Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейронально изолированная кора как модель для изучения внутрикорковых механизмов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Нейронально изолированная кора как модель для изучения внутрикорковых механизмов"

о л

' и' № 19ЯЗ

На правах рукописи

АГЛАДЗЕ НАДЕЖДА НИКОЛАЕВНА

НЕЙРОНАЛЬНО ИЗОЛИРОВАННАЯ КОРА КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВНУТРИКОРКОВЫХ МЕХАНИЗМОВ '

03.00.13. - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1998

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, член-кор. РАЕН М.Н. Жадин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, М. М. Хананашвили, кандидат биологических наук Ю. С. Медникова

Ведущая организация - Московский Государственный университет

им. М. В. Ломоносова, биологический ф-т.

Защита состоится "Л " апрг^Я 1998г. в 1С-°о часов на заседании Диссертационного Совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, г. Пущино, Московской области, проспект Науки, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного Центра биологических исследований РАН (г.Пущино, ИТЭБ РАН).

Автореферат разослан "27"ср*вр -1998г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Исследование механизмов функционирования коры головного мозга остается одним из важнейших направлений нейрофизиологии. Современная компьютеризация науки дает возможность не только усилить теоретический анализ данной проблемы, но позволяет разрабатывать элегантные методики, с помощью которых удается наблюдать и исследовать тонкие процессы, происходящие в коре не только на уровне отдельной клетки, но и в одиночном синапсе. Однако даже очень детальные исследования элементов не дают возможности понять механизмы функционирования системы в целом. Вполне актуальными поэтому остаются исследования, проведенные на системном уровне, к которым относится предлагаемая работа. Поскольку именно кора в конечном счете отвечает за высшие (психические) функции головного мозга, понятен пристальный интерес исследователей к ней. Однако изучение многих процессов, происходящих в коре, невозможно из-за огромного числа структурно-функциональных связей, объединяющих ее с другими отделами мозга в единую систему. Поэтому возможность изолировать кору от подкорковых влияний, но сохранить при этом ее внутренние функциональные свойства, и тем самым получить возможность исследовать разнообразные внутрикорковые механизмы (передача возбуждения по коре, взаимодействие нейротрансмиттеров, возникновение очагов патологической активности и многое другое), представляется актуальной.

Цель и основные задачи исследования. Целями данной работы было: показать, что в коре головного мозга кролика, изолированной от подкорковых синаптических влияний (ИзК), сохраняются основные свойства, характеризующие деятельность интактной коры (ИнтК); исследовать возможность проведения возбуждения по внутрикорковым связям в ИзК; экспериментально проверить теоретическое положение о зависимости спектрального состава ЭЭГ от уровня собственного возбуждения коры. В связи с этим были поставлены конкретные экспериментальные забачи: 1.определить количественные параметры ИзК: среднее число ФА клеток в треке, распределение их по слоям коры, среднюю частоту импульсации ФА клеток, распределение частот им-пульсации, распределение клеток по типу их ФИА (по форме АКФ); 2. проанализировать спектральный состав ЭЭГ ИзК; 3. исследовать скор-

Обозначения, принятые 8 тексте: АКФ-автокорреляционная функция, АХ-ацетилхолин, Зр-зрительная, ИзК-изолированная кора, ИнтК-ин-тактная кора, КК- коэффициент корреляции, ККФ-кросскорреляционная функция, МИИ-межимпульсный интервал, СМ-сенсомоторная, ФА-Фоново-активные, ФИА-фоновая импульсная активность, ЦСЖ-цереброспинальная жидкость, ЭЭГ-электроэнцефалограша.

релированность импульсных потоков взаимоудаленных клеток (по их ККФ); 4.проЕести сравнительный анализ указанных параметров для ИзК и ИнтК; 5.исследовать изменения ЭЭГ и ее спектра, вызванные введением АХ в ЦСЖ, в ИзК и ИнтК.

Научная новизна исследования. В работе большинство параметров, достаточных для характеристики функционального состояния изолированной коры, впервые измерено на одном виде животного (кролике).

Методом корреляционного анализа показано, что передача возбуждения из одной точки коры в другую может осуществляться самой корой без участия подкорковых структур.

В модельной ситуации показано, что при искусственном повышении уровня возбуждения ИзК ее ЭЭГ по форме и спектру становится аналогичной ЭЭГ ИнтК.

Научно-практическая ценность исследования. Полученные экспериментальные данные об изменении спектрального состава ЭЭГ ИзК дополняют и расширяют современные научные представления о собственных механизмах функционирования коры головного мозга. Одним из практических приложений может стать изучение механизмов возникновения эпилептических форм активности в коре и других патологий головного мозга, исследование которых на интактном мозге затруднено или невозможно. Функциональные характеристики препарата ИзК головного мозга кролика, полученные в данной работе, могут облегчить постановку и интерпретацию качественных задач по изучению внутри-корковых механизмов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), YIII Всесоюзной конференции по нейрокибернетики (Ростов-на-Дону, 1983), Всесоюзном симпозиуме "Нейронные механизмы коркового торможения" (Киев,1985), ежегодной научной конференции Института биофизики клетки РАН (Пущине, 1995) , I Международном симпозиуме "Electrical activity of the brain: mathematical models anc! analytical methods" (Пущино, 1997), совместном семинаре лаборатории системной организации нейронов и группы изучения механизмов синалтической передачи ИТЭБ РАН.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик, результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы. Содержание изложено на 110 страницах машинописного текста, включая 3 цифровые таблицы и 17 рисунков; список литературы содержит 219 источников.

По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 34 кроликах с ИзК и 36 кроликах с ИнтК.

Хирургическая изоляция. Неокортекс взрослых кроликов изолирова-

ли по методике Тишаниновой /1973/ с собственными модификациями (рис.1), при этом мягкая и пиальная мозговые оболочки рассекались на латеральной поверхности коры в месте прохождения скальпеля, но над изолированным участком они не повреждались. Как правило, верхние слои белого вещества сохранялись, нижние - отчасти разрушались. что позволяло говорить о частичной сохранности длинных ассоциативных связей в ИзК. В результате операции получалась дорзаль-ная поверхность неокортекса площадью около 260 мм2, изолированная от подкорковых структур и включавшая СМ и Зр зоны. Через 6-9 недель проводили электрофизиологические измерения в условиях хронического опыта на ненаркотизированных необездвиженных животных, по окончании которых осуществляли морфологический контроль изоляции у каждого животного на срезах мозга (рис.1).

Импульсную активность регистрировали в CM (АР±2, L3-5) и Зр [АР+(10-11), L7*9] зонах коры вольфрамовыми микроэлектродами (рис.1). Фоновоактивными (ФА) считали нейроны, на нейрограмме которых соотношение сигнал/шум было не менее 3/1, а импульсная активность представляла последовательность не менее 8-10 спайкоЕ в течение 30 с (для низкочастотных клеток) или продолжалась не менее 15 с (для высокочастотных клеток). При исследовании структурно-функциональной организации (ИзК - 6 кроликов, ИтК - 9) анализировали: среднее число ФА клеток в треке (ИнтК: СМ -22 трека, Зр -19; ИзК: СМ-18, Зр-19), среднюю частоту разрядов нейронов (ИнтК:

L4 АР+11

Рис.1.Изоляция коры и схема эксперимента.

СМ-125 клеток, Зр-150; ИзК: СМ-86. Зр-81), распределение средних частот, распределение ФА клеток по слоям (ИнтК: СМ-94 клетки, Зр-96; ИзК: СМ-142, Зр-108). Границы трека традиционно определяли по изменению микроэлектродного и нейронного шумов. Глубину трека контролировали измерением толщины коры по окончании опытов. Ширину слоев определяли на серийных целлоидиновых 20-микронных срезах. Временную организацию импульсного потока (ИзК - 15 кроликов, ИнтК -16) определяли по его АКФ (ИнтК: СМ-79 клеток, Зр-107; ИзК: СМ-71, 3р-73). Скоррелированность импульсных потоков (ИзК-9 кроликов, ИнтК-7) анализировали по ККФ нейронной активности, одновременно регистрируемой в СМ и Зр зонах (ИнтК: 39 пар; ИзК:45). Программа статистической обработки включала вычисление доверительных уровней для 1-, 2-й 3-точечных отклонений АКФ и ККФ от средней линии. Для выявления общих закономерностей усредняли АКФ и ККФ разных пар нейронов и определяли достоверность пиков суш,(арных коррелограмм по критерию Стьюдента. В диапазоне малых задержек (до 61 мс) сравнивали средние значения в отдельных бинах по критериям Колмогорова и Фишера и определяли соотношение ^/Ро, где Я1 - значение ККФ в 1-ом временном интервале, йо - КК. ЭЭГ регистрировали монополярно стальными игольчатыми электродами, вживленными в СМ (АР±2, Ь3*5) и Зр [АР+(10*11), 1,7+93. Раствор АХ (8x10'2М) вводили субдурально микроинъектором через специальный хемитрод, вживленный посредине между отводящими электродами (рис.1). Для исследования спектрального состава ЭЭГ (ИзК-13 кроликов, 20 опытов; ИнтК - соответственно 6, б) в результате статистической обработки получали ненормированный спектр мощности ЭЭГ с доверительными интервалами. Введение АХ (ИзК- 6 кроликов, 6 опытов; ИнтК - соответственно 5, 5). После 30-мин записи фоновой ЭЭГ в ЦСЖ быстро (5-10 с) вводили субдурально раствор АХ (8x10"2М, 10-20 мкл) микроинъектором через хемитрод, 15 мин регистрировали ЭЭГ, затем повторно вводили АХ и регистрировали ЭЭГ 15-30 мин (2-5 введений). При статистической обработке строили ненормированный спектр мощности ЭЭГ для каждой минуты (с доверительными интервалами), вычисляли функцию когерентности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Хирургическая изоляция неокортекса приводит к определенным изменениям его структурно-функциональной организации. Прежде всего уменьшается среднее число ФА клеток в треке: в 2 раза в СМ зоне (ИзК - 8, ИнтК - 17) и в 3 раза в Зр (ИзК-6, ИтнК-17). Одновременно увеличивается число "фоновомолчащих" клеток, реагирующих на механическое касание электродом (ИзК: 2-3/трек, что составляет 35% от ФА клеток; ИнтК: 1-2/трек, 956). Средние частоты импульсации по всем зарегистрированным ФА клеткам статистически не различимы ни для СМ (6,4*1,3 имп/с) и Зр (6.54.2) зон в ИнтК, ни для СМ (5.6±1.8) и Зр (5,1±1,4) зон в ИзК, ни при их сравнении по зонам между ИнтК и ИзК. Анализ частотного распределения показал, что большинство ФА клеток СМ и Зр зон ИнтК и ИзК разряжаются со средней частотой до 10 имп/с, однако процент клеток с частотой до 1 имп/с в ИзК для обеих зон примерно в 3 раза выше по сравнении с ИнтК (рис.2). После изоляции происходит перераспределение ФА клеток по слоям (рис.3). Если в ИнтК большинство их регистрируется в нижних слоях (СМ зона-67%, Зр -64,5%), то в ИзК только половина всех зафиксированных ФА клеток приходится на эти слои (СМ зона - 46.5%, Зр -50%). Это наблюдение согласуется с литературными данными о том, что заметные морфологические изменения происходят именно в нижних слоях ИзК. По результатам собственного визуального гистологического контроля (статистической обработки не проводили) в слоях 5-6 ИзК происходит гибель части крупных и средних пирамид, причем этот

10

СМ зона N=1 25

интакгная кора (\л

еО

Зр зона 150

А

сенсомоторная зрительная

70-

10 15 20 15 10 15 20 изолированная кора

имп/с

СМ зона N = 86 ■

л

10 15 20

Зр зона N=81

"И пП ^и»

10 15 20

л/с

50

30-

10

I

Т

1-Э45-6

1-3 ^ 5-6

Рис.2.Распределение средних частот импульсации нейронов ИнтК и ИзК. в %. М-число проанализированных нейронов, по оси абсцисс -частота, имп/с.

Рлс.3.Распределение фоновоактивных клеток по слоям ИнтК (сплошная линия) и ИзК (пунктирная линия). По оси ординат - число клеток.

0

эффект сильнее выражен в сенсомоторной зоне. Нейронная активность слоя 4 в ИнтК служила критерием местонахождения электрода - в обеих областях на данном уровне погружения регистрировались группы импульсов, которые принадлежали разным клеткам и имели различающиеся амплитуды. В ИзК на глубине погружения электрода, соответствующей 4 слою, не было зарегистрировано ни одного устойчивого ФА нейрона (рис.3). Этот факт вполне объясним, т.к. известно, что клетки 4 слоя являются мишенью специфических таламических афферен-тов, которые перерезаются в процессе изоляции.

При анализе временной организации импульсных потоков ФА нейронов на основании характера активности и формы ее АКФ было выделено 4 основных паттерна ФИА (рис. 4): одиночный, одиночно-групповой, пачечный и пачечно-групповой. Формы АКФ были получены при следующих параметрах построения: интервал квантования временной оси - 11 мс, длина ветви АКФ 1100 мс, причем программа обработки была такой. что первое окно равнялось М/2=5,5 мс*, что позволяло точнее определить форму АКФ в диапазоне малых задержек (до 61 мс). Выбранная длина эпохи анализа (ИООмс) давала возможность анализировать частоты, характерные для электрической активности коры головного мозга кролика (дельта- и тета-диапазон).

*) Временные параметры е дальнейшем будут округляться, чтобы не перегружать читателя и не создавать иллюзии высокой значимости количественных временных характеристик. Корреляционный анализ

в значительной степени устраняет элемент субъективности при построении распределения клеток по типам их ФИА, что важно при изучении перестроек в характере спонтанной активности под влиянием различных факторов, в данном случае - деафферентации коры. Лишение притока афферентного возбуждения приводит к изменениям характера работы корковых клеток, что проявляется в выраженной тенденции к усилению процессов группи-

одиночныи

одиночно-групповой

0,05- 0,0 5

Г4. | с""- -Ч >-ч —

I 200

0,05- / -0,05

0,1 -0,1

пачечный

пачечно-групповой

0,1-

200

-0,1

200

Рис.4. Типичные индивидуальные АКФ нейронной активности (с указанием типа ФИА нейрона). По оси ординат- значения АКФ: в нулевой точке значения АКФ равны единице и на рисунке не показаны .

рования в ИзК (табл.). Если в ИнтК около трети ФА клеток (СМ-33%, Зр-27%) имеют одиночный тип разряда, то в ИзК он представлен мало (СМ-4%, Зр- 10%). Пачечная активность выражена незначительно и в ИнтК, и ИзК, зато, если в СМ зоне ИнтК всего 18% ФА клеток работают в пачечно-групповом режиме, то о ИзК их 47%. В Зр области увеличение не такое яркое (31% и 38% соответственно), но здесь заметным становится одиночно-групповой тип ФИА (ИнтК- 29%, ИзК- 44%). В ИзК нейроны разряжались группами и пачками импульсов, которые следовали нерегулярно и перемежались сравнительно длительными периодами молчания, измеряемыми сотнями миллисекунд.

Таблица. Распределение фоновоактивных нейронов по

типам фоновой импульсной активности.

Типы ФИА Сенсомото рная зона Зрительная зона

ИнтК, N=79 ИзК, N=71 ИнтК, N=107 ИзК, N=73

Одиночный 26 (32,9%) 3 (4,2%) 29 (27,1%) 7 (9,6%)

Одиночно-групповой 33 (41,8%) 28 (39,4%) 31 (28,9%) 32 (43,8%)

Пачечный 6 (7,6%) 7 (9,9%) 14(13,1%) 6 (8,2%)

Пачечно-групповой 14 (17,7%) 33 (46,5%) 33 (30,9%) 28 (38,4%)

N - количество проанализированных нейронов.

Математический анализ условий возникновения электрической активности коры /Жадин, 1982,1994/, проведенный на основе представлений о ней как о совокупности взаимосвязанных возбудительных и тормозных клеток, показал, что для поддержания незатухающей спонтанной импульсной активности клеток коры необходим либо приток возбуждения по корковым афферентам, либо наличие эндогенно активных клеток в коре. Наличие спонтанной импульсной активности в ИзК, лишенной возбуждающего афферентного притока, может быть объяснено только существованием в коре эндогенно активных нейронов. Ранее подобные клетки обнаружены в ретикулярной формации /Segundo et al.,1967/, септуме /Виноградова с соав., 1979/, а позже и в неокор-тексе морской свинки (метод переживающих срезов /Карнуп с соав., 1985/). Однако в деафферентированной коре эндогенно активные клетки обеспечивают невысокий уровень активации по сравнению с ИнтК. Формирование спонтанной активности в ИзК, возможно, происходит следующим образом. Эндогенно активные клетки, которые скорее всего, подобно нейронам беспозвоночных, имеют смешанный эндоген-но-синалтический механизм импульсации /Соколов, 1975/, по корко-во-корковым связям активируют нейроны ИзК, которые вовлекают в ак-

тивность следующие группы клеток. Число ФА клеток постепенно растёт, пока активность не охватит заметный процент клеток и не включит механизм возвратного торможения, предположительно имеющий место в коре /Батуев, 1978; Заркешев, 1980; Шуранова.1977; Элькина, Холодов, 1971; Серков,1986/. Тормозные клетки, вовлекаясь в деятельность, выключают часть ФА нейронов, которые находятся в низкоактивном состоянии до тех пор, пока до них не дойдет очередная волна возбуждения, исходящая от эндогенно активных клеток. Таким образом, спонтанная активность нейронов ИзК формируется в виде достаточно длительных нерегулярных периодов активации, перемежающихся тоже нерегулярными периодами торможения. Эти длительные периоды торможения, разделяющие группы и пачки импульсов, на АКФ проявлялись в виде длительного "хвоста", который колебался около средней линии после начального подъёма, отражающего групповую активность. Причиной существования в ИзК длительных тормозных и активационных периодов, по-видимому, является сравнительно низкий уровень её возбуждения по сравнению с ИнтК. Этому утверждению не противоречит тот факт, что в ИзК сохраняется заметный процент клеток, разряжающихся с высокой частотой (рис.2). Действительно, тормозные нейроны, суммируя воздействия большого числа клеток /Батуев.1978; Шура-нова, 1977/, оказывают тормозящее действие на пирамидные нейроны только при достижении определенного уровня активности. Так как в ИзК число ФА клеток меньше, чем в ИнтК, отдельные пирамидные нейроны в ней могут достигать более высокого уровня возбуждения по сравнению с нейронами ИнтК прежде, чем они затормозятся. Описанные процессы приводят к установлению слабо синхронизированной низкочастотной ритмики с превалирующими дельта-частотами на ЭЭГ ИзК, что и наблюдается в опыте. В ИнтК приток афферентного возбуждения, быстро приводящий клетки в активное состояние, существенно уменьшает период между прекращением гиперполяризации на соме пирамидных клеток и возобновлением активации указанных нейронов /Жадин,1982/. В определенной мере афферентный поток также синхронизирует время возникновения гиперполяризации, обусловленной механизмом возвратного торможения. В результате возникает более регулярная и высокочастотная ритмика биопотенциалов ИнтК под действием афферентного возбуждения.

Для изучения возможности передачи возбуждения по коре анализировали ККФ импульсных потоков клеток СМ и Зр зон (ИнтК - 39 пар, ИзК -45), причем достоверные отклонения ККФ от средней линии рассматривали как повышенную вероятность разряда одного нейрона вслед за разрядом другого /Жадин с соав. ,1977; и др./, а временной сдвиг отклонения - как задержку, с которой разряды возникают друг относительно друга. Правая ветвь ККФ отражала вероятность разряда

изолированная кора -ВД1

клетки СМ зоны после разряда клетки Зр. левая - наоборот. Средний КК, посчитанный в интервале. ±6 мс. равен 2,64,6(10"3) для клеток ИнтК и З.г^.ОСЮ"3) для ИзК. Анализ индивидуальных ККФ им-пульсации как в ИнтК, так и в ИзК. не выявил существенных закономерностей в них. Анализ суммарных ККФ показал, что значимые отклонения имелись только в диапазоне малых задержек (до 61 мс), причем в ККФ активности ИзК в обеих ветвях, а ИнтК только в правой (рис.5). Взаимосогласованность работы двух нейронов может быть обусловлена либо морфофункционапьной связью между ними, либо влиянием на них общего источника, так называемого общего входа, который может находиться как в подкорковых структурах, так и в самой коре. Известно, что Зр кора, тщательно и всесторонне исследованная многими авторами /Обухова,1966,1981; Супин,1981; Маунткасл, 1981 и др. /, существенно отличается тем, что имеет в целом наименьшее число входящих кортикальных связей из других зон по сравнению с другими областями коры. Это дает возможность считать, что в ИнтК для СМ и Зр областей существование внутрикортикапьного общего входа маловероятно. Для хронической ИзК такое положение не вполне очевидно, так как происходящее в ней увеличение числа корко-кор-ковых связей /Новожилова, Бабминдра, 1980; Серков, Гете, 1980 а, б; Gruner et al., 1974/. возможно, приводит к формированию внутрико-ртикального общего входа. Это предположение опровергается тем, что расположение достоверных отклонений в правых ветвях суммарных ККФ не меняется после изоляции (т.е. они отражают процесс, общий для ИнтК и ИзК, рис. 5). Поскольку в ИзК не существует подкоркового общего входа, мы вправе утверждать, что главной причиной, обусловливающей повы-

интактная кора

«004

ш

50

I I -

L 6i

-0,002

L-Q002

Рис.5. Суммарные кросскорреляционные функции импульсной активности нейронов ИнтК и ИзК в диапазоне малых задержек. Правая ветвь-разряд сенсомо-торного нейрона после разряда зрительного, левая-наоборот. По оси орди-нат-значения ККФ. черные кружки-дос-товерные отклонения ККФ от средней линии. стрелки-величина доверительного интервала для данного значения.

шенную скоррелированность работы двух удалённых нейронов в ИзК, является внутрикортикальная взаимосвязь между ними. Трудно ожидать. что регистрируемые нами нейроны, находящиеся на расстоянии 12-15 мм друг от друга и принадлежащие разным проекционным областям, связаны моносинаптически. Скорее всего, возбуждение передается с клетки на клетку в микрообъеме коры по коротким межнейронным связям, и только достигнув нейрона, имеющего выход в белое вещество, оно переходит в другой микрообъем, где также будет некоторое время распространяться по коротким внутрикорковым связям. Таких переходов через белое вещество может быть несколько, прежде чем возбуждение перейдет из одной проекционной зоны в другую. То есть, можно представить, что проведение возбуждения по коре состоит из двух компонент - проведения по коротким внутрикорковым связям и проведения по длинным связям с выходом в белое вещество. Ввиду быстрого распространения импульсов по миелинизированным волокнам белого вещества кажется очевидным, что если взаимодействие между двумя удаленными нейронами осуществляется только посредством длинных связей, оно будет протекать быстро, за 2-3 мс. Если же допустить возможность взаимодействия двух нейронов только посредством коротких связей, этот процесс может длиться очень долго при условии, что возбуждение не затухнет раньше, чем достигнет цели. Иначе говоря, длинные связи осуществляют быструю компоненту проведения, а короткие - медленную. Тогда коэффициент корреляции (Яо), посчитанный в нашей работе в интервале ±6 мс отражает, главным образом, участие длинных связей в проведении возбуждения, а отклонения ККФ от среднего значения ) при больших временных сдвигах - возрастающую долю участия коротких связей. При этом чем больше сдвиг ККФ, тем дольше длится передача возбуждения. Соотношение в

таком случае указывает на то, какие связи преобладают в переносе возбуждения - длинные или короткие. Действительно, если возбуждение приходит из СМ зоны в Зр за 28-39 мс (рис.5- ИзК, левая ветвь, Из), то вклад длинных и коротких связей в процесс переноса примерно одинаков, т.к. Из/Но»!. В переходе возбуждения с затратой времени 39-50 мс №4) большую нагрузку несут короткие связи (И4/1^0=1,8 больше 1), зато дальнейшее удлинение времени передачи (50-61 мс, Я5) происходит за счет увеличения удельного веса длинных связей (1*5 Л?о =0,5 меньше 1). Поскольку возбуждение клетки передается не непосредственно на другую, удаленную, клетку, а из одного микрообъема коры в другой, оно может переключаться произвольное число раз по любым (коротким и длинным) связям прежде, чем достигнет регистрируемого нейрона.

Наличие положительных достоверных отклонений в обеих ветвях суммарной ККФ нейронной активности ИзК свидетельствует о возмож-

ности переноса возбуждения в ней как из Зр области в СМ (правая ветвь), так и из СМ в Зр (левая ветвь). Однако расположение достоверных отклонений на временной оси показывает, что если на переход возбуждения из Зр коры в СМ необходимо время примерно до 28 мс, то предпочтительное время передачи в обратном направлении оказывается большим и оценивается в 28-61 мс. Можно полагать, что те же особенности распространения возбуждения свойственны и ИнтК, однако рельеф ее усредненной ККФ менее выражен и как бы "зашумлен". Этот эффект будет иметь место, если афферентный приток носит шумовой характер и слабо синхронизирован в разных волокнах на уровне коэффициента корреляции, меньшим по сравнению с положительными экстремумами усредненной ККФ ИзК.

Анализ фоновой ЭЭГ ИзК показал, что в ней всегда доминировали медленные процессы - нерегулярные высокоамплитудные (300 -400 мкВ) дельта - волны; тета-активность была нерегулярной и существенно менее выраженной по сравнению с ИнтК, в фоновой ЗЗГ которой основными составляющими были дельта- и тета-колебания (0,5-3,5 и 4,07,5 Гц). Спектры ЭЭГ ИзК имели, как правило, один выраженный пик в дельта - диапазоне, в отличие от автоспектров ИнтК с разной выраженностью пиков в дельта- и тета-диапазонах (рис.6). Фоновая когерентность ЭЭГ СМ и Зр зон для ИзК и ИнтК различалась, главным образом, в диапазоне частот 8-13 Гц: в ИзК на этих частотах она была практически равна нулю (рис.7).

1000

Итак, ИзК сохраняет основные генерировать суммарную и фоновую импульсную активность. В ИзК возможна передача возбуждения на достаточно большие расстояния. Что же происходит в коре в результате хирургической деафферентации? Литературные данные убедительно свидетельствуют о том, что нормальным ответом нео-кортекса на изменение сенсорного опыта является с одной стороны ветвление терми-налей и синаптическая пролиферация /Новожилова, Бабмин-дра, 1980; Усова, 1975; Хана-нашвили, 1971; Серков, Генис, 1980; Darlan-Smith, Gilbert. 1994/, а с другой - функцио-

корковые свойства - способность

интактная кора

200

100

Рис.6.Типичные фоновые суммарные спектры мощности автокор-релограмм сенсомоторной (сплошная линия) и зрительной (пунктирная) зон. По оси ординат -значения спектра мощности,мкВ2.

нальное увеличение корко-корковых связей за счет "демаскировки" уже имеющихся, но не функционирующих в нормальном состоянии и находящихся как бы в резерве /Barlnaga M. 1992; Byrne, Cal ford, 1991; Cal ford. Tweedale. 1988. 1991; Clark et al.. 1988; Das, Gilbert. 1995; Diamond et al.,1993; Doetsch et al.,1996; Haas, 1991,1995; Kaas et al.. 1990; Merzenich et al., 1987; Nudo et al.. 1990; Pons et al., 1991; Ramochandran et al.,1992; Xerry et al.,1994/. Поэтому можно предположить, что изоляция, отключая кору от подкорковых синаптическия влияний, лишает ее мощного притока возбуждения, но с другой стороны, усиливает ее собственные внутренние свойства за счет морфологического и функционального увеличения числа корко-корковых связей.

Анализ биофизической модели формирования ЭЭГ /Жадин, 1994/ показал, что спектр ЭЭГ существенно зависит от уровня собственного возбуждения коры: при невысоком уровне активации коры в ЭЭГ преобладают дельта-волны, а при усилении возбуждения в спектре ЭЭГ появляются все более высокие частоты, низкочастотные же ритмы становятся менее выраженными. Преобладание дельта-активности в деаффе-рентированной коре (рис.6), представляется обусловленным именно резким снижением её активации за счет прекращения афферентного возбуждающего притока. В качестве иллюстрации методических возможностей ИзК и с целью экспериментальной проверки теоретического вы-воЭа модели был проведен сравнительный спектральный анализ ЭЭГ ИзК при искусственном изменении уровня ее собственного возбуждения. Для повышения уровня активации применяли АХ, выбор которого обусловлен следующими соображениями. 1. Давно и надежно показано, что в коре головного мозга млекопитающих происходит выделение свободного АХ, количество которого зависит от уровня возбуждения коры и коррелирует с ним /Celesia,Jasper, 1966/. 2.В коре имеется большое

0.5

0.5

0.5

0,5

0.5

0.5

\ фон

---— lÎHH 1 ____ 1-ая мин

6-ая мин j . 7-ая мин

/ —^-ая МИН 1-4 j_^ 9-ая мин

^К)-ая мин 1 h- 10-ая мин

--ч^^М-ая^ мин г«] 12-ая мин

ГЦ

1

1Е>

15 1

10

15

Рис.7. Изменение когерентности ЭЭГ ИзК (слева) и ИнтК (справа) после введения АХ. По оси ординат - значения когерентности.

количество холиночувствительных клеток, в частности в коре нео-бездвиженных, ненаркотизированных кроликов они составляют до 7056 всех ФА нейронов /Олейник, 1978/. Отмечена тенденция к преимущественному сосредоточению таких клеток в более глубоких слоях коры, но и в 1 слое обнаружена достаточно высокая плотность холинерги-ческих мускариновых и никотиновых рецепторов /Sarter, Bruno,1997; ZI1les et al., 1989 и др./. 3.Большинство нейронов ИнтК и изолированной полоски отвечает возбуждением при микроионофоретическом воздействии на них АХ /Ильюченок,Гилинский,1971; Krnjevic et al., 1971 и др./, хотя регистрируются клетки, отвечающие торможением /Phillis,1974/. Понижение количества АХ в коре (введением антихо-линергических веществ) сопровождается отчетливо выраженной тенденцией к группированию разрядов клеток /Ильюченок, Гилинский, 1971/, а увеличение (например,стимуляцией ретикулярной формации) - усилением упорядоченности спайковой активности /Якупова,1988/. Тенденция к группированию импульсов, наблюдавшаяся нами в ИзК, логически хорошо согласуется с двумя последними положениями. Безусловно, действие вводимого в ЦСЖ АХ, не заменяло в полной мере возбуждающего подкоркового афферентного притока, но в данном случае это не имело принципиального значения. Главной задачей было создать в ИзК очаг возбуждения, который увеличил бы число активных нейронов в ниро-ком, окружавшем очаг участке коры, включавшем СМ и Зр зоны. Количество вводимого АХ (10-20 мкл) значительно превышает его нормальное высвобождение интактной корой /Celesla, Jasper, 1966/. Однако, попадая в ЦСЖ, АХ прежде, чем дойти до корковых синапсов 1 слоя, частично гидролизуется ложной холинэстеразой, которая содержится в ликворе. Диффундируя по межклеточному пространству, АХ подвергается гидролизу истинной АХЭ. Т.е., реальное его количество в коре хотя и неизвестно, но, очевидно, существенно меньие вводимого. Мы подобрали минимальную дозу, которая вызывала изменения в ЭЭГ ИзК и её спектре. Дойдя до коры, АХ действует на 1 слой, в котором зафиксировано значительное количество мускариновых и никотиновых рецепторов, вызывая в первый момент возбуждение, иррадиирующее по коре от места введения. Затем наступает синаптическая блокада, вызванная избытком АХ /Ильюченок, 1972/, которая рано или поздно прекращается в результате действия АХЭ, обнаруженной в изолированной полоске и ИзК /Бурчинская с соав.,1984; Хананашвили,1971/. Для того, чтобы возбуждение достигло исследуемых участков, находящихся на расстоянии 6-8 мм от места введения, нужно время (что мы и наблюдали в опыте: реакция наступала на 1-3-й мин после введения АХ).

Введение АХ вызывало в ИзК реакцию, которая имела у разных животных свои особенности, но три её последовательные фазы выделялись вполне отчетливо, что проиллюстрировано на примере одного

кролика (рис.8): 1 - появление нерегулярных коротких (2-4 с) периодов активности с повышением частоты до 3-6 Гц. не проявляющейся на спектрограмме; заметное снижение амплитуды дельта-волн и последующий ее рост (6-8 мин) до фоновых значений, что выражалось в уменьшении и последующем росте (рис.8) соответствующих отклонений спектральной кривой; 2 - дальнейший рост амплитуды дельта-волн (максимальные значения - на 7-8 мин, рис.8), сопровождающийся усилением процессов, которые могли иметь частоту выше тета-диапазона (до 13 Гц, рис.8, 7-ая мин); 3 - постепенное возвращение активности в состояние, близкое к фоновому. Особенностью реакции этого животного было появление на 10 сек (в конце 7-ой мин) судорожной активности в ЭЭГ без внешних

фон

900,

I о

проявлений судорог (рис.9). Когерентность в первые 5-7 мин увеличивалась в диапазоне 0, 5-1 Гц. затем ее рост отмечен только в диапазоне 7-10 Гц и наконец на 14-15 мин. кривая когерентности была по форме близка к фоновой, но в диапазоне 8-13 Гц сохраняла повышенные в 2-4 раза (по сравнению с фоном) значения (рис.7). При повторном введении АХ реакция протекала качественно также, но быстрее. Если реакция на первое введение была выражена слабо и заключалась в незначительных изменениях амплитуды ЭЭГ. то реакция на второе введение име-

900,

ю

1-ая мин после введения — Гц 6-ая мин

600-

Гц

15

Б-ая мин

900

600-

14 - а я мин

I200

1 5 _I мкв

1с

Рис. 8 .Влияние I введения АХ на электрическую активность ИзК. Слева-суммарные спектры модности автокоррелограмм: сплошная линия-сенсомоторная зона, пунктирная-зрительная; по оси ординат-значения спектра. мкВ2. Справа - фрагменты ЭЭГ: верхняя линия - сенсомоторная зона, нихняя линия -зрительная.

ая мин

ла все 3 фазы. В определенный промежуток времени ЭЭГ и ее спектр внешне не отличались от таковых для ИнтК (рис.10). Высокочастотная активность могла достигать значений 10-13 Гц.

Реакция ИнтК на введение АХ (5 опытов на 5 животных) заключалась, главным образом, в увеличении амплитуды ЭЭГ (иногда с первоначальным незначительным уменьшением) , что отражалось на спектрограммах. Более значительные изменения наблюдались в дельта-диапазоне (рис.11) на 5-10 мин. Затем амплитуда ЭЭГ или постепенно снижалась, или оставалась достаточно высокой по сравнению с фоном. Периоды высокочастотной активности могли проявиться на автоспектре примерно на 7-10 мин (не у всех животных и не в обеих областях коры, рис.11,Зр). Когерентность после введения колебалась на частотах дельта- и те-та-диалазонов, но уже с 1-3 мин исчезала в диапазоне выше 9-10 Гц (рис.7) и не восстанавливалась в нем даже на 12 мин.

Таким образом, под действием АХ в ИзК наблюдались характерные признаки усиления уровня возбуждения в ЭЭГ - сначала

I введение АХ. конец /-ои мин

1200 _|м

кВ

IV введение АХ. 6-ая мин 1с

И

П'

200 мкВ

1 с

Рис.9. Примеры развития судорожной активности в ИзК после введения АХ (разные животные). Верхняя кривая-сенсомоторная зона, нижняя -зрительная .

500 200

500 200

400 100

500 100

1

.Гц

1 5 10 15

I введение АХ. 10-ая мин

. Гц

10 15

И введение АХ. 1-ая мин Гц

15 10 15

II введение.АХ. 3-ья мин

200 мкВ

15 10 15

.Гц

1с

Рис. 10.Пример отсутствия выраженной реакции ИзК на I введение АХ и реакция на II введение. Зрительная зона. По оси ординат-значе-ния суммарных автоспектров. мкВ2.

усиливалась тста и ослаблялась дельта - активность, появлялись и постепенно усиливались более высокочастотные ритмы (рис.8). ЭЭГ становилась на некоторое время похожей на фоновую ЭЭГ ИнтК. (рис.12). Затем ЭЭГ постепенно приходила в исходное состояние. Весь период возбуждения коры продолжался около 10 мин. Очевидно,

что такая растянутая во времени реакция на введение АХ отражает, с одной стороны, системный процесс, при котором очаг возбуждения довольно долго остается самоподдерживающимся за счет вовлечения в процесс новых внугрикорковых связей и нейронов. С другой стороны, сравнительно большая доза вводимого АХ позволяет ему долгое время сохраняться в ЦСЖ и быть источником возбуждения многих клеток. В двух опытах была зарегистрирована судорожная активность, которая в одной ситуации была продолжением усиления процессов возбуждения (I

введение АХ), а в другом опыте имела место лишь при четвертом введение АХ без предшествующих последовательных фаз развития реакции (рис.9). В рамках указанной модели форма спектра ЭЭГ определяется значениями коэффициентов А и В, которые пропорциональны плотностям синапсов между возбудительными и тормозными и тормозными и возбудительными клетка. ми, количеству возбудительных и тормозных кле-

/-ая мин

10 15 1

Ю 15

Рис.11.Влняние I введение АХ на электрическую активность ИнтК. Суммарные спектры мощности автокосрелограмм сенсомоторной (сплошная линия) и зрительной (пунктирная! зон. По оси ординат - значения спектра. мкВ3 .

интактная кора, фон

Мумл

изолированная кора. фон

изолированная кора, 10-ая мин. после II введения АХ

200мкВ

1с

Рис.12.ЭЭГ ИнтК в фоне и изменение ЭЭГ

ИпК ПОСЛР ПНР. ПРРИЯ АУ. ЧшгТРПкИЯО ^пыя

ток, а также уровню активации коры. Заметное изменение хотя бы одного параметра приводит к тому, что режим работы коры, пройдя зону физиологического функционирования, попадает в область патологического состояния, когда электрическая активность становится незатухающей и самоподдерживающейся. Один из вариантов такой активности - судорожная. Вероятно, в ИзК поступление экзогенного АХ может вызвать такое увеличение А и В, которое не только нейтрализует их исходно низкие (до введения) значения по сравнению с ИнтК (за счет уменьшения общего количества клеток и синапсов в ИзК), но и переводит кору из физиологического функционирования в патологическое.

В ИнтК АХ вызывал лишь увеличение амплитуды ЭЭГ и соответственно высоты частотных пиков (рис.11), которые мы склонны рассматривать как отражение усиления возбудительных процессов в ИнтК. Очевидно. поведение ИнтК определяется в первую очередь мощным контролем подкорковых структур, . оказывающих стабилизирующее влияние. Возможно также, что в подобных экстремальных условиях (мощное увеличение уровня активации за счет экзогенного АХ) происходит процесс, обратный демаскировке связей (см. выше), а именно - их "маскировка". То есть подкорковые структуры функционально выключают часть корко-корковых связей для того, чтобы предотвратить переход коры в состояние патологической активности. Быть может именно в связи с этим ИнтК слабее и несколько инкм образом реагирует на воздействие экзогенного АХ.

Анализ изменения когерентности показывает, что в формировании реакции ИзК принимают участие более высокочастотные, чем тета-ритм, процессы, и их доля значительна (рис.7). В ЭЭГ ИнтК (рис.7) во время реакции на АХ когерентность в тета-диапазоне становилась выше, чем в дельта-диапазоне, что также обычно является показате-' лем активации коры /Труш, Кориневский. 1978/.

Таким образом, структурно-функциональные характеристики ИзК кролика, полученные и проанализированные в данной работе, подтверждают, что она является полноценной экспериментальной моделью, на которой можно изучать механизмы функционирования, присущие самой коре. Продемонстрировано, что при искусственном повышении её возбуждения до определенного уровня изолированная кора способна генерировать электрическую активность, спектр и форма которой вполне подобны спектру и форме ЭЭГ интактной коры. ИзК оказалась способной к генерации достаточно регулярных высокочастотных ритмов и судорожной активности. Это совпадает с основными выводами теоретической модели /Жадин, 1994; гЬас11п. 1984/, главным из которых является то, что ритмика ЭЭГ в значительной мере определяется общим уровнем активации коры. В естественных условиях в спектре ЭЭГ может проявляться ритмическая активность подкорковых структур, но

лишь в том случае, если она ярко выражена, синхронна в большом числе корковых афферентов и соответствует спектральному диапазону ритмики, генерируемой самой корой /Жадин, 1994; гйасИп. 1984/. Кроме того подтверждено положение вышеупомянутой модели о том, что сама кора является основным генератором ЭЭГ с её общими свойствами, при этом подкорковые структуры опосредованно влияют на генерацию ЭЭГ, главным образом модулируя средний уровень активации корковых нейронов.

ВЫВОДЫ.

Анализ полученных данных позволяет сделать следующие выводы.

1. Хроническая изоляция неокортекса от афферентных воздействий приводит к заметному уменьшению в нем количества фоновоактивных клеток, увеличению числа "молчащих" клеток, к перераспределению ФА нейронов по поперечнику коры и увеличен™ процента клеток, имеющих низкую частоту разряда. Большинство (около70%) нейронов ИзК в поздние сроки после изоляции (6-9 недель) имеет пачечно-групповой тип активности, характеризующийся чередованием нерегулярных длительных (до нескольких секунд) периодов активации и таких же нерегулярных и длительных периодов торможения. Начальное отрицательное отклонение в АКФ, как правило, отсутствует. В ИнтК преобладает одиночный (около 40%) и одиночногрупповой (около25%) типы активности. для которых характерно наличие интервала послеразрядного торможения длительностью 25-35 мс, проявляющегося в АКФ отрицательным отклонением от средней линии вблизи нулевой точки. В спектре ЭЭГ ИзК происходит уменьшение выраженности частот тета-ди-апазона и одновременное усиление частот дельта-диапазона.

Эти экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при де-гфферентации кора сохраняет свои основные свойства (фоновую импульсную активность и фоновую ЭЭГ), но уровень её возбуждения понижается по сравнению с ИнтК.

2. Средние корреляционные коэффициенты активности взаимно-удалённых нейронов зрительной и сенсомоторной областей ИнтК и ИзК достоверно положительны и равны соответственно 2,6 1 1,6(х10"3) и 3,2 1 З,0(х10"3). Наличие достоверных экстремумов на суммарной кросскорреляционной функции активности удаленных нейронов отражает возможность передачи возбуждения в ИзК от нейронов зрительной области к нейронам сенсомоторной, и наоборот. В первом случае передача может длиться до 28 мс, во втором переход осуществляется медленнее - от 28 до 61 мс. Это доказывает, что кора, в отсутствии связи с подкорковыми структурами, сама способна к передаче возбуждения. Возможность передачи возбуждения в хронической ИзК в обоих направлениях может быть обусловлена как морфологическим увеличени-

ем числа внутрикорковых связей, так и включением в функционирование тех связей , деятельность которых в ИнтК сдерживается подкорковыми структурами.

3. Воздействие АХ на ИзК вызывает сложную многофазную реакцию в ней, длящуюся более 10 минут и сводящуюся главным образом к постепенной смене ритмики - усилению тета-активности и появлению более высокочастотных процессов в ЭЭГ. Это приводит к постепенному переходу ЭЭГ к форме и частотному составу, характерному для ЭЭГ ИнтК. Реакция завершается обратными процессами и возвращением активности в состояние, близкое к фоновому. Этот факт интерпретируется как доказательство предположения о том, что спектральный состав ЭЭГ коры определяется уровнем ее возбуждения.

4. Воздействие АХ на ИнтК вызывает увеличение амплитуды ЭЭГ и высоты пиков в её спектре, в ряде случаев усиливается высокочастотная активность и когерентность на этих частотах возрастает. Различия в реакциях ИнтК и ИзК определяются, по-видимому, в первую очередь сохранением контроля за состоянием ИнтК со стороны подкорковых структур, которые, возможно, функционально отключают часть внутрикорковых связей, не давая тем самым интактной коре перейти в патологическое для нее состояние возбуждения.

5. Показано,что когерентность является более чувствительным параметром при анализе ЭЭГ, чем ее спектральный состав.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Агладзе H.H.(1982). Анализ нейронной активности изолированной коры головного мозга. 1 Всесоюзный биофизич. съезд, Москва, тезисы докл. ,3, 30-31.

2. Агладзе H.H.(1983). Формирование спонтанной импульсной активности в изолированной коре. В сб: Проблемы нейрокибернетики, изд.Ростовского универ., 69.

3. Агладзе H.H., Бахарев Б. В., Жадин М. Н. (1984). Спонтанная импульсная активность нейронов изолированной коры головного мозга кролика. ЖВНД, 34,3,510-519.

4. Игнатьев Д.А..Агладзе H.H. (1984). Изменение электрической активности изолированной коры головного мозга кролика под влиянием аппликации серотонина и ацетилхолина. В сб: Нейрохимические механизмы регуляции памяти, Пущино,69.

5. Агладзе H.H., Бахарев Б.В., Жадин М.Н. (1984). Корреляционный анализ спонтанной импульсной активности нейронов изолированной коры головного мозга. ЖВНД, 34,4,761-766.

6. Игнатьев Д. А., Агладзе H.H., Жадин М.Н. (1985). Влияние серотонина и ацетилхолина на электрическую активность изолированной коры головного мозга кролика. ЖВНД, 35,4,733-741.

7. Ignatyev D. A., Agladze N.N. .Zhadin M.N. (1986). Effect of serotonin and acetylcholine on electrical activity of the isolated rabbit cortex. Neuroscience and Behavioral Physiology, 16.5,376.

8. Агладзе H.H. (1985). Проявление торможения в хронически изолированной коре головного мозга кролика. В сб: Нейронные механизмы коркового торможения, Киев.З.

9. Агладзе Н.Н.(1985). Сравнительный анализ фоновой импульсной активности нейронов зрительной и сенсомоторной области коры головного мозга кролика. ЖВНД, 35,5,980-982.

10. Карнуп С.В., Бортник А.Т.. Агладзе Н.Н., Коломоец А.В. (1987). Частоты электроэнцефалографического диапазона в фоновой им-пульсации нейронов неокортекса in vivo и in vitro. Пущино, деп. в ВИНИТИ, N2145-B87,1-17. И. Агладзе Н.Н.(1989). Анализ фоновой импульсной активности нейронов хронически изолированной коры головного мозга кролика. Пущино, деп. в ВИНИТИ, N1867-B89.

12. Агладзе Н. Н., Жадин М. Н.. Игнатьев Д. А. (1995). Электрическая активность изолированной коры головного мозга кролика после аппликации на неё ацетилхолина. ЖВНД, 45,4. 782-790.

13. Agladze N.N., Zhadin М. N.. Ignatyev D.А.(1996). Electrical activity of isolated rabbit cerebral cortex after direct application of acetylcholine. Neuroscience and Behavioral Physiology, 26, 6:500-506.

14. Agladze N.N.(1997). Electrical activity of the isolated neocortex of rabbit in the background state and after artificial activation by acetylcholine. Proceedings of the 1-st International Symposium "Electrical Activity of the Brain. Mathematical Models & Analytical Methods", Pushchino. May 25-28, 61.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Искренне благодарю коллег - сотрудников лаборатории нейрокибер-нетики, руководимой профессором М.Н.Жадиным, - за помощь и сотрудничество в работе.

Особую сердечную признательность выражаю профессору О.С.Виноградовой за конструктивные советы, своевременную поддержку и дружеское участие.