Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОПТИМИЗАЦИОННЫЕ ПОДХОДЫ К УПРАВЛЕНИЮ ЧИСЛЕННОСТЬЮ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИИ В ПОЧВЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ОПТИМИЗАЦИОННЫЕ ПОДХОДЫ К УПРАВЛЕНИЮ ЧИСЛЕННОСТЬЮ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИИ В ПОЧВЕ"

й-жог

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ нменн М. В. ЛОМОНОСОВА

Факультет почвоведения

, На правах рукописи

ДОДЗИН Михаил Евгеньевич

УДК 615.33+631.41

ОПТИМИЗАЦИОННЫЕ ПОДХОДЫ К УПРАВЛЕНИЮ ЧИСЛЕННОСТЬЮ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ В ПОЧВЕ

03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1987

Работа выполнена на кафедре .биологии почв факультета Почвоведения Московского 'государственного университета . .имени М, В. Ломоносова, ■ ' Научный-руководитель—доктор биологических наук, профессор Д. Г. Звягинцев.

, Официальные оппоненты—доктор биологических наук, заведующий лабораторией Д. И. Никитин, кандидат биологических'наук, научный сотрудник В. А. Терехова.

Ведущая организацйя —Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева.

Защита состоится « » . . . . . 1987 го-

да в 15 час. ЗО'мин. на заседании Специализированного совета по микробиологии и агрохимии КО53.05.86 на факультете Почвоведения МГУ по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, факультет Почвоведения, аудитория М-2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета Почвоведения МГУ.'

Автореферат разослан <Л0» . . . 1987 года.

. Ученый секретарь Специализированного совета /2 //

Л И. П. Бабьевд.

Актуальность сабсти. Выдвинутая на ХХУН съезде КПСС стратегия экономического а социального развитая ставит перед микробиологами ряд неотложных задач, для рационального решения которых требуется экологическая ют^оркац.'гя, по э воля идея более дОДективно использовать имещиеся возможности управления конкретном я микроорганизмами в природных местообитаниях.

Лр:глером может служить проблема повышения урожая бобовых за ече? биологического азота. Чтобы увеличить эффективность применений бактериальны*! удобрения, следует, помимо прочего^ убедиться в наличия опт дальних решения по коятголм -попзлпакокно« пхотяости внесенных в яочзу нлубеньховздс бакте-. ряй. После длительного пребывания в:почве численность популяции кояет существенно снлтаться до уровня, недостаточаого для .инфицирования. При уране я:; я бактериальна одобрен:!?, такяе наблюдается значительное снижение титра клеток клубеньковых бактерий, что ведет к резному ухудяеииа хачесгвэ препарата. Актуальные представляется изучение принципиальней возмохаостп обе' спечекпя задзнаого обилия клубеньковше бактерий в почве к коне нту ня^ицпрозаш:я с покощь» оптаиизеционного подхода.

Примером другой» не ыеяее взжяоЛ задачи, монет служить проблема целенаправленного поиска а погиоения полноты выделения на почвы микроорганизмов с - заданная свойства«;), включая .дотенцтольнкх продуцентов еовьх антибиотиков. В последней случае важно разработать на экологической основе принципиально но . вые подходы, которые позволили бы максимально повысить э^ентя вяоеть пояска»

Цель работы состояла б поиске путей оптимизации численности или процесса рефляции численности ш как отдельных'представителе!'. комплекса почвеннш. микроорганизмов, так и искусственно внесенных популяций.

Основные задача исследования. .

Г. Изучение возможности повышения разнообразия выделяемых из почвы кикроорганиз«ов с заданными свойствеми с помощью микробной сукцессии- на примере актинсыицетов - потенциальных продуцентов антибиотиков.

2, Количественное описание зависимости обилия'в нестерильной почве изучаемой популяции клуСеньковкх бактерий от величии воздействующих факторов; прогнозирование популяционной динамики.

3. Проверка возмокности значительного повшеииа численности искусственно-внесенной в почву популяции"клубеньковых бактерий к определенному моменту времени на основе математического планирования эксперимента.

• рвучная новизна. Оптимизационный подход Сил впервые при- ■ пенен для управления микробными популяциями. в естественных условиях. Значительное увеличение полноты выделяемых из почвы микроорганизмов с заданными свойствами реализовано за счет инициирован ил микробной сукцессия. Поиск'а выделение искомых объектов кэ почвы осуществлялись с учетом их экологических стратегий.

. С помощью математического планирования эксперименте получено количественное описание зависимости обилия конкретной'

-Д-

штаиыовой популяции непосредственно в нестерильной почзе от воздействующих факторов, что позволяет прогнозировать событии.и управлять численностью микроорганизмов.

Впервые показано возможность существенного повышения К определенное коыенту времени в нестерильной почве численности различна микроорганизмов, включая как внесенные ■ популяции, так и представителей естественного комплекса. .

Практическая ценность. Предлагаемые оптимизационные, подходы когут быть использованы для повышения.э^октирности бактериальных удобрений, включая регуляцию численности клу-беньковюс бактерий э почве и в самом удобрении; а таете для решения проблемы поиска в природных местообитаниях объектов с заданным спектром свойств, в.честности, продуцентов новых .антибиотиков» '.

. Птбллкации. По теме диссертации опубликовано ^работы.

" Апробация работы. Оснозние положения работы доложены на конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Москва,;

1986), на Всесоюзной семинаре .'Методы направленного скрининга антибиотиков и других биологически активных веществ" (Цооква,

1987), а также на заседании кафедры биологии почв факультета Почвоведения ИГУ (ISS6).

Объем работы. Диссертация состоит извведения,_глав, заключения, - выводов,^Материалы диссертации изложены на J^t страницах машинописного текста, содержат рисунков, 35*. таблиц, списо« литературы из ИЗО. незваний (из них/йЗ - за-' рубежяые). .

ОБЬЕСШ И ЦЬТОДЦ ЕССЛЕДОБШН

Регуляцию численности различных цикроСных популяций осуществляя« непосредственно в природном иестообитании, а именно, в двух типах почв: дерново-лодзолистая слабоонуль-туреквая (Московская область), чернозем обыкновенный суглинистый на локровной суглинке (Вброкерская область). ' I. Оптимизаций численности акт'.и'^минетов с заданным спектром свойств.

Для инициации сукцессии почвенных акт^шоиицетов осуществляли два типа воздействия: I) увлажнение почвы до 60JS от otíuiefi ввагоемкости 2) увлажнение одновременное с внесением хитина я количестве IJ& от веса.почв». Чашки Петри с почвой помещали в зксмкатор и культивировали в течение 4; месяцев при коанатяоИ температуре и постоянной влажности. ' Выделение актияоиицетов производили неоднократно в течение Л месяцев: на 0-, ?-, 15-, 18-, 43-, 100-е сутки с коиента инициации сукцессии в перяозеые; на; 0-, 10-, 17-, 31-, ТО-, • 315-е сутки - в дерново-подзолистой почве; получали яо 3Q-35 иволятов в коядый срок. Все'выделенные актинойидеты были проверены на наличие антагонизма к набору тест-культур: Rhi-яоЫои 1 egumiaosarum шт. ZK из коллекции Латвийской сельскохозяйственной академии; Arthrobacter globlfoxeile

. шт.ВКИ-655; StaphylococexiB áureas шт.В1Ш-120; Vertió±1-

- ' •

Hum dahlia« шт.377 из коллекций отдела генетика хлопчатнике АН ТаджССР; Streptomycea olivocinereu» йт.ИЭЙ ИЗ коллекции кафедры микробиологии Биологического факультета. ИГУ; из коллекции кафедры биологии лочл факультета Почвоведе« и я ЮТ: Escherichia cali , Cbe«tonlum fértil* ШТ.2, Tu-earium eoleni вт.28. Относительное обилие актиноницетов с определенным.спектром антимикробного действия выражали в %■ от общей выборки на каждой этапе сукцессии;

Для оценки изменения разнообразия актиномицетов в ходе сукцессии рассчитывали индекс разнообразия по Шеннону:

- 1 - Z Уп *6Pn . \

■ 1в2

где Рп = ——■— ttn - до ля а от иномицет ов п-го

. класса. /

2. * ^Изучение взаимосвязи 'между численностью нопуляциа клубеньковые бактерий в почве и её ияЗкциртиксей активность».

. В дерново-подзолистую почву вносили.' популяцию ' клубеньковая бактерий ЙМгоМит legumlnosarum шт. гК в

-■ - ; 4 : * Q

диапазоне численности от 10 до 10 кл/r почвы, одновременно гисазигая s почву 2-дневные проростки гороха. Через месяц . * растения'.извлекали из почвы,' отмывали корни ^ подсчитывали общее-число клубеньков на каждом растении. Затем споиощью иккунофлуоресцентноЯ микроскопии . препаратов с материалом из ; '' раздавленньа клубеньков. определяли^ какие именно риэобии ин- . фацировзли растение (внесенный.втаим или спонтанные). Специ-фическу». сыворотку, полу чели, иммунизируя: кроликов культурой • ■ В,1 l«gwBi»o»airum .njT.ZK". По стандартной'методике (Хожсгин,

1976» Йбйгпйцей tt др. ,1980} готовили окрашенные препараты на 30 клубеньков для каждого' Урйвня внесения риэобий в поч-. ву. Долю клубеньйов» образованных данный штемиоа, рассчитывали исходя из данных о специфической свечении клеток. Одновременно определяли уровень стабилизации клубеньковых бактерия в моивнт извлечения растений из почвы, его зависимость ОТ ИСХОДНОГО урЙЕНЯ ПОПуЛЯЦИОННОЙ плотности. ..'■." 3. Регуляция численности клубеньковых бактерий в почве на основе методики матеьшткчддкдго планирования эксперимента'.

С целью регуляции численности клубеньковых бактерий в нестерильной почвь бсуиествляли следующие типы воздействия: внесение ЦгпЬчвУ гл»ко&Ы'(фактор ьоэдекствия Xj), стрептомицина (^^варьирование времени пребывания популядяи в почве после воздействий факторами Xj и Х2 (jCj). Возможность контроля численности Популяции научали как в кратковременных • (глюкозу и стрептомицин вносили в почву одновременно с клу-СенъКовыин бактериями), так и в долгосрочных (глюкозу и стрептомицин вносили в почву через месяц после клубеньковых бактерий) экспериментах* Образцы дерноро-подэояистой почвы и-

ЧерНОЗеиа« ИКОКУПИроВВЙНЫе ПОПуЛЯЦКеЙ Е. lef^uaiiiosariuii ит, ъ

в широком диаrteзоне исходного Обилия (10^- 10^ ьл/г почвы)» распределяли по чаткам Петри (20 г почвы/ чашку) -икультиви" ровала в эксикаторе при-лостоянной влажности и комнатной теЫ1 пературе. • •- :¡ ;''. ■ ; "... .

■За начало отечете в экспериментах принимали момент внесения в почву глюкозы и стрептомицина я дозах, обусловленных методикой математического'планирования эксперимента. В определенные моменты времени (Хз-сутки после воздействия) высевали почвенную суспезию на бобовый агар (БА). Выявление и учет популяции обеспечивались генетической маркировкой (стреп-юшщиноустойчивооть) и внесением стрептомицина я БА (1 г/л); кроме того, для подавления ва среде роста почвенных грибов . иоцольвовали кристаллический фиолетовый (2 мг/л среды). Перед посевом почвенную суспензию для десорбции микроорганизмов Обрабатывали на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН-1 (22 кГц; 0,4 А; 2 кинуты) (Звягинцев и др., 1980).

Процесс отыскания оптимального варианта воздействия,

• I .'. - • • ' - *

обеспечивающего максимальное повышение численности в почве Клубеньковых бактерий к заданному моменту времени, основанный- на математической планировании эксперимента* состоит из 2 ц'оцпанецтов; полного факторного эксперимента (П$Э) и "крутого восхождения" (Максимов; Федоров,136Э, Иаксавов,1981), ■ ПФЭ-2^ = реализации 2^=8 вариантов воздействия всеми ! еочетбйияич 3 факторов Х^),:каждый из которых Срала

Я8 2 урояняэг (ййянен и верхнем)-значений: Исходя из рерудьта^ то» отклика популяции на все 8 вариантов воздействия с?раитя ОЯ регрессионная модель, описывающая зависимость обилия 50= яудчцая'» почве'в конкретнее моменты времени от величин $езв действующих факторов. Представляется такая модель в форме уравнения регрессии следувиего вида:

+ В1гзХхХ2Х3) х ,

где У- численность клубеньковых бактерий; ХА - воздействующие ¡¡«кторк; ХЛ^ ~ зНект совместного действия (факторов; В1 -коэффициенты регрессии; рассчктътзе^ие по результатам П9Э. ■ ' . ■

"Крутое восходленне" является завершающим этапом оптимизация. В серии вариантов последовательно увеличиваются с определенным шагом дозы тех факторов, которое по уравнению регрессии оказывают положительный эффект, на численность популяции; уменьшаются дозы факторов, снкаешцх численность популяции. Величина шага рассчитывается по стандартной методике на основе результатов ПОЗ.

4, Проверка эТ^ектиттости "оптимальных" воздействий в уело- Ркнх вегетационного опыта.

В дерново-подзолистую почву вносили суспензию клубеньковых бактерий, а также раствор глюкозы и стрептоницине в опти-иальных по результатам "крутого восхождения" концентрациях. . Время высева в почву 2-дневних проростков гороха.выбирали таким образом, чтоби ожидаемый максимальный эффект,от воздействия пришелся на:4-6 сутки развития растения. Прослеживали по-, пуляционлу» динаиику клубеньковых бактерий во всех вариантах вегетационного опыте. Чере" месяц после высева гороха рзсте-ния извлекали из почвы, отмывали корни и подсчитывали "урожаи" в яаадом варионте {а-ассе надземной части растения) и среднее число клубеньков. 1 '

-В-

РЕЗУЛЬТАТА, . й С СЯ Е Д О В А Н И 'А И И X О Б С У Г Д Е Н й В

Оптимизация процесса выделения из почвы зктнношздетов см заданным спектоси антимикробных свойств...

При решении сакых разнообразных задач может возникать . необходимость в поиске и выделении из природных местообитаний микроорганизмов с заданными свойствами. . В частности, одна из .важнейших задач такого рода, которую следует решать на оптимизационной основе;- поиск и выделение из почвы актиноыице-, тов-продуцентов новых антибиотиков. Традиционно эта задача решается путем однократного анализа почвенных образцов. Производится разовое выделение, актинокицетов из большого числа образцов различных типов почв (Егоров,1979), с дальнейшей оптимизацией условий культивирования и состава селективных питательных* сред , Далее'изоляты анализируются на новизну: для тысяч выделенных объектов может быть реализовано до 130 '. тестов ( Кеая! ех, . ,1904). Очевидно, что'указанная про--

■ цедура предполагает огромный объем экспериментальной работы, она трудоемка.и весьма малоэффективна. Однократный анализ но. позволяет выявить всего разнообразия'прасутотвущих в каждом /образце искомых объектов, охватывается лишь относительно уз-' кая группа актв^омицетов, доминировавшая ъ почве в момент вы! "деления. " : V

Поскольку в ходе микробной сукцессии в почве происходит сыеаа дошширущ.сс популяций (Кохевив,Звягинцев, 1530), можно допытаться повысить.полноту выделения актиномицетов с помоцьс

сукцессионншс механизмов. Микробная сукцессия - закономерная смена доминирующих видов, следовательно, перестройка структуры акткномяцетного комплекса иояет происходить таким образов, что объекты о определенный спектром свойств будут выходить в относительные доминанты яа различных этапах сукцессии. -

.Выбор хитина в качестве воздействующего фактора связан с'-теи, что данный полимер считается одни и из основных пищевых , субстратов для актиномицетов. Поскольку микробная сукцессия после внесения в почву хитина продолжается 2-4 месяца (Звягинцев ,1 др.,1981), отбор иэолятоэ' производили неоднократно г райках этого временного интервала. -

Результаты указывают на существенное изменение во времени' структуры актиномицетного комплекса, оцениваемое по динамике относительного обилия антагонистов.х набору.тест-культур. Во всех вариантах относительное обилие актяноиицетов, подавляюща рост в. 1в«ияйпвввгим, было иакскиальныц на ?-10-е и 31-70-е сутки с момента воздействия на микробный комплеко почвы инициирующими сукцессию агентами; минимальным - на 17-18-а сутки, а также в исходных образцах аочвы (рисЛ). Иаксималь-

' ' - ' . ' - / щ ~ . ■

.нее количество антагонистов к г. во1ап1 ,~у. ¿алПав , 3> ♦ 0ц. чею1»»гвив отмечалось в исходных образцах дерново-подзолистой почвы (60-65£ от общей выборки акткномицетов) и к 31-м суткам о момента воздействия {50-7'^); минимальное же количество, как и в случае с ант агониетам ик К. 1«Ешп1аоваплп - к 17-ц суткам (10-30^). В то ке время, на 17-е сутки отмечалось увеличение по сравнению о исходным моментом относительного обилия внтаго-

-Ю- .

CJTHJI

сутки

7 10 15 17 18 ;. " 31 " 43 ..■

70 100 115 CJTKH

, Рае.I Динамика относительного обилия актиномицетов-антаго-НИСТОВ К A. globif oralis (I), Staphylococcus aureus (2),

P. s'olanl и v. dahlia* (3), LStrept<anycee elivocinereua .:'.' "... (4). E' leguminoaarum ; (5) в ходе сукцессии, инициированной . увлажнением дерново-аодэолистоп почвы ( •■), увлажнением с одновременным внесением хитина в деркою-п од зол истую почву "...{ А.) или.в чернозем ( а ). .'■ ' ^

1ШСТ0В К Л. glot>i forra le ИЗ. aureus для обоих вариантов сукцессии: 25-1% я I2-I8jS соответственно (рис.1). Однако, дименика относительного обилия ахтиномицетов.с.данным спектром антагонистических свойств выражена, не сталь явно, и не подвержена таким значительном колебаниям, какие били отме-. чены для рассмотренных ранее групп; Что касается актиноми-цетов, не проявлявших антагонистических свойств к изученно-,

в ходе сукцессии, инициированной увлажнением С— — —} или увлажнением ¡вместе с ^несением хитина (—.. —) в-: чернозем (• ) или в дернбво-подаолястую почву (V.).

на всех этапах сукцессии* било максимально на 17-16-е сутки в в черноземе и в де рн ов о-лод аол исто Я почве' (30-40%).

Итак, представленные р&зультаты указывают на динамический характер структуры актиномицетного комплекса, «а возможность

увеличения в ходе сукцессии полноты выделения объектов с опре--деленным'спектром антимикробных свойств. Наглядной иллюстрацией такихдинамических ..процессов служит заметное изменение на ■ различных »талах сукцессии значений индекса разнообразия по Шеннону (рис.2).

Из представленных результатов следует, что создание в среде условий определенного этапа сукцессия позволит повысить, .эффективность поиска продуцентов антибиотиков с конкретным : 'спектром действия. В нашей' работе это отчетливо проявилось для групп эктиномицетов со следующим спектром свойств! антагонизм ; широкого спектра действия (подавление-роста двух и более тест-культур); антагонизм узкого спектра действия против только од--. ; ной конкретной мишени; отсутствие антагонизма к'изученным тест-культурам* Такого уровня детализации оказалось достаточно для того, чтобы выявилось'значительное изменение в ходе сукцессии обилия актиномицетов с узкий спектром антимикробных свойств. Не удавалось выделить из исходных образцов дерново-подзолистой почвы антагонистов.узкого спектра действия против А. ..«юьи«-п!э , е иге из , 7. ао1ап1 * однако на 10-е сутки с ио-' мента увлажнения почвы рост данных тест- культур подавлялся * соответственно в, 12 и Щ> выделенных актиномицетов (табл.1). 'Актиномицетов с широким антимикробным спектром много на всех , этапах сукцессии, однако максимальное обилие отмечено на 31-е сутки с момента увлажнил дерново-подзолистой почвы - 72%, Аналогичные закономерности наблюдались в олучае-внесеная в дерново-подзолистую почву хитина.

Лишь 5%>ввделенншс из исходных образцов чернозема актино-

■■'.-■■ V. '■■■ -/з- '■ ■

Таблица I

Перестройка структуры актиномицетного комплекса в ходе сукцессии* инициированной увлажненной дерново-подзолистой почвы (относительное обилие актиноиицетлв » группах в ¡Е)

Группы '■'/ актквошщетов . : О ~ Сутки с иоиента воздействия 115

Актиномкцеты, не п роя в л пвдва антагонизма 12 га и . ■

Аитин^мицеты, подав ЛЯЮЩН® рост только л^ьгоьас^г е1о- в 3 ■ " - ■

аигеих ■ - - 12 ■ •> -

НМ»еЪ1ига . Хе£1т»1- -повагит 6 ■ . ■ '■г'--: II

Уое1пегеи5 - 13 ; 4 ; 9 з; ■„ 6 - б

11ае ■ 6 ;; 3 9 3

-V .'. 4 ■ :; - ■ 3

Акгиноиицеты- антагонисты к 2 и более тест-культурам 53 ■ 44 : - 44 ..'■ 72 : бз 59

Примечания: (-) - актиномкцетов-антагонвстоя данного

: .спектре действии ве обнаружено.

■■■'..■' Таблица 2.

Перестройка структуры актнномгцетного коиялексэ б ходе ; сукцессии, инициированной увлажнением и внесенней хитина в чернозем (относительное обилие е'ктивомицетов в группах в .

■ Группы акт/номицетов , 0 __ Сутки с момента воздействия ?~ I3~ ~I3 ~ ~ 43 100*

Актйноыицеты, ве проявляющие антаго-нивиа ■ ■ ■■ ■ ■ 25 ' 14: 42 w; : as 45

вктавошщеты, - - ■ подавляющие рост :■ только: ■■■'.. Staphylococcus aureus 10 ■ ■ 10 . 3 . . б.

fthlvebitm mifLas*run 5 36' 9 ' * V п 30

Escherichia coll 10 6 , 6 4 5

Vertlcillivm ' dfthiiee 20 • 's ■ -3.'. 6 ^ •

ChutomluK ■ ■ ' ■ ■ . ■■" -; . 3 15

яктиномицеты-антагонисты к двум и более тест-культура». 30- , ;35 - 34 38.. -■.56. 5

Примечания: (-) - актиноыуцеты-антагонвсты

, данного спектре действия яе

,''■"• обяарулены

ыицетов проявляли узкий антагонизм яоотяоюени» кв. 1в«и-minosarum ( югда как ужо на .7-е сутки с мокента иници-. . вции сукцессии увлажнением.и внесением хитина их доля в общей выборке составляла (табл.2). Это согласуется с ■даннынш'о наиболее и наименее благоприятных для клубеньковых бактерий этапах микробной сукцессии (Звягинцев и др., . •1981, Кочккка, 1981), '..Л

'Проведенный анализ изменения в структуре ектиношцетно- -го ким:meutа.позволяет считать перспективным выявление стэ-J ' дий сукцосоаи", оптимальных, для выделения' из почвы объектов с заданный спектром антимикробных свойств. Налицо принципиальная возможность оптимизации.процесса поиска продуцентов зн- ; тибиотиков различного спектра действия, Б условиях данного : эксперименте, например, заведомо малоэффективным представляет^ ,'ся поиск актиноиицетов, проявляющих узкий антагонизм к A, gio-bifomle , 3. » F. soi«ni в исходных образ-

цах дерново-подзолистой почвы ло сравнению с поиском на 16717-е сутки сукцессии. Аналогично, поиск продуцентов антибиотиков, подавляющих рост клубеньковых бактерий, будет наиболее эф^ек- '* тивенка Т?-е и IPt^-e сутки с. момента увлажнения и внесения хитина в чернозем в заданных условиях. ■ у "1;

Оптимизация контроля численности клубеньковых бактерий . в нестерильной почве на основе математического планирования эксперимента. ' : ' _--.л-

Известно, что обеспечение достаточно высокого уровня обилия клубеньковых бактерий к определенному моменту време-

ни в почве позволяет, при прочих равных условиях, ожидать большего эффекта от искусственной инокуляции (Доросинский, 1970, Пальто,1982). ;

Проверяли способность популяции ИЫгоЫит 1еецш1йоэлгит

ит.гк инфицировать горох в зависимости от уровня обилия в

почве, для чего вносили клубеньковые бактерия в дерново* о

подзолистую почву в широком диапазоне от 10 до 10° кл/г почвы, одновременно высаживая ¿-дневные проростки гороха. Использование ккмунофлуоресцентной микроскопии показало, что в условиях опыта инфицирование корней гороха даняьы штаммом при наличии спонтанных рязобий регистрируется начиная с уровня внесения кл/г почвы. С возрастанием уровня внесения до 10® кл/г почвы доля клубеньков, образованных внесенным штаммом, возрастала о 1-10% до 40%. .

Следовательно, для случая о низким уровнен внесения или стабилизации численности клубеньковых бактерий актуальны постановка а решение оптимизационной задачи. Для её решения осуществляли целенаправленное воздействие на популяцию 3-ий факторами; глюкоза (Х^), стрептомицин время <Х3).

Для повышения численности клубеньковых бактерий преде-' тавляют интерес различные воздействия, в том числе: внесение в почву легкодоступных мономеров (глюкоза); внерение полимеров (целлюлоза) для активации почвенных гидролитиков, что влечет за собой увеличение потока мономеров (КочкинаДожевий, Звягинцев,1981); введение в почву с аналогичной целью популяции гидролитика, особенно одновременно о полимером (Лиыарь я др.(198<0. При всей-значимости таких подходов, они не ставили целью полное решение оптимизационной задачи. В нааей работе

реиение этой проблемы осуаествдндось на основе математического планировании э.чоперимента, :

Для регуляции численности клубеньковых бактерЫ было ре™ . ■ ализовано—5-факторрое.воздействие. Стрептомицин выбрав как., фактор для дополнительного увеличения численности устойчивой к нему популяции клубеньковых бактерий за счес ожидаемого подавления роста почвенных конкурентов и антагонистов. Целесоо- ■-'; ^разность внесения в почву глюкозы отмечена выше. Что касается , знач;;аост<1 времени как фактора, то известно, что исход конкурент« ири пинцировании корней растения-хозяина решается в рамках сравнительно узкого временного интервала - первых 5-7-и , луток с момента высева проростков в почву (Васильева,1991,'Gep-hold, DaEEo ,1985). . Выяснение срока максимального эЗДекта дей-» ствия факторов Xj и ^'позволило бы так координировать вр^ия -воздействия и время высева в почв; бобового растения, чтобы ; кэкскиальное обилие клубеньковых бзятеряй приходилось на этап инфицирования растения. ; ■ "

Реализация воздействия на популяцию вдуфэньковых' бзктерий в соответствии с планом П.Ф£ позволила добиться значимого эффекта:- отмечали 48-кратное"увеличение численности ривобиД к 3-й . суткам с уровня-внесения IQ5 кл/г почЗД» 79-кретяое к 12>м су?« каи - с уровня, внесения 10* кл/г почвы ^ то же время,

в контрольных вариантах,без внесения гйЮйЬэы к стрептомицина, . отмечалось снижение численности популяции.сразу после вяеееняч .в почву. Следовательно, 'отмеченный эффект неслучаен и реализуй . . ется именно благодаря.внесению в почву ггекоэц и сурелтомицияч,

в определенных сочетаниях. : 1

: .

фахкшгээцкя гагхе&сЕвде. ва. ¡шушвд® в..1е£оп£поваги» , осуществляемого сразу после вве-*«кая бактерий в дерноза-аодасстгегу» псязу.

■ ■■ ■' Тик зксаердоеяхз

Исшуляционкан плотность ___та/г_почвм_____

до воздействия после воз. (уровень вкесе- действия на нив) - . ц-й сутки;

Величины факторов

иг/г почвы сутки

&У£ект от

воздействия

''¿2/А1

мз-г^

I) • 2хЮ3 ;"'.";.■ 95хЮ3

1,0- $,75 3

48

2)

Юч

79x10

1,0 9,75 '12-

79

: "Крутое восхождение"

10' 10 юг

,2 ■■'

.1,Н*ЯГ

М&Ю5 ^еохЮ5

2.5 . 7,50 9

2.6 ■ 9,90 2 0,5 9,70 13

..1140 Г460 1600

Примечания: уравнений регрессии для-двух.уровней внесения рвзобий* почву -I) У1= (37- 17Х2- 22К3- ПВДт 6К2Х3- х ХО3

- 2) У2= (20-1«!+ 812+.Ш3- ЗХ^- бХ^+ЮХ^- 7X^5)' х 10 ; - глюкоза, Х^ - стрептомицин,. . Х3 .г время

Рассчитанное по результатем.ВДЭ уравнение регрессии (тайл.1) дает количественное опасение зависимости обилия популяции от величин воздействущих факторов, «кспериыентальная проверка пою- . вала, что данная математическая модель позволяет.с достаточной степенью достоверности предсказывоть'отклвк популяции на.воздействие изученными фактораин-

Возможность прогноза популяционной динамики клубеньковых бактерий - важныйяо не единственный результат постановки П1>Э. Исходл ка 'зпачениИ коэффициентов регрессии определяли план реализации 2-го' эч'апа оптимизационного эксперимента - "крутого восхождения", цельа которого являлось отыскание оптимальных'в условиях опыта вариантов воздействия.

Уровень внесения клубеньковых бактерий в дерново-подзолкс-ту» почву был столь низок.(менее 10 кл/г почва), что методом посева популяция не учитывалась. Однако, за 2 суток обилие возрастало на 3 порядна, "до 1,1-1,6хЮ5кл/г почвы (табл.3),'.т.е.-. до уровня, способного обеспечить инфицирование бобового растения исследуемым итакмом; найденные оптимальные сочетания ректоров воздействия позволили, таким образом,добиться 1100-1600-кратного эффекта.:

■Эффективный оказалось применение математического планпро- . ванип эксперимента и при оптимизации численности рмзобий^ "дли- ; тельно, до момента воздействия в течение месяца'находивиихся в дерново-подзолистой почве. Оптимальные варианты воздействия тонн же факторами.позволили достичь'765-кратного'возрастания чис-' пенаости популяции с уровня стабилизации численности 10^- кл/г. почвы, 5000-краткого - с уровня менее 10. кл/г почвы (табл.4).

'Таблица Ч

Оптимизация воздействия на популяцию й.1«ршЬ1сг,агит , осуществляемого через кеенц после внесения клубеньковых бактерий в дерново-подзолкстуа почву.

Тип эксперимента Полуляциокная плотность кл/г лочви до воздействия после воэ-(уровень стаби- действия на ЛИЗБдня) . Х3-Н сутки . А1 . кг Величина Акторов Ь *г Ц . кг/г почвк сутки ' Щтт от воздев* СТЕИЯ

ПУс-г5 ■ ВТхЮ5 1,00 9,75 12 87

1С3 ' 1731Ю3 1,00 9,75 "в 173 ■

ю3 ■ 254хЮ3 4,00 9,75 12 гьч

"Крутое восхождение" га4 - .290x10* 765x10* 2,65 2,70 9,20 9,80 12 13 290 765

102 ■ 500хЮ2 2,55 8,15 .10 - 500

Ю2 50001Ю2 --- 2,65 9,45' 12 5000

Приечанте: уравнение регрессии ииеег следующий.вид-

У= (91+ 5Х1+ 37Х2+ 48Х3- 7X^2+ 37ХхХ3+ ЮХ^ 'МОД^У х Ю3 ,

где Х^- глюкоза, З^- стрелтоввцин, Ху время

В контроле без внесений глюкозы к стрептомицина никакого положительного эффекта не наблюдакось, .наоборот, численность популяция снижалась еще более.

На фоне эффектов, полученных благодаря постановке IU3 и "крутого восхождения", малоэффективным выглядит реализованное ' нами з эксперименте воздёйствне Акторами, положительное действие которых известно из литературы: внесение в дерново-псд-золистую почву хитина (10 ьт/г почвы) или же целлюлоза (Ю аг/г почвы) oüccr.t'üiBano не более чем б-кратное увеличение обилия клубеньковых бактерий с уровня стабилизации Ю^-ГО* кл/г почвы на протяжении 10 суток с момента;воздействия. Именно мате- , магическое планирование эксперимента поззолето.найти те сочетания факторов-воэдействия, которые дают максимальный аффект^ и, следовательно, решить поставленную оптимизационную задачу. !

Проведенные опыты убедительно показали возможность макса-' низацяк обилия малочисленной популяции'на'строго математической основе..Способность-клубеньковых бактерий, относимых к группе микроорганизмов с- г-сгратегаей,~ к "и ог.у ляд конному взрыву" при наличии легкодоступных элементов питания, отмеча- ' лась и ранее (Кочкляа ,1981, Кожеэ;;в,19В5). Однако, достижение " максиыальаого эффекта к возможность; его прогнозирования, особенно непосредственно в нестерильной почве,.ранее не были pea-, лизованы. Иежду i ем/это очень важно.с практической точки зрения, при наличии в почве на недостаточном для^инфицирования уровне активных спонтанных клубеньковых" бактерий., • ■ ' ' ■-■.

йффекгавность найденных оптимальных сочетаний факторов "' ' проверяли в вегетационном опыте. В дсрново-подзолистую почву

одновременно вносили глюкозу, стрспто«ка:;н и популяцию н. и1позагив> , после чего высаживали проростки гороха. На 13-е сутки с моыенха воздействия численность риаобий »проела до

с '2 6

2^5x10 кл/г почвы с уровня менее 10 .кл/г почвы, до 1,6x10, кл/г почву - с уровня 7,5x10 ял/г почвы; имел место соответ-; ственно 2500- к 2270-кратяцй эффект, В то ке время,-в контроле отмечалось не более чем 6-кратпое увеличение обилия клубеньковых бактерий во всех,вариантах..Число клубеньков, сформировавшихся иа корнях гороха, в вариантах с внесением в почву факторов и Х^ достоверно выше, чей в контроле. """ Отдельный интерес представляет возможность оптимизации (максимизации) численности клубеньковых бактерий с достаточно высокого исходного уровня. С этой цель» осуществляли воздействие на популяцию, обилие которой составляло 10^-10^ кл/г почвы, сразу после внесений в чернозем, а-также после достижения уровг яя стабилизации. В обоих случаях был достигнут положительные! ре ' зультат:. найденные оптимальные варианты воздействия обеспечивали 57-кратное увеличение численности с уровня внесения ДО** кл/г почвы,:Х50-кратнов - с уровня стабилизации 6x10 кл/г почвы, то ■гда как в контроле обилие популяции не возрастало.

£ Итак, с применением математического планирования эксперимента показана возможность оптимизации.к определенному моменту времени численности популяции клубеньковых бактерий, независимо от исходного обилия и от длительности пребывания-в почве.

.выводы.

1. Доказана принципиальная возможность оптшлзац;;к процесса управления численностью определенных микроорганизмов в нестерильной почве. Решены задачи по максимизации численности как.. -' для внесенных, в почву популяций (клубеньковые бактерии)« так

п для представителей естественного комплекса (актиномнцеты). .

2. Инициация сукцессии приводит к перестройке структуры комплекса почвенных актиномкцетов, прослеживаемой по динамике от-носигольного обилия группировок с различным спектром антимикробных свойств и по изменению индекса разнообразия. Установле- . но» что неоднократное выделение объектов в ходе сукцессии поз-, волям более.полно охарактеризовать качественное разнообразие . микроорганизмов по сравнений с'традиционной процедурой анализа. 3» Еодаззно, что суеествунт стадии сукцессии, иначе моменты времени, наиболее благоприятные для выявления объектов с заданными свойствами. В условиях эксперимента максимальное.количество антагонистов к л. 1ееитШозагии1 отмечается на 7-10-е сут-кя, к А. еХоыгогг^1е я э. ашгеиз - на 10-17-е сутки сукцессии. 4. Математическое планирование эксперимента позволяет прогнозировать динамику а найти оптимальные варианты воздействия для максимизации численности штаммовой популяция в. 1евшй1«оза1?шп

к определенному моменту времена. Удается на 2-3 порядка увеличивать обилие клубеньковых бактерий сразу-после их внесения в почву, а также о уровня стабилизации после длительного пребыв ни я ■ клеток в почве. : -■

По материалам диссертации опубликованы следующие работы;

1. Управление численностью клубеньковых бактерий в природном местообитании, — В сб. «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных кулътур>, —Вильнюс, 19S6, с. 106.

2. Оптимизационные л ад ходы к управлению численностью микроорганизмов в почве. — Тезисы конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве»,— Москва, 1986. с. 53. ,

3. О возможности управления численностью клубеньковых бактерий & природном местообитании (соавт, Полянская Л. М.). — Вестник МГУ. Сер. почвовед.,— 19S6. № 4. с. 69—71. ' .

4. Оптимизация процесса выделения из почвы микроорганизмов с антагонистическими свойствами (соавт. Звягинцев Д, Г., Полянская Л. М.).— Тезисы конференции «МГУ — Главмикробиопром», — Москва, 1986, с. 27.

Л-55525 Э/П-87 г. ' Объем 1'/з п. л. Зак. 507. Тир. 100

. Типография Московской с.-х. академии им. К. А, Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44

Бесплатно