Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование комплекса при взаимодействии церулоплазмина и лактоферрина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Образование комплекса при взаимодействии церулоплазмина и лактоферрина"

На правах рукописи

Пулина Мария Олеговна

ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСА ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА И ЛАКТОФЕРРИНА.

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики

ГУ Научно-исследовательский Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Васильев Вадим Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Денисенко Александр Дорофеевич доктор биологических наук Янковский Олег Юлианович

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

ч

Защита состоится » уЬуИ/ь* 2004 г. в о/ часов на заседании

диссертационного совета Д001.022.03 Научно-исследовательского института

экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376 Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского Института экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Пучкова Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Белок-белковые взаимодействия (ББВ) лежат в основе многих жизненно важных процессов. Образование белковых комплексов важно для формирования активных центров олигомерных ферментов, регуляции систем клеточного метаболизма, передачи сигнала в клетку, формирования клеточных контактов, транспорта электронов, взаимодействия антигена с антителом, синтеза и фолдинга белка, построения внутриклеточных структур и многого другого. К настоящему времени обнаружено и изучено большое количество ББВ с разнообразными функциональными и структурными особенностями и энергетическими принципами.

Комплексы белков приобретают новые свойства по сравнению с мономерами. Исследования особенностей существующих ББВ и поиск новых белков, образующих комплексы, вероятно, помогут глубже проникнуть в природу белковых комплексов. Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия церулоплазмина (ЦП) -медьсодержащего белка плазмы крови, и лактоферрина (ЛФ) - трансферрина молока.

ЛФ - один из белков острой фазы воспаления, поступающий в русло крови из вторичных гранул нейтрофилов. Он участвует в обмене железа, обладает антибактериальными, иммуномодулирующими, противоопухолевыми свойствами. Этот белок широко представлен в клеточно-тканевых образованиях организма млекопитающих: он выявлен в большинстве барьерных эпителиев пищеварительного, респираторного и мочеполового трактов и их секретах, а также в экзокринных железах и их секретах. Широкий спектр функций ЛФ во многом определяется его способностью специфически связывать ионы железа и некоторых других металлов переходной группы. Многофункциональность ЛФ можно объяснить его способностью взаимодействовать с другими веществами. ЛФ человека взаимодействует с некоторыми секреторными белками — казеином, а-лактальбумином, секреторным иммуноглобулином А, лизоцимом, с альбумином сыворотки крови, с внутриклеточным белком - кальмодулином и с бактериальными белками [Heckman, 1971; Watanaba et al, 1984; Sawatski, 1987; De Lillo et al, 1992]. ЛФ коровьего молока обладает сродством к некоторым другим белкам молочной сыворотки [Lampreave et al., 1990], а также к специфическим последовательностям ДНК [Не and Furmanski, 1995]. Аргининовый кластер, расположенный в N-концевой части молекулы ЛФ,

участвует в связывании ДНК, бактериальных липополисахаридов (ЛПС) и гепарина [Van Berkeley/., 1997].

Церулоплазмин (ЦП), медьсодержащий белок плазмы крови, проявляя ферроксидазную активность, принимает участие в метаболизме железа, что обеспечивает встраивание Fe+3 в апо-трансферрины. Другие функции ЦП связаны с участием в транспорте меди и окислительными процессами, в которых он выступает как антиоксидант. Работами последних лет показано, что ЦП также приобретает новые функции, взаимодействуя с рядом других белков. Например, конкурируя с факторами свертывания крови (ФСК) FV и FVIII за связывание с протеином С, ЦП может участвовать в регуляции коагуляции [Walker and Fay, 1990]. Взаимодействие ЦП с миелопероксидазой (МПО) может иметь значение для регуляции ее опасных прооксидантных свойств [Segelmark et al, 1997; Park et al., 2000]. Взаимодействие ЦП с ферритином необходимо для полноценного встраивания Fe3+ в ферритин [Reily and Aust, 1997; Juan and Aust, 1998]. Изучая взаимодействие ЦП с другими белками, можно получить представление о его новых функциональных свойствах.

В свете сказанного представляется актуальным исследование особенностей взаимодействия ЦП и ЛФ и возможности образования комплекса ЦП/ЛФ. Такой комплекс мог бы служить примером ББВ двух многофункциональных металлопротеинов. Изучение ассоциации-диссоциации ЦП и ЛФ, а также структурных особенностей комплекса позволит выявить условия его формирования и возможную роль in vivo. Совместное присутствие этих белков в пограничных к инфекции тканях говорит о том, что их комплекс может играть роль в формировании неспецифической резистентности организма. Железосодержащий ЛФ и медьсодержащий ЦП являются ключевыми звеньями метаболизма двух важных для организма микроэлементов. Изучение их взаимодействия, приводящего к формированию комплекса ЦП/ЛФ, позволит пролить свет на неизвестные стороны регуляции обмена металлов в норме и при ряде патологических состояний.

Цель и задачи исследования.

Целью представленной работы явилось выяснение условий, приводящих к образованию комплекса ЦП/ЛФ, и определение некоторых его физико-химических характеристик. Для ее достижения были поставлены следующие задачи: 1) Показать возможность образования комплекса ЦП/ЛФ in vitro и in vivo.

2) Определить стехиометрическое соотношение молекул белков в составе комплекса.

3) Изучить условия диссоциации комплекса ЦП/ЛФ и определить константу диссоциации при физиологических значениях рН и концентрации NaCl.

4) Оценить избирательность взаимодействия ЛФ и ЦП.

5) Изучить условия, при которых происходит переход ионов меди из ЦП в ЛФ

6) Исследовать возможность влияния ЛФ на ферментативную (ферроксидазную) активность ЦП.

Новизна работы.

В работе впервые показано прямое взаимодействие ЦП и ЛФ, определены основные характеристики этого взаимодействия и свойства специфического комплекса ЦП/ЛФ, что позволяет высказать гипотезу о его физиологической роли. Практическая значимость работы. В данной работе охарактеризован комплекс между двумя избирательно реагирующими друг с другом металлопротеинами, участвующими в реакциях острой фазы воспаления. Исследование ББВ на примере столь физиологически значимых металлопротеинов, как ЦП и ЛФ, может пролить свет на роль этого феномена в сложных обменных процессах (в первую очередь связанных с метаболизмом металлов) в норме и при патологии. Глубокое изучение воспалительных реакций, способов их регуляции и побочных процессов, вызываемых очаговым воспалением, позволит найти новые подходы к терапевтической коррекции многих заболеваний, сопровождающихся воспалительным процессом инфекционной и неинфекционной природы. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Доказано существование комплекса ЦП/ЛФ in vitro и in vivo, произведена оценка избирательности взаимодействия ЦП и ЛФ.

2. Определена стехиометрия комплекса ЦП/ЛФ, а также условия его диссоциации и константа диссоциации при физиологических значениях рН и концентрации NaCl.

3. Выявлены условия, способствующие переходу ионов меди из ЦП в ЛФ.

4. Показано, что ферроксидазная активность ЦП возрастает в присутствии ЛФ. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на ежегодных научно-технических конференциях «Неделя науки СПбГТУ», Санкт-Петербург, 1998-2000 гг.; научной конференции, посвященной 110-летию Института Экспериментальной медицины,

Санкт-Петербург, 2000 г.; на IV и VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2001 и 2003 гг.; на 12-ой Европейской конференции студентов, Берлин, 2001 г.; на 7-ом Международном симпозиуме «Ионы металлов в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 2002 г.; на III съезде Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 2002; и на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2004.

Основное содержание диссертации опубликовано в 2х научных статьях и тезисах докладов.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 104 страницах и содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов» и «Выводы». Работа содержит 23 рисунка и 1 таблицу. Список литературы содержит 142 работы на русском и английском языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования были выделены апо-ЛФ (из грудного молока первого месяца лактации) и ЦП (из плазмы крови человека). Часть полученного апо-ЛФ была насыщена ионами железа и меди. ЛФ коровы, свиньи и овцы, а также катепсин G и эластаза из нейтрофилов человека были любезно предоставлены сотрудниками Отдела общей патологии НИИЭМ.

За исключением особо оговоренных случаев в работе применяли 10 мМ фосфатный буфер (Na2HPO4, NaH2PO4), рН=7,4 с добавлением 0,15 М NaCl, который далее обозначается как PBS (phosphate-buffered saline).

Экстракт нейтрофильных лейкоцитов получали из кровяной клеточной массы, вначале осаждая центрифугированием лейкоцитарную фракцию, затем лизируя лейкоциты и выделяя из них секреторные гранулы. После повторной процедуры замораживания/оттаивания содержимое гранул выходило в раствор и использовалось для выделения ЛФ.

Очищенные белки и их смесь анализировали методами гель-фильтрации на Сефакриле S-300, электрофореза (ЭФ) в ПААГ в неденатурирующих условиях [Davis, 1964] и в присутствии SDS [Laemmli, 1970].

Специфическую оксидазную активность ЦП в ПААГ выявляли путем окрашивания гелей раствором о-дианизидина [Owen, 1980]. Количественную оценку оксидазной активности ЦП получали по методу Рэйвина [Ravin, 1956].

Для исследования комплекса ЦП/ЛФ с помощью иммуноэлектрофореза [Weeke, 1977] и иммуноэлектродиффузии [Grabar et Williams, 1953] были получены моновалентные кроличьи антитела (AT) к ЦП и ЛФ [Zakharova et al., 1983]. Для изучения сродства белков методом аффинной хроматографии ЦП либо Ре2-ЛФ иммобилизовали на BrCN-активированной Сефарозе 4В в колонках небольшого объема (0,5-2 мл). Раствор ЛФ (или ЦП), содержащий 2-5 мг белка в PBS, наносили на колонку и элюировали 0,3 М NaCl в PBS. Моделирование комплекса in vivo проводили на самцах белых крыс. В хвостовую вену крысы вводили 10 мг очищенного ЛФ человека и через 0,5, 1, 2, 3, 4 и 5 часов, отбирали образцы крови для анализа методами ЭФ и иммуноэлектрофореза.

Перенос ионов меди из ЦП в металлосвязывающие сайты апо-ЛФ регистрировали спектрофотометрически. Все растворы предварительно пропускали через Хелекс-100 для удаления непрочно связанных ионов металлов.

Окисление ЦП под действием Н2О2 проволили в фосфатном буфере с рН 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 и 7,4, содержавшем 0,15 M NaCl. Основные эксперименты проводили, используя 10 мМ Н2О2 и инкубируя пробы в течение 5 часов. По окончании реакции пробы анализировали методом ЭФ и измеряли в них оксидазную активность ЦП.

Хемилюминесценцию измеряли на автоматическом люминометре. Конечная концентрация люминола в пробах была Ю^М. Измерения проводились при 37° С.

Спектры кругового дихроизма (КД) в ближней УФ-области регистрировали при 20° С. Концентрация белков в пробах составляла 5 мкМ.

Ферроксидазную активность ЦП определяли по модифицированной методике [Pousset et al., 2001]. Проба содержала 0,45 мг ЦП и различные количества ЛФ (0; 0,45 и 0,9 мг) в 2,5 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера рН 6,0. Реакцию проводили при 20 °С. Содержание Fe3+ в пробах определяли по оптической плотности при 450 нм, измеренной против смеси со спонтанно окисленным железом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Образование комплекса ЦП/ЛФ in vitro и in vivo.

Взаимодействие ЦП и ЛФ человека впервые обнаружено методом ЭФ в ПААГ с окраской о-дианизидином (Рис. 1 А, дорожки 1 и 2). При добавлении ЛФ к сыворотке крови электрофоретическая зона, обладающая оксидазной активностью, расположена выше предыдущей, то есть ЦП приобретал меньшую подвижность. Аналогичный опыт повторили с чистыми препаратами ЛФ и ЦП. Результаты ЭФ показали, что оба белка в смеси движутся иначе, чем по отдельности: подвижность ЦП снижается, как и в предыдущем опыте, и такую же подвижность приобретает ЛФ, который в чистом виде едва входит в гель (Рис. 1 А, дорожки 3-5). Таким образом, при ЭФ смеси ЦП и ЛФ наблюдается единственная белковая зона, соответствующая комплексу ЦП/ЛФ. Денатурирующий ЭФ смеси ЦП и ЛФ нарушает их взаимодействие - белки мигрируют отдельно друг от друга (рисунок не приводится).

А В

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 _V, мл_

♦ ЦП • ЛФ А ЦП + ЛФ

Рис. 1. А Неденатурирующий ЭФ в ПААГ 5 мкл сыворотки крови (1), 5 мкл сыворотки крови + 2,5 мкг ЛФ (2), 2 мкг ЦП (3), 2 мкг ЦП+ 2,5 мкг ЛФ (4) и 2,5 мкг ЛФ (5). Окраска о-дианизидином (1,2) и Кумасси К-250 (3-5). В Гель-фильтрация ЦП, ЛФ и смеси ЦП и ЛФ на Сефакриле 8-300.

Для изучения возможности образования комплекса ЦП/ЛФ в нейтральной среде проводили гель-фильтрацию на Сефакриле S-ЗОО в PBS. На колонку наносили образцы ЦП (1 мг), ЛФ (1 мг) и их смеси (1 мг ЦП + 0,6 мг ЛФ). При совместном нанесении ЦП и ЛФ происходило образование комплекса, который выходил в меньшем объеме (59,2 мл), чем ЛФ (71,7 мл) или ЦП (61,7 мл) (Рис. 1 В). Молекулярные массы ЦП, ЛФ и комплекса оценены, соответственно, как 140,3 ±9,7 кД; 75,8 ± 4,5 кД и 205,4 ± 18,1 кД.

Проведенные эксперименты впервые показали, что ЛФ и ЦП человека образуют комплекс in vitro как в щелочных условиях (рН 8,3), так и при физиологических солевых концентрациях и значениях рН.

Мы предположили, что ЛФ и ЦП, полученные от разных видов млекопитающих, могут взаимодействовать, поскольку из литературы было известно, что гомология первичной структуры между ЛФ-ми различных видов животных составляет ~70% [Baker, 1994] и почти столь же велико сходство между ЦП разных видов [Ryden, 1984; Harris et al., 1997]. К сыворотке крови человека, крысы, кролика и мыши добавляли очищенные препараты ЛФ человека, свиньи, коровы и овцы, и все полученные смеси анализировали методом неденатурирующего ЭФ в ПААГ с окраской о-дианизидином. Во всех комбинациях белков происходило снижение подвижности ЦП в результате добавления ЛФ, хотя исходные подвижности ЦП разных животных и новые подвижности комплексов для различных пар ЦП и ЛФ заметно отличались друг от друга. По-видимому, ЦП и ЛФ разных видов животных образуют между собой гетерогенные комплексы, а значит взаимодействие ЦП/ЛФ не является видоспецифичным.

В следующем опыте мы наблюдали образование гетерогенного комплекса между ЦП крысы и ЛФ человека in vivo, а именно - в русле крови крыс при внутривенном введении им ЛФ. ЦП крысы и человека в высокой степени гомологичны: по результатам клонирования соответствующих кДНК, гомология между аминокислотными последовательностями ЦП человека и крысы достигает 93% [Harris et al., 1997]. После инъекции 3 мг препарата ЛФ человека у крыс брали кровь через определенные промежутки времени. На Рис. 2А представлен результат иммуноэлектрофореза образцов сыворотки крови крысы в агарозе (AT к ЛФ человека). Через 5 часов ЛФ почти полностью элиминируется из русла крови. ЭФ этих

же образцов показал, что ЛФ человека образует комплекс с ЦП крысы, существенно снижая подвижность последнего в пробах, взятых не позднее 3 часов после инъекции (Рис. 2 В, 1-4). Со временем эта новая зона исчезает, и возрастает интенсивность зоны, характерной для свободного ЦП (Рис. 2 В, 4-7).

Рис. 2. А Иммуноэлектрофорез сыворотки крови крыс после внутривенной инъекции ЛФ человека. В пробах 1-6 содержится по 5 мкл препаратов сыворотки, взятых через 30 мин, 1, 2, 3, 4 и 5 часов после инъекции. В Неденатурирующий электрофорез в ПААГ тех же образцов (1-6) и очищенного ЦП крысы (7). Окраска о-дианизидином.

ЛФ избирательно взаимодействовал с ЦП, несмотря на присутствие других сывороточных белков в плазме крови крыс. Элиминация ЛФ из русла крови крысы в течение 5 часов происходила одновременно с исчезновением в ПААГ комплекса ЦП крысы/ЛФ человека. Ранее мы показали, что in vitro комплекс довольно стабилен и может храниться при +4° более двух суток. Скорее всего, исчезновение комплекса из кровотока животных вызвано уменьшением в их крови количества введенного ЛФ.

Стехиометрическое соотношение комплекса ЦП/ЛФ.

Стехиометрическое соотношение комплекса ЦП/ЛФ изучали методом ЭФ в ПААГ. К одинаковым количествам ЦП (2 мкг) или сыворотки (5 мкл) добавляли ЛФ, начиная с эквимолярного количества (1,2 мкг) и увеличивая его вдвое на каждом шаге, и проводили ЭФ этих препаратов.

Смешивание чистых ЦП и ЛФ в эквимолярных количествах приводило к появлению дополнительной зоны, мигрировавшей медленнее, чем зона ЦП. Обе зоны имели оксидазную активность. При молярном соотношении ЛФ:ЦП, равном 2:1, весь ЦП приобретал подвижность комплекса. Дальнейшее увеличение количества ЛФ приводило к появлению еще двух зон ретардации ЦП: первая находилась на границе раздела концентрирующего и разделяющего гелей, она появлялась при восьмикратном

избытке ЛФ; вторая - в середине концентрирующего геля - хорошо видна при соотношении 64ЛФ:ЩП.

Видимо, оптимальное стехиометрическое соотношение молекул в составе комплекса составляет 2ЛФ:ЩП, однако, дополнительные молекулы ЛФ способны ассоциироваться с комплексом ЦП/ЛФ, причем эта ассоциация происходит ступенчато — следующая зона подвижности возникает только когда соотношение ЛФ:ЦП равняется 8:1 или 64:1. Пока концентрация ЛФ не достигла порогового значения, наблюдается «размывание» исходной зоны, вероятно, вызванное нестехиометрическим связыванием ЛФ с предварительно сформировавшимся комплексом. Появление дополнительных зон ретардации при нарастании количества ЛФ можно объяснить его склонностью к самоассоциации, в частности - к тетрамеризации [Беппй & а1., 1981].

Результаты гель-фильтрации позволяют оценить стехиометрию комплекса в нейтральной среде, когда белки взаимодействуют в соотношении 1:1.

Условия разобщения комплекса ЦП/ЛФ.

В предварительных экспериментах мы выяснили, что хотя ЛФ, нанесенный на колонку с ЦП-Сефарозой, взаимодействовал с носителем, ЦП при тех же условиях не взаимодействовал с ЛФ-Сефарозой. Возможно, это происходило потому, что богатые аргинином участки поверхности ЛФ, через которые он связывался с Сефарозой, важны для образования комплекса ЦП/ЛФ. Однако после ограниченного протеолиза ЦП приобретал способность сорбироваться на ЛФ-Сефарозе.

ЛФ, связанный с ЦП-Сефарозой, диссоциировал из комплекса под действием: 300 мМ №01, 75 мМ ЭДТА, 50 мМ СаС12. Влияние рН на взаимодействие ЦП и ЛФ изучали, пропуская через колонку, на которой сорбирован ЛФ, буферы с уменьшающимися значениями рН (от 9,4 до 3,0). Эффективное разобщение комплекса происходило при рН=4,7. Вероятней всего взаимодействие ЦП (р1 = 4,5) и ЛФ (р1 = 8,6) имеет ионную природу, поскольку оно эффективно разобщается при повышении ионной силы, и при снижении рН элюирующего раствора. Гидрофобные агенты (5% этанол, 50 % этиленгликоль и 1% Тритон Х-100) не вызывали эффективной десорбции ЛФ. Температура также существенно не влияла на взаимодействие ЦП и ЛФ, что говорит о второстепенной роли гидрофобных сил при образовании комплекса.

Диссоциация комплекса (1 мкг ЦП и 1,6 мкг ЛФ) происходила при добавлении к нему природных полианионов (10 мкг ДНК цыпленка, 20 мкг ЛПС, 1,25 мкг гепарина). Так же действовали AT к ЛФ.

Способность полианионов взаимодействовать с ЛФ, вытесняя ЦП, подтверждает ведущую роль ионных сил при формировании комплекса. В связывании ДНК, ЛПС и гепарина участвует аргининовый кластер на N-конце ЛФ [Van Berkel et al. 1997]. Вероятно, там же расположен и сайт для связывания ЦП. Участок поверхности ЦП, вовлеченный в формирование комплекса, должен нести отрицательный заряд.

Влияние металлопростетических групп ЛФ на формирование комплекса.

Чтобы определить, зависит ли сродство ЛФ к ЦП от присутствия ионов металлов в его специфических сайтах, на колонку с ЦП-Сефарозой по очереди наносили три формы ЛФ: железосодержащую ^е2-ЛФ), медьсодержащую (Сц-ЛФ) и апо-форму. Элюировали ЛФ градиентами концентраций СаС12 и NaCl. Оказалось, что все три формы ЛФ взаимодействуют с носителем, но 0,3 М NaCl нарушает взаимодействие. Действие СаС12 отличалось: Си2-ЛФ эффективно элюировался 40 мМ раствором, а для Fе2-ЛФ и апо-ЛФ наиболее эффективной была концентрация 50 мМ.

Поскольку наличие или отсутствие у ЛФ металлопростетических групп, а значит измененение его пространственной структуры в результате встраивания ионов, не влияет на взаимодействие с ЦП, можно считать, что взаимодействие не затрагивает поверхность ЛФ вблизи металлосвязывающего сайта.

Избирательность взаимодействия ЦП и ЛФ.

Как сказано выше, комплекс ЦП/ЛФ формируется не только при смешивании очищенных белков, но и в плазме крови. При этом ЛФ и ЦП избирательно взаимодействуют друг с другом. Доводом в пользу избирательности этого взаимодействия служит и то, что, несмотря на высокую структурную гомологию ЛФ с ТФ (около 60 %, [Baker, 1994]), непосредственного взаимодействия между ЦП и ТФ мы не обнаружили, использовав приемы, выявляющие комплекс ЦП/ЛФ (ЭФ, гель-фильтрацию). Основное отличие ЛФ от ТФ и других членов семейства трансферринов состоит в наличии на поверхности молекулы ЛФ нескольких положительно заряженных областей [Baker et al, 2002], которые, по-видимому, важны для взаимодействия с ЦП.

Исключительное сродство ЦП и ЛФ позволяет избирательно выделить ЛФ из слезной жидкости и молока методом аффинной хроматографии на ЦП-Сефарозе. ЛФ из сыворотки грудного молока или слезной жидкости ЛФ сорбировался на ЦП-Сефарозе и элюировался 0,3 М NaCl. Иммуноэлектрофорез обнаруживал ЛФ в элюате. Денатурирующий ЭФ элюата показал в обоих случаях единственную зону с молекулярной массой около 80 кД, то есть со смолой селективно взаимодействовал ЛФ. В семенной жидкости ЛФ был идентифицирован, но в элюате с аффинной смолы найден не был. Однако, если семенную жидкость предварительно подвергали ионообменной хроматографии на КМ-Сефарозе, то частично очищенный ЛФ сорбировался на ЦП-Сефарозе и элюировался 0,3 М NaCl. Известно, что ЛФ взаимодействует с белками семенной жидкости, e.g. с альбумином и секреторным иммуноглобулином A [Sorrentino et al., 1999]. Возможно, они или другие компоненты семенной жидкости препятствовали взаимодействию ЛФ с иммобилизованным ЦП. Частичная очистка позволяла ЛФ сорбироваться на ЦП-Сефарозе.ЛФ из экстракта нейтрофильных лейкоцитов, как и ЛФ вышеперечисленных секретов, взаимодействует с ЦП-Сефарозой и элюируется 0,3 М NaCL..KpoMe того, уже после элюции NaCl, кислый буфер элюировал с ЦП-Сефарозы ряд белков, среди которых не было ЛФ. Вестерн-блотгтинг [Соколов и др., 2004] установил присутствие МПО, обладающей сродством к ЦП [Segelmark et ah, 1997]. Также в этом элюате была обнаружена ферментативная активность сериновой протеазы, катепсина G. Изоэлектрические точки большинства белков из нейтрофильных гранул лежат в щелочной области рН, что объясняет сродство этих белков к ЦП (pl~4,5).

Определение константы диссоциации.

Константу диссоциации (Kd) комплекса ЦП/ЛФ определили, построив график Скэтчарда по результатам серии аффинных хроматографий ЛФ на ЦП-Сефарозе. Колонка, содержащая 1 мл ЦП-Сефарозы, предварительно была уравновешена PBS. На нее наносили фракции, содержащие различное количество ЛФ (2-8 мг) в 2 мл этого же буфера. Раствор циркулировал через колонку в течение 3 часов для установления равновесия между свободным ЛФ и комплексом ЦП/ЛФ. Затем отделяли жидкую фазу (собственным током), а связавшийся ЛФ элюировали 0,3 М NaCl. В обеих фракциях спектрофотометрически определяли концентрацию ЛФ. По полученным данным построили график Скэтчарда (Рис. 3). Аппроксимирующая прямая для

экспериментальных точек найдена Методом наименьших квадратов при помощи программы Microsoft Excel. Константа диссоциации определяется из этого графика как тангенс угла, смежного с углом наклона аппроксимирующей прямой, то есть как отношение отрезков, отсекаемых прямой от осей ординат и абсцисс. Для комплекса ЦП/ЛФ мы получили Kd= (8,2±0,21 )х 10"6 моль/л.

Рис. 3. График Скэтчардадля взаимодействия ЛФ с иммобилизованным ЦП. В - концентрация ЛФ, сорбированного на ЦП-Сефарозе;

Р — концентрация свободного ЛФ в циркулирующей системе.

Кс1= (8,2±0,21)х10"6 моль/л.

Полученную константу можно сравнить с известной константой диссоциации комплекса ЛФ человека и специфических последовательностей ДНК: Kd - 3,2-10 ~8 моль/л [Не and Furmanski, 1995], а также с константой взаимодействия бычьих ЛФ и ß-лактоглобулина: Kd= 22,2- KT6 моль/л [Lampreave et al, 1989]. Видно, что белок-белковый комплекс ЦП/ЛФ человека прочнее, чем комплекс ЛФ-Р-лактоглобулин быка. Взаимодействие же ЛФ с ДНК существенно прочнее, чем с ЦП, поскольку константа диссоциации на 2 порядка меньше. Сравнить полученную нами Kd с константами взаимодействия ЦП с МПО и ферритином не представляется возможным, поскольку в соответствующих работах Kd не определялись [Segelmark et al., 1997; Juan and Aust, 1998].

При изучении диссоциации комплекса мы показали, что AT к ЛФ препятствуют взаимодействию ЦП и ЛФ. Константы диссоциации для большинства комплексов антиген-антитело имеют порядок 10"9 моль/л [Jones and Thornton, 1995], то есть комплексы более прочные, чем комплекс ЦП/ЛФ.

Исходя из графика Скэтчарда, можно оценить стехиометрию комплекса ЦП/ЛФ. Точка пересечения аппроксимирующей прямой с осью абсцисс показывает максимальную концентрацию связанного ЛФ в равновесной системе, то есть на использованной колонке (объем циркулирующей системы равен 2,81 мл) может связаться до 50,5 мкмоль ЛФ. Зная, что при иммобилизации ЦП с активированной Сефарозой связалось 7,5 мг белка на 1 мл смолы, мы рассчитали, что колонка содержит 56,8 мкмоль ЦП. То есть, при насыщении колонки, молярное соотношение ЦП и ЛФ близко к 1:1, как и в случае гель-фильтрации. Возможно, при аффинной хроматографии на стехиометрию комплекса оказывает влияние не только значение рН, но и то, что в результате иммобилизации ЦП на смоле часть групп, взаимодействующих с ЛФ, стала пространственно недоступной.

Перенос ионов меди из ЦП в апо-ЛФ.

Захватывая ионы переходных металлов, которые могут служить катализаторами реакций фентоновской химии, апо-ЛФ может предотвращать образование опасных для макромолекул кислородных радикалов. Апо-ЛФ способен встраивать ионы металлов в широком (3,5 - 10,0) диапазоне рН [Ainscough et al, 1983; Baker et ah, 2002]. Мы изучали, при каких условиях ионы меди могли выходить из молекул ЦП и встраиваться в апо-ЛФ. Белковые пробы (15 мг/мл холо-ЦП и 18 мг/мл апо-ЛФ) предварительно диализовали против PBS, содержащего 0, 1, 10 и 100 мМ , поскольку бикарбонатный анион способствует встраиванию металлов в трансферрины.

Мы анализировали разностные спектры поглощения всех этих фракций, полученные против апо-ЛФ или холо-ЦП (Рис. 4 А, В). При сравнении спектров комплекса холо-ЦП/апо-ЛФ, измеренных против отдельных его составляющих в присутствии 100 мМ NaHCC>3, с аналогичными спектрами, полученными в отсутствие , заметно небольшое увеличение оптической плотности при 435 нм и понижение при 610 нм, то есть происходило образование Сиг-ЛФ. В спектрах, полученных при меньших концентрациях (1 и 10 мМ), появления пика при

435 нм не наблюдали.

ABC

»1» 4И БСв 00* 700 119 № » Ю ш 300 ООО 4в0 540 020 7«

Длима волны, им

Рис. 4. А, В Разностные спектры оптического погощения комплекса холо-ЦП/апо-ЛФ против А - холо-ЦП и В - апо-ЛФ в отсутствие (черная линия) и в присутствии (серая линия) 100 мМ NaHCOj. С Спектры оптического поглощения комплекса ЦП/ЛФ в присутствие 0,1 М ЫаНСОз против PBS на различных этапах триптического гидролиза (0 мин —1; 20 мин — 2; 60 мин — 3 и 100 мин -4).

Повышение концентрации NaHCOj приводило к увеличению рН раствора. Так, в препаратах, содержащих 1,10 и 100 мМ NaHCOj, рН был равен, соответственно, 7,4; 7,8 и 8,5. Для изучения влияния щелочной среды на выход ионов меди из ЦП, содержание меди в препаратах ЦП до и после диализа измеряли при помощи атомно-адсорбционной спектроскопии. В результате 17-ти часового диализа против раствора с рН 8,5 ЦП потерял 9,7±2,4 % своей меди. При меньших значениях рН потери меди составляли: 1,4±0,4% при рН 6,8; 1,8±0,6% при рН=7,4 и 2,7±0,6% при рН 8,0.

Нарушение целостности ЦП в результате ограниченного гидролиза трипсином усиливает выход из ЦП ионов меди и образование С112-ЛФ. К комплексу, содержащему холо-ЦП (15 мг/мл) и апо-ЛФ (18 мг/мл) в PBS с добавлением 100 мМ NaHC03 (рН 8,5), добавляли трипсин (1:50, по отношению к ЦП) и регистрировали спектры поглощения через 20, 60 и 100 мин. На Рис. 4 С видно, что со временем происходило снижение пика при 610 нм и нарастание пика при 435 нм. Поскольку ЛФ весьма устойчив к трипсиновому протеолизу [Brines and Brock, 1983], этот процесс моделирует разрушение ЦП, которое могло бы происходить в очаге воспаления под действием, например, нейтрофильных протеаз. В русле крови ЦП протеолизован на 10% [Sato and Gitlin, 1991], причем не известно, какая протеаза(ы) отвечает за это. Захват апо-ЛФ ионов меди, высвобождающихся из легко протеолизуемого ЦП, может

оказаться механизмом защиты организма от сильного окисляющего действия так называемой «прооксидантной меди» [Mukhopadhyay et a/., 1997]. Влияние ЛФ на деградацию ЦП под действием Н2О2.

Одним из деструктивных факторов, которые принимают участие в патогенезе воспаления, является перекись водорода и продукты ее превращений, известные как активные формы кислорода (АФК). Сравнительно недавно было показано, что при взаимодействии с пероксинитритом [Swain et al., 1994] и с Н2О2 [Choi et al, 2000] ЦП может подвергаться окислительной деструкции, результатом которой является разрушение полипептидной цепи, потеря ферментативной активности белка и высвобождение ионов меди. Реагируя с Н2Ог, эти ионы могут служить катализаторами реакций фентоновской химии, приводящих к образованию активных форм кислорода (АФК) [Янковский, 2000]. В серии опытов, результаты которой представлены ниже, изучалось влияние ЛФ на окислительную деградацию ЦП, моделирующую воспалительный процесс.

Схема экспериментов по окислительной деструкции ЦП изложена в разделе «Материалы и методы». Результаты показали, что в ходе инкубации препаратов ЦП с происходит снижение оксидазной активности фермента и исчезновение белковых зон, соответствующих ЦП при ЭФ в ПААГ. Процесс разрушения ЦП зависел от концентрации Н^Ог и времени инкубации. Так, при концентрации HjOj 5 мМ за 5 часов инкубации при 37° С оксидазная активность ЦП снижалась до 30 %, а при 10 мМ - практически до 0. По данным неденатурирующего ЭФ, в этих пробах полностью отсутствуют белковые зоны. Изучение временной зависимости процесса деградации показало, что в течение первых 3 часов активность ЦП снижается прямо пропорционально времени инкубации почти до 0, а интенсивность окраски зон ЦП на электрофореграммах постепенно уменьшается. В последующих экспериментах для стандартизации исследования концентрацию ЦП в пробе брали равной 2,7 мкМ, концентрацию Н2Ог -10 мМ и инкубировали пробы в течение 5 ч.

При добавлении апо-ЛФ к системе ЦП+Н2О2 процесс деградации ЦП подавлялся тем сильнее, чем больше ЛФ было добавлено (Рис. 5). При добавлении эквимолярного количества апо-ЛФ через 5 часов ЦП сохранял 37 % своей активности,

двукратный избыток апо-ЛФ позволял сохранить 50% активности ЦП, а максимальное действие достигалось при четырехкратном избытке апо-ЛФ - ЦП сохранял около 80 % активности.

Рис. 5. Защита ЦП от перекисного окисления при помощи апо-ЛФ. А Оксидазная активность ЦП, сохраняющаяся в присутствии апо-ЛФ (в пробах 3 мкМ ЦП). В Денатурирующий ЭФ в ПААГ исходного ЦП (1) и ЦП, подвергавшегося воздействию Н2О2 в отсутствие (2) и в присутствии апо-ЛФ (3). Апо-ЛФ + 10 мМ Н2Ог в отсутствие (4) и в присутствии (5) 50 мМ СиБО^

Белковые зоны при ЭФ также сохранялись. На Рис. 5 В, представлены результаты денатурирующего ЭФ исходного ЦП (1), и ЦП, подвергавшегося воздействию перекиси водорода в отсутствие (2) и в присутствии апо-ЛФ (3). Инкубация ЦП с Н2О2 в присутствии апо-ЛФ не приводила к исчезновению белковых зон, тогда как без апо-ЛФ ЦП был полностью разрушен. Мы проверили также, что апо-ЛФ в концентрации 3 мкМ не разрушался в присутствии 10 мМ ЦО^, но при добавлении в реакционную смесь 50 мМ происходила его деградация (Рис. 5 В,

4-5).

Чтобы исследовать влияние рН среды на окислительную деградацию ЦП, предыдущие эксперименты повторили при различных рН (в 10 мМ Na-фосфатных буферах, рН 5,5; 6,0; 6,5; 7,0). Мы не выявили зависимости окислительной деградации ЦП от рН, но показали, что защитное действие апо-ЛФ зависело от рН. С наибольшим эффектом оно проявлялось при рН 7,4 - четырехкратный избыток ЛФ сохранял около 80 % исходной оксидазной активности ЦП. При снижении рН до 6,5 защитный эффект ЛФ был в два раза слабее, сохранялось около 40 % активности. При рН 5,5 ЛФ не защищал ЦП от деградации. Как показал денатурирующий ЭФ, сам ЛФ не разрушался при инкубации с 10 мМ Н2О2 вне зависимости от рН.

Для того, чтобы прояснить механизм деградации ЦП и защитного действия апо-ЛФ, мы исследовали влияние на эти процессы некоторых ингибиторов АФК и хелаторов металлов, а также супероксиддисмутазы (СОД). Такие гасители ОН*-радикалов как маннитол (100 мМ), азид натрия (100 мМ) и ДМСО (2%), а также СОД (10 мкг/мл) не защищали ЦП от перекисной деградации. В то же время гистидин (20 мМ), обладающий как способностью «гасить» некоторые АФК, так и прочно связывать ионы меди, существенно тормозил разрушение ЦП, сохраняя до 75 % исходной оксидазной активности. Защитное действие ЭДТА возрастало в зависимости от ее концентрации. Максимальный эффект достигался при концентрации ЭДТА 10 мМ, при этом сохранялось не более 20% активности ЦП. Проведение реакции в присутствии смолы Хелекс-100 способствует сохранению 80 % активности ЦП.

О продукции АФК в нашей системе мы судили по хемилюминесценции, происходившей при окислении люминола. Добавление к ЦП стимулировало

эмиссию света, которая возрастала с течением времени. Через 1 час после начала реакции уровень свечения составлял примерно 1000 мВ. Свечение контрольной пробы, содержащей 10 мМ Н2О2 в PBS, составляло 1,3-1,6 мВ. Добавление к реакционной смеси маннитола (100 мМ) не изменяло характера хемилюминесценции. В присутствии смолы Хелекс-100 и при добавлении 20 мМ гистидина свечение люминола достигало только уровня 200 мВ. В присутствии 10 мМ ЭДТА уровень свечения оставался постоянным в течение всего эксперимента и составлял 10 мВ. При добавлении к ЦП 3 мкМ апо-ЛФ уровень хемилюминесценции через 1 час составлял около 200 мВ. Четырехкратное количество апо-ЛФ (12 мкМ) снижало этот уровень до 100 мВ. Мы также проверили, как проявляет себя в данном эксперименте

железосодержащий ЛФ. В пробе, содержавшей 3 мкМ Fe2-J№, за 30 минут уровень хемилюминесценции достигал 600 мВ и далее в ходе реакции оставался постоянным.

Вещества, связывающие ионы меди (гистидин, Хелекс-100, ЛФ), снижая уровень продукции АФК, оказывали защитное действие, что с большой степенью вероятности указывает на ведущую роль ионов меди в деструкции ЦП. Неспособность таких «гасителей» гидроксильных радикалов, как маннитол и ДМСО, защитить ЦП от деградации, может объясняться «сайт-специфическим» действием этих радикалов на молекулу ЦП. Возможный механизм такого действия предложен авторами статьи [Halliwel and Gutteridge, 1999]: из-за короткого времени жизни гидроксильные радикалы разрушают белок-мишень непосредственно вблизи места своего образования, не успевая выйти в раствор и прореагировать с маннитолом или ДМСО. Подавление хемилюминесценции в присутствии ЭДТА можно объяснить тем, что, образуя хелатный комплекс, ЭДТА препятствует работе ионов меди как катализаторов реакции разложения Н2О2. А снижение оксидазной активности в присутствии ЭДТА можно объяснить способностью этого хелатора искажать геометрию активного центра ЦП [Fee, 1975; Farver and Pecht, 1984].

Как апо-ЛФ, так и Ре2-ЛФ снижали уровень хемилюминесценции, однако апо-ЛФ оказывал более выраженное действие. Следует напомнить о способности ЛФ в любой форме связывать поверхностными остатками Гис ионы меди [Hutchens and Yip, 1991]. Снижение рН, уменьшая сродство ЛФ к ионам меди, приводило к потере протекционных свойств этого белка. Нельзя исключить, что способность ЛФ захватывать реакционно-способные ионы меди снижена также в очагах патологических процессов, связанных с окислительным стрессом, многие из которых происходят при низких значениях рН [Vorland, 1999]. В настоящее время накоплено много фактов, указывающих на взаимосвязь заболеваний человека со свободно-радикальными процессами [Halliwel and Gutteridge, 1999]. Несомненно, что ЛФ принимает участие в регуляции уровня свободных ионов металлов переходной группы, в частности — меди и железа, в организме.

Спектры кругового дихроизма (КД) для комплекса ЦП/ЛФ.

Конформационные особенности комплекса ЦП/ЛФ исследовали методом КД в области ближнего ультрафиолета. В этих экспериментах изучали комплексы, образованные как холо-, так и апо-формами ЦП и ЛФ в различных комбинациях в

соотношении ЩП:2ЛФ. Чтобы определить, изменяются ли конформации белков при формировании комплекса, мы сравнили спектры комплексов с арифметической суммой спектров ЦП и ЛФ. Анализ показал, что при длинах волн меньше 270 нм соответствующие кривые практически совпадают. Небольшие различия в разрешении вибрационных компонент главной электронной полосы в области 280 нм находятся в пределах погрешности использованного метода. Можно считать, что при образовании комплекса не происходило существенных структурных перестроек, затрагивающих ориентацию ароматических аминокислотных остатков.

Влияние ЛФ на ферментативную активность ЦП.

О ферроксидазной активности ЦП судили по количеству ионов железа, окисленных из Ре2+ до Ре3+ в ходе катализируемой ЦП реакции. Измерения проводили в отсутствии ЛФ и с добавлением к 0,45 мг ЦП равного или двукратного (М/М) количества ЛФ в трех его формах: апо-, Рег- и Сиз-белка (Рис. 7).

Рис. 7. Влияние ЛФ на ферроксидазную активность ЦП. Количество ионов железа, окисленных при участии ЦП в отсутствие и в присутствии различных форм ЛФ.

Добавление к ЦП эквимолярного количества апо-ЛФ приводило к тому, что в ходе реакции за 10 минут образовывалось в 1,4 раза больше Ре3+, чем в отсутствие апо-ЛФ. Удвоение количества апо-ЛФ не увеличивало скорость реакции. В отличие от апо-ЛФ, добавленные в эквимолярном количестве Рег-ЛФ и Си^-ЛФ повышали содержание окисленных ионов железа в 1,5 раза. При двукратном избытке

насыщенных металлами форм ЛФ скорость реакции становилась еще выше: за 10 минут образовывалось в 1.9 раз больше Ре3+, чем в опыте с чистым ЦП. Дальнейшее добавление -ЛФ и -ЛФ не влияло на ферментативную активность ЦП. Можно предположить, что вследствие конформационных отличий апо-ЛФ и холо-ЛФ по-разному взаимодействуют с ЦП, и стехиометрические соотношения белков в составе активных комплексов различаются.

Во всех этих случаях не наблюдалось значительного изменения угла наклона прямой зависимости количества продукта реакции от времени, поскольку это увеличение происходило на первых минутах хода реакции. Такую зависимость можно объяснить образованием промежуточного комплекса ЦП с ЛФ. Этот промежуточный продукт обладает высокой ферментативной активностью, но быстро переходит в комплекс, активность которого не превышает активности ЦП.

В заключение сделаем предположения о возможном физиологическом значении комплекса ЦП/ЛФ, свойства которого изучались в работе. ЦП обладает ферментативной активностью ферроксидазы и занимает одну из ключевых позиций в метаболизме железа млекопитающих, поэтому его взаимодействие с железосвязывающим белком трансферринового семейства кажется неслучайным. Из этого семейства только ЛФ взаимодействует с ЦП, и тем важнее, что он оказывает влияние на его ферментативную активность. В организме ЛФ содержится преимущественно в апо-форме, то есть обладает возможностью связывать ионы железа, окисленные при участии ЦП. С другой стороны, можно предположить, что задача апо-ЛФ - секвестрировать «прооксидантные» ионы меди, источником которых может стать ЦП, подвергшийся действию протеаз или неспецифической окислительной деградации в очаге воспаления. Связывая ионы переходных металлов, апо-ЛФ может предотвращать образование кислородных радикалов, опасных для макромолекул, мембран и клеток в целом.

ВЫВОДЫ

1. При смешивании очищенных ЦП и ЛФ и при добавлении очищенного ЛФ к белкам сыворотки крови образуется комплекс ЦП/ЛФ. При внутривенном

введении лабораторным крысам ЛФ человека он образует комплекс с ЦП крысы in vivo.

2. Показано, что в различных экспериментальных условиях молярное соотношение ЛФ и ЦП в комплексе может быть равно 2:1 либо 1:1.

3. Образование комплекса происходит при физиологических концентрациях солей и значениях рН. Высокие концентрации ЭДТА, хлористого натрия и хлористого кальция, а также природные полианионы способствуют диссоциации комплекса. Гидрофобные агенты не оказывают заметного влияния на комплекс.

4. Константа диссоциации комплекса ЦП/ЛФ в условиях, моделирующих физиологические (рН=7,4; 0,15 М NaCl), составляет Kd=( 1,8±0,21 )d0"6 моль/л.

5. При добавлении ЛФ к сыворотке крови ЦП и ЛФ проявляют сродство исключительно друг к другу, взаимодействия других сывороточных белков с ЛФ в этих условиях не наблюдается, что говорит об избирательности взаимодействия.

6. Определены условия, при которых ионы меди, высвобожденные из ЦП, могут встраиваться в металлосвязывающие сайты ЛФ.

7. В присутствии ЛФ увеличивается ферроксидазная активность ЦП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Пулина М.О. Специфическое взаимодействие двух металлопротеидов -церулоплазмина и лактоферрина. Тезисы докладов научно-технической конференции «Современные научные школы: перспективы развития. XXVII неделя науки СПбГТУ» 7-12 декабря 1998 г, изд-во СПбГТУ, СПб, 1999.

2. Пулина М.О. Взаимодействие лактоферрина с церулоплазмином. Тезисы докладов научно-технической конференции «XXVIII неделя науки СПбГТУ» 611 декабря 1999 года, изд-во СПбГТУ, СПб, 2000.

3. Е.Т. Zakharova, M.M. Shavlovski, M.G. Bass, A.A Gridasova, M.O.Pulina, V. De

Filippis, M. Beltramini, P. Di Muro, B. Salvato, A. Fontana, V.B. Vasilyev and V.S.Gaitskhoki. (2000) Interaction of Lactoferrin with Ceruloplasmin Arch. Biochem. Biophys. 374 (2), 222-228.

4. Захарова Е.Т., Пулина М.О., Басс М.Г., Шавловский М.М., Васильев В.Б. Специфическое взаимодействие церулоплазмина и лактоферрина. Тезисы научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвященной 110-летию ИЭМ РАМН 18-20 декабря 2000 г.

5. Соловьев К., Пулина М. Защита апо-лактоферрином церулоплазмина от деградации перекисью водорода. Тезисы научно-технической конференции «XXIX неделя науки СПбГТУ» 27 ноября-2 декабря 2000г, изд-во СПбГТУ, СПб, 2001.

6. М. Пулина. Комплекс лактоферрина и церулоплазмина и некоторые его свойства. Тезисы 4ой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей Человек и его здоровье, Санкт-Петербург, 2001.

7. Соловьев К. Пулина М. Апо-лактоферрин защищает церулоплазмин от деградации под действием Тезисы 4ой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей Человек и его здоровье, Санкт-Петербург, 2001.

8. М. Pulina, К. Solovyov CERULOPLASMIN-LACTOFERRIN COMPLEX: A PUTATIVE ROLE IN ACUTE PHASE REACTIONS. Abstract book 12th European Student's Conference -November 21я-25'ь, 2001.

9. Pulina M.O., Zakharova E.T., Sokolov A.V., Solovyov K.V., Kokryakov V.N. and Vasilyev V.B. (2002) Studies of the ceruloplasmin-lactoferrin complex. Biochem. CellBiol, 80(1), 35-39.

10. Pulina M.O., Zakharova E.T., Bass M.G., Sokolov A.V., et al. Proteolysis of ceruloplasmin and copper transfer to lactoferrin. Proceedings of the 7th International Symposium «Metal Ions in Biology and Medicine», St-Petersburg, Russia, May 5-9, 2002, Eds. I. Khassanova, et.al. v. 7,94-99, John Libbey Eurotext, Paris, 2002.

11. K.V.Solovyov, M.O. Pulina, A.V. Sokolov, E.T. Zakharova et al. Lactoferrin and albumin protect ceruloplasmin against Cu-mediated degradation induced by Proceedings of the 7th International Symposium «Metal Ions in Biology and Medicine», St-Petersburg, Russia, May 5-9, 2002, Eds. I. Khassanova, et.al. v. 7, 517-522, John Libbey Eurotext, Paris, 2002.

12. Захарова Е.Т., Соколов А.В., Соловьев К.В., Пулина М.О., Шавловский М.М., Васильев В.Б. Получение стабильного препарата церулоплазмина человека. Тезисы докладов III Съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 26.0601.07.2002., стр. 158.

13. Пулина М.О., Захарова Е.Т., Соловьев К.В., Соколов А.В., Басс М.Г., Шавловский М.М., Васильев В.Б. Изучение специфического комплекса церулоплазмина и лактоферрина. Тезисы докладов III Съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 26.06-01.07.2002, стр. 511.

14. Соколов А.В., Пулина М.О. Изменение ферроксидазной активности церулоплазмина при белок-белковых взаимодействиях. Тезисы 6-ой всероссийской медико-биологической конференции «Человек и его здоровье», 19 апреля 2003 г., стр. 151-152, Санкт-Петербург.

15. Соколов А.В., Сусорова А.С., Пулина М.О., Рунова О.Л., Захарова Е.Т. Взаимодействие церулоплазмина с белками нейтрофильных гранул. Тезисы научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», 2004, СПбМАПО, Санкт-Петербург, стр. 246.

16. Сусорова А.С., Соколов А.В., Пулина М.О., Захарова Е.Т. Обнаружение и характеристика комплекса церулоплазмин-лактоферрин в молоке женщин. Тезисы научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», 2004, СПбМАПО, Санкт-Петербург, стр. 249.

Работа частично финансировалась из средств грантов РФФИ №№ 00-04-49812, 03-04-49201, 02-04- 49694, Президентского гранта 1730.2003.4, ГШ^ № YSF 20020407, а также получила финансовую поддержку администрации Санкт-Петербурга и фонда Сороса.

Подписано в печать 26.08.2004 Формат 60x90 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая.

Усл. печ. л. 1,5. Тираж 70 экз. Заказ 233 Отпечатано ООО "Мебиус плюс" с оригинал-макета заказчика.

1178 18

РНБ Русский фонд

2005-4 16965

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пулина, Мария Олеговна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие принципы изучения белок-белковых взаимодействий.

1.1.1. Типы ББВ.

1.1.2. Структура и свойства поверхности контакта при ББВ.

Топография поверхности контакта.

Аминокислотный состав.

Вторичная структура.

1.1.3. Силы, определяющие белок-белковое взаимодействие.

Гидрофобное взаимодействие.

Электростатические силы и заряды.

Водородные связи.

Молекулы воды в области контакта.

1.1.4. Изменение конформации белков при ББВ.

1.1.5. Термодинамика белок-белковых взаимодействий.

1.1.6. Распределение характерных элементов по поверхности белкового контакта.

1.1.7. Факторы, влияющие на белок-белковое взаимодействие.

1. 2. Лактоферрин.

1.2.1. Строение лактоферрина.

1.2.2.Строение металлосвязывающих сайтов ЛФ.

1.2.3. Биологические функции лактоферрина.

Роль ЛФ в метаболизме железа.

Лактоферрин как фактор роста.

Противовоспалительное действие.

Бактериостатическое и бактерицидное действие ЛФ.

ЛФ как транскрипционный фактор.

Эндонуклеазная активность ЛФ.

1.3. Церулоплазмин.

1.3.1. Строение ЦП.

1.5.2. Атомы меди в составе ЦП, строение активного центра.

1.3.3.Биологические функции ЦП.

Транспорт меди.

Участие в метаболизме железа.

Регуляция уровня биогенных аминов.

Антиоксидантные свойства ЦП.

1.3.4. Взаимодействие ЦП с некоторыми белками, связывающими ионы железа.

Образование комплекса ЦП с ферритином в ходе загрузки ионов железа.

Ингибирование пероксидазной активности МПО при ее взаимодействии с

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение ЛФ.

2.2. Насыщение апоЛФ железом и медью.

2.3. Выделение ЦП.:.

2.4. Получение апо-ЦП.

2.5. Получение экстракта из нейтрофильных лейкоцитов.

2.6. Гель-фильтрация.

2.7. Электрофоретический анализ белков.

2.8. Получение специфических антител к ЛФ и ЦП человека.

2.9. Иммунодиффузия.

2.10. Иммуноэлектрофорез.

2.11. Иммуноэлектродиффузия.

2.12. Иммобилизация ЦП и ЛФ на Сефарозе.

2.13. Аффинная хроматография ЛФ на ЦП-Сефарозе.

2.14. Моделирование комплекса in vivo.

2.15. Перенос ионов меди из холо-ЦП в апоЛФ.

2.16. Окисление ЦП под действием Н2О2.

2.17. Измерение оксидазной активности ЦП.

2.18. Измерение хемилюминесценции.

2.19. Спектры кругового дихроизма.

2.20. Измерение ферроксидазной активности ЦП.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Образование комплекса ЦП/ЛФ in vitro.

3.2. Образование комплекса ЦП/ЛФ in vivo.

3.3. Стехиометрическое соотношение комплекса ЦП/ЛФ.

3.4. Условия разобщения комплекса ЦП/ЛФ.

3.5. Влияние металлопростетических групп ЦП и ЛФ на формирование комплекса.

3.6. Избирательность взаимодействия ЦП и ЛФ.

3.7. Определение константы диссоциации.

3.8. Взаимодействие ЛФ с частично протеолизованным ЦП.

3.9. Перенос ионов меди из ЦП в апо-ЛФ.

ЗЛО. Влияние ЛФ на деградацию ЦП под действием Н2О2.

3.11. Спектры кругового дихроизма (КД) для комплекса ЦП/ЛФ.

3.12. Влияние ЛФ на ферментативную активность ЦП.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Образование комплекса при взаимодействии церулоплазмина и лактоферрина"

В течение ряда лет в отделе молекулярной генетики изучают нарушения метаболизма металлопротеинов.

Лактоферрин (ЛФ) - или трансферрин молока, один из белков острой фазы воспаления, поступающий в русло крови из вторичных гранул нейтрофилов, обладает антибактериальными свойствами. В частности, молекула ЛФ обладает способностью связывать в специфических сайтах два иона железа, таким образом секвестрируя в очаге воспаления микроэлемент, необходимый для жизни микробов. Этот белок широко представлен в клеточно-тканевых образованиях организма млекопитающих: он выявлен в большинстве барьерных эпителиев пищеварительного, респираторного и мочеполового трактов и их секретах, а также в экзокринных железах и их секретах. Исследования ЛФ, выделенного из грудного молока, были начаты более 50 лет назад, однако его новые функции обнаруживают до сих пор. Об интенсивности проводимых исследований можно судить по материалам международных конференций (Lactoferrin: Structure, Functions and Applications), которые проводят каждые два года. Некоторые недавно обнаруженные функции обусловлены способностью ЛФ взаимодействовать с другими молекулами (гепарином, белками бактериальных клеточных стенок, секреторными белками, ДНК). Такие взаимодействия могут иметь отношение к физиологической роли ЛФ, которая до сих пор однозначно не определена.

Церулоплазмин (ЦП), медьсодержащий белок плазмы крови, проявляя ферроксидазную активность, принимает участие в метаболизме железа, что обеспечивает встраивание Fe в апо-трансферрины. Другие функции ЦП связаны с транспортом меди и окислительными процессами, в которых он выступает как антиоксидант. Работами последних лет показано, что ЦП может приобретать некоторые функции, взаимодействуя с рядом других белков. Так, например, конкурируя с факторами свертывания крови (ФСК) FV и FVIII за связывание с протеином С, ЦП может участвовать в регуляции коагуляции. Взаимодействие ЦП с миелопероксидазой может быть важным для регуляции ее опасных прооксидантных свойств. Взаимодействие ЦП с ферритином наряду с его ферроксидазной активностью необходимо для полноценного встраивания

Fe3+ в ферритин. Таким образом, изучая взаимодействие ЦП с другими белками, можно получить представление о его новых функциональных свойствах.

Исходя из вышесказанного, представляется актуальным исследование особенностей взаимодействия ЛФ и ЦП и возможности образования комплекса ЦП/ЛФ. Такой комплекс мог бы служить примером белок-белкового взаимодействия (ББВ) двух многофункциональных металлопротеинов. Изучение ассоциации-диссоциации ЦП и ЛФ, а также структурных особенностей комплекса позволит выявить условия его формирования и возможную роль in vivo. Совместное присутствие этих белков в пограничных к инфекции тканях говорит о том, что их комплекс может играть роль в формировании неспецифической резистентности организма. Поскольку в организме ЛФ по большей части не содержит ионы металлов (аполактоферрин, апоЛФ), можно предполагать встраивание в него ионов железа, окисленных ЦП. Известно, что ЛФ оказывает антимикробное действие, которое синергично возрастает при совместном действии с другими антибактериальными белками (лизоцимом или миелопероксидазой). Хотя об антибактериальном действии ЦП известно мало, нельзя исключить, что в комплексе с ЛФ этот эффект усиливается. ЦП человека легко подвергается ограниченному протеолизу, в том числе и в русле крови. Не исключено, что в таком случае апо-ЛФ мог бы секвестрировать ионы меди, высвобождающиеся из ЦП, не допуская развития катализируемых ими цепных окислительных реакций.

В ходе исследований, результаты которых представлены в этой работе, предполагалось детально изучить условия, способствующие и препятствующие образованию комплекса ЦП/ЛФ in vitro, определить константу диссоциации комплекса, уточнить стехиометрическое соотношение ЦП и ЛФ в составе комплекса. Изучение ограниченного протеолиза ЦП в составе его комплекса с ЛФ под действием протеаз и неспецифической деградации под действием перекиси водорода, должно прояснить возможность переноса ионов меди с частично протеолизованного ЦП на апоЛФ, исследовать особенности взаимодействия деградированного и интактного ЦП с ЛФ in vitro. В опытах с лабораторными животными планировалось изучить формирование комплекса ЦП/ЛФ in vivo. Было запланировано проведение экспериментов, позволяющих оценить, влияет ли ЛФ на ферментативную активность ЦП. Также планировалось при помощи биофизических методов оценить конформацию комплекса в целом и его отдельных компонент. Возможно, это позволит построить пространственную модель комплекса ЦП/ЛФ.

Актуальность предложенной работы обусловлена важностью изучения взаимодействия между ЦП и ЛФ как частного случая ББВ - механизма, ответственного за функционирование многочисленных биохимических процессов. Железосодержащий ЛФ и медьсодержащий ЦП являются ключевыми звеньями метаболизма двух важных для организма микроэлементов. Изучение их взаимодействия, приводящего к формированию комплекса ЦП/ЛФ, позволит пролить свет на неизвестные стороны регуляции обмена металлов в норме и при ряде патологических состояний.

Новизна работы состоит в том, что в ней впервые показано прямое взаимодействие ЦП и ЛФ, определены основные характеристики этого взаимодействия и свойства специфического комплекса ЦП/ЛФ, что позволяет высказать гипотезу о его физиологической роли.

Основной целью представленной работы явилось: Выяснение условий, приводящих к образованию комплекса ЦП/ЛФ, и определение некоторых его физико-химических характеристик.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1) Показать возможность образования комплекса ЦП/ЛФ in vitro и in vivo.

2) Определить стехиометрическое соотношение молекул белков в составе комплекса.

3) Изучить условия диссоциации комплекса ЦП/ЛФ и определить константу диссоциации при физиологических значениях рН и концентрации NaCl.

4) Оценить избирательность взаимодействия ЛФ и ЦП.

5) Изучить условия, при которых происходит переход ионов меди из ЦП в ЛФ

6) Исследовать возможность влияния ЛФ на ферментативную (ферроксидазную) активность ЦП.

В соответствии с поставленными задачами проводились экспериментальные исследования, результаты которых представлены далее.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пулина, Мария Олеговна, Санкт-Петербург

1. Aisen P., and Harris DC. (1989) Physical biochemistry of the transferrins. 1.:1.on carriers and iron proteins. Vol. 5 (Ed. by Loehr T) VCH Publishers, New York. 241-351.

2. Archakov A.I., Ivanov Yu.D. (1999) The optical biosensor study of the protein-protein interactions with cytochrome P450s. In Biophysics of electron transfer and molecular Bioelectronics, Pleum Publication Corporation: USA. 173-194.

3. Argos P. (1988) An investigation of protein subunit and domain interfaces. Protein Eng. 2, 101-113.

4. Baker E.N. (1994) Structure and reactivity of transferrins. Adv. Inorg. Chem. 41,389-463.

5. Baker E.N., Anderson B.F., Baker H.M., Day C.L., Haridas M., Norris G.E., Rumball S.V., Smith C.A., Thomas D.H. (1994) In: Lactoferrin. Structure and function (Ed. by Hutchens T.W, Rumball S.V., Lonnerdal В., Plenum Press, NY & Lond.).

6. Baker E.N., Baker H.M., and Kidd R.D. (2002) Lactoferrin and transferring: Functional variations on a common structural framework. Biochem. Cell Biol. 80, 27-34.

7. Baker E.N., Rumball S.V., and Anderson B.F. (1987) Transferrins: insights into structure and functions from studies on lactoferrin. TIBS 12, 350-353.

8. Bakker G. R., and Boyer R.F. (198в) J. Biol. Chem. 261, 13182-13185.

9. Bannister J.V., Bannister W.H., Hill H.A.O., Mahood J.F., Willson R.L., and Wolfenden B.S. (1980) Does ceruloplasmin dismute superoxide? No. FEBS Lett. 118,127-129.

10. Barchas I.D., and Freedman D.X. (1963) Brains amines: response to phisiological stress. Biochem.Pharmacol. 12, 1232-1235.

11. Barlow D.J., Tornton J.M. (1986) The distribution of charged groups in proteins. Biopolymers. 25, 1717-1733.

12. Bellamy W., Takase M., Yamauchi K., Wakabiashi H., Kawase K., and TomitaM. (1992) Identification of the bacterial domain of lactoferrin. Biochim.Biophys.Acta 1121, 130-136.

13. Beltramini M., Salvato В., Santamaria M., and Lerch K. (1990) The reaction of CN' with binuclear copper site of Neurospora tyrosinase: its relevance for a14