Нарушение редокс-баланса в сперматозоидах и семенной плазмы мужчин при патоспермии

Быкова, Мария Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нарушение редокс-баланса в сперматозоидах и семенной плазмы мужчин при патоспермии
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нарушение редокс-баланса в сперматозоидах и семенной плазмы мужчин при патоспермии"

На правах рукописи

БЫКОВА Мария Валерьевна ,

НАРУШЕНИЕ РЕДОКС-БАЛАНСА СПЕРМАТОЗОИДОВ И СЕМЕННОЙ ПЛАЗМЫ МУЖЧИН ПРИ ПАТОСПЕРМИИ

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидатабиологических наук

Красноярск - 2008

ЯШ

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии человека и животных ГОУ ВПО «Сибирский федеральный университет» и в Центре репродуктивной медицины е. Красноярска

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

Титова Надежда Митрофановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Меныцикова Елена Брониславовна доктор медицинских наук Душкин Михаил Иванович

Ведущая организация:

Институт биофизики СО РАН

Защита диссертации состоится « // » /-^Л^м^ 2008 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 00 ЬО34.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН.

Автореферат разослан » 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук"'

Русских Г.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Мужская репродуктивная система, являясь одной из наиболее чувствительных и ранимых в организме, подвергается воздействию целого ряда неблагоприятных факторов, которые, влияя на эндокринные железы, центральную нервную систему и непосредственно на гонады, вызывают дистрофические изменения в семенных канальцах и межуточной ткани яичек. Это приводит к снижению оплодотворяющей способности эякулята и, как следствие, к нарушению репродукции в супружеской паре (бесплодию, невынашиванию беременности, рождению неполноценного потомства). В литературе последнего десятилетия появляются данные, что важным патогенетическим звеном при развитии мужской инфертильности (независимо от этиологии) является наличие окислительного стресса (Sharma RK. et al, 1999; Gil-Guzman E. et al, 2001; Sikka S., 2001).

В эякуляте источниками образования АФК являются как сами сперматозоиды (при неправильной дифференциации клеток во время стадий сперматогенеза), так и лейкоциты. Генерация АФК в сперме может иметь как позитивные последствия, так как во время капацитации и акросомальной реакции АФК подготавливают спермий для связывания и оплодотворения яйцеклетки (deLamirande Е. et al, 1997; O'Flaherty СМ. et al, 1999), так и негативные, приводя к снижению жизнеспособности клетки. Положительный эффект связан с умеренной продукцией АФК, тогда как гиперпродукция приводит к неблагоприятными последствиям. Кроме того, окислительный стресс в эякуляторных спермиях может быть вызван активацией синтеза АФК в комбинации с бедностью антиоксидантных компонентов в семенной плазме. Нарушение редокс-баланса может быть важной причиной мужского бесплодия (Sharma RK. et al, 1999; Gil-Guzman E. et al, 2001; Sikka S., 2001).

В то же время механизмы развития ОС, его выраженность при различных видах патоспермии, а также функциональная активность АОС в изучаемой нами литературе не имеют достаточного освещения. В немногочисленных работах, посвященных исследованию антиоксидантного статуса при мужском бесплодии, состояние АОС больных оценивается в большинстве случаев по активности СОД и ГПО либо по концентрации одного из продуктов ПОЛ, что не может дать полноценного представления о состоянии окислительно-восстановительного гомеостаза.

Комплекс лечебных мероприятий при мужском бесплодии включает как медикаментозное консервативное лечение, так и хирургическое вмешательство при тяжелых формах патологии. В последнее время в практику терапии идиопатического бесплодия внедряются методы лечения, обеспечивающие антирадикальную защиту органа и организма в целом. Чаще в качестве терапии антиоксидантами применяются витамины Е, С, карнитин и др. (Rolf С. et al, 1999; Keskes-Ammar I. et al, 2003).

Приведенные данные свидетельствуют об актуальности проблемы и целесообразности проведения исследований по изучению особенностей

развития окислительного стресса и состояния АОС при различных видах нарушения сперматогенеза.

Цель исследования

Выявить закономерности изменения прооксидантного и антиоксидантного статуса сперматозоидов и семенной плазмы у мужчин с различными типами нарушения сперматогенеза.

Задачи исследования

1. Изучить интенсивность процессов перекисного окисления липидов в спермиях и семенной плазме у мужчин при нормозооспермии и при нарушении сперматогенеза.

2. Исследовать состояние антиоксидантной системы семенной плазмы и спермиев у мужчин при патоспермии и нормозооспермии.

3. Установить характер взаимосвязи между физиологическими параметрами и редокс-балансом эякулята и его изменение в зависимости от вида патоспермии.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые при нарушении нормального сперматогенеза проведена оценка интенсивности ПОЛ: дифференцированно исследовано содержание диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в спермиях и семенной плазме у мужчин. Впервые у мужчин при патоспермии проведено комплексное исследование внутриклеточного и экстрацеллюлярного звена АОС по показателям супероксиддисмутазы, каталазы, восстановленного глутатиона, глутатионпероксидазы, глутатион-8-трансферазы,

глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Установлено, что у мужчин при нарушении сперматогенеза по сравнению с нормозооспермией в семенной плазме и спермиях происходит интенсификация процессов перекисного окисления липидов и снижение мощности антиоксидантной защиты.

Вычленены и охарактеризованы достоверно значимые различия в состоянии редокс-баланса у мужчин с разными формами нарушений сперматогенеза. Установлено, что лимитирующим фактором при развитии разных типов патоспермии является нарушение различных звеньев антиоксидантной защиты.

Предложен коэффициент, позволяющий оценить соотношение про- и антиоксидантных процессов как в спермиях, так и в семенной плазме.

Впервые установлены взаимосвязи между физиологическими параметрами эякулята с одной стороны, содержанием продуктов ПОЛ и активностью антиоксидантной защиты с другой стороны и их изменения в зависимости от вида патоспермии.

Материалы диссертации используются при чтении курсов: «Биохимия», «Биохимия тканей» студентам Сибирского федерального университета, обучающимся по специальности «Биохимия». Методики, изложенные в диссертации, включены в разделы большого практикума по биохимии на кафедре биохимии и физиологии человека и животных СФУ, а

также используются студентами при выполнении курсовых и дипломных работ.

Практическая значимость

Исследование функциональной активности антиоксидантной системы и продуктов лшидной пероксидации позволяет оценить степень тяжести окислительного стресса при патоспермии. В процессе исследования установлено, что максимальная депрессия антиоксидантной способности семенной плазмы отмечена при тератоастенозооспермии, тогда как в спермиях - при тератозооспермии.

Результаты исследования антиоксидантного статуса семени могут быть использованы при дифференциальной диагностике мужского идиопатического бесплодия (бесплодия неясного генеза). Пациентам с выраженным ОС рекомендуется принимать антиоксидантную терапию, позволяющую предотвратить утяжеление патологии.

Результаты проведённых исследований внедрены в практику работы Центра репродуктивной медицины (г. Красноярск).

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Независимо от вида патоспермии по сравнению с нормозооспермией у мужчин происходит интенсификация процессов ПОЛ как в семенной плазме, так и в спермиях.

2. Патоспермия сопровождается снижением активности большинства антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионпероксидазы, глутатион-8-трансферазы) и содержания восстановленного глутатйона в спермиях и семенной плазме на фоне повышения активности супероксидцисмутазы.

3. Буферная емкость антиоксидантной системы семенной плазмы превышает таковую у сперматозоидов.

4. Для патоспермии характерна отрицательная корреляционная взаимосвязь интенсивности процессов ПОЛ с подвижностью спермиев и положительная — с количеством аномальных форм сперматозоидов.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования обсуждены на: Межрегиональной научно-практической конференции "Объединение субъектов Российской Федерации и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири" (Красноярск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции Российской ассоциации репродукции человека (Чебоксары, 2005); Международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения" (Санкт-Петербург, 2005); научной конференции молодых ученых Ростовского

государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2006); 63 ежегодном международном конгрессе американского общества по репродуктивной медицине (Вашингтон, 2007); научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 3 статьи и 3 тезиса в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертационных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и их обсуждение», заключения, выводов, списка литературы, включающего 40 отечественных и 186 иностранных источников. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 10 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для биохимического анализа использовалась сперма 176 мужчин в возрасте 22-48 лет (средний возраст 32,5±2,5 года), которые проходили предварительное обследование в Центре репродуктивной медицины г. Красноярска по причине подозрения на бесплодие. У пациентов получено информированное согласие на проведение исследований. В зависимости от показателей спермограммы были выделены 4 группы пациентов: 1-е нормозооспермией (п=95), 2-е астенозооспермией (п=40), 3-е тератозооспермией (п=19), 4-е тератоастенозооспермией (п=22). Первая группа мужчин являлась контрольной (эякулят соответствовал нормативным показателями и обладал высокой оплодотворяющей способностью). Астенозооспермия - форма нарушения нормального сперматогенеза, когда подвижность ниже нормативных значений, тератозооспермия - когда морфология ниже нормативных значений, соответственно тератоастенозооспермия - сочетанная патология. Нормативные значения эякулята (по руководству ВОЗ, 1992): объем 2,0 мл и более, рН 7,2 и более, концентрация 20 миллионов в 1 миллилитре, общая концентрация 40 миллионов, подвижность 50% и более подвижных, морфология менее 40% аномальных спермиев. Для сдачи спермы мужчины использовали метод мастурбации. Получению спермы предшествовало воздержание в течение 2-7 дней.

Анализ спермограммы включал определение времени разжижения, цвета эякулята, измерение объема, вязкости, степени агглютинации, концентрации спермиев, характер подвижности и морфологии спермиев по критериям ВОЗ (WHO, 1992).

Объектами исследования послужили спермии и семенная жидкость пациентов Центра репродуктивной медицины г. Красноярска. Для исследования брали 1-2 мл эякулята. Спермии отделяли от семенной жидкости центрифугированием в течение 15 мин при 1700 g. Полученный осадок промывали в десятикратном объеме 0,9 % NaCl и вновь

центрифугировали в течение 10 мин с последующим удалением надосадочной жидкости. Такую процедуру повторяли 3 раза. Полученные объекты исследования использовались для измерения изучаемых параметров спектрофотометрическим и биохемилюминисцентным методами. Количество белка для последующих расчетов измеряли микробиуретовым методом.

О содержании продуктов липидной пероксидации судили по содержанию МДА (Ко K.M. et al., 1990) и уровню ДК (Каган В.Е. и др., 1986). Определение содержания малонового диальдегида основано на взаимодействии МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм. Определение содержания ДК проводили в экстрактах сперматозоидов и семенной жидкости. Для этого липиды из сперматозоидов экстрагировали стократным избытком смеси растворителей (гептан-изопропанольная смесь в соотношении 1:1). В гептановом экстракте (верхняя фаза) исследовали содержание сопряженных диенов, которые определяли по оптической плотности пробы при 233 нм.

О состоянии АОС судили по содержанию FSH (Beutler Е., 1990), активности глутатионпероксидазы (Beutler Е., 1990), глутатион-S-трансферазы (Habig W.H. et al., 1974), СОД (Сирота Т.В., 1999), каталазы (Королюк М.А. и др, 1988).

Определение количества восстановленного глутатиона основано на взаимодействии FSH с ДТНБК (5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона "2-нитро-5-тиобензоата. Интенсивность окраски регистрировали

спектрофотометрически при длине волны 412нм (Beutler Е., 1990).

Мерой активности ГПО является скорость окисления FSH в присутствии гидроперекиси трет - бутила (ГПТБ). Концентрацию TSH до и после инкубации определяли спектрофотометрически. В основе развития цветной реакции лежит взаимодействие SH-группы FSH с 5,5'-дитиобис"2-нитробензойной кислотой (ДТНБК) с образованием окрашенного продукта - тионитрофенильного аниона (ТНФА). Количество последнего прямо пропорционально количеству SH-групп TSH, прореагировавших с ДТНБК. Присутствие азида натрия (NaN3) в инкубате подавляет каталазную и псевдокаталазную активность в пробе и не влияет на активность ГШ (Beutler Е., 1990).

Активность глутатион-Б-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-й-конъюгатов между FSH и 1-хлор-2,4-динитробезолом (ХДНБ). Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион -S-ХДНБ) (Habig WH. et al., 1974).

Принцип метода определения активности СОД основан на ингибировании реакции автоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии СОД вследствие дисмутации супероксидных анион-радикалов, которые являются продуктом одного из этапов окисления и, по-видимому,

одновременным участником его последующих стадий. Исходная концентрация адреналина в пробе составляет 230 мкМ. Об интенсивности его автоокисления судили по динамическому нарастанию поглощения при длине волны 347 нм, обусловленному накоплением продукта окисления (с максимумом поглощения при 480 нм) (Сирота Т.В., 1999).

Принцип метода определения активности каталазы основан на образовании окрашенного в желтый цвет комплекса не разрушенной в ходе каталазной реакции перекиси водорода с молибдатом аммония (Королюк М.А. и др., 1988).

Биолюминесцентным методом определяли активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и глутатионредуктазы (ГР). Биолюминесцентное определение активности дегидрогеназ сперматозоидов проводили по модифицированной самостоятельно разработанной методике (Савченко А.А., 1989). Для этого суспензию выделенных сперматозоидов, содержащую 2 млн. клеток, после однократного замораживания -размораживания дополнительно разрушали путем осмотического лизиса добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. В 600 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносили 200 мкл суспензии разрушенных сперматозоидов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 7.0» (StatSoft Inc., 2004). Для всех данных определяли медиану (Me) и интерквартильный разброс в виде подсчета 25- (С25) и 75-процентилей (С75). Все полученные результаты проверяли на нормальность с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. В связи с тем, что распределение полученных данных не соответствовало нормальному, использовался непараметрический U-критерий Манна-Уитни при сравнении двух несвязанных выборок. Различия между показателями считали достоверными при значении р<0,05. Оценка взаимосвязи исследуемых показателей осуществлялась подсчетом коэффициента ранговой корреляции по Спирману.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Показатели спермограммы в исследуемых группах

Параметры спермограмм в группах пациентов, включенных в обследование, представлены в табл.1. Пациенты с лейкоцитоспермией исключались из группы обследуемых. Клетки сперматогенеза, эпителиальные клетки, лейкоциты, клеточный дебрис объединялись в понятие «круглые клетки», и средняя величина данного показателя во всех группах мужчин была в норме и не превышала 1 000 000 клеток/мл, что говорит об отсутствии острых воспалительных процессов (или лейкоцитоспермии) у обследованных мужчин (WHO, 1992).

Таблица 1

Параметры спермограмм в обследованных группах мужчин_

Группа Количество сперматозоидов (Me(C2s;C75))

Концентр., млн/мл Прогрессив-ноподвиж., % Слабоподвижные, % Аномальные, %

Нормозооспермия (п=95) . 64,5 (41;105) 57,0 (52,0;63,0) 6,0 (5,0;8,0) 34,5 (31,0;39,0)

Астенозооспермия (п=35) 47,5* (26,0;90,0) 34,5** (29,0;41,0) 7,0 (5,0;10,0) 39,0* (35,0;43,0)

Тератозооспермия (п=20) 53,5 (23,0;90,0) 45,0* (39,4;51,0) 7,0* (6,0; 10,5) 52,0** (50,0;55,0)

Тератоастенозоо-спермия (п=25) 29,0** (20,0;62,0) 25,0** (21,0;34,0) 9,0** (7,0; 12,0) 56,0** (52,0;61,0)

Примечание:*- р<0,05, **-р<0,001 в сравнении с нормозооспермией.

Обследуемые в работе группы достоверно отличались по общей концентрации и содержанию прогрессивноподвижных сперматозоидов. Такие параметры как рН и объем эякулята не различались достоверно между группами.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в сперматозоидах и семенной плазме при патоспермии

В ряде работ выявлено, что при мужском бесплодии происходит повышение уровня МДА (Sanocka D. et al, 1996; Lenzi A. et al, 2000; Tavilani H. et al, 2005), причем большинство исследователей анализировали содержание этого соединения в основном в семенной плазме инфертильных мужчин, не подразделяя их на группы согласно видам патоспермии. Данные же об интенсивности процессов липопероксидации в семенной плазме и спермиях при разных видах патоспермии немногочисленны и противоречивы (Alvarez JG., Storey ВТ., 1982; Calamera J. et al, 2003; Tavilani H. et al, 2005). Принимая во внимание вышесказанное, нами исследовалось в сперматозоидах и семенной плазме содержание как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ в зависимости от вида нарушения сперматогенеза.

Содержание ДК и МДА при всех формах патоспермии было повышено по сравнению с нормозооспермией как в сперматозоидах, так и в семенной плазме (рис 1).

| ВНормозоослермия "¡ЗАстеноТоослермйя ОТератозооспермия ВТератоастенозооспермия

ДКвслермиях ДК всей плазме МДАвспермиях МДА в сем плазме

Примечание: *-р<0,05, **-р<0,001, ***-р<0,0001 в сравнении с нормозооспермией

Рис 1. Содержание диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в спермиях и семенной плазме в исследуемых группах мужчин в процентах.

В сперматозоидах при астено-, терато- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией уровень ДК был достоверно выше на 76%, 47% и 126% соответственно. В семенной плазме содержание ДК при астено-, терато- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией достоверно выше соответственно на 65%, 37% и 103%).

Содержание МДА при всех формах патоспермии было повышено в сравнении с нормозооспермией как в сперматозоидах, так и в семенной плазме. В сперматозоидах при астено- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией уровень МДА был достоверно выше на 54% и 147% соответственно, а при тератозооспермии недостоверно повышался на 27%. В семенной плазме содержание МДА при астено- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией достоверно выше на 67% и 131% соответственно, а при тератозооспермии наблюдалась тенденция увеличения содержания МДА на 59%.

По клиническим характеристикам спермограмма «тератоастенозоо-спермия» является более тяжелой формой нарушения сперматогенеза. В нашей работе количество как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ при тератоастенозооспермии было наибольшим по сравнению со всеми другими формами патоспермии.

Накопление продуктов пероксидации может вести к появлению в мембранах своеобразных пор за счет увеличения содержания гидрофильных углеводородных хвостов, а также к увеличению ее жесткости за счет снижения содержания ненасыщенных жирных кислот и, таким образом, влиять на проницаемость мембран.

Таким образом, полученные нами результаты по увеличению содержания как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ позволяет

считать, что клеточные мембраны при патоспермш претерпевают существенные структурные изменения, что ведет к снижению оплодотворяющей способности спермиев.

В результате чрезмерной интенсификации процессов ПОЛ текучесть мембраны спермиев уменьшается и происходит перестройка фосфолипидов, что может индуцировать снижение мембранной проницаемости. Это, в свою очередь, является губительным для выполнения спермием своих функций (Aitken RJ. et al, 1995; Storey BT. et al, 1997). Перекисные продукты могут оказать негативное влияние на подвижность (Aitken RJ., 2000; Luconi M. et al, 2006), акросомальную реакцию и взаимодействие сперматозоида с ооцитом (Nolan JP., Hammerstedt RH., 1997; O'Flaherty CM. et al, 1999), приводить к потере оплодотворяющей способности сперматозоидов человека и негативно коррелировать с уровнем оплодотворения in vitro (Conte G. et al, 1999; Comhaire FH. et al, 2000; Raineri I. et al, 2001).

В группе мужчин с астенозооспермией обнаружены отрицательные взаимосвязи между процентом прогрессивноподвижных сперматозоидов и содержанием ДК в спермиях (г= -0,50; р<0,01) и семенной плазме (г= -0,49; р<0,01). Кроме того, определены положительные взаимосвязи между процентом слабоподвижных спермиев и концентрацией МДА в спермиях (г=0,44; р<0,05) и в семенной плазме (г=0,47; р<0,01). Точно также при увеличении содержания МДА количество слабоподвижных спермиев растет, при этом падает процент прогрессивноподвижных спермиев. Так же как в группе «астенозооспермия», в группе «тератозооспермия» обнаружены положительные взаимосвязи процента слабоподвижных и МДА в спермиях (г=0,57; р<0,05) и в семенной плазме (г=0,70; р=<0,01). Данный факт можно объяснить тем, что мембраны сперматозоидов богаты ПНЖК и поэтому сильно подвержены процессам липопероксидации, в ходе которой повреждается целостность мембраны и клеточные структуры, а также модифицируется работа систем клеточного метаболизма, вследствие чего снижается подвижность спермиев (Aitken RJ., 2000).

В группе «нормозооспермия» процент аномальных сперматозоидов положительно коррелирует с содержанием ДК в семенной плазме (г=0,21; р<0,05), с концентрацией МДА в спермиях (г=0,22; р<0,05) и в семенной жидкости (г=0,26; р<0,05).

Активность супероксиддисмутазы и каталазы в сперматозоидах и семенной плазме при патоспермии

В норме процессы свободнорадикального окисления, в частности, процессы ПОЛ, поддерживаются на стационарном уровне благодаря работе антиоксидантной системы. Клетка, и сперматозоид в том числе, имеют такие защитные механизмы против АФК как СОД и каталаза, ГПО и др. (Lewis SE. et al, 1995; Poveri A. et al, 2002; Sheweita S. et al, 2005),

В нашей работе определялась суммарная активность СОД (Си, Zn-СОД И Мп-СОД) и активность каталазы в спермиях, в семенной плазме -активность внеклеточной или экстрацеллюлярной Си, Zn-СОД (СОДэц) и

каталазоподобная активность в зависимости от типа нарушения сперматогенеза. Результаты представлены на рис. 2._

ИНормозооспермия ВАстенозооспермия оТератозооспермия ВТератоастенозооспермия

180 160 140 3 120

I юо

зг о а. с

153

100

¡134

118ц

173

юоШ

100

-JA-

100

Р1

СОД в спермиях СОД в сем плазме КТ в спермиях |<Т в сем пл

Примечание: *-р<0,05, **-р<0,001, ***- р<0,0001 в сравнении с нормозооспермией.

Рис 2. Активность СОД и каталазоподобной активности в спермиях и семенной плазме у мужчин в норме и при патоспермии в процентах.

Активность СОД была достоверно выше при астено-, терато- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией в спермиях человека на 46, 34 и 53 %. В семенной плазме при тератозооспермии в сравнении с нормозооспермией отмечена тенденция к достоверному повышению активности СОД на 14%, при астено- и тератоастенозооспермии активность супероксидцисмутазы достоверно увеличивалась на 18% и 23%.

При астено- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией в спермиях человека выявлено достоверное снижение активности каталазы соответственно на 40% и 39 %. Достоверное снижение каталазоподобной активности наблюдается в семенной плазме на 47% и 48 % при астено- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией соответственно.

Найденное нами изменение активности СОД и каталазы может быть связано, главным образом, с модифицирующим действием АФК на ферментативные белки.

Модификации под действием АФК могут подвергаться все аминокислотные остатки, но наиболее чувствительными являются остатки триптофана, тирозина, гистидина и цистеина. Кроме того, отмечена роль окислительной модификации лизина, аргинина, пролина и серина (Devies KJ. et al, 1987; Арчаков А.И., Мохосеев И.М., 1989).

Так, возможность модификации СОД кислородными радикалами показана в работах Дэвиса с соавт. (Devies KJ. et al, 1987). К тому же, наличие в структуре каталитического центра СОД остатков гистидина, аргинина,

ионов меди, а также дисульфидного мостика между гистидином-58 и -160 увеличивает вероятность воздействия АФК на данный фермент.

В нашей работе негативное влияние АФК на активность СОД не имеет места. К тому же СОД относится к ферментам, которые наиболее долго сохраняют свою высокую активность, почти не требуют энергии активации, скорость реакции этого энзима лимитирует лишь скорость диффузии субстрата к активному центру (Зенков Н.К. и др., 1993).

Таким образом, повышение активности СОД в спермиях и семенной плазме мужчин с патоспермией можно назвать компенсаторной реакцией на увеличение интенсивности свободнорадикального окисления при нарушении сперматогенеза.

Результатом повышения активности СОД в эякуляте является накопление активных радикалов кислорода и, в первую очередь, Н2О2. По данным многих авторов развитие нарушений подвижности спермиев обусловлено в основном воздействием супероксидного радикала и Н202 (deLamirande Е., Gagnon С., 1995; Aitken RJ, 2000; Rivlin J. et al, 2004).

Существует точка зрения, что увеличение клеточной активности СОД связано с увеличением длины спермия (Aitken RJ., 1996). СОД, вероятно, происходит из цитозоля удлиненных сперматид (Fisher HM., Aitken RJ., 1997) и ее активность используется как маркер цитоплазматических капель (Aitken RJ., 1996). Более того, по мнению ряда исследователей, высокие активности СОД отражают большее количество аномальных сперматозоидов с цитоплазматическими каплями (Aitken RJ., 1996).

Высокая активность СОД косвенно свидетельствует об интенсивной генерации 02\ Рассмотрим возможные источники образования супероксиданион-радикала. Генерация 02" может происходить при нарушении переноса электронов в дыхательной цепочке митохондрий, которыми так богата средняя часть (шейка) сперматозоида. Однако в настоящее время все больше исследователей склоняется к тому, что именно одним из основных источников супероксиданион-радикала в сперматозоидах является НАДФН-оксидаза (NOX5). В недавних работах было продемонстрировано, что морфологически нормальные сперматозоиды не могут продуцировать 02~ в НАДФН-оксидазной реакции.

В нашей работе установлено существенное снижение активности каталазы. Это может быть связано с тем, что в структуре активных центров каталазы имеются вышеперечисленные аминокислотные остатки аспарагина и гистидина, тирозина, наиболее чувствительные к модификации АФК (Kirkman HN., Gaetani G., 1984).

При нормозооспермии были определены положительные связи активности СОД с уровнем ДК в спермиях (г=0,24; р<0,05) и с содержанием МДА в спермиях (г=0,25; р<0,05). В группе «астенозооспермия» подобно нормозооспермии содержание МДА в спермиях положительно коррелировало с активностью СОД (г=0,50; р<0,01), в группе «тератоастенозооспермия» взаимосвязь содержания МДА с активностью СОД в спермиях была еще сильнее (г=0,55; р<0,05). При интенсификации

липопероксидации при тератоастенозооспермии активность СОД тоже повышалась. Для мужчин с астенозооспермией более высокое содержание ДК и МДА в спермиях вызывает увеличение активности СОД, данная связь при патоспермии является более выраженной, чем при нормозооспермии.

Кроме того, в группе «тератоастенозооспермия» найдена отрицательная связь МДА и каталазоподобной активностью в семенной плазме (г=-0,56; р<0,01). Таким образом, при интенсификации липопероксидации у мужчин с тератоастенозооспермией каталазная активность снижалась.

В группе «тератоастенозооспермия» установлены положительные взаимосвязи между процентом аномальных сперматозоидов и активностью СОД в семенной плазме (г=0,48; р<0,05). Действительно, нами показано, что при тератоастенозооспермии происходит значительное увеличении активности СОД, и наличие прямой связи говорит о значительном количестве спермиев с цитоплазматическими каплями в данной группе мужчин. Кроме того, в группе «астенозооспермия» определены положительные взаимосвязи между процентом слабоподвижных спермиев и активностью СОД в семенной плазме (г=0,47; р<0,01).

Таким образом, установлено, что активность рассматриваемых ферментов претерпевает значительные изменения при патоспермии. При этом в группах с астено- и тератоастенозооспермией достоверно по сравнению с мужчинами с нормозооспермией изменяются супероксиддисмутазная и каталазная активности (у мужчин с тератозооспермией - лишь супероксиддисмутазная): первая повышается, последняя снижается.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при патоспермии происходят разнонаправленные изменения активности СОД и каталазы. Дефицит каталазной активности косвенно может свидетельствовать о накоплении пероксида водорода, при высоких концентрациях являющегося ингибитором СОД. Отсутствие ингибирующего эффекта Н202 (активность СОД существенно возрастала при патоспермии) можно трактовать следующим образом: концентрация Н202 не достигает величин, вызывающих инактивацию СОД вследствие устранения пероксида водорода глутатионпероксидазой, одним из важнейших компонентов глутатионовой антиоксидантной системы.

Состояние глутатионового звена в сперматозоидах и семенной плазме при патоспермии

Глутатион - важный гидрофильный антиоксидант и необходимый кофактор для антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы и глутатион-Б-трансферазы, вместе объединенных в глутатионовое звено АОС. В клетках обнаруживаются высокие миллимолярные концентрации FSH (Кулинский В.И., Колисниченко Л.С., 1990; Arthur Ж., 2000).

В семени млекопитающих неферментативное звено антиоксидантной защиты представлено в основном глутатионом (Irvine DS., 1996; Lenzi А. et

al, 2002). Обнаружено, что уровень этого тиола уменьшается во время процессов созревания сперматозоида (Lenzi A. et al, 2002; Montiei EI. et al, 2003).

Данные по содержанию компонентов глутатионовой системы фрагментарны и противоречивы. Согласно сведениям некоторых авторов (Aitken RJ., 1994), восстановленный глутатион отсутствует или содержание его крайне низко в сперматозоидах. Тогда как по данным других исследователей (Irvine DS., 1996; Sikka SC., Agarwal A., 1996) зрелые сперматозоиды содержат все компоненты глутатионовой системы, несмотря на то, что имеют ограниченный объем цитоплазмы.

Работ, в которых оценивалось бы состояние глутатионового звена АОС при патоспермии, на сегодняшний день очень мало. В нашей работе эффективность работы глутатионового звена АОС спермиях (рис. 3) и семенной плазмы (рис. 4) в группах с различными характеристиками семени оценивалась как по содержанию TSH, так и по активности TSH-зависимых ферментов.

ИНормозоослермия О Астенозоосперглия

□ Тератозооспермия О Тератоастекозоослермия

120 г-

! 100 100 100

100 -TSZE1-ШШШ,-Е7=1

гэн mo tst

Примечание: *-р<0,0001 в сравнении с нормозооспермией

Рис 3. Содержание восстановленного глутатиона, активность глутатионпероксидазы и глутатион-Б-трансферазы в спермиях в исследуемых группах мужчин в процентах.

В сперматозоидах при астено- и тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией уровень Г8Н достоверно снижался на 54% и 62% соответственно. При тератоастенозооспермии содержание Г8Н падало на 64% (рис. 3).

При астено- и тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией в спермиях человека выявлено достоверное снижение активности глутатион пероксидазы соответственно на 50% и 66%. В группе «тератоастенозооспермия» активность ГПО снижалась на 70% по сравнению с нормозооспермией.

При астено- и тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией в спермиях человека выявлено достоверное снижение активности ГБТ соответственно на 36% и 33 %. При тератоастенозооспермии активность глутатион-Б-трансферазы снижалась на 35%.

ВНормозооспермия □ Тератозооспериия

О Астенозооспермия ЕЗ Тератоастенозооспермия

120 100 30 60 40 20 0

100

а— ***

гэн

100

гпо

100

95_

1МЩГ

*** ч^_

гет

Примечание: *-р<0,05, **-р<0,001, ***-р<0,0001 в сравнении с нормозооспермией

Рис 4. Содержание восстановленного глутатиона, активность глутатионпероксидазы и глутатион-8-трансферазы в семенной плазме в исследуемых группах мужчин в процентах.

В семенной плазме содержание ГБН при астено- и тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией достоверно снижалось на 39% и 44% соответственно, а в группе «тератоастенозооспермии» - данный показатель по сравнению с нормой падал на 60% (рис. 4).

Достоверное снижение активности ГПО также наблюдается и в семенной плазме на 24% и 67 % при астено- и тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией соответственно. В группе «тератоастенозооспермия» активность ГПО падала на 48% по сравнению с нормозооспермией.

Достоверное снижение активности глутатион-Б-трансферазы также наблюдается и в семенной плазме на 5% и 62% при астено- и тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией соответственно. При тератоастенозооспермии активность глутатион-8-трансферазы снижалась на 58%.

Концентрация восстановленного глутатиона в сперматозоидах при патоспермии, возможно, снижается в результате непосредственного привлечения значительного количества тиола в процессы защиты клетки от гидроксильных и алкоксильных свободных радикалов, а также от источников их образования. Отчасти поэтому происходит снижение

активностей ферментов ГПО и TST в сперматозоидах, поскольку TSH для данных энзимов является дефицитным косубстратом.

Снижение мощности глутатионовой системы может приводить к радикальной перестройке процессов жизнедеятельности клетки: изменению активности ферментов, проницаемости клеточных мембран, интенсивности метаболизма и других процессов, которые имеют большое значение в генезе различных форм патоспермии (Foresta С. et al, 2002; Hemachand Т., Shaha С., 2003).

Найденное нами снижение активности ферментов глутатионового метаболизма также может быть связано с действием АФК. Нужно отметить, что в структуре активных центров рассматриваемых нами ферментов имеются аминокислотные остатки, которые в первую очередь окисляются под действием ОН, Н202, а также свободные SH-группы. Так, в активном центре молекулы FST имеется гистидин, а также свободная SH-rpynna. Фермент ГПО содержат в своем активном центре аргинин (Кулинский В.И., Колесниченко JI.C., 1993).

Установленное нами снижение внутриклеточного уровня восстановленного глутатиона при патоспермии нельзя рассматривать в отрыве от активности ферментов, участвующих в его регенерации из окисленной формы. Такими ферментами являются глутатионредуктаза и глкжозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Необходимо отметить, что активность фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы ни в спермиях, ни в семенной жидкости достоверно не различалась у мужчин с разными видами патоспермии по сравнению с нормозооспермией.

Таблица 2

Активность глутатионредуктазы (мкмоль/мин/г белка) в спермиях и

Группа N Сперматозоиды, Ме(С25;С75) Семенная плазма, Me(C25;C7s)

Нормозооспермия 42 52,1 (0,01; 155) 6,07 (0,01; 101)

Астенозооспермия 13 487,3* (38,5; 1127) 27 (7,1; 97)

Тератозооспермия 11 15 (0,69; 244) 60 (0,01; 329)

Тератоастенозооспермия 8 55,7 (2,7; 104,5) 25 (2,8; 64)

Примечание: *р<0,001 в сравнении с нормозооспермией

Согласно полученным данным, активность глутатионредуктазы в сперматозоидах при астенозооспермии достоверно выше в 9,3 раза по сравнению с нормозооспермией. При тератозооспермии ГР имеет тенденцию снижения активности на 72%, а при тератоастенозооспермии активность ГР практически не изменяется. В семенной плазме изменения активности ГР при различных видах нарушения сперматогенеза носят недостоверный характер.

Таким образом, изменения активностей обоих ферментов, отвечающих за рециклирование восстановленного глутатиона, в спермиях носят

следующую направленность при патоспермии: при астенозооспермии активность ГР возрастает, а при тератозооспермии и тератоастенозооспермии - падает. Активность ГР в семенной плазме была крайне низкой и достоверно не различалась между группами мужчин с различными показателями семени.

Так же как и в группе «нормозооспермия», в группе «астенозооспермия» обнаружена положительная корреляционная связь между количеством аномальных форм сперматозоидов и активностью ГПО спермиев (г=0,34; р<0,05 и i=0,42; р<0,05 соответственно ).

Найдена в группе «астенозооспермия» отрицательная взаимосвязь между активностью каталазы спермиев и содержанием глутатиона (г=-0,53; р<0,001), что может быть характерным при развитиии патоспермии.

В группе «тератозооспермия» определена положительная связь между процентом аномальных спермиев и содержанием FSH в спермиях (г=0,70; р<0,001). Кроме того, в группе «тератозооспермия» обнаружены положительные связи между процентом подвижных сперматозоидов и активностью в них FST (г=0,48; р<0,05).

Обнаруженная в группе «нормозооспермия» отрицательная связь (г=-0,40; р<0,01) подвижности спермиев с активностью Г6ФДГ в семенной плазме может быть связана с тем, что НАДФН, продуцируемый в ходе ГбФДГ-реакции, используется НАДФН-оксидазой для образования супероксидного радикала. Ог" провоцирует запуск процессов ПОЛ, в результате чего подвижность спермиев падает (Fisher HM., Aitken RJ., 1997).

Оценка редокс-баланса в сперме

В некоторых работах в качестве дополнительного критерия оценки антиоксидантной системы используется коэффициент редокс-баланса, оцениваемый путем отношения суммарного количества прооксидантов к суммарной активности антиоксидантов (Garrido N. et al, 2004).

В нашей работе для расчета подобного коэффициента использованы в относительных величинах следующие параметры: содержание МДА, ДК, активность СОД, каталазы, ГПО. Коэффициент рассчитан как отношение содержания прооксидантов к активности антиоксидантов. Мы использовали два варианта расчета коэффициента редокс-баланса.

В первом случае мы рассчитали формулу редокс-баланса как произведение в относительных единицах содержания МДА и ДК, отнесенное к произведению активности СОД и каталазы. За единицу принимали значения измеряемых величин при нормозооспермии.

Спермин Семенная плазма

а астенозооспернмия ■ тератозооспермия □ тератоастенозооспермия о нормозооспермия

Рис 5. Редокс-баланс спермиев и семенной плазмы при различных формах патоспермии (ДКхМДА)/(СОДхКАТАЛАЗА).

Результаты проведенных подсчетов, представленные на рис. 5, свидетельствуют, что при патоспермии происходит смещение редокс-баланса в сторону увеличения количества прооксидантов. Очевидно, что коэффициент редокс-баланса в спермиях был максимален в группе «тератозооспермия», тогда как в семенной плазме данный коэффициент имеет наименьшую величину по сравнению с другими видами патоспермии. В семенной плазме данный коэффициент был максимален в группе с тератоастенозооспермией. Для групп «астено-» и «тератоастенозооспермия» редокс дисбаланс был выше в семенной плазме, чем в спермиях.

При расчете другим способом формула редокс-баланса выглядела как произведение в относительных единицах МДА и ДК, отнесенное к произведению активности СОД, каталазы и ГПО. За единицу принимали значения измеряемых величин при нормозооспермии.

Коэффициент I ' 1 11,4,3 6.19 0.25 14,1

1 г | 1

Г спермии семипал плазма пла ■ нормозооспермия ■ асгсмозооспрсмия а терагозооспермии я юратоастснозооспермим зма 1

Рис 6. Редокс-баланс спермиев и семенной плазмы при различных формах патоспермии (ДКхМДА)/(СОДхКАТАЛАЗАхГПО).

Из рисунка 6 видно, что коэффициент редокс-баланса и в спермиях был максимален в группе «тератозооспермия», а в семенной плазме - в группе «тератоастенозооспермия». Следует отметить, что в клетках, за исключением группы «тератоастенозооспермия», данный коэффициент имеет большее значение по сравнению с семенной плазмой.

Интересно, что сопоставляя коэффициенты, рассчитанные первым и вторым путем, можно увидеть несколько иной характер редокс нарушений в семенной плазме и спермиях. В группах «астено-» и «тератозооспермия» дисбаланс прооксидантов и антиоксидантов в семенной плазме был ниже, чем в сперматозоидах. Это может говорить о том, что семенная плазма у таких мужчин обладала большей антиоксидантной мощностью по сравнению с семенной жидкостью в группе «тератоастенозооспермия».

Итак, полученные в ходе нашей работы результаты исследования антиоксидантного статуса указывают на дефицит мощности антиоксидантной защиты как в спермиях, так и в семенной плазме при астено-, терато- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией. Обнаружено снижение уровня ГБН, активности каталазы, ГПО, ГБТ и в сперматозоидах, и в семенной плазме при всех видах патоспермии по сравнению с нормозооспермией. При этом падение активности указанных ферментов и снижение уровня ГБН при тератоастенозооспермии является более значительными, чем при других формах нарушения сперматогенеза.

Повышение ферментативной активности было зафиксировано для СОД в спермиях и семенной плазме во всех группах мужчин с нарушением сперматогенеза по сравнению с нормозооспермией, тогда как достоверное увеличение активности ГР в спермиях наблюдалось только в группе «астенозооспермия», а при терато- и тератоастено- можно было говорить о тенденции к увеличению активностей ферментов ГР и Г6ФДГ.

Вероятно, наиболее важной причиной снижения мощности антиоксидантной защиты семени у мужчин с нарушением сперматогенеза является развитие окислительного стресса. Известно, что лейкоциты в семени являются мощным источником АФК, способных вызвать окислительную модификацию белков ферментов, следствием которой является потеря их активности (БЬекатг М. et а1, 1995).

Обнаруженное снижение в спермиях содержания ГБН может быть связано с тем, что на начальных этапах развития окислительного стресса ферментативная защита, в силу ряда причин, оказывается менее эффективной по сравнению с протекторным действием низкомолекулярных антиоксидантов. При этом ГБН, способный непосредственно перехватывать Ог~ и "ОН, становится главной мишенью для атаки АФК. Помимо собственного защитного действия, с которым связан его усиленный расход, ГБН принимает участие в ГПО- и ГБТ- реакциях, а также в регенерации других компонентов АОС - а-токоферола и аскорбата, что дополнительно снижает его концентрацию в спермиях. Поддержание необходимого клетке

уровня TSH обеспечивается восстановлением rSSF системой «Г6ФДГ-ГР». Активность Г6ФДГ в группах достоверно не различалась, активность ГР при астенозооспермии достоверно повышалась, а при терато- и тератоастенозооспермии она понижалась по сравнению с нормой.

Результатом повышенной генерации АФК является усиление интенсивности липидной пероксидации, что проявляется накоплением ДК и МДА в сперматозоидах и семенной плазме, концентрация продуктов ПОЛ во всех группах мужчин с патоспермией превышает показатели в группе «нормозооспермия». Нарушение стационарного состояния ПОЛ, сочетающееся с накоплением ДК и МДА, обладающих мембранотоксическими эффектами, снижает способность спермиев выполнять свои физиологические функции (Tavilani Н. et al, 2005).

Изменение активности ферментов под влиянием АФК объясняют в основном локальными нарушениями в области активного центра. Эти нарушения могут быть связаны с окислительной модификацией аминокислотных остатков (серосодержащих аминокислот, гистидина), изменением валентности и нарушением координационной геометрии металлов для ряда металлзависимых ферментов. К. Дэвис и др. (Davies КГ. et al, 1987) убедительно показали, что любое влияние АФК на белки различного типа приводит к сложным окислительным модификациям в структуре белковой молекулы и изменениям ее физико-химических и биологических свойств.

Таким образом, причины, вызывающие интенсификацию свободнорадикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекулярном "уровне носят однотипный характер. Общим для всех видов патоспермии является усиление процессов липопероксидации, снижение буферной емкости АОС, нарушение мобилизации ее в ответ на повышение активности прооксидантной системы.

Все компоненты АОС в норме находятся во взаимокомпенсаторных отношениях. Как правило, снижение концентрации или активности одних антиоксидантов приводит к соответствующему изменению других. При патоспермии нарушение редокс-баланса приводит к перестойке системы корреляционных связей, затрудняя выполнение сперматозоидом его физиологической функции.

ВЫВОДЫ

1. У мужчин при нарушении сперматогенеза по сравнению с нормозооспермией в семени происходит интенсификация процессов перекисного окисления липидов и снижение мощности антиоксидантной защиты.

2. По сравнению с нормозооспермией при астено-, терато-, тератоастенозооспермии у мужчин происходит увеличение содержания продуктов липопероксидации, ДК и МД А, в семенной плазме и спермиях.

3. Нарушение сперматогенеза сопровождается снижением каталазной активности на фоне повышения активности СОД в спермиях и семенной плазме.

4. Патоспермия сопровождается снижением активности глутатионпероксидазы, глутатион-Б-трансферазы и содержания восстановленного глутатиона в спермиях и семенной плазме.

5. При астенозооспермии в спермиях происходит увеличение активности глутатионредуктазы, тогда как в других группах достоверных изменений активности фермента не обнаружено. Активность Г6ФДГ при патоспермии по сравнению с нормозооспермией достоверно не изменяется.

6. Введенный нами коэффициент редокс-баланса в спермиях был максимален в группе «тератозооспермия», а в семенной плазме - в группе «тератоастенозооспермия». Коэффициент дисбаланса прооксидантов и антиоксидантов в спермиях имеет большее значение, чем в семенной плазме.

7. При астено- и тератозооспермии обнаружена отрицательная корреляционная связь между интенсивностью процессов ПОЛ и подвижностью спермиев.

8. При патоспермии обнаружена положительная корреляционная связь между состоянием некоторых компонентов глутатионового звена (FSH для терато- и ГПО для астенозооспермии) и количеством аномальных форм сперматозоидов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1. Быкова М.В., Артюхова В.Г., Титова Н.М., Светлаков A.B. Влияние криоконсервации на состояние перекисных процессов и антиоксидантную систему в сперматозоидах человека // Материалы Итоговой научной конференции ГУНИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири». - Красноярск, 2004. - С.164-165.

2. Быкова М.В., Маркова Е.В., Светлаков A.B., Серебренникова O.A., Титова Н.М. Интенсивность перекисных процессов в сперматозоидах мужчин // Вестник Красноярского государственного университета. Естественные науки. - 2005. - №5. - С.264-267.

3.Быкова М.В. Процессы перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов в сперматозоидах человека при патоспермии // Материалы Международного молодежного медицинского Конгресса "Санкт-Петербургские научные чтения". - Санкт-Петербург, 2005. - С.111.

4. Быкова М.В., Маркова Е.В., Светлаков A.B., Филлимонов С.Ф. Влияние криоконсервации на процессы перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов в сперматозоидах человека при патоспермии //Сборник материалов работы конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (РАРЧ) «Вспомогательные репродуктивные технологии сегодня и завтра». - Чебоксары, 2005. - С.74-76.

5. Быкова М.В. АНТИ- И Прооксидантный статус сперматозоидов при патоспермии// Сборник тезисов и материалов Межрегиональной научно-

практической конференции "Объединение субъектов Российской Федерации и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири". - Красноярск, 2005- С.311-312.

6. Быкова М.В. Состояние проксидантной и антиоксидантной систем в сперме мужчин при астенозооспермии // Сборник тезисов научной конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета. - Ростов-на-Дону, 2006. - С. 161.

7. Быкова М.В., Титова Н.М., Маркова Е.В., Светлаков А.В. Про-/антиоксидантный статус в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при астенозооспермии // Сборник материалов работы XVI международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (РАРЧ) «Вспомогательные репродуктивные технологии сегодня и завтра». - Ростов-на-Дону, 2006. - С.47-48.

8. Bykova M., Titova N., Sharma R., Agarwal A. Association of classical semen parameters with superoxide dismutase and catalase activities in human semen// Fertil Ster. - 2007.- №88, Sup.l - P.302-303.

9. Bykova M., Titova N., Sharma R., Agarwal A. Malondialdehyde and diene conjugate levels in sperm and seminal plasma of infertile and normozoospermic men// Fertil Ster. - 2007. - №88, Sup.l - P.303-304.

10. Bykova M., Titova N., Sharma R., Agarwal A. Glutathione and glutathione-dependent enzymes in sperm and seminal plasma from infertile men// Fertil Ster. - 2007. - №88, Sup.l - P.366-367.

11. Mahfouz R., Sharma R., Jianbo L., Bykova M., Sabanegh E., Agarwal A. Diagnostic value of the total antioxidant capacity assay in human seminal plasma by receiver operating characteristic curve analysis // Fertil Ster. - 2007. - №88, Sup.l- P.269.

12. Bykova M., Athayde K., Sharma R., Jha R., Sabanegh E., Agarwal A. Defining the reference value of seminal reactive oxygen species in a population of infertile men and normal healthy volunteers // Fertil Ster. - 2007. - №88, Sup.l - P.305.

13. Mahfouz R., Aziz N., Sharma R., Bykova M., Sabanegh E., Agarwal A. Simultaneous evaluation of intracellular superoxide and hydrogen peroxide in different sperm fractions // Fertil Ster. 2007.-№88, Sup.l -P.363-364.

14. Быкова M.B., Титова H.M., Маркова E.B., Светлаков А.В. «Глутатион и глутатионзависимые ферменты в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при патоспермии» // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимиии». - Вятский медицинский вестник. - 2007. - №4. -С.41-43.

15. Быкова М.В. Оценка про-/антиоксидантного статуса в спермиях и семенной плазме у мужчин при патоспермии// Материалы научно-практического симпозиума «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия». - Волгоград, 2008. - С.6.

16. Быкова М.В. Глутатион и глутатионзависимые ферменты в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при патоспермии // Материалы

IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. -Новосибирск, 2008. - С. 466.

17. Быкова М.В., Титова Н.М. Процессы перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при патоспермии // Материалы XI межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины». - Абакан, 2008. - С.62-67.

18. Быкова М.В., Титова Н.М., Савченко A.A., Маркова Е.В. Активность ферментов полиольного пути в спермиях и семенной плазме мужчин при патоспермии // Материалы научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири». - Красноярск, 2008. - С.21-23.

19. Быкова М.В., Титова Н.М., Маркова Е.В., Светлаков A.B. Про-/антиоксидантный статус в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при патоспермии //Проблемы Репродукции. - 2008. - №3. - С.63-67.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

TSH - глутатион

TST - глутатион-Б-трансфераза

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ДК - диеновые конъюгаты

KT - каталаза

МДА - малоновый диальдегид

ОС - окислительный стресс

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПФП - пентозофосфатный путь

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

СОД - супероксиддисмутаза

Автор выражает благодарность заведующему кафедрой биохимии и физиологии человека и животных ГОУ ВПО «Сибирский федеральный университет» д-ру мед. наук, профессору A.A. Савченко, кандидату биол. наук, директору Центра репродуктивной медицины г. Красноярска A.B. Светлакову, кандидату биол. наук, доценту, заместителю директора по науке Центра репродуктивной медицины Е.В. Марковой за проявленный интерес к работе, ценные теоретические и методологические советы, а также за помощь в организации проведения исследования.

Подписано в печать НО,200$г . Формат 60 х 84г/1в. Печать оперативная. Усл. пем. л. Тираж 100 экз. Заказ №

Отпечатано в ИПК СФУ. 660041 Красноярск, пр. Свободным, 79.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Быкова, Мария Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 11 Активные формы кислорода и механизмы их образования

1-2 Пер екисное окисление липидов

1 -3 Антио^сидантная система

1 -4 Роль АФК в мужской репродуктивной системе

1.4.1 Яички и сперматогенез

1.4.2 Путь через эпидидимус: созревание сперматозоидов

1.4.3 Семенная плазма и эякулят

1.4.4 Участие АФК в капацитации и акросомальной реакции 3 О

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Краткая характеристика пациентов

2.2 Объекты исследования

2.3 Анализ эякулята

2.4 Определение содержания диеновых коньюгатов

2.5 Определение содержания малонового диальдегида

2.6 Определение активности супероксиддисмутазы

2.7 Определение активности каталазы

2.8 Определение содержания восстановленного глутатиона

2.9 Определение активности глутатионпероксидазы

2.10 Определение активности глутатион-Б-трансферазы

2.11 Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ

Определения содержания белка

2.13 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Показатели спермограммы в исследуемых группах

3.2 Содержание продуктов перекисного окисления липидов в сперматозоидах и семенной плазме при патоспермии

3.3 Активность супероксиддисмутазы и каталазы в сперматозоидах и семенной плазме при патоспермии

3.4 Состояние глутатионового звена в сперматозоидах и семенной плазме при патоспермии

3.5 Оценка редокс-баланса в сперме 87 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91 ВЫВОДЫ 101 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102 Список сокращений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нарушение редокс-баланса в сперматозоидах и семенной плазмы мужчин при патоспермии"

Репродуктивная функция человека является одним из наименее изученных разделов медицины. Несмотря на значительные успехи современной гинекологии, андрологии, эндокринологии, медицинской генетики, иммунологии в диагностике нарушений репродуктивной функции, разработке и проведении реабилитационных мероприятий в супружеской паре, частота бесплодных браков в настоящее время составляет, по данным ВОЗ, от 8,0 до 15,0 %, частота невынашивания беременности - от 7 до 55% (Кулаков В.И., 1999).

В литературе последнего десятилетия появляются данные, что важным патогенетическим звеном при развитии мужской инфертильности (независимо от этиологии) является окислительный стресс (Gil-Guzman E.et al, 2001; SharmaRK. et al, 1999; Sikka S., 2001).

При протекании окислительно-восстановительных реакций часть потребляемого организмом кислорода претерпевает последовательное одноэлектронное восстановление с образованием активных форм кислорода (АФК) (Владимиров Ю.А. и др., 1991). Являясь специфическими сигнальными и регуляторными молекулами в организме, АФК, при повышении их концентрации, могут привести к опасным для поддержания жизнедеятельности клетки процессам: неконтролируемому перекисному окислению липидов (ПОЛ), окислительной модификации нуклеиновых кислот и ферментов с последующей потерей их активности и др. (Арчаков А.И., Мохосеев И.М., 1989; Калуев А.В., 1998; Дубинина Е.Е., 2001). Усиление процессов свободнорадикального окисления влечет за собой нарушение ряда важнейших биохимических процессов и функционирования мембранных структур клеток и субклеточных образований, что в свою очередь может послужить толчком к развитию в том числе и мужской инфертильности (Agarwal A., Prabakaran SA., 2004; Lopes S. et al, 1998).

Нарушение окслительно-восстановительного гомеостаза (редокс-баланса) приводит к возникновению окислительного стресса (ОС), ключевым событием которого является гиперпродукция АФК (Меныцикова Е.Б. и др., 2006; Fridovich I., 1997). Стационарный уровень АФК поддерживается многокомпонентной антиоксидантной системой (АОС), предупреждающей развитие ОС. Система антиоксидантной защиты организма представлена 1 рядом низкомолекулярных биоантиоксидантов и специализированных ферментов, проявляющих специфичность в отношении определенных АФК, эффективно функционирующих как внутри клетки, так и во внеклеточном пространстве (Владимиров Ю.А., 1998; Halliwell В., Gutteridge М., 2003).

В эякуляте источниками образования АФК являются как сами сперматозоиды (при неправильной дифференциации клеток во время стадий сперматогенеза), так и лейкоциты. Генерация АФК в сперме может иметь как позитивные последствия, так как во время капацитации и акросомальной реакции АФК подготавливают спермий для связывания и оплодотворения яйцеклетки (deLamirande Е. et al, 1997; O'Flaherty СМ. et al, 1999), так и негативные, приводя к снижению жизнеспособности клетки. Положительный эффект связан с умеренной продукцией АФК, тогда как гиперпродукция приводит к неблагоприятным последствиям. Кроме того, окислительный стресс в эякуляторных спермиях может быть вызван активацией синтеза АФК в комбинации с бедностью антиоксидантных компонентов в семенной плазме. Нарушение редокс-баланса может являться важной причиной мужского бесплодия (Sharma RK. et al, 1999; Gil-Guzman E. et al, 2001; Sikka S., 2001).

В то же время механизмы развития ОС, его выраженность при различных видах патоспермии, а также функциональная активность АОС в изучаемой нами литературе не имеют достаточного освещения. В немногочисленных работах, посвященных исследованию антиоксидантного статуса при мужском бесплодии, состояние АОС больных оценивается в большинстве случаев по активности СОД и ГПО либо по концентрации 5 одного из продуктов ПОЛ, что не может дать полноценного представления о состоянии окислительно-восстановительного гомеостаза.

Приведенные данные свидетельствуют об актуальности проблемы и целесообразности проведения исследований по изучению особенностей развития окислительного стресса и состояния АОС при различных видах нарушения сперматогенеза.

Цель исследования: Выявить закономерности изменения прооксидантного и антиоксидантного статуса сперматозоидов и семенной плазмы у мужчин с различными типами нарушения сперматогенеза.

Задачи исследования:

1.Изучить интенсивность процессов перекисного окисления липидов в спермиях и семенной плазме у мужчин при нормозооспермии и при нарушении сперматогенеза.

2.Исследовать состояние антиоксидантной системы семенной плазмы и спермиев у мужчин при патоспермии и нормозооспермии.

3.Установить характер взаимосвязи между физиологическими параметрами и редокс-балансом эякулята и его изменение в зависимости от вида патоспермии.

Научная новизна: Впервые при нарушении нормального сперматогенеза проведена оценка интенсивности ПОЛ: дифференцированно исследовано содержание диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в спермиях и семенной плазме у мужчин. Впервые у мужчин при патоспермии проведено комплексное исследование внутриклеточного и экстрацеллюлярного звена АОС по показателям супероксиддисмутазы, каталазы, восстановленного глутатиона, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Установлено, что у мужчин при нарушении сперматогенеза по сравнению с нормозооспермией в семенной плазме и спермиях происходит интенсификация процессов перекисного окисления липидов и снижение мощности антиоксидантной защиты.

Впервые установлены взаимосвязи между физиологическими параметрами эякулята (подвижностью и морфологией спермиев), с одной стороны, и содержанием продуктов ПОЛ и активностью антиоксидантной защиты при патоспермии, с другой стороны.

Практическая значимость: Исследование функциональной активности антиоксидантной системы и продуктов липидной пероксидации позволяет оценить степень тяжести окислительного стресса при патоспермии. В процессе исследования установлено, что максимальная депрессия антиоксидантной способности семенной плазмы отмечена при тератоастенозооспермии, тогда как в спермиях — при тератозооспермии.

Изучение состояния антиоксидантной системы семени у мужчин при нарушении сперматогенеза позволяет своевременно принимать меры, направленные на коррекцию окислительно-восстановительного гомеостаза. Кроме того, оценка тяжести ОС как в спермиях, так и в семенной плазме у каждого конкретного мужчины имеет важное значение с точки зрения прогноза развития дальнейших осложнений, что в конечном итоге влияет на оплодотворяющую способность спермиев и развитие эмбриона из генетического материала сперматозоидов. Результаты исследования антиоксидантного статуса семени могут быть использованы при дифференциальной диагностике мужского идиопатического бесплодия (бесплодия неясного генеза). Пациентам с выраженным ОС рекомендуется принимать антиоксидантную терапию, позволяющую предотвратить утяжеление патологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Независимо от вида патоспермии, по сравнению с нормозооспермией, у мужчин происходит интенсификация процессов ПОЛ как в семенной плазме, так и в спермиях.

2. Патоспермия сопровождается снижением активности большинства антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы) и содержания восстановленного глутатиона в спермиях и семенной плазме на фоне повышения активности супероксиддисмутазы.

3. Буферная емкость антиоксидантной системы семенной плазмы превышает таковую у сперматозоидов.

4. Для патоспермии характерна отрицательная корреляционная взаимосвязь интенсивности процессов ПОЛ с подвижностью спермиев и положительная - с количеством аномальных форм сперматозоидов.

Апробация работы: Основные положения и результаты исследования обсуждены на: Межрегиональной научно-практической конференции "Объединение субъектов Российской Федерации и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири" (Красноярск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции Российской ассоциации репродукции человека (Чебоксары, 2005); Международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения" (Санкт-Петербург, 2005); научной конференции молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2006); 63-м 8 ежегодном Международном конгрессе американского общества по репродуктивной медицине (Вашингтон, 2007); научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов ( Новосибирск, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 3 статьи и 3 тезиса в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертационных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Быкова, Мария Валерьевна

выводы

2. По сравнению с нормозооспермией при астено-, терато-, тератоастенозооспермии у мужчин происходит увеличение содержания продуктов липопероксидации, ДК и МДА, в семенной плазме и спермиях.

4. Патоспермия сопровождается снижением активности глутатионпероксидазы, глутатион-8-трансферазы и содержания восстановленного глутатиона в спермиях и семенной плазме.

8. При патоспермии обнаружена положительная корреляционная связь между состоянием некоторых компонентов глутатионового звена (rSH для терато- и ГПО для астенозооспермии) и количеством аномальных форм сперматозоидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема нарушения репродуктивной функции мужчин возникла с момента становления моногамного брака, но особую актуальность этот вопрос приобрел в XX веке. Относительное увеличение доли мужского фактора в генезе репродуктивных расстройств в супружеской паре в последние годы объясняется двумя причинами. Во-первых, это связано со значительными успехами в реабилитации детородной функции у женщин. Во-вторых, мужская репродуктивная система, являясь одной из наиболее чувствительных и ранимых в организме, в настоящее время подвергается воздействию ряда неблагоприятных факторов, которые, влияя на эндокринные железы, центральную нервную систему и непосредственно на гонады, вызывают дистрофические изменения в семенных канальцах и межуточной ткани яичек. Это приводит к снижению оплодотворяющей способности эякулята и, как следствие, к нарушению репродукции в супружеской паре (бесплодию, невынашиванию беременности, рождению неполноценного потомства).

Установлено, что важным патогенетическим звеном мужского бесплодия независимо от его этиологии является наличие окислительного стресса (ОС) (Sharma RK. et al, 1999; Gil-Guzman E. et al, 2001; Sikka S., 2001).

Состояние ОС в организме является следствием резкой активации процессов свободнорадикального окисления (Зенков Н.К. и др., 1999). В условиях физиологического оптимума наиболее мощной и универсальной системой, предупреждающей развитие ОС, является АОС. Система антиоксидантной защиты организма представлена рядом низкомолекулярных биоантиоксидантов и специализированных ферментов, проявляющих специфичность в отношении определенных АФК, эффективно функционирующих как внутри клетки, так и во внеклеточном пространстве (Владимиров Ю.А., 1998). Увеличение интенсивности свободнорадикального окисления сопряжено с мобилизацией АОС, что проявляется увеличением

91 активности ее ферментов. В то же время длительное напряжение АОС приводит к ее истощению, что создает условия для дальнейшего развития патологии (Барабой В.А., 1991).

Данные об интенсивности процессов липопероксидации и состоянии антиоксидантной защиты при патологиях мужской репродуктивной системы недостаточны и противоречивы. Еще более невыясненным является вопрос участия окислительного стресса в развитии дифференцированной формы нарушения сперматогенеза. При этом важно понять, нарушение каких именно звеньев АОС семени может стать пусковым фактором в развитии той или иной формы патоспермии. Наконец, данные по состоянию АОС и интенсивности липопероксидации при таких формах нарушения сперматогенеза, как терато- и тератоастенозооспермия вообще отсутствуют.

В связи с этим актуальным представляется вопрос о поиске и применении методов терапии, способствующих восстановлению и поддержанию мощности системы антирадикальной защиты организма при различных патологиях, в том числе и при патоспермии. В последнее время в практику терапии идиопатического бесплодия внедряются методы лечения, обеспечивающие антирадикальную защиту органа и организма в целом. Чаще в качестве терапии антиоксидантами применяются витамины Е, С, L-карнитин и др. (Rolf С. et al, 1999; Keskes-Ammar I. et al, 2003).

Цель исследования: выявить закономерности изменения состояния системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов семени у мужчин при различных формах нарушения сперматогенеза.

Для достижения цели нами были обследованы группы мужчин с нормо-, астено-, терато- и тератоастенозооспермией, обратившихся в Центр репродуктивной медицины г. Красноярска по причине подозрения бесплодия. Объектом исследования служили эякуляты мужчин возрастом от 22 до 48 лет с различными параметрами спермограммы. Всего в работе было исследовано 180 человек. Определение продуктов ПОЛ (ДК и МДА), содержания восстановленного глутатиона и активностей основных

92 ферментов АОС: СОД, каталазы, ГПО, а также активности ферментов, участвующих в рециклизации глутатиона (ГР и Г6ФД) проводили в семенной плазме и спермиях. Результаты экспериментов подвергали статистической обработке. Все серии опытов сравнивали по непараметрическим ранговым критериям Уилкоксона и Манна-Уитни.

Полученные в ходе нашей работы результаты исследования антиоксидантного статуса указывают на дефицит мощности антиоксидантной защиты как в спермиях, так и в семенной плазме при всех видах патоспермии по сравнению с нормозооспермией. Обнаружено снижение уровня TSH, каталазной активности, ГПО-, TST-активностей в сперматозоидах и в семенной плазме при астено-, терато- и тератоастенозооспермии по сравнению с нормозооспермией. При этом падение активности указанных ферментов и снижение уровня TSH при тератоастенозооспермии является более значительным, чем при других формах нарушения сперматогенеза.

Повышение ферментативной активности было зафиксировано для СОД в спермиях и семенной плазме во всех группах мужчин с нарушением сперматогенеза по сравнению с нормозооспермией, тогда как достоверное увеличение активности ГР в спермиях наблюдалось только в группе «астенозооспермия», а при терато- и тератоастенозооспермии можно было говорить о тенденции к увеличению активностей ГР и Г6ФДГ.

Такая неоднозначная направленность изменений компонентов АОС — дефицит активности и содержания одних компонентов и активация других, возможно, является следствием неоднозначного воздействия АФК и продуктов окислительной модификации биомолекул на компоненты АОС.

Существует точка зрения, что увеличение клеточной активности СОД связано с увеличением длины спермия (Aitken RJ., 1996). СОД, вероятно, происходит из цитозоля удлиненных сперматид (Fisher НМ., Aitken RJ., 1997) и ее активность используется как маркер цитоплазматических капель (Aitken RJ., 1996). Более того, по мнению ряда исследователей, высокие активности

СОД отражают большее количество аномальных сперматозоидов с цитоплазматическими каплями (Aitken RJ., 1996).

Высокая активность СОД косвенно свидетельствует об интенсивной генерации Ог". Рассмотрим возможные источники образования супероксиданион-радикала. Генерация 02" может происходить при нарушении переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий, которыми так богата средняя часть (шейка) сперматозоида. Однако в настоящее время все больше исследователей склоняется к тому, что одним из основных источников супероксиданион-радикала в сперматозоидах является НАДФН-оксидаза. Поскольку в недавних работах было продемонстрировано, что морфологически нормальные сперматозоиды не могут продуцировать 02" через НАДФН-оксидазу, то более вероятными источниками образования НАДФН, вызывающих продукцию АФК и повреждение ДНК в сперматозоидах, являются цитоплазматические капли (Said ТМ et al., 2005).

Долгое время исследователи не смогли идентифицировать и выделить НАДФН-оксидазу из человеческих сперматозоидов. Тем не менее, недавно было найдено, что генерация АФК зависит от изоформы каталитической субъединицы НАДФН-оксидазы (NOX5), относящейся к тому же семейству гликопротеинов, что и gh91-phox нейтрофилов (Banfi В. et al, 2001). Нельзя исключить, что NOX5 присутствует в семени благодаря заражению лейкоцитами. Однако в исследования Дж. Армстронга с соавт. (Armstrong JS. et al, 2002) было показано, что продукция супероксида через NOX5 в спермиях была ниже, чем образование АФК белых кровяными клетками в семени человека.

Генерация внутриклеточной НАДФН в спермиях является подтверждением того, что цитоплазма сперматозоида содержит окислительно-восстановительные ферменты, в том числе и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, что и было показано в работах А. Агарвала (Agarwal А., 2006).

Неферментативные антиоксиданты составляют первую линию защиты, клетки от повреждения АФК и на начальных этапах OG становятся главной мишенью для их атаки (Кулинский В.И;, Колесниченко Л.С., 1990; Кения MlB. и др., 1993). Перехват АФК приводит к окислению TSH и снижает его концентрацию в спермиях. В наших исследованиях показано; что при астено-, терато-, тератоастенозооспермии концентрация восстановленного глутатиона как в семенной плазме, так и в спермиях была достоверно ниже, чем в группе с нормальным сперматогенезом.

Обнаруженное снижение в спермиях содержания- FSH может быть связано'с тем, что на начальных этапах развития окислительного стресса ферментативная защита, в силу ряда причин, оказывается менее эффективной по сравнению с протекторным действием низкомолекулярных антиоксидантов (Кулинский В;И., Колесниченко Л.С., 1990). При этом TSIT, способный непосредственно перехватывать Ог и-"ОН, становится главной мишенью для атаки АФК. Помимо собственного защитного действия, с которым связан его усиленный расход, TSH принимает участие в ГПО- и FST- реакциях; а также в регенерации других компонентов АОС - а-токоферола и аскорбата, что дополнительно может снижать его? концентрацию в спермиях (Кулинский В.И, Колесниченко Л.С., 1990).

Поддержание необходимого клетке уровня FSH обеспечивается восстановлением FSSF системой «ГбФДГ-ГР». Активность Г6ФДГ в группах достоверно не различалась, активность ГР при астенозооспермии достоверно повышалась, а при терато- и тератоастенозооспермии можно было наблюдать тенденцию снижения активности по сравнению с нормой.

В ряде работ, в которых моделируется ситуация стресса, было показано' существенное снижение содержания восстановленного глутатиона у мужчищ находящихся в стрессовом состоянии (Eskiocak S. et al, 2005).

Первичные механизмы активации процессов свободнорадикального окисления в семенной плазме и спермиях при мужской инфертильности до настоящего времени окончательно не выяснены. Но большинство

95 исследователей считают, что пусковым фактором является нарушение микроциркуляции в органах мужского полового тракта. При нарушении микрогемодинамики происходит разобщение дыхательных цепей митохондрий и неполное восстановление в растворенном липидном матриксе мембран клеток кислорода, что приводит к образованию свободных радикалов и нарушению структуры клеточных мембран (Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., 2006).

Основные формы АФК исходно являются нормальными компонентами клеточного метаболизма и выполняют определенные биологические функции, так, для спермия это участие в реакциях капацитации и акросомальной реакции (deLamirande Е. et al, 1997; Conte G. et al, 1999). Согласно современным представлениям, АФК могут выполнять функции вторичных мессенджеров в процессах жизнедеятельности клеток, осуществляя регулирующую роль в процессах роста клеток, апоптозе, клеточной адгезии и др. (Осипов А.Н. и др., 1990; Дубинина Е.Е., 2001).

Процессы свободнорадикального окисления, протекающие в клетке, затрагивают все без исключения клеточные структуры и модифицируют работу многочисленных систем клеточного метаболизма. Наиболее активным процессом, идущим на поверхности клеточных мембран, является перекисное окисление липидов (Владимиров Ю.А., 1989). Биологическая значимость процессов ПОЛ проявляется в обновлении состава и поддержании свойств биомембран, регуляции их проницаемости, активности мембраносвязанных ферментов, участии в энергетических процессах, клеточном делении, синтезе биологически активных веществ. Инициация ПОЛ осуществляется путем взаимодействия АФК с полиненасыщенными жирными кислотами. Известно, что мембрана спермия богата ПНЖК с высоким числом ненасыщенных связей, таким образом, мембрана сперматозоида легко подвергается инициации липопероксидации (Storey ВТ. et al, 1998; Baumber J. et al, 2000).

Результатом повышенной генерации АФК является усиление

96 интенсивности липидной пероксидации, что проявляется накоплением ДК и МДА в сперматозоидах и семенной плазме, концентрация продуктов ПОЛ во всех группах мужчин с патоспермией превышает показатели в группе «нормозооспермия». Нарушение стационарного состояния ПОЛ, приводящее к накоплению ДК и МДА, обладающих мембранотоксическими эффектами, вероятно, снижает способность спермиев выполнять свои физиологические функции (Tavilani Н. et al, 2005).

В условиях ОС происходит увеличение интенсивности ПОЛ, что приводит к уменьшению количества жидких гидрофобных липидов в бислойных участках, вследствие этого увеличивается вязкость мембран, происходит увеличение отрицательного заряда на их поверхности, обусловленное появлением вторичных продуктов ПОЛ. Следствием этих изменений является нарушение барьерных свойств, проницаемости, гормон-рецепторных взаимодействий, трансдукция сигналов в клетку (Пескин А.В., 1998).

Изменение активности ферментов под влиянием АФК объясняют в основном локальными нарушениями в области активного центра. Эти нарушения могут быть связаны с окислительной модификацией аминокислотных остатков (серосодержащих аминокислот, гистидина), изменением валентности и нарушением координационной геометрии металлов для ряда металлзависимых ферментов. К. Дэвис и др. (Davies KJ. et al, 1987) убедительно показали, что любое влияние АФК на белки различного типа приводит к сложным окислительным модификациям в структуре белковой молекулы и изменениям ее физико-химических и биологических свойств.

Нарушение структурной организации клеточных мембран приводит к повышению уровня цитозольного Са2+ и неконтролируемому запуску каскада Са2+-зависимых реакций. Высокая концентрация Са2+ приводит к разобщению окислительного фосфорилирования, что сопровождается увеличением коферментов и субстратов в восстановленной форме и создает

97 условия для дополнительной генерации АФК (Halliwell В., Gutteridge М., 1984). В условиях ОС наблюдается истощение компонентов неферментативной АОС, которые при нейтрализации радикальных продуктов переходят в неактивное состояние или образуют радикальные продукты разной степени токсичности. Процесс восстановления антирадикальной способности этих соединений снижен (Davies KJ. et al, 1987).

В конечном итоге описанные выше изменения организации мембран сперматозоида под действием АФК могут привести к нарушению оплодотворяющей способности спермия in vivo. Можно заключить, что гиперпродукция АФК в семени может иметь отрицательный эффект на исход проведения вспомогательных репродуктивных технологий при попытке зачатия ребенка экстракорпоральным путем.

Изучение антиоксидантного статуса при астенозооспермии показало, что направленность изменений, в большинстве случаев, совпадала с изменениями показателей АОС при тератозооспермии и тератоастенозооспермии, при этом они являлись более выраженными, а общее состояние АОС при тератоастенозооспермии характеризовалось более глубокой депрессией ее защитных свойств, чем при других видах патоспермии.

Коэффициент редокс-баланса, рассчитанный как произведение в относительных единицах содержания МДА и ДК, отнесенное к произведению активностей СОД, каталазы и ГПО и в спермиях был максимален в группе «тератозооспермия», а в семенной плазме - в группе «тератоастенозооспермия». Следует отметить, в клетках, за исключением группы «тератоастенозооспермия», данный коэффициент имеет большее значение, чем в семенной плазме. Это может говорить о том, что семенная плазма у таких мужчин обладала большей антиоксидантной мощностью, чем семенная жидкость.

Проведенный корреляционный анализ показал, что в группах «астено-» и «тератозооспермия» отмечается более сложный по сравнению с нормозооспермией характер корреляций, образование ряда новых взаимодействий, не наблюдавшихся в группе здоровых людей. Однако количество корреляционных связей при тератоастенозооспермии значительно уменьшается по сравнению с другими группами мужчин. Тератоастенозооспермия — сочетанная форма нарушения сперматогенеза, при наложении двух патологий большое количество метаболических связей теряется.

Также корреляционный анализ показал, что в группе «астенозооспермия» с подвижностью спермиев, кроме содержания ДК и МДА, связана активность СОД, с процентом аномальных - активность ГПО. В группе «тератозооспермия» с подвижностью спермиев связаны содержание МДА и активность TST, с процентом аномальных - содержание восстановленного глутатиона. А при тератоастенозооспермии обнаружены взаимосвязи между количеством аномальных по морфологии спермиев и активностью СОД и Г6ФДГ.

В группе «астенозооспермия» найдены взаимосвязи: положительные между активностями СОД с TST семенной плазмы и активностями каталазы и Г6ФДГ спермиев, отрицательная - между активностью КТ с содержанием TSH спермиев. В группе «тератозооспермия» найдены взаимосвязи: положительная между содержанием МДА с активностью ГР спермиев, отрицательная - между активностями КТ и Г6ФДГ семенной плазмы. Кроме того, при тератоастенозооспермии обнаружены отрицательная связь между содержанием МДА и активностью КТ семенной плазмы и положительная -между содержанием МДА и активностью СОД спермиев.

Корреляционный анализ выявил, что в группах «астено-» и «тератозооспермия» имеются отрицательные взаимосвязи между содержанием продуктов ПОЛ и процентом подвижных спермиев. Это объясняется тем, что мембраны сперматозоидов богаты ПНЖК и поэтому

99 сильно подвержены процессам липопероксидации, в ходе которой нарушается целостность мембраны и повреждаются клеточные структуры, а также модифицируется работа систем клеточного метаболизма, вследствие чего снижается подвижность спермиев (Aitken RJ., 2000).

Итак, изучение состояния АОС и интенсивности ПОЛ при различных формах нарушения сперматогенеза по сравнению с нормозооспермией показало снижение функциональной активности АОС (кроме активности СОД во всех группах с нарушением сперматогенеза и активности ГР в группе «астенозооспермия», имеющих повышенную активность ферментов) на фоне активации перекисных процессов с нарастанием концентрации ДК и МДА в спермиях и семенной плазме. Возможным объяснением сбоя антиоксидантной защиты при патоспермии является редокс-дисбаланс вследствие генерации АФК аномальными сперматозоидами и лейкоцитами, присутствующими в семени.

В литературе имеются сведения о возможности с помощью антиоксидантов снижать интенсивность ПОЛ при мужском бесплодии, а также влиять на состояние клеточной мембраны путем изменения ее «жидкостных» характеристик.

Таким образом, причины, вызывающие интенсификацию свободнорадикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекулярном уровне носят однотипный характер. Общим для всех видов патоспермии является усиление процессов липопероксидации, снижение буферной емкости АОС, нарушение мобилизации ее в ответ на повышение активности прооксидантной системы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Быкова, Мария Валерьевна, Красноярск

1. Артюхов, В.Г. Олигомерные белки: структурно-функциональные модификации и роль субъединичных контактов/В .Г. Артюхов, О-В. Башарина, В.А. Вашанов.- Воронеж: изд-во ВГУ, 1997.-264 с.1

2. Арчаков, А.И. Модификация белков активным кислородом и их распад / А.И. Арчаков, И.М. Мохосеев // Биохимия. 1989. - Т.54.- №2. -С.179-185.

3. Барабой, В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов / В.А.Барабой // Успехи совр. биологии. 1991. - Т.111.-№6. -С.923-931.

4. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и биоантиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестник РАМН. 1998. - №7. - С.43-51.

5. Владимиров, Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя/ Ю.А. Владимиров // Биофизика. -1989.- 32.-№5. С.830-844.

6. Гусев, В.А. Современные концепции свободнорадикальной теории старения/В.А. Гусев, Л.Ф. Панченко//Нейрохимия.-1997.-Т.14.-№1.-С. 14-29.

7. Гуткин, Д.В. Глутатионпероксидаза в системе антиоксидантной защиты мембран / Д.В. Гуткин, Ю.А. Петрович // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1981. -№5. - С.76-78.

8. Дубинина, Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса / Е.Е. Дубинина // Вопр. мед. химии. 2001. - Т.47.- №6. - С.561 -581.

9. Дьяконов, Л.П. Методологические указания по криоконсервированию культур клеток животного происхождения в жидком азоте / Л.П. Дьяконов, А.А. Поздняков, Г.Е. Панков и др.- М., 1978.-9с.

10. Зенков, Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н.К. Зенков, Е.Б. Меныцикова // Успехи совр. биологии. 1993. - Т. 113.- № 3. - С.286-295.

11. Зенков, Н.К. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз / Н.К. Зенков, Е.Б. Меныцикова, Н.Н. Вольский // Успехи совр. биологии. -1999. Т.119. -№ 5. - С.440-446.

12. Зенков, Н.К. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика/Н.К. Зенков, Е.Б. Меныцикова, С.М. Шергин. Новосибирск, 1993.- 181 с.

13. Каган, В.Е. Проблема эндогенных продуктов перекисного окисления липидов / В.Е. Каган, О.Н. Орлова, Л.Л. Прилипко // Биофизика. Итоги науки и техники / ВИНИТИ АН СССР. М., 1986. - Т.18. - 136 с.

14. Калуев, А.В. К вопросу о регуляторной роли активных форм кислорода в клетке / А.В. Калуев // Биохимия. 1998. - №9. - С.86-89.

15. Кахновер, Н.Б. Глутатион-S- трансферазы ферменты детоксикации / Н.Б. Кахновер, Ю.В. Хмелевский // Укр. биохим. журнал. -1983.- Т.55.- №1. - С.86-92.

16. Кения, М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, Л.И. Лукаш, Е.И. Гуськов // Успехи совр. биологии. 1993. - Т.113. -№ 4. - С.456-470.

17. Кизиченко, Н.В. Защитный эффект адаптации к стрессу от повреждений, вызванных геморрагическим шоком: роль антиоксидантной системы/Н.В. Кизиченко, Ю.В. Архипенко//Бюл. эксп. биол. и мед.-1998.-Т. 126.-№9.-С.270.

18. Колесниченко, Л.С. Влияние направленного изменения концетрации глутатиона на температуру тела и толерантность к ишемиимозга/ JI.C. Колесниченко, В.И. Кулинский, Т.В. Сотникова. В.Ю. Ковтун// Биохимия. 2003. - Т. 68. -№ 5. - С. 656-663.

19. Королюк, М.А. Метод определения активности каталазы/М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова //Лабораторное дело.-1988.-№.1.-С.16-17.

20. Корякин, М. Мужское бесплодие: диагностика и лечение/ М. Корякин, А. Акопян //Пробл. репрод.-1995.-№4.-С.24-30.

21. Косовер, Н. Глутатион дисульфидная система / Н. Косовер, Э. Косовер // Свободные радикалы в биологии. - М.: Мир, 1979. - С.65-95.

22. Кулаков, В.И. Репродуктивное здоровье: проблемы, достижения, перспективы / В.И. Кулаков //Пробл. репрод.-1999.-№2.-С.6-10.

23. Кулинский, В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / В.И. Кулинский // Сорос, образов, журнал. 1999. -№1. - С.2-7.

24. Кулинский, В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И. Кулинский, Л.С. Колесниченко // Успехи совр. биологии. 1990. - Т. 110. -№ 1. - С.20-33.

25. Кулинский, В.И. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы / В.И. Кулинский, Л.С. Колесниченко // Успехи совр. биологии. 1993. - Т. 113.-№ 1. - С. 107-122.

26. Меньщикова, Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков // Биохимия.-2000.-Т.65.-№ 4.-С.485-503.

27. Меньщикова, Е.Б. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К.Зенков, И.А.Бондарь, Н.Ф.Круговых, В.А. Труфакин.-М.: Слово, 2006.-556с.

28. Мирошниченко, О.С. Биогенез, физиологическая роль и свойства каталазы/ О.С. Мирошниченко // Биомембраны и клетка. 1989. - №7. -С.32-41.

29. Осипов, А.Н. Активные формы кислорода их роль в организме / А.Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи биол. химии. 1990. -Т.31.-С. 180-208.

30. Пескин, А.В. О регуляторной роли активных форм кислорода / А.В. Пескин // Биохимия. 1998. - Т. 63. -№ 9. - С. 1307-1308.

31. Потапович, А.И. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств и цитопротекторной активности флавоноидов/ А.И. Потапович, В.А. Костюк// Биохимия. 2003. - Т. 68.-№ 5. - С. 632-638.

32. Савченко, А.А. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом / А.А. Савченко, J1.H. Сумцова // Лаб. дело.-1989.-№11.-С.23-25.

33. Саприн, А.Н. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развитии патологических процессов / А.Н. Саприн, Е.В. Калинина // Успехи биол. химии. 1999. - Т.39. - С.289-326.

34. Сирота, Т.В. Новый подход к исследованиям аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы / Т.В. Сирота // Вопр. мед. химии. 1999. - № 3. — С. 36-42.

35. Скулачев, В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П. Скулачев // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. 1999. — №1. -С. 12-18.

36. Слобожанина, Е.И. Структурная модификация мембран эритроцитов при окислительном стрессе и активность мембраносвязанной NADH-метгемоглобинредуктазы /Е.И. Слобожанина, Л.М. Лукьяненко, Н.М. Козлова// Биофизика. 2000. - Т.45. -№ 2.- С.288-292.

37. Чернов, Н.Н. Глутатионредуктаза / Н.Н. Чернов // Белки и пептиды. -М: Наука, 1995. Т. 1 - С.89-93.

38. Шакиров, Д.Ф. Состояние системы перекисного окисления липидов в организме экспериментальных животных после воздействия105циклических нуклеотидов/ Д.Ф. Шакиров, Д.А Еникеев// Патол. физиол. и эксперим. терапия. 2003. - № 1 . - С. 26-28.

39. Шатаева, J1.K. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы)/ J1.K. Шатаева, В.Х. Хавинсон, И.Ю. Ряднова. СПб.: Наука, 2003. -222с.

40. Aebi, Н. Heterogeneity of erythrocyte catalase. II. Isolation and characterization of normal and variant erythrocyte catalase and their subunits. / H. Aebi, S. Wyss .//Eur. J. Biochem. 1974. - Vol. 48.- №1. -P.137-145.

41. Agar, N.S. Erythrocyte catalase. A somatic oxidant defense? / N.S. Agar, S.M. Sadszadeh, P.E. Hallaway // J. Clin. Invest. 1986. - Vol. 77.- №1. -P.319-322.

42. Agarwal, A. Role of free radicals and antioxidants in reproduction. Review Article/ A. Agarwal, S. Gupta, S. Sikka// Curr. Opin. Obstet. Gynecol.-2006.-Vol. 18.-P.325-332.

43. Agarwal, A. The role of antioxidants in treatment of male infertility: an overview of the literature. Review Article/ A. Agarwal, KP. Nallella, SR. Allamaneni, TM. Said // Reprod. Biomed. Online.-2004.-№ 8.-P.616-627

44. Agarwal, A. What an andrologist/urologist should know about free radicals and why. Review Article/ A. Agarwal, SA. Prabakaran, and SSR. Allamaneni// Urology.-2006.-Vol. 67.-P.2-8

45. Agarwal, A. Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility/ A. Agarwal, RK. Sharma, KP. Nallella, AJ. Jr. Thomas et al.// Fertil. Steril.-2006.-Vol. 86.-P.878-885.

46. Aitken, RJ. The Amoroso Lecture. The human spermatozoa a cell in crisis?/ RJ. Aitken // J. Reprod. Fertil.- 1999.-Vol. 115.-P.1-7.

47. Aitken, RJ. Analysis of lipid peroxidation mechanisms in human spermatozoa / RJ. Aitken, D. Harkiss, DW. Buckingham // Mol. Reprod. Dev. -1993.-Vol.35.-P. 302-315.

48. Aitken, RJ. Free radicals, lipid peroxidation and sperm function/ RJ. Aitken //Reprod. Fertil. Dev. -1995.-№7.-P.659-668.

49. Aitken, RJ. Possible redox regulation of sperm motility activation/ RJ. Aitken //J. Androl.- 2000.-Vol. 21.-P. 491-496.

50. Aitken, RJ. Reactive oxygen species generation and human spermatozoa: the balance of benefit and risk/ RJ. Aitken, H. Fisher // Bioessays.-1994.-Vol. 16.-P.259-267.

51. Aitken, RJ. Redox regulation of tyrosine phosphorylation in human spermatozoa and its role in the control of human sperm function/ RJ. Aitken, M. Peterson, H. Fisher, DW. Buckingham and M. van Duin // J. Cell Sci.- 1995.-Vol.108.-P. 2017-2025.

52. Aitken, RJ. Superoxide dismutase in human sperm suspensions: relationship with cellular composition, oxidative stress, and sperm function/ RJ. Aitken, DW. Buckingham, A. Carreras and DS. Irvine //Free Radic. Biol. Med.-1996.-Vol. 21.-P. 495-504.

53. Alkan, I. Reactive oxygen species production by the spermatozoa of patients with idiopathic infertility: relationship to seminal plasma antioxidants/ I. Alkan, F. Simsek, G. Haklar et al.// J. Urol.- 1997.-Vol. 157.-P.140-143.

54. Alvarez, JG. Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa/ JG. Alvarez and ВТ. Storey //Mol. Reprod. Dev.- 1995.-Vol. 42.-P. 334-346.

55. Alvarez, JG. Increased DNA damage in sperm from leukocytospermic semen samples as determined by the sperm chromatin assay / JG. Alvarez, RK. Sharma, M. Ollero, RA. Saleh et al. // Fertil. Steril.- 2002.- Vol. 78.-P. 319-329.107

56. Alvarez, JG. Role of superoxide dismutase in protecting rabbit spermatozoa from 02 toxicity die to lipid peroxidation/ JG. Alvarez and ВТ. Storey // Biol. Reprod. -1983.-Vol. 28.-P. 1129-1136.

57. Alvarez, JG. Spontaneous lipid peroxidation in rabbit epididymal spermatozoa: its effects on sperm motility/ JG. Alvarez and ВТ. Storey // Biol. Reprod. -1982.-Vol. 27.-P.1102-1108.

58. Ames, B.N., Endogenous DNA damage is related to cancer and aging/ B.N. Ames// Mutat. Res. 1989. -Vol. 214. - P.41-46.

59. Armstrong, JS. A comparison of NADPH oxidase in human sperm and white blood cell / JS. Armstrong, TJ. Bivalacqua, W. Chamulitrat, SC. Sikka and WJ. Hellstrom // Int. J. Androl.-2002.-Vol.25.-P.223-229.

60. Arthur, JR. The glutathione peroxidases / JR. Arthur // Cell. Mol. Life Sci. -2000.-Vol. 57.-P. 1825-1835.

61. Baker, MA. The importance of redox regulated pathways in sperm cell biology / MA. Baker, RJ. Aitken // Mol. Cell. Endocrinol.- 2004.-Vol. 216.-P.47-. 54.

62. Banfi, B. A Ca(2+)-activated NADPH oxidase in testis, spleen, and lymph modes / B. Banfi, G. Molnar, A. Maturana, K. Steger et al. // J. Biol. Chem.-2001.-Vol. 276.-P. 37594-37601.

63. Beutler, E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods / E. Beutler. -Grune & Stration, Orlando, 1990.-P. 131-134.

64. Bhardwaj, A. Status of vitamin E and reduced glutathione in semen of oligozoospermic and azoospermic patients/ A. Bhardwaj, A. Verma, S. Majumdar, KL. Khanduja //Asian J. Androl.- 2000.-№ 2.-P. 225-8.

65. Binda, M.M. Reactive oxygen species and adhesion formation: Clinical implications in adhesion prevention/ M.M. Binda, C.R. Molinas, P.R. Koninckx// Hum. Reprod. 2003. - Vol. 18. - P. 2503 - 2507.

66. Carlberg, I. Glutathione reductase / I. Carlberg, B. Mannervik // Mol. Enzymol. 1985. - № 113. - P.484 - 490.

67. Casano, L.M. Inactivation and degradation of Cu, Zn-Superoxide Dismutase by active oxygen species in chloroplasts exposed to photooxidative stress/L.M. Casano, L.D. Gomes, H.R. Laskano//Plant and Cell Physiol.-1997.-Vol.38.-№4.-P.433-440.

68. Castellini, C. Effect of seminal plasma on the characteristics and fertility of rabbit spermatozoa/ C.Castellini, P.Lattaioli, M.Moroni, and A.Minelli //Anim. Reprod. Sci. -2000.-Vol. 63.-P.275-282.

69. Cayli, S. Cellular maturity and apoptosis in human sperm: creatine kinase, caspase-3 and Bcl-XL levels in mature and diminished maturity sperm / S.„ Cayli, D. Sakkas, L. Vigue, R. Demir, G. Huszar // Mol. Hum. Reprod.-2004.-Vol.l0.-P.365-372.

70. Chen, H. Protection of sperm DNA against oxidative stress in vivo by accessory sex gland secretions in male hamsters/ H.Chen, MP.Cheung, PH.Chow and et al. // Reprod. 2002.-Vol. 124.-P. 491-499.

71. Conclin, K.A. Dietary antioxidants during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects/K.A.Conclin//Nutrition & Cancer.-2000.-Vol.37.-18p.109

72. Conte, G. Reactive oxygen species in male infertility. Review of literature and personal observations/ G. Conte, D. Milardi, L. De Marinis, A. Mancini // Panminerva Med.- 1999.-Vol. 41.-P. 45-53.

73. Dandekar, SP. Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in male infertility / SP. Dandekar, CD. Nadkarni, VS. Kulkarni, S. Punelcar // J. Postgrad. Med. -2002.-Vol. 48.-№ 3.-P. 186-190.

74. Delrio, L.A. Metabolism of oxygen radicals in peroxisomes and cellular implications /Delrio, L. A., Sandalio L. A., Palma J. M. et al. // Free Radical Biology and Medicine. -1992.- Vol. 13. -P. 557—580.

75. Devies, К,J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects/ K.J. Devies// J. Biol. Chem.- 1987.- Vol.262.- Issue 20.- P.9895-9901.

76. Devies, K.J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino asids/ K.J. Devies, M.E. Delsignore, S.W. LinII J. Biol. Chem.- 1987.- Vol.262.- Issue 20.- P.9902-9907.

77. Diaconu, M. Failure of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase expression in oligoasthenozoospermia and mutations in the PHGPxgene/ M. Diaconu, Y. Tangat, D. Bohm, H. Kuhn // Andrologia.-2006.-Vol. 38.-№4.-P.152-157.

78. Drevet, J. The antioxidant glutathione peroxidase family and spermatozoa. A complex story/ J. Drevet // Mol. Cell. Endocrinol. -2006.-Vol. 250.-P. 70-79.

79. Drobnis, EZ. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes a demonstration using sperm as a model / EZ. Drobnis, LM Crowe, T. Berger, TJ. Anchordoguy et al // J. Exp. Zool. - 1993.-Vol. 265.-P.432-437.

80. Ebisch, IMW. Homocysteine, glutathione and related thiols affect fertility parameters in the (sub)fertile couple/ IMW. Ebisch, WHM. Peters, CMG. Thomas et al. // Hum. Reprod.- 2006.-Vol. 21.-№7.-P.1725-1733.

81. Ebisch, IMW. The importance of folate, zinc and antioxidants in the pathogenesis and prevention of subfertility / IMW. Ebisch, CMG.Thomas, WHM. Peters et al. // Hum. Reprod. Update. -2007.- Vol. 13.-№2.-P. 163-174.

82. Engel, S. Lipid peroxidation in human spermatozoa and maintenance of progressive sperm motility / S. Engel, A. Schreiner, R. Petzoldt // Andrologia. -1999.-Vol. 31.-P. 17-22.

83. Eskenazi, B. Antioxidant intake is associated with semen quality in healthy men / B. Eskenazi, SA. Kidd, AR. Marks et al // Hum. Reprod. -2005.-Vol.20.-№4.-P. 1006-1012.

84. Eskenazi, B. The association of age and semen quality in healthy men /B.Eskenazi, AS.Wyrobek, E. Sloter, SA. Kidds et al. //Hum. Reprod. -2003.-Vol. 18.-P. 447-454.

85. Eskiocak, S. Glutathione and free sulphydryl content of seminal plasma in medical students during and after exam stress / S. Eskiocak, AS. Gozen, SB. Yapar, F. Tavos et al. // Hum. Reprod.- 2005.-Vol. 20.-№9.-P. 2595-2600.

86. Fisher, HM. Comparative analysis of the ability of precursor germ cells and epididymal spermatozoa to generate reactive oxygen metabolities/ HM. Fisher, RJ. Aitken // J. Exp. Zool.- 1997.-Vol. 277.-P. 390-400.111

87. Folden, D.V. Malondialdegyde inhibits cardiac contractile function in ventricular myocytes via a p38 mitogen-activated protein kinase-dependent mechanism/ D.V. Folden, A. Gupta, A.C. Sharma// British J. Pharmacol. 2003. -Vol. 139.-P. 1310-1316.

88. Foresta, C. Male fertility is linked to the selenoprotein phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase / C. Foresta, L. Flohe, A. Garolla, A. Roveri, F. Ursini, M. Maiorino // Biol. Reprod.- 2002.-Vol. 67.-P. 967-71.

89. Fraga, CG. Smoking and low antioxidant levels increase oxidative damage to sperm DNA/ CG. Fraga, PA. Motchnik, AJ. Wyrobek et al II Mutat. Res.- 1996.-Vol. 352.-P. 199-203.

90. Fridovich, I. Superoxide radical and superoxide dismutases / I. Fridovich // Annu. Rev. Biochem. 1995. - № 64. - P.97-112.

91. Fujii, J. Cooperative function of antioxidant and redox systems against oxidative stress in male reproductive tissues/ J. Fujii, Y. Iuchi, S. Matsuki, T. Ishii // Asian J. Androl. -2003.-№ 5.-P.231-242.

92. Gadella, BM. Dynamics in the membrane organization of the mammalian sperm cell and functionality in fertilization/ BM. Gadella, FM. Flesch, LM. van Golde and B. Colenbrander // Vet. Q. -1999.-Vol. 21.-P. 142-146.

93. Garrido, N. Pro-oxidative and anti-oxidative imbalance in human semen and its relation with male fertility / N. Garrido, M. Meseguer, C. Simon et al. //Asian J. Androl.- 2004.-№ 6.-P. 59-65.

94. Gavella, M. Antioxidative effect of melatozin on human spermatozoa/ M.Gavella and V. Lipovac // Arch. Androl.- 2000.-Vol. 44.-P. 23-27.

95. Geller, B. L. Rat liver Cu-, Zn-superoxide dismutase. Subcellular location in lysosomes / B. L. Geller, D. R. Winge // J. Biol. Chem.- 1982.- Vol. 257.- P. 8945-8952.

96. Gerber, M. Tumor progression and oxidant-antioxidant status/ M. Gerber, C. Astre , C. Segala et al. // Cancer Lett. 1997. - Vol.114. - P.41-46.

97. Geva, E. The effect of antioxidant treatment on human spermatozoa and fertilization rate in an in vitro fertilization program / E. Geva, B. Bartoov, N. Zabludovsky, JB. Lessing et al. // Fertil. Steril.-1996.-Vol.66.-P.430-434.

98. Giannattasio, A. Glutathione peroxidase (GPx) activity in seminal plasma of healthy and infertility males / A. Giannattasio, M. De Rosa, R. Smeraglia, S. Zarrilli S. et al.//J. Endocrinol. Invest.-2002.-Vol. 25.-№ 11.-P. 983986.

99. Gil-Guzman, E. Differntial production of reactive oxygen species by subsets of human spermatozoa at different staged of maturation / E. Gil-Guzman, M. Ollero, MC. Lopez et al.//Hum. Reprod. -2001.-Vol. 16.-P. 1912-1921.

100. Gopalakrishnan, B. Studies on glutathione-S-transferases important for sperm function: evidence of catalytic activity-independent functions / B. Gopalakrishnan, S. Aravinda, CH. Pawshe, SM. Totey et al. // Biochem. J.- 1998.-Vol. 329.-P. 231-241.

101. Gopalakrishnan, В., Inhibition of sperm glutathione-S-transferase leads to functional impairment due to membrane damage / B. Gopalakrishnan, C. Shaha // FEBS Lett.- 1998.-Vol. 422.-P. 296-300.

102. Grankvist, K. CuZn-superoxide dismutase. Mn-superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase in pancreatic islets and other tissues in the mouse /К. Grankvist, S.L. Marklund, I.B. Taljedat // Biochcm. J. -1981. -Vol. 199.-P. 393—398.

103. Griveau, JF. Reactive oxygen species and human spermatozoa: physiology and pathology / JF.Griveau, D. leLannou // Int. J. Androl.- 1997.-Vol. 20.-P. 61-69.

104. Griveau, JF. An in vitro promoting role for hydrogen peroxide in human sperm capacitation/ JF. Griveau, P. Renard, and D. leLennou // Int. J. Androl.- 1994.-Vol. 17.-P.300-307.

105. Gutteridge, J.M. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future / J.M. Gutteridge, B. Halliwell // Ann. N.Y. Acad. Sci. -2000.-Vol. 899.-P.136-147. '

106. Habig, W.H. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation / W.H. Habig, M.J. Pabst, W.B. Jacoby // J. Biol. Chem. 1974. - V.249.-№22. - P.7130-7139.

107. Halliwell, B. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease / B. Halliwell, M. Gutteridge // Biochem. J. -1984. -Vol. 219.- P. 1— 14.

108. Halliwell, B. Oxidative stress: adaptation, damage, repair and death / B. Halliwell, M. Gutteridge.// Free radicals in biology and medicine. Oxford, University Press, 2003. P. 246-350.

109. Halliwell, B. Oxidative stress, nutrition and health. Experimental strategies for optimization of nutritional antioxidant intake in humans / B. Halliwell // Free Radic. Res. 1996. - Vol. 25. - P. 57-74.

110. Harrison, RA. CAMP-dependent protein kinase control of plasma membrane lipid architecture in boar sperm/ RA. Harrison and NG. Miller // Mol. Reprod. Dev.- 2000.-Vol. 55.-P. 220-228.

111. Harrison, RA. Capacitation mechanisms, and the role of capacitation as seen in eutherian mammals/ RA.Harrison // Reprod. Fertil. Dev.-1996.-Vol.8.-P. 581-594.

112. Hemachand, T. Sperm plasma-membrane-associated glutathione-S-transferases as gamete recognition molecules / T. Hemachand, B. Gopalakrishnan, D. Salunke et al. // J. Cell Sci. -2002.-Vol. 115.-P. 2053-2065.

113. Hemachand, T. Functional role of sperm surface glutathione-S-transferases and cellular glutathione in the haploid spermatozoa under oxidative stress / T. Hemachand, C. Shaha // FEBS Lett.- 2003.-Vol. 538.-P. 14-18.

114. Henkel, R. Urogenital inflammation: changes of leucocytes and reactive oxygen species(ROS) / R. Henkel, G. Maab, H. Hajimohammad et al. // Andrologia.- 2003.-Vol. 35.-P. 309-313.

115. Hsieh, YY. Superoxide dismutase activities of spermatozoa and seminal plasma are not correlated with male infertility / YY. Hsieh, YL. Sun, CC. Chang et al. // J. Clin. Lab. Anal.- 2002.-Vol. 16.-P. 127-131.

116. Huszar, G. Correlation between the rate of lipid peroxidation and cellular maturity as measured by creatine kinase activity in human spermatozoa / G. Huszar, L. Vigue // J. Androl.-1994.-Vol.l5.-P.71-77.

117. Ikeda, M. Role of radical oxygen species in rat testicular germ cell apoptosis induced by heat stress /М. Ikeda, H. Kodama, J. Fukuda, Y. Shimizu et al. //Biol. Reprod.- 1999.-Vol.61.-P. 393-399.

118. Imai, H. Failure of the expression of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase in the spermatozoa of human infertile males / H. Imai, K. Suzuki, K. Ishizaka, S. Ichinose et al. // Biol. Reprod.- 2001.-Vol. 64.-P. 674-683.

119. Irvine, DS. Glutathione as a treatment for male infertility / DS. Irvine //Rev. Reprod.- 1996.-№ l.-P. 6-12.

120. Jeulin, С. Catalase activity in human spermatozoa and seminal plasma / C. Jeulin, JC. Soufir, P. Weber, D. Lonal-Martin, R. Calvayrace // Gamete Res. -1998.-Vol. 24.-№2.-P. 186-196.

121. Jones, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermical properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma/ RJones, T. Mann, R. Sherins // Fertil. Steril.- 1979.-Vol. 31.-P.531-537.rt

122. Jozwik, M. Nonenzymatic antioxidant activity of human seminal plasma / M.Jozwik, M.Jozwik, W.Kuczynski, M.Szamatowicz // Fertil. Steril. -1997.-Vol. 68.-№l.-P. 154-157.

123. Kalab, P. Regulation of protein tyrosine phosphorylation in boar sperm through a cAMP-dependent pathway/ P.Kalab, J.Peknicova, G.Geussova and J. Moos // Mol. Reprod. Dev.- 1998.-Vol. 51.-P. 304-314.

124. Kantola, M. Selenium and glutathione peroxidase in seminal plasma of men and bulls/ M. Kantola, M. Saaranen and T. Vanha-Perttula // J. Reprod. Fertil.- 1988.- Vol. 83.-P. 785-794.

125. Kawakami, E. Superoxide dismutase and catalase activities in the seminal plasma of normozoospermic and asthenozoospermic beagles / E. Kawakami, A. Takemura, M. Sakuma et al. // J. Vet. Med. Sci. -2007.-Vol. 69.-№2.-P. 133-136.

126. Kayanoki, Y. The protective role of glutathione peroxidase in apoptosis induced by reactive oxygen species / Y. Kayanoki, J. Fujii, KN. Islam, K. Suzuki et al. //J. Biochem.- 1996.-Vol. 119.-P. 817-822.

127. Keele, В. B. Superoxide dismutase from Escherichia coli B; A new manganese-containing enzyme/ B.B. Keele, J. M. McCord, I.Fridovich // J. Biol. Chem. -1970. -Vol. 245.- P. 6176-6181.

128. Kepper, D. Export pumps for glutathione-S-conjugates/D. Kepper //Free Radic. Biol. & Med.-1999.-№27.-P.985-991.

129. Keskes-Ammar, L. Sperm oxidative stress and the effect of an oral vitamin E and selenium supplement on semen quality in infertile men / L. Keskes-Ammar, N. Feki-Chakroun, T. Rebai, Z. Sahnoun et al. // Arch. Androl.- 2003.-Vol. 49.-P. 83-94.

130. Kirkman, H. Mammalian catalase: a venerable enzyme with new mysteries / H. Kirkman, G. Gaetani // TRENDS in Biochem. Sci.- 2006.-Vol. 32.-№1.-P. 44-50.

131. Kirkman, H.N. Regulation of glucose-6-phosphate dehydrogenase in human erithrocytes / H.N. Kirkman, G.F. Gaetani // J.Biol. Chem. 1986. — Vol. 261.- №9. -P.4033 — 4038.

132. Kirkman, N. Catalase: a tetrameric enzyme with four tightly bound molecules of NADPH / N. Kirkman, G. Gaetani // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1984.-Vol. 81.-№ 14. P.4343-4347.

133. Ко, К. M. Ferric ion-induced lipid peroxidation in erythrocyte membranes: effects of phytic acid and butylated hydroxytoluene / K.M. Ко, D.V. Godin // Mol. Cell. Biochem. 1990. - Vol. 95.-№ 2. -P. 125-131.

134. Kobayashi, T. Protective role of superoxide dismutase in human seminal plasma and spermatozoa / T. Kobayashi, T. Miyazaki, A. Natari, S. Nozawa // Hum. Reprod.- 1991.-Vol. 6.-P. 987-991.

135. Kondala, R. Multiple glutathione-S-transferases isoforms are present on male sperm cell plasma membrane / R. Kondala, C. Shaha // FEBS Lett.- 2001.-Vol. 507.-P. 174-180.

136. Kondala, R. Role of glutathione-S-transferases in oxidative stress-induced male germ cell apoptosis / R. Kondala, C. Shaha // Free Radic. Biol. Med. -2000.-Vol. 29.-№10.-P. 1015-1027.

137. Kot, J. Oxidative stress during oxygen tolerance test/ J. Kot, Z. Sicko, M. Wozniak// Int. Marit. Health. 2003. - Vol. 54. - P. 117-126.

138. Lenzi, A. Polyunsaturated fatty acids of germ cell membranes, glutathione and glutathione-dependent enzyme-PHGPx: from basic to clinic / A. Lenzi, L. Gandini, F. Lombardo, M. Picardo et al. // Contraception.- 2002.-Vol. 65.-P. 301-304.

139. Lenzi, A. Fatty acid composition of spermatozoa and immature germ cell / A. Lenzi, L. Gandini, V. Maresca, R. Rago et al. // Mol. Hum. Reprod.-2000.-Vol.6.-P. 226-231.

140. Lenzi, A. Lipoperoxidation damage of spermatozoa polyunsaturated fatty acids (PUFA): scavenger mechanisms amd possible scavenger therapies / A. Lenzi, L. Gandini, M. Picardo, F. Tramer et al. // Front. Biosci.- 2000.- Vol. 5.-P. 1-15.

141. Lenzi, A. Glutathione treatment of dyspermia: effect on the lipoperoxidation process/ A. Lenzi, M. Picardo, L. Gandini, F. Lombardo, O. Terminali et al. // Hum. Reprod.- 1994,-Vol. 9.-P. 2044-2050.

142. Lewis, S. Comparison of individual antioxidants of sperm and seminal plasma in fertile and infertile men / S. Lewis, ES. Sterling, I. Young, W. Thompson//Fertil. Steril. -1997.-Vol. 67.-№l.-P. 142-147.

143. Lewis, SE. Total antioxidant capacity of seminal plasma is different in fertile and infertile men / SE.Lewis, PM.Boyle, KA. McKinney et al. // Fertil. Steril.- 1995.-Vol. 64.-P. 868-870.

144. Lopes, S. Reactive oxygen species: potential cause for DNA fragmentation in human spermatozoa / S. Lopes, A. Jurisicova, JG. Sun, RF. Casper//Hum. Reprod.- 1998.-Vol. 13.-№4.-P. 896-900.

145. Luconi, M. Pathophysiology of sperm motility / M. Luconi, G. Forti, E. Baldi // Front. Biosci.- 2006.-Vol. 1 l.-P. 1433-1447.

146. Maarten, F.C. Glutathione and glutathione-related enzymes in reproduction / F.C. Maarten, M. Knapen, L.M. ObradoPetra //Eur. J. Abstr. & Gynet. And Reprod. Biol.-1999.-№82.-P.171-184.

147. Maiorino, M. Genetic variations of gpx-4 and male infertility in human / M. Maiorino, V. Bosello, F. Ursini, C. Foresta et al.// Biol. Reprod. -2003.-Vol. 68.-№ 4.-P. 1134-1141.

148. Mann Т., Mann C. Male reproductive function and semen. 1981; Springer-Verlag, Berlin, 341 p.

149. Marklund, S. L. Human copper containing superoxide dismutase of high molecular weight/ S. L. Marklund // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982. -Vol. 79.- P. 7634—7638.

150. Marklund, S. L. Superoxide dismutase in extracellular fluids / S. L. Marklund, E. Holme, L. Hellner// Clin. Chim. Acta.- 1982.- Vol. 126.- P. 41—51.

151. McCord, I.M. The pathophysiology of superoxide role in inflammation and ischemia/I.M. McCord, R.S. Roy//Can. J. Physiol. Pharmacol.-1982.-Vol.60.-P. 1346-1352.

152. Montiel, EI. Glutathione-related enzymes in cell cultures from different regions of human epididymis / EI.Montiel, CC. Huidobro, EA. Castellon // Arch. Androl.- 2003.- Vol.49.-P. 95-105.

153. Moustafa, MH. Relationship between ROS production, apoptosis and DNA denaturation in spermatozoa from patients examined for infertility /МН. Moustafa, RK. Sharma, J. Thornton, E. Mascha et al.// Hum. Reprod.-2004.-Vol. 19.-P.129-138.

154. Mruk, DD.Antioxidant superoxide dismutase a review: its function, regulation in the testis, and role in male fertility / DD. Mruk, B. Silvestrini , MY. Mo, CY. Cheng //Contraception.- 2002.-Vol. 65.-P. 305-311.

155. Nakamura, H. Detection of oxidative stress in seminal plasma and fractionated sperm from subfertile male patients / H. Nakamura, T. Kimura, A.

156. Nakajima, К. Shimoya et al. // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.- 2002.-Vol. 105.-P. 155-160.

157. Nakamura, H. Redox regulation of cellular activation / H. Nakamura, K. Nakamura, J. Yodoi // Ann. Rev. Immunol.- 1997.-Vol. 15.-P. 351-369.

158. Nolan, JP. Regulation of membrane stability and the acrosome reaction in mammalian sperm / JP. Nolan, RH. Hammerstedt // FASEB J. -1997.-Vol. 11.-P. 670-682.

159. Obrador, E. Regulation of tumor cell sensitivity to TNF-induced oxidative stress and cytotoxity: role of glutathione/E. Obrador, J. Novarro, J. Mompo//Biofactors.-1998.-V.8.-P.23-27 .

160. Ochsendorf, FR. Glutathione in spermatozoa and seminal plasma of infertile men/ FR. Ochsendorf, R. Buhl, A. Bastlein, H. Beschmann // Hum. Reprod.- 1998.-Vol. 13.-P. 353-359.

161. O'Flaherty, C. Positive role of reactive oxygen species in mammalian sperm capacitation; triggering and modulation of phosphorylation events / C. O'Flaherty, E. deLamirande, C. Gagnon // Free Radic. Biol. Med.- 2006.-Vol. 41.-P. 528-540.

162. O'Flaherty, CM. Reactive oxygen species requirements for bovine sperm capacitation and acrosome reaction/ CM. O'Flaherty, NB. Beorlegui and MT. Beconi // Theriogenology.- 1999.-Vol. 52.-P. 289-301.

163. Paasch, U. Apoptosis signal transduction and the maturity status of human spermatozoa / U. Paasch, A. Agarwal, S. Gupta, RK. Sharma et al.// Ann. N.Y. Acad. Sci.-2003.-Vol. 1010.-P. 486-488.

164. Paglia, D.E. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase / D.E. Paglia, W.N. Valentine//J. Clin. Lab. Med. 1967. -№ 70. - P. 158-169.

165. Pasqualotto, FF. Oxidative stress in normospermic men undergoing infertility evaluation / FF. Pasqualotto, RK. Sharma, H. Kobayashi, DR. Nelson et al.// J. Androl.-2001.-Vol. 22.-P.316-322.

166. Pasqualotto, FF. Relationship between oxidative stress, semen characteristics, and clinical diagnosis in men undergoing fertility investigation / FF. Pasqualotto, RK. Sharma, DR. Nelson et al. // Fertil. Steril.-2000.-Vol. 73.-P.459-464.

167. Poveri, A. Phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase in sperm / A. Poveri, L. Flohe, M. Maiorino, F. Ursini // Meth. Enzymol.- 2002.-Vol. 347.-P. 208-212.

168. Puglisi, R. PHGPx in spermatogenesis: how many functions? / R. Puglisi, F. Tramer, C. Garlomagno, L. Gandini et al. // Contraception. -2005.-Vol. 72.-P. 291-293.

169. Rao, AV. Role of glutathione S-tranferases in oxidative stress-induced male germ cell apoptosis / AV. Rao, C. Shaha // Free Radic. Biol.- 2000.-Vol. 29.-P. 1015-1027.

170. Reddy, С. C. Selenium-dependent glutathione peroxidase: expression in selenium deficiency / С. C. Reddy, N. Q. Li., P. S. Reddy et al // Biological Oxidation systems. -1990. -Vol. 1. -P. 473—485.

171. Riley, JC. Oxygen radicals and reactive oxygen species in reproduction / JC. Riley and HR.Behrman // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1991.-Vol. 198.-P. 781-791

172. Rivlin, J. Role of hydrogen peroxidase in sperm capacitation and acrosome reaction/ J. Rivlin, J. Mendel, S. Rubinstein et al. // Biol. Reprod. -2004.-Vol. 70.-P. 518-522.

173. Said, TM. Human sperm superoxide anion generation and correlation with semen quality in patients with male infertility / TM. Said, A. Agarwal, RK. Sharma, E. Mascha et al. // Fertil. Steril.-2004.-Vol. 82.-P.871-877.

174. Said, TM. Impact of sperm morphology on DNA damage caused by oxidative stress induced by beta-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate / TM. Said, A.Agarwal, RK. Sharma, AJ. Thomas, SC. Sikka // Fertil. Steril.-2005.-Vol.83.-P.95-103.

175. Saleh, R.A. Oxidative stress and male infertility: from research bench to clinical practice. Review Article / R.A. Saleh and A. Agarwal // J. Androl.- 2002.-Vol.23.-P. 737-752.

176. Saleh, RA. Leukocytospermia is associated with increased reactive oxygen species production by human spermatozoa / RA. Saleh, A. Agarwal, E. Kandirali, RK. Sharma, AJ. Thomas //Fertil. Steril.-2002.-Vol.78.-P. 1215-1224.

177. Sanocka, D. Oxidative stress and male infertility / D. Sanocka, R. Miesel, P. Jedrejczak, MK. Kurpisz // J. Androl.- 1996.-Vol.l7.-№4.-P.449-454.

178. Shekarriz, M. Positive myeloperoxidase staining (Endtz Test) as an indicator of excessive reactive oxygen species formation in semen / M. Shekarriz, RK. Sharma, AJ. Jr. Thomas and A. Agarwal // J. Assist. Reprod. Genet.-1995.-Vol. 12.-P. 70-74.

179. Sheweita, S. Mechanism of male infertility: role of antioxidants / S. Sheweita, A. Tilmisany, H. Al-Sawof // Curr. Drug Metabol.- 2005.-Vol. 6.-P. 495-501.

180. Sikka, S. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function / S. Sikka// Curr. Med. Chem.- 2001.Vol. 8.-P.851-862.

181. Sikka, RK. Role of reactive oxygen species in male infertility / RK. Sikka, A. Agarwal // Urology.-1996.-Vol. 48.-P. 835-850.

182. Sikka, SC. Role of oxidative stress and antioxidants in male infertility/ SC. Sikka, M. Rajasekaran and WJ. Hellstrom // J. Androl.- 1995.-Vol. 16.-P. 464481.

183. Storey, ВТ. Biochemistry of the induction and prevention of lipoperoxidative damage in human spermatozoa / ВТ. Storey // Mol. Hum. Reprod.- 1997.-Vol. 13.-P. 203-214.

184. Storey, ВТ. Human sperm glutathione reductase activity in situ reveals limitation in the glutathione antioxidant defense system due to supply of NADPH / ВТ. Storey, JG. Alvarez and KA. Thompson // Mol. Reprod. Dev.-1998.-Vol.49.-P.400-407.

185. Tappet, A. L. Selcnium-glutathione peroxidase: properties and synthesis/ A. L. Tappet // Curr. Top. Cell. Regul.- 1984.- Vol- 24.- P. 87—97.

186. Tavilani, H. Malondialdehyde levels in sperm and seminal plasma of asthenozoospermic and its relationship with semen parameters / H. Tavilani, M. Doosti, H. Saeidi // Clinica Acta.- 2005.-Vol. 356.-P. 199-203.

187. Taylor, SL. Somatic cell apoptosis markers and pathways in human ejaculated sperm: potential utility as indicators of sperm quality / SL. Taylor, SL. Weng, P. Fox, EH. Duran et al. // Mol. Hum. Reprod.-2004.-Vol.10.-P. 825-834.

188. Therond, P. Alpha-Tocopherol in human spermatozoa and seminal plasma: relationship with motility, antioxidant enzymes and leukocytes/ P. Therond, J. Auger, A. Legrand and P. Jouannet // Mol. Hum. Reprod.- 1996.-Vol. 2.-P. 739-744.

189. Verma, A. Effect of vitamin E on human sperm motility and lipid peroxidation in vitro / A. Verma and КС. Kanwar //Asian J. Androl.- 1999.-Vol. l.-P. 151-154.

190. Verma, A. Human sperm motility and lipid peroxidation in different ascorbic acid concentrations: an in vitro analysis / A. Verma and КС. Kanwar // Andrologia.- 1998.-Vol. 30.-P. 325-329.

191. Vernet, P. Anioxidant strategies in the epidymidis / P. Vernet, RJ. Aitken, JR. Drevet//Mol. Cell. Endocrinol.- 2004.-Vol. 216.-P. 31-39.

192. Villegas, J. Reactive oxygen species induce reversible capacitation in human spermatozoa / J. Villegas, K. Kehr, L. Soto, R. Henkel et al. // Andrologia.-2003.-Vol. 35.-P. 227-232.

193. Whittington, K. Relative contribution of leukocytes and of spermatozoa to reactive oxygen species production in human sperm suspensions / K. Whittington, WCL. Ford // Int. J. Androl.- 1999.-Vol. 22.-P. 229-235.

194. Williams, A. Functional significance of the pentose phosphate pathway and glutathione reductase in the antioxidant defenses of human sperm / A. Williams, C. Ford //Biol. Reprod.- 2004,-Vol. 71.-P. 1309-1316.

195. Williams, A. Relationship between reactive oxygen species production and lipid peroxidation in human sperm suspensions and their association with sperm function/ A. Williams, C. Ford // Fertil. Steril.- 2005.-Vol. 83.-P. 929-936.

196. Wolgemuth, DJ. Genetic control of mitosis, meiosis and cellular differentiation during mammalian spermatogenesis / DJ. Wolgemuth, K. Rhee, S. Wu, SE. Ravnik // Fertil. Reprod. Dev.- 1995.-Vol. 7.-P. 669-683.

197. World Health Organization. Laboratory Manual For The Examination Of Human Semen And Sperm Cervis Mucus Interaction 1992 Cambridge, Univ Press -378p.

198. Yost, F. J. An iron-containing superoxide dismutase from Escherichia coli B/F. J. Yost, I. Fridovich // J. Biol. Chem.- 1973. -Vol. 248,- P. 4905-490

199. Zabludovsky, N. Relationship between human sperm lipid peroxidation, comprehensive quality parameters and IVF outcome / N. Zabludovsky, F. Eltes, E. Geva, E. Berkovitz et al. // Andrologia.-1999.-Vol. 31.-P. 91-98.

200. Zelko, IN. Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2) and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression / IN. Zelko, TJ. Mariani and RJ. Folz / Free Radic. Biol. Med.-2002.-Vol. 33.-P.337-349.

201. Zini, A. Reactive oxygen species in semen of infertile patients: levels of superoxide dismutase-like and catalase-like activities in seminal plasma and spermatozoa/ A. Zini, E. de Lamirande, C. Gagnon // Int. J. Androl.- 1993.-Vol. 16.-P. 183-188.

202. Zini, A. Catalase-like and superoxide dismutase-like activities in human seminal plasma / A. Zini, MA. Fisher, V. Мак, D. Phang, K. Jarvi // Urol. Res.- 2002.- Vol. 30.-P. 321-323.

203. Zini, A. Antioxidant activity in the semen of fertile and infertile men / A. Zini, K. Garrels, D. Phang // Urology.- 2000.- Vol. 55.-P. 922-926.

204. Zubkova, EV. Effect of glutathione depletion on antioxidant enzymes in the epididymis, seminal vesicles, and liver and on spermatozoa motility in the aging brown Norway rat/ EV. Zubkova, B. Robaire // Biol. Reprod. 2004.-Vol. 71.-P. 1002-1008.

Информация о работе

Быкова, Мария Валерьевна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Нарушение редокс-баланса в сперматозоидах и семенной плазмы мужчин при патоспермии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы