Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ограниченный протеолиз пролактина в секреторных гранулах из аденогипофиза крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ограниченный протеолиз пролактина в секреторных гранулах из аденогипофиза крысы"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО РАЗРАБОТКЕ И ВНЕДРЕНИЮ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА ТАТЬЯНА ВИЛЕНОВНА

УДК ЪП.№-(о<2.ЧЬЪ.ОШ

ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ ПРОЛАКТИНА В СЕКРЕТОРНЫХ ГРАНУЛАХ ИЗ АДЕНОГИПОФИЗА КРЫСЫ.

03 . 00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Институте &спериментальной кардиологии ВКНЦ АШ СССР, в СП "Константа" в в Научном центре по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики N3 СССР.

Научный;руководитель: доктор медицинских наук В .А. Виноградов.

Официальные оппоненты: доктор биолргических наук, зав. -сектором "Обмен белков" МЖ II МОЛШИ им Н.И. Пирогова М.Й. Савина.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института экспериментальной эндокринологии и химии гормонов Кеда ЮЛ!.

Ведущая организация: Институт иммунологии МЗ СССР.

Защита состоится Ч/У 1990 г. в м/2?,г<%эсов

на заседании специализированного Совета К 074.51.01 при Научном центре по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики МЗ СССР по адресу: Симферопольский бул., д. 8.

С диссертацией мовдо ознакомиться в библиотеке Научного центра по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики МЗ СССР.

Автореферат разослан хээо г.

Ученый секретарь специализированного Совета

кандидат биологических наук Отраднова

ШШ ХАРАКТЕРИСТИКА РДБОШ

Актуальность работа. Белково-пептидные гормоны являются пож^нк-циональными гормонами я обладают широким спектром биологической активности. В последние годы их рассматривают как.прогормовы, которые активируются после биосинтеза в результате посттрансдя-ционаого модифицирования и протеолиза с образованием множественных форы в фрагментов, ответственных за разнообразие биологических эффектов гормонов ( l»wi» 4 1984 ; Mittra , 1384 ). Посттрансляционный процессинг, как процесс биоактивации гормона, начинается в аппарате Гольдзи и секреторных гранулах эндокринной железы и продолжается в крови и на периферии при взаимодействии о рецепторами органов-мишеней.

Многочисленные работы посвящены посттрансляционному процес-сингу пептидных гормонов - дшпотропана, адренокортикотропного гормона, меланоцитстимулирувдего гормона, вазопрессина, окситоцина

(Mains , 1983; J»CMon, 19ß0 ; Steiner, jgg)

Сравнительно мало изучены в этом отношении высокомолекулярные белковые гормоны, в том числе - пролактин (ЛТГ) • ЛГГ встречается в сыворотке крови и в экстрактах аденогипофиза человека и аивот-ных в виде различных форм и нескольких фрагментов. Однако до сих пор неясно, в каких клеточных органеллах происходит модифицирование и протеолиз гормона и какие ферменты участвуют в этом процессе. Кроме того, не идентифицированы пептидные связи, атакуемые ферментами.

Одним из подходов к решению этих вопросов яелястся изучение форм, в виде которых пролактин запасается и хранится в секреторных гранулах, а такае исследование протеолитическсй активности гранулярной фракции. Кроне того, представляет интерес изучение структуры и биологический скрининг пептидов как содержащихся в интактных гранулах, так и образованпвхся в результате протеолиза при инкубировании содержимого грянул. Выяснение ¿тих.вопросов

важно как в теоретическом плане, тай и с практической точка зрения, так как показано, что фрагменты гормонов, образующиеся в результате процессанга, могут обладать Измененным спектром биологической. активности, а часто и новыми свойствами, вв. свойственными исходной молекуле( ми»« , 1983 В работе использовались секреторные гранулы, порченные из аденогипофязов какйН2актяых, так и астрогенизированных животных. Введение эстрогенов проводилось для стимуляции нротеолитической активности. Пель и задачи исследования: Целью работы являлось исследование возможности протекания в секреторных гранулах, содержание ЛГГ, ограниченного сротеояиза гормона.

В работе решались следующие основные задачи:

1. Выделение и характеристика ЛТГ-содержэдих гранул ив аденоги-пофизов интактных и эстрогенизированных крыс.

2. Изучение форм пролактина и пеггГидов, содержащихся в сегфетор-ных гранулах.

3* Исследование нротеолитической активности гранулярной фракции. 4. Изучение фазико-хишческих и биологических свойств шотидов« образующихся в результате протеолиза в гранулах.

Научная новизна: С псысщья шщуноблоттинга впервые показано наличие в интактных секреторных гранулах фрагментов пролактина о молекулярной массой 17 и 12 {Да и высокомолевудярдой формы 4) вДа. Сочетанием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии в радиоиммунологического анализа в секреторных гранула! обнаружены шшунореактиЕные формы гормона (з а случае эстрогена-гированных животных и 6 в случае интактных ) . С псысщьв синтетических субстратов в гранулярной фракяии найдена и охарактеризована аыинопептидазная активность. Методом электрофореза в поди-Бкриламидноы геле впервые показано присутствие в гранулярной фракция пролактЕН-преврацаэдей нротеолитической активности.

Активность максимальна при рН 3,9 и 6,2. С помацыо ингибиторного анализа показано, что в ограничением протеолазе ЛТГ в гранулярной фракции при рй 3,5 участвует аспарталъная протеиназа. Выделен а охарактеризован низкомолекуляряый пептид, выцепляемый этой протеиназой.

Научно-практическая ценность радеть*; Биолог-лчэский скркшшг нового пептида обнаружил его способность увеличивать концентрацию про-лактина в сыворотке крови крыс при многократном его введения и снижать ее при однократном. Пептид 'увеличивал концентрацию прогестерона в крови при однократном введении и снижал цри ьшогократ-ногл. Зти свойства, а такае легкость синтеза пептида делают перспективным создание па его основа нового лекарственного препарату гормонального действия.

Апробация работы: Материалы диссертации были доложены на Всероссийской конференции "Олигопептиды, как регуляторы функшй организма" Москва, 1987 г.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы.

Объем и структура диссертации: Основной текст изложен на 148 страницах машинописи. Диссертация состоит из введения,. обзора литературы, главы "Материалы и иетоды", 4 глав, посвященных экспериментальным исследованиям и их обсуждении, общего заключения я выводов. Библиографический указатель содержит отечественных а зарубемшх источников. Диссертация илластрировша 21 таблицей и 3? рисунками.

г

ШШ1АШ И МЕТОДЫ В экспериментах использовали лабораторных животных - крыс линии Вистар, содержащихся при контролируемом режиме освещения (14 ч свет, в ч темнота) . Масса тела животных, их возраст и пол, а такие характер воздействий указаны в соответствуют!! разделах "Результатов".

В•качестве основных методов исследования использовали ультра-дентриЗугирование (для выделения ЛТГ-содеряэдих секреторных гранул гипофиза) ; электрофорез в полиакриламидном геле, гель-хро-матографио и обращенно-фазовую хроматографию, радиоиммунологический метод (для анализа чистоты, изучения множественных форы ЛТГ. исследования протеолитической активности гранулярной фракции ) • Для сценки содержания в сыворотке крови других гормонов использовались стандартные наборы дли Шк. Белок в пробах определили методом SedMaK в) ai ( 1377 ). Нротеолнтическую активность определяли по Скорости расщепления синтетических субстратов 1-лвйцил-Е-нитроанндида, м-бензоил-1-тирозид-л-нитроанилида, н-бензоил-о». -п-нитроанилида при jfl 3,9» 6,2г 5,0 » 7,2, 7t8 ( Giynbaum Аминокислотная последовательность выделенного пептида была определена о помощью газофазного секвенатора белков модели 4Ю А» работающего в режиме on lin* с анализатором ФГГ аминокислот модели И) А, кдл. Егоровым Ц.А. (институт общей генетики Ж СССР) . Пептид был синтезирован по классическому методу шйш» белка в растворе к л: л. Пеке лисом Б» (ШЗЦ ¿Ш СССР ) • Электрона ошщроско пическое исследование грану ляршх франций было выполнено на микроскопе yem ВО к.6.нв Соловьевой 1LB. (институт общей реаниматологии АМН СССР) . % деградации ШГ оценивали .по уменьшению площади пика мономера гормона из денситограммы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И СБСУЩНИЕ

Выделение и характеристика секреторных грант д. содержащих ЛТГ из аденогипофиза интактннх и эстрогенизированных крыс.

ЛТГ-содержащие секреторные гранулы выделяли из аденогипофизов интактных и эстрогенизированных самок крыс по методу Zar.ini (1Э73), Яспользуя дифференциальное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (рис* I). Метод основан на использования высокой от&Зильности гранул пролактина. При их выделении наиболее трудно удаляемой примесью является примесь секреторных гранул гормона роста. Использование инкубирования грубой, гранулярной фракция о пуромицином при 37°С и высокой ионной силе приводило к лизису гранул гормона роста и разрушению ыеиЗраноснязанных рибосом, близких по плотности к секреторным гранулам пролактина. Последующее

овста гоногенрт

1200а ,10 кии

супер 1 ос,к

| 150000о,Э1> НИН

Г~1

|СУПЕР 2 ОСАДОК

инкубация

190000а ,135 иян

Рис. I . Схема фракционирования аденогипофизов крысы.

центрифугирование в градиенте плотности сахарозы позволило отделить фравдию секреторных гранул ЛТГ от свободных рибосом в разрушенных гранул гормона роста. Из полученных 5 зон в дальнейшей работе использовали зону 3, содеряадую гранулы про лак-тина,

Электронномикроскопяческое исследование гранулярных фракций показало, что он? практически не содержат митохондрий, лизосоы ж других посторонних клеточных органелл (рис» 2 . Фракция, полученная вэ аденогипо^азов ннтактных лсивоттх, состоит из грану л, нмеюцнх округлую ели овальную форм? (рис. 2 а), мелкие гранулы (ВОнм^), заполненные веществом очень высокой электронной плотности, преобладают в данной фракции, кроме того, содержатся крупные грануяы(бОО-ЯЮ нм) с менее йлектронноплотнш содержимым, с электроннсплстными участками на периферии матрикса, характерными только для'ЛГ-содеряацих гранул (' Коми го р 1987)*

Рис« 2«. Электронные фотография ЛГ-содзт^яци* г-ресул гакоф!эав порченных ог кятактаыж яивотнш: (слева) „ о-т готгрогенйзЕройаяных (справа) в Увеличение ФОООХо Окразшвадло иг &,с, е

Стрелками показаны злектропяоцлотнке зчгкези аа поверхности гранул»

[о форме а размеру гранулы, близка к описанным в литературе Л1Г-¡одержщим гранулам гипофиза крысы (модами т зэбз} -!ак вядно из рис. 2 б„ эстрогеназация приводят к изменению формы [ уменьшении диаметра секреторных гранул.

Из-за высокой стабильности гранул нам не удалось мягко и восп-юизводимо дизировать микроколачества гранул, гомогенизируя их ра 1Я 7-8. Поэтому для облегчения лизиса гранулы инкубировали 10лоброле РХ, который,, как показано ( 2апЫ ЗЭТЭ),

астворяет мембрану гранул л облегчает лизис содержимого. Поденную суспензию, содерадяую гранулы и мембраны, использовали ¡о всех экспериментах.

При электрофорезе содержимого гранул в полиакриламидном еле в неденатурирущих условиях обнаруживался один доминирующий омпонент, данций по данным иммунопрецапиташш перекрестную реайда с антисывороткой к пролактину крысы. Часть иммунореактивного ещества остается на старте а, вероятно, соответствует агрегиро-анному ШТ, либо ЛГГ, связанному с мемЗраной.

При электрофорезе в градиенте пористости геля от 5 до в рисутствии ДДС-натрия преобладающий компонент гранул интактных 'рас. 3 а) и эстрогенизированных (рис. 3 б]) совпадал по аодваж-ости с шсокоочпщенным препарате^ ЛТГ быка (рис» 3 в]) и ШГ в эмогенате гипофиза крысы (рис. 3 г) и соответствовал молекулярной ассе 25 вДа. Содержание мономера ЛТГ, рассчитанное из денситог-аммы, составляло 43% для секреторных гранул, полученных от ш-зктних животных, и 8$ -.от эстрогенизированных животных. Содер-зние гормона роста, рассчитанное из денситограмми, составляло знее Таким образом, проведенные наш исследования показывают, го Л1Т является основным белковым компонентом гранул, что согла-гется с литературными данными гапМ в» а1 , .

а 1Г в г д е Рио. 3. Электрофорез в ПЛАТ с ДЦС-натрия. а - гранулы от интактных крыс ^2) мкг белка")а б - гранулы от эстрогенизированных крыс (ЗЭ мкг белк^, в - 33 мкг ЛТГ быка0 г - экстракт 4/5 гипофиза крысы, д - гранулы от интактных крыс (хю мкг белк^, в - сза-детели. Все образпу растворены в буфер© Ягммлч.

Множественные формы пролактияа в секреторных гранулах»

Множественные формы ЛТГ изучали несхолькиш методами г гель-, хроматографией, обраценно-фазовой хроматографией в сочетании с РИА, ДЦС-электрофорезом а иммуноблоттингом.

Эдектрофоретическое исследование показало, что кроме мономера ЛТГ в гранулах как интактных, так к эстрогенизированных крысс наблюдается свыше XI минорных белковых компонентов с молекулярной, массой от 43 до 3X3 |Да и некоторое количество низкомолекуларных компонентов от £) до 21 кДа (рис. 3 д). Во йракпии з были обнаружены компоненты с молекулярной массой К, Г7 вДа я следовые количества 18 в 23' ?Да. Содержание пептидов составляло около б£ от общей площади окрашенных пиков в гедз.

Иммунореактивные формы ШТ в гранулах были охарактеризованы методсм иммуноперокеадазяого окрашивания после' аазктродереноса

беляов аз ПААГ на натродедлолозную ыемЗрану. Каи видно из рис. 4, антиеыворотка к иролактану крысы выявляет 4 компонента: доминя-руиций, отвечавдий молекулярной массе 25 ВДа, и 3 минорных, соот-ветствуацих молекулярным массам «СГ, Г7-18 и 12 кДа. Наличие фрагментов ИТ в секреторных гранулах позволяет предположить, что ограниченный протеолиз пролактина начинается уже в аппарате Годьд-

гранулах.

Рис. 4. Злектропэренос белков на НЦ мембрану после электрофореза в ПААГ с ДДС-яатрия. а - грану лы после переноса на НЦ мембрану (амидочерный D Б) , б - гранулы после переноса на НЦ мемЗрану (иммунопероксидазное ■ окрашивание) (схема) , в - свидетели -

При гель-офоматографаи гранулярной фракции из гипофизов лимитных а эстрогенизированннх крыс, растворенных в буфере, содержацем ДДС-натрия, обнаруживаются наряду с мономером высокомолекулярные иммунореактивные формы горлона (рис. 5 а). Эстрогенизацая приводит к возрастанию-количества высокомолекулярных форм. После инкубирования секреторных гранул в буфере, содержащем 2,5 М мочевину, при гель-хроматографии доминировал иммунореактивный пик, соответствующий мономеру гормона - 25 кДа (ряс. 5 б). Кз полученных данных можно предположить, что ЛТГ хранится в секреторных гранулах гипофизов крыс в виде мономера и высокомолекулярных форм, стабилизированных в основном гидрофобными ила водородными связями.

аи, либо идет в салах секреторных

78 К 56 К

45 К

30 к

Ш< Г7'2 К 12,3 К

Рис. 5. Гелъ-хроматогра фая гранулярной фракции яэ гипофизов интактных крыс аа колонке Т8К 2000 . Внесено СО шг белка. Элвент ш »М нат ри£ фосфатный буфер ра 7,2, содержаний0»1 М хлорид натрия» Скорость 0,5 ыд/мин» Схолбикаш отмечена нш^нореактив-ность фракций. Стрелка указывают время глазирования маркерных белков.

а - гранулы растворяли в 0,05 Ы трио-НС1 буфере рН 6,8, содержащем 3& ДДС-аатрияр.

б - гранулы инкубировали при комнатной температуре в течение 3 *зас в Ш Ш натрий фосфатном буфере» содержаце* М мочевину.

При обращенно-фазовой хроматографии лазата гранулярной фракция, полученной от интактных крыс, было обнаружено 6 пиков змму норе активного ШТ, а в случае эстрогенизированных - 3 иммунореактивных пика ([рис. 6 а-б} » Доминировал пик, соответствующий мономеру.» Полученные с помсщыз обраценно-фазовой зроматографии данные указывают на присутствие в гранулярных фракциях нескольких форы Ш\ различающихся лнпофильностью и молекулярной массой»

Ограниченный протеолиз пролактина в секреторных гранулах.

Используя синтетические субстраты в широком диапазоне рН, мы не обнаружили во фракциях секреторных гранул трипсиноподобной а химотрипсиноподобной активности. Однако мы нашли во фракции ЛЗГ-содержащих гранул аданопептидазную активность. Активность била обнаружена с помощью синтетического субстрата I -лейцин-п-нитро-анилида при {й 6,2 н 7,8 и была максимальной при рН 7,2-7*5. Енгн-биторный анализ показал, что обнаруженная аминодаптидаза является ыетаплозависикнм ферментом, чувствительным к лейпелтияу и ингибитору тиоловых протеиназ. Данный фермент отличается от описанных ранее аминопептидаз гипофиза. Роль его в секреторных ЛТГ-содержащих гранулах пока не ясна.

Для выявления ЛТГ-превращаюцей протеолитической активности суспензию гранул, предварительно обработанных любролем, инкубировала при различных рН в течение 4 час ери 37°С. Ход процесса контролировали с помощью электрофореза в присутствии ДЦС-натрия (рис. Ч). В случае эстрогенизированных адвотных интенсивный протеолиз пролактина наблюдается при 3,9 и 6,2. В дальнейшей работе мы ограничились изучением протеолиза гормона при рН 3,9 (^деградации - 7]Г) . При этом образуются фрагменты с молекулярной массой 17, 12 и около 3) кДа и наблюдается уменьшение интенсивности полосы 25 вДа, соответствующей мономеру ЖГ. Иммуноблоттинг показал, что пептиды Г7 и 12 ВДа дают перекрестную

ром показан профиль градиента концентрации метанола в 0, $ Т&7» Скорость I мл/ти. Столбиками отмечена яммунореактивность фракций. Стрелкой указано место элюирования стандартного препарата ЛТГ крысы, а. Гранулы из гипофизов интактных крыс5 внесено 1Ш

Pao. 7. Денситограшй анодной части подиакрилэмидного геля после электрофореза в присутствии НДС-натрия. Внесено 23 икр белка' гранул» инкубированных при 37°с в течение 4 чао при различных р0: а - 3,9, б - 5,0, в - 6", 2, г - 7,2. Д - "¡V8» е - неинкубировашшй образец гранул.

реакцгю с акта сывороткой к ШТ крысы. ЛЗТ-преврачакцая активность наблвдается а в гранулярной фракций, выделенной из гипофизов нн-.тактных животных, однако в этом случае протеолиз менее интенсивен

деградации - 65) .

Исследование кинетики протеолнза при рН 3,9 (рис. 8) показало, что в течение первых 2х часов инкубации происходит нарастание содержания в основном 17 вДа фрагмента. Далее по мере инкубирования йабдвдаотея увеличение содержания Б и 12 кДа фрагментов как за счет мономера цролактша, так и 17 кДе фрагмента. Несмотря на значительное уменьшение количества мономера аосле длительной инкубации (J8 час) , часть его остается неизменной ^рис. 8 в]), можно предположить, что в протеолиз вовлекаются не все вариантные формы пролактана. Через 18 час инкубации наблюдается, кроме того, снижение общего содержания белково-пептидного материала. В описанных экспериментах электрофорез проводила в восстанавливавших условиях.

На рис. 9 приведены данные электрофоретического исследования, проведенного в невосстанавливгшцих условиях. ЛЕГ в этих условиях

Рис. 8. Денситогршш анодной .часта полиаврилааодного геля пооле электрофореза в присутствии ДДС-натрия. Внесено по 2) икр белка гранул в буфере Лэммда. а - неинкубированные гранулы» б,в,г,д,е( а - гранулы, инкубированные при ф 3,9 пра.37°С в течение 1,2.4» 6,,18 и 33 час* соответственно.

Рис. 9. Денсатограшн анодной части полиакрилемидного гедн после электрофореза в црисутствш ДДС-аатаая,. Внесено ?,<кг оолка» а - грану лы„ растворенные в буфере Лэшлн, б - грачу да, раедатрм?-нне в буфере без 2-меркаптозтанола, в - яграну.ш, НЕгуу'ировахзшз при рй 3,9 в течение 4 час, растворенные в буфере Лгмьда, г - гранулы, инкубированные при $ 3,9 в течение 4 час, растворенные в буфере без 2-^ерпаптоэтанола.

обнаруживается в виде 2х компонентов 23 и 25 кЦа рис. 9 6 , что объясняется информационными изменения«® молекулы гормона (Меиг|9 ¡а а1 , 1983 ). Видно, что инкубирование гранулярной фракции в кислой среде приводит к исчезновению полосы 23 1Да интактного ШГ и усилению полосы 25 кДа (рис. 9 г). Образование фрагментов наблюдается в значительно меньшей степе га, чем после восстановления 2-МЗ. йз этих данных ионно заключить, что инкубирование ведет К образованию расщепленной формы пролактина с -гидролизом пептидной связи в пределах большой дисульфида ой петли. В невосстанавливающих условиях расщепленная форма практически не отличается по подвиг® о ста от интактного ЛТГ. После восстановления 2-МЭ эта форма образует фрагменты и таким образом отделяется от интактного гормона(мшга • ,158]) .

Таким образом, приведенные в этом раздела данные указывают на присутствие ЛТГ-превращавдей протеолитической актишостя з высоко-очищенных фракциях ДТГ-содераацях гранул гипофиза, участвующей в образовании при рН 3,9 расщепленной формы и фрагментов с молекулярной массой 17, 12 и около Б кЦа.

Для характеристики обнаруженных в гранулярной фракции протеиназ, расщепдивдих пролактин, мы использовала ряд ингибиторов (рис. в). Как видно аз денсятограмм, лейдептш, РСМВ ж 1-ацетамид не оказывают ингибирущего действия, тогда как пепстатиз А полностью ивги-бирует цротеолиз. Хлорохая, фзнантролпп и ШЗр частично и избирательно Енгибяруят образование фрагмента с молекулярной ?лассон 17 кЦа» Ингибиторпгй анализ ппппзэл, что ЛТР-преврачащая активность обладает свойствам аспартильннх ,протежаз9 "цвстзательна зонам металлов и ннггбвтору сграневых протейная. По ангибиторному щгафа-лп Е по оитшгуку рН ЛГГ-преврл'дадая активность близка у. ЛК'-фраг-кектярукщей активности, паЗдеонсй в ашзосогдальной ©акции простаты

(Создр4ап а! , 198-0 •

4

6

в

г

л

Е

Рис. 23 • Ленсвтограты анодной части ПААГ посла электрофореза в присутствии ДДС-натрия. Внесено по 23 мкг белка. Гранулы инкубированы при 3,9 в течение 4 час в присутствии различных ингибиторов: А - без ингибиторов, Б - I мМ ГМБР , В - 2 ММ лейпептин, Г-1Ш 'пепстатин А, Д - 130 мяМ хлорохин, Е - I Ш фенантролин, 2 - I ММ 1-ацетамид, 3 - I Ш РШ.

Протеолиз пролактина в секреторных гранулах изучали методой гель-хроматографии после обработки 2.5 М мочевиной; Как видно аз рис. II, по мере протекания протеолиза происходит возрастание пептидного шка (в) , соответствующего молекулярной массе 18 цЦа, появление плеча Сг) солевого пика и одновременное снижение пика мономера гормона (б) . Кроме того, наблодается увеличение количества веществ, сильно удерживающихся на колонке (е) . Через 18 час шкубасти отмечается уменьшение общего количества белка, набдэдаэ— мое ранее методом электрофореза, что ыогно объяснить агрегацией продуктов протеолиза. Небольшая величина пептидного пика (в) по сравнению с картиной электрофореза, набвдапцейся в восстанавливаю-

щихся у слотах (рис. 4 г а 9 в) указывает на образование в основном растепленной формы гормона, совпадающей по времени выхода о

Для исследования образующихся при протеолизе фрагментов использовался, метод сбрзцешо-фазовой хроматографии» Из рис. 12 ведно,, что инкубироваяяе в кислой среде приводит к образованна нескольких паков оптической плотности, максимальный аз которых элотруется после 33 мин. одновременно уменьшается основной пик оптической плотности, соответствующий пролактину. В случае зстро-генЕзировашых животных нротеолиз более интенсивен (рис. 12 б}. Образующийся пептгд очищали окончательно на колонке Ачигроге

кв-гоо-.

С помощью секрйпатора была идентифицирована аминокислотная

пиком мономера пролактина (Б, рис. II)

Рис. II. Гель-хроматография гранулярной фракции на колонке Т5К 3300. Образцы инкубировала пра кошатной температуре в течение 3 ч в буфере с 2» 5 М мочевиной (-исходная фракция,

(—^ фракция посла инкубирования прй- 1Н 3,9 в течение 4 ча ,

барованкя при 3,9 в течение 18 час. Внесено ГО ?жг белка.

Рис. 12.

ВЗНХ гранулярной фракции на колонке /<■ Уь-мраз. С 18. Внесено БО мкг белка. Пунктиром показан профиль градиента концентрации метанола в 0Г]% Т<£7,. Скорость элоировандя I мл/мин. Звездочкой оплечен пик пептида, стрелкой - место эдаирования стандартного препарата ЛТГ крысы. Столбиками показана иммунореактивность фракций- а. Гранулы из гипофизов интактных щшс, инкубировашше при

1Й 3,9 в течение 4 час,-б. Гранулы из гипофизов эст-рогеназированных крыс, инкубированные при рй 3,9 в течение 4 час.

последовательность выделенного пептида: Уш-УаЬТгр . . сравнение со структурой ЛТГ крысы показывает,, что эта последовательность совпадает с участком 146-148 молекулы ЛТГ крысы (си па , 2ЭШ) • Можно предположить, что эндопептидаза, присутствующая в гранулярной фракция, выщепляет пептид, гидролизуя молекулу ЛГ по связям Туг |45~^ ^ и Тгр г 149« В этом случае специфичность

действия фермента не противоречат участию в ограниченном протеолизе ЛТГ аспартальноЗ протеолатической активности« Действительно, исследование,, проведенное на колонке /г-Уегаарасл С^д показало, что после инкубирования гранул в присутствии пепстатина А на хрдаа-тограмме не детектируется пак, отвечапций пептиду, т.е. пепстатин полностью ангибирует выцепленае пептида.

Несмотря на то, что пептид совпадает с участки» аминокислотной последовательности ЛТГ крысы, некоторые экспериментальные данные трудно объяснить вщепленнем пептида из молекула ЛТГ- Так, добавление к инкубационной смеси экзогенного ЛТГ крысы не вызывало прироста пака трипептйда. Кроме того, исследование дннашка образования пептида (риз. 13^) показало, что спустя 8 час нвкубацпл при рН 3,9 шк пептвда достигает максимума а не изменяется при дальнейшей инкубации не смотря на то0 что значительная часть Д1Г р-ВДР,. сохраняется.

Рис» 13 » Зависимость высоты пика пептида' от времени инкубепгш етзи 1« 3,9.

Кроме того, расчет показывает,, что из I мг белка грану л (4 нмодь ЛТг) внцепляется только 75 пмоль пептида в случае гранул от интакг-них крыс и 3© пмоль - при использовании эстрогеназированных животных, т.е. количество выцеплящегося пептида составляет менее Ъ% от общего количества ЛЕГ гранул.' Таким образом химическая природа предшественника Сеч-«а(-Тгр пока не ясна.

Можно допустить две альтернативные возможности: 1 - пептид вы-щепляется из примеси какого-либо другого гормона или белка, присутствующего в гранулярной фракции и 2 - в ферментативную реа1<вда вовлекается одна из присутствующих в секреторных гранулах изоформ самого пролактина.. Анализ банка аминокислотных последовательностей белков показал, что последовательность 1еи-уа!-т>р достаточно уникальна и отсутствует в структуре других гормонов гипофиза и ах предшественников. Что касается второго предположения, то известно, что посттранслядаонные модификации молекулы белка могут изменять

ее конформацшо и тем самым влиять на доступность связей, атакуемш

£

цротешгазащ(и*иге е\ г1, хэвз) • В пользу этого предположения говорит тот факт, что выцепление пептида полностью ингибируется анта а короткой против содержимого секреторных гранул и лишь частично ингибируется антисывороткой против высокоочищенного препарата пролактина крысы.

'Биологический скрининг пептида ии-УаНГгр

Как известно, больиинство эффектов пролактина связано с репродуктивной функцией. Предполагая, что трипептод выщепляется из пролактина, мы предприняли скрининговое исследование его пролак-тино-подобного действия. Исследовалось его влияние на секрецию гормонов гипофиза (ЛГ, ЛТГ, СП?) , половых стероидных гормонов (ьстрадиол, прогестерон, тестостерон) , гормонов щитовидной (Тд и Т^} , поджелудочной (вн сулил) желез и надпочечников (альдостерон)

Наиболее важным представлялось исследовать влияние-пептида при однократном и многократном 5-ти дневном введении его в/б, на секрецию пролактина в циркуляцию у самцов и самок крыс, а также на продукцию прогестерона яичниками крыс.

При однократном введении пептида самкам крыс с массой тела 130-140 г использовала дозу В мкг/кг. Контрольной группе вводили в/б равный обьем физиологического раствора. Кровь у животных контрольной н опытной групп собирала через 3), 60 а 120 минут после введения. Как видно из рис. 14 , пептид снижает содержание пролактина в сыворотке кродя самок, начиная с 60 глину га после введения» и увеличивает концентрацию прогестерона (рис. 14 б) в сыворотке крови по сравнению с контролем на 3} а 60 минутах после введения. (Результаты РВД обработаны отатистически с использованием теста Стьюдента) .

Рис о 14 » Содеряание гормонов в сыворотке крови после однократного введения пептида в дозе В мкг/кг о а - пролактин, б - прогестерон. (—) контрольная группа, С - Д опытная группа.

I»«тспга Ь V У

,<«.01 к».«"

В случае 5-ти дневного введения пептида в/б самцам и самкам крыс •с' массой тела 133-140 г использовались дозы В, ЮО и 1X30 ыкг/кг. Как видно из рис. 15, у самцов и самок крыс набиздалось достоверное увеличение концентрации цролактина в сыворотке крови на дозе I) акт/кг. При 5-ти дневном введении пептид понижал содержание прогестерона в дозах Б и 1X30 мкг/кг у самцов и самок (рис. 15) .

Результаты опытов показывают, что в случае однократного введения пептид имитирует лютеотропное действие пролактина на продукцию прогестерона яичниками, а в случае многократного введения - лютео-литическое действие гормона на желтые тела. Лгатеолитическое и лютеотропное действия пептида были подтверждены опытами на модели ложной беременности у крыс.

Выявлено стймулируыцее действие пептида на секрецию альдосте-рона, характерное для пролактина. Предварительные опыты не выя-

Зак. оф-848-90

- га

вяля значительного е-иякия пептида па секрешиз других исследованных гормонов.

Результату» полученные в настоящем исследовании, говорят о тем, что при инкубировании высокоочищеяпой гранулярной фракции in

vil го наблодается ограниченный ирстеояиз лролактдаа о образованием расщепанной формы и нескольких фрагментов. По специфичности действия я оптимуму тЯ обнаруженная нами ЛТГ-гшоврдайХПая активность оказалась близка к ЯТГ-фрагментнрухщек активности, найденной в лизосомальной фракции простаты (СомрЮп г>{ а! ,, 3984)* Это указывает на зозмоаность яизосшального пути актлваим про-лактипа. Опубликован ряд данных, свидетельстцущих об участач ляаосомалвша пентвдаз s генерации биологячесян активных пептидов

rx предшественников как з сргайе, ароду дарующей гога«о:;с ?ап Е 5?а периферий ГАзаряя Д., 1987$ 1*о»с- ai «« 4 I3£7 í- OOehMt* 9» al „ 19S4_) » В случае секреторных гранул показана возможность miz á¡yse3i ise5o непосредственная упаковка лиаосогладь?шх т'отен-яаз ала ях аредаегЛЕенняков s секреторных rpaay та«, /£бп •ахокдениа в них яр« сяиапчч п .«изосоиа&я С Bochen«» «t ¡>t » 1384). Неизвестно, какой аз зутей реализуется э гоогактте-'/овриздциг еекрегсрнвх гранулах*

Различные гаряапгнке форгл; гормона,, ебгярулеьште яес-гл « earpeTogim лравуда«^ адг^т, то-взвасгсзд зддогь греиз$ичепт:п оуй(Зтратакй„ ггнерпздаккя ея.ззчаш?ес:я gparusaw

ДсЭсткатсльнс,, ввдожкний на»-® аз жиаубкроеашгой г-рапулкртси фраксий тоасекгад совпадает по структурь а ^чаетко^ последовательности колокола ЛЕГ крысы, обладает блоляячвсжсИ адгар-зосгсл.*

ЙШЮЧЕНИЕ

О

ишгарущей некоторые функции самого пролактина, во не ввдеплк-ется из экзогенного гормона.

ВЫВОДЫ

1. Методом ишуноблоттинга в пролактин-содерздщих гранулах гипофиза впервые обнаружены, врсые основной, вариантные формы гормона с молекулярной массой 40, 17 к 12 лДа.

2. С помощью синтетических субстратов в пролактан-ссщержедих гранулах найдена лейвднаминопептидазнак активность о оптимумом Р0 7,2-7,5.

3. Показано, что в секреторных гранулах, инкубированных in

vitro , происходит ограниченный протеолиз гориона о образованием расщепленной формы и фрагментов с молекулярной массой 17, 12 и около D кДа.

4. Установлено, что ограниченный протеолаз пролактина обусловлен наличием в секреторных гранулах пролактин-преврещдацеп аспарталь-ной протеолитической активности.

5. Из гранулярной фракции, инкубированной цри 1Я 3,9, выделен пептид uu-VaFTrp , совпадающий с последовательностью I4&-I48 молекулы пролактина крысы.

6. В опытах ín vivo на крысах выявлено дотеотропное и дотео-латическое действия пептида, а также его стимулирующее влияние на секрецию альдостерона.

СПИСОК РАБОТе ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Кузнецова Т.В., Твденко В .А»? Нагорная Я.В», Кривошеев О.Г., Кравцов Виноградов Ограниченный яротеояиз пролактана

в секреторных гранулах из гипофиза эстрогвнязированных 1фыо. -Бнохимия, 19878 г. 52« выпуск ?р о. ШЭ-1215.

2. Кузнецова Т.В., Тищенко В.А., Нагорная Я.З. Процессжнг пролактана в секреторных грану лаз. - В материалах Всероссийской конференции "Ожсопентидн, как регуляторы функция организма Н. 1987» раздел Клинической медицины, о. 88-84®