Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наночастицы гидрофобных природных соединений как адъюванты

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Наночастицы гидрофобных природных соединений как адъюванты"

На правах рукописи

005003988

Гаврилова Лариса Арсентьевна

НАНОЧАСТИЦЫ ГИДРОФОБНЫХ ПРИРОДНЫХ СОЕДИНЕНИИ КАК АДЪЮВАНТЫ

03.01.06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

- 8 ДЕК 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2011

005003988

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор кандидат химических наук, доцент

Ведущая организация:

Каплун Александр Петрович

Варламов Валерий Петрович Маслов Михаил Александрович

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится « ^2011 г. в ¿З^мин на

заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86). С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте уу\улу.топ.е.оу.гц

Автореферат разослан ноября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1

Актуальность проблемы

Разработка новых классов адыовантов является перспективным направлением современной иммунобиологии. За последние десятилетия произошли значительные изменения в технологии производства вакцинных препаратов. В результате многие вакцины, которые проходят в настоящее время клинические испытания, значительно отличаются от традиционных вакцин. Это касается, прежде всего, перехода от цельновирионных и субъединичных вакцин к рекомбинантным вакцинам на основе очищенных белков, что послужило причиной поиска новых адъювантов.

Адъюванты — это вещества, компоненты вакцин, усиливающие иммунный ответ. Воздействие адъювантов на иммунный ответ в основном обусловлено двумя их свойствами: способностью удерживать антиген в том месте, где он экспонируется лимфоцитам (эффект «депо») и способностью вызывать синтез цитокинов, регулирующих лимфоцитарные функции. Таким образом, адъюванты способны не только вызывать мощный иммунный ответ на различные антигены, но и эффективно управлять им, избирательно воздействуя на лимфоциты ТЫ (клеточный иммунный ответ), ТЬ2 (гуморальный иммунный ответ), цитотоксический Т-клеточный ответ, а также неспецифический иммунитет. Использование адъювантов позволяет уменьшить дозу антигена в вакцине, увеличить иммуногенность «слабых» антигенов, предотвращать конкуренцию антигенов в комбинированных вакцинах, увеличивать скорость развития и продолжительность иммунного ответа у привитых, индуцировать защитные свойства слизистых оболочек, а также увеличивать силу иммунного ответа у детей и лиц пожилого возраста.

Наночастицы (НЧ) в настоящее время рассматриваются как самые перспективные адъюванты. Одной из причин использования НЧ в качестве адъювантов является тот известный факт, что они эффективно поглощаются антигенпредставляющими клетками. Таким образом, если с НЧ связать антиген, то он будет направленно поглощаться макрофагами, что приведет к усилению иммунного ответа.

В настоящее время в качестве адъювантов исследуется целый ряд НЧ: липосомы, виросомы, ниосомы, иммуностимулирующие комплексы, эмульсии, полимерные наносферы, вирусоподобные частицы и др.

На кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова проводятся исследования сферических аморфных наночастиц (САНЧ) из смеси тритерпеноидов бересты (СТБ). В частности, было показано, что САНЧ могут быть использованы в качестве носителей для инкапсуляции гидрофобных лекарственных субстанций, таких как доксорубицин, силимарин, силибинин, метилфеофорбид

1 Список сокращений: ГСфД - глнкосфинголппиды, ДГК - дпгпдрокверцетнн, НЧ - наночастица, ПДК -предельно допустимая концентрация. САНЧ - сферические аморфные наночаепщы, СГТ - средняя

геометрическая титра, СТБ - смесь тритерпенопдов бересты лупанового ряда, ТГФ - тетрагидрофураи, яФХ -яичный фосфатпднлхолнн, I ПЬА§ - поверхностный антиген гепатита В.

3

(ВВ. Красилышкова, 2009). Также в САНЧ включали гидрофобную противотуберкулезную субстанцию рифабутин.

Эти САНЧ, с одной стороны, имеют размер (100-200 нм), характерный для большинства НЧ, исследуемых в качестве адъювантов, с другой стороны, обладают отрицательным зарядом (дзета-потенциал САНЧ -32 мВ). Заряженные НЧ представляют особый интерес, поскольку эффективность НЧ как адъювантов во многом определяется эффективностью связывания с белком-антигеном, а основными взаимодействиями, наряду с гидрофобными, являются электростатические. В связи с этим актуальным являлось исследовать адъювантные свойства САНЧ из СТБ.

Также были исследованы адъювантные свойства НЧ, полученных из дигидрокверцетина (ДГК) и гликосфинголипидов (ГСфЛ).

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-18-356 «Конструирование композитных суб.микронных частиц с улучшенной фармакокинетикой», а также в рамках госбюджетной темы 2Б-39-356, аналитической ведомственной программы Министерства образования науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы, 2009-2011 гг.» (проекты № 2.1.1/2715 и 2.1.1/9349) и гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-3468.2010.4).

Цель настоящего исследования

Получение наночастиц, обладающих адъювантными свойствами, на основе тритерпеноидов бересты, дигидрокверцетина и гликосфинголипидов.

Задачи исследования

1. Получение наночастиц из природных соединений.

1.1. Получение НЧ на основе тритерпеноидов бересты.

1.1.1. Влияние кофеата бетулина на формирование сферических аморфных наночастиц и их стабильность; стадии формирования САНЧ.

1.2. Получение НЧ на основе дигидрокверцетина.

1.3. Получение НЧ на основе гликосфинголипидов.

2. Исследование биологических свойств НЧ.

2.1. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови: клетками, белками и метаболитами.

2.2. Исследование адъювантных свойств НЧ.

2.2.1. Экспериментальные вакцины против гепатита В.

2.2.2. Экспериментальные вакцины против вируса гриппа.

2.3. Исследование токсичности НЧ in vitro.

3. Разработка и испытание экспериментальных установок для получения САНЧ.

3.1. Установки дчя получения САНЧ из СТБ.

3.2. Разработка методов контроля.

3.2.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях.

3.2.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ.

3.3. Подбор криопротектора для лиофилнзации САНЧ из СТБ.

Научная новтиа работы

Разработаны методы получеши НЧ на основе гликосфинголипидов и дишдрокверцетина. Продемонстрирована ключевая роль кофеата бетулина в стабилизации дисперсий САНЧ, определены стадии формирования таких НЧ. Получены данные о взаимодействии САНЧ из тритерпеноидов бересты с белками и клетками крови. Показано, что САНЧ в концентрациях до 55 мкг/мл практически не взаимодействуют с эритроцитами, но ассоциируются почти со 100% клеток иммунной системы (гранулоциты, лимфоциты, моноциты). Выявлены основные белки плазмы крови, которые адсорбируются на САНЧ: альбумин, ApoA-IV, АроЕ, IgG. Биологические испытания на сплит-вакцине вируса гриппа H5N1 и поверхностном антигене гепатита В (HBsAg) показали, что разработанные адъюванты на основе НЧ из СТБ гораздо эффективнее гидроксида алюминия, используемою в настоящее время. Исследована токсичность САНЧ на клеточных линиях HeLa и Jurkat, показано, что дисперсии САНЧ не токсичны вплоть до концентрации 512 мкг/мл; токсичность НЧ на основе ГСфЛ на порядок выше.

Практическая значимость работы

Разработанные методы получения НЧ могут быть использованы для других соединений.

Биологические испыташи выявили эффективные НЧ с точки зрения иммуногенности. Вакцины на основе расщепленного вируса гриппа птиц H5N1 А/Вьетнам/1194/2004 и рекомбинантного HBsAg с применением адъювантов на основе тритерпеноидов бересты проходят расширенные испытания на предприятиях «НПО «Микроген». Есть хорошие перспективы для расширения спектра антигенов на основе разработанных адъювантов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Методы получети НЧ на основе дигидрокверцетина, гликосфинголипидов и САНЧ, модифицированных олеиновой кислотой и мирамистином.

2. Влияние кофеата бетулина на формирование САНЧ и стабильность дисперсий. Выяснение стадий формировашн САНЧ.

3. Биологические свойства нанодисперсий.

3.1. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови: клетками, белками и метаболитами.

3.2. Результаты биологических испытаний экспериментальных вакцин на основе расщепленного вируса гриппа птиц H5N1 и рекомбинантного HBsAg с применением разработанных адъювантов на основе НЧ.

3.3. Результаты оценки токсичности САНЧ из тритерпеноидов бересты и НЧ из ГСфЛ и мирамистина на клеточных линиях HeLa и Jurkat.

4. Разработка и испытание экспериментальных установок для получения САНЧ; методы определения концентрации СТБ и ТГФ в дисперсиях САНЧ. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ из СТБ.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезиса докладов на международных конференциях, 1 патент и заявка на получение патента РФ.

Результаты диссертации были доложены и представлены на международных научных конференциях: 15-й Международной выставке «Химия 2009» (Москва, 28 сентября - 2 октября 2009), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта 2009), Международной научно-практической конференции «Биотехнология: Экология крупных городов» в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 15-17 марта 2010).

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на //^страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего

источников. Работа проиллюстрирована рисунками и содержит схем и

таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве гидрофобных природных соединений для получения НЧ нами были выбраны компоненты СТБ: бетулин (60±5%), лупеол (30±4%) и кофеат бетулина (9±3%) (рис. 1, А, Б, В). Дигидрокверцетин и мирамистин (рис. 1, Г, Д) в качестве объектов исследования были выбраны по данным ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, в котором проходили биологические испытания вакцин на основе разработанных адъювантов.

Для получения НЧ были использованы два подхода. В первом варианте исследовали САНЧ из тритерпеноидов бересты, которые получали осаждением из смешивающихся с водой растворителей. Для изменения заряда НЧ их модифицировали добавлением мирамистина и олеиновой кислоты. Метод, разработанный для получения САНЧ, был адаптирован для получения НЧ из природного полифенола дигидрокверцетина в присутствии фосфатидилхолина (яФХ).

Для получения НЧ с мирамистином был разработан универсальный метод получения заряженных НЧ, заключающийся в смешении в различных соотношениях амфифильных веществ с противоположными зарядами: положительно заряженного мирамистина и отрицательно заряженного цереброзид сульфата (рис. 1, Е), входящего в состав гликосфинголипидов (45-65% цереброзид, 14-17% цереброзид сульфат, 10-15% сфингомиелин, 10-15% триглицериды и фосфолипиды).

Рис. 1. Структурные формулы соединений, используемых для получения НЧ: тритерпеноиды бересты: бетулин (А) (Кр 1.02-109), лупеол (Б) (Кр 95.50-Ю9), кофеат бетулина (В) (Кр 83.18-Ю9): дигидрокверцетин (Г) (Кр 66.07); мирамистин (Д): цереброзид сульфат (Е).

Методы исследования

Размер частиц оценивали с помощью метода турбидиметрии и с помощью метода динамического светорассеяния2. Дзета-потенциал НЧ измеряли методом электрофоретического светорассеяния. Стабильность нанодисперсий оценивали по скорости осаждения №1 при центрифугировании. Морфологию НЧ определяли по электронным микрофотографиям*', полученным негативным контрастированием с 1% водным раствором уранилацетата. 1. Получение наночастиц из природных соединений 1.1. Получение наночастиц на основе тритерпеноидов бересты

Ранее нами был описан способ получения САНЧ из СТБ: быстрое прибавление 25-кратного избытка воды к раствору смеси СТБ в ТГФ с последующим удалением органического растворителя. Для создания САНЧ, модифицированных олеиновой кислотой или мирамистином. необходимо было подобрать наилучшее соотношение СТБ/'модификатор с точки зрения размера частиц и стабильности препарата. Были приготовлены и исследованы серии нанодисперсий СТБ с различным содержанием модификаторов: 0.025, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 и 2% (от массы СТБ) (рис. 2).

Измерения проводились в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и в Центре коллективного пользования МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

3 Электронные микрофотографии выполнены в ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН вед. н. сотр., д.б.н. В.И. Попенко

Рис. 2. Электронные микрофотографии дисперсий САНЧ из СТБ с мирамистином 0.1% (Б), олеиновой кислотой 0.1% (В) и контрольной дисперсии СТБ (А); масштабный отрезок 50 нм.

Было показано, что добавление к САНЧ 2% олеиновой кислоты увеличивает их отрицательный заряд на ~ 30%, а добавление 0.1% мирамистина не приводит к изменению заряда; увеличение доли мирамистина дестабилизирует дисперсии -образуются нестабильные дисперсии, очевидно, вследствие уменьшения плотности заряда.

1.1.1. Влияние кофеата бетулина на формирование САНЧ и их стабильность; стадии формирования САНЧ

В отличие от большинства НЧ, получение САНЧ из СТБ не требовало присутствия каких-либо детергентов. Мы предположили, что основную роль в стабилизации дисперсий играет кофеат бетулина.

Константа диссоциации кофеата бетулина рКа ~ 9, это значит, что при рН, близком к 9, не менее 50% фенольных гидроксилов будет ионизировано. Такие заряженные молекулы при формировании САНЧ должны вытесняться на поверхность частиц, придавая им отрицательный заряд. Этот поверхностный заряд в свою очередь должен препятствовать агрегации САНЧ.

Действительно, электронные микрофотографии показали, что только при рН 9 образуются НЧ сферической формы (рис. 3, Г), при рН 3, 5, 7 дисперсии нестабильны, наблюдается образование дисков различных размеров (рис. 3, А, Б, В).

Рис. 3. Электронные микрофотографии дисперсий САНЧ из СТБ при различных рН: 3 (А), 5 (Б), 7 (В), 9 (Г): масштабный отрезок 200 нм.

Для подтверждения определяющей роли кофеата бетулина в стабилизации нанодисперсий, а возможно, и в формировании САНЧ также исследовали дисперсии, полученные из выделенных компонентов СТБ - лупеола, бетулина и кофеата бетулина, а также из смеси этих компонентов в различных соотношениях. Из перечисленных веществ только кофеат бетулина образовывал САНЧ. Для смесей

веществ были найдены соотношения кофеат бетулина/лупеол и кофеат бетулина/бетулин (83:17 и 80:20 соответственно), при которых получались САНЧ. Увеличение доли кофеата бетулина в смесях приводило к образованию дисперсий с меньшим размером частиц (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость среднего диаметра САНЧ. полученных из смеси кофеат бетулина/лупеол, от доли кофеата бетулина.

Таким образом, было показано, что кофеат бетулина играет основную роль в стабилизации и формировании САНЧ, придавая им значительный отрицательный заряд, препятствующий их агрегации. Стадии формирования САНЧ

До сих пор было не ясно, как из кристаллических веществ (т.пл. бетулина 261°С, т.пл. лупеола 215-216°С), составляющих основу тритерпеноидов бересты, образуются аморфные НЧ с довольно узким распределением по размерам (100-200 нм). Для выяснения стадий формирования САНЧ были зафиксированы частицы, образующиеся в первый момент. Для этого было определено соотношение объемов воды и раствора тритерпеноидов бересты в ТГФ, при котором появляются первые частицы (рис. 5).

Соотношение 80да/ТГФ

Рис. 5. Зависимость оптической плотности (450 нм) раствора тритерпеноидов бересты от соотношения водаЛТФ.

Первые частицы образовывались при соотношении вода'ТГФ 0.77, на электронных микрофотографиях наблюдались сферические частицы размером около

9

400 нм (рис. б, А). Быстрое разбавление водой данной дисперсии в четыре раза приводило к появлению цепочек неразделенных сфер с размером частиц, характерным для САНЧ (100-200 нм) (рис. 6, Б). При разбавлении еще в четыре раза образовывались цепочки сфер того же размера, но уже отделенные друг от друга (рис. 6, В).

Рис. 6. Электронные микрофотографии частиц, образующихся при смешении воды и раствора СТБ в ТГФ в соотношении 0.77 (А), частиц, полученных при разбавлении водой в 4 (Б) и 16 раз (В); масштабный отрезок 400 нм.

Таким образом, нам удалось зафиксировать стадии образования САНЧ из СТБ.

При смешении двух жидкостей возникший градиент химических потенциалов вызывает массоперенос между фазами. При этом на границе раздела жидких фаз возникает процесс, описываемый как эффект Марангони. В каком-то смысле физические параметры образующихся НЧ представляют собой память о событиях в переходном слое на границе двух жидкостей, где происходил процесс их рождения. 1.2. Получение наночастиц на основе дигидрокверцетина

Дисперсии ДГК получали методом, аналогичным методу получения САНЧ из СТБ. Помимо ДГК для стабилизации НЧ в состав дисперсий включали фосфатидилхолин. Были получены две серии дисперсий с ДГК: без модификатора и с положительно заряженным амфифилом мирамистином. Дисперсии с размерами частиц 50-100 нм оказались стабильны (более месяца хранения).

Рис. 7. Электронная микрофотография дисперсии ДГК/яФХ (1:1) с мирамистином 2%; масштабный отрезок 100 нм.

1.3. Получение наночастиц на основе гликосфинголипидов

НЧ получали при смешении в различных соотношениях разнозаряженных амфифильных веществ: мирамистина и гликосфинголипидов.

На рис. 8 представлена зависимость оптической плотности дисперсий от соотношения ГСфЛ и мирамистина. В точке эквивалентности зарядов образуется

10

крайне нестабильная дисперсия: частицы быстро агрегируют и осаждаются. Четко выделяются две области концентрации мирамистина с минимальным рассеиванием: до 0.1 мг/мл и после 0.5 мг/мл. Поэтому для получения стабильных нанодисперсий смешивали амфифильные вещества с противоположными зарядами в следующих соотношениях мирамистин/ГСфЛ: <0.08 для получения отрицательно заряженных и >0.40 - положительно заряженных частиц.

Концентрация мирамистина, мг/мл

Рис. 8. Зависимость оптической плотности дисперсий, содержащих 1.25 мг/мл ГСфЛ и мирамистина, от концентрации последнего.

Были получены дисперсии из ГСфЛ и мирамистина с различным содержанием последнего (концентрация мирамистина: 0, 0.15, 0.2, 0.5 мг/мл, концентрация ГСфЛ -1.25 мг/мл) (ГМ). Как и ожидалось, с увеличением доли мирамистина, поверхностный заряд частиц менялся с отрицательного на положительный, а в зоне эквивалентности был близок к нулю (табл. 1). При концентрации мирамистина 0.5 мг/мл и без него дисперсии содержали основную фракцию частиц с размерами порядка 100-400 нм, 0.15 мг/мл - более 2 мкм, а при содержании мирамистина 0.2 мг/мл - на порядок больше.

Таблица 1. Дзета-потенциал частиц из ГСфЛ (1.25 мг/мл) и мирамистина.

Концентрация мирамистина, мг/мл 0 0.15 0.20 0.50

Дзета-потенциал, мВ -40.93 -25.12 -3.45 26.01

Также были получены дисперсии из ГСфЛ и мирамистина, в составе которых присутствовал третий компонент - ДГК. В этих дисперсиях из-за значительной доли мирамистина частицы заряжены положительно, основная масса частиц с повышенным содержанием ДГК (0.054 мг/мл) (ГМД250) имеет на порядок большие размеры (107 нм) по сравнению с дисперсией ГМД100 (содержание ДГК 0.024 мг/мл).

Изучение морфологии наиболее стабильной положительно заряженной дисперсии из ГСфЛ и мирамистина показало, что по форме частицы напоминают вогнутые диски (рис. 9).

%

Рис. 9. Электронная микрофотография дисперсии ГМ50 (ГСфЛ 1.25 мг/мл, мирамистин 0.50 мг/мл); масштабный отрезок 300 нм.

2. Исследование биологических свойств наночастиц

2.1. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови: клетками, белками и метаболитами

Взаимодействие с клетками и белками крови является одним из самых главных свойств как лекарственного препарата, так и адъюванта, определяющих их судьбу в организме.

Для исследования взаимодействия САНЧ из СТБ с клетками крови человека использовали проточную цитофлуориметрию; САНЧ вводили с гидрофобной флуоресцентной меткой - 3-метоксибензантроном. Результаты данного исследования показали, что наибольшая адсорбция САНЧ из СТБ наблюдается на клетках иммунной системы: гранулоцитах, лимфоцитах и моноцитах (рис. 10). С эритроцитами САНЧ практически не взаимодействуют (рис. 11). Обнаруженное взаимодействие НЧ с клетками иммунной системы может служить объяснением известных иммуномодуляторных свойств СТБ и давало серьезные основания ожидать, что САНЧ могут оказаться хорошими адъювантами.

Рис. 10. Результаты цитофлуориметрии клеток иммунной системы после 30 мин инкубации сыворотки с САНЧ. меченными 3-метоксибензантроном; по оси ординат - количество клеток, по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции: А - гранулоциты с САНЧ. Б - лимфоциты с САНЧ. В - моноциты с САНЧ. М1 - интервал значимой флуоресценции.

f

Концентрация САНЧ, мг/мл

Рис. 11. Зависимость количества клеток, содержащих САНЧ, меченные 3-метоксибензантроном. от концентрации САНЧ в дисперсии.

Распределение в организме и аккумулирование в органах и тканях лекарственной субстанции после внутривенного введения в значительной степени определяется взаимодействием частиц с белками плазмы. В зависимости от свойств поверхности частиц, на них будут преимущественно адсорбироваться определенные белки, что может привести к специфическому связыванию частицы с соответствующим рецептором клеточной поверхности.

Состав белков плазмы крови, адсорбирующихся на поверхности НЧ, исследовали с помощью двумерного гель-электрофореза4 (табл. 2). Для оценки состава белков, адсорбирующихся на САНЧ, было использовано программное обеспечение Image-Master 2D Platinum software. Основные фракции составили: альбумин, аполипопротеины (ApoA-IV, ApoJ, АроЕ), трансферрин, гаптоглобин, в небольших количествах присутствовали фибриноген, а также иммуноглобулин. Количественные характеристики пятен на гель-электрофорезе, соответствующих белкам плазмы крови, адсорбировавшихся на САНЧ, получали с помощью программ ImageJ (National Institutes of Health, США) и Phoretix 2D v. 6.01 software (Phoretix Intl., Durham, NC).

Таблица 2. Белки плазмы крови, адсорбированные на САНЧ, по результатам двумерного гель-электрофореза.

Белок Доля белка, % Белок Доля белка, %

Секреторный Ig (а-цепь) 6.8 Гаптоглобин (|3-цепь) 3.5

Трансферрин 13.4 Гаптоглобин (а+|3-цепи) 8.8

Атьбумии 16.8 Ig (легкая цепь) 16.7

Фибриноген (а-иепь) 7.5 ApoA-IV 4.8

Фибриноген (у-цепь) 4.9 ApoJ 6.2

IgG (тяжелая у-цепь) 6.9 АроЕ 3.6

4 Двумерный гель-электорофорез (2D-PAGE) выполнен И.А. Демнной, НИИ физико-химической медицины, ООО «PYNNY».

Гидрофобные наночастицы из СТБ могут быть использованы для другой важной роли - очищения крови от избытка гидрофобных токсичных метаболитов, среди которых не последнее место занимает билирубин.

Для определения количества билирубина в плазме крови использовали реакцию Ван ден Берга, основанную на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию билирубина в исследуемой пробе. Было установлено, что САНЧ в концентрации 0.835 мг/мл адсорбируют от 47 до 62% билирубина, при его содержании в крови, превышающем нормальное от 1.5 до 12 раз. Таким образом, САНЧ, возможно, могут выступать в качестве перспективных систем для очистки крови.

2.2. Исследование адъювантных свойств НЧ

2.2.1. Экспериментальные вакцины против гепатита В

Для исследования адъювантных свойств НЧ на основе ДГК беспородным мышам вводили внутримышечно HBsAg с различными адъювантами и определяли в сыворотках животных титр антител к HBsAg методом ИФА5 (рис. 12).

Анализ гуморального иммунного ответа у беспородных мышей показал, что дисперсия на основе ДГК в качестве адъюванта способствует выработке более высокого уровня гуморального иммунного ответа у мышей на введение вакцины гепатита В в дозе 10 мкг/мышь по сравнению со стандартным адъювантом, применяемым в вакцинных препаратах - гидроокисью алюминия.

140 -

1120 -ш

!юо -

я о.

I 80 -

то

5 60

е- 40 -

□ 1 неделя Ш 3 неделя

□ 6 неделя

¿1

Вакцина с адъювантными композициями на основе ДГК

Рис. 12. Иммуногенные свойства вакцины HBsAg с адъювантами на основе ДГК: 1 - дисперсия ДГК/'яФХ (1:1 моль/моль); 2 - дисперсия ДГК/яФХ (1:1 моль/моль) с 2% мирамистина; 3 - гидроокись алюминия: 4 - контроль: HBsAg.

Для исследования адъювантных свойств САНЧ с олеиновой кислотой морским свинкам двукратно подкожно с интервалом в 14 дней вводили HBsAg с различными

Испытания проводили в ФГУП «НПО «Мпкроген» МЗ РФ

14

адъювантами и определяли в сыворотках животных титр антител к HBsAg методом ИФА (табл. 3).

Таблица 3. Иммуногенные свойства вакцины гепатита В с адъювантами на основе САНЧ.

Количество препарата, введенного одному животному Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл

1-я прививка 2-я прививка

Контроль:! IBsAg (20 мкг HBsAg + 600 мкг А1(ОН),) 16.3 [5.6-47.21 718.7 [450.9-1145.5]

20 мкг HBsAg + 50 мкг САНЧ с олеиновой к-той (0.5% от СТБ) 16.4 [8.99-29.8] 1484.9* [809.7-2723.2]

20 мкг HBsAg + 500 мкг САНЧ с олеиновой к-той (0.5% от СТБ) 11.7 [5.2-26.3] 1500.3* [1057.96-2127.6]

♦различия средних величин существенные по сравнению с контролем.

Существенных различий в СГТ после первой прививки не наблюдалось. Однако, после второй прививки в случае адъюванта на основе САНЧ с олеиновой кислотой, наблюдали достоверно более высокий уровень антител (примерно в 2 раза выше) по сравнению с вакциной, адыовантом в которой являлся гидроксид алюминия. Причем, снижение концентрации разработанного адъюванта в 10 раз (с 500 до 50 мкг) не уменьшило иммуногенность вакцины. Таким образом, было показано, что адъювантные свойства САНЧ, модифицированных 0.5% олеиновой кислоты, проявляются в концентрациях значительно меньших, чем для гидроксида алюминия, обеспечивая высокий иммунный ответ. 2.2.2. Экспериментальные вакцины против вируса гриппа

В эксперименте были использованы инактивированныс вакцины, вводимые с адъювантами или без них, образцы живых вакцин на основе аттенуированных штаммов: вакцина против гриппа птиц на основе штамма H5N1 Nibrq-14 (А/Вьетнам/1194/2004) (обозначение Split); очищенный ннактивированный цельновирионный препарат из H5N1 реассортантного типа А/Вьетнам/1203/2004(H5N 1)-PR8/CDC-RG (TONI) (обозначение Vir); целыювирионная вакцина на основе штамма H1N1 А/Пуэрто-Рико/8/34 (обозначение PR8); а также две вакцины на основе живых вирусов: H5N2 реассортанта вирусов A/BbernaM/1203/2004(H5Nl)-PR8/CDC-RG (H5N1) и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57- (H2N2) (обозначение V-L) и вакцина на основе реассортанта человеческого H1N1 вируса А/Новая Каледония/20/99 с А/Ленинград/134/17/57 (обозначение NC).

Результаты испытаний различных типов вакцинных препаратов с различными адъювантами против высокопатогенного H5N1 штамма А/Курица/Курган/3/2005 представлены в табл. 4.

Таблица 4. Протективные и иммуногенные свойства инактивированных целыювирионных и расщепленных вакцин (содержание гемагглютинина - 2.5 мкг на животное).

Количество препарата, введенного одному животному Вирус Средний тигр антител к H5N1 вИФА % выживших мышей после заражения

Split H5N1 160 83.3

Split + 83 мкг САНЧ H5N1 640 93.3

Split+ 83 мкг А1(ОН)3 H5N1 160 86.7

Split + 83.3 мкг дисперсии ДГК/яФХ с мирамистином 2% H5N1 160 94.1

Split + 8.3 мкг дисперсии ДГК/яФХ с мирамистином 2% H5N1 160 60.0

Split + 83.3 мкг ГМД250 H5N1 160 41.2

Split+ 8.3 мкг ГМД250 H5N1 160 46.7

Split+ 83.3 мкг ГМД100 H5N1 160 46.7

Split + 8.3 мкг ГМД100 H5N1 160 50.0

8 мкг Vir H5N1 640 95.2

8 мкг PR8 H1N1 - 12.5

V-L H5N2 160 100.0

NC H1N1 - 93.8

Контроль: PBS (фосфатный буфер) - - 0

Контроль: PBS + САНЧ - - 25.0

Максимальный прирост антител и практически полную защиту от контрольного заражения высокопатогенным H5N1 вирусом А/Курица/Курган/3/2005 наблюдали в случае цельновирионной инактивированной H5N1 вакцины (Vir) и Split-вакцины с добавлением в качестве адъюванта САНЧ.

Таким образом, в отличие от гадроксида алюминия, композиции с которым сходны по протективной способности со Split-вакциной без адъюванта, адъюванты на основе САНЧ достоверно повышали как уровень антител, так и уровень защиты от контрольного заражения. 2.3. Исследование токсичности НЧ in vitro

Токсикологические исследования САНЧ из СТБ и НЧ на основе ГСфЛ с мирамистином проводили на суспензионной культуре клеток линии Jurkat (человек, Т-лимфобластная лейкемия) и адгезионной культуре клеток линии HeLa (человек, эпителиоидная карцинома шейки матки).

Для всесторонней оценки цитотоксичности НЧ использовали широкий набор тестов6: МТТ-тест, окрашивание трипановым синим, оценку цитотоксичности с использованием проточной цитометрии, выявление окислительного стресса, оценку

6 Токсикологические исследования проводились в НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН С.О. Мироновой, Т.И. Игнашковой и Б.Б. Шайбоновым.

гемолитической активности НЧ. Данные методики позволяли оценить либо выживаемость клеток (соотношение живых и мертвых), либо определить механизм токсического воздействия.

МТТ-тест показал, что дисперсии САНЧ не оказывает цитотоксического эффекта вплоть до концентрации СТБ 512 мкг/мл (рис. 13), в то время как дисперсии на основе ГСфЛ с мирамистином цитотоксичны при концентрациях выше 50 мкг/мл.

ню -

i

1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 Концентрация СТБ. мкг/мл

Рис. 13. Зависимость жизнеспособности клеток линии НеЬа от концентрации СТБ.

Учитывая концентрацию САНЧ, используемую в биологических испытаниях по определению адъювантной активности НЧ, для проведения дальнейших токсикологических исследований были выбраны две концентрации САНЧ -100 и 50 мкг/мл.

Для оценки цитотоксичности дисперсий САНЧ (100 и 50 мкг/мл) и НЧ на основе ГСфЛ и мирамистина (50, 25, 12.5 и 6.25 мкг/мл) методом окрашивания трипановым синим, измеряли количество окрашенных (мертвых) и неокрашенных (живых) красителем клеток Литка! после инкубации их с НЧ (рис. 14). Было показано, что САНЧ в концентрации 50 и 100 мкг/мл не оказывают существенного влияния на жизнеспособность клеток, тогда как НЧ на основе ГСфЛ и мирамистина проявляют цитотоксический эффект при концентрациях выше 50 мкг/мл.

Рис. 14. Зависимость жизнеспособности интакгных клеток (СопЦг) и клеток, к которым была добавлена дисперсия САНЧ в концентрации 50 мкг/мл и 100 мкг/мл. от времени инкубации.

Цитотоксичность НЧ с использованием проточной цитометрии оценивали, используя отдельно две флуоресцентные метки: пропидий йодид (Р1) и флуоресцеин диацетат (ГОА). Было показано, что САНЧ в концентрациях 50 и 100 мкг/мл не обладают цитотоксическим действием в отличие от НЧ на основе ГСфЛ и мирамистина, которые цитотоксцчны при концентрациях выше 50 мкг/мл (табл. 5).

Таблица 5. Жизнеспособность клеток 1игка1 после 24 ч инкубации.

Препарат Количество мертвых клеток, %

Окрашивание PI Окрашивание FDA

Контроль (интактные клетки) 4.27 2.05

САНЧ (50 мкг/мл) 4.19 2.17

САНЧ (100 мкг/мл) 5.32 2.37

Развитие окислительного стресса под действием НЧ определяли на клетках линии HeLa. Для детекции активных форм кислорода использовали дихлорфлуоресцеин диацетат и его производные. Для детекции количества клеток в качестве флуоресцентного красителя использовали краситель Hoechst 33342. Результаты эксперимента показали, что САНЧ вплоть до 100 мкг/мл и НЧ из ГСфЛ и мирамистина вплоть до 200 мкг/мл не приводят к повышенной генерации активных форм кислорода: значения для НЧ сравнимы с результатами для отрицательного контроля (интактные клетки) и гораздо меньше для положительного контроля (10 мМ Н202).

Для оценки гемолитической активности НЧ определяли их действие на эритроциты барана. Было показано, что дисперсии НЧ из ГСфЛ и мирамистина в концентрациях выше 12.5 мкг/мл обладают гемолитической активностью в отличие от САНЧ из СТБ, которые не приводят к лизису эритроцитов вплоть до концентрации 100 мкг/мл.

3. Разработка и испытание экспериментальных установок для получения САНЧ ЗЛ. Установки для получения САНЧ из СТБ

Положительные результаты биологических испытаний адъювантных свойств САНЧ из СТБ привели к необходимости масштабировать процесс их получения. Для этого необходимо было решить две проблемы: сделать первую стадию, т.е. процесс получения дисперсии САНЧ непрерывным (смешение избытка воды и раствора СТБ в ТГФ) и оптимизировать вторую стадию - концентрирование дисперсии (удаление ТГФ и большей части воды на вакуумном роторном испарителе).

Были разработаны варианты установок для непрерывного процесса получения дисперсии САНЧ с различной конструкцией элемента смешения водного раствора и раствора СТБ в ТГФ: дроссельный и смеситель закрытого типа с мешалкой. Эти установки позволяют ускорить процесс получения дисперсии САНЧ. Для непрерывного процесса возможна автоматизация.

Как возможную замену стадии упаривания при концентрировании дисперсии

рассматривали улырафильтрацию. Увеличив все загрузки в 100 раз (по разработанной нами методике (обозначение «стандартная») - 26 мл дисперсии подвергается упариванию на вакуумном роторном испарителе), с помощью перистальтического насоса дисперсию подавали в ультрафильтрационную ячейку, получая на выходе дисперсию САНЧ, концентрированную в 13 раз. Так была получена дисперсия САНЧ с размером частиц характерным для дисперсий, получаемых по «стандартной» методике (100-200 нм). Этот метод позволил уменьшить временные затраты по сравнению со «стандартной» методикой примерно в 10 раз.

Для расширенных биологических испытаний около 12 л дисиерсии САНЧ было получено другим методом, в котором вместо воды использовали уже готовую дисперсию САНЧ, повторяя циклы и концентрируя, таким образом, дисперсию в 2 раза. Этот метод позволяет получать дисперсии с большим содержанием действующего вещества, уменьшая расход воды, и, тем самым, снижая энергетические и временные затраты. 3.2. Разработка методов контроля

3.2.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях

Методики получения САНЧ, отличные от «стандартной», показали актуальность разработки простого метода определения концентрации СТБ в дисперсиях.

Разработанный метод основывался на том, что в состав СТБ входит кофеат бетулина, имеющий максимум поглощения в электронных спектрах при 320 нм. Таким образом, после построения калибровочной кривой для данной партии СТБ -зависимость поглощения при 320 нм от концентрации СТБ в смеси ТГФ/вода - можно легко определять концентрацию СТБ в любых дисперсиях. Необходимым условием для проведения анализа являлось полное растворение САНЧ, что достигалось добавлением к дисперсии десятикратного избытка ТГФ.

В качестве эталонного изучался гравиметрический метод. Концентрации дисперсий, определенные двумя этими методам, отличались не более чем на 3%. Но для последнего метода требовался в несколько раз больший объем дисперсии и на порядок больше времени.

3.2.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ

Методика получения САНЧ из СТБ, а также частиц ДТК включает стадию упаривания ТГФ и части воды на вакуумном роторном испарителе. ТГФ является слабо токсичным веществом (ЛД50=2.3 г/кг; ПДК=100 мг/м3). Тем не менее, необходимо контролировать его содержание в дисперсиях. В качестве метода определения концентрации растворителя был выбран метод ВЭЖХ. Регистрацию хроматографической информации и обработку результатов осуществляли с помощью программы «МультиХром для Windows» (Ampersand Ltd., Россия). Эксперимент состоял в следующем: ТГФ и вода смешивались в тех же соотношениях (1:25), что и для приготовления САНЧ. Этот раствор последовательно упаривали до следующих

19

объемов, мл: 25-18-12, отбирая каждый раз пробы по 1 мл, и анализировали их с помощью ВЭЖХ (колонка 4.6x120 мм исЬговогЬ 11Р-18, элюент метанол-вода 4:6 (объемные доли), скорость подачи элюента 0.70 мл/мин, объем вводимой пробы 20 мкл) (табл. 6).

Таблица 6. Концентрация ТГФ в образцах.

Объем дисперсии, мл Площадь сигнала на хроматограмме, отн. ед. Концентрация, %

25 20862.67 2.0

18 203.75 0.0195

12 3.22 0.00031

Было показано, что при упаривании в два раза концентрация ТГФ составляет 0.00031%. Это значит, что при введении 1 мл дисперсии в организме массой 70 кг окажется 3 мкг ТГФ, что почти в 52 млн. раз меньше ЛДЯ>. 3.3. Подбор криопротектора для лиофилизацип САНЧ из СТБ

Подготовка образцов для биологических испытаний включала стадию лиофилизации. Как правило, лиофильно высушенный продукт лучше хранится, в отсутствие воды не размножаются микроорганизмы.

В качестве криопротектора мы использовали наиболее доступный углевод -сахарозу, которую добавляли в количестве, необходимом для получения при регидратации лиофилизированного адъюванта изотонического или менее концентрированного раствора криопротектора. Были проверены и другие кандидаты в качестве криопротекторов: маннит, мальтоза, трегалоза, манноза, сорбит. Лиофилизированные с каждым из углеводов образцы регидратировали и сравнивали морфологию и размер полученных частиц с дисперсией САНЧ до лиофилизации (контроль).

Было показано, что все регидратированные образцы САНЧ подобно контрольной дисперсии состоят из сферических частиц, кристаллических включений не наблюдалось. Размеры частиц исследуемых образцов сопоставимы с контрольной дисперсией (табл. 7), наилучшие результаты показали образцы, содержащие в качестве криопротектора: сахарозу > манит > мапнозу > трегалозу > сорбит > мальтозу.

Таблица 7. Размер частиц САНЧ после регидратации с различными криопротекторами.

Криопротектор Распределение НЧ по размеру, нм

Маннит 236.1 (98%) и 72.4 (2%)

Мальтоза 109.6 (85%) и 1612 (15%)

Трегалоза 105.6 (98%) и 1131.8(2%)

Сахароза 102.2 (100%)

Манноза 101.1 (97%) и 649.1 (3%)

Сорбит 95.4 (88%) и 1523(12%)

САНЧ 96.6 (100%)

Таким образом, в качестве криопротектора при лиофшшзацин нанодисперсий САНЧ использовали самый дешевый криопротектор - сахарозу.

ВЫВОДЫ

1. Получены и охарактеризованы наночастицы, несущие либо положительный, либо отрицательный заряд, на основе тритерпенондов бересты, дигидрокверцетина и глнкосфинголипидов с размером частиц 100-400 им. Разработаны методы получения двух последних типов наночастиц.

2. Было показано, что основную роль в стабилизации САНЧ играет кофеат бетулина, придавая им значительный отрицательный заряд, препятствующий нх агрегации (дзета-потенциал САНЧ -32 мВ). При рН>9 образуются сферические частицы, понижение рН приводит к образованию частиц, отличных от сферических, и нестабильных дисперсий. Образование САНЧ происходит путем последовательного формирования двух структур: сфер размером около 400 нм и цепочек с характерным для САНЧ размером 100 нм.

3. САНЧ при концентрации 55 мкг/мл в сыворотке практически не взаимодействуют с эритроцитами, но ассоциируются почти со 100% клеток иммунной системы (гранулоцитами, лимфоцитами и моноцитами). Наиболее выраженное взаимодействие САНЧ наблюдается с фагоцитирующими клетками (гранулоцитами и моноцитами). Выявлены основные белки плазмы крови, которые адсорбируются на САНЧ: альбумин, АроА-1У, АроЕ, Состав адсорбирующихся белков должен способствовать увеличению циркуляции частиц в крови (альбумин) и нацеливанию их в мозг (АроА-1У, АроЕ, Аро.1). Было показано, что САНЧ в концентрации 0.835 мг/мл адсорбируют от 47 до 62% билирубина при его содержании в плазме крови, превышающем норму от 1.5 до 12 раз.

4. Было установлено, что подобранные композиции на основе тритерпенондов бересты, дигидрокверцетина и глнкосфинголипидов обладают выраженными адъювантными свойствами. Экспериментальные вакцины на основе расщепленного вируса гриппа птиц Н5Ш А/Вьетнам/1194/2004 и рекомбинантного ПВхАс с применением САНЧ из тритерпенондов бересты в качестве адъювантов показали наилучшие результаты. По иммуногенности они превосходили аналогичные вакцины с гадроксидом алюминия.

5. Было показано, что САНЧ из СТБ не оказывают цитотоксического эффекта на клетки НсЬа и Лика! вплоть до концентрации СТБ 512 мкг/мл, в то время как дисперсии глнкосфинголипидов с мирамистином цитотоксичны при концентрациях выше 50 мкг/мл.

6. Было разработано несколько вариантов установок для непрерывного процесса получения дисперсии САНЧ. Замена стадии упаривания ультрафильтрацией существенно ускоряет процесс концентрирования дисперсии САНЧ.

7. Были разработаны: метод определения концентрации САНЧ тритерпенондов бересты, основанный на измерении концентрации кофеата бетулина, и метод

21

определения концентрации ТГФ с помощью ВЭЖХ; показано, что в конечных дисперсиях САНЧ содержание ТГФ в миллионы раз меньше ЛД50. Подобран криопротектор (сахароза) для лиофилизации САНЧ.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Каплун А.П., Пахарькова H.H., Поручикова (Гаврилова) Л.А., Безруков Д.А., Попенко В.И., Швец В.И. Сферические аморфные наночастицы, загруженные противотуберкулезной субстанцией рифабутином. // Вестник МИТХТ. - 2010. - Т. 5. -№ 2. - С. 73-75.

2. Поручикова (Гаврилова) Л.А., Лыу Т.Н., Безруков Д.А., Каплун А.П. Взаимодействие сферических аморфных наночастиц из тритерпеноидов бересты с билирубином. // Вестник МИТХТ. - 2010. - Т. 5. - № 3. - С. 77-78.

3. Цалман А. Я., Безруков Д.А., Каплун А.П., Поручикова (Гаврилова) Л.А., Швец В.И. Способ выделения смеси для получения водных дисперсий сферических наночастиц. // Патент РФ № 2424516; G01N 33/15, В82В 1/00; опубл. 20.07.2011.

4. Лыу Т.Н., Быкова Н.В., Безруков Д.А., Каплун А.П., Поручикова (Гаврилова) Л.А., Швец В.И. Способ получения водных дисперсий сферических наночастиц из тритерпеноидов коры березы. // Заявка на патент № 2010119612. Приоритет 18.05.2010.

5. Поручикова (Гаврилова) Л.А., Бастрич А.Н., Лыу Т.Н., Безруков Д.А., Каплун А.П., Попенко В.И. Оптимизация получения сферических аморфных наночастиц из лупановых тритерпеноидов бересты. // Материалы Пятого московского международного конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития». -Москва, 16-20 марта, 2009. -Ч. 1. - С. 481-482.

6. Поручикова (Гаврилова) Л.А., Каплун А.П., Швец В.И. Сферические аморфные наночастицы на основе лупановых тритерпеноидов бересты как адъюванты. // Конкурс проектов молодых ученых: Тезисы докладов. 29 сентября 2009 г. - М.: ЦБК «Экспоцентр». - С. 25-26.

7. Поручикова (Гаврилова) Л.А., Каплун А.П., Швец В.И. Сферические аморфные наночастицы на основе лупановых тритерпеноидов бересты как адъюванты. // Ресурсо- и энергосберегающие технологии в химической и нефтехимической промышленности, I Международная конференция РХО им. Д.И. Менделеева: Сб. тезисов докладов - М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева 2009. - С. 157.

8. Поручикова (Гаврилова) Л.А., Логинов A.A., Безруков Д.А., Каплун А.П., Попенко В.И. Исследование механизма формирования сферических аморфных наночастиц из лупановых тритерпеноидов бересты. // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». - Москва, 15-17 марта, 2010- С. 488-489.

Подписано в печать 24.11.11 Заказ № 33 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. ООО «Генезис» 119571, г. Москва, пр-т Вернадского,86 (495) 936-88-35 (495) 434-83-55

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Гаврилова, Лариса Арсентьевна

1. Список сокращений.

2. Введение.

3. Обзор литературы. Наночастицы как адъюванты.

3.1. Введение. Классификация адъювантов по механизму их действия.

3.2. Эмульсии.

3.2.1. Коммерческие адъювантные препараты на основе эмульсий.

3.2.1.1. Адъюванты на основе эмульсий «вода в масле».

3.2.1.2. Адъюванты на основе эмульсий «масло в воде».

3.3. Липосомы и виросомы.

3.4. Сапонины и ИСКОМы.

3.5. Полимерные наночастицы.

3.6. Неорганические наночастицы.

3.7. Влияние размеров частиц адъювантов на свойства вакцин.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Гаврилова, Лариса Арсентьевна

6. Выводы

1. Получены и охарактеризованы наночастицы, несущие либо положительный, либо отрицательный заряд, на основе тритерпеноидов бересты, дигидрокверцетина и гликосфинголипидов с размером частиц 100-400 нм. Разработаны методы получения двух последних типов наночастиц.

2. Было показано, что основную роль в стабилизации САНЧ играет кофеат бетулина, придавая им значительный отрицательный заряд, препятствующий их агрегации (дзета-потенциал САНЧ -32 мВ). При рН>9 образуются сферические частицы, понижение рН приводит к образованию частиц, отличных от сферических, и нестабильных дисперсий. Образование САНЧ происходит путем последовательного формирования двух структур: сфер размером около 400 нм и цепочек с характерным для САНЧ размером 100 нм.

3. САНЧ при концентрации. 55 мкг/мл в сыворотке практически не взаимодействуют с эритроцитами, но ассоциируются почти со 100% клеток иммунной системы (грануло'цитами, лимфоцитами и моноцитами). Наиболее выраженное взаимодействие САНЧ наблюдается с фагоцитирующими клетками (гранулоцитами и моноцитами). Выявлены основные белки плазмы крови, которые' адсорбируются на САНЧ: альбумин, АроА-1У, АроЕ, Состав адсорбирующихся белков должен способствовать увеличению циркуляции частиц в крови- (альбумин) и нацеливанию их в мозг (АроА-1У, АроЕ, АроХ). Было показано, что САНЧ в концентрации 0.835 мг/мл адсорбируют от 47 до 62% билирубина при его содержании в плазме крови, превышающем норму от 1.5 до 12 раз.

4. Было установлено, что подобранные композиции на основе тритерпеноидов1 бересты, дигидрокверцетина и гликосфинголипидов обладают выраженными адъювантными свойствами. Экспериментальные вакцины на основе расщепленного вируса гриппа птиц Н5Ы1 А/Вьетнам/1194/2004 и рекомбинантного НВэА§ с применением САНЧ из тритерпеноидов бересты в качестве адъювантов показали наилучшие результаты. По иммуногенности они превосходили аналогичные вакцины с гидроксидом алюминия.

5. Было показано, что САНЧ из СТБ не оказывают цитотоксического эффекта на клетки НеЬа и 1игка1 вплоть до концентрации СТБ-512 мкг/мл, в то время как дисперсии < « гликосфинголипидов с мирамистином цитотоксичны при концентрациях выше 50 мкг/мл.

6. Было разработано несколько вариантов установок для непрерывного процесса получения дисперсии САНЧ. Замена стадии упаривания ультрафильтрацией существенно ускоряет процесс концентрирования дисперсии САНЧ.

7. Были разработаны: метод определения концентрации САНЧ тритерпеноидов бересты, основанный на измерении концентрации кофеата бетулина, и метод определения концентрации ТГФ с помощью ВЭЖХ; показано, что в конечных дисперсиях САНЧ содержание ТГФ в миллионы раз меньше ЛД50. Подобран криопротектор (сахароза) для лиофилизации САНЧ.

7. Благодарности

Выражаю благодарность:

• фирме «Биолек» за любезно предоставленные липиды;

• д.б.н. В.И. Попенко, ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН за электронную микрофотосъемку;

• K.X.H. C.B. Еремину за помощь в проведении ВЭЖХ;

• О.Г. Роговой, РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН за внимание и помощь в проведении измерений распределения частиц по размерам на автокорреляционном спектрофотометре «Наносайзер»;

• О.С. Харченко, ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ за лиофилизацию нанодисперсий;

• A.C. Гамбарян, ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН за внимание и помощь в проведении биологических испытаний адъювантов;

• С.О. Мироновой, вед. инж. Т.И. Игнашковой, Б.Б. Шайбонову НИИ ОПП РАМН за проведение исследований токсичности НЧ in vitro;

• Т.Н. Лыу за помощь в проведении исследований по взаимодействию САНЧ с клетками и белками крови;

• к.б.н. М.И. Лукашиной, РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН за помощь в проведении экспериментов на проточном цитофлуориметре;

• А.М. Бичучер, ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского за забор крови и выделение плазмы;

• И.А. Деминой, НИИ физико-химической медицины, сотруднице ООО «PYNNY» за проведение двумерного гель-электрофореза белков плазмы крови;

• И.А. Тинькову, сотруднику ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН за возможность использования ультрацентрифуги;

• проф., д.х.н. А.П. Каплуну, студентам кафедры биотехнологии и биотехнологии: за то, что сдали кровь для экспериментов;

• также благодарю весь коллектив кафедры биотехнологии и биотехнологии за оказанную помощь и поддержку, особенно О.В. Есипову, Д.А. Безрукова;

• отдельное спасибо моей семье за понимание, помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Гаврилова, Лариса Арсентьевна, Москва

1. A. Pashine, J.B. Ulmer, N.M. Valiante // Innate immune mechanisms and the identification of immune potentiators as vaccine adjuvants // Immunopotentiators in modem vaccines. 2006. P. 57-72.

2. S.A. Plotkin // Vaccines: the Fourth Century // Clin. Vaccine Immunol. 2009. V. 16 (12). P.1709-1719.

3. R. Rappuoli, C.W. Mandl, S. Black, E. De Gregorio // Vaccines for the twenty-first century society //Nat. Rev. Immunol. 2011. V. 11 (12). P. 865-872.

4. B.B. Красильникова // Алгоритм выбора наночастиц как носителей лекарственных субстанций // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. МИТХТ им. М.В. Ломоносова. Москва. 2009.

5. V.E.J.C Schijns // Immunological concepts of vaccine adjuvant activity // Curr. Opin. Immunol. 2000. V. 12 (4). P. 456-463.

6. V.E.J.C. Schijns // Mechanisms of vaccine adjuvant activity: initiation and regulation of immune responses by vaccine adjuvants // Vaccine. 2003. V. 21. P. 829-831.

7. R. Brunner, E. Jensen-Jarolim, I. Pali-Scholl // The ABC of clinical and experimental adjuvants -a brief overview // Immunol. Lett. 2010. V. 128 (1). P. 29-35.

8. K. Kawakami, T. Yoshikawa, Y. Moroto, E. Kanaoka, K. Takahashi, Y. Nishihara, K. Masuda // Microemulsion formulation for enhanced absorption of poorly soluble drugs. I. Prescription design. // J. Cont. Release. 2002. V.81. P. 65-74.

9. A.C. Allison // Squalene and squalane emulsions as adjuvants // Methods 1999. V. 19. P. 87-93.

10. A. Roux, A. Marx, O. Burkhardt, B. Schweiger, A. Borkowski, A. Banzhoff, M.W.R. Pletz, H. Lode // Impact of corticosteroids on the immune response to a MF59-adjuvanted influenza vaccine in elderly COPD-patients // Vaccine. 2006. V. 24. P. 1537-1542.

11. A. Podda // The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants: experience with the MF59-adjuvanted vaccine // Vaccine. 2001. V. 19. P. 2673-2680.

12. A. Podda, G. Del Giudice, D.T. O'Hagan // MF59: a safe and potent adjuvant for human use // Immunopotentiators in Modem Vaccines. 2006. P. 149-159.

13. I. Azuma // Synthetic immunoadjuvants: application to non-specific host stimulation and potentiation of vaccine immunogenicity // Vaccine. 1992. V. 10. P. 1000-1006.

14. A.C. Allison, N.E. Byars // Immunological adjuvants: desirable properties and side-effects // Mol. Immunol. 1991. V. 28. P. 279-284.

15. H.S. Warren, F.R. Vogel, L.A. Chedid // Current status of immunological adjuvants // Ann. Rev. Immunol. 1986. V. 4. P. 369-388.

16. H.F. Stills // Adjuvants and antibody production: dispelling the myths associated with Freund's complete and other adjuvants // ILAR J. 2005. V. 46. P. 280-293.

17. D. Stewart-Tull // The future potential for the use of adjuvants in human vaccines. In: A.A. Hincal, H.S. Kas // Biomedical Science and Technology: Recent Developments in the Pharmaceutical and Medical Sciences. NY: Plenum Press. 1998. P. 129-136.

18. P.C. Ferber, P. Ossent, F.R. Homberger, R.W. Fischer // The generation of monoclonal antibodies in mice: influence of adjuvants on the immune response, fusion efficiency and distress //Lab. Anim. 1999. V. 33. P. 334-350.

19. D.E. Stewart-Tull // Adjuvant formulations for experimental vaccines // Methods Mol. Med. 2003. V. 87. P. 175-194.

20. V.M. Jennings // Review of selected adjuvants used in antibody production H J. ILAR. 1995. V. 37. P. 119-125.

21. E. Ribi, J.L. Cantrell, K. Takayama, N. Qureshi, J. Peterson, H.O. Ribi // Lipid A and immunotherapy//Rev. Infect. Dis. 1984. V. 6. P. 567-584.

22. F.R. Vogel, M.F. Powell // A compendium of vaccine adjuvants and excipients. In: M.F. Powell, M.J. Newman // Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. NY: Plenum. Press. 1995. P. 141-227.

23. S.K. Sahoo, V. Labhasetwar // Nanotech approaches to drug delivery and imaging // Drug Deliv. Today. 2003. V. 8. N. 24. P. 1112-1120.

24. P.S. Gill, B.M. Espina, F. Muggia, S. Cabriales, A. Tulpule, J.A. Esplin, H.A. Liebman, E. Forssen, M.E. Ross, A.M. Levine // Phase I/II clinical and pharmacokinetic evaluation of liposomal daunorubicin//J. Clin. Oncol. 1995. V. 13 (4). P. 996-1003.

25. J.M. Sual, A. Annapragada, J.V. Natarajan, R.V. Bellamkonda // Controlled targeting of liposomal doxorubicin via folate receptor in vitro. // J. Cont. Rel. 2003. V. 92. P. 49-67.

26. C.R. Alving // Liposomes as carriers of antigens and adjuvants // J. Immunol. Methods. 1991. V. 140. P. 1-13.

27. D.D. Lasic, J.J. Vallner, P.K. Working // Sterically stabilized liposomes in cancer therapy and gene delivery // Curr. Opin. Мої. Ther. 1999. V. 1. N. 2. P. 177-185.

28. S.K. Singh, P.S. Bisen // Adjuvanticity of stealth liposomes on the immunogenicity of synthetic gp41 epitope of HIV-1 //Vaccine. 2006. V. 24. P. 4161-4166.

29. I.N. Mbawuike, P.R. Wyde, P.M. Anderson // Enhancement of the protective efficacy of inactivated influenza A virus vaccine in aged mice by IL-2 liposomes // Vaccine. 1990. V. 8. P.347-352.

30. N.C. Phillips, A. Emili // Enhanced antibody response to liposome-associated protein antigens: preferential stimulation of IgG2a/b production//Vaccine. 1992. V. 10. P. 151-158.

31. J.D. Almeida, D.C. Edwards, C.M. Brand, T.D. Heath // Formation of virosomes from influenza subunits and liposomes // Lancet. 1975. N.8. P. 899-901.

32. А.П. Каплун, Л.Б. Шон, Ю.М. Краснопольский, В.И. Швец // Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопр. Мед. Хим. 1999. Вып. 1. Т. 5.

33. H.S. Kim, Y.S. Park // Effect of lipid, compositions on gene transfer into 293 cells using Sendai F/HN-virosomes// J. Biochem. Мої. Biol. 2002. V. 35. P. 459-464.

34. J. Shoji, Y. Tanihara, T. Uchiyama, A. Kawai // Preparation of virosomes coated with the vesicular stomatitis virus glycoprotein as efficient gene transfer vehicles for animal cells // Microbiol. Immunol. 2004. V. 48. P. 163-174.

35. R.S. Haddad, L.M. Hutt-Fletcher // Depletion of glycoprotein gp85 from virosomes made with Epstein-Barr virus proteins abolishes their ability to fuse with virus receptor-bearing cells // J. Virol. 1989. V. 63. P. 4998-5005.

36. R.K. Scheule // Novel preparation of functional Sindbis virosomes // Biochemistry. 1986. V. 25. P.4223-4232.

37. R. Gluck, R. Mischler, S. Brantschen, M. Just, B. Althaus, S J. Jr Cryz // Immunopotentiating reconstituted influenza virus virosome vaccine delivery system for immunization against hepatitis A // J. Clin. Invest. 1992. V. 90. P. 2491-2495.

38. E. Waelti, N. Wegmann, R. Schwaninger, A. Wetterwald, C. Wingenfeld, B. Rothen-Rutishauser, C.D. Gimmi // Targeting her-2/neu with antirat Neu virosomes for cancer therapy // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 437-444.

39. R. Gluck, K.G. Burri, I. Metcalfe // Adjuvant and antigen delivery properties of virosomes // Curr. Drug Deliv. 2005. V. 2. P. 395^100.

40. C.R. Kensil // Immunomodulatory adjuvants from Quillaja saponaria // Immunopotentiators in Modern Vaccines. 2006. P. 109-122.

41. R.E. Smith, A.M. Donachie, F.H. McLaren, A.M. Mowat // Preservation of mucosal and systemic adjuvant properties of ISCOMS in the absence of functional interleukin-4 or interferon-gamma// Immunology. 1998. V. 93. P. 556-562.

42. H.X. Sun, Y. Xie, Y.P. Ye // ISCOMs and ISCOMATRIX™ // Vaccine // 2009. V. 27. P.4388-4401.

43. M.A. Thapar, E.L. Parr, J.J. Bozzola, M.B. Parr // Secretory immune responses in the mouse vagina after parenteral or intravaginal immunization with an immunostimulating complex (ISCOM) //Vaccine. 1991. V. 9. P. 129-133.

44. J. Myschik, D.G. Lendemans, W.T. McBurney, P.H. Demana, S. Hook, T. Rades // On the preparation,microscopic investigation and application of ISCOMs // Micron. 2006. V. 37 (8). P. 724-734.

45. G.F. Kersten, D.J. Crommelin // Liposomes and ISCOMS as vaccine formulations // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1241. P. 117-138.

46. A.M. Mowat, A.M. Donachie, G. Reid, O. Jarrett // Immune-stimulating complexes containing Quil A and protein antigen prime class I MHC-restricted T lymphocytes in vivo and are immunogenic by the oral route // Immunology. 1991. V. 72. P. 317-322.

47. A.M. Mowat, K.J. Maloy, A.M. Donachie // Immune-stimulating complexes as adjuvants for inducing local and systemic immunity after oral immunization with protein antigens // Immunology. 1993. V. 80. P. 527-534.

48. H. Takahashi, T. Takeshita, B. Morein, S. Putney, R.N. Germain, J.A. Berzofsky // Induction of CD8+ cytotoxic T cells by immunization with purified HIV-1 envelope protein in ISCOMs // Nature. 1990. V. 344. P. 873-875.

49. A.M. Mowat, A.M. Donachie // ISCOMS a novel strategy for mucosal immunization? // Immunol. Today. 1991. V. 12. P. 383-385.

50. J. Ekstrom, K.F. Hu, K.L. Bengtsson, B. Morein // Iscom and iscom-matrix enhance by intranasal route the IgA responses to OVA and rCTB in local and remote mucosal secretions // Vaccine. 1999. V. 17. P. 2690-2701.

51. S. Sjolander, D. Drane, R. Davis, L. Beezum, M. Pearse, J. Cox // Intranasal immunisation with influenza-ISCOM induces strong mucosal as well as systemic antibody and cytotoxic' T-lymphocyte responses // Vaccine. 2001. V. 19. P. 4072-4080.

52. M.P. Pileni, J. Tanori, A. Filankembo // Biomimetic strategies for the control of size, shape and self-organization of nanoparticles // Coll. Surfaces A: Physicochem. Engineer. Aspects. 1997. V. 123-124. P. 561-573.

53. M.P. Desai, V. Labhasetwar, E. Walter, R.J. Levy, G.L. Amidon // The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent // Pharm. Res. 1997. V. 14.1. N. 11. P. 1568-1573.

54. M. Chorny, I. Fishbein, H.D. Danenberg, G. Golomb // Study of the drug release mechanism from tyrphostin AG-1295-loaded nanospheres by in situ and external sink methods // J. Control. 2002. V. 83. P. 401-414.

55. T. Banerjee, S. Mitra, A.K. Singh, R.K. Sharma, A. Maitra // Preparation, characterization and biodistribution of ultrafine chitosan nanoparticles // Int. J. Pharm. 2002. V. 243. P. 93-105.

56. R. Langer // Tissue engineering: a new field and its challenges // Pharm Res. 1997. V. 14. N. 7. P. 840-841.

57. R.J. Raghuvanshi, A. Mistra, G.P. Talwar, R.J. Levy, V. Labhasetwar // Enhanced immune response with a combination of alum and biodegradable nanoparticles containing tetanus toxoid // J Microencapsul. 2001. V. 18. P. 723-732.

58. T. Pitaksuteepong, N.M. Davies, M. Baird, T. Rades // Uptake of antigen encapsulated in polyethylcyanoacrylate nanoparticles by D1-dendritic cells // Pharmazie. 2004. V. 59. P. 134-142.

59. Y. Fujita, H. Taguchi // Current status of multiple antigen-presenting peptide vaccine systems: Application of organic and inorganic nanoparticles // Chem. Cent. J. 2011. V. 5 (1).

60. R. Levy, U. Shaheen, Y. Cesbron, V. See // Gold nanoparticles delivery in mammalian livecells: a critical review // Nano. Rev. 2010. V. 1.i

61. C. Villiers, H. Freitas, R. Couderc, M.-B. Villiers, P. Marche // Analysis of the toxicity of gold nano particles on the immune system: effect on dendritic cell functions // J. Nanopart. Res. 2010. V. 12 (1). P. 55-60.

62. A. Tomii, F. Masugi // Production of anti-platelet-activating factor antibodies by the use of colloidal gold as carrier // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1991. V. 44 (2). P. 75-80.

63. Y.S. Chen, Y.C. Hung, W.H. Lin, G.S. Huang // Assessment of gold nanoparticles as a size-dependent vaccine carrier for enhancing the antibody response against synthetic food-and-mouth disease virus peptide //Nanotechnol. 2010. Y. 21 (19).

64. S. Parween, P.K. Gupta, V.S. Chauhan // Induction of humoral immune response against PfMSP-l(19) and PvMSP-l(19) using gold nanoparticles along with alum // Vaccine. 2011. V.,29 (13). P. 2451-2460.

65. M.O. Oyewumi, A. Kumar, Z. Cui // Nano-microparticles as immune adjuvants: correlating particle sizes and the resultant immune responses // Expert Rev Vaccines. 2010. V. 9 (9). P. 1095-1107.

66. S.D. Xiang, A. Scholzen, G. Minigo, et al. // Pathogen recognition and development of particulate vaccines: does size matter? // Methods. 2006. V. 40 (1). P. 1-9.

67. P.L. Mottram, D. Leong, B. Crimeen-Irwin, et al. // Type 1 and 2 immunity following vaccination is influenced by nanoparticle size: formulation of a model vaccine for respiratory syncytial virus // Mol. Pharm. 2006. V. 4 (1). P. 73-84.

68. J.M. Brewer, K.G J. Pollock, L. Tetley, D.G. Russell // Vesicle size influences the trafficking, processing, and presentation of antigens in lipid vesicles // J. Immunol. 2004. V. 173. P. 6143-6150.

69. J.W. Yoo, S. Mitragotri //Polymer particles that switch shape in response to a stimulus // PNAS. 2010 V. 107 (25). P. 11205-11210.

70. H. Zhang, H. Zhao, J. Wang, J. Chen, Y. Lu, J. Yun // Facile preparation of monodisperse pharmaceutical colloidal spheres of atorvastatin calcium via self-assembly // Small. 2009. V. 5 (16). P. 1846-1849.

71. A.H. Бастрич // Магистерская диссертация. МИТХТ им. М.В. Ломоносова. Москва 2006.

72. M.J. Francis, N. Gulati, R.M. Pashley // The dispersion of natural oils in de-gassed water // J. of Colloid and Interface Sci. 2006. V. 299. P. 673-677.

73. MJ. Francis, R.M. Pashley // A study of de-gassed oil in water dispersions as potential drug delivery systems// Colloids Surf. A. 2005. V. 260. P. 7-16.

74. V. Tandon, S.K. Bhagavatula, W.C. Nelson, B.J. Kirby // Zeta potential and electroosmotic mobility in microfluidic devices fabricated from hydrophobic polymers: 1. The origins of charge // Electrophoresis. 2008. V. 29. P. 1092-1101.

75. V. Tandon, В J. Kirby // Zeta potential and electroosmotic mobility in microfluidic devices fabricated from hydrophobic polymers: 2. Slip and interfacial water structure // Electrophoresis. 2008. V. 29. P. 1102-1114.

76. E. Kovac-Besovic, K. Duric, Z. Kalodera, E. Sofic // Identification and isolation of pharmacologically active triterpenes in Betuale cortex, Betula pendula Roth., Betulaceae // Bosn. J. Basic. Med. Sci. 2009 V. 9 (1). P. 31-38.

77. P.A. Krasutsky // Birch bark research and development // Nat. Prod. Rep. 2006. V. 23, P. 919-942.

78. P. W. Linder, A. Voye // Potentiometrie investigations of the equilibria between caffeic acid and copper(II), zinc(II), iron(II) and hydrogen ions in aqueous solution // Polyhedron. 1987. V. 6. Iss. 1. P. 53-60.

79. M. Wegener, M. Fevre, A.R. Paschedag, M. Kraume // Impact of Marangoni instabilities on the fluid dynamic behaviour of organic droplets // International Journal of Heat and Mass Transfer. V. 52. (11-12). 2009. P. 2543-2551.

80. M. Wegener, A. Paschedag, M. Kraume // Mass transfer enhancement through Marangoni instabilities during single drop formation // International Journal of Heat and Mass Transfer. 2009. N. 52. P. 2673-2677.

81. M. Howard, M.D. Shapiro // Practical flow cytometry //Forth edition. Wiley-Liss. 2003. P. 721.

82. M. Luck, B.-R. Paulke, W. Schröder, T. Blunk, R.H. Müller // Analysis of plasma protein adsorption on polymeric nanoparticles with different surface characteristics // John Wiley & Sons. Inc. 1998. P. 478-485.

83. T.M. Göppert, R.H. Müller // Adsorption kinetics of plasma proteins on solid lipid nanoparticles for drug targeting. Int. J. Pharm. 2005. V. 302 (1-2). P. 172-186.

84. M. Torsten, T.M. Göppert, R.H. Müller // Protein adsorption patterns on poloxamer- and poloxamine-stabilized solid lipid nanoparticles (SLN) // Eur. J. Pharm, and Biopharm. 2005. V. 60. P. 361-372.

85. S. Schmidt, R.H. Müller // Plasma protein adsorption patterns on surfaces of Amphotericin B-containing fat emulsions // Int. J. Pharm. 2003. V. 254. P. 3-5.

86. J. Kreuter, D. Shamenkov, V. Petrov, P. Ramge, K. Cychutek, C. Koch-Brandt, R. Alyautdin // Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier // J. Drug Target. 2002. V. 10 (4). P. 317-325.

87. Г.И. Ковалев, P.M. Салимов, В.В.Балакшин, A.H. Чистяков // Ноотропное средство. Патент РФ. RU 2300389. 10.06.2007. Бюлл. № 16.

88. Г.И. Ковалев, Д.А. Абаимов, Ю.Ю. Фирстова, В.В. Балакшин, А.Н. Чистяков // Средство для профилактики и лечения болезни Паркинсона. Патент РФ. RU 2324492. 20.05.2008. Бюлл. № 14.

89. О.А. Верховский, C.JI. Кальнов, В.В. Балакшин, А.Н. Чистяков // Способ продления жизни больных прионными болезнями. Патент РФ. RU 2353379. 27.04.2009. Бюлл. № 12.

90. М.Б. Щербинина// Низкий уровень билирубина крови: возможное диагностическое и прогностическое значение // Клиническая медицина. 2007. Т. 85, № 10. С. 10-14.

91. В.Н. Титов, М.Г. Творогова // Методические приемы исследования билирубина // Клиническая лабораторная диагностика. М.: Медицина. 1994. № 5. С. 36-38.

92. J.B. Landis, H.L. Pardue // Kinetics of the reactions of unconjugated and conjugated bilirubins with p-diazo-benzenesulfonic acid // Clin. Chem. 1978. V. 24. P. 1690-1699.

93. M. Michaelsson // Bilirubin determination in serum and urine // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1961. V. 13. N. 56. P. 1-80.

94. B. Nosslin // The direct diazo reaction of bile pigments in serum. Experimental and clinical studies // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1960. V. 12. N. 49. P. 1-176.

95. S. Meites, C.K. Hogg // Studies on the use of the van den Bergh reagent for determination of serum bilirubin // Clin. Chem. 1959. V. 5. P. 470^178.1Ц P. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл // Биохимия человека. Т. 2. М.: Мир. 1993. 415 с.

96. B.J. Marquis, S.A. Love, K.L. .Braun, C.L. Haynes // Analytical methods to assess nanoparticle toxicity // Analyst. 2009. V. 134. P. 425-439.

97. A.B. Глушкова, A.C. Радилов, B.P. Рембовский // Нанотехнологии и нанотоксикология взгляд на проблему // Токсикологический вестник. 2007. № 6. С. 4-8.

98. A. Dowling, R. Clift, N. Grobert et al. // Nanoscience and nanotechnologies: opportunities and uncertainties // The Royal Society. 2004. P. 116.118 http://www.erowid.org/archive/rhodium/pdf/thfrecovery.pdf

99. P. Jaaskelainen // Betulinol and its utilization // Paperi ja Puu. 1981. V. 63. N. 10. P.599-603.

100. B.P. Pradhan, A. Hassan, T. Ray I I Reduction of ketones to epimeric alcohols with potassium hydroxide-diethylene glycol // Tetrahedron. 1985. V. 41. N. 12. P. 2513-2516.r