к ней напряжений.

Экспериментальное исследование поведения облученных и контрольных клеток крови в переменном электрическом поле проводили с помощью экспериментальной установки (рис. 4, 5), которая включала: генератор переменного напряжения, осциллограф, микроскоп с видеокамерой, телевизор, видеомагнитофон, компьютер со специальной программой обработки изображений, а также измерительную камеру [Бакиров Т.С. и др., 2000].

Измерение поляризации клеток осуществляли в измерительной камере в которой формировали неоднородное переменное электрическое поле з

НПЭП) в частотном диапазоне f = (50 -s- 2000) 10 Гц с напряженностью

Е=105 В/м и градиентом напряженности grad Е = 10И В/м2 [Бакиров Т.С. и др., 2001].

Измерения проводили в следующей последовательности. Клетки крови пипеткой вносили под покровное стекло в измерительную камеру. После того как эритроциты заполняли пространство измерительной камеры и приходили в состояние покоя, на электроды измерительной камеры подавали переменное напряжение и начинали видеозапись поведения клеток в НПЭП.

Расчет характеристик НПЭП, измерение степени поляризации и амплитуды деформации клеток, осуществлялся с помощью оригинальной компьютерной программы [Бакиров и др., 2001].

Компьютер Монитор Вндеомагнито фон t

Генератор прямоугольных Микроскоп Видеокамера импульсов t

Генератор синусоидальных импульсов R1 Осциллограф

Рис. 4. Схема лабораторной установки.

Рис. 5. Внешний вид устройства для измерения электрических характеристик клетки

2.4.3. Метод фотоаффинной модификации белков

Работа проведена совместно с младшим научным сотрудником Ильиной Е. С. и ведущим научным сотрудником Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН к. б. н. доцентом Ходыревой С. Н.

Использование метода фотоаффинной модификации белков позволяет идентифицировать в клеточных экстрактах состав белков эксцизионной репарации оснований (ЭРО) [Khodareva S.N. et. al., 2005]. Метод основан на ковалентном присоединении фотоактивных ДНК к белкам, индуцируемом облучением ближним УФ-излучением [Ходарева С.Н., 2006].

После облучения фибробласты JI-68 отмывали от питательной среды фосфатно-солевым буферным раствором (без кальция) и готовили клеточный экстракт согласно [Biade et. al., 1998]. Затем в клеточном экстракте определяли суммарную концентрацию белков согласно [Bradford М.М., 1976].

Для проведения фотоаффинной модификации белков концентрация белков в полученных экстрактах, была выровнена. Фотоаффинную модификацию проводили в соответствии [Dezhurov S.V. et. al., 2005] с использованием следующих ДНК-дуплексов:

5 '-GGCG ATT A AGTTGGG©/PAACGTC AGGGTCTTCC-3' 3 '-CCGCTAATTCAACCC G TTGCAGTCCC AGAAGG-5' 5'-GGCGATTAAGTTGGG©/HOAACGTC AGGGTCTTCC-3' 3'-CCGCTAATTCAACCC G TTGCAGTCCCAGAAGG-5' 5 '-GGCGATTAAGTTGGGO-3'

3 '-CCGCTAATTCA ACCCGTTGCAGTCCCAGAAGG-5' 5'-GGCGATTAAGTTGGG ©/' AACGTCAGGGTCTTCC-3' 3 '-CCGCTAATTCAACC С G T T GCAGTCCCAGAAGG-5' 5'C A T С С A С A

5'-GGCGATTAAGTTGGG ©/ AACGTCAGGGTCTTCC-3' 3'-CCGCTAATTCAACC С G T T GCAGTCCCAGAAGG-5' где © - FAP-dCMP, p - фосфатная группа, но - гидроксильная группа, F -З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуран.

Облучение клеточного экстракта проводили УФ-излучением лампы Bio-Link-BLX (VILBER-LOURMAT) А,=312нм, 1,5 Дж/см2, 5 мин. После облучения аликвоты реакционных смесей анализировали электрофоретическим разделением SDS-электрофореза по Лемми для разделения белковых компонентов [Laemmli U.K., 1970].

2.4.4. Метод определения жизнеспособности клеток Количество жизнеспособных клеток в культуре определяли стандартным методом [Адаме Р., 1983] с помощью 0,5 %-ного водного раствора трипановый синий. При этом методе живые клетки не окрашиваются, а нежизнеспособные клетки окрашиваются в синий цвет.

Процент жизнеспособных клеток в культуре определяли по формуле: общее число клеток - число нежизнеспособных клеток ) : (общее число клеток) х 100

2.4.5. Метод измерения уровня карбонильных соединений

Уровень карбонильных соединений в культуральной жидкости определяли в соответствии с методикой [Распопина Г.И. и др., 1991]. Метод предусматривает косвенную оценку концентрации КС спектрофотометрически, по оптической плотности питательной среды после реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (ДНФГ) при длине волны 505 нм.

В пробирку микропипеткой вносили 0,3 мл исследуемой культуральной среды и добавляли 0,3 мл насыщенного раствора ДНФГ, пробу выдержали при комнатной температуре 10-12 минут. Затем добавляли 3 мл раствора натрия гидроокиси с концентрацией 0,4 моль/л, выдерживали 10-12 минут и измеряли оптическое поглощение растворов на спектрофотометре «Specord М 40» при длине волны 505 нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 1см. В качестве раствора сравнения использовали воду очищенную.

2.4.6. Световая микроскопия

Морфологию культур клеток оценивали с помощью инвертированного микроскопа "Carl Zeiss Jena" (Германия). Клетки исследовали и фотографировали без дополнительной фиксации или окрашивания.

2.4.7. Электронная микроскопия

Электронно-микроскопический анализ клеток после облучения KrF-эксимерным лазером проведен совместно с проф. Е. И. Рябчиковой (лаборатория микроскопических исследований ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Облученные разными дозами УФ - излучения клетки культивировали в течение 1, 20 и 48 часов. Затем клетки фиксировали в 4% растворе параформальдегида на растворе Хенкса, дофиксировали 1% раствором осмиевой кислоты, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, заливали в смесь эпон-арадлит [Уикли Б., 1975]. Ультратонкие срезы готовили на микротоме Reichert-Jung (Австрия), окрашивали растворами уранилацетата и цитрата свинца, и исследовали в электронном микроскопе Н-600 Hitachi (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

2.4.8. Иммуноферментный анализ цитокинов

Для проведения иммуноферментного анализа цитокинов культуру Л-68 облучали (без нарушения стерильности). После облучения клетки культивировали в течение 3-х пассажей, далее фибробласты человека Л-68 снимали с культуральной посуды и в концентрации 1млн кл./мл питательной среды помещали в пробирки. Затем пробирки центрифугировали 10 мин при 3000 g, надосадочную жидкость замораживали и хранили при минус 40 °С до проведения анализа. Концентрацию цитокинов (фактора некроза опухоли-альфа, интерлейкина 8, интерлейкина 16, интерлейкина 4, интерлейкина 1РА, интерферона альфа, интерферона гамма) в культуральных супернатантах облученных фибробластов Л-68 определяли стандартным твердофазным иммуноферментным методом с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) в соответствии с инструкцией фирмы производителя. Схема проведения анализа па примере интерлейкина 4, приведена на рисунке 6. Чувствительность тест систем для интерферона альфа составляла 2 пг/мл (0 — 25 пг/мл), для интерферона гамма - 5 пг/мл {0 -2000 пг/мл), для интерлейкина 4, 8, 16-2 пг/мл (0 - 400 пг/мл), для фактора некроза опухоли - альфа - 2 пг/мл (0-250 пг/мл).

Внесение образца Внесение конъюгата Внесение субстратной к

Инкубация 2 ч, 37Х, л ш->** шейкер 2 о к

Инкубация 1 ч, ЗГС, в X л шейкер £

Ни смеси

Инкубация 25 мин, С I ТМК (20-25) С с НА

I 0) i А а» а. I с о и

Моноклональные антитела к ИЛ-4, сорбированные в лунках планшета

ИЛ-4 э исследуемом образце

Конъюгат моноклональных антител к ИЛ-4 с пероксида-зой хрена

Рис 6. Схема иммуноферментного анализа на примере интерлейкина 4 (ИЛ-4).

2.4.9. Кариологический анализ

Препараты хромосом культур клеток готовили стандартным методом, который предусматривает накопление в культуре клеток с помощью колхицина метафазных пластинок, обработку клеток гипотоническим раствором, фиксацию препаратов и их окрашивание [Графодатский А.С., Раджабли С.И., 1988].

Окраска азур-эозином. Для окраски использовали готовый краситель азур-эозин по Романовскому. К 100 мл дистиллированной воды добавляли 5 мл готового красителя и 2-3 мл 0,1 %-ного раствора натрия двууглекислого для создания рН среды в пределах от 6,8 до 7,2 ед. рН. Предметные стекла выдерживали в красителе 20-25 мин, ополаскивали дистиллированной водой и высушивали, проводя через этиловые спирты возрастающей концентрации (70°, 80°, 96°) и ксилол. Затем наносили 1 каплю канадского бальзама и закрывали покровным стеклом.

Дифференциальная окраска хромосом (G-окраска). Приготовленные препараты хромосом помещали в 0,25 %-ный раствор трипсина нагретый до 30 °С на 5-10 мин, ополаскивали буферным раствором и оставляли в термостате в буферном растворе на 1 час при температуре 62°С. (Буферный раствор готовили растворяя 17,53 г хлористого натрия и 8,82 г цитрата натрия в 1 л дистиллированной волы). Затем препараты окрашивали 2 %-ным раствором красителя Гимза.

С-окраска. Свежеприготовленные препараты обрабатывали раствором НС1 с концентрацией 0,2 моль/л при комнатной температуре в течение 30-40 мин, ополаскивали в дистиллированной воде и помещали в 5%-ный раствор Ва(ОН)2 при температуре 62-65 °С на 10-15 мин. После инкубации в Ва(ОН)2 препараты промывали в 0,2 моль/л растворе НС1, в дистиллированной воде и затем помещали в буферный раствор на 1 час при температуре 62 °С. Затем препараты помещали в 2 %-ный раствор красителя Гимза на 1 час для окрашивания.

Для рутинного анализа и определения кривой распределения числа хромосом исследовали не менее 50 метафаз. Число полиплоидных клеток определяли при анализе 800 метафазных пластинок. Исследовали кариотип клеток, распределение числа хромосом, процент плоидности, структурные хромосомные нарушения.

2.4.10. Статистические методы исследования

Статистическая обработка данных исследования проводилась средствами интегрированной статистической системы Origin 7.0. for

Windows, аппаратное обеспечение Pentium 4, 2500 МГц, используемое программное обеспечение: ОС Microsoft Windows ХР, Microsoft Office ХР Pro. Для статистической обработки результатов исследования использовали альтернативный анализ, метод вариационной статистики: вычисление средней арифметической (М) и ее ошибки (м), метод оценки достоверности различий между группами по критерию Стьюдента (t) с определением показателя статистической достоверности (р<0,05) и в программе Origin по критерию ANOVA (при р<0,05 различия рассматривались как статистически достоверные).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оценка эффективности метода ЛИФ на модели различных культур клеток in vitro

Развитие фундаментальных исследований в области создания лазерных источников, изучение их взаимодействия с биологическими объектами открывает новые широкие перспективы использования лазеров в биологии, в экспериментальной и практической медицине. Опыт работы исследователей в последние годы показал, что лазер может быть использован для терапевтического лечения ряда сложных заболеваний, в том числе и в онкологии. Появились первые сообщения о принципиальной возможности использования лазеров и для диагностики, в частности, склероза и атероматоза сосудов, новообразований кишечника. Однако метод лазерной диагностики состояния тканей и органов в медицинской практике, в том числе и в кардиохирургии, до настоящего времени не разработан. Тогда как, для оценки и контроля жизнеспособности донорских тканей или органов, используемых для пересадки, а также для своевременной интраоперационной диагностики патологических процессов в сердце различного генеза, весьма важна разработка методов быстрой и точной лазерной диагностики.

Возможность диагностики состояния сердечных трансплантатов и аллографтов методом ЛИФ (А,=248 нм) показана в ряде работ [Ларионов П.М. и др., 2002; Потапенко М.М. и др., 2005]. В исследованиях [Маслов А.А., 2003] установлено отличие патологических и здоровых спектров ЛИФ тканей сердца: изменение спектра ЛИФ тканей при патологических процессах, сопровождаемых кальцинозом, связано с появлением дополнительной, отсутствующей в здоровой ткани сердца, флуоресценции минерала гидроксиаппатита. Также, определено, что снижение жизнеспособности различных тканей сердечно-сосудистой системы, обусловленной сроками и условиями хранения, приводят к перестройке их спектров ЛИФ [Маслов А.А., 2004].

Однако, в этих исследованиях точно не установлено, с чем связаны наблюдаемые спектральные изменения. Анализ представленных спектров ЛИФ весьма затруднен, что может быть связано с присутствием в биологических тканях множества хромофоров, а также с противоречивостью, неоднородностью (исследовались различные ткани, широко варьировались режимы лазерного облучения (мощность, экспозиция, длины волн). В настоящее время практически отсутствуют данные по эффективности применения метода ЛИФ с использованием коротковолнового излучения в медицинской практике.

Для выяснения, с какими процессами связаны изменения в спектрах тканей сердца, полного контроля над процессами деградации, происходящими во время хранения органов трансплантатов, а также для изучения перспективности применения метода для диагностики других патологий, представлялось целесообразным провести исследование на клеточном уровне.

Выполнение такого рода исследования требует создание биологической модели in vitro, пригодной для исследования спектров ЛИФ. Поэтому на первом этапе нашей работы был отработан метод получения первичных культур клеток сердца, созданы "патологические" и "здоровые" модели in vitro первичных и перевиваемых культур клеток.

3.1.1. Создание биологической модели in vitro, пригодной для исследования спектров ЛИФ. Отработка метода получения и культивирования клеток, составляющих ткани сердца.

Первичные культуры клеток получали из желудочков миокарда (ЖМ) и эндотелия (ЭТ) аорты свиней.

В условиях экспериментальной операционной под эфирным наркозом животным проводилась левосторонняя торакотомия. После вскрытия перикарда производилось выделение магистральных сосудов, наложение зажимов с последующим лигированием обеих полых вен, аорты, легочного ствола и легочных вен и выполнялось изъятие сердца и аорты. Изолированное сердце и аорту помещали в стерильный раствор Хенкса с антибиотиком. Затем, в специализированном боксовом помещении с соблюдением правил асептики, сердце и аорту свиньи тщательно промывали, очищали от соединительной ткани и кровеносных сосудов. Выделение клеток сердца проводили механо-ферментативным методом. Кусочки ткани измельчали до фрагментов размером 1x1 мм, помещали в раствор диспергента для дезагрегации, используя в качестве диспергента коллагеназу IV типа в концентрациях 0,025 %, 0,05 %; трипсин в концентрации 0,025 % и сочетание фермента трипсина и раствора солей версена 2:1 и 1:2 в концентрации 0,025% и 0,02%, соответственно. Полученную клеточную суспензию фильтровали, центрифугировали, супернатант сливали, а осадок клеток ресуспендировали в питательной среде.

После определения концентрации и жизнеспособности клеток в суспензии, выделенные клетки культивировали при температуре 37 °С в ростовой питательной среде, состоящей из питательной среды и сыворотки крови крупного рогатого скота или плодов коровы. Посевная концентрация составляла 200 тыс. клеток в 1 мл. Пассирование клеток проводили спустя 3 недели ферментативным методом с использованием 0,25 %-ного раствора трипсина и 0,02 %-ный раствор версена в соотношении 1:1. Для наблюдение за состоянием и ростом клеток использовали инвертированный микроскоп "Carl Zeiss Jena" (Германия).

При изучении влияния растворов диспергентов на процесс дезагрегации ткани использовали 0,25 %-ный раствор трипсина, 0,02 %-ный раствор версена в сочетании с 0,25 %-ным раствором трипсина в соотношении 1:2 и 2:1, 0,025 %-ный и 0,05 %-ный растворы коллагеназы (п=6). Результаты по эффективности действия ферментативных растворов на диссоциацию тканей желудочков миокарда представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, при использовании 0,25 %-ного раствора трипсина, а также растворов трипсин :

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фатюхина, Ольга Евгеньевна, Кольцово

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983. - 302 с.

2. Аршакян Х.А., Пушкарев С.В., Половников Е.С., Мешалкин Ю.П. Диагностические возможности индуцированной лазером флуоресценции смывов с шейки матки при онкологических заболеваниях. // Бюллетень СО РАМН. 2007. - № 1 (123). - С. 30-34.

3. Бакиров Т.С., Демыгина Е. Разработка электрооптических систем детекции клеток микроорганизмов // Scientific American. В мире науки. -2006. № 8. - С. 74-77.

4. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Дурыманов А.Г., Порываев В.Д., Топорков B.C. Эквивалентная электрическая схема клетки // Биотехнология. 2000. - № 2. - С. 53-59.

5. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Пугачев В.А., Репин В.Е., Куслий А.А., Смолина М.П., Чепурнов А.А. Исследование амплитудно-частотной поляризации биочастиц в ответ на внешние воздействия // Доклады академии наук. 2001. - Т. 377. - № 3. - С. 399-401.

6. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Топорков B.C. Измерение поляризации отдельной клетки в неоднородном переменном электрическом поле // Биотехнология. 1998. -№2. - С. 73-82.

7. Барабой В.А. Солнечный луч. М: Наука, - 1976. - 97 с.

8. Богадельникова А.Е. Фототерапия УФБ-лучами 311 нм больных атопическим дерматитом с учетом нарушений иммунного статуса. : Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 2007. 20 с.

9. Ботабекова Т.К. Применение излучения лазера на парах золота (на длине волны 0,628 мкм) как новое направление в области лазерной офтальмологии: Автореф.дис. д-ра. мед. наук. М., 2003. 40 с.

10. Брюннер В., Юнге К. Справочник по лазерной технике. / Под ред. А.П.Напартовича. М.: Энергоатомиздат, 1991. - 275 с.

11. Бурштейн Э.И. Люминесценция белка. Природа и применение. Итоги науки и техники. Сер. Молекулярная биология. М.:ВИНИТИ. - 1973. - Т. 3. -С. 126.

12. Быченков О.А., Поляков П.Ю., Рогаткин Д.А. Неинвазивная лазерная флюоресцентная диагностика в лечении рака кожи и и слизистых оболочек полости рта // В сб. Использование лазеров для диагностики и лечения заболеваний, Вып. 3 М.: ЛАС,'2001. - С. 65-71.

13. Вайнберг Ю.П. Способ получения лекарственной формы натриевой соли ДНК // Патент РФ № 2007165. Опубл. - 1993.

14. Веденкина Н.С., Бурштейн Э. А. Триптофановая флуоресценция белков в растворах. Положение максимума спектра флуоресценции // Молекулярная биология. 1970. - № 4. - С. 743-748.

15. Винокуров М.Г., Косякова Н.И., Николаева Н.Н. Печатников В.А. // Биофизика. 1998. - Т. 44. - №.5. - С. 929-930.

16. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

17. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Д. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высш. шк., - 1983. - 196 с.

18. Волков В.В. О выборе источника и дозировок лазерной энергии в лечении глазных болезней // Материалы международного конгресса. М. - 1999. - С. 194-195.

19. Восканян К.Ш. Некоторые общие закономерности действия ионизирующих и лазерных излученийна клетки бактерий: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Обнинск, 2004. 42 с.

20. Гамалея Н.Ф. Применение излучения лазеров в цитологических исследованиях // Фотобиология живой клетки. JL: Наука, - 1979. - С. 194200.

21. Гейниц А.В., Цыганов Г.И., Базаитов JI.B. Современные научные направления и тенденции развития лазерной медицины / Материалы международного конгресса. М. - 1999. - С. 3-6.

22. Георгиев В.Б. Комплексное использование лазерного лечения и кератопластики при эпибульбарных опухолях // Материалы международного конгресса. М. - 1999. - С. 196-197.

23. Гиллет Дж. Фотофизика и фотохимия полимеров. М.: Мир, 1988. 212 с.

24. Гираев К.М., Амиров А. Лазеро-индуцированная флуоресценция спектроскопия в гепатологии // Тезисы докладов на ВНКСФ 7. -Екатеринбург, 2000. С. 27-31.

25. Графодатский А.С., Раджабли С.И. Хромосомы лабораторных и сельскохозяйственных животных. Атлас. // "Наука". Новосибирск: Изд-во СО РАН. - 1988.-С. 8-16.

26. Гринберг К.Н. Цитологические проявления хромосомного дисбаланса у человека // Прогресс в медицинской генетике. М: Медицина, 1978. - С. 151186.

27. Данилин Н.А. Актуальные вопросы лазерной медицины и операционной эндоскопии: Материалы 3-й Международной конференции. М. Видное,1994. с. 39-40.

28. Демченко П. Люминесценция и динамическая структура белков. Киев, 1988.- 112 с.

29. Дубнищева Т. Концепции современного естествознания. М.: Мир, 1997. -832 с.

30. Ето О.А. Клиническая эффективность лечения гипертонической болезни с применением низкоинтенсивной лазеротерапии: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Воронеж, 2005. 20 с.

31. Животная клетка в культуре // Под. ред. Дьяконова Л.П., Ситькова В.И. М., 2000.-412 с.

32. Зорин Н.А., Зорина P.M., Зорина В.М. Получение препаратов альфа-макроглобулина с заданными свойствами // Гематология и трансфузиология. 2000. - №5. - С. 20-21.

33. Измеров Н.Ф., Суворов Г.А. Физические факторы производной и природной среды. Гигиеническая оценка и контроль. М.: Медицина, 2003. -560 с.

34. Илларионов В.Е. "Основы лазерной терапии". М. - 1992. - Серия "Лазерная терапия. В помощь практическому врачу". - М.: Аспект- Пресс,1995.- 18 кн.-518 с.

35. Илларионов В.Е. Техника и методики процедур лазерной терапии. М.: Мир, 1995.-411 с.

36. Интерфероногены: перспективы клинического применения // Под ред. Романцова М.Г. СПб, Наука. - 1998. - 32 с.

37. История и методология клонирования // Человек. 1998. - №3. - С. 11-17.

38. Капранова Е.И. Закаливание детей раннего возраста // Русский медицинский журнал. 1997. - №5. - С. 5.

39. Карачевцева Т.В., Обросов А.Н. Использование естественного и искусственного УФ излучения в лечебных и профилактических целях // Сб. Докладов Использование ультрафиолетового излучения в лечебных и профилактических целях. М.: Наука, 1980. - С. 104-177.

40. Ключарева С.В. Новообразования кожи в офтальмологической практике и современные методы их лечения лазерной установкой на парах меди «Яхрома-Мед» // Лазеры в офтальмологи. 2005. - Т 6. - № 1. - С. 734-742.

41. Концепции современного естествознания: Учебное пособие / Под ред. С.И. Самыгина. Р/Д: Феникс, 1997. - 448 с.

42. Корепанов В.И. Руководство по лазерной терапии. Теория и практика лазерной терапии. М., 1995. - 222 с.

43. Котомина Г.А., Биологический эффект воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на область селезенки поросят : Автореф. дис. . канд. биол. наук. Новосибирск, 2005. 18 с.

44. Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р. Фрешни. М.: Мир, 1989.-333 с.

45. Кульчавеня Е.В. Низкоинтенсивные лазеры в урологии: Учебно-методическое пособие / Е. В. Кульчавеня. Новосибирск, 1995. - 50 с.

46. Кунин А.А. Использование низкоинтенсивной лазерной терапии с целью улучшения пломбирования зубов // Материалы международного конгресса. -М. 1999. - С. 338-339.

47. Ларионов П.М., Малов А.Н., Маслов Н.А., Оришич A.M. Применение метода ЛИФ для исследования влияния УФ-излучения на биологические ткани // Оптика Атмосферы и Океана. 2000. - №2. - С. 305-308.

48. Ларионов П.М., Малов А.Н., Оришич A.M., Щукин B.C. Лазерно-индуцированная флуоресценция сердечных тканей при поражении кальцинозом // Журнал прикладной спектроскопии. 1997. - Т.64. - С. 539544.

49. Ляндрес И.Г., Шкадаревич А.П., A.M. Забазнов A.M., Людчик Т.Б. Лазерные медицинские технологии и лазерная аппаратура в стоматологии // Тезисы докладов международной научной конференции "Лазерная физика и применение лазеров". Минск, 2003. - С. 47-49.

50. Маслов Н.А. Исследование динамики состояния тканей сердца методом лазерно-индуцированной флуоресценции. : Автореф. дис. . канд. физ-мат. наук. Н., 2004. 32 с.

51. Методические рекомендации по экспериментальному изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран. М. -1989. -С. 45.

52. Мешалкин Ю.П., Самойлова Е.С., Федоров В.И., Черкасова О.П. Флуоресценция андрогенов при УФ лазерном возбуждении // Мат. VI межд. Конф. "Актуальные проблемы электронного приборостроения. АПЭП-2002." Новосибирск, 2002. Т.5. - С. 45-49.

53. Мешалкин Ю.П., Черкасова О.П., Самойлова Е.С., Федоров В.И. Лазерно-индуцированная флуоресценция эстрогенов // Оптика и спектроскопия. -2002.-Т. 92.-№1.-С. 38-41.

54. Микробиология с вирусологией и иммунологией / Под ред. Л.Б.Борисова, А.М.Смирновой. М.: Мир, 1994. - 506 с.

55. Минкевич К.В., Проценко Н.Е. Применение полупроводниковых лазеров в гинекологии. М.: Медицина, 2001. - 184 с.

56. Можанов Е.В. Лазерная аутофлюоресцентная спектроскопия в диагностике неспецифического язвенного колита и острой ишемии толстой кишки: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Казань, 2005. -23 с.

57. Мохов A.M., Коган Д., Клименко С.М. // Успехи совр. биол. 1989. -Т. 107. - № 2. - С. 259-273.

58. Мчедлидзе М.Ю., Тюкавина А.И., Венкова А.А. Использование высокоинтенсивных лазерных излучений для коррекции трофических нарушений при заболеваниях сосудов нижних конечностей // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. — 2002. №3. - С. 67-74.

59. Никифоров А.А., Светлова М.П., Соловьева JI.B., Плескач Н.М., Ханавальт Ф., Томилин Н.В. УФ индуцированная иммобилизация репарационного белка ХРА в различных линих клеток человека // Цитология. - 2000. - Т.42. - №2. - С. 181-189.

60. Носик Д.Н., Носик Н.Н., Каплина Э.Н. и др. Активность препарата ферровир в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов // Вопр. вирусол. -2002. -№3. -С. 21-23.

61. Оспельникова Т.П. Системы интерферона и иммунитета при воспалительных гинекологических заболеваниях. Коррекция нарушений индукторами интерферона. М.: Наука, 2002. - 36 с.

62. Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги: Руководство для врачей. СПб.: Питер, 2000. - 480 с.

63. Пелевина И.И., Саенко А.С., Готлиб В.Я., Сынзыныс Б.И. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК. М.: Энергоатомиздат, 1985.-59 с.

64. Петренко П.П. Лазерно-индуцированная флуоресценция как метод диагностики системного остеопороза (клинико-экспериментальное исследование) : Автореф. дис. канд. мед. наук. Н., 2004. 23 с.

65. Петрищева Н. Н., Соколовский Е. В. Применение полупроводниковых лазеров в дерматологии и косметологии: Пособие для врачей. СПб.: СПбГМУ, 2001.- 125 с.

66. Петров А.Н. Основные аспекты культивирования и трансплантации культур фибробластов человека. : Автореф. дис. канд. биол. наук. Н., 2001. -24 с.

67. Потапенко М.М. Оценка жизнеспособности миокарда изолированного сердца методом лазерно-индуцированной флюоресценции. : Автореф. дис. . канд. мед. наук. Новосибирск, 2006. 31 с.

68. Приезжаев Ф.В., Тучин В.В., Шубочкин А.П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука и техника, 1989. - 506 с.

69. Распопина Г.И., Мартынец Л.Д., Колокольцова Т.Д., Децина А.Н. Уровень карбонильных соединений в питательной среде при культивировании клеток животных. // Биотехнология. -1991.- № 1. С. 75-79.

70. Рассохин В.Ф. Лазерная терапия в неврологии. К.: Азимут-Украина, 2001.-202 с.

71. Расулов Г.М. Обоснование клинической эффективности применения Er:YAG лазера при лечении глубокого кариеса: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Москва, 2004. 25 с.

72. Руководство в клинической медицине. Руководство для врачей./ Под ред. С.В. Плетнева. М.: Медицина, - 1996. - С. 432.

73. Chen Y., Liu В., Yu N.-T., Barkley M.D. The peptide bond quenches indole fluorescence // J. Amer. Chem. Soc. 1996. - V. 118. - P. 9271-9278.

74. Самосюк И.З., Лисенюк В.П., Лобода M.B. Лазеротерапия и лазеропунктура в клинической и курортной практике. Киев: Здоровье, 1997. - 240 с.

75. Ситников А.Н. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Мальченко Д.А., Фефелов О.В. Измерение вязкоупругих характеристик частиц методом диэлектрофореза. // Оптика атмосферы и океана. 2003. - Т. 16. - № 5-6. -С. 512-515.

76. Скулачев В.П. Соросовский Образовательный Журнал. 1996. - №3. - С. 4-10.

77. Сперанский А. П. Учебное пособие по физиотерапии.- М.: Медицина, 1975.- 171 с.

78. Ступак В.В. Nd-Yag лазер в хирургии экстрамедуллярных опухолей // Хирургия позвоночника. 2004. - Т. 1. - №1. - С. 71-77.

79. Субботин Д.В. Морфологическая оценка изменений структуры клапансодержащего фрагмента аорты на этапах его подготовки длятрансплантации. : Автореф. дис. . канд. мед. наук. Новосибирск, 2006. 27 с.

80. Тапонайнен Н.Я., Готлиб В.Я., Пелевина И.И. Чуствительность к воздействиям ингибиторов пострадиационной репарации и повторного облучения потомков облученных клеток // Радиобиология. 1986. - Т. 26. -№6. - С. 755-760.

81. Таранов А.Г. Диагностические тест системы: радиоиммунный и иммуноферментный методы диагностики. - Новосибирск: НГУ, 2000. - 260 с.

82. Тхабисимова М.Д., Комарова JT.H., Петин В.Г. Темновое восстановление диплоидных дрожжевых клеток после одновременного воздействия УФ-излучения и гипертермии // Цитология. 2002. - Т. 44. - № 6. - С. 555-559.

83. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М., Мир. 1975. -288 с.

84. Утц С.Р., Кнушке П., Синичкин Ю.П. Применение неинвазивных методов применения в экспериментальной дерматологии // Вестник дерматологии. -1997. -№ 1.-С. 13-16.

85. Фрейдлин И.С. Защита от вирусов с помощью клеток-убийц. М.: Флинта Наука. 1999-2000. - 237 с.

86. Фрейдлин И.С. Иммунная система // Нормальная физиология человека. Учебник для высших учебных заведений / Под ред.академика РАМН Б.И.Ткаченко. 2-е изд.,испр. И доп. М.:ОАО "Медицина", 2005. С. 363 - 386.

87. Химические основы генной инженерии: Учебное пособие М.: МГУ, 1994.-344 с.

88. Холмогоров В.Е., Крыленков В.А., Османов М.А. Первичные фотопроцессы в крови и ее компонентах при действии оптического излучения // Сб. Докладов Биологическое действие ультрафиолетового излучения. М.: Наука, - 1975. - С. 164-177.

89. Черницкий Е.А., Слобожанина Е.И. Спектральный люминесцентный анализ в медицине. Минск, 1989. - 79 с.

90. Черницкий Е.А., Володин В.Н., Воробей А.В. Интенсификация перекисного окисления липидов при повреждении мембран клеток // Биофизика.- 1991. -Т.36. №.5. - С. 855-857.

91. Чорномыз В.В., Фесенко В.В. Применение аутогенных фибробластов в косметологии // Эстетическая медицина. 2004. - Т.З. - №4. - С. 336-342.

92. Шабалин В.Н., Карпенко О.М., Жамилов И.С. Энергетическая насыщаемость сыворотки крови низкоинтенсивным излучением ИК-лазера // Лазер и здоровье 99: материалы Междунар. Конгр. - М., 1999. - С. 496-499.

93. Шелковникова С.Г. Низкоинтенсивные лазеры в комплексном лечении начального кариеса // Современные технологии в терапевтической стоматологии: Материалы науч.сипоз., Воронеж, 2002. - С.52-55.

94. Шпольский Е.В. Современная фотохимия // Успехи физических наук. -1993.-Т. 163. -№ 4. -С. 87-105.

95. Alfano R.R., Das В.В., Cleary J., Prudente R., Celmer E.J. Light sheds light on cancer—distinguishing malignant tumors from benign tissues and tumors // Bulletin of the New York Academy of Medicine. 1991. - V.67.2. - P. 143-150.

96. Altaian A., Jochmus I., Rosl E. Intra and extracellular control mechanisms of human papillomavirus infection // Interviology. - 1994. - V.37. - P. 180-188.

97. Ballangrud A.M., Barajas O., Georgousis A., Miller G.G., Moore R.B. et.al., In vivo light transmission spectra in EMT6/Ed murine tumors and Dunning R3327 rat prostate tumors during photodynamic therapy // Lasers Surg. Med. 1997. -V.21.-P. 124-33.

98. Biade S., Sobol R.W., Wilson S.H., Matsumoto Y. Imprairment of proliferating cell nuclear antigen-dependent apurinic/apurimidinic site repair on linear DNA//J. Biol. Chem. 1998. - V.273. - P. 898-902.

99. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V.72. - P. 248-254.

100. Chen W.R., Adams R.L., Carubelli R., Nordquist R.E., Laser-photosensitizer assisted immunotherapy: a novel modality for cancer treatment // Cancer-Lett. -1997.-V.115.- P. 25-30.

101. Cheong W.F., Prahl S.A., Welch A.J. A review of the optical properties of biological tissues // IEEE Journal of Quantum Electronics. 1990. - V.26. - P. 2166-2185.

102. Chio K.S., Tappel A.L. Synthesis and characterization of the fluorescent products derived from malonaldehyde and amino acids // Biochemistry. 1969. -V.8. - P. 2827.

103. Chu E.H.Y. Effects of ultraviolet radiation on mammalian cells. I. Induction of chromosome aberrations // Mutat. Res. 1965. - V.2. - P. 75-94.

104. Clarke R.H., Isner J.M., Gauthier Т., Nakagawa K., Cerio F., Hanlon E., Gaffney E., Rouse E., and DeJesus S. Spectroscopic characterization of cardiovascular tissue // Laser Surg. Med. 1988. - V.8.1. - P. 45-59.

105. Conia J., Edwards B.S., Voelkel S., The micro-robotic laboratory: optical trapping and scission for the biologist // J.Clin.Lab.Anal. 1997. - V.l 1. - P. 28-38.

106. Cutruzzola F.W., Stetz M.L., O'Brien K.M., Gindi G.R., Laifer L.I., Garrand T.J., Deckelbaum L.I. Change in laser-induced arterial fluorescence during ablation of atherosclerotic plaque // Laser Surg. Med. 1989. - V.9. - P. 109-116.

107. Deckelbaum L.I., Stetz M.L., O'Brien K.M., Cutruzzola F.W., Gmitro A.F., Laifer L.I., Gindi GR. Fluorescence spectroscopy guidance of laser ablation of atherosclerotic plague // Laser Surg. Med. 1989. - V.93. - P.205-214.

108. Deckelbaum, LI, Desai, SP, Kim, C, and Scott, JJ. Evaluation of a fluorescence feedback system for guidance of laser angioplasty // Laser Surg. Med. 1995. - V.16.3. - P.226-234.

109. Drobetsky E.A., Truscott J., Chateauneuf, A. A role of ultraviolet A in solar mutagenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995.- V. 92. - P. 2350-2354.

110. Du M., Flanagan J.H., Lin В., Ma Y. Rapid separation and laser-induced fluorescence detection of mutated DNA by capillary electrophoresis in a self-coating, low-viscosity polymer matrix // Electrophoresis. 2003. Sep.24 (18): 3147-53.

111. Eisenbud D.A., Huang, N.F, Luke S. Skin substitutes and wound healing // Wounds. 2004. - V.16. - P.217.

112. Ernst E., Fialka V. Low-dose laser therapy: critical analysis of clinical effects // Schweiz-Med-Wochenschr. 1993. - V. 123. - P. 949-954.

113. Gaffney E.J., Clarke R.H., Lucas A.R., Isner J.M. Correlation of fluorescence emission with plaque content and intimae thickness of atherosclerotic coronary arteries // Lasers Surg. Med. 1989. - V.9. - P. 215-228.

114. Gao J.P., Lanks K.W., Rosen M., Lai B.T. Mechanism of action and spectrum of cell types susceptible to doxorubicin photo chemotherapy // Cancer Chemother. Pharmacol. 1997. - V.40. - P. 138-142.

115. Garrand T.J., Stetz M.L., O'Brien K.M., Gindi G.R., Laifer L.I., Deckelbaum L.I. Characterization of the site dependency of normal canine arterial fluorescence. // Lasers Surg. Med. 1990. - V.10.4. - P. 375-383.

116. Gasparo F.P. Sunscreen, skin photobiology, and skin cancer: the need for UVA protection and evaluation of efficacy // J. Natl. Inst. Env. Health Sci. 2000. - V. 108.-P. 71-81.

117. Gates F.L. On nuclear derivatives and the lethal action of ultraviolet light // Science. 1928. - V.68. - P. 259-275.

118. Gerber W., Arheilger В., Ha T.A. Ultraviolet В 308-nm eximer laser treatment of psoriasis: a new phototherapeutic approach // British J of Dermatol. -2003.-V. 149.-P. 1250-1258.

119. Geschwind H.J., Aptecar E., Boussignac G., Dubois-Rande J.L., Zelinsky R., Poirot G., and Tomaru T. Results and follow-up after percutaneous pulsed laser-assisted balloon angioplasty guided by spectroscopy // Circulation. 1991. -V.83.3. - P. 787-796.

120. Ghadially F.N., Neish W.J.P., Dawkins H.C. Mechanisms involved in the production of red fluorescence of human and experimental tumors // J. of pathology and bacteriology. 1963. - V. 85. - P. 77-92.

121. Ghadially, F.N. Red fluorescence of experimentally induced and human tumors // J. of pathology and bacteriology. 1960. - V.80. - P. 345-361.

122. Greco M., Guida G., Perlino E. Increase in RNA and protein synthesis by mitochondria irradiated with helium-neon laser // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 163. - № 3. - P. 1428-1434.

123. Grossman N., Schneid N., Reuveni H., Halevy S., Lubart R., 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species // Lasers Surg. Med. 1998. - V.22. - P. 212-218.

124. Gruijl F.R. Health effects from solar UV radiation // Radiat. Prot. Dosim.-1997.-V.72.-P. 177-196.

125. Hargreaves A., Taivo F.A., Duggan O., Kirk S.N., Ahmad S.I. Near-ultraviolet photolysis of phenylpyruvic acid generates free radicals and results in DNA damage. // Journal of Photochemistry and Photobiology. - 2007. - V. 54. -P. 378-384.

126. Harris DM, Werkhaven J. Endogenous porphyrin fluorescence in tumors // Lasers Surg. Med. 1987. - V.7.6. - P. 467-472.

127. Hashieh I.A., Tardieu C., Franquin J.C., Helium-neon laser irradiation is not a stressful treatment: a study on heat-shock protein (HSP70) level // Lasers Surg.Med. 1997. - V.20. - P. 451-460.

128. Hendrich C., Huttmann G., Lehnert C., Diddens H., Siebert W.E. Photodynamic therapy for rheumatoid arthritis. Cell culture studies and animal experiments // Knee Surg. Sports traumatol Arthrosc. 1997. - V.5. - P. 58-63.

129. Hillenkampf F. Lasers effects on biologic systems // Proc. of the NATO Symp. on lasers in biol. and medicine. New York, 1980. - P. 37-68.

130. Ichihashi M., Ueda M., Budiyanto A., Bito Т., Oka M., Fukunaga M., Tsuru K., Horikawa Т., UV-induced skin damage // Toxicology. 2003. - V. 189. - P. 21-39.

131. Ito K., Inoue S., Yamamoto K., Kawanishi S. 8-Hydroxydeoxyguanosine formation at the 5' site of 5-GG-3' sequences in double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 13221-13227.

132. Jahn R., Dressel M., Neu W., Jungbluth K.H. Ablation of hard biological tissue with the excimer laser // Unfallchirurgie. 1992. - V.18. - P. 261-265.

133. Kawanishi S., Hiraku Y. Sequence-specific DNA damage induced by UVA radiation in the presence of endogenous and exogenous photosensitizers // Current Probl. Dermatol. 2001. - V. 29. - P. 74-82.

134. Khodareva S.N., Lavrik O.I. Photoaffmity labeling technique for studying DNA replication and DNA repair // Curr. Med. Chem. 2005. - V. 12. - P. 641655.

135. Kochevar I.E. Cytotoxicity and mutagenicity of excimer laser radiation // Lasers Surg. Med. 1989 - V.9. - P. 440-445.

136. Koebner K. Lasers. Lasers in medicine. Chichester. Willey, 1980. - 289 p.

137. Koenig F., Larne R., Enquist H., McGovern F.J., Schomacker K.T., Kollias N., Deutsch T.F. Spectroscopic measurement of diffuse reflectance for enhanced detection of bladder carcinoma // Urology. 1998. - V.51.2. - P.342-345.

138. Koenig F., McGovern F.J., Althausen A.F., Deutsch T.F., Schomacker K.T. Laser induced autofluorescence diagnosis of bladder cancer // J. of Urology. -1996.-V.156.-P. 1597-1601.

139. Kubo Y., Urano Y., Matsumoto K., Ahsan K., Arase S. Mutations of the INK4a locus in squamous cell carcinomas of human skin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 232. - P. 38-41.

140. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophaage T 4 //Nature. 1970. - V. 277. - P. 680-685.

141. Larionov P.M., Malov A.N., Maslov N.A., Orishich A.M. The effect of UV radiation dose on biological tissues' laser-induced fluorescence spectra // Optical Technologies in Biophysics and Medicine. Saratov, 2004. V. 5474. - P. 385-388.

142. Larko O., Swanbeck G. Is UVB treatment of psoriasis safe? A study of extensively UVB-treated psoriasis patients compared with a matched control group // Acta Dermatovenerol. 1982. - V. 62. - P. 507-512.

143. Laube S., George S.A. Adverse effects with PUVA and UVB phototherapy // J. Dermatol.-2001.-V. 12.-P. 101-105.

144. Lavker R.M., Gerberick G.F., Veres D., Irwin С .J., Kaidbey K.H. Cumulative effects from repeated exposures to suberythemal doses of UVB and UVA in human skin // J. Am. Acad. Dermatol. 2000. - V. 32. - P. 53-62.

145. Lin YW, Chiu TC, Chang HT. Laser-induced fluorescence technique for DNA and proteins separated by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. Analyt. Technol. Biomed Life Sci. 2003. - V.793(l). - P. 37-48.

146. Lowe, N.J. An overview of ultraviolet radiation, sunscreen, and photoinduced dermatosis // Dermatol. Clin. 2006. - V. 24. - P. 9-17.

147. Luftl M., Rocken M., Plewig G., Degitz K. PUVA inhibits DNA replication, but not gene transcription at nonlethal dosages // J. Invest. Dermatol. 1998. — V. 111.-P. 399-405.

148. Majumder SK, Ghosh N, Kataria S, Gupta PK. Nonlinear pattern recognition for laser-induced fluorescence diagnosis of cancer // Lasers Surg Med. 2003. -V.33(l).-P. 48-56.

149. Malov A.N., Maslov N.A., Orishich A.M. LIF excited by excimer KrF and XeCl lasers for the study of biological tissues // Intern. Conf. on Methods of Aerophys. Research: Proc. Pat 3. Novosibirsk, 1996. - P. 201-205.

150. Marshall J. et al. Photoablative reprofiling of the cornea using an excimer laser photorefractive keratotomy. // Lasers Ophthalmol. 1986. - V.l. - P. 21.

151. Matsumura Y. Toxic effects of ultraviolet radiashion oon the skin. // Toxicology and Applied Pharmacology. 2004. - V. 195. - P. 2998-3008.

152. McAuliffe D.J., Lee S., Flotte T.J., Doukas A.G. Stress-wave-assisted transport through the plasma membrane in vitro // Lasers Surg. Med. 1997. V.20. -P. 216-222.

153. Meffert H., Metz D., SonnicheenN. // Dermatol. Monatsschr. 1978. - V.l64. -P. 567.

154. Mitchell D., Revisiting the photochemistry of solar UVA in human skin // Proc. Natl. Acad. Sci. 2006. - V. 103.- P. 13567-13568.

155. Moore D.E., Wang J. Electron transfer mechanisms in photosensitization by the anti-inflammatory drug benzydiamine // J. Photochem. Photobiol. 1998. -V. 43.-P. 175-180.

156. Morguet A. J., B. Korber, H. Hippler, V. Wiegand, H. Kreuzer, Autofluorescence spectroscopy using a XeCl excimer laser system for simultaneous plaque ablation and fluorescence excitation // Lasers Surg. Med. -1994.-V.14.-P.-238-248.

157. Morison W.L. In vivo effects of psoralens plus longwave ultraviolet radiation on immunity // Natl. Cancer Inst. Monogr. 1984. - V. 66. - P. 243-246.

158. Nishigori C. Cellular aspects of photocarcinogenesis // Photochem. Photobiol. Sci. -2006. P. 208-214.

159. Nishigori C., Yarosh D.B., Ullrich S.E., Vink A.A., Bucana C.D., Roza L., Kripke M.L. Evidence that DNA damage triggers interleukin 10 cytokine production in UV-irradiated murine keratinocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. - V. 93. - P. 10354-10359.

160. Nossik D., Kaplina E., Nossik N. et al. Antiviral and immunomodulating activity of the drug on base of natural DNA // Abstracts of the VIII International Congress on Immunoreabilitation. Cannes. France. 2002. - P. 31.

161. Oraevsky A.A., Jacques S.L., Pettit G.H., Tittel F.K., Henry P.D. XeCl laser ablation of atherosclerotic aorta: luminescence spectroscopy of ablation products // Lasers Surg. Med. 1993. - V.13.2. - P. 168-178.

162. Oraevsky, AA, Jacques, SL, Pettit, GH, Sauerbrey, RA, Tittel, FK, Nguy, JH, and Henry, PD. XeCl laser-induced fluorescence of atherosclerotic arteries.

163. Spectral similarities between lipid-rich lesions and peroxidized lipoproteins // Circulation Research. 1993. - V.72.1. - P. 84-90.

164. Overholt B.F., Panjehpour M., Haydek J.M. Photodynamic therapy for Barretts esophagus follow-up in 100 patients // Gastrointest Endosc. 1999. - V.49.- P. 1-7.

165. Ozawa M., Ferenczi K., Kikuchi Т., Cardinale I., Austin L.M., Coven T.R., Burack L.H., Krueger J.G. 312-nanometer ultraviolet В light (narrow-band UVB) induces apoptosis of T cells within psoriatic lesions // J. Exp. Med. 1999. - V. 189.-P. 711-718.

166. Ozawa Y., Shimizu N., Abiko Y. Low-energy diode laser irradiation reduced plasminogen activator activity in human periodontal ligament cells // Lasers Surg. Med. 1997. - V.21. - P. 456-463.

167. Papazoglou T.G., Papaioannou Т., Arakawa K., Fishbein M., Marmarelis V.Z., Grundgest W.S. Control of excimer laser aided tissue ablation via laser-induced fluorescence monitoring // Applied Optics. 1990. - V.29.33. - P. 49504955.

168. Peak M.J., Peak J.G. Use of action spectra for identifying molecular targets and mechanisms of action of solar ultraviolet light // Physiol. Plant. 1983. - V.58.- P. 367-372.

169. Perk M., Flynn G.J., Smith С et al. Laser-indused fluorescence emission. I. The spectroscopic identification of fibrotic endocardium and myocardium // Laser Surg, and Med. 1991. - V.l 1. - P. 523-534.

170. Perk M., Flynn G.J., Smith C., Bathgate В., Tulip J., Yue W., and Lucas A. Laser-induced fluorescence emission: I. The spectroscopic identification of fibrotic endocardium and myocardium // Lasers Surg. Med. 1991. - V.l 1.6. - P. 523-534.

171. Pflaum M., Boiteux S., Ере B. Visible light generates oxidative DNA base modifications in high excess of strand breaks in mammalian cells // Carcinogenesis. 1994. -V. 15. - P. 297-300.

172. Pogrel М.А., Chen J.W., Zhang К., Effects of low-energy gallium-aluminum-arsenide laser irradiation on cultured fibroblasts and keratinocytes // Lasers Surg. Med. 1997. - V.20. - P. 426-432.

173. Poque B.W., Pitts J.D., Mycer M.A. et. al. In vivo NADH monitoring as an assay for cellular damage in photodynamic therapy // Photochem. and Photobiol. -2001.-V.74.-P.817-824.

174. Pullmann H. A study of cellular inflammatory reaction in human malignant melanoma, using in vitro-labeling techniques with3H. // Z. Hautkr. 1984. - V.59. - P. 285-289.

175. Richards-Kortum R., Sevick-Muraca E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis // Ann. Rev. Phys. Chem. 1996. - V.47. - P. 555-606.

176. Rogatkin D.A., Polyakov P.Yu., Bychenkov O.A., Stepanenko E. Noninvasive fluorescent diagnostics in radiotherapy of mucosal oral tumors // Proc. SPIE, vol. 4707, 2002. P. 236-243.

177. Santamaria A.B., Davis D.W., Nghiem D.X., McConkey D.J. p53 and Fas Ligand are required for psoralen and UVA -induced apoptosis in mouse epidermal cells // Cells Death Differ. 2002. - V. 5. - P. 549-560.

178. Schomcker K.T., Frisoli J.K., Compton C.C., Flotte T.J., Richter J.M., Nishioka N.S., Deutsch T.F. Ultraviolet laser-induced fluorescence of colonictissue: basic biology and diagnostic potential 11 Laser Surg. Med. 1992. - V.12. -P. 63-78.

179. Shannon Danes B. The humble fibroblast a curiosity or a cell model for human genetic research // Clin. Genet. - 1985. - V.28. - № 6. - P. 563-566.

180. Spencer J.M., Hadi S.M. He excimer lasers // J. Drugs Dermatol. 2004. - V. 16.-P. 522—525.

181. Stingl G. Antigen presentation by murine epidermal Langerhans cells and its alteration by ultraviolet В light. // Hautarzt. 1984. - V.35. - P. 121.

182. Taiwo F.A., Brophy P.M., Pritchard D.I., Brown A., Wardlaw A.W., Patterson L.H., Cu/Zn superoxide dismutase in excretory-secretory products of the human hookworm Necator americanus // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 18. - P. 434-438.

183. Wagnieres G.A., Star W.M., Wilson B.C. In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological applications // Photochem. and Photobiol. 1998.-V.68. - P. 603-632.

184. Yamamoto Y., Kono Т., Kotani H., Kasai S., Mito M., Effect of low-power laser irradiation on procollagen synthesis in human fibroblasts // J. Clin. Laser Med. Surg. 1996. - V.14. - P. 129-132.

185. Zagdi M., Smid L., Fajdiga I., Bubnic В., Lenarcic J., Oblak P. Laser induced fluorescence in diagnostics of laringeal cancer // Acta Otolaryngoll Suppl. (Stokh). 1997. - V.527. - P.125-127.

186. Zolzer F., Kiefer J. Wave-length dependence inactivation and mutation induction to 6-thioguanine-resistance in V-79 Chinese hamster fibroblasts // Photochem. and Photobiol. 1984. - V.40. - P. 49-53.

187. Zonios G., Cothren R., Crawford J.M., Fitzmaurice M., Manoharan R., Van Dam J., Feld M.S. Spectral pathology // Annals of the New York Academy of Sciences. 1998. - V.838. - P. 108-115.

188. Федеральное государственное учреждениеf3630055, г. Новосибирск, ул. Речкуновская, 15 • шмпейаПшш1. ПРИЕМНАЯ ДИРЕКТОРА:

189. ОТДЕЛ ПО РАБОТЕ С ПАЦИЕНТАМИ:1. ПРЕСС-ГРУППА:тел. (383) 332 47 58, факс (383) 332 24 37 тел. (383) 332 76 74, факс (383) 332 26 51 тел. (383) 332 39 56, факс (383) 332 74 85 ma'l-gmeslialkinclinic ru media@nneshalkinclinic.ru

190. Сущность внедрения. На основе полученных новых знаний обоснована целесообразность и эффективность использования метода лазерно-индуцированной флуоресценции для оценки состояния тканей сердца для целей трансплантации.

191. Необходимость внедрения определяется потребностью в совершенствовании технологий направленных на оценку качества тканей сердца, пригодного для трансплантации, а также для изучения состояния сердечного трансплантата в послеоперационный период.

192. Преимущество внедрения заключается в том, что оно позволяет произвести точную, быструю, неинвазивную диагностику состояния донорского сердца при минимальной лучевой нагрузке.

193. Эффект от внедрения. Результаты диссертационной работы позволяют апробировать метод лазерно-индуцированной флуоресценции для контроля состояния органов трансплантатов.

194. Председатель: Член комиссии:

195. Чернявский A.M. Ларионов П.М.

196. Ответственный исполнитель:1. Субботин Д.В.

197. УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

198. ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ПРИКЛАДНОЙ МЕХАНИКИ им. С.А. ХРИСТИАНОВИЧА

199. СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН (ИТПМ СО РАН)ул. Институтская, 4/1, г. Новосибирск, 630090 Для телеграмм: Новосибирск-90, Звук Факс (383) 330-72-68 Телефон (383) 330-42-68 E-mail: admin@itain.nsc.ru

200. ОКПО 03533783, ОГРН 1025403641900 ИНН/КПП 5408100018/540801001153131. На -\qот1. УТВЕРЖДАЮ»

201. ПРЕДСЕДАТЕЛЬ КОМИССИИ: зам. директора по науке, профессор, д.ф.-м.н. ЧЛЕНЫ КОМИССИИ:.1. К.Т.Нк.ф.-м.н1. Оришич А.М.jy^O^ft Малов А.Н.1. Маслов Н.А.1. УТВЕРЖДАЮ

202. Зав. кафедрой экологии, д.б.н., профессор Члены комиссии:1. Н.Г. Никифоровад.м.н., доцент кафедры экологии к.м.н., доцент кафедры экологии

Информация о работе

Фатюхина, Ольга Евгеньевна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Оценка безопасности и эффективности применения метода лазерно-индуцированной флуоресценции для диагностики состояния тканей и культур клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы