Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности морфофункционального становления генеративной функции семенников у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимального генеза

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Особенности морфофункционального становления генеративной функции семенников у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимального генеза"

На правах рукописи

Ласьков Дмитрий Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ СТАНОВЛЕНИЯ ГЕНЕРАТИВНОЙ ФУНКЦИИ СЕМЕННИКОВ У ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ХРОНИЧЕСКИМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ АЛКОГОЛЬНОГО И МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ГЕНЕЗА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 АВГ 2014

Оренбург-2014

005551698

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет» Минобрнауки Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор»

Брюхин Геннадий Васильевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Янин Владимир Леонидович

заведующий кафедрой гистологии, цитологии, эмбриологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессиошшьного образования «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации;

кандидат биологических наук, Блинова Елена Владиславовна доцент кафедры гистологии, цитологии, эмбриологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессиошшьного образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Защита диссертации состоится «18» сентября 2014 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.04 Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессиошшьного образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 460000, Россия, г. Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России, пр. Парковый д. 7 и на сайте www.orgma.ru

Автореферат разослан «_»_2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Шевлюк

у Николай Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Общепризнанной на сегодняшний момент является определяющая роль материнского здоровья в воспроизводстве полноценного потомства, а также снижении перинатальной заболеваемости и ранней смертности, что является одним из необходимых условий для выхода из демографического кризиса. Демографические проблемы, находясь в одном ряду с экономическими и социальными, а иногда и сливаясь или тесно переплетаясь с ними, входят в число общепризнанных, определяющих общий социально-политический климат в стране (Вишневский А.Г. и др., 2003).

Важной составляющей демографических процессов являются репродуктивные проблемы в браке, включающие бесплодие, невынашивание беременности и перинатальную патологию (Артифексова A.A., 1999). Согласно данным литературы, в настоящее время наблюдается неуклонное снижение здоровья женщин репродуктивного возраста (Кислицына O.A., 2011). Особое место в структуре экстрагенитальной патологии при этом занимают болезни гепатобилиарной системы: холангиты, холециститы, гепатиты, желчнокаменная болезнь, дискинезии желчевыводящих путей, рост которых отмечается повсеместно (Подымова С.Д., 2004; Шехтман М.М., 2005; Апресян C.B., 2009).

Всё вышеперечисленное определило устойчивый интерес к изучению влияния экстрагенитальных заболеваний женщин на здоровье их потомства, особенно репродуктивное. В связи с этим целью настоящего исследованя явился анализ морфофункционального становления генеративной и эндокринной функции семенников у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимального генеза в различные сроки постнатального развития.

Цель исследования обусловила постановку следующих задач:

1. Изучить особенности сперматогенеза у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимхльного генеза: количество сперматогенных клеток семенных извитых канальцев, содержание эпидидимальных сперматозоидов, их жизнеспособность и наличие патологических форм.

2. Оценить эндокринный компартмент семенников у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольной и мезенхимальной природы: суммарное содержание клеток Лейдига, их субпопуляционный состав и концентрацию тестостерона в сыворотке крови.

3. Исследовать влияние иммобилизационного стресса на состояние генеративного и эндокринного аппарата семенников потомства самок крыс с поражением гепатобилиарной системы алкогольного и мезенхимального генеза.

4. Изучить показатели фертильности потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы алкогольного и мезенхимального генеза.

Научная новизна.

На адекватных экспериментальных моделях, воспроизводящих различные формы поражения печени материнского организма, установлены общие закономерности морфофункционалыюго становления генеративного и эндокринного аппарата семенников у потомства. Выявлено нарушение морфофункцнональных характеристик эпидидимальных сперматозоидов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени мезенхимального и алкогольного генеза: изменение количественного состава, уменьшение подвижности и жизнеспособности, а также их осмотической и кислотной резистентности. Показано, что эндокринный и генеративный компартменты семенников потомства самок крыс с патологией гепатобилиарной системы характеризуются сниженной резистентностью к стрессовым воздействиям. Установлено, что у самок крыс с экспериментальным поражением печени рождается потомство со сниженной фертильностью.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Проведенное исследование носит фундаментальный характер. Его результаты углубляют и расширяют знания о механизмах, лежащих в основе нарушения репродуктивной функции потомства, рожденного от матгрей с хроническим поражением печени. Полученные результаты содержат новые сведения о влиянии патологии гепатобилиарной системы матери алкогольного и мезенхимального генеза на сперматогенез, эндокринный аппарат семенников и на фертильность потомства.

Полученные в ходе исследования результаты могут быть использованы при обосновании выделения детей, рожденных от матерей с патологией гепатобилиарной системы алкогольной и мезенхимальной этиологии, в группу риска в связи с возможностью развития нарушений репродуктивной системы, в том числе бесплодия.

Результаты исследования используются в научно-исследовательской деятельности и в учебном процессе курса гистологии, цитологии и эмбриологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет» в дисциплинах: «Биология размножения и развития» (бакалавриат и специалитет), «Гистофизиология репродуктивной системы» (магистратура).

Положения выносимые на защиту:

1. Экспериментальная патология гепатобилиарной системы алкогольного и мезенхимального генеза матери вызывает нарушение процессов сперматогенеза у потомства, проявляющееся в изменении числа сперматогенных клеток, снижении жизнеспособности сперматозоидов и увеличении содержания их патологических форм.

2. Патология гепатобилиарной системы у матери алкогольной и мезенхимальной природы в условиях эксперимента вызывает изменения эндокринного компартмента семенников у потомства, что находит своё проявление в уменьшении числа клеток Лейдига и снижении концентрации тестостерона в сыворотке крови.

3. Экстрагенитальная патология в виде хронического мезенхимального и алкогольного поражения гепатобшшарной системы матери обусловливает у потомства задержку наступления беременности и нарушение фертильности.

Апробация материалов работы.

Материалы конференции были представлены на III эмбриологическом симпозиуме Всеросийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011 Закономерности эмбриофетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийск, 2011); на XI международном конгрессе международной ассоциации морфологов (Самара, 2012); на III международной, (X итоговой) научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2012); на второй всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологические механизмы адаптации и экология человека» (Тюмень, 2012); на IV международной научно-практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2012); на II всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); на всероссийской молодежной конференции «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2013); на IV международной, (XI итоговой) научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2013); на международной конференции «Реформування та розвиток науки: сучасшвиклики» (Киев, 2013); на международной научно-практической конференции «Наука, образование, общество: тенденции и перспективы» (Москва, 2013); на IV международной научно-практической конференции «Приоритетные научные направления: от теории к практике» (Новосибирск, 2013); на всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных процессов», посвященной памяти чл.-кор. АМН СССР профессора Ф. М. Лазаренко (Оренбург, 2013).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации: Основное содержание работы изложено на 199 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 409 источников, в том числе 243 работы зарубежных авторов. Диссертация содержит 12 таблиц, 56 рисунков, из которых 23 микрофотографии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на белых лабораторных крысах «Вистар» (75 взрослых половозрелых самок) и их потомстве (235 крысят из 75 пометов). Сроки исследования соответствуют общепризнанному подразделению возрастных периодов у данной группы животных (Западнюк И.П. с соавт., 1983).

Исходя из поставленных задач, экспериментальные животные были разделены на 3 группы. Первую группу составили животные от интактных родителей (контрольная группа) - 85 животных из 28 пометов. Во вторую

группу вошли животные от матерей с алкогольным поражением печени (опытная фуппа № 1) - 74 самца из 24 пометов. В третью группу вошли животные от самок с мезенхимальным поражением печени (опытная группа № 2) - 76 животных из 23 пометов. Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в эксперименте и для других научных целей (.№> 123 1986 г.).

Моделирование алкогольного поражения печени у экспериментальных животных. Алкогольное поражение печени моделировалось путем замены питьевой воды взрослым половозрелым самкам на 15% раствор этилового спирта в течение трех месяцев, при этом питьевую воду животные не получали (Буров Ю.В., 1986).

Модель мезенхималыюго поражения печени экспериментальных животных. Для создания мезенхимального (гранулематозного) поражения печени у крыс была использована щелочная фосфатаза из бычьей сыворотки («S igma -Р5521 », США). Половозрелым самкам крыс до беременности однократно внутривенно вводили 0,1 мл раствора данного препарата в физиологическом растворе, содержащий дозу 20 ЕД активности (Маянский Д.Н. с соавт., 1990).

Экспериментальная модель «мобилизационного стресса. Для оценки адаптационных резервов репродуктивной системы использовали нагрузку в форме иммобилизационного стресса. Для этого помещали 70-дневных крысят в камеру Когана, где животные находились в положении лежа на спине (Лобанова H.H. с соавт., 1986). Первоначально иммобилизация продолжалась с 10.00 до 15.00 часов. Затем, после двухчасового отдыха животные вновь помещались в камеру на ночь. После отдыха животные в 17.00 часов снова подвергались иммобилизации до утра.

Морфологические методы исследования семенника. Отпрепарованные

семенники после взвешивания фиксирован! в жидкости Буэна, дальнейшее уплотнение материала производилось через заливку в парафин. Гистологические срезы толщиной 4-5 мкм, изготовленные на санном микротоме, окрашивались гематоксилином и эозином (Саркисов Д.С. и Петров ЮЛ., 1996).

Морфометрические методы исследования семенника. Оценку генеративной функции семенника производили с использованием следующих морфометрических показателей: оценки площади поперечного сечения извитых семенных канальцев, индекса сперматогенеза, цитологического профиля сперматогенеза, количества сус тентоцитов, клеточного индекса Сертоли. Также производился подсчёт количества канальцев со слущенным эпителием и количества гигантских сперматогенных клеток. Оценка площади семенных извитых канальцев производилась с помощью автоматизированной системы захвата и обработки изображения Motic ВА 400 с программным обеспечением Видео-Тест Морфометрия v.5.0. Измерения проводили в 50 поперечных срезах семенных извитых канальцев.

Индекс сперматогенеза определяли как отношение суммы слоев сперматогенных клеток в подсчитанных канальцах к числу канальцев.

Для анализа цитологического профиля сперматогенеза нами производился подсчёт суммарного количества сперматогенных клеток в 30 поперечных срезах семенных извитых канальцев, а также подсчёт отдельных видов сперматогенных клеток: сперматогоний различной степени зрелости (А, П, Б), а также их суммарного количества, первичных и вторичных сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов (Бурнашева С.А. с соавт., 1982).

Для оценки популяции клеток Лейдига производился подсчет как суммарного количества данных клеток в 30 полях зрения, в том числе активных и неактивных интерстициальных эндокриноцитов из расчета на 1 семенной извитой каналец. Индекс активности клеток Лейдига вычислялся, как отношение активных и неактивных эндокриноцитов.

Оценка жизнеспособности еперматозоидов.Зрелые сперматозоиды получали из придатка семенника, изготавливая из него гомогенат 5% раствора глюкозы (в объеме 1 мл), предварительно подогретой до температуры 37° С. Затем в камере Горяева производился подсчет сперматозоидов с учетом характера их подвижности в течение первого часа через каждые 15 минут, а затем через 30 минут до 240 минуты включительно. Оценка подвижности проводилась по общепринятой методике 4-х бальной оценки сперматозоидов по характеру подвижности (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 1999).

Определение кислотной резистентности сперматозоидов проводили в чашке Петри, в которую помещали 1,5 мл суспензии. Затем по каплям прибавляли 0,1 N раствор соляной кислоты до полной остановки движения сперматозоидов, которая наблюдалась под микроскопом. При этом регистрировали реакцию рН (с помощью рН-метра с микроэлектродом) (Саноцкий MB. и др., 1978). Для определения осмотической резистентности сперматозоидов изготавливалась шкала растворов хлорида натрия от 1,5 до 3,75% с интервалом 0,25% (штатив с пробирками). На предметные стекла с лунками помещали по 0,05 мл суспензии и вносили поочередно из каждой пробирки равное количество раствора, устанавливая концентрацию, при которой под микроскопом наблюдается полная остановка сперматозоидов (Саноцкий И.В. с соавт., 1978).

Для оценки патологических форм изготавливали мазки гомогената придатков семенников, окрашенных 1%-ым раствором эозина (Kuriyama К., et al., 2004).

Биологические методы. Производили взвешивание животных на механических весах. После декапитации животных выделяли мужские половые железы, после чего определяли массу левого семенника на торсионных весах и весовой индекс. Кроме того, исходя из цели настоящего исследования, оценивались физиологическая зрелость и фертильность животных: процент наступления беременности, число крысят в помете, в том числе мертворожденных.

Статистические методы исследования. При обработке полученных результатов использовались методы вариационной статистики. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программного обеспечения: Microsoft Excel 2007, SPSS 17.0, PAST 3.01. При статистической обработке определялись среднее и 95% доверительный интервал. Для оценки достоверноти исследования использовались непараметрические методы (коэффициент Манна-Уитни) (Реброва О.Ю., 2002). Для оценки сочетанного действия патологии печени матери и иммобилизационного стресса применялся двухфакторный дисперсионный анализ, что позволило выявить не только различие между группами, но и выявить значимые взаимодействия между данными факторами. Проверка распределений на нормальность проводилась с помощью критерия Колмагорова-Смирнова (Холлендер М. и Вульф Д., 1983). Проверка распределений на однородность дисперсий производилась с помощью критерия Левене (Levene П., 1960) Нормализацию данных, производили с помощью преобразования Бокса-Кокса (Sakia R.M., 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одним из чувствительных показателей, отражающих морфофункциональное состояния органа, является его весовой индекс, представляющий собой отношение массы органа к массе тела, выраженное в процентах (Мина М.В., Клевезаль Г.А., 1976). Установлено, что данный показатель у экспериментальных животных постепенно увеличивается с периода новорожденности и достигает максимального значения к 70-му дню жизни (рис. 1).

1,2 I

0,8 0,6 0,4 02 0

m.....Ml

il

Е Контроль ООпыт I О Опыт 2

Рис. 1. Весовой индекс семенников экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Обращает на себя внимание тог факт; что на начальных сроках постнатального онтогенеза исследуемый показатель у подопытных животных практически не отличается от такового у ингактаых самцов. Однако, начиная с периода полового созревания, наблюдается его снижение по сравнению с интактными животными.

Оценка сперматогенного эпителия экспериментальных животных.

Установлено, что площадь извитых семенных канальцев у крыс увеличиваются в процессе роста организма животного и достигает максимального значения к периоду половой зрелости (рис. 2). Как видно из рисунка, у крысят 1 опытной группы исследуемый показатель превышает на большинстве сроков исследования, а у животных 2 опытной группы, напротив, снижен по сравнению с интактными животными. В период половой зрелости у подопытных крысят обеих групп площадь канальцев достоверно снижена по сравнению с контролем.

50000 45000 40000 35000 30000 МКМ2 25000 20000 15000 10000 5000 0

Рис. 2. Площадь семенных извитых канальцев экспериментальных животных. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

У экспериментальных животных в извитых семенных канальцах наблюдается постепенное увеличение содержания сперматогенных клеток в процессе постнатального развития (рис. 3). На большинстве сроков исследования исследуемый показатель снижен по сравнению с контролем. При этом у 70-дневных подопытных крысят алкогольной группы суммарное количество сперматогенных клеток превышает, а у крысят мезенхимальной группы, снижено.

■ Контроль ИОпыт 1 □ Опыт 2

400 350 300 250 200 150 100 50 0

■ Контроль

□ Опыт 1

□ Опыт 2

Рис. 3. Суммарное количество сперматогенных клеток в семенных

извитых канальцах экспериментальных животных. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

При этом суммарное количество сперматогоний постепенно возрастает в течение постнатального развития у животных всех экспериментальных групп (табл. 1).У 15-и и 30-дневных самцов обеих подопытных групп, а также у животных второй опытной группы на 45-й день, наблюдается снижение данного показателя по сравнению с контролем. При этом количество незрелых сперматогоний типа А у подопытных животных снижено по сравнению с контролем (рис. 4). Исключение составили крысята 1 опытной группы, у которых в период половой зрелости исследуемый показатель существенно превысил таковой в контроле.

Таблица 1.

Суммарное содержание сперматогоний в семенных извитых канальцах.

Возраст Контрольная группа Опытная группа 1 Опытная группа 2

15 23,93 (23,28-24,58) 20,15 (19,63-20,67) 19,44 (17,38-21,50)

30 31,36 (30,04-32,68) 28,36* (27,04-29,68) 24,95* (21,34-28,56)

45 40,75 (39,62-41,88) 36,62 (26,67-40,40) 30,45* (26,67-34,23)

70 54,91 (50,66-59,16) 65,97 (56,82-75,12) 53,43 (46,80-60,06)

* - результаты статистически достоверны (р<0,05)

40 35 30 25 20 15 10

-г *

* Ш-г *

* * э 111

О Контроль П Опыт I □ Опыт 2

Рис. 4. Количество сперматогоний А в семенных извитых канальцах. * - результаты статистически достоверны (р<0.05)

Изучение количества зрелых сперматогоний (тип В) позволило установил,, что их количество у ингактных животных постепенно увеличивается в ходе постнапшьного онтогенеза. Исследуемый показатель оказался снижен у подопытных животных на большинстве сроков исследования. Исключение составили только половозрелые самцы опытной группы 1. у которых он был, напротив, существенно повышен.

ГО

45 70

Рис. 5. Количество сперматогоний В в семенных извитых канальцах. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

У животных всех экспериментальных групп количество спермаггоцитов возрастает и достигает максимального значения в период половой зрелости. При этом на большинстве сроков исследования данный показатель снижен у подопытных животных.

250

■ Контроль

__О Опыт I

100 _.„

ООпыт 2

О 15 30 45 70

Рис. 6. Количество сперматоцитов в семенных извитых канальцах экспериментальных животных. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Анализ суммарного количества сперматид позволил установить, что данные клетки впервые появляются на 15-ый день и их количество остаётся незначительным у животных всех экспериментальных групп вплоть до наступления периода половой зрелости.

У 70-дневневных крысят опытной группы 1 количество сперматид резко возрастает до уровня41,17 (95% ДИ: 36,57-45,77) существенно превышающего контрольные значения - 16,46 (95% ДИ: 14,11-18,81). При этом у животных опытной группы 2 сперматиды в это время обнаруживаются в небольшом количестве, составив 1,38 (95% ДИ: 0,83-1,93).

Сперматозоиды у животных всех экспериментальных групп впервые обнаруживаются на 45-ыйдень постнатальной жизни (табл. 2).

и

Таблица 2.

Суммарное содержание сперматозоидов в семенных извитых

Возраст Контрольная группа Опытная группа 1 Опытная группа 2

45 1,01 (0,88-1,14) 0,66 (0,59-0,73)*

70 9,94 (8,25-11,63) 36,47 (30,29-42,65)* 1,67 (0,54-2,80)*

* - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Как видно из таблицы 2, количество сперматозоидов у животных опытной группы 1 снижено на 45-е сутки постнатального развития и повышено на 70-е. У животных опытной группы 2 небольшое количество сперматозоидов появляется только в период половой зрелости.

Повышенное количество канальцев со слущенным эпителием является важным признаком нарушения сперматогенного эпителия (Г'ольдберг Е.Гс соавт., 1995). Установлено, что у крысят обеих опытных групп количество канальцев со слущенным эпителием превышает данный показатель в контроле на всех сроках исследования (рис. 8).

Увеличение числа канальцев со слущиванием эпителия косвенно указывает на поражение сустентоцитов, а также межклеточных контактов, без которых не создается микросреда, необходимая для дифференцировки половых клеток (Тирси К.А. с соавт., 2000).

45 40 35 30 23 20 15 10 5 0

ь

I

¿1

А

■ Контроль О Опыт 1 О Опыт 2

Рис. 8. Количество канальцев со слущенным эпителием. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Гигантские сперматогенные клетки представляют собой дегенеративные формы сперматогенных клеток, подвергающихся апоптозу (РоПегУ. е1а1., 1993).На большинстве сроков исследования количество гигантских клеток в семенных извитых канальцах подопытных крысят опытной группы 1 превышает, а у животных опытной группы 2 снижено по сравнению с контролем (рис. 9).

О 15 30

Рис. 9. Количество гигантских сперматогенных клеток в извитых канальцах.

* - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Важнейшим количественным показателем, характеризующим генеративную активность семенника, является индекс сперматогенеза (Саяпина И.Ю.,2013).

■ Контроль И Опыт 1 О Опыт 2

Рис. 10. Индекс сперматогенеза экспериментальных животных. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Установлено снижение индекса сперматогенеза на 15-е и 30-е сутки постнатального развития у животных опытной группы 1 и на всех сроках развития у животных опытной группы 2 (рис. 10). Снижение содержания данных клеток у животных опытной группы 2, очевидно, связано с низким суммарным содержанием сперматид.

Сустентоциты играют ключевую роль в процессах развития и функционирования яичек, поскольку именно они играют роль специфического микроокружения для развивающихся половых клеток (Shape R.M. et al., 2003).

У подопытных крысят количество ядер сустентоцитов в семенных извитых канальцах после рождения постепенно увеличивается и достигает максимальных значений в период половой зрелости. При этом на большинстве сроков исследований данный показатель у подопытных крысят снижен (рис. 11).

Рис. 11. Количество ядер сустентоцитов в семенных извитых канальцах. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Таким образом, у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимального генеза отмечаются изменения в структуре сперматогенного пласта, как адаптивного, так и, в большей степени, негативного характера, что отражает нарушение процессов сперматогенеза.

Характеристика эндокринного компартмента. Известно что синтезируемый клетками Лейдига тестостерон диффундирует через базальную мембрану семенных извитых канальцев, регулируя тем самым интенсивность процессов сперматогенеза (Демяшкин Г,А., Амиров Н.Ш., 2009), поэтому изучение эндокринного компартмента семенников является необходимым условием для оценки генеративной функции.

Анализ суммарного количества клеток Лейдига выявил, что на всех сроках исследования количество эндокриноцитов, из расчета на 1 извитой семенной каналец, существенно снижено по сравнению с контролем.

60

ш МП

■ Контроль

□ Опыт I

□ Опыт 2

30 45 70

Рис. 11. Суммарное содержание клеток Лейдига. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Анализ абсолютного количества активных интерстициальных эндокриноцитов

позволил установить, что на большинстве сроков исследования данный показатель у подопытных крысят снижен по сравнению с

контролем (рис. 12 А).Обратная закономерность выявлена при анализе относительного содержания активных клеток Лейдига (рис. 12 Б).

5 30 45 70

■ Контроль ЕЮпыт 1 □ Опыт 2

Ш Контроль И Опыт 1 □ Опыт 2

Рис. 11. Абсолютное (А) и относительное (Б) содержание активных клеток Лейдига.

* - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Изменение соотношения активных и неактивных клеток Лейдига обусловило изменение их индекса активности (рис. 12).Обращает на себя внимание, что на всех сроках исследования индекс активности клеток Лейдига у подопытных крысят обеих групп превышает таковой в контроле, что, по-видимому. обусловлено развитием адаптационных процессов, направленных на восстановление численности популяции активных эндокриноцитов.

4 3.5 3

2.5 2 1.5 I

0.5 0

■ Контроль

□ Опыт 1

□ Опыт 2

0 15 30 45 70

Рис. 12.Индекс активности клеток Лейдига животных.

* - результаты статистически достоверны (р<0,05)

у экспериментальных

Поскольку клетки Лейдига парактринно взаимосвязаны с сустентоцитами (Демяшкин Г.А., Амиров Н.Ш., 2009) для изучения генеративной функции особо важно изучить их соотношение (рис. 13). На большинстве сроков

исследования данный параметр был снижен у подопытных животных обеих групп по сравнению с интактными крысятами.

■ Контроль ИОпыт 1 □ Опыт 2

Рис. 13. Индекс, отражающий соотношение клеток Лейдига и сустентоцитов.

* - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Одним из важнейших показателей функционального состояния клеток Лейдига является уровень концентрации тестостерона. Установлено, что у половозрелого потомства самок крыс животных обеих опытных групп концентрация тестостерона снижена (соответственно 134,58 нг/дл (95% ДИ: 132,31—136,85 нг/ дл), и 112,4 (95% ДИ: 98,59-126,21)), по сравнению с контролем: 150,11 нг/дл (95% ДИ: 146,77-153,45 нг/дл).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о нарушении структуры и функции эндокринного компартмента у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимального генеза.

Характеристика морфофункциональных параметров сперматоюидов.

Морфофункциональное состояние сперматозоидов оценивали комплексно с учетом их содержания, характера жизнеспособности, двигательной активности, уровня их кислотной и осмотической резистентности, количества атипичных форм (Молнар Е., 1969).

Установлено, что у подопытных животных опытной группы 2 содержание эпидидимальных сперматозоидов снижено по сравнению с интактными крысятами на 61,09%. Так, если у животных группы контроля данный показатель составил 44,20 х 10' (95% ДИ: 36,60-51,80 х 10") в 1мл, то у крысят второй подопытной группы исследуемый показатель составил 17,21 (95% ДИ: 14,35-20,07 х 106). Содержание сперматозоидов у 70-дневных крысят опытной группы 1 не претерпело статистически значимых изменений и составило 51,22 х 106 (48,6953,55 х 10б) в 1 мл.

Кроме того, установлено увеличение количества мертвых и паталогических форм сперматозоидов у подопытных самцов по сравнению с контролем (рис. 14).

А

70 60

50 %4°

0 30 20 10 0

□

Контроль Опыт 1 Опыт 2

25 20 15 10 5 о

А

Й

Контроль Опыт 1 Опыт 2

Рис. 14. Содержание мертвых (А) и патологических (Б) сперматозоидов в гомогенате придатка семенника. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Оценка кислотной и осмотической резистентности сперматозоидов позволяет оценить свойства биологических мембран данных клеток (Müller К. et al., 2008). В ходе исследования было установлено, что данные показатели у животных, рождённых от матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы, оказались снижены по сравнению с интактными самцами (рис. 15).

А

pH

4 3,5 3

2,5 2 1,5 1

0,5 0

3.5

3

2,5

%

NaCl

1,5 1

0.5 0

Контроль Опыт 1 Опыт 2 Контроль

Рис. 15. Характеристика кислотной (А) резистентности сперматозоидов у экспериментальных животных. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

Опыт 1 Опыт 2 и осмотической (Б)

Таким образом, полученные результаты убедительно свидетельствуют об изменении количественных и качественных параметров сперматозоидов у животных обеих подопытных групп.

Анализ двигательной активности сперматозоидов у экспериментальных животных. Установлено, что у подопытных крысят обеих групп содержание быстрых прогрессивноподвижных сперматозоидов на первой минуте исследования снижено по сравнению с интактными крысятами. Так у интактных половозрелых самцов данный показатель составил 26,65% (95% ДИ: 24,02-29,28%), в то время как у животных из первой опытной группы 10,22% (95% ДИ: 9,76-10,68%), а у мезенхимальной группы только 2,29% (95% ДИ: 0,60 3,98%). Обращает па себя внимание то, что на 15-ой минуте исследования у подопытных крысят прогрессивноподвижные сперматозоиды

отсутствуют в отличие от контрольных животных, у которых данный показатель составил 0,65% (95% ДИ: 0,02-1,28%).

мин.

— К ~ — Алк .........М

Рис. 16. Характеристика слабоподвижных сперматозоидов у экспериментальных животных. * - результаты статистически достоверны (р<0,05)

О 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225

I, мин

К • Алк -------М

Рис. 17. Характеристика непрогрессивноподвижных сперматозоидов у экспериментатьных животных.

Наблюдается также изменение содержания как слабоподвижных (рис. 16), так и непрогрессивноподвижньк сперматозоидов (рис. 17).

Влияние иммобилизационного стресса на генеративный и эндокринный компартмент семенников экспериментальных животных.

Установлено, что у самцов обеих подопытных групп, подвергшихся иммобилизационному стрессу, наблюдаются нарушения генеративного и эндокринного компартмента (табл. 3-4).

Из таблиц 3 и 4 видно, что в большинстве случаев наблюдается взаимодействие факторов наличия гепатобилиарной патологии у магери и воздействием иммобилизационного стресса, проявляющееся в выраженном по сравнению с интактными животными угнетении большинства исследуемых показателей.

Таблица 3

Влияние иммобнлшацношюго стресса на снерматогешшый эпителий потомства

Параметр К К стресс 01 01 стресс 02 02 стресс

Суммарное количество сперматогенных клеток 265,90 (253,60278,20) 336,43ь (330,5342,35) 352,28" (325,1379,45) 197,81аЬс (155,30240,32) 153,79" (140,49167,09) 100,09"Ьс (80,34119,11)

Суммарное количество сперматогоний 54,91 (50,6659,16) 85,11ь (82,6487,56) 65,97" (56,8275,12) 59,24аЬс (51,1567,30) 53,43" (46,8060,06) 47,26"Ьс (40,2754,25)

Количество сперматогоний типа А 22,38 (22,0322,73) 60,48ъ (58,562,38) 35,72" (30,9440,5) 54,25"Ьс (49,0259,48) 19,69 (18,2421,14) 30,79 (24,7536,83)

Количество сперматогоний промежуточного типа 8,87 (7,3410,04) 4,87ь (4,415,32) 9,93 (8,8111,05) 1,68^ (0,872,47) 23,72" (20,9026,54) 10,34аЬс (7,8012,88)

Количество сперматогоний типа В 13,69 (13,1014,28) 19,76ь (19,6519,87) 20,30" (17,0923,51) 3,31аЬс (1,265,35) 10,02" (9,6610,38) 6,13аЬс (2,729,54)

Количество спер матоцитов 194,57 (190,93198,21) 217,6Ь (203,6231,54) 229,70* (222,8236,55) 124,50аЬс (96,75152,25) 67,31" (62,5972,03) 50,20"Ьс (39,5060,90)

Количество сперматид 16,46 (14,1118,81) 18,57 (17,5519,59) 41,17" (36,5745,77) 11,46 "с (5,5917,33) 1,38" (0,831,93) 0,89 "с (0,361,42)

Количество сперматозоидов 9,94 (8,2511,63) 15,15Ь (12,7217,58) 36,47" (30,2942,65) 2,61"^ (1,813,42) 1,67" (0,542,80) 1,38аЬс (0,212,54)

Количество канальцев со слущенным эпителием, % 7,63 (5,1810,05) 11,33 (10,0312,55) 15,50" (13,6917,31) 11,42 "с (8,2414,60) 29,60" (27,6831,52) 26,60ас (23,6529,55)

Количество гигантских сперматогенных клеток 0,85 (0,730,97) 0,88 (0,651,11) . 1,23" (1,091,37) 1,36" (0,632,09) 0,96" (0,891,03) 1,26" (0,781,74)

Индексспермато генеза 3,90 (3,863,94) 3,83ь (3,813,85) 3,93" (3,913,95) 3.74"ь (3,633,85) 2,96" (2,803,15) 3,27"ь (3,033,52)

а- статистически значимое влияние патологии печени матери Ь- статистически значимое влияние иммобилизационного стресса с- статистически значимое взаимодействие между факторами

Таблица 4

Влияние иммобилизационного стресса на эндокринный аппарат семенников потомства самок крыс с экспериментальным поражением

печени.

Параметр К К стресс 01 01 стресс 02 02 стресс

Суммарное количество клеток Лейдига 14,60 (15,2613,93) 11,85ь (11,2512,45) 9,64а (7,86— 11,42) 7,13 аЬ (6,587,68) 8,12й (7,718,53) 5,01аЫ (4,53--;,49)

Абсолютное количество активных клеток Лейдига 10,28 (9,1911,37) 7,29ь (6,777,81) 5,72а (4,197,25) 3,58аЬ (3,353,81) 6,25" (5,856,65) 3,21аЬс (2,823,60)

Абсолютное количество неактивных клеток Лейдига 4,24 (2,716,07) 4,56 (4,484,64) 3,92 (3,774,04) 3,54 (3,353,73) 1,87а (1,732,01) 1,80а (1,402,20)

Относительное количество активных клеток Лейдига 70,38 (68,3772,32) 61,52" (60,1862,86) 59,37а (57,7461,00) 50,16аЬс (47,0152,76) 76,97а (74,6979,25) 64,17аЬс (56,3472,00)

Относительное количество неактивных клеток Лейдига 29,03 (27,0131,05) 38,48ь (37,1439,82) 40,63а (39,0042,26) 49,61аЬс (47,0052,76) 23,03а (20,7525,31) 35,83аЬс (23,0043,66)

Индекс активности клеток Лейдига 2,42 (2,172,67) 1,60ь (1,511,69) 2,59а (2,542,64) 1,01аЬс (0,911,11) 3,40а (3,323,48) 1,92аЬс (1,362,48)

Индекс активности клеток Лейдига 2,42 (2,172,67) 1,60ь (1,511,69) 2,59а (2,542,64) 1,01аЬс (0,911,11) 3,40а (3,323,48) 1,92"Ьс (1,362,48)

Диаметр ядер клеток Лейдига 5,77 (5,555,99) 5,12Ь (4,765,48) 5,30а (4,905,70) 4,91аЬ (4,565.25) 5,20а (4,935,47) 5.01аЬ (4,725,30

Отношение количества клеток Лейдига к количеству сустентоцитов 1,02 (0,951,09) 0,78ь (0,710,85) 0,67а (0,590,75) 0,54аЬ (0,390,69) 0,84а (0,681,00) 0.76аЬ (0,511,01)

Уровень сывороточного тестостерона, нг/дл 150,11 (143,56156,66) 119,97ь (111,3128,55) 134,58а (130.1139,03) | 84,77аЬс (65,72 -103,82) 112,40а (85,33 -13,47) 49.55аЫ: (21,4677,64)

а- статистически значимое влияние экстрагенитальной патологии печени матери

Ь- статистически значимое влияние иммобилизационного стресса с- статистически значимое взаимодействие между факторами

На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что у потомства матерей с экспериментальной хронической патологией гепатобилиарной системы наблюдается снижение стрессоустойчивости генеративного и эндокринного компартмента, что создает дополнительные риски в отношении репродуктивного здоровья.

Генез выявленных морфофункциональных отклонений представляется нам следующим образом. Экспериментальное повреждение структур печени в конечном итоге приводит к нарушению основных функций печени, в том числе дезинтоксикационной (Golding P.L. et al., 1973; Подымова С.П., 2004). Вследствие данных нарушений в крови самок крыс накапливаются токсические метаболиты (креатинин, остаточный азот и т. д.), способные вызывать морфофункциональные нарушения различных органов и систем организма матери, в том числе сердечно-сосудистой, иммунной, эндокринной и репродуктивной, что приводит к изменениям межклеточных, межтканевых, межорганных и межсистемных взаимоотношений в ее организме (Михайленко Е.Т., 1990; Фарбер Н.А., 1990 Анохина В.А., 2002). Экспериментальными исследованиями установлено, что хроническое поражение гепатобилиарной системы крыс сопровождается усилением проницаемости гематоплацентарного барьера (Аверкина Р.Ф., 1985; Крыжановский и др., 1997). В итоге наблюдается массированное поступление токсических метаболитов через фетоплацентарный барьер в организм плода, что обуславливает нарушение условий внутриктробного развития, приводящее к изменению процессов гисто-, органо- и системогенеза. Дисморфогенез, развивающийся в результате данных процессов, обуславливает, в свою очередь, нарушение функций различных систем органов развивающегося плода.

Общеизвестно, что любой патологический процесс включает в себя две детерминанты: стрессорные повреждения (первичные) и аутоимунные процессы (вторичные) (Крыжановский Г.Н., 1980). В свою очередь любой эпизод стресса сопровождается накоплением в межклеточной среде эндогенных флогогенов (инициаторов воспаления), в роли которых выступают белки теплового шока — шапероны (Smith D. et al., 1998), с последующей стимуляцией фагоцитоза, активацией НАДФН-оксидазы нейтрофилов и образованием активных форм кислорода (АФК), вследствие чего развивается окислительный стресс (Галимова Э.Ф. с соавт., 2010). С другой стороны, аутоантитела, проникающие из материнского организма, обуславливают у потомства развитие аутоимунных реакций, что приводит к истощению компенсаторно-приспособительных реакций организма. В организме плода также могут образоваться аутоантитела, которые, несомненно вносят вклад в повреждение различных органов, в том числе и яичек. Кроме того, семенники подвергаются изменению кровоснабжения, гипоксии под влиянием стресового воздействия и аутоимунного процесса, что, в конечном счете, может приводить к изменению экспрессии генов, отвечающих за митотический потенциал первичных половых клеток (Pcpling М.Е., 2006).

Вместе с тем, существенную роль в развитии нарушений репродуктивной функции может играть и повреждение органов эндокринной системы. Согласно

современным представлениям, интегрирующим центром мужской репродуктивной системы является гипоталамус, осуществляющий координацию регуляторных сигналов из высших центров и сигналов обратной связи из гонад (Crowley W.F. et al., 1991; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012). В работах Кузнецовой А.Б. (20022006) показано, что экстрагенитальная патология матери в виде хронического поражения гепатобилиарной системы приводит к нарушению структурного становления в постнатальном онтогенезе крупноклеточных и мелкоклеточных ядер гипоталамуса потомства. На уровне гипоталамуса осуществляется взаимодействие нейросекреторных элементов, необходимое для адаптации организма к воздействию факторов внешней среды (Стадников A.A., 2001), поэтому нарушения, развивающиеся в его структурах у потомства самок крыс с экспериментальной патологией гепатобилиарной системы, неизбежно приводят к возникновению патологических состояний, обусловленных нарушениями гомеостаза, в том числе и в семенниках.

Таким образом, в результате развивающихся нарушений у самок крыс с хроническим алкогольным и мезенхимальным поражением печени ро>::<дается физиологически незрелое потомство, для которого характерно нарушение морфофункционального состояния систем жизнеобеспечения, в том числе и генеративной функции.

ВЫВОДЫ

1. Хроническое экспериментальное поражение печени матери алкогольного и мезенхимального генеза приводит к морфофукциональным нарушениям становления репродуктивной системы потомства в постнатальном периоде.

2. Хроническое экспериментальное поражение печени самок крыс алкогольного и мезенхимального генеза приводит к нарушению сперматогенеза у потомства, что проявляется в изменении количественного и качественного состава сперматогенного пласта, в усилении процессов слущивания сперматогенного эпителия, изменении количества эпидидимальных сперматозоидов, в уменьшении их подвижности и жизнеспособности, а также осмотической и кислотной резистентности и увеличении содержания патологических форм.

3. У потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимального генеза наблюдаются нарушения со стороны эндокринного компартмента семенников, что проявляется в уменьшении суммарного количества клеток Лейдига. изменении их субпопуляционного состава, протекающее на фоне снижения уровня тестостерона в сыворотке крови.

4. Генеративный и эндокринный аппарат семенников потомства самок крыс с хронической патологией гепатобилиарной системы алкогольного и мезенхимального генеза характеризуется снижением резистентности к действию стрессовых факторов, что проявляется в более выраженном по сравнению с интактными животными уменьшении количества сперматогенных меток, снижении индекса активности клеток Лейдига и падении концентрации тестостерона в сыворотке крови.

5. У самок крыс с хроническим экспериментальным поражением

гепатобилиарной системы рождается потомство со сниженной

фертильностью, что проявляется в нарушении наступления и течения

беременности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ласьков, Д.С. Влияние хронического поражения печени самок крыс на сперматогенез у их потомства / Д.С. Ласьков // Морфология, 2011 - Т. 140. - №5. - С. 53.

2. Ласьков, Д.С. Характеристика весовых параметров внутренних органов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени в различные сроки постнатального периода / В.А. Вахнин, Д.С. Ласьков // Медицинский академический журнал. Приложение, 2012. - С. 147-149.

3. Ласьков, Д.С. Особенности морфофункционалыюго становления яичек потомства самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза / М.Л. Сизоненко, Г.В. Брюхин, Д.С. Ласьков // Морфология, 2011.-Т. 141.-jYs3.-C. 142.

4. Ласьков, Д.С.Характеристика сперматогенного эпителия у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени мезенхимального генеза / Д.С. Ласьков, Г.В. Брюхин // Физиологические механизмы адаптации и экология человека: Материалы второй всеросийской научно-практической конференции с международным участием, г. Тюмень, 23 октября 2012. - Тюмень: «Лаконика», 2012. - С. 128-131.

5. Ласьков, Д.С. Особенности сперматогенеза у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного генеза / Д.С. Ласьков, Г.В. Брюхин, М.Л. Сизоненко // Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды: материалы IV Международной науч.-практич. конф. (Челябинск, 8-9 октября 2012 г.). -Челябинск: Изд-во Челяб. гос. пед. ун-та, 2012. - С. 111-116.

6. Ласьков, Д.С. Оценка подвижности сперматозоидов у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного генеза / Д.С. Ласьков // Материалы III международной (X итоговой) научно-практической конференции молодых ученых.- Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2012. - С. 173 -177.

7. Ласьков, Д.С. Роль хронического экспериментального поражения печени матери в нарушении генеративной функции потомства / Г.В. Брюхин, М.Л. Сизоненко, A.C. Романов, И.В. Зубарев, Д.С. Ласьков // Вестник Южноуральского государственного университета Образование, здравоохранение, физическая культура, 2012. - № 8 (267). - С. 98 -102.

8. Ласьков, Д.С. Характеристика сперматогенного эпителия у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного генеза / Д.С. Ласьков, М.Л. Сизоненко, Г.В. Брюхин // Вестник уральской медицинской академической науки, 2012. - №2. - С. 103-104.

9. Ласьков, Д.С. Влияние иммобилизационного стресса на кислотную резистентность эпидидимальных сперматозоидов у потомства самок крыс с поражением печени мезенхимального генеза / Д.С. Ласьков, Г.В. Брюхи н, М.Л. Сизоненко И Наука, образование, общество: тенденции и перспективы: сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции 31 января 2013 г.: в 7 ч. - М.: «АР-Консалт», 2013. - Ч. IV. - С. 84-85.

10. Ласьков, Д.С. Физиологические параметры эпидидимальных сперматозоидов у потомства самок крыс с поражением печени различного генеза / Д.С. Ласьков, М.Л. Сизоненко, Г.В. Брюхин // Реформування та розвиток науки: сучасш виклики - частина IV: М1жнароднаяконфере:нц1я м. Кшв, 2 лютого 2013 р. - Киев: Изд-во: «Центр наукових публжацш», 2013. - С. 23-26.

И. Ласьков, Д.С. Исследование особенностей формирования половой мотивации у самцов потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы различной этиологии / В.А. Вахнин, Д.С. Ласьков // Сборник тезисов докладов Всеросийской молодежной конференции «Нейробиология интегративных функций мозга» Санкт-Петербург 12-14 ноября 2013 г. - СПб: Изд-во «НИИЭМ СЗО РАМН», 2013. - С. 23-24.

12. Ласьков, Д.С. Особенности эндокринного компартмента семенников у потомства самок крыс с хроническим алкогольным поражением печени / Д.С. Ласьков // Материалы IV международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. - Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2013. - С. 143-146.

13. Ласьков, Д.С. Характеристика сперматогенного эпителия у половозрелого потомства самок крыс с хроническим экспериментгшьным поражением печени алкогольного генеза / Д.С. Ласьков // Материалы IV международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. - Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2013. - С. 146-148.

14. Ласьков, Д.С. Оценка весовых параметров потомства при поражении печени матери различной этиологии в условиях эксперимента / В.А. Вахнин, Д.С. Ласьков, Р.К. Абдильдин //Вестник Челябинского государственного университета, 2013. -№ 7 (298). - С. 139-141.

15. Ласьков, Д.С. Особенности эндокринного компартмента мужских половых желез потомства самок крыс с алкогольным и мезенхимальным поражением гепатобилиарной системы Д.С. Ласьков //Вестник Челябинского государственного университета, 2013. -№ 7 (298). - С. 136-138.

16. Ласьков, Д.С. Оценка морфологических и биологических показателей развития у потомства самок крыс при поражении гепатобилиарной системы различной этиологии / В.А. Вахнин, Д.С. Ласьков // Приоритетные научные направления: от теории к практике: сборник материалов IV Международной научно-практической конференции Новосибирск, 23 апреля 2013 г. - Новосибирск: ООО агентство «СИБПРИНТ», 2013. - С. 7-13.

17. Ласьков, Д.С. Морфологическая характеристика сперматогенеза у потомства самок крыс с хронической алкогольной интоксикацией / МЛ. Снзоненко, Г.В. Брюхин, Д.С. Ласьков // Морфология, 2013. - Т. 143. - №1. - С. 59-62.

18. Ласьков, Д.С. Влияние поражения печени мезенхималыюго генеза у самок крыс на сперматогенез их потомства / Д.С. Ласьков // Морфология, 2013. - Т. 144. - №5. - С. 59-62.

19. Ласьков, Д.С. Влияние иммобилизационного стресса на двигательную активность сперматозоидов потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени / Г.В. Брюхин, Д.С. Ласьков, М.Л. Снзоненко // Проблемы репродукции, 2013. - Т. 19. - № 1. - С. 17-20.

20. Ласьков, Д.С. Особенности морфофункциональных характеристик сперматозоидов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени алкогольного генеза / Д.С. Ласьков, Г.В. Брюхин, М.Л. Снзоненко, Е.А. Алымов // Проблемы репродукции, 2014.-Т. 20.2.-С. 18-22.

На правах рукописи

Ласьков Дмитрий Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ СТАНОВЛЕНИЯ ГЕНЕРАТИВНОЙ ФУНКЦИИ СЕМЕННИКОВ У ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ХРОНИЧЕСКИМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ АЛКОГОЛЬНОГО И МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ГЕНЕЗА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 03.07.204 Усл. печ. л. 1,6 Формат 60x88 1/8 Тираж 150 Заказ 287 Типография Сити-Принт ИП Мякотин И. В. 454080, г. Челябинск, ул. Энгельса, 61

Оренбург - 2014

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ласьков, Дмитрий Сергеевич, Оренбург

Минобрнауки России Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет»

На правах рукописи 04201460875 —

Ласьков Дмитрий Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАНОВЛЕНИЯ ГЕНЕРАТИВНОЙ ФУНКЦИИ СЕМЕННИКОВ У ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ХРОНИЧЕСКИМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ АЛКОГОЛЬНОГО И МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ГЕНЕЗА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Брюхин Геннадий Васильевич

Оренбург - 2014

Содержание

Введение_4

Список принятых сокращений_ 10

Глава I. Обзор литературы. «Морфофункциональная характеристика мужских половых желёз в различные сроки антенатального и постнатального периода»_ 11

1.1 Гистофизиология мужских гонад в антенатальном периоде_ 11

I.2. Гистофизиология мужских гонад в постнатальном периоде_37

Глава II. Материал и методы исследования_55

II.1. Общая характеристика экспериментальных животных_55

II.2. Экспериментальные модели хронических поражений печени_56

II.2.1. Моделирование алкогольного поражения печени у

экспериментальных животных_57

II.2.1. Моделирование мезенхимального поражения печени экспериментальных животных_60

11.3 Экспериментальная модель имобилизационного стресса_61

11.4 Методы исследования_61

11.4.1. Морфологические методы исследования семенника_62

11.4.2. Морфометрические методы исследования семенника_62

11.4.3. Оценка физиологических параметров сперматозоидов_73

11.4.4. Оценка эндокринной функции клеток Лейдига и сустентоцитов_ 77

11.4.5. Оценка полового поведения экспериментальных животных_78

11.4.6. Биологические методы исследования семенника._78

11.4.7. Статистические методы Исследования. _79

Глава III. Результаты собственных исследований и их обсуждение_80

III. 1. Характеристика весовых параметров мужских половых желез

экспериментальных животных._80

III.2. Оценка сперматогенного эпителия экспериментальных животных _ 84

111.2.1. Оценка площади извитых семенных канальцев_84

111.2.2. Характеристика сперматогенного пласта_87

Ш.2.3.Характеристика сустентоцитов_ 104

111.3. Характеристика эндокринного компартмента_ 117

111.4. Характеристика морфофункциональных параметров эпидидимальных сперматозоидов_ 108

111.4.1. Содержание эпидидимальных сперматозоидов у экспериментальных животных_ 108

111.4.2. Анализ двигательной активности сперматозоидов у экспериментальных животных_ 110

111.4.3. Характеристика кислотной и осмотической резистентности сперматозоидов экспериментальных животных_ 115

111.5. Оценка стресс-резистентности экспериментальных животных_ 126

111.5.1. Оценка стресс-резистентности генеративного компонента семенников экспериментальных животных_ 128

111.5.2. Оценка стресс-резистентности эндокринного компонента семенников экспериментальных животных_ 135

111.6. Оценка полового поведения экспериментальных животных_ 138

111.7. Оценка фертильности экспериментальных животных_ 141

Глава IV. Заключение_ 145

Выводы _ 151

Список использованной литературы_ 153

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Актуальность настоящего исследования обусловлена тесной связью здоровья детей и их родителей. Общепризнанной на сегодняшний момент является определяющая роль материнского здоровья в воспроизводстве полноценного потомства, а также снижении перинатальной заболеваемости и ранней смертности, что является одним из необходимых условий для выхода из демографического кризиса. Демографические проблемы, находясь в одном ряду с экономическими и социальными, а иногда и сливаясь или тесно переплетаясь с ними, входят в число общепризнанных, определяющих общий социально-политический климат в стране (Вишневский А.Г. с соавт., 2003). Сложившаяся в настоящее время демографическая ситуация в нашей стране остается крайне неблагоприятной вследствие высокой смертности, низкой рождаемости (причем здоровых детей рождается все меньше и меньше), миграции трудоспособного населения. Однако в последние годы наметилось некоторое улучшение демографической ситуации, так в 2012 году зафиксирован естественный прирост населения — родилось 1,9 млн детей (в 2006 — 1,4 млн), вместе с тем эксперты связывают подобный рост с благоприятной для деторождения половозрастной структурой населения. Через несколько лет ситуация может ухудшиться, поскольку в детородный возраст вступят малочисленные поколения 90-х годов (Альбиков И.Р., 2013). Таким образом, вопрос сохранения и приумножения уровня рождаемости остается первостепенным для нашего общества.

Важной составляющей демографических процессов являются репродуктивные проблемы в браке, включающие бесплодие, невынашивание беременности и перинатальную патологию (Артифексова A.A., 1999). Согласно данным литературы, последние десятилетия характеризуются ростом числа бесплодных браков во многих странах мира, в том числе и в России, увеличением количества семейных пар, в жизни которых были

факты невынашивания беременности, а число врожденных аномалий развития не имеет тенденции к уменьшению (Сидельникова В.М., 2007; Доклад ВОЗ «Врожденные пороки», 2010). В нашей стране с проблемами планирования семьи вследствие бесплодия на протяжении жизни сталкивается в среднем каждая седьмая супружеская пара (Пшеничникова, Т.Я., 1991; Анохин Л.В., Коновалов O.E., 1995; Леваков С.А, 2010).

Здоровье будущего поколения тесно связано с репродуктивным здоровьем женщин (Кулаков В.И., 2003). Согласно данным литературы, в настоящее время наблюдается неуклонное снижение здоровья женщин репродуктивного возраста, при этом особое беспокойство вызывает состояние здоровья девушек-подростков, вступающих в репродуктивный возраст и имеющих, как известно, минимум одно хроническое экстрагенитальное заболевание, осложняющее затем течение и исход беременности, что негативно отражается на здоровье новорожденных (Кислицына O.A., 2011). Особое место в структуре экстрагенитальной патологии при этом занимают болезни гепатобилиарной системы: холангиты, холециститы, гепатиты, желчнокаменная болезнь, дискинезии желчевыводящих путей, рост которых отмечается повсеместно (Подымова С.Д., 2004; Шехтман М.М., 2005; Апресян C.B., 2009). Неблагоприятное влияние хронической патологии гепатобилиарной системы матери на морфофункциональное становление систем жизнеобеспечения потомства в условиях эксперимента было показано многочисленными работами сотрудников кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Южноуральского государственного медицинского университета (Брюхин Г.В., 1990-2013; Грачев А.Ю., 1994; Бояков A.A., 1999; Евченко Е.В., 2000; Федосов А.А, 2001; Пашнина E.H., 2003; Николина О.В., 2004; Пивень Г. В., 2004; Михайлова Г.И., 2005; Кузнецова А. Б., 2006; Ильиных М.А., 2006; Леонов Н.В., 2007; Барышева C.B., 2008; Малышева О.М., 2008; Вторушина Е.В., 2008; Романов A.C., 2008; Сизоненко М.Л., 2008 - 2013; Шаврина Е.Ю.,

2012; Зубарев И.В., 2012; Невзорова Н.В., 2012; Солянникова Д.Р., 2013; Серышева О.Ю., 2013; Алымов Е.А., 2013; Шопова Н.В., 2013; Мальгина Т.Д., 2013; Вахнин В.А., 2013).

Всё вышеперечисленное определило устойчивый интерес к изучению влияния экстрагенитальных заболеваний женщин на здоровье их потомства, особенно репродуктивное. В связи с этим целью настоящего исследованя явился анализ морфофункционального становления генеративной и эндокринной функции семенников у помства самок крыс с экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимального генеза в различные сроки постнатального развития.

Цель исследования обусловила постановку следующих задач:

1. Изучить особенности сперматогенеза у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольного и мезенхимального генеза: количество сперматогенных клеток семенных извитых канальцев, содержание эпидидимальных сперматозоидов, их жизнеспособность и наличие патологических форм.

2. Оценить эндокринный компартмент семенников у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени алкогольной и мезенхимальной природы: суммарное содержание клеток Лейдига, их субпопуляционный состав и концентрацию тестостерона в сыворотке крови.

3. Исследовать влияние иммобилизационного стресса на состояние генеративного и эндокринного аппарата семенников потомства самок крыс с поражением гепатобилиарной системы алкогольного и мезенхимального генеза.

4. Изучить показатели фертильности потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы алкогольного и мезенхимального генеза.

Научная новизна.

На адекватных экспериментальных моделях, воспроизводящих различные формы поражения печени материнского организма, установлены общие закономерности морфофункционального становления генеративного и эндокринного аппарата семенников у потомства. Выявлено нарушение морфофункциональных характеристик эпидидимальных сперматозоидов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени мезенхимального и алкогольного генеза: изменение количественного состава, уменьшение подвижности и жизнеспособности, а также их осмотической и кислотной резистентности. Показано, что эндокринный и генеративный компартменты семенников потомства самок крыс с патологией гепатобилиарной системы характеризуются сниженной резистентностью к стрессовым воздействиям. Установлено, что у самок крыс с экспериментальным поражением печени рождается потомство со сниженной фертильностью.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Проведенное исследование носит фундаментальный характер. Его результаты углубляют и расширяют знания о механизмах, лежащих в основе нарушения репродуктивной функции потомства, рожденного от матерей с хроническим поражением печени. Полученные результаты содержат новые сведения о влиянии патологии гепатобилиарной системы матери алкогольного и мезенхимального генеза на сперматогенез, эндокринный аппарат семенников и на фертильность потомства.

Полученные в ходе исследования результаты могут быть использованы при обосновании выделения детей, рожденных от матерей с патологией гепатобилиарной системы алкогольной и мезенхимальной этиологии, в группу риска в связи с возможностью развития нарушений репродуктивной системы, в том числе бесплодия.

Результаты исследования используются в научно-исследовательской деятельности и в учебном процессе курса гистологии, цитологии и эмбриологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет» в дисциплинах: «Биология размножения и развития» (бакалавриат и специалитет), «Гистофизиология репродуктивной системы» (магистратура).

Положения выносимые на защиту:

1. Экспериментальная патология гепатобилиарной системы алкогольного и мезенхимального генеза матери вызывает нарушение процессов сперматогенеза у потомства, проявляющееся в изменении числа сперматогённых клеток, снижении жизнеспособности сперматозоидов и увеличении содержания их патологических форм.

2. Патология гепатобилиарной системы у матери алкогольной и мезенхимальной природы в условиях эксперимента вызывает изменения эндокринного компартмента семенников у потомства, что находит своё проявление в уменьшении числа клеток Лейдига и снижении концентрации тестостерона в сыворотке крови.

3. Экстрагенитальная патология в виде хронического мезенхимального и алкогольного поражения гепатобилиарной системы матери обусловливает у потомства задержку наступления беременности и нарушение фертильности.

Апробация материалов работы.

Материалы конференции были представлены на III эмбриологическом симпозиуме Всеросийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011 Закономерности эмбриофетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийск, 2011); на XI международном конгрессе международной ассоциации морфологов (Самара, 2012); на III международной, (X итоговой)

научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2012); на второй всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологические механизмы адаптации и экология человека» (Тюмень, 2012); на IV международной научно-практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2012); на II всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); на всероссийской молодежной конференции «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2013); на IV международной, (XI итоговой) научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2013); на международной конференции «Реформування та розвиток науки: сучасш виклики» (Киев, 2013); на международной научно-практической конференции «Наука, образование, общество: тенденции и перспективы» (Москва, 2013); на IV международной научно-практической конференции «Приоритетные научные направления: от теории к практике» (Новосибирск, 2013); на всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных процессов», посвященной памяти чл.-кор. АМН СССР профессора Ф. М. Лазаренко (Оренбург, 2013).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации: Основное содержание работы изложено на 201 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 409 источников, в том числе 243 работы зарубежных авторов. Диссертация содержит 12 таблиц, 56 рисунков, из которых 23 микрофотографии.

Список принятых сокращений

AZF Фактор азооспермии

ЕСМ Внеклеточный матрикс

SCF Фактор стволовых клеток

ТА Túnica albugínea - «Белочная оболочка»

TDF Фактор развития семенников

АМГ Антимюллеров гормон

АСБ Андрогенсвязывающий белок

ГТБ Гематотестикулярный барьер

ГСПГ Глобулин, связывающий половые гормоны

ДГТ Дигидротестостерон

ди Доверительный интервал

дпс Дни после спаривания

ДЭА Дегидроэпиандростерон

ДЭАС Дегидроэпиандростерон сульфат

ИЛ Интерлейкин

лг Лютеинизирующий гормон

ЛГРГ Гонадотропин-рилизинг-гормон

1Ü1K Первичные половые клетки

ТФР р Трансформирующий фактор роста |3

тэсг Тестостерон-эстрадиолсвязывающий глобулин

ФСГ Фолликулостимулирующий гормон

хгт Хорионический гонадотропин

цАМФ Циклический аденозинмонофосфат

эпс Эндоплазматическая сеть

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

«Морфофункциональная характеристика мужских половых желёз в различные сроки антенатального и постнатального периода».

1.1 Гистофизиология мужских гонад в антенатальном периоде.

На начальном этапе жизни любого млекопитающего гонады XX и XY эмбрионов развиваются одинаково и, будучи морфологически идентичны, называются индифферентными гонадами (Habert R. et al., 2001).

Гонады закладываются в виде полового валика по обе стороны от дорсальной брыжейки кишки. Они особенно хорошо видны в средней части туловища (Noden D.M., De Lahunta А., 1985). Половой валик развивается из промежуточной мезодермы и представляет собой общий зачаток почек и половых желез. Половой валик состоит из цел омического поверхностного эпителия и мезенхимы. Эти элементы представляют собой так называемый соматический компонент гонад (Gier Н.Т., Marion G.B., 1969). На вентромёдиальной поверхности полового валика, целомический эпителий начинает разрастаться и быстро становится многослойным. Разрастание эпителия в результате митотических делений приводит к тому, что половой валик начинает выпирать в целомическую полость. Утолщенный половой валик проходит в продольном направлении и, таким образом, располагается параллельно мезонефральной закладке, но медиальнее ее (Rüsse I., Sinowatz F., 1998; George F.W., Wilson J.D., 1994). Данная структура может быть обнаружена при гистологическом исследовании в мышиных эмбрионах на 9,5 дпс (дни после спаривания) (Kaufman М.Н., 1992), на 21-22 дпс и 28 дпс у эмбрионов свиней и овец соответственно (Rüsse I., Sinowatz F., 1998), на 2731 дпс у крупного рогатого скота (Wrobel К.Н., 1998) и на 31-35-е сутки развития у человека (Кожухарь В.Г., 1982).

Клетки целомического эпителия активно пролиферируют и врастают в подлежащую мезенхиму мезонефрической почки в виде тяжей, называемых половыми шнурами. Формирование половых шнуров у мышей завершается

на 11.5 дпс, в это время часть из них уже заселена первичными половыми клетками (ППК) (Moreno S.G. et al., 2001). У человека данные структуры формируются к 6-7-ой неделе эмбриогенеза (Satoh M., 1991).

В настоящее время открыто множество генов, необходимых для формирования индифферентных гонад. Некоторые из них играют важную роль в дифференцировке промежуточной мезодермы и мочеполовой системы в целом. Наиболее важными генами в данном процессе являются ген стероидог�