Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Научные основы методики оценки сортов риса на охраноспособность

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Научные основы методики оценки сортов риса на охраноспособность"

Г ^

\ гВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РИСА

На правах рукописи

МДАТКО ОЛЬГА ВАСИЛЬЕВНА

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ МЕТОДИКИ ОЦЕНКИ СОРТОВ РИСА НА ОХРАНОСПОСОБНОСТЬ

(Специальность 06.01.05,- селекция и семенолодстсс!

Автореферат диссертации на соискание .ученей степей кандидата биологических пау.

•Краснодар, 1996

Работа выполнена в Краснодарском Сельскохозяйственном Биотехнологическом Центре (КСБЦ) в 1990-1996 гг.

Научный,руководитель: академик, доктор сельскохозяйственных

наук Алешин Н. Е. .

Официальные оппоненты: доктор .сельскохозяйственных наук, профессор Апрод А. И.;

кандидат сельскохозяйственных наук. • ■ доцент Курячий Л. Г.

Ведущее предприятие: Научно-технический центр по рису (НТЦ

"Рис") Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации-

Защита состоится "¿6" ноября 1996 г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 020. 66.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте риса по . адресу: . 350083, г. Краснодар, п/о Белозерное.

С диссертацией можно ознакомиться б научной библиотеке ВНИИ риса.

Автореферат разослан зддб г

Ученый секретарь диссертационного совета, ¡сандидат биологических наук ' С? ( ' Е. М. Сорочинская

%

1. ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Необходимым этапом селекционного процесса, помимо собственно селекции, является экспертиза на охраноспособность сортов, которая расширяет возможности поиска и оценки исходного материала для отбора родительских форм, оценки полученного селекционного материала (сорта) № устраняет плагиат при создании сорта.

Наиболее существенным элементом экспертизы на охраноспособность является патентная защита селекционных достижений (получение патента на сорт). В решении данного вопроса.Россия крайне отстала от других стран мира, что обусловило, с одной стороны, расхищение генофонда селекционных центров, а с другой стороны - распространение в производстве сортов растений и пород животных, не прошедших государственное испытание и производственную проверку.

В связи с таким положением Верховный Совет Российской Федерации своим Постановлением N 5606-1 от 6 августа 1993 г. ввел в действие Закон РФ "О селекционных достижениях", в соответствии с которым (п. 2 статьи 4) критериями охраноспособности селекционных достижений являются: новизна, отличимость, однородность, стабильность. Установить соответствие сортов, гибридов названным критериям возможно путем экспертизы на отличимость, однородность и стабильность (ООС), используя частные методики, утвержденные Государственной комиссией Российской Федерации по испытанию и охране селекционных достижений, за основу которых взяты соответствующие методики Международного Союза по Охране Новых Сортов (УПОВ), что облегчает международное сотрудничество по испытанию сортов между ответственными за 1 эти испытания организациями.

Однако, утвержденные методики, и в частности, Методика проведения испытаний на ООС по рису Oryza sativa L. имеет ряд существенных недостатков.

Методика основана на оценке растений по 30 морфологическим признакам, преобладающее количество которых оценивается визуально, что весьма относительно, из-за отсутствия четких градаций по степени выраженности того или иного признака, и

приводит к неизбежным ошибкам, повторным исследованиям, а следовательно значительным материальным и трудовым затратам. Так, для определения отличимости обследуются минимум 20 растений или органов 20 растений (метелки, стебли, листья, зерно и т. д.), для оценки однородности обследуются 100 растений или органов 100 растений по каждому селекционному достижению.

Параметры в методиках на 00С определялись на анализе у$ё существующих популяций сортов каждой культуры и, в принципе, возможна ситуация когда образец будет отличаться по признакам, не включенным в список базы данных. Так, для риса - растения кремниефила содержание кремния является важным показателем. Кремниефильность - сортовой признак, каждый сорт имеет свою сподограмму.

Сходство образцов по морфологии может быть следствием гомологии и не иметь под собой значительного генетического сходства. Кроме того, описываемые признаки имеют определенную дисперсию значений в популяции, которая обычно не учитывается при анализе сходства образцов.

Методика по'рису предусматривает 5 признаков: опушение пластинки предпоследнего листа; антоциановая окраска ушек предпоследнего листа; время выметывания (50% растений с метелки); длина стебля (исключая метелку и плавающий рис); ширина обрушенного зерна, которые следует использовать каждый вегетационный период для оценки всех сортов и всегда включать в описание сорта. Однако, эти признаки значительно варьируют в пределах сорта в зависимости от факторов внешней среды. Это приводит к ситуациям, когда сорта одной группы спелости ни чем не" отличаются по данным признакам друг от друга.

В арсенале Российской науки имеется значительное количество современных методов, позволяющих оцениЬать сорта по различным критериям, обеспечивающим.быструю и точную их оценку, не зависящую от условий внешней среды в связи с чем и была проделана настоящая работа.

Цель исследований. Поиск и подбор методов, позволящих надежно и в короткие сроки идентифицировать сорта риса по хозяйственно ценным и иным признакам с целью использования их на этапе экспертизы селекционных достижений на охраноспособность.

Задачи исследования:

1. Установить методы, обеспечивающие следующие параметры: достоверность, воспроизводимость, массовость, быстроту, исключение зависимости от факторов внешней среды.

2. Определить перечень признаков сортов риса с целью проведения испытаний на ООС.

Научная новизна. - Впервые определен перечень признаков и методов точной и быстрой■оценки сортов риса с - преобладанием •' лабораторных, а не визуальных, приемов, обеспечивающих -.досто^ верность, воспроизводимость,. массовость, быстроту, исключение зависимости от факторов внешней среды.

Практическая значимость работы. Использование отобранных в процессе выполнения данной' работы признаков и методов для патентной экспертизы сортов риса позволят 'усовершенствовать существующую методику по испытанию селекционных достижений на ООС, устранить плагиат при создании сорта, сократить'сроки Государственных испытаний, материально-технические ресурсы и ускорить получение патента.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены: на расширенном заседании Совета НТЦ "Рис" (Краснодар, 1995 г.), на конференциях молодых ученых ВНИИ риса (Краснодар, 1995 г. , Краснодар, 1996 г.), на', ученом Совете ВНИИ риса-(Краснодар, 1996 г.). ' ■

Публикации. Основные результаты исследований, изл^-енные в диссертации, опубликованы в трех статьях. .

Объем-работы. Диссертация/состоит" из введения, 5 глав, выводов, предложений Госкомиссии, . списка использованной литературы, включающего 147 наименований^ в том числе 8 на иностранных языках. Материалы диссертации.изложена на 432. страницах машинописного текста, в 19 таблицах, 13 рисунках.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве . основных объектов исследований использованы сорта селекции ВНИИ риса: Краснодарский 3352, ВРОС 3716, ВРОС МЗЗ, Дубовский.129, ВРОС. 213, ВРОС 5123, Краснодарский 424, Красноармейский 313, . Кубань. 3. Кубань 9, Горизонт, Старт,

Спальчик, Солнечный, Солярис, Альтаир, Жемчужный, Лиман, Кулон, Буденовский, Привольный, ВНИИР 8847, Краснодарский 86, Славянец, .КПХ-1, Касун, Первоцвет, Вевель, Наутико, Павловский, Лагуна, Регул, Рапан (ВНИИР 6753), Спринт.

Для идентификации данных сортов на подлинную оригинальность по критериям ООС использовали следующие методы: определение устойчивости риса к пирикуляриозу; определение солеус-тойчивости растений; отбор продуктивных форм зерновых культур;-выявление кремнийсодержащих биологических структур; оценка селекционного материала риса на ЦМС; подбор родительских пар при гибридизации; разработка смеси для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот растений; электрофоретическое разде- . ление нуклеиновых кислот растений; подбор смеси для анализа оптических свойств митохондрий; • изучение сравнительного распределения белка в эндосперме риса; получение растений-регене-рантов риса; подбор питательной среды для выращивания риса и культивирования пыльников риса; скрининг устойчивых и толерантных к рисоеой листовой нематоде растений риса.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Способы и методы оценки селекционного процесса

Определения устойчивости риса к гафмкуляриозу по а. с.

N 1468442 дает возможность проведения ранней диагностики ус- -тойчивости риса к этому заболеванию. Оценка устойчивости к пирикуляриозу заключается в определении содержания Шзв листьях в фазу повышенной восприимчивости растений,к патогену - в фазу трубкования с помощью мембранного ионселективного электрода при сравнении со стандартом (сорт Краснодарский 424).

Как видно из данных таблицы 1, при коэффициенте корреляции - 0,87, чем больше Шз содержится в листьях, тем менее растения устойчивы к заболеванию. Так, например, сорт Кулон наиболее подвержен заболеванию пирикуляриозом. Рассматриваемый, способ (а.С- N 1468442) дал результаты, сопоставимые с традиционным методом определения устойчивости, в то же время он очень прост для исполнения работниками любой квалификации, не

Выявление интенсивности развития пирикуляриоза в зависимости от содержания нитрат-ионов в листьях

Сорт, сортообразец! Содержание N03 , 1 Интенсивность раз-!мг/100 г сырой массы ! вития болезни, %

Краснодарский 424 18 9,9

Спальчик 14 8,0

Кулон 51 28,1

Лиман 19 10,0

1 30 16,9

2 58 35 у 2

3 37 21,2

требует искусственного инфекционного фона и позволяет быстро оценить селекционный материал на устойчивость к болезни, которая в условиях-Кубани в отдельные годы приобретает характер эпифитотий. Шзтому в экспертную оценку сортов на охраноспособность необходимо ввести" обязательный показатель "устойчивость к пирикуляриозу", а в методику по испытанию селекционных достижений на ООО. в частности по рису, актуально введение' метода оценки на устойчивость к пирикуляриозу по а. с. N 1468442.

Определение солеустойчивости растений риса по а. с. N 1166745 позволяет быстро и полно идентифицировать селекционный материал на солеустойчивость. Актуальность введения этого показателя для экспертной оценки объясняется значительным наличием под посеЕами риса.засоленных земель. Оценка на солеустойчивость заключается в проращивании стерильно выделенных за-родазпей на питательной среде с МаС1.

Как видно из данных таблицы 2 различные сорта риса по показателю солеустойчивости расположились в порядке убывания в следующем порядке: Спальчик > Лиман > Краснодарский 424> Сла-вянец > Союзный. Полученные нами результаты соответствуют дан-

Прорастание изолированных зародышей риса на искусственной питательной среде в стерильных условиях, 7.

Дни Питательная среда

про-

Сорт ращи- без NaCl ! ZZ ÑaCl ¡ 3 % NaCl

вания

рост- !коре- ! рост- ! коре- I рост- ! коре-

ки ! шки I ки ¡ шки ! ки I шки

Спальчик 5 100 93 78 44 2 0

11 100 100 100 70 47 8

15 100 100 100 73 59 12

Союзный 244 5 98 94 16 2 0 0

11 98 98 51 8 3 0

15 98 98 53 14 3 0

Лиман 5 99 98 75 42 2 0

11 99 100 85 .65 40 8

15 99 100 93 70 55 11

Краснодарский 424 5 100 99 60 • 35 2 0

11 100 .100 . 69 59 35 8

15 100 100 77 .62 40 10

Славянец 5 98 98 55 ' -30 0 0

11 99 9S ' 59 48 8 5

15 99 99 68 50 8 7 .

ным сортов по описанию в соответствующих авторских свидетель-, ствах на них. При 2% концентрации МаС1 различия между сортами проявляются укз на 5-й день проращивания, при 37. НаС1 - на 11-й день. Предложенный способ резко увеличивает дифференциацию сортов по солеустойчивости.

Оцешга ка продуктивность по а. с. N 1287313 позволяет путем анализа морфо-физиологических показателей оценить продуктивность сорта. В качестве таких показателей используются ско-

- 'Л

рость накопления сухих веществ растениями риса в фазу всходов и фазу формирования 6-8 листа, корнем в середине фазы кущения и продолжительность фазы трубкования. Расчет продуктивности ведется по формуле:

у = 9,25 + 0,64х1 - 0,28х2 - 0,01хз- 0,08X4

где: у - продуктивность растения в г; - скорость накопления сухого вещества растением в фазу всходов в мг/сут.; хц - скорость накопления сухого вещества корнем в фазу кущения в мг /сут.; Хз - скорость накопления сухого вещества растением в период формирования 6-8 листа в мг/сут.; Х4 - продолжительность фазы трубкования в днях.

Как видно из данных таблицы 3 расчетная продуктивность у

Таблица 3

Фактическая и расчетная продуктивность сортов риса

Скорость накопления сухого Продол- Продуктив-

вещества, мг/сут житель- ность рас-

ность тений, г

Сорт расте- корнем в! растением фазы

нием в середине! в фазу трубко- факти-! рас-

фазу фазы ку-1 6-8 вания, чес- ! чет-

всходов щения листьев дни кая ! ная

(*1) С (х3) (Х4) 1 1

Краснодар-

ский 424 3,67 12,7 232 34 10,7 10, 2

Кулон 4,56 9Д 255 36 9,9 9, 3

Жемчужный 4,57 8,9 301 35 9,4 8, 9

Кубань 3 4,57 10,4 286 33 9,7 9, 6

Старт 3,00 15,1 218 34 10,7 ю, 5

сорта Краснодарский 424 ниже, чем фактическая на 4,7%; у сорта

Кулон - на 6,1%, у сорта Жемчужный - на 5,3%, у сорта Кубань 3 - на 1,0%, у сорта Старт - на 1,9%. Величины продуктивности сортов по предложенному способу совпадают с таковыми фактическими значениями. Таким образом, предложенный способ определения продуктивности по морфо-физиологическим показателям в фазу всходов и в период 6-8 листа, в фазы кущения и трубкования можно рекомендовать для экспертной оценки селекционного материала на охраноспособность.

Выявление кремнийсодержащих биологических структур по п. N 2009490 можно использовать на всех этапах селекционного процесса при оценке форм, линий, сортообразцов на общую устойчивость к болезням и полеганию. . Оценка заключается в тепловой, обработке исследуемого объекта при 20-40°' С, последующей обработке его препаратом флюоресцирующего лектина и дальнейшем микроскопировании. Этот■ прием позволяет выявить нативное состояние кремнийсодержащих биологических структур, в т. ч. тех, где кремний (БО присутствует в форме кремнийсодержащих соединений.

Этот способ позволяет оценивать гистологические и цитологические процессы у кремниефильных организмов. Известна корреляция между уровнем -содержания 31 в семенах и устойчивостью сорта к болезням и полеганию. Чем больше в растении, тем выше тип устойчивости. Сравнение интенсивности окраски препаратов позволяет оценить уровни содержания и дать предварительную характеристику общего статуса устойчивости селекционного материала. Наличие 51 - сортовой признак, следовательно каждый сорт имеет свою специфическую сподограмму. Используемые в практике способы определения устойчивости к полеганию длительны и трудоемки. Предлагаемый прием прост и доступен, а поэтому .рекомендуется использовать при экспертной оценке селекционного достижения на ООС,

Оценка селекционного материала риса на ЦМС по п. N 1741672 позволяет определить уникальность генома сорта на сравнительную способность к ЦМС. Оценка заключается в том, что анализируемые растения выращивают параллельно с нестерильными растениями того же сорта на кремнийсодержащэм питательном растворе с добавлением гиббереллина к без него до стадии !>х

листьев. Результаты выращивания оценивают по измерению относительного прироста длины влагалища и содержанию суммы хлорофил-лов в листьях проростков. Явление цитоплазматической. мужской стерильности (ЦМС) ягляется важнейшей характеристикой растений, используемых для производства гибридного риса. Определяют коэффициенты дифференциации, а уровень стерильности определяют по формуле:

П = (ах х к2): (ац х Кх)

где: П - показатель ЦМС; а^ - содержание суммы хлорофиллов в ■оцениваемых растениях; ад. - содержание суммы хлорофиллов в нестерильных растениях сорта; кх - коэффициент дифференциации в оцениваемых растениях; к2 - коэффициент дифференциации в' нестерильных растениях сорта.

При значениях П>1 - растения с ЦМС, а при значениях П<1 - • без ЦМС. Как видно из данных таблицы 4 показатель ЦМС у несте-

,. ' Таблица 4

Показатели роста проростков риса

1 1 Прирост !Коэффициент диф- Суммарное! Показатель

1 1 длины ! ференциации меж- содержа- 1 ЦМС по пре-

Форма риса ! влагали- 1ду нестерильны- ние хло- 1длагаемому

• 1 ща 1-го !ми растениями и рофиллов, 1 способу

! листа, % ! растениями с ЦМС иг/г 1

Спальчик 83,0 0,88 2,99 • 1,00

Прикубанский 81,0 0,86 2,90 1,00 .

Пластик ■ 79,0 0,84 . 2,92 1,00

Спальчик ЦМС 73,0 0,78 3,72 1,42

Прикубанский

ЦМС 78,0 0,82 3,76 1,35

Пластик ЦМС 58,0 0,59 3,48 1,68 Р > Р 001

рильных форм сортов Спальчик, Прикубанский, Пластик не превышает единицы. В тоже время показатель ЦМС у стерильных форм существенно превышает единицу. Так, у сорта Пластик значения П самые высокие - 1,68, а у сорта Спальчик ниже, чем у Пластика. Эти три сорта по показателю ЦМС можно расположить в ряду Пластик > Спальчик > Прикубанский. При использовании предлагаемого способа показатель ЦМС обеспечивает высокую разрешающую способность мелзду нестерильными формами и формами, имеющими ЦМС. Способ прост, не требует больших затрат времени и средств. Требующиеся для его осуществления материалы доступны любой биологической лаборатории. Использование п. N 1741672 в экспертной оценке на охраноспособность позволит однозначно определить генетическую индивидуальность сорта и его ценный селекционный признак - показатель ЦМС.

Определение интенсивности растений риса по п. N 1514277 позволяет точно различать близкие по интенсивности сорта. Оценка заключается в выращивании растений на питательном растворе без гиббереллина и с его присутствием, и последующим определением величины дифференциации при выращивании проростков риса с кремнийсодержащим веществом. Потребность в диагностике селекционного материала на интенсивность возникла е 1970-1980 годы в связи с усиленным развитием селекционного процесса на выведение интенсивных сортов риса. Интенсивный тип риса характеризуется высокой отзывчивостью на обеспеченность удобрениями и в условиях интенсивных технологий дает большие прибавки урожая. Имеющиеся в то время способы оценки селекционного материала на интенсивность обладали значительно меньшей чувствительностью, имели более . низкую разрешающую способность и заключались в'непосредственном выявлении отзывчивости на удобрений в онтогенезе.

При определнии интенсивности растений по п. N 1514277 в питательные растворы для выращивания проростков риса в качестве кремнийсодержащего вещества можно использовать, например, металисикат натрия с концентрацией по 0,19-0,32 мМ, что приводит к увеличению дифференциации между близкими по интен еивности формами риса и позволяет на стадии проростков определять их отношение к той или иной группе интенсивности без до-

полнительных на то экспериментов.

Оценка близких по интенсивности сортов риса (Краснодарский 424, Спальчик, Лиман) показала, что наибольшие различия между этими сортами (1,0-0,37) достигнуто при использовании именно этого способа при концентрации кремния в растворе 0,25 мМ в отличие от использования способа-прототипа (без БО. Исходя из результатов опыта сорт Спальчик имеет большую интенсивность, чем Краснодарский 424, а Лиман - меньшую.

Таким образом, предлагаемый способ (п. N 1514277) имеет большую чувствительность, высокую разрешающую способность и позволяет точно различать близкие по интенсивности сорта. Его применение позволяет вовлечь в селекционный процесс большое количество исходного материала, упростить сравнение различных исходных форм при снижении затрат и времени. Все это делает его весьма перспективным для патентной идентификации сортов в исследованиях- на ООС.

Подбор родительских пар при гибридизации растений по а. с. N 1054940 позволяет по уровню хемилюминисценции достоверно отличать генотипы друг от друга. Этот способ основан на определении сверхслабого свечения гомогенатов тканей растений. Применение хемилюминисценции для подбора родительских пар при гибридизации используется в селекционном процессе ВНИИ риса начиная с конца 1970 годов и является выразительным показателем энергетических превращений в клеточных и субклеточных структурах и генотипической отдаленности различных форм и сор-тообразцов.

В эксперименте уровни энергетических процессов у Краснодарского 424 и Спальчика схожи и достаточно сильно отличаются от сорта Спутник (табл. 5). Последний наиболее отдален геноти-пически от двух других сортов и может быть с большим успехом использован для получения гибридов.- Для установления разницы генотипов была использована интенсивность хемилюминисценции, которая является маркерным признаком формы и сорта и, стало быть, характеристикой генома. В связи с этим этот способ однозначно рекомендуется для проведения экспертной оценки на ООС.

Интенсивность хьмилюмшшсценции зародышей риса, им. г/сек.

Сорт ! До обработки рас-1 твором Н2 Ог (Бк) ! После обработки раствором Н20г (Бобр) !Разность !(Бк-Бобр)

Краснодар-

ский. 424 59 290 231

Спутник 88 274 1В6

Спальчик 62 295 233

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот (НК) растений позволяет получать информацию о растении на генном уровне. Разделение НК риса на фрагменты и идентифицирование их по количеству скорости движения этих фрагментов в геле осуществляется по способу п. N 1770358 и смеси п. N 1754778. Смесь для электрофореза НК содержит компоненты, мол. трис-борат 46,84- 49, 30; борную кислоту 46,84-49,30; этилен-циаминтетраацетат 1,06 - 1,12; гибберелловую кислоту (ГК) 0,02 -5,62. При использовании смеси с содержанием ГК'(в мол. %) 0,02 повышается разрешающая способность электрофореза - количество фрагментов НК увеличивается с 2-х до 5-ти. фи концентрации ГК.(в мол.%) ,0,56 удается разделить близкие по массе фрагменты - вместо 2-х фрагментов - 6. В соответствии со способом (п. N 1770358) препарат НК предварительно обрабатывается

метасиликатом натрия, вносится в агарозный гель и подвергается

~3 ~2

электрофорезу. Обработка НК 10 М, 10 М, 10 М растворами г метасиликата натрия приводит к изменению электрофоретических показателей, уменьшению пройденного пути. Это в свою очередь : позволяет разделить фрагменты НК, близкие по злектрофо|1етичес-, ким свойствам (масса, заряд и т.д.). Предлагаемые способ и смесь дают принципиально новые возможности для быстрой и точной диагностики чистоты семян. Он позволяет оценить генотипы растений по белковым фенотипам в семенах на ранних стадиях (в проростках). Использование вышеназванных разработок в значи-

- 1Ь -

тельной степени исключает зависимость исследуемых параметров от факторов среды. Эти методы точны и высокочувствительны и чем больше генетическая разница, тем больше разница в показателях. ■

Анализ оптических свойств митохондрий, отражающих генную индивидуальность сорта или формы риса, по п. N 1540728 основан на их способности к сжатию и набуханию в водном растворе соля-но-кислого триса, хлорида калия, сукцината натрия и лектина.

Показательность динамики сжатия и набухания митохондрий (органелл клетки) заключается в том, что в присутсвии сукцината натрия оптическая плотность растворов сначала возрастала -митохондрии сжимались, затем уменьшалась - митохондрии набухали. Скорость роста ее у митохондрий сортов Славянец, Лиман, Кубань' 3, Спальчик была выше, чем у сортов Краснодарский 424, йэмчужный, Кулон, мутант Алексеенко.

Результаты такого эксперимента несут информацию об уникальности сорта. Поэтому обоснованной является рекомендация применения параметра оптические свойства митохондрий проростков риса с использованием смеси по изобретению (п. N 1540728) при экспертной оценке на 00С. Для этого необходимо выбрать сорт-стандарт, например, Краснодарский 424) и по отношению к нему оценивать отклонения в оптических свойствах митохондрий анализируемого материала. Чем выше будут отклонения, тем дальше отстоит сорт или форма по происхождению от сорта-стандарта.

Анализ сравнительного распределения белка в эндосперме различных сортов риса позволяет прогнозировать технологические свойства и пищевую ценность крупы риса: чем глубже проникновение белка вглубь крахмалистой паренхимы, тем больше его остается после шлифования и тем меньше выход дробленки. Информативность этого показателя при экспертной оценке сорта достаточно высока, он позволяет полно и достоверно характеризовать индивидуальность сорта, т. к. распределение белка в зер-новкг риса - важнейший- показатель сортов. Неравномерность распределения белка в субалейроновом и глубоколежащих слоях эндосперма была установлена в конце шестидесятых годов японскими и итальянскими исследователями. Российскими учеными Н. к. Алешиным и Е. В. Лебедевым Е. К (ВНИИ риса) предложена клас-

сификация сортов риса по распределению белка в зерновке риса, • основанная на буквенно-цифровой индексации:

А - наличие диффузной белковой сети в субалейроновом слое и эндосперме: - богатая белком; аа - бедная белком; а0 -отсутствие белковой сети.

В - глубина проникновения диффузной белковой сети в эндосперме: (íi - глубокая; 62 - средняя; б3 - слабая; бо - отсутствие.

С - наличие "карманов" с белковыми телами в субалейроновом слое эндосперма- с^ - много; с2 - мало; с3 - единично; с0

- отсутствие.

Б - величина "карьанов": с^ - большие; с1 ^ - средние; <33 -малые; - отсутсвие.

Е - слойность карманов: - многослойные; - двуслойные; е3 - однослойные; е0 - отсутствие.

Г - наличие отдельных клеток богатых белком в глубине крахмалистной паренхимы эндосперма: - много; ^ - мало; Г0>

- отсутствие.

й - равномерность распределения белка в эндосперме: -равномерное (хорошее}; - равномерное (среднее); - неравномерное (плохое).

В соответствии с приведенной индексацией каждому сорту, мутанту или другой форме риса соответствует определенная формула распределения Оолка (табл. 6). Оптимальной формулой является следующая: ^ Ь^с^е^

Из 19 проанализированных сортов и мутантов наиболее близки к оптимальной формуле следующие сорта: мутант Алексеенко, Краснодарский 86, Малыш.

Распределение белка в эндосперк&х изученных сортов и мутантов риса"

N N ! 1 Сорт, мутант 1 Формула

п/п 1 1 1 1 распределения белка

1 Мутант Алексёенко A^VC'DVGV

2 -Малыш А1 В1 CJ D2'5 Е3 Gi С1

3 . Краснодарский 86 А* В1 C° D° Е° G1 С1

4 Горизонт А2'В2 С1 Di-3 Е2'3 G2 С2

5 Старт д2.в3 co Do Eo Go с2~3

6 Кулон A2B* С3 D3 Е3 G2"< С2*3

7 Зерноградский А2 В1 С3 D3 Е3 G°-C2

8 Дунай Ai В1'2 С3 D3 E^G1 С2

9 Мутант Шиловского А' В* С2 D2"3 Е5 G° С2'3

10 . - Донской 402 А2 В3 C°D° Е° G°C2

11 Кубань 3 А2 В2 С1 D1 Е-1"2 G2 С2

12 Спальчик А2 В3 С3 D3 Е3 G0 С5

13 Жемчужный А2 В3 С2 D2"3 Е2'3 G1 С2

14 АЛьтаир'• А1 Bi Cl-Di-i 'E3 G° С2

15 Альбиносный мутант Спальчик А2 В3- С1 Dz Е2 G2 С3

16 Донской 63 А2- В3 Ci D2 Е2 G-* С 3

17. Солнечный А2 в3 с3 0з Ез q2 с-з

18 Кубань 9 А2 В2С10'-5 Е^2 G° С2

19 Юбилейный ' А0"2 В5 С1 D1 Е3 G0 С3

" Методы Культуры тканей. ' В работе' изучали возможность использования изобретений в области методов культуры Тканей для патентной идентификации, а именно: скрининг устойчивых и толерантных к рисовой листовой -нематоде растений риса (а.с. N 1445185); способы получения растений-регенерантов (а. с. N 1541252, N 986345, N 1665987). Все они относятся к биотехнологическим тестам,' которые выявляют особенности Ъорта по реакции на питательную среду. Использование этих приемов в патент-

ной экспертизе проблематично, т.к. они недостаточно информативны и требуют специальной, оснащенности материалами для биотехнологических исследований.

3.2. Признаки для оценки на ООС

В результате исследования совокупности методов в рамкам экспертизы селекционного достижения на охраноспособность нами установлены новые признаки оценки на ООС, позволяющие точнее и достовернее дополнить.информацию о сорте, ускорить процесс экспертизы и исключить зависимость получаемой информации от факторов внешней среды. -

Устойчивость риса к пирикуляриозу. Заболевание' в отдел: цые годы носит характер зпифитотий'и уничтожает до 80% урожая. Устойчивость оценивают по уровню NO3 в тканях листа перед выходом растения в трубку. Сорт стандарт - Краснодарский 424.

Оолеустойчквость. Признак важен в связи с произростанием риса на. засоленных почвах. . Солеустойчивость определяется по количеству проросших корешков при культивировании зародышей со щитком на среде. Ыурасиге-Скуга в присутствии различных концентраций NaCl. Сорт стандарт - Спальчик.

Продуктивность. Генетически, детерминированный признак, позволяющий прогнозировать потенциальную урожайность. Оценивается путем, анализа морфо-физиологических показателей в период кущения и трубкования растений риса. Сорт стандарт - Краснодарский 424. .

. Кремниефильность. Показатель индивидуальности сорта, характеризующий устойчивость риса к .нологанию и пирикуляриозу по, сподограммам.

Показатель Щ/С. .Позволяет.отличить уникальность сорта по способности образовывать растения с .ЦМС. Селекционный материал оценивается'в возрасте 2-х листьев на кремнийсодержащей питательной среде .с добавлением гиббереллина. .

Интенсивность растений риса.' Важнейший -показатель, 'характеризующий-геном сорта; Дает возможность рекомендовать выращивание сорта, на ■ высоком,'или'низком-агрофоне. Определяется по биометрическим параметрам проростка на среде, содержащей гиб-

- 19 - '

береллин и кремнийсодержащис вещества. Сорт стандарт - Краснодарский 424.

Хемилюминисценция тканей риса. Показатель, позволяющий оценить генетическое родство сорта по уровню физико-химических процессов в растительной ткани. Сорта стандарты: Краснодарский 424, Спальчик-, Лиман, Кубань.

Злектрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот. Выявление индивидуальности и отличимости происходит посредством выявления характерных полос фрагментов ДНК на электрофореграм-ме. Родство или отличимость сорта определяют по количеству фрагментов ДНК и их электрофоретической подвижности. Сорт стандарт - Краснодарский 424. '

Оптические свойства митохондрий. Показатель регистрирует индивидуальность сорта по оптическим свойствам митохондрий. Динамика сжатия митохондрий в присутствии сукцината натрия и ГК имеет свой характер для каждого сорта. Сорт стандарт -Краснодарский 424.

Распределение белка в эндосперме зерновки риса. Показатель, позволяющий оценить технологические качества крупы риса и его пищевую ценность по характеру и глубине залегания белка в эндосперме зерновки. Сорт описывается . с помощью. буквенно-цифровой индексации распределения белка в эндосперме.

ВЫВОДЫ

1. С принятием закона Российской Федерации "О селекцион- ' ных достижениях", ключевое значение в его реализации приобретают методы идентификации, регистрации и сравнения сортов и гибридов растений,- которые должны стать средством правовой защиты достижений.в области.селекции.

2. Разработанная и принятая многими странами, в том числе и Россией, система идентификации сортов Международного Союза по Защите Новых Сортов Растений содержит в качестве одной из главных частей информационную базу данных по морфологическим признакам.растений, которая связана со значительными затратами труда, а также посевных площадей. Надежность ее достаточна при условии, что морфологические.различия генотипов четкие и они

• ' ■ 2 о -

обладают равной жизнеспособностью.

3. Методы идентификации сортов, на которых должно-базироваться . выполнение закона "О селекционных достижениях", должны обладать следующими параметрами: достоверность, воспроизводимость,. массовость, быстрота, а полученные результаты не должны зависеть от- условий внешней среды.

4. Проводимые во ВНИИ, риса на протяжении ряда лет исследования в области морфологической,, биохимической и.электрофо-ретической идентификации сортов и гибридов риса йашли широкое применение в селекции и семеноводстве. Результаты этих исследований защищены авторскими свидетельствами и патентами на изобретения и уже сейчас позволяют достаточно надежно идентифицировать сорта, гибриды и сортообразцы риса.

б. При оценке сортов риса на охраноспособность необходимо пользоваться следующими признаками: устойчивость к пирикуляри-озу; солеустойчивость; продуктивность; интенсивность растений риса; электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот; оптические свойства митохондрий; кремниефильность; распределение белка в эндосперме зерновки риса; показатель ЦЫС; хемилюминис-ценция тканей риса. При установлении соответствующего признака . необходимо пользоваться, следующими методами юс определения: способ определения устойчивости . к пирикуляриозу (а. с. N 1446701); способ определения солеуст.ойчивости растений (а. с. . И 1166745); способ оценки продуктивности (а. с. N ' 1287313); способ оценки интенсивности растений риса (п. N 1514277);,спо-. соб выявления кремнийсодержаших биологических структур (п. N2009490); способ электрофоретического разделения НК .(п. N 17703558); смесь для электрофоретического разделения НК растений (п. N 1754778); смесь для анализа оптических свойств митохондрий (п. N 1540728); метод.изучения сравнительного распределения белка в эндосперме зерновки риса; способ получения всходов на искусственно засоленной почве (а.с. N. .1468442); способ оценки на ЦМС (п. . N 174672); способ подбора родительских пар при'гибрадизации растений (а с. N 1054940). Использование этих методик открывает принципиально новые возможности, . позволяющие ' быстро и точно идентифицировать сорта, оценивать генотипы растений по белковым фенотипам, выявлять

селекционно-значимые признаки на ранних стадиях онтогенеза, исключая зависимость от условий внешней среды.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ГОСКОМИОСИИ ПО СОРТОИСПЫТАНИЮ И СЕЛЕКЦЕНТРАМ

На основании проведенных исследований рекомендуем:

1. Для повышения эффективности охраноспособной работы внедрить в правовую практику селекционных достижений комплексное использование морфологических, биохимических и других признаков при оценке сортов на ООС.

2. Для повышения достоверности, большей полноты и инфор- •' мативности, быстроты получения результатов, не зависящих от условий выращивания, включить в методику проведения испытаний по рису следующие признаки: устойчивость к пирикуляриозу; со-леустойчивость; продуктивность; интенсивность растений риса;'' злектрофоретическая подвижность НК; оптические, свойства митохондрий; кремниефильность; , распределение белка в эндосперме зерновки риса; показатель ЦМС; хемилюминисценция тканей и методы их определения, характеристика которых содержится в патентах: N 1514277, N 2009490, N 1770358, N 1754778, N 1540728,

N 1741672; авторских свидетельствах: N 1446701, N 1166745, -. N 1287313, N 1054940, а также в методике изучения сравнительного распределения белка в эндосперме зерновки риса.

Публикации

1. К вопросу об использовании морфологических признаков для идентификации сортов и,гибридов // Рис России, 1996, т.4,

N 3(8), с. 3-4 (в соавторстве). • '

2. Экономическая эффективность применения фосфора в посевах разных сортов риса // Рис России, 1996, т. 4, N 3(8), с. 46 -47 (в соавторстве).

3. Методика оценки на отличимость, однородность и стабильность: состояние и пути совершенствования // в печати (в соавторстве).