Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности архитектуры хромосом у мутантов локуса agnostic дрозофилы - модели геномных заболеваний человека

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности архитектуры хромосом у мутантов локуса agnostic дрозофилы - модели геномных заболеваний человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт физиологии им И П Павлова

На правах рукописи

00344Э666

МЕДВЕДЕВА Анна Владимировна

/

ОСОБЕННОСТИ АРХИТЕКТУРЫ ХРОМОСОМ У МУТАНТОВ ЛОКУСА agnostic ДРОЗОФИЛЫ - МОДЕЛИ ГЕНОМНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

03 00 13 - физиология и 03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург -2008

003449666

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики Института физиологии им И П Павлова Российской академии наук

Научный руководитель

доктор биологических наук Е В Саватеева-Попова

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Кузнецова Татьяна Владимировна Институт Акушерства и Гинекологии им Отто РАМН

доктор биологических наук Семенов Дмитрий Германович Институт физиологии им И П Павлова РАН

Ведущее учреждение Санкт-Петербургский

Государственный Университет

Защита диссертации состоится «I ^ » 2008 г в II часов

на заседании Диссертационного Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002 020 01 при Институте физиологии им И П Павлова РАН по адресу 199034, Санкт-Петербург, наб Макарова, 6

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Института физиологии им И П Павлова РАН

Автореферат разослан ^ 2008 :

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002 020 01 доктор биологических наук Н Э Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Актуальной проблемой современной нейрофизиологии и медицины является изучение предпосылок возникновения социально-значимых болезней - синдромов с разнообразными расстройствами высшей нервной деятельности и васкулярными патологиями Эти синдромы возникают спонтанно и непредсказуемо (спорадически) в результате протяженных делеций и дупликаций, генерируемых неравной рекомбинацией в районах хромосом со специфической архитектурой Это синдромы Уильямса в 7qll 23 (Peoples et al, 2000), Смит-Магениса в 17p 11 2 (Chen et al, 1997), ДиГеорги в 22qll 2 (Shaikh et al, 2001), Прадер-Вилли-Ангельман в 15qll-ql3 (Amos-Landgraf et al, 1999), дупликационный синдром (17)(pl 1 2pl 1 2) и синдромы с делециями в У-хромосоме (Shaw and Lupski, 2004) Высокая частота таких структурных перестроек генома, значительно превышающая частоты появление болезней из-за мутаций какого-либо одного гена, привлекла внимание клиницистов и привела к формированию концепции «геномных болезней» (Shaw and Lupski, 2004) Если симптомы таких болезней описаны, то механизмы их возникновения еще мало изучены, что требует усилий исследователей на стыке физиологии и генетики Концепция «геномных болезней» определяет и соответствующую стратегию исследований - трехмерную проекцию нарушения каждого иерархического уровня организации генома на изменения физиологии клетки и организма На первичном уровне - нуклеотидном - генетическим резервом этих заболеваний являются кластеры повторяющихся последовательностей, псевдогенов, фрагментов генов, палиндромы и другие хромосомные сегменты Следующим уровнем является распределение этих районов по зонам различной конформации в хромосоме И в заключение - создание определенной организации ядра, в которой достигается пространственное сближение функционально и структурно связанных районов хромосом, что создает возможность неравного кроссинговера по последовательностям с частичной гомологией Все три уровня организации генетического материала находятся в гибком соподчинении Роль основного фактора сопряжения отводят актину ядра Актин способен а) регулировать транскрипцию, активируя все три класса РНК-полимераз (Visa, 2005), б) участвовать в ремоделировании хроматина, взаимодействуя с большим количеством белков (Olave et al, 2001), в) выстилать ядерную мембрану, определяя точки прикрепления хромосом и образование ядерных пор, регулируя транспорт из ядра (Pederson and Aebi, 2005) На уровне физиологии клетки ремоделирование актинового цитоскелета определяет локализацию рецепторов нейромедиаторов в синаптических уплотнениях и морфологию шипиков дендритов, что на уровне физиологии организма

влияет на синаптическую пластичность - основу процессов обучения и памяти В последнее время выяснено, что многие гены, кодирующие у человека рецепторы нейромедиаторов, ионные каналы и компоненты сигнальных каскадов, так же, как и у дрозофилы, расположены в районах хромосом со специфической архитектурой (Rossi et al, 2007) Поэтому неслучайно большинство нейродегенеративных болезней старения также возникают спорадически из-за нарушений интегральной целостности генетического аппарата и, следовательно, физиологических последствий его функционирования, предопределяемых в частности сигнальными каскадами ремоделирования актина (Minamide et al, 2000, Sherman and Goldberg, 2001) В связи с этим, большое значение приобретают модели, позволяющие осуществить комплексное изучение как механизмов взаимосвязи всех уровней организации генетического аппарата, так и физиологических последствий их нарушений на основе мутаций с известным биохимическим проявлением Такая модель была разработана нами у Drosophila melanogaster, политенные хромосомы слюнных желез которой дают уникальную возможность изучения пространственной организации интерфазного ядра, а становление различных форм обучения соотнесено с функциями определенных структур мозга В 1978 году ЕВ Савватеевой и Н Г Камышевым была получена мутация по гену agnostic (Савватеева и др 1978), нарушающая системы вторичных посредников и оборонительное ольфакторное обучение Клонирование фрагментов геномной ДНК локуса agnostic позволило установить его точное расположение в пределах района 11АВ Х-хромосомы дрозофилы, который содержит ген CG1848 для LIM-киназы 1 (LIMK1), гомологичный у многих видов (Савватеева-Попова и др 2002, 2004) Известно (Nagata et al, 1999), что фермент имеет два LIM-домена, обеспечивающих белок-белковое взаимодействие, и PDZ-домен, играющий ключевую роль в клеточной сигнализации и узнающий белки семейств рецепторов (NMDA NR2/D, АМРА, GluR2, mGluR5, бета-адренергических, мелатонина) и ионных каналов (Shaker К+, потенциал-управляемый Na+, Са2+ - N-типа) LIMK1 принимает участие в регуляции динамики актина, фосфорилируя фактор его деполимеризации- кофилин (Yang et al, 1998), и, таким образом, совместно с актином является ключевым звеном интеграции иерархических уровней генома и продуктов его экспрессии в цитоплазме Считается, что именно гемизиготность по этому гену в случае делеционного синдрома Уильямса обусловливает когнитивные нарушения у пациентов У дрозофилы ген LIMK1 находится в районе 11АВ цитологической карты X хромосомы, который является районом интеркалярного гетерохроматина, обогащенного повторами, а сам ген фланкирован АТ-богатыми повторами (The National Centre for Biotechnology Information, NCBI), что создает на нуклеотидном уровне ситуацию сходную с той, которая

наблюдается у пациентов с делеционно-дупликационными синдромами Трехкратное расширение карты в районе локализации мутантной аллели позволяет делать предположение о дупликационной природе данного повреждения, которое произошло в результате неравного кроссинговера (Савватеева-Попова и др, 2004) Кроме того, делеции, обнажающие ген agnostic, т е его гемизиготность, как в случае синдрома Уильямса, проявляют себя как мутации гена

Цели н задачи работы состояли в том, чтобы на модели мутанта дрозофилы с известным биохимическим проявлением провести комплексное изучение взаимосвязи структурно-функциональной организации гена LIMK1, конформации и свойств хроматина, пространственной организации хромосом в ядре и физиологических последствий их нарушений на уровне клетки и целостного мозга В связи с этим были поставлены следующие задачи

1 Изучить распределение и активность LIMK1 в мозге имаго дрозофилы в норме и у мутантов по гену agnostic при пермиссивкой (22° С) и рестриктивной (29° С) температуре

2 Выяснить характер влияния гомозиготного и гемизиготного состояния гена LIMK1 (моделирование синдрома Вильямса) на распределение LIMK1 по зонам мозга имаго дрозофилы в норме и у мутантов по гену agnostic при пермиссивной (22° С) и рестриктивной (29° С) температуре

3 Изучить распределение LIMK1 и фосфорилированного (р)-кофилина в -слюнных железах личинок дрозофилы до и после действия теплового шока для выяснения их ядерно-цитоплазматической локализации

4 Изучить частоту формирования эктопических контактов районами интеркалярного гетерохроматина в политенных хромосомах слюнных желез у разных линий дикого

¡S3

типа, темизигот по гену agnostic, гомо- и гетерозигот мутанта agn , как показателя конформационного состояния гетерохроматиновых районов хромосом

5 Изучить частоту асинапсиса в политенных хромосомах слюнных желез в норме и у

Is3

мутантов agn , как показателя пространственной организации ядра в предположении, что способность к гомологичному синапсису варьирует в зависимости от внутриядерной локализации соответствующего района хромосомы

6 Оценить частоту формирования белковых агрегатов - амилоидоподобных включений в мозге имаго и личиночных тканях до и после действия теплового шока в норме и у мутантов agn как следствие нарушении сигнального каскада ремоделирования актина

Научная новизна работы Впервые сформулирована концепция необходимости изучения многоуровневой организации ядра для выявления предпосылок геномных болезней Впервые с использованием комплексного подхода с привлечением методов иммунофлуоресцентного, гистохимического, цитогенетического и поведенческого анализа прослежено изменение всех уровней организации генома при повреждении структуры гена для LIMK1 и физиологических последствий геномных нарушений Впервые показано, что мутационно-обусловленное повреждение структуры гена для LIMK1, ключевого фермента ремоделирования актина, приводит к нарушениям формирования гетерохроматиновых районов и пространственной организации хромосом в ядре Таким образом, спонтанные нарушения структуры гена для LIMK1, равно как и гемизиготность по этому гену (что наблюдается в случае синдрома Уильямса у человека) могут приводить к повреждениям всех уровней организации ядра, сказываясь и на когнитивных способностях Впервые показано, что мутационно-обусловленное повреждение гена для LIMK1 приводит к образованию амилоидоподобных включений, частота которых снижается после теплового шока, и прослежена связь этих явлений со способностью к обучению и формированию памяти

Научно-практическая значимость работы состоит в создании модели, позволяющей спроецировать повреждение каждого уровня организации генома на трехмерную организацию ядра и выяснить мало известные предпосылки для осуществления неравной рекомбинации, генерирующей делеционно-дупликационные синдромы (геномные болезни) со множественными, в том числе физиологическими и когнитивными проявлениями Кроме того, работа позволяет представить механизмы возникновения спорадических нейродегенеративных заболеваний, сопровождаемых прогрессивной потерей памяти и нарушениями сигнального каскада ремоделирования актина

Апробация работы Полученные в ходе работы данные были представлены на следующих конференциях V Съезде ВОГиС, 1987, III школе по генетике и селекции животных, Бийск, 1989, Международных конференциях «Простые нервные системы», Калининград -2003, XIX Съезде физиологов России, Екатеринбург, 2004, 39lh International Danube Symposium and 1" International Congress on ADHD, Wurzburg, Germany, 2007, 17lh World Congress "Parkinson's and Related Disorders", Amsterdam, 2007

Вклад автора. Экспериментальная работа и обработка полученных результатов выполнена автором лично, в том числе и в ходе уникальных одномоментных молекулярно-генетических и поведенческих исследований лаборатории Материалы,

вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем

Структура н объем диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы Работа изложена на/^страницах печатного текста, содержит "^таблиц и иллюстрирована'"// рисунком В списке литературы приведен^¿источник

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Линии Drosophila melanogaster. Локус agnostic был обнаружен при целенаправленном скрининге индуцированных этилметансульфонатом (ЭМС) в линии Canton-S температуро-чувствительных (ts) мутаций, которые могли бы нарушать активность ферментов синтеза и распада цАМФ Df(l)112 несет небольшую, цитологически невидимую делецию, индуцированную нами рентгеном в линии CS и приводящую к гибели мух при их развитии при 29 °С в компаунде с agn"3 Р-инсерционных мутанты Р40 и Р29 были индуцированы перемещением Р-элемента из хромосомы 2 в X хромосому и отобраны по сниженной выживаемости при развитии в гетерозиготе с Df(l)112 при 29° С В качестве контроля использовали линию дикого типа Canton-S (CS) и Oregon-R Развитие всех линий происходило при 24±0,5°С

Предъявление теплового шока (ТШ) Для изучения эффектов ТШ, подаваемого в течение развития и у имаго дрозофилы, получали 5- часовые кладки яиц Стаканчики с личинками 1-го возраста или предкуколками помещали на 30 мин в водяную баню при 37 "С Для воздействия на взрослых мух их перед опытом переносили в предварительно подогретые стаканчики, которые затем помещали в водяную баню при тех же условиях Этим достигалось резкое включение ТШ

Иммунофлуоресценция Мух помещали в воротнички для массовой гистологии (Hiesenberg and Bohl, 1979), фиксировали в течение 4-х час в 4% параформальдегиде, и заливали в парафин Срезы толщиной 7 мкм подвергали депарафинизации и процедуре выявления антигенов в микроволновой печи (10 мин в 0 03 М цитратном буфере) После блокировки срезов в 10% нормальной сыворотке для выявления первичных антител к LIM-киназе 1 человека в разведении 1 500 использовали вторичное FITC-конъюгированное антитело в разведении 1 400 (goat LIMK1, donkey-anti-goat IgG-FITC, donkey serum, Santa Cruz) Для иммунофлуоресцентного изучения личиночных тканей выделение слюнных желез проводили на стадии предкуколки в РВТ (0,l%Tnton Х-100 в PBS РН7,5), фиксировали в 3,7% параформальдегиде на 1% Triton Х-100 в PBS РН7,5 в течение 10-30 сив 2% параформальдегиде на 45% уксусной кислоте 2-3 мин После

замораживания покровные стекла скалывали и препараты промывали в двух сменах PBS РН7,5 в течении 15 мин Блокировку производили 1 час в 10% сыворотке на РВТ Первичное антитело в разведении 1 500 (goat LIMK1, rabbit p-cofilm, Santa Cruz) в 1,5% сыворотке на РВТ инкубировали во влажной камере на ночь при температуре 4С После отмывки в PBS 3 раза по 5 мин , инкубировали вторичное антитело (donkey-antx-goat IgG-FITC, donkey-anti- rabbit IgG-RHODAMINE, Santa Cruz) в разведении 1 400 в1,5% сыворотке на РВТ в течение 1 часа После трехразовой отмывки в PBS окрашивали DAPI в течении 5 мин Заключенные в среду Vectashield (Vector Laboratories) для сохранения флуоресценции препараты изучали с помощью флуоресцентного микроскопа МИКМЕД И, FITC-фильтр Изображения срезов вводили в компьютер (черно-белая цифровая видеокамера с накоплением сХ05 Baumer Optronic) и анализировали с использованием программного обеспечения FISH-ВидеоТест С Петербург

Эктопическое спаривании и асинапсис политенных хромосом Использовали стандартную методику приготовления давленных препаратов слюнных желез личинок дрозофилы III возраста и ацето-орсеинового окрашивания Частоты формирования негомологичных (эктопических) контактов (ЧЭК) и асинапсиса для каждого района рассчитывали по отношению к общему числу проанализированных ядер и выражали в процентах Межлинейные различия выражали в процентах и оценивали критерием t- dif Всего для каждой линии проанализировано от 40 до 50 особей, по 10-20 ядер в каждой

Применение Конго Ред - красителя для диагностики амилоидных отложений Препараты слюнных желез личинок или мозга имаго дрозофилы, приготовленные вышеописанным способом подвергали окраске Конго Ред в модификации Путчлера с параллельным окрашиванием гематоксилином по Майеру для выявления розово-красных амилоидных отложений и окрашенных голубым ядер (Elghetany and Saleem, 1988) Препараты заключали в среду Entellan-New Частоту появления особей с Конго Ред-позитивными включениями выражали в процентах и межлинейные различия выявляли критерием t-dif

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Распределение LIMK1 по зонам мозга у гомозигот и гемизигот по гену agnostic до и после температурного воздействия.

Иммунно-флуоресцентное изучение распределения LIMK1 по зонам мозга дрозофилы выявляет ее преимущественную локализацию в центральном комплексе и в зрительной системе у нормальных мух линии CS (рис 1) У agn"3 наблюдается резкое увеличение экспрессии LIMK1 во всех зонах мозга Подобные изменения происходят у CS после

экспозиции при 29°С (2 час). Гемизиготность по гену 1ЛМК1, аналогичная наблюдаемой при синдроме Уильямса у человека, приводит к тому, что ЫМКЛ обнаруживается

Рис.1. Распределение 1ЛМКЛ по зонам мозга. Обозначения: ЦК - центральный комплекс мозга; Н - нодули; М- медула

исключительно в зрительной системе и теряет зависимость от температурного воздействия. По-видимому, подобными перераспределениями локализации 1ЛМК1 в зонах мозга объясняются когнитивные нарушения зрительно-пространственной ориентации при синдроме Уильямса. Выявляемые у agn's3 когнитивные нарушения при условно-рефлекторном подавлении ухаживания могут быть результатом повышенной экспрессии 1ЛМК1.

2. Характер распределения ИМК1 и р-кофилина в слюнных железах у Св и а$п"3 до и после температурного воздействия.

Иммуно-гистохимические исследования (рис.2) свидетельствуют о повышенной экспрессии 1ЛМК1 в слюнных железах мутантов а^п53 по сравнению с контролем. Также для ^п"3 характерно аномальное распределение 1ЛМК1 в клетках слюнных желез -крупными метками в ядре и цитоплазме, в то время как у СЭ 1ЛМК1 формирует состоящие из мелких меток структуры, подобные цитоскелетным. Продемонстрирована повышенная активность ЫМКЛ линии agn'si, которая выражается в высоком содержании р- кофилина по сравнению с СБ. После температурного воздействия межлинейные различия agn's3 и СБ практически нивелируются за счет увеличения окрашивания антителами к 1ЛМК1 у линии СБ и, напротив, уменьшения размеров метки у agrisS . При этом для обеих линий характерна ядерно-цитоплазматическая локализация ЫМКЛ. В обоих случаях показано усиление активности ЫМК1, что выражается в увеличении яркости свечения меченного р- кофилина. Проведенный в нашей лаборатории ПЦР-анализ гена 1ЛМК1 выявил

полиморфизм среди линий дикого типа и у agnK . За пределами гена, в 3'-нетранслируемом районе, у agn's3 была обнаружена вставка. Можно предположить, что повреждение З'-нетранслируемого района мутантной линии скажется на постгранскрипционной регуляции гена agnostic с помощью микро РНК (miR-134).

Рис. 2. Иммунофлуоресцентное выявление 1ЛМК1 (а-5) и фосфорилированного кофилина (в-г) в слюнных железах личинок линий дикого типа и мутантов agns3 до (!) и после действия ТШ (II). а- ЫМК1 у Сайоп-Б; б - ЫМК1 у аёп'53- в -р-кофилин у СаЩоп-Э; г- р-кофилин у agns. Результирующее изображение: зеленый цвет - ЫМК1, РГГС; красный цвет - р-кофилин, ЯНООАМШ; сине-голубой -окраска РАР1 хромосом ядра. Калибровочный маркер (белый

прямоугольник) - 100 мкм.

Известно, что miR-134 частично комплементарна нетранслируемому 3' району LIMK1 (3'UTR) и регулирует трансляцию иРНК для LIMK1 (Schratt et al.,2006). По-видимому, сбоями в регуляции можно объяснить повышенное содержание LIMK1 у agti"J. Дальнейшие эксперименты по секвенированию гена и его 3' района позволят прояснить этот вопрос.

3. Частота формирования эктопических контактов (ЧЭК) районами интеркалярного гетерохроматина (ИГХ) в левом плече хромосомы 2 (2L) слюнных желез у CS и agn'sS при разнонаправленных температурных воздействиях.

При 22°С наблюдаются высокие межлинейные различия по ЧЭК, как показателя конформационного состояния гетерохроматиновых районов хромосом. ИГХ в agn"3 вступает в эктопическое спаривание достоверно чаще по сравнению с двумя линиями дикого типа CS и Or-R (рис.За). При этом ЧЭК в гетерозиготе по гену agnostic зависит от направления скрещивания и, таким образом, по этому признаку наблюдается материнский эффект. Рис.36 демонстрирует увеличение ЧЭК также и при гемизиготном состоянии гена, независимо от того какая хромосома находится в компаунде с делецией - дикого

и

типа, мутанта agn's\ Р-инсериионного мутанта. Таким образом, существует связь между увеличением ЧЭК и изменением дозы гена, а так же нарушением его структуры. Следовательно, ген agnostic вовлечен в механизмы формирования негомологичных контактов.

g 80

$ 70

| и 60

о £ 50

Ь fc 40

S ¡5 30

л х 20

о g 10

Ь 0

11

Л?

-Г

£

Рис. 3. Частота формирования эктопических контактов у разных линий.

При разнонаправленных температурных воздействиях (15°, 29°, 37°С) на эмбриональную и личиночные стадии развития выявлены чувствительные периоды формирования ЧЭК. У С8 это первый 4.5- часовой период после откладки яйца, выявляемый при 37°С по увеличению ЧЭК. Температурное воздействие на вторую половину эмбрионального развития - стадию интенсивного органогенеза (Марвин,1975), не изменяет ЧЭК. По современным представлениям для формирования гетерохроматина необходима транскрипция соответствующего района хромосомы (Нозктв й а1., 2002; [лрртап й а1., 2004). Поэтому мы предполагаем, что именно в период начала транскрипции зиготических генов возможна модификация свойств гетерохроматиновых районов, что и подтверждают наши данные. У agn'i3 ранняя эмбриональная стадия оказалась нечувствительной к снижение ЧЭК в ответ на воздействие 15°С наблюдается на I и II личиночных стадиях. По-видимому, в первые часы развития происходит закладка гетерохроматина, а на личиночных стадиях свойства гетерохроматина могут быть модифицированы в сторону большей или меньшей компактизации ранее сформированной «закрытой» конформации гетерохроматина при помощи соответствующих белковых комплексов. Исходя из того, что именно эмбриональная стадия оказывается нечувствительной к температурному воздействию у agn' , можно предположить, что мутационное повреждение гена приводит к нарушению формирования гетерохроматиновых районов хромосом. Гетерохроматин agn'sS приобретает повышенную конъюгационную способность, которую невозможно модифицировать на этой стадии развития. Полученные результаты по формированию ЭК на стадии бластодермы

согласуются с данными изучения процессов гетерохроматинизации при эффекте положения, для которого критичными являются первые 3 час развития эмбриона (Vlassova et al ,1991) Совпадение критических сроков распространения эффекта положения по хромосоме и формирования ЭК, а также их однонаправленность, свидетельствуют как о связи этих двух явлений, так и об усилении гетерохроматиновых, репрессирующих, свойств под действием температуры Таким образом 1) частота формирования негомологичных контактов является таким же показателем степени генетической репрессии этих участков, как и эффект положения, 2) ген agnostic принимает участие в репрессивных механизмах, так как мутационное повреждение гена увеличивает ЧЭК и нарушает механизмы формирования гетерохроматина Это выражается в снижении ЧЭК и модификации чувствительных периодов при температурном воздействии

3. Частота асинапсиса и сопоставление частот гомологичного и гетерологичного синапсиса (ЧЭК) в политенных хромосомах у CS и agn's3 с целью выявления различий в хромосомной организации ядра.

Опосредуя функции транскрипционных факторов (Scott, Olson, 2007, Schul et al, 1998, Jacobs, 1999) и комплексов ремоделирования хромосом (Olave et al, 2001), LIMKl и функционально связанный с ней актин участвуют в работе подвижных компартментов ядра Известно, что эти белковые компартменты осуществляют и структурную функцию, организуя в пространстве активные домены хромосом Кроме того, те же подвижные ядерные домены принимают участие в формировании гетерохроматина, который в свою очередь, является основным структурообразующим фактором ядра Таким образом, аппарат ремоделирования актина обусловливает организацию в ядре активных, и репрессированных районов хромосомы Изучая роль LIMK1 в пространственной организации ядра, мы предположили, что его характеристикой может служить частота асинапсиса и особенности распределения асинаптированных зон В гомологичное спаривание (синапсис) вступают как эу- так и гетерохроматиновые районы, и межлинейные различия способны вскрыть модификацию и тех, и других Как представлено на рис 4, сам феномен асинапсиса происходит у agri"3 почти в 2,5 раза реже, чем у CS Анализ межлинейных различий по распределению ЭК и асинаптированных зон по длине Х-хромосомы и 2L показал, что за незначительным исключением, районы, демонстрирующие повышенную ЧЭК, редко асинаптируются Для всех хромосом выявлены "точки слома" (гетерохроматиновой природы) характеристик асинапсиса, обусловленные резким изменением частот асинапсиса в одной или в обеих изучаемых

линий. Известно, что районы ИГХ связаны с ядерной мембраной эктопическими нитями (Майк^ е! а!.,1984).

Рис. 4. Межлинейные различия по частоте формирования асинапсиса отдельными хромосомами

X 2L 2R 3L 3R

Поэтому вероятно, что относительно "точек слома" возможно перемещение ограниченного ими участка хромосомы в альтернативные территории ядра. Перемещение способствует изменению свойств интерстициального участка хромосомы, что приводит к изменениям интимности синапсиса гомологичных хромосом. Наши результаты подтвердили наблюдения об индивидуальности каждого плеча хромосом по распределению терминальных точек и частоте возникновения асинапсиса (Полянская, 1976). Впервые выявлены межхромосомные различия по соотношению асинапсисов разной протяженности. Они могут быть короткими (до 5 секций), средними ( 5-10 секций), длинными (10 - 15 секций) и почти полностью асинаптированные плечи хромосом (15-20 секций). В хромосомах CS и а^п"3обнаружены сильные межлинейные различия по всем характеристикам асинапсиса. Так как для agn'i3 характерно увеличение ЧЭК и, в то же время, резко сниженная частота асинапсиса, то можно предположить наличие связи между анализируемыми признаками: вовлечение ИГХ в гомологичное спаривании, а также - участие в этих процессах гена agnostic. По-видимому, модификации асинаптированного состояния слагаются из двух факторов: 1) при сходном распределении длинных и коротких асинапсисов межлинейные различия его частот будут зависеть от того, в какой компартмент ядра попадет интерстициальный, ограниченный терминальными точками, район; 2) в случае межлинейных различий, касающихся распределения длин асинапсиса большее значение приобретает состояние гетерохроматина и его прикрепленность к мембране или ядерному матриксу (Mathog et al., 1984). На основе полученных нами данных возможно построение теоретических моделей пространственной организации хромосом в ядре.

4. Частота появления особей с Конго Ред-познтивными включениями у Св и agn's3, отражающих нарушения каскадов сигнальной трансдукции в норме и при температурном шоке.

Амилоидо-подобные включения, выявляемые диагностическим красителем Конго Ред, возникают при системных нарушениях функций клетки и целого организма. В мозге имаго СЭ включений не наблюдается, в то время как у agn's3 обнаружены конгофильные агрегаты как при нормальной температуре, так и после ТШ (рис. 5).

Рис. 5. Конго Ред-позитивные включения у личинок (а-в) и имаго (г-д). а - нормальная температура, личинки agn's3; б - личинки agn's3 через 1 час после ТШ; в - процент личинок с включениями; Черные столбики - СаЩоп-Э Заштрихованные столбики -- agns3; г - включения в клеточной протоцеребральной массе;

д - то же, увеличено Стрелками обозначены включения

В тканях личинок включения встречаются и у CS (40%), но у agn1'3 присутствуют у всех проанализированных особей. Таким образом, наблюдаемое у agn"3 повышенная экспрессия LIMK1 и р- кофилина приводит к сбоям в динамике актинового цитоскелета и формированию амилоидных агрегатов. Такие агрегаты, окруженные комплексом актин-кофилин, равно как и собственно «актиновые» включения, обнаружены при болезни Альцгеймера (Minamide et al.,2000). Тепловой шок (ТШ) вызывает резкое уменьшение частоты включений у agn\ что хорошо согласуется с результатами иммунохимического исследования экспрессии LIMK1 в слюнных железах личинок, когда ТШ приводит к снижению уровня LIMK1 у agn's3. Показано наличие корреляции между частотой амилоидных включений и успешностью обучения у самцов. У agn'"3 по сравнению с диким типом при 22°С резко подавлены 3-х часовая память и способность к обучению. При ТШ на стадии предкуколки обучение и память восстанавливаются до уровня дикого типа. По-видимому, улучшение когнитивных способностей agn'"3 связано со снижением частоты амилоидных включений после ТШ на стадии формирования центрального комплекса мозга. Выявленная связь мутационного повреждения гена agnostic, изменение

экспрессии и активности LIMK1, наличие амилоидных включений и нарушений в когнитивной сфере, позволяет использовать данную модель для изучения как нейродегенеративных заболеваний, так и геномных болезней

Результаты исследования свидетельствуют о существовании еще мало изученного уровня сигнальной трансдукции Гены сигнальных каскадов, локализованные в гетерохроматине, подобно hmkl, регулируют экспрессию генов при формировании памятного следа и обучения не только посредством активации эффекторных молекул, но и перестраивая генетический аппарат, именно в силу особенностей своей локализации Возможно, этим объясняется согласованность биохимических каскадов в процессах адаптации и в ответ на стрессорные воздействия ВЫВОДЫ

1 Иммунно-флуоресцентное изучение распределения по зонам мозга дрозофилы LIMK1, ключевого фермента сигнального каскада ремоделирования актина, выявляет его преимущественную локализацию в центральном комплексе мозга и в зрительной системе Мутационно-обусловленное повреждение гена LIMK1, (мутация agn"3) приводит к резкому увеличению активности LIMK.1 во всех зонах мозга Такой же эффект вызывает у нормальных мух воздействие повышенной температурой (29° С)

2 Гемизиготное состояние гена LIMK1, как и при синдроме Уильямса у человека, приводит у дрозофилы к изменению распределения LIMK1 по зонам мозга Фермент локализуется исключительно в зрительной системе и теряет зависимость от температурного воздействия

3 Иммунно-флуоресцентное изучение распределения LIMK1 и фосфорилируемого этим ферментом кофилина (р-кофилина) в клетках слюнных железах личинок дрозофилы выявляет их преимущественно цитоплазматическую локализацию в норме Тепловой шок вызывает перемещение компонентов сигнального каскада ремоделирования актина в ядро и приводит к резкому увеличению активности LIMK1 и р-кофилина Мутационно-обусловленное повреждение гена LIMK1 (мутация agn's3) увеличивает содержание и активность LIMK1, которое падает после теплового шока

4 Мутационно-обусловленное повреждение гена LIMK1 (ЭМС и Р-инсерционные мутации по гену agnostic) влияет на конъюгационные свойства хромосом у дрозофилы резко увеличивает частоту формирования эктопических контактов районами интеркалярного гетерохроматина в политенных хромосомах слюнных желез Гемизиготность по гену, как при синдроме Уильямса у человека, воспроизводит мутантный фенотип

5 При разнонаправленных температурных воздействиях выявлены критические периоды эмбрионального (формирование гетерохроматина) и пост-эмбрионального (модификация свойств гетерохроматина) развития дрозофилы в отношении конъюгационных свойств хромосом Воздействие на эти стадии в норме приводит к увеличению частоты формирования эктопических контактов Мутационно-обусловленное повреждение гена LIMK1 нарушает чувствительность эмбриональной стадии к температурным воздействиям и приводит к снижению частоты эктопического спаривания на личиночных стадиях развития, что свидетельствует об участии гена agnostic в формировании гетерохроматина

6 Ген agnostic вовлечен в механизмы гомологичного синапсиса хромосом, что выражается в резком снижении частоты асинапсиса в линии agna3 и аномалиях распределения длинных и коротких аеинапсисов по длине хромосомы Это указывает на различия локализации в ядре хромосомных плеч относительно друг друга в норме и у agnul, те на разные способы формирования пространственной Зх-мерной организации ядра

7 Мутационно-обусловленные нарушений сигнального каскада ремоделирования актина приводят к формированию амилоидо-подобных агрегатов в мозге имаго и в личиночных тканях всех особей agn'si Частота встречаемости агрегатов снижается до уровня нормы после теплового шока Это коррелирует со способностью к обучению и формированию памяти при условно-рефлекторном подавлении ухаживания резкие дефекты у мутантов agn"3 восстанавливаются при действии теплового шока

Публикации по теме диссертации Статьи

1 Фельчер А В. Стефанова В H, Дукельская А В, Смирнов А В Изучение закономерностей специфической деконденсации гетерохроматиновых районов митотических хромосом дрозофилы // Цитология -1981-Т 10-С

2 Smaragdov M G , Smimov A F , Felcher A V. Dukelskaya A V Condensation and interchromosomal heterogeneity of Drosophila melanogaster heterochromatin //DIS - 1981 -V 56-С 127

3 Smirnov A F , Chiraeva О G , Felcher A V . Stefanova V N , Dukelskaya A V Specific decondensation of heterochromatic regions of Drosophila chromosomes - mtrachromosomal an genomic control // Genetica - 1986 - V 71 - P 225-231

4 Медведева А В. Савватеева E В Влияние ts-мутаций по гену agnostic, контролирующему функции кальмодулина и способность к обучению, на эктопическую конъюгацию политенных хромосом у дрозофилы // Докл АН СССР -1991 -Т 318 - С 733-736

5 Медведева А В. Савватеева Е В Влияние температуры на пространственную организацию политенных хромосом мутантов дрозофилы с измененными функциями кальмодулина // Докл АН СССР -1991 - Т 318 - С 988-991

6 Sawateeva Е , Peresleny I, Peresleny А , Tokmacheva E , Medvedeva A . Sharagina L

Behavioral and biochemical effects of the agnostic gene mutations // J Neurogenetics -1993 - V 8 - P 247-248

7 Медведева А В . Токмачева E В , Савватеева E В , Корницкий В С Особенности организации генома дрозофилы у мутантов с изменениями метаболизма вторичных посредников и способности к обучению // Физиол Журн , 1995, Т 81, № 8, С 90-93 Medvedeva А У.. Tokmacheva Е V , Sawateeva Е V , Komitskn V S Organization of the Drosophila genome in mutants with changes m second messenger metabolism and learning ability // Neurosci Behav Physiol - 1997 - V 27 - P 272-274

8 Савватеева-Попова E В, Переслени А И, Шарагина Л М, Медведева А В. Корочкина С Е , Григорьева И В , Дюжикова Н А , Попов А В , Баричева Е М , Карагодин Д, Хайзенберг М Особенности архитектуры Х-хромосомы, экспрессии LIM - киназы 1 и рекомбинации у мутантов дрозофилы локуса agnostic модель синдрома Уильямса человека // Генетика - 2004 - Т 40 - № б - С 749-769

9 Савватеева-Попова Е В , Переслени А И , Шарагина Л М , Токмачева Е В , Медведева А В . Камышев Н Г , Попов А В , Озерский П В , Баричева Е М , Карагодин Д, Хайзенберг М Комплексное изучение мутантов Drosophila melanogaster по локусу agnostic модель для сопряжения нарушений архитектуры генома и когнитивных функций // Журн Эвол Биохим Физиол - 2002 - Т 38 - № 6 - С 557-577

10 Sawateeva-Popova, Е V , Popov, А V, Nikitina, Е А , Medvedeva. А V . Pereslem, А I, Korochkin, L , Grossman, А I, Pyatkov, КI, Zatsepina, О G, Zelentsova, Е S , Evgen'ev, М В , Pathogenic chaperone-Like RNA induces congophilic aggregates and facilitates neurodegneratton in Drosophila II Cell Stress & Chaperones - 2007 - V 12 - P 9-19

11 Медведева А В . Молотков Д A, Никитина E A , Попов A A, Карагодин Д A , Баричева E M , Савватеева-Попова E В Системная регуляция генетических и цитогенетических процессов сигнальным каскадом ремоделирования актина локус agnostic дрозофилы // Генетика - 2008 - Т 44 - № 6 - С 669-681

Избранные тезисы

1 Савватеева Е В .Переслени И В , Переслени А И , Медведева А В Генетический контроль внутриклеточных регуляторов (циклические нуклеотиды - Са2+ -калмодулин) у дрозофилы // Тез Докл 5 Съезда ВОГиС - 1987 - Т 1 - С 241-242

2 Медведева А В. Савватеева Е В Роль вторичных посредников в структурно-функциональной организации хромосом интеркалярного гетерохроматина дрозофилы // Тез докл 3 школы по генетике и селекции животных, Бийск - 1989 - С 80

3 Sawateeva-Popova Е , Pereslem А, Medvedeva А . Gngoneva I, Popov А , Bancheva Е , Heisenberg М The Drosophila agnostic locus as a model for human Williams syndrome // Простые нервные системы, Калининград - 2003 - С 99

4 Савватеева-Попова Е В , Переслени А И , Медведева А В . Токмачева Е В , Никитина Е А , Шарагина Л М , Комарова А Ю , Ильиных Ю Ф , Молотков Д А , Попов А В Нейротрофины - факторы пластичности нервной системы и генотерапия нейродегенеративных болезней человека // Материалы XIX Съезда физиологов России Екатеринбург -2004 - С 121

5 Molotkov D , Medvedeva А . Nikitina Е , Sawateeva-Popova Е From structure of the LIMK 1 gene to cognitive disorders a Drosophila model for defective actin remodelling // J Neural Transmission Abstracts of 39"1 International Danube Symposium and 1st International Congress on ADHD Wurzburg, Germany - 2007 - Vol 114 - № 7 - P CXIV

6 Molotkov D , Kaminskaya A , Medvedeva A . Nikitina E , Popov A , Sawateeva-Popova E (2007) Cognitive and locomotor deficits accompanied by congophilic aggregate formation in the Drosophila model for defective actin remodeling Proceedings of the XVII WFN World Congress on Parkinson's Disease and Related Disorders, 9-13 December, Amsterdam RAI, Netherlands, session 2 022

Подписано в печать 14 07 2008г Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ № 874

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В О , Средний пр , д 24, тел /факс 323-67-74 e-mail izd_lema@maii ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Медведева, Анна Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Геномные болезни. Первый уровень организации генома нуклеотидные последовательности.

1.1.2. Неаллельные гомологичные последовательности.

1.1.3. Неаллельная рекомбинация по LCR в синдроме Уильямса (WBS).

1.1.4. Связь настоящего исследования с обсуждаемой проблемой.

1.2. Второй уровень организации генома - структурная организация хромосомы.

1.2.1. Примеры организации повторов в хромосоме.

1.2.2. Организация эухроматиновых и гетерохроматиновых районов в политенных хромосомах Drosophila.;.

1.2.3. Свойства интеркалярного гетерохроматина.

1.3. Этапы генетической репрессии: РНК-зависимое метилирование.

1.3.1. Роль двухцепочечной РНК.

1.3.2. Аппарат РНК-интерференции.

1.3.3. Механизмы РНК-зависимого метилирования ДНК.

1.3.4. Микро-РНК.

1.3.5. Связь настоящего исследования с обсуждаемой проблемой.

1.4. Этапы генетической репрессии: модификация гистонов.

1.4.1. Роль фракционного состава гистонов в конформации хроматина.

1.4.2. Гистоновый код.

1.4.3. Белок SuUR, как фактор ремоделирования хроматина.

1.4.4. Связь настоящего исследования с обсуждаемой проблемой.

1.5. Третий уровень организации генома - пространственная организация хромосом в ядре.

1.5.1. Вклад гетерохроматиновых районов в топологию ядра и дифференциальную экспрессию генов.

1.5.2. Вклад транскрипционно активных последовательностей в архитектуру ядра.

1.5.3. Хромосомные территории.

1.5.4. Интерхоматидные домены.

1.5.5. Связь настоящего исследования с обсуждаемой проблемой.

1.6. Синдром Уштьямса (Williams-Beuren Syndrome).

1.6.1. Гены, локализованные в районе делеции.

1.6.2. Серин-треонин киназаЫМК1 — часть сигнального каскада интегрины -малые ГТФазы.

1.6.2.1. Семейство малых ГТФаз.

1.6.2.2. Роль LIMK1 в формировании стрессорных фибрилл и де-ассоциации микротрубочек.

1.6.2.3. Роль LIMK1 и актина в транскрипции.

1.6.2.4. Роль LIMK1 в пролиферации.

1.6.2.5. Роль LIMK в канцерогенезе.

1.6.2.6. Роль LIMK1 в нервной системе.

1.6.3. Связь настоящего исследования с обсуждаемой проблемой.

1.7. Внутриклеточные актин-кофилиновые включения.

1.7.1. Связь настоящего исследования с обсуждаемой проблемой.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Характер распределения LIMK1 в структурах мозга.

3.2. Распределение LIMK1 и фосфорилированного кофилина в слюнных железах CS и aglf^ro и после температурного воздействия.

3.3. Частота формирования эктопических контактов (ЧЭК) районами интеркалярного гетерохроматина (ИГХ) в левом плече хромосомы 2 (2L) слюнных желез у CS илол^при разнонаправленных температурных воздействиях.

3.4. Частота асинапсиса и сопоставление частот гомологичного и гетерологичного синапсиса (ЧЭК) в политенных хромосомах линии CS и мутантов AGI/sS с целью выявления различий в хромосомной организации ядра.

3.4.1. Х-хромосома.

3.4.2. Левое плечо хромосомы 2 (2L).

3.4.3. Правое плечо хромосомы 2 (2R).

3.4.4. Левое плечо хромосомы 3 (3L).

3.4.5. Правое плечо хромосомы 3 (3R).

4. Частота появления особей с Конго Ред-позитивными включениями у

CS ViAGNrs3, отражающих нарушения каскадов сигнальной трансдукции в норме и при температурном шоке.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Роль гена agnostic в генетической репрессии.

4.2. Возможные механизмы влияния L1MK1 на структуру гетерохроматина и физиологические последствия нарушений ее экспрессии на уровне клетки и целостного мозга.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности архитектуры хромосом у мутантов локуса agnostic дрозофилы - модели геномных заболеваний человека"

Актуальность проблемы. Актуальной проблемой современной нейрофизиологии и медицины является изучение предпосылок возникновения социально-значимых болезней - синдромов с разнообразными расстройствами высшей нервной деятельности и васкулярными патологиями. Эти синдромы возникают спонтанно и непредсказуемо (спорадически) в результате протяженных делеций и дупликаций, генерируемых неравной рекомбинацией в районах хромосом со специфической архитектурой. Это синдромы: Уильямса в 7ql 1.23 (Peoples et al., 2000), Смит-Магениса в 17pl 1.2 (Chen et al., 1997), ДиГеорги в 22qll.2 (Shaikh et al., 2001), Прадер-Вилли-Ангельмана в 15qll-ql3 (Amos-Landgraf et al., 1999), дупликационный синдром (17)(pll.2pl 1.2) и синдромы с делециями в У-хромосоме (Shaw and Lupski, 2004). Высокая частота таких структурных перестроек генома, значительно превышающая частоты появления болезней из-за мутаций какого-либо одного гена, привлекла внимание клиницистов и привела к формированию концепции «геномных болезней» (Shaw and Lupski, 2004). Если симптомы таких болезней описаны, то механизмы их возникновения еще мало изучены, что требует усилий исследователей на стыке физиологии и генетики. Концепция «геномных болезней» определяет и соответствующую стратегию исследований - трехмерную проекцию нарушения каждого иерархического уровня организации генома на изменения физиологии клетки и организма. На первичном уровне - нуклеотидном — генетическим резервом этих заболеваний являются кластеры повторяющихся последовательностей, псевдогенов, фрагментов генов, палиндромы и другие хромосомные сегменты. Следующим уровнем является распределение этих районов по зонам различной конформации в хромосоме. И в заключение - создание определенной организации ядра, в которой достигается пространственное сближение функционально и структурно связанных районов хромосом, что создает возможность неравного кроссинговера по последовательностям с частичной гомологией. Все три уровня организации генетического материала находятся в гибком соподчинении. Роль основного фактора сопряжения отводят актину ядра. Актин способен: а) регулировать транскрипцию, активируя все три класса РНК-полимераз (Visa, 2005), б) участвовать в ремоделировании хроматина, взаимодействуя с большим количеством белков (Olave et al., 2001); в) выстилать ядерную мембрану, определяя точки прикрепления хромосом и образование ядерных пор; регулируя транспорт из ядра (Pederson and Aebi, 2005). На уровне физиологии клетки ремоделирование актинового цитоскелета определяет локализацию рецепторов нейромедиаторов в синаптических уплотнениях и морфологию шипиков дендритов, что на уровне физиологии организма влияет на синаптическую пластичность - основу процессов обучения» и памяти. В последнее время выяснено, что многие гены, кодирующие у человека рецепторы нейромедиаторов, ионные каналы и компоненты сигнальных каскадов, так же, как и у дрозофилы, расположены в районах хромосом со специфической архитектурой (Rossi et al., 2007). Поэтому неслучайно большинство нейродегенеративных болезней старения также возникают спорадически из-за нарушений интегральной целостности генетического аппарата, и, следовательно, физиологических последствий его функционирования, предопределяемых в частности сигнальными каскадами ремоделирования актина (Minamide et al., 2000; Sherman and Goldberg, 2001). В связи с этим, большое значение приобретают модели, позволяющие осуществить комплексное изучение как механизмов взаимосвязи всех уровней организации генетического аппарата, так и физиологических последствий их нарушений на основе мутаций с известным биохимическим проявлением. Такая модель была разработана нами у Drosophila melanogaster, политенные хромосомы слюнных желез которой дают уникальную возможность изучения пространственной организации интерфазного ядра, а становление различных форм обучения соотнесено с функциями определенных структур мозга. В 1978 году Е.В Савватеевой и

Н.Г.Камышевым была получена мутация по гену agnostic (Савватеева и др. 1978), нарушающая системы вторичных посредников и оборонительное ольфакторное обучение. Клонирование фрагментов геномной ДНК локуса agnostic позволило установить его точное расположение в пределах района 11АВ Х-хромосомы дрозофилы, который содержит ген CG1848 для LIM-киназы 1 (LIMK1), гомологичный у многих видов. (Савватеева-Попова и др. 2002, 2004). Известно (Nagata et al., 1999), что фермент имеет два LIM-домена, обеспечивающих белок-белковое взаимодействие, и PDZ-домен, играющий ключевую роль в клеточной сигнализации и узнающий белки семейств рецепторов (NMDA NR2/D, АМРА, GluR2, mGluR5, бета-адренергических, мелатонина) и ионных каналов (Shaker К+, потенциал-управляемый Na+, Са2+ - N-типа). LIMK1 принимает участие в регуляции динамики актина, фосфорилируя фактор его деполимеризации- кофилин (Yang et al., 1998), и, таким образом, совместно с актином является ключевым звеном интеграции иерархических уровней генома и продуктов его экспрессии в цитоплазме. Считается, что именно гемизиготность по этому гену в случае делеционного синдрома Уильямса (Williams-Beuren Syndrome -WBS) обусловливает когнитивные нарушения у пациентов. У дрозофилы ген LIMK1 находится в районе 11АВ цитологической карты X хромосомы, который является районом интеркалярного гетерохроматина, обогащенного повторами, а сам ген фланкирован АТ-богатыми повторами (The National Centre for Biotechnology Information, NCBI), что создает на нуклеотидном уровне ситуацию сходную с той, которая наблюдается у пациентов с делеционно-дупликационными синдромами. Трехкратное расширение карты в районе локализации мутантной аллели позволяет делать предположение о дупликационной природе данного повреждения, которое произошло в результате неравного кроссинговера (Савватеева-Попова и др., 2004). Кроме того, делеции, обнажающие ген agnostic, т.е. его гемизиготность как в случае синдрома Уильямса, проявляют себя как мутации гена.

Цели и задачи работы состояли в том, чтобы на модели мутанта дрозофилы с известным биохимическим проявлением провести комплексное изучение взаимосвязи структурно-функциональной организации гена LIMK1, конформации и свойств хроматина, пространственной организации хромосом в ядре и физиологических последствий их нарушений на уровне клетки и целостного мозга. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распределение и активность LIMK1 в мозге имаго дрозофилы в норме и у мутантов по гену agnostic при пермиссивной (22° С) и рестриктивной (29° С) температуре.

2. Выяснить характер влияния гомозиготного и гемизиготного состояния гена LIMK1 (моделирование синдрома Уильямса) на распределение LIMK1 по зонам мозга имаго дрозофилы в норме и у мутантов по гену agnostic при пермиссивной (22° С) и рестриктивной (29° С) температуре.

3. Изучить распределение LIMK1 и фосфорилированного (р)-кофилина в слюнных железах личинок дрозофилы до и после действия теплового шока для выяснения их ядерно-цитоплазматической локализации.

4. Изучить частоту формирования эктопических контактов районами интеркалярного гетерохроматина в политенных хромосомах слюнных желез у разных линий дикого типа, гемизигот по гену agnostic, гомо- и гетерозигот мутанта agnts3, как показателя конформационного состояния гетерохроматиновых районов хромосом.

5. Изучить частоту асинапсиса в политенных хромосомах слюнных желез в норме и у мутантов agnts3, как показателя пространственной организации ядра в предположении, что способность к гомологичному синапсису варьирует в зависимости от внутриядерной локализации соответствующего района хромосомы.

6. Оценить частоту формирования белковых агрегатов -амилоидоподобных включений в мозге имаго и личиночных тканях до

Is3 и после действия теплового шока в норме и у мутантов agn как следствие нарушений сигнального каскада ремоделирования актина.

Научная новизна работы. Впервые сформулирована концепция необходимости изучения многоуровневой организации ядра для выявления предпосылок геномных болезней. Впервые с использованием комплексного подхода с привлечением методов иммунофлуоресцентного, гистохимического, цитогенетического и поведенческого анализа прослежено изменение всех уровней организации генома при повреждении структуры гена для LIMK1 и физиологических последствий геномных нарушений. Впервые показано, что мутационно-обусловленное повреждение структуры гена для LIMK1, ключевого фермента ремоделирования актина, приводит к нарушениям формирования гетерохроматиновых районов и пространственной организации хромосом в ядре. Таким образом, спонтанные нарушения структуры гена для LIMK1, равно как и гемизиготность по этому гену (что наблюдается в случае синдрома Уильямса у человека) могут приводить к повреждениям всех уровней организации ядра, сказываясь и на когнитивных способностях. Впервые показано, что мутационно-обусловленное повреждение гена для LIMK1 приводит к образованию амилоидоподобных включений, частота которых снижается после теплового шока, и прослежена связь этих явлений со способностью к обучению и формированию памяти.

Научно-практическая значимость работы состоит в создании модели, позволяющей спроецировать повреждение каждого уровня организации генома на трехмерную организацию ядра и выяснить мало известные предпосылки для осуществления неравной рекомбинации, генерирующей делеционно-дупликационные синдромы (геномные болезни) со множественными, в том числе физиологическими и когнитивными проявлениями. Кроме того, работа позволяет представить механизмы возникновения спорадических нейродегенеративных заболеваний, сопровождаемых прогрессивной потерей памяти и нарушениями сигнального каскада ремоделирования актина.

Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены на следующих конференциях: V Съезде ВОГиС, 1987; III школе по генетике и селекции животных, Бийск, 1989, Международных конференциях «Простые нервные системы», Калининград.-2003 и Казань, 2006; XIX Съезде физиологов России, Екатеринбург, 2004; 39th International Danube Symposium and 1st International Congress on ADHD, Wiirzburg, Germany, 2007; 17th World Congress "Parkinson's ^and Related Disorders", Amsterdam, 2007.

Вклад автора. Экспериментальная работа и обработка полученных результатов выполнена автором лично, в том числе и в ходе уникальных одномоментных молекулярно-генетических и поведенческих исследований лаборатории. Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Медведева, Анна Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Иммунно-флуоресцентное изучение распределения по зонам мозга дрозофилы LIMK1, ключевого фермента сигнального каскада ремоделирования актина, выявляет его преимущественную локализацию в центральном комплексе мозга и в зрительной системе. Мутационно-обусловленное повреждение гена LIMK1, (мутация agnts3) приводит к резкому увеличению активности LIMK1 во всех зонах мозга. Такой же эффект вызывает у нормальных мух воздействие повышенной температурой (29° С).

2. Гемнзиготное состояние гена LIMK1, как и при синдроме Уильямса у человека, приводит у дрозофилы к изменению распределения LIMK1 по зонам мозга. Фермент локализуется исключительно в зрительной системе и теряет зависимость от температурного воздействия.

3. Иммунно-флуоресцентное изучение распределения LIMK1 и фосфорилируемого этим ферментом кофилина (р-кофилина) в клетках слюнных железах личинок дрозофилы выявляет их преимущественно цитоплазматическую локализацию в норме. Тепловой шок вызывает перемещение компонентов сигнального каскада ремоделирования актина в ядро и приводит к резкому увеличению активности LIMK1 и р-кофилина. Мутационно-обу словленное повреждение гена LIMK1 (мутация agnts3) увеличивает содержание и активность LIMK1, которое падает после теплового шока.

4. Мутационно-обусловленное повреждение гена LIMK1 (ЭМС и Р-инсерционные мутации по гену agnostic) влияет на конъюгационные свойства хромосом у дрозофилы: резко увеличивает частоту формирования эктопических контактов районами интеркалярного гетерохроматина в политенных хромосомах слюнных желез. Гемизиготность по гену, как при синдроме Уильямса у человека, воспроизводит мутантный фенотип.

5. При разнонаправленных температурных воздействиях выявлены критические периоды эмбрионального (формирование гетерохроматина) и пост-эмбрионального (модификация свойств гетерохроматина) развития дрозофилы в отношении конъюгационных свойств хромосом. Воздействие на эти стадии в норме приводит к увеличению частоты формирования эктопических контактов. Мутационно- обусловленное повреждение гена LIMK1 нарушает чувствительность эмбриональной стадии к температурным воздействиям и приводит к снижению частоты эктопического спаривания на личиночных стадиях развития, что свидетельствует об участии гена agnostic в формировании гетерохроматина.

6. Ген agnostic вовлечен в механизмы гомологичного синапсиса хромосом, что выражается в резком снижении частоты асинапсиса в tsl линии agn ~ и аномалиях распределения длинных и коротких асинапсисов по длине хромосомы. Это указывает на различия локализации в ядре хромосомных плеч относительно друг друга в норме и у agnts3, т.е. на разные способы формирования пространственной Зх-мерной организации ядра.

7. Мутационно-обусловленные нарушений сигнального каскада ремоделирования актина приводят к формированию амилоидо-подобных агрегатов в мозге имаго и в личиночных тканях всех особей agnts3. Частота встречаемости агрегатов снижается до уровня нормы после теплового шока. Это коррелирует со способностью к обучению и формированию памяти при условно-рефлекторном подавлении ухаживания: резкие дефекты у мутантов agnts3 восстанавливаются при действии теплового шока.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Медведева, Анна Владимировна, Санкт-Петербург

1. Гвоздев В.А., Ананьев Е.В., Котелянская А.Э., Жимулев И.Ф. Транскрипция участков хромосом, соответствующих районам ИГХ в культуре клеток Drosophila melanogaster // Генетика. 1980. - Т. 16.- № 10.- С. 1729-1740.

2. Жимулев И.Ф., Куличков В.А. Анализ пространственной организации генома Drosophila melanogaster на основе данных об эктопической конъюгации политенных хромосом // Генетика.- 1976.- Т. 12.- С. 81-90.

3. Жимулев И.Ф., Беляева Е.С., Мальцева Н.И., Большаков В.Н. Изменение проявления свойств ИГХ у Drosophila melanogaster под влиянием модификаторов эффекта положения // Генетика.- 1989.- Т. 25.- С. 1589-1598.

4. Жимулев И.Ф., Беляева Е.С. Гетерохроматин, эффект положения гена и генетический сайленсинг// Генетика.- 2003.- Т. 39.- С. 187-201.

5. Ильинская Н.Б., Демин С.Ю., Мартынова М.Г. Сезонная динамика хромосомного полиморфизма у Chironomus plumosus L (Diptera. Chironomidae) //Генетика.- 1988.- Т. 24.- С. 1393-1401.

6. Мальцева Н.И., Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы овариальных питающих клеток новая модель цитогенетики // Цитология.- 1997.- Т. 39.- С. 79.

7. Марвин A.M. Основные этапы эмбрионального и постэмбрионального развития дрозофилы и определяющие его факторы // Фауна Урала и европейского Севера. Сборник статей, № 4, Свердловск, 1975, С. 88-91.

8. Марков А.В., Захаров А.А., Галкин А.П., Струнников А.В., Смирнов А.Ф. Локализация комплексов когезии в политенных хромосомах Drosophila melanogaster связана с междисками // Генетика.- 2003.- Т. 39.-№9.-С. 1203-1211.

9. Митрофанов В.Г., Полуэктова Н.А., Демин С.Ю. Инверсионный полиморфизм в природной популяции Drosophila imeretensis Sokolov (.Drosophila littoralis, Meig.) //Генетика,- 1982.- Т. 18.- С. 1849-1855.

10. Ю.Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. М.: Медицинское информационное агентство, 2003.

11. П.Полянская Г.Г. Сравнительное изучение асинапсиса политенных хромосом слюнных желез личинок Drosophila melanogaster, Drosophila simulans и их гибридов. Генетика.- 1975.- Т. 11.- № 9.- С. 46-53.

12. Полянская Г.Г. Цитологическая карта терминальных точек асинапсиса в политенных хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster II Цитология.- 1976.- Т. 18,- № 6.- С. 693-701.

13. Прокофьева-Бельговская А.А., Хвостова В.В. Распределение разрывов в Х-хромосоме Drosophila melanogaster // ДАН.- 1939.- Т. 23.- С. 269271.

14. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматизация как изменение цикла хромосом // Журнал Общей Биологии.- 1945.- Т. 6.- С. 93-125.

15. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. -М.: Наука. 1986.

16. Савватеева Е.В., Камышев Н.Г., Розенблюм С.Р. Получение температуро-чувствительных мутаций, затрагивающих метаболизм циклического 3'5 * -аденозиимонофосфата у D. melanogaster // Докл. АН СССР.- 1978.- Т. 240,- С. 1443-1445.

17. Савватеева-Попова Е.В., Переслени А.И., Шарагина Л.М., Медведева А.В., Корочкина С.Е., Григорьева И.В., Дюжикова Н.А., Попов А.В.,

18. Баричева Е.М., Карагодии Д., Хайзенберг М. Особенности архитектуры Х-хромосомы, экспрессии LIM-киназы 1 и рекомбинации у мутантов дрозофилы локуса agnostic: модель синдрома Вильямса человека // Генетика.- 2004.- Т. 40.- No 6.- С.749-769.

19. Фокина Н.А., Керкис А.Ю., Груздев А.Д. Контактирование политенных хромосом с ядерной оболочкой // Цитология.- 1972.- Т. 14.- № 7.- С. 830-835.

20. Хесин Р.Б., Лейбович Б.А. Структура хромосом, гистоны и активность генов дрозофилы // Молекулярная биология.- 1976.- Т. 10.- С. 3-35.

21. Ahmad K., Henikoff S. The histone variant H3.3 marks active chromatin by replication-independent nucleosome assembly // Mol. Cell.- 2002.-V. 19.-P. 1191-1200.

22. Andrulis E. D., Neiman A. M., Zappulla D. C. Sternglanz R. Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing // Nature.-1998,-V. 394.- P. 592-595.

23. Aoyagi S., Narlikar G., Zheng C., Sif S., Kingston R.E., Jeffrey J. Nucleosome remodeling by the human SWI/SNF complex requires transient global disruption of histone-DNA interactions // Mol. Cell. Biol.- 2002.-V. 22.- P. 3653-3662.

24. Aravin A.A., Lagos-Quintana M., Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder В., Gaasterland Т., Meyer J., Tuschl T. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development // Dev. Cell.- 2003.- V. 5.- P. 337350.

25. Aravin A.A., Naumova N.A., Tulin A.V., Vagin V.V., Rozosky Y.M., Gvozdev V.A. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline // Curr. Biol.-2001.-V. 11.-P. 1017-1027.

26. Arber S., Barbayannis F.A., Hansen H., Schneider C., Stanyon C.A., Bernard O., Caroni P. Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase. //Nature.- 1998.- V. 393.- P. 805- 809.

27. Агпеу К. L., Bao S., Bannister A. J., Kouzarides Т., Surani M. A. Histone methylation defines epigenetic asymmetry in the mouse zygote // Int. J. Dev. Biol.- 2002.- V. 46.- P. 317-320.

28. Ashburner M. Some aspects of the structure and function of the polytene chromosomes of the Diptera // In '"Insect. Cytogenetics", 1980 (RL.Blackman, G.M.Hewit, M.Ashburner, eds.).

29. Aufsatz W., Mette M. F., van der Winden J., Matzke A. J., Matzke M. RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2002.- V. 99.- P. 16499-16506.

30. Avner P., Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation//Nat. Rev. Genet.- 2001.- V. 2.- P. 59-67.

31. Bannister A.J., Zegerman P., Partridge J.F., Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C., Kouzarides T. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain // Nature.- 2001.- V. 410,- P. 120124.

32. Bao N., Lye K.W., Barton M.K. MicroRNA binding sites in Arabidopsis class III HD-ZIP mRNAs are required for methylation of the template chromosome // Dev Cell. 2004.- V. 7.- P. 629-30.

33. Baumer A., Dutly F., Balmer D., Riegel M., Tukel Т., Krajewska-Walasec M., Schinszel A.A. High level of unequal meiotic crossovers at the origin of the 22ql 1.2 and 7ql 1.23 deledns // Hum. Mol. Genet.- 1998.- V. 7.- P. 887984.

34. Bayes M., Magano L.F., Rivera N., Flores R., Perez-Jurado L.A. Mutational mechanisms of Williams-Beuren syndrome deletions // Am. J. Hum. Genet.-2003.- V. 73.-P. 131-151.

35. Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Molecular-cytogenetic aspects of gene inactivation under position effect variegation in Drosophila melanogaster II Tsitologiia. 1997.- V. 39.- P. 40-41.

36. Birchler J.A., Kavi H.H., Fernandez H.R. Heterochromatin: RNA points the way // Curr. Biol.- 2004.- V. 14.- P. 759-61.

37. Bozhenok L., Wade P.A., Varga-Weisz P. WSTF-ISWI chromatin remodeling complex targets heterochromatic replication foci // EMBO J.-2002.- V. 21.-N. 9.- P. 2231-2241.

38. Bridges C.B. Salivary chromosome maps with a key to the banding of the chromosomes of Drosophila melanogaster// J. Hered.- 1935.-V. 26.- P. 6064.

39. Brown J.M., Leach J., Reittie J.E., Atzberger A., Lee-Prudhoe J., Wood W.G., Higgs D.R., Iborra F.J., Buckle V.J. Coregulated human globin genes are frequently in spatial proximity when active // JCB.- 2006.- V. 172.- N. 2.-P. 177-187.

40. Brown S.W. Heterochromatin // Science.- 1966.- V. 151.- P. 417-425.

41. Cai X., Dong F., Edelmann R.E., Makaroff C.A. The Arabidopsis SYN1 cohesin protein is required for sister chromatid arm cohesion and homologous chromosome pairing // J. Cell Sci.- 2003.- V. 116.- P. 29993007.

42. Caims B.R., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Winston F., Kornberg R.D. Two actin-related proteins are shared functional components of the chromatin-remodeling complex RSC and SWI/SNF // Mol. Cell.- 1998.- V. 2.- P. 639-51.

43. Calhoun V.C., Stathopoulos A., Levine M. Promoter-proximal tethering elements regulate enhancer-promoter specificity in the Drosophila Antennapedia complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002.- V. 99.- P. 9243-9247.

44. Cam H.P., Sugiyama Т., Chen E.S., Chen X., FitzGerald P.C., Grewal S.I. Comprehensive analysis of heterochromatin- and RNAi-mediated epigenctic control of the fission yeast genome // Nat. Genet. 2005.- V. 37.- P. 809819.

45. Carrano A.V., Wolff S. Distribution of sister chromatid exchanges in euchromatin and heterochromatin in Indian muntjac // Chromosoma-1975.-V. 53.- P. 361-369.

46. Carter D., Chakalova L., Osborne C.S., Dai Y.F., Fraser P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo // Nat. Genet.- 2002.- V. 32.- P. 623-626.

47. Carthew R.W. Gene regulation by microRNAs // Curr. Opin. in Genetics & Development- 2006,- V. 16.- P. 203-208.

48. Chan S.W., Zilberman D., Xie Z., Johansen L.K., Carrington J.C., Jacobsen S.E. RNA silencing genes control de novo DNA methylation II Science.-2004.-V. 303.-P. 1336.

49. Chen K.S., Mnian P., Koeuth Т., Potocki L., Zhao Q., Chinault A.C., Lee

50. C.C., Lupski Jr. Homologous recombination of a flanking repeat gene cluster is a mechanism for a common contiguous gene deletion syndrome // Nat Genet.- 1997.- V. 17.- P.154-163.

51. Cmarko D., Verschure P. J., Martin Т. E., Dahmus M. E., Krause S., Fu X.

52. D., van Driel R., Fakan S. Ultrastructural analysis of transcription and splicing in the cell nucleus after bromo-UTP microinjection // Mol. Biol. Cell.-1999.-V. 10.-P. 211-223.

53. Сгешег Т., Cremer С. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells // Nat. Rev. Genet.- 2001.- V. 2,- P. 292-301.

54. Cristofanilli M., Akopian A. Calcium channel and glutamate receptor activities regulate actin organization in the salamander retinal neuron // J. Physiol.- 2006.- V. 575.-P. 543-554.

55. Delattre M., Spierer A., Jaquet Y., Spierer P. Increased expression of Drosophila Su(var)3-7 triggers Su(var)3-9-dependent heterochromatin formation // J. Cell Sci.- 2004.-V. 117.- P. 6239-6247.

56. Djupedal I., Portoso M., Spahr H., Bonilla C., Gustafsson C.M., Allshire R.C., Ekwall K. RNA Pol II subunit Rpb7 promotes centromeric transcription and RNAi-directed chromatin silencing // Genes Dev.- 2005.-V. 19.- P. 2301-2306.

57. Eberharter A., Becker P.B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin Second in review series on chromatin dynamics // EMBO Rep.- 2002.-V. 3.- P. 224-229.

58. Eissenberg J.C. and Elgin S.C. The HP1 protein family: getting a grip on chromatin // Curr. Opin. Genet. Dev.- 2000,- V. 10.- P. 204-210.

59. Elghetany MT, Saleem A Methods for staining amyloid in tissues: A review.// Stain Technol.1988. V. 63. P. 201-212.

60. Ferguson M., Ward D.C. Cell cycle dependent chromosomal movement in pre-mitotic human T-lymphocyte nuclei // Chromosoma.- 1992.- V. 101.- N. 9.- P. 557-65.

61. Finnegan E.J., Kovac K.A. Plant DNA methyltransferases // Plant Mol. Biol.- 2000.- V. 43,- P. 189-201.

62. Francastel C., Schubeler D., Martin D.I.K., Groudine M. Nuclear compartmentalization and gene activity // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.- 2000.-V. l.-P 137-143.

63. Francke U. Williams-Beuren syndrome: genes and mechanisms // Human Molecular Genetics.- 1999.- V. 8.- P. 1947-1954.

64. Fukagawa Т., Nogami M., Yoshikawa M., Ikeno M., Okazaki Т., Takami Y., Nakayama Т., Oshimura M. Dicer is essential for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells // Nat. Cell Biol.- 2004.- V. 6.-P. 784-791.

65. Furukawa R., Maselli A., Thomson S.A.M., Lim R.W.L., Stokes J.V., Fechheimer M. Calcium regulation of actin crosslinking is important for function of the actin cytoskeleton in Dictyostelium II J. Cell Sci.- 2003.- V. 116,-P. 187-196.

66. Galloway P. G., Perry G., Gambetti P. Hirano body filaments contain actin and actin-associated proteins // J. Neuropathol. Exp. Neurol.- 1987.- V. 46.-P. 185-199.

67. Gasser S.M. Nuclear architecture visualizing chromatin dynamics in interphase nuclei // Science.- 2002.- V. 296.- P. 1412-1416.

68. Gerasimova T.I., Byrd K., Corces V.G. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA // Mol. Cell.- 2000.- V. 6.- P. 1025-1035.

69. Gorisch S.M., Wachsmuth M., Ittrich C., Bacher C.P., Rippe K., Lichter P. Nuclear body movement is determined by chromatin accessibility and dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2004.- V. 101.- P. 13221-13226.

70. Gorovoy M., Niu J., Bernard O., Profirovic J., Minshall R., Neamu R., Voyno-Yasenetskaya T. LIM Kinase 1 coordinates microtubule stability and actin polymerization in human endothelial cells // Curr. Opin. Cell. Biol. -1999.- V. 11.-P. 81-94.

71. Goto В., Okazaki K., Niwa O. Cytoplasmic microtubular system implicated in de novo formation of a Rabl-like orientation of chromosomes in fission yeast // J. Cell Sci.- 2001.- V.l 14.- P. 2427-2435.

72. Gottlieb S., Esposito R.E. A new role for a yeast transcriptional silencer gene, SIR2, in regulation of recombination in ribosomal DNA // Cell.-1989.-V. 56.-P. 771-776.

73. Grewal S.I.S., Elgin S.C.R. Heterochromatin: new posibitis for the inheritance of structure // Curr. Opin. Cell. Genet. Devel.- 2002.- V. 12.- P. 17-187.

74. Gu Z., Jiang Q., Fu A.K.Y., Ip N.Y., Yan Z. Regulation of NMDA receptors by neuregulin signaling in prefrontal cortex // J. Neurosci.- 2005.- V. 25.- P. 4974-4984.

75. Gundersen G.G., Cook T.A. Microtubules and signal transduction // JBC.-2005.- V. 280.- N. 28.- P. 26533-26542.

76. Haaf Т., Schmid M. Centromeric association and non-random distribution of centromeres in human tumour cells // Hum. Genet.- 1989.- V. 81.- N. 2.- P. 137-43.

77. Haaf T, Schmid M. Chromosome topology in mammalian interphase nuclei // Exp. Cell Res. 1991 - V. 192.- N. 2.- P. 325-32.

78. Hakimi M.A., Bochar D.A., Schmiesing J.A., Dong Y., Barak O.G., Speicher D.W., Yokomori K., Shiekhattar R. A chromatin remodellingcomplex that loads cohesin onto human chromosomes I I Nature.- 2002.- V. 418.- P. 994-8.

79. Hall I., Noma K., Grewal S. RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003.- V. 100.- N. 1.- P. 193-198.

80. Hammond S.M., Boettcher S., Caudy A.A., Kobayashi R., Hannon G. J. Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi // Science.- 2001.- V. 293.- P. 1146-1150.

81. Hannah A. Localization and function of heterochromatin in Drosophila melanogaster II Adv. Genet.- 1951.- V. 4.-P. 87-125.

82. Hartmann-Goldstein I. On the relationship between heterochromatinization and variegation in Drosophila, with special reference to temperature-sensitive periods // Genet. Res. Camb.- 1967.- V. 10.- P. 143-159.

83. Heisenberg M, Bohl K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means // Z. Naturf.- 1979.- V.34.- P. 134-147.

84. Holaska J.M., Kowalski A.M. et al. Caps the pointed end of actin filaments: Evidence for an actin cortical network at the nuclear inner membrane // Plos. Biol.- 2004.- V. 2.- N. 9.- P. 231.

85. Hoogenraad C.C., Akhmanova A., Grosveld F., De Zeeuw C.I., Galjart N. Functional analysis of CLIP-115 and its binding to microtubules // J. Cell. Sci-. 2000.- V. 113.- P. 2285-2297.

86. Hotchin N.A., Hall A. The Assembly of Integrin Adhesion Complexes Requires Both Extracellular Matrix and Intracellular rho/rac GTPases // J. Cell Biol.- 1995.- V. 131.- P. 1857-1865.

87. Huang S., Spector D. L. Nascent pre-mRNA transcripts are associated with nuclear regions enriched in splicing factors // Genes Dev.- 1991.- V. 5.-P. 2288 -2302.

88. Huisinga K.L., Brower-Toland В., Elgin S. The contradictory definitions of heterochromatin: transcription and silencing // Chromosoma.-2006.-V. 115.- P. 110-122.

89. Jacobs E.Y., Frey M.R., Wu W., Ingledue Т. C., Gebuhr T.C., Gao L., Marzluff W F., Gregory A. Coiled bodies preferentially associate with U4,

90. Ull, and U12 small nuclear RNA genes in interphase HeLa cells but not with U6 and U7 genes // Matera Mol. Biol. Cell.- 1999.- V. 10.- P. 16531663.

91. Janevsky J., Park P.C., De Boni U. Organization of centromeric domains in hepatocyte nuclei: rearrangement associated with de novo activation of the vitellogenin gene family in Xenopus laevis // Exp. Cell Res.- 1995. V. 217.- P. 227-239.

92. Jenuwein Т., Allis C. D. Translating the histone code // Science.-2001.-V. 293.-P. 1074-1080. Lachner M., O'Sullivan R. J., Jenuwein T. An epigenetic road map for histone lysine methylation // J. Cell Sci.- 2003.- V. 116,- P. 2117-2124.

93. Kaji N., Ohashi K., Shuin M., Niwa R., Uemura Т., Mizuno K. Cell cycle-associated changes in Slingshot phosphatase activity and roles in cytokinesis in animal cells // J. Biol. Chem.- 2003.- V. 278.- P. 3345033455.

94. Kamyshev N.G., Iliadi K.G., Bragina J.V. Drosophila conditioned courtship: Two ways of testing memory // Learn. & Mem.- 1999.- V.6.- P. 1 -20.

95. Katahira J., Sugiyama H., Inoue N., Horiguchi Y., Matsuda M., Sugimoto N. Clostridium perfringens enterotoxin utilizes two structurally related membrane proteins as functional receptors in vivo // J. Biol. Chem.-1997.- V. 212.- P 26652-26658.

96. Kato H., Goto D.B., Martienssen R.A., Urano Т., Furukawa K., Murakami Y. RNA polymerase II is required for RNAi-dependent heterochromatin assembly // Science.- 2005.- V. 309.- P. 467-469.

97. Kaufmann B.P. Organization of chromosome. 1. Break distribution and chromosome recombination in Drosophila melanogaster // J. Exp. Zool.- 1946.- V. 102.- P. 293-320.

98. Kaufmann B.P., Iddles M.K. Ectopic pairing in salivary gland chromosomes of Drosophila melanogaster II Portug. Acta. Boil.- 1963.- V. 7,- P. 225-249.

99. Kavi H.H., Fernandez H.R., Xie W., Birchler J.A. RNA silencing in Drosophila IIFEBS Lett.- 2005.- V. 579.- P. 5940-9.

100. Kelly T.J., Qin S., Gottschling D.E., Parthun M.R. Type В histone acetyltransferase Hatlp participates in telomeric silencing // Mol. Cell. Biol.- 2000,- V. 20.- P. 7051-7058.

101. Kiyosawa H., Lensch M.W., Chance P.F. Analysis of the CMT1A-REP repeat: mapping crossover breakpoints in CMT1A and HNPP // Hum. Mol. Genet.- 1995.- V. 4.- P. 2327-2334.

102. Krauss S.W., Chen C., Penman S., Heald R. Nuclear actin and protein 4.1: Essential interactions during nuclear assembly in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003.- V. 100.- P. 10752-10757.

103. Kuhn T B. et al. Regulating actin filament dynamics in neuronal growth cones by ADF/cofllin and rho family GTPases // J. Neurobiol.-2000.- V. 44.- P. 126-144.

104. Kwak I.H., Kim H.S., Choi O.R., Ryu M.S., Lim I.K. Nuclear accumulation of globular actin as a cellular senescence marker // Cancer Res.- 2004,- V. 64.- P. 572-80.

105. Lachner M., O'Carroll D., Rea S., Mechtler K., Jenuwein T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins // Nature.-2001.- V.410.-P. 116-120.

106. Lachner M., Jenuwein T. The many faces of histone lysine methylation// Curr. Opin. Cell Biol. -2002.-V. 14.- P. 286-298.

107. Laemmli U.K., Kas E., Poljak L., Adachi Y. Scaffold-associated regions: cis-acting determinants of chromatin structural loops and functional domains // Curr. Opin. Genet. Dev.- 1992.- V. 2.- P. 275-285.

108. Laird C.D., Hammond M., Lamb M. Polytene chromosomes of Drosophila // Chromosomes Today.- 1987.- V. 9,- P. 40-47.

109. Lee C.S. A possible role of repetitious DNA in recombinatoiy joining during chromosome rearrengement in Drosophila melanogaster // Genetics.-1975.- V. 79.-P. 467-470.

110. Lee J.T. Molecular links between X-inactivation and autosomal imprinting: X-inactivation as a driving force for the evolution of imprinting // Curr. Biol.- 2003.- V. 13.- P. 242-254.

111. Leitch A. Higher levels of organization in the interphase nucleus of cycling and differentiated cells // Microbiol, and Mol.Biol. Rev 2000.- P. 138-152.

112. Lenhoff H.M., Wang P.P., Greenberg F., Bellugi U. Williams syndrome and the brain // Sci. Am.- 1997.- V. 277.- P. 68-73.

113. Li Y., Kirschmann D. A., Wallrath L. L. Does heterochromatin protein 1 always follow code? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2002.-V. 99.-P. 16462-16469.

114. Liao G., Kreitzer G., Cook T.A., Gundersen G. G. A signal transduction pathway involved in microtubule-mediated cell polarization // FASEB J.- 1999.- V. 13.- P. 257-260.

115. Lin Т., Zeng L., Liu Y., DeFea K., Schwartz M.A., Chien S., Shyy J.Y.-J. Rho-ROCK-LIMK-Cofilin pathway regulates shear stress activationof sterol regulatory element binding proteins I I Circ. Res.- 2003.- V. 92.- P. 1296-1304.

116. Liu J., Carmell M. A., Rivas F. V., Marsden C. G., Thomson J. M., Song J. J., Hammond S. M., Joshua-Tor L., Hannon G. J. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi // Science.- 2004.- V. 305.- P. 14371441.

117. Locke J., Kotarski M.A., Tartof K.D. Dosage-dependent modifiers of position effect variegation in Drosophila and a mass action model that explains their effect//Genetics.- 1988.-V. 120.-P. 181-198.

118. Losada A., Hirano T. Intermolecular DNA interactions stimulated by cohesin complex in vitro: implications for sister chromatid cohesion // Curr. Biol.- 2001.- V. 11.- N. 4.- P. 268-272.

119. Luff В., Pawlowski L., Bender J. An inverted repeat triggers cytosine methylation of identical sequences in Arabidopsis II Mol. Cell.- 1999.- V. 3.-P. 505-511.

120. Lupski J.R. Genomic disorders recombination-based disease resulting from genomic architecture // Am. J. Hum. Genet.- 2003.- V. 72.- P. 246-252.

121. Lyman L., Copps K., Rastelli L., Kelley R., Kuroda M. Drosophila male-specific lethal-2 protein: structure/function analysis and dependence on MSL-1 for chromosome association // Genetics.- 1997.- V. 147.- P. 17431753.

122. Lyman S.K., Gerace L. Nuclear pore complexes: dynamics in unexpected places // J. Cell Biol.- 2001.- V. 154.- N. 1.- P. 17-20.

123. MacCallum D.E., Losada A., Kobayashi R., Hirano T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora В // Mol. Biol.Cell.- 2002.- V. 13.- P. 25-39.

124. Maciver S. K., Harrington C. R. Two actin binding proteins, actin depolymerizing factor and cofilin, are associated with Hirano bodies // Neuroreport.- 1995.- V. 6.- P. 1985-1988.

125. Mahy N.L., Perry P.E., Bickmore W.A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH // J. Cell Biol.-2002.- V. 159.- P. 753-763.

126. Mahy N.L., Репу P.E., Gilchrist S., Baldock R.A., Bickmore W.A. Spatial organization of active and inactive genes and non-coding DNA within chromosome territories // J. Cell Biol.- 2002.- V. 157.- P. 579-589.

127. Manning J.E., Schmidt C.W., Davidson N. Interspersion of repetitive and non-repetitive DNA sequences in the Drosophila melanogaster genome // Cell.- 1975.- V. 4.- P. 141-155.

128. Martienssen R.A., Zaratiegui M., Goto D.B. RNA interference and heterochromatin in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe // Trends in Genetics.- 2005.- V. 21.

129. Martou G., De Boni U. Nuclear topology of murine, cerebellar Purkinje neurons: changes as a function of development // Exp. Cell. Res.-2000.- V. 256.-P. 131-9.

130. Maselli A., Furukawa R., Thomson S.A.M., Davis R.C., Fechheimer M. Formation of Hirano bodies induced by expression of an actin crosslinking protein with a gain-of-function mutation // Eukariotic Cell.- 2003.-V. 2.- N. 4.- P. 778-787.

131. Mathieu O., Bender J. RNA-directed DNA methylation // J. Cell Sci.-2004.- V. 117.-P. 4881-4888.

132. Melquist S. Bender J. Transcription from an upstream promoter controls methylation signaling from an inverted repeat of endogenous genes in Arabidopsis И Genes Dev.- 2003.- V. 17.- P. 2036-2047.

133. Meneghini M.D., Wu M., Madhani H.D. Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin // Cell.- 2003.- V. 112.- P. 725-736.

134. Meng Y., Zhang Y., Tregoubov V., Janus C., Cruz L., Jackson M., Lu W.-Y., MacDonald J.F., Wang J.Y., Falls D.L., Jia Z. Abnormal spine morphology and enhanced LTP in LIMK1 knockout mice // Neuron.- 2002.-V. 35.- P. 121-133.

135. Minamide L. S., Striegl A.M., Boyle J.A., Meberg P.J., Bamburg J.R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function // Nat. Cell Biol.- 2000.- V. 2.- P. 628-636.

136. Motamedi M.R., Verdel A., Colmenares S.U., Gerber S.A., Gygi S.P., Moazed D. Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to non-coding centromeric RNAs // Cell.- 2004,- V. 119.- P.789-802.

137. Nakayama Т., Matsuoka R., Kimura M., Hirota H., Mikoshiba K., Shimizu Y., Shimizu N., Akagawa K. Hemizygous deletion of the HPC-1/syntaxin 1A gene (STX1A) in patients with Williams syndrome // Cytogenet Cell Genet.- 1998.- V. 82.- P. 49-51.

138. Nakayasu H., Ueda K. Association of rapidly-labelled RNAs with actin in nuclear matrix from mouse L5178Y cells // Exp Cell Res.- 1985.- V. 160.- P. 319-30.

139. Narlikar G.J., Fan H.Y., Kingston RE. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription // Cell.- 2002.-V. 108.- P. 475-487.

140. Nielsen J.A., Lynn D. et al. Nuclear organization in differentiating oligodendrocytes // J. Cell Sci.- 2002.- V. 115.- P. 4071-4079.

141. Nimchinsky E.A., Sabatini B.L., Svoboda K. Structure and function of dendritic spines // Ann. Rev. Physiol.- 2002.- V. 64,- P. 313-353.

142. Nishida E., Iida K., Yonezaw, N., Koyasu S., Yahara I., Sakai H. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1987.- V. 84.- P. 5262-5266.

143. Nye A.C., Rajendran R.R., Stenoien D.L., Mancini M.A., Katzenellenbogen B.S., Belmont A.S. Alteration of large-scale chromatin structure by estrogen receptor // Mol. Cell. Biol.- 2002.- V. 22.- P. 34373449.

144. Osborn L.R., Campbell Т., Daradich A., Scherer S.W., Tsui L.C. Identification of a putative transcripyion factor gene that is commonly deleted in Williams-Beuren syndrome // Genomics.- 1999.- V. 57.- P. 279284.

145. Osborn L.R., Li M., Pober В., Chitayat D., Bodurtha J., Mandel A., Costa Т., Crebe Т., Cox S., Tsui L.C., Scerer S.W. A 1,5 million-base pair inversion polymorphism in families with Williams-Beuren syndrome // Nat. Genet.- 2001.- V. 29.- P. 321-325.

146. Pal-Bhadra M., Leibovitch B.A., Gandhi S.G., Rao M., Bhadra U., Birchler J.A., Elgin S.C. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery // Science.- 2004.- V. 303.- P. 669-72.

147. Pederson Т., Aebi U. Nuclear actin extends, with no contraction in sight // MBC -2005.- V. 16.- P. 5055-5060.

148. Pendleton A., Pope В., Weeds A., Koffer A. Latrunculin В or ATP depletion induces cofilin-dependent translocation of actin into nuclei of mast cells // J. Biol. Chem. 2003.- V. 16,- P. 14394-14400.

149. Peoples, R., Perez-Jurado, L., Wang, Y.K., Kaplan, P. and Francke, U. The gene for replication factor С subunit 2 (RFC2) is within the 7q 11.23 Williams syndrome deletion // Am. J. Hum. Genet.- 1996.-V. 58,- P. 13701373.

150. Peoples R., Franke Y., Wang Y.K., Perez-Jurado L., Paperna Т., Cisko M., Francke U. A physical map, including а ВАС/РАС clone contig, of the Williams-Beuren syndrome deletion region at 7ql 1.23 // Am. J. Hum. Genet.- 2000.- V. 66.- P. 6647-68.

151. Percipalle P., Jonsson A., Nashchekin D., Karlsson C., Bergman Т., Guialis A., Daneholt B. Nuclear actin is associated with a specific subset of hnRNP A/B-type proteins // Nucleic Acids Res.- 2002.- V. 30.- P. 17251734.

152. Percipalle P., Fomproix N., Kylberg K., Miralles F., Bjorkroth В., Daneholt В., Visa N. An actin-ribonucleoprotein interaction is involved in transcription by RNA polymerase II // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003.-V. 100.-P. 6475-6480

153. Pfeffer S., Meister G., Landthaler M., Tuschl T. RNA silencing // 90th International Titisee Conference B.I.F. FUTURA.- 2005.- V. 20.

154. Platani M., Goldberg I., Lamond A.I., Swedlow J.R. Cajal body dynamics and association with chromatin are ATP-dependent // Nat. Cell Biol.- 2002.- V. 4.- P. 502-8.

155. Politz J. C., Tuft R. A., Pederson Т., Singer R. H. Movement of nuclear poly(A) RNA throughout the interchromatin space in living cells // Curr. Biol.- 1999.- V. 9.- P. 285-291.

156. Prokofyeva-Belgovskaya A.A. Cytological properties of inert regions and their bearing on the mechanics of mosaicism and chromosome rearrangement // Dros. Inform. Serv.- 1941.- V. 15.- P. 34-35.

157. Rando O.J., Zhao K., Janmey P., Crabtree G.R. Phosphatidylinositol-dependent actin filament binding by the SWI/SNF-like BAF chromatin remodeling complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002.- V. 99.- P. 28242829.

158. Rea S., Eisenhaber F., O'Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W., Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., et al. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases // Nature.- 2000.- V. 406.- P. 593-599.

159. Redon C., Pilch D., Rogakou E., Sedelnikova O., Newrock K., Bonner, W. Histone H2A variants H2AX and H2AZ // Curr. Opin. Genet. Dev.- 2002,- V. 12.- P. 162-169.

160. Reyes J.C., Muchardt C., Yaniv M. Components of the human SWI/SNF complex are enriched in active chromatin and are associated with the nuclear matrix // J. Cell Biol.- 1997.- V. 137.- P. 263-274.

161. Richards E.J., Elgin S.C. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects // Cell.- 2002,- V. 108.- P. 489-500.

162. Richter-Cook N.J., Dever Т.Е., Hensold J.O., Merrick W.C. Purification and characterization of a new eukaryotic protein translation factor: eukaryotic initiation factor 4H // J. Biol. Chem.- 1998.- V. 273.- P. 7579-7587.

163. Rosok O., Pedeutour F., Ree A.H., Aasheim H.C. Identification and characterization of TESK2, a novel member of the LIMK/TESK family of protein kinases, predominantly expressed in testis // Genomic.- 1999.- V. 61.-P. 44-54.

164. Rusche L.N., Kirchmaier A.L., Rine J. Ordered Nucleation and Spreading of Silenced Chromatin in Saccharomyces cerevisiae //Mol. Biol. Cell.- 2002.- V. 13.- P. 2207-2222.

165. Sahai E., Olson M.F., Marshall C.J. Cross-talk between Ras and Rho signalling pathways in transformation favours proliferation and increased motility // EMBO J.- 2001,- V. 20.- P. 755-766.

166. SantosRosa H., Schneider R., Bannister A. J., Sherriff J., Bernstein B. E., Emre N. С. Т., Schreiber S. L., Mellor J., Kouzarides T. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3 // Nature.- 2002.- V.419.- P. 407-411.

167. Sawateeva E.V., Kamyshev N.G. Behavioral effects of temperature sensitive mutations affecting metabolism of cAMP in D. melanogaster II Pharm. Biochem. Behav. 1981.- V.14.- P. 603-611.

168. Scheer U., Hock R. Structure and function of the nucleolus // Curr. Opin. Cell Biol.- 1999,-V. 11.-P. 385-390.

169. Schotta G., Ebert A., Krauss V., Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein Т., Dorn R., Reuter G. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing // EMBO J.-2002.- V. 21.-P. 1121-1131.

170. Schramke V., Allshire R. Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing // Science.- 2003.- V. 301.-P. 1069-1074.

171. Schramke V., Sheedy D.M., Denli A.M., Bonila C., Ekvvall K., Hannon G.J., Allshire R.C. RNA-interference-directed chromatin modification coupled to RNA polymerase II transcription // Nature.- 2005,-V. 435.-P.1275-1279.

172. Schubert V., Da Silva J.S., Dotti C.G. Localized recruitment and activation of RhoA underlies dendritic spine morphology in a glutamate receptor-dependent manner // J. Cell Biol.- 2006,- V. 172.- N. 3.- P. 453467.

173. Schul W., Van Driel R., De Jong L. Coiled bodies and U2 snRNA genes adjacent to coiled bodies are enriched in factors required for snRNA transcription//Mol. Biol. Cell.- 1998.- V. 5.-P. 1025-1036.

174. Scott R.W., Olson M.F. LIM kinases: function, regulation and association with human disease // J. Mol. Med.- 2007.- V. 85.- P.555-568.

175. Shaw C.J., Lupski J.R. Implications of genome architecture for rearrangement-based disorders: the genomic basis of disease // Human Mol. Gen.- 2004.- V. 13.- P. 57-64.

176. Sherman M.Y., Goldberg A.L. Cellular defenses against unfolded proteins: a cell biologist thinks about neurodegenerative diseases. Neuron.-2001,- V. 29.- P. 15-32.

177. Shi Y., Ethell I.M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization // J. Neurosci.-2006.- V. 26.- P. 1813-1822.

178. Sjolinder M., Bjork P., Soderberg E., Sabri N., Farrants A.-K., Visa N. The growing pre-mRNA recruits actin and chromatin-modifying factors to transcriptionally active genes // Genes & Dev.- 2005.- V. 19. P. 1871-1884.

179. Smith J.S., Caputo E., Boeke J.D. A Genetic screen for ribosomal DNA silencing defects identifies multiple DNA replication and chromatin-modulating factors // Mol. Cell. Biol.- 1999.- V. 19,- N. 4.- P. 3184-3197.

180. Spector D.L. Nuclear domains //J. Cell. Sci.- 2001.- V. 114.- P. 28912893.

181. Spellman P.T., Rubin G.M. Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome // J. Biol.- 2002.- V. 1.- N. 1.- P. 5.

182. Stadler S., Schnapp V., Mayer R., Stein S., Cremer C., Bonifer C., Cremer Т., Dietzel S. The architecture of chicken chromosome territories changes during differentiation // BMC Cell Biol.- 2004,- V. 5,- P. 44.

183. Stein G.S., Van Wijnen A.J., Stein J., Lian J.B., Montecino M. Contributions of nuclear architecture to transcriptional control // Lnt. Rev. Cytol.- 1995.- V. 162.- P.251-78.

184. Sugiyama Т., Cam H., Verdel A., Moazed D., and Grewal S. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2005.- V. 102.- P. 152-157.

185. Sumara I., Vorlaufer E., Gieffers C., Peters B.H., Peters J.-M.'Characterization of vertebrate cohesin complexes and their regulation in prophase // J. Cell Biol.- 2000.- V. 151.- N. 4.- P. 749-762.

186. Sun F.-L., Haynes K., Simpson C.L., Lee S.D., Collins L., Wuller J., Eissenberg J.C., Elgin S. C. R. c/s-Acting determinants of heterochromatin formation on Drosophila melanogaster II Chromosome Four. Mol. Cell. Biol.- 2004.- V. 24.- P. 8210-8220.

187. Swaminathan J., Baxter E., Corces V. The role of histone H2Av variant replacement and histone H4 acetylation in the establishment of Drosophila heterochromatin // Genes & Develop.- 2005.- V. 19.- P. 65-76.

188. Talbert P.B., Henikoff S. Spreading of silent chromatin: inaction at a distance //Nature Review Genetics.- 2006.- V. 7.- P. 793-803.

189. Tanabe H, Habermann FA, Solovei I, Cremer M, Cremer T. Non-random radial arrangements of interphase chromosome territories: evolutionary considerations and functional implicatios // Mutat. Res.- 2002. -V. 504.-N. 1-2.-P. 37-45.

190. Tariq M., Saze H., Probst A. V., Lichota J., Habu Y., Paszkowski J. Erasure of CpG methylation in Arabidopsis alters patterns of histone H3 methylation in heterochromatin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003.- V. 100,-P. 8823-8827.

191. Tassabehji M., Metcalfe K., Fergusson W.D., Carette M.J.A., Dore J.K., Donnai D., Read A.P., Proschel C., Gutowski N.J., Мао X., Sheer D. LIM-kinase deleted in Williams syndrome //Nat. Genet.- 1996.- V. 13.- P. 272-273.

192. Tassabehji M. Williams-Beuren syndrome: a challenge for genotype-phenotype correlations // Human Mol. Gen.- 2003.- V.12.- P. 229-237.

193. Tchurikov N. A., Ponomarenko N.A. Detection of DNA domains in Drosophila, human, and plant chromosomes possessing mainly 50- to 150-kilobase stretches of DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.- V. 89.- N. 15.- P. 6751-5.

194. Tchurikov N.A., Krasnov A.N., Ponomarenko N.A., Golova Y.B., Chernov B.K. Forum domain in Drosophila melanogaster cut locus possesses looped domains inside // Nucleic Acids Res.- 1998.- V. 26. -N. 13.- P. 3221-7.

195. Tchurikov N.A., Kretova O.V., Chernov B.K., Golova Y.B., Zhimulev I.F., Zykov I.A. SuUR protein binds to the boundary regions separating forum domains in Drosophila melanogaster II J. Biol. Chem.- 2003.-V. 279.-P. 11705-11710.

196. Tchurikov N.A., Kretova O.V., Chernov B.K., Golova Y.B., Zhimulev I.F., Zykov I.A. SuUR protein binds to the boundary regions separating Forum domains in Drosophila melanogaster II J. Biol. Chem.- 2004.- V. 279.- P. 11705-11710.

197. Tomari Y., Zamore P.D. Perspective: machines for RNAi // Genes and Development.- 2005,- V. 19,- P. 517-529.

198. Turner B.M. Cellular memory and the histone code // Cell .-2002.-V. 111.-P. 285-291.

199. Urban Z., Helms C., Fekete G., Csiszar K., Bonnet D., Munnich A., Donis-Keller H., Boyd C.D. 7qll.23 deletions in Williams syndrome arise as a consequence of unequal meiotic crossover // Am. J. Hum. Genet.-1996.- V. 59.-P. 958-962.

200. Vakoc C.R., Mandat S.A., Olenchock B.A., Blobel G.A. Histone H3 lysine 9 methylation and HP 1 gamma are associated with transcription elongation through mammalian chromatin // Mol. Cell.- 2005.- V. 19.- P. 381-391.

201. Van de Ven T.J., VanDongen H.M.A., VanDongen A.M.J. The nonkinase phorbol ester receptor- 1-chimerin binds the NMDA receptor NR2A subunit and regulates dendritic spine density // J. Neurosci.- 2005.-V. 25.- P. 9488 -9496.

202. Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama Т., Gygi S., Grewal S.I., Moazed D. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex // Science.- 2004.- V. 303.- N. 5658.- P. 672-6.

203. Visa N. Actin in transcription // EMBO reports.- 2005.- V. 6.- P. 3.

204. Vlassova I.E., Graphodatsky A.S., Belyaeva E.S, Zhimulev I.F. Constitutive heterochromatin in early embryogenesis of Drosophila melanogaster II Mol. Gen. Genet.- 1991.- V.229.- P.316-318.

205. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.I., Martienssen R.A. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi // Science.- 2002.-V. 297,- P. 1833-1837.

206. Wada A., Fukuda M., Mishima M., Nishia E. Nuclear export of actin: a novel mechanism regulating the subcellular localization of a major cytoskeletalprotein//EMBO J.- 1998.- V. 17.-P. 1635-1644.

207. Wang J.Y., Frenzel K.E., Wen D., Falls D.L. Transmembrane neuregulins interact with LIM kinase 1, a cytoplasmic protein kinase implicated in development of visuospatial cognition // J. Biol. Chem.- 1998.-V. 273.- P. 20525-20534.

208. Watanabe N., Kato Т., Fujita A., Ishizaki Т., Narumiya S. Cooperation between mDial and ROCK in Rho-induced actin reorganization //Nat. Cell. Biol.- 1999.- V. 1.- P. 136-43.

209. Weber E.J., Levenson J.M., Sweat J.D. Molecular genetics of human cognition // Molecular Interventions.- 2002.- V. 2.- P. 376-391.

210. Weitzman J.B. Transcriptional territories in the genome // J Biol.-2002.- V. l.-N. 1.-P2.

211. Wimber D.E., Steffensen D.M. Localization of gene function // Annu. Rev. Genet.- 1973.- V. 7.- P. 205-223.

212. Xie Z., Johansen L.K., Gustafson A.M., Kasschau K.D., Lellis A.D., Zilberman D., Jacobsen S.E., Carrington J.C. Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants// PLoS Biol.- 2004.- V. 2,-N. 5.- P. 104.

213. Yang E.J., Yoon J.-H., Min D.S., Chung K.C. LIM kinase 1 activates cAMP-responsive element-binding protein during the neuronal differentiation of immortalized hippocampal progenitor cells //J. Biol. Chem.- 2004.- V. 279.- N. 10.- P. 8903-8910.

214. Yang H., Higuchi O., Ohashi K., Nagata K., Wada A., Kangawa K., Nishida E., Mizuno K. Cofilin phosphorylation by LIM kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization // Nature.- 1998.- V. 393.- P. 809-812.

215. Yang N., Mizuno K. Nuclear export of LIM-kinase 1, mediated by two Ieucine-rich nuclear-export signals within the PDZ domain // Biochem. J.- 1999.- V. 338.- P. 793-798.

216. Zegerman P., Canas В., Pappin D., Kouzarides T. Histone H3 lysine 4 methylation disrupts binding of nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) repressor complex // J. Biol. Chem.- 2002.- V. 277.- P. 1162111624.

217. Zhang R, Maksymowych A.B., Simpson L.L. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding human syntaxin 1A, a polypeptide essential for exocytosis // Gene.- 1995.- V. 159.- P. 293-294.

218. Zhao К., Wang W., Rando O.J., Xue Y., Swiderek K., Kuo A., Crabtree G.R. Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling// Cell.- 1998.- V. 95.- P. 625-36.

219. Zhimulev I.F. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation// Advances in Genetics.- 1998.- V. 37.- 566p.

220. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S. Intercalary heterochromatin and genetic silencing //BioEssays.- 2003.- V. 25.- P. 1040-1051.

221. Zhimulev I.F., Semeshin V.F., Kulichkov V.A., Belyaeva E.S. Intercalary heterochromatin in Drosophila. Localisation and general characteristics // Chromosoma.- 1982.- V. 87.- P. 197-228.

222. Talbert P.B., Henikoff S. Spreading of silent chromatinrinaction at a distance // Science.- 2004.- V. 303.- P. 672-676.1. Благодарности.

223. В заключении приношу глубокую благодарность моему руководителю дбн Е.В. Саватеевой-Поповой за предоставление темы исследования, многолетнюю помощь и поддержку на всех этапах работы.