Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенез полиэмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Морфогенез полиэмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы"

На правах рукописи

Галин Илыпат Рафкатович

МОРФОГЕНЕЗ ПОЛИЭМБРИОИДОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПЫЛЬНИКОВ ПШЕНИЦЫ

03.01.05 - физиология и биохимия растений 03.02.01 - ботаника

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 MAP 2015

005559954 уфа-2015

005559954

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Уфимском Институте биологии Российской академии наук (лаборатория экспериментальной эмбриологии растений)

Научный руководитель кандидат биологических наук,

Сельднмирова Оксана Александровна Научный консультапт кандидат биологических наук,

Титова Галина Евгеньевна

Официальные оппоненты: Кашин Александр Степанович,

доктор биологических наук, профессор (Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»)

Зарипова Альфии Ануровна,

кандидат биологических наук (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический сад-институт Уфимского научного центра Российской академии наук)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный университет»

Защита диссертации состоится «9» апреля 2015 г. в 1600 ч. на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет» по адресу: 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332. Факс (347)-273-67-78, e-mail: disbiobsugmail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет», адрес сайта: ЬИр://упулу.bashedu.ru/dissertatsionnvi-sovet-d-21201311

Автореферат разослан « (2 » ipefytuf 201

э г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Шарипова Марина Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования в области морфогенеза растений - одна из важных задач биологии развития растений. Удобная модель для изучения различных аспектов растительного морфогенеза - эмбриоидогенез in vitro (формирование зародышеподобной структуры - эмбриоида), в том числе андроклинный (формирование эмбриоида из гаплоидной клетки пыльника -микроспоры [Круглова, 2001, 2002; Эмбриологические основы ... , 2005]).

При культивировании in vitro изолированных пыльников пшеницы, наряду с формированием эмбриоидов, сходных по строешпо с зиготическими зародышами, ранее было выявлено формирование особых полимерных зародышеподобных структур с измененным типом полярности и симметрии, что выражалось в образовании в их апикальной части множественных щитков и апикальных меристем побегов [Эмбриологические основы .... 2005; Сельдимирова, Титова, 2007]. Так как специальные термины применительно к таким структурам отсутствуют, нами предложен термин «полиэмбриоидтл».

К настоящему времени накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных по различным аспектам формирования и развития эмбриоидов, сходных по строению с зиготическими зародышами, в том числе у пшеницы [Круглова, 20016; Эмбриологические основы ... , 2005; От микроспоры ..., 2010]. Данные же о генезисе полиэмбриоидов, а также о структурных и физиологических механизмах их образования почти полностью отсутствуют. В то же время такие данные позволят внести вклад в решение таких фундаментальных проблем биологии как механизмы становления полярности и симметрии в процессе эмбриогенеза растений, морфологическая природа органов зародыша однодольных растений и эволюционное становление однодольности. Кроме того, стабильное массовое получение полиэмбриоидов позволит оптимизировать биотехнологию клонирования ценных генотипов пшеницы в селекционных целях за счет увеличения продуктивности растений-регенерантов.

Цель исследования - выявление цито-физиологических особенностей морфогенеза полиэмбриоидов в культуре in vitro изолированных пыльников пшеницы.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить фитогормональные условия получения полиэмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы.

2. Методом сканирующей электронной микроскопии провести исследование пространственной организации полиэмбриоидов in vitro п динамике их развития от инициальной клетки до сформированной структуры.

3. Методом световой микроскопии изучить особенности морфогенеза in vitro полиэмбриоидов с помощью анализа образцов, предварительно изученных методом сканирующей электронной микроскопии.

4. Исследовать иммунолокализацию эндогенного ауксина ИУК в полиэмбриоидах на различных фазах их развития in vitro.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота образования полиэмбриодов in vitro зависит от определенного соотношеши эндогенного ауксина ИУК (в пыльнике) и экзогенного синтетического ауксина 2,4-Д (в индукционной питательной среде).

2. Полиэмбриоиды in vitro проходят следующие фазы развития: инициальная клетка —> бластомеризация —> органогенез —>• сформированный полиэмбриоид. Структурный механизм формирования полиэмбриоидов состоит в кливажной

полиэмбрионии и последующей фасциации органов отдельных эмбриоидов (радиальной или линейной).

3. Гомогенное распределение эндогенного ауксина ИУК в клет ках апикальной части при переходе от фазы бластомеризации к фазе органогенеза обуславливает формирование у полиэмбриоидов in vitro множественных щитков и соответствующих им апикальных меристем побегов.

Научная новизна. Впервые на основании комплексных цито-физиологических исследований выявлены условия индукции образования полиэмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы. Показано, что максимальная частота образования полиэмбриоидов в условиях выполненных экспериментов in vitro определяется подбором адекватного баланса между эндогенным и экзогенным ауксинами. Впервые проведен детальный анализ и выявлены особенности морфогенеза полиэмбриоидов in vitro в динамике развития от инициальных клеток до сформированных структур, сопоставлены данные о пространственной организации и внутреннем строении полиэмбриоидов и выявлены механизмы, обуславливающие различные типы симметрии изучаемых структур. Впервые методом иммунолокализации фитогормонов изучено распределение эндогенного ауксина ИУК в клетках развивающихся полиэмбриоидов пшеницы и проанализированы физиологические механизмы, обуславливающие изменение симметрии у полиэмбриоидов (по сравнению с зиготическими зародышами и сходными с ними по строению эмириоидами).

Теоретическая н практическая значимость работы.

Результаты исследований позволяют расширить представления о клеточных механизмах морфогенеза и регенерации растений в культуре in vitro, вносят вклад в разработку моделей гормональных и структурных механизмов становления полярности и симметрии в процессе эмбриогенеза, а также в решение такой фундаментальной проблемы, как морфологическая природа органов зародыша цветковых растений. Полученные данные позволят оптимизировать метод культуры in vitro изолированных пыльников в биотехнологических и селекционных исследованиях пшеницы. Полученные результаты используются в учебном процессе базовой кафедры Башкирского государственного университета при ФГБУН Уфимский Институт биологии РАН.

Конкурсная по,вдержка работы. Исследования выполнены в рамках НИР лаборатории экспериментальной эмбриологии растений УИБ РАН «Полиэмбриоидогения как система размножения пшеницы в модельных условиях культуры in vitro» (номер государственной регистрации темы 01201361803) и проекта «Ведущие научные школы Российской Федерации» (гранты HIII-7637.2010.4 и НШ 5282.2014.4, лидер школы - член-корр. РАН Т.Б. Батыгина, БИЛ РАН).

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования были представлены на 9 Международных (Брянск-Киев, 2010; Санкт-Петербург, 2010, 2012; Москва, 2012, 2014; Брянск-Брест, 2012; Stuttgart, 2012; Санкт-Петербург-Пушкин, 2013; Ялта, 2014) и 4 Всероссийских (Саратов, 2010; Уфа, 2012, 2013; Москва, 2013) конференциях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертация изложена на 207 страницах, в

том числе 161 странице основного текста, иллюстрирована 79 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 311 работ, в том числе 220 - на иностранных языках.

ОБЪЕКТ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования послужили сорта яровой мягкой пшеницы Жница, Башкирская 26, Салават Юлаев, Экада 70, Скала. Для экспериментов использовались растения, выращенные в полевых условиях научного стационара Уфимского Института биологии РАН (Уфимский район).

В работе были использованы метод культуры in vitro изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы [Круглова, Батыгина, 2002], метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), модифицированный применительно к морфогенным структурам пшеницы [От микроспоры ..., 2010], методы световой микроскопии (СМ), модифицированные применительно к морфогенным структурам пшеницы [Круглова и др., 2013], метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) растительных тканей [Кудоярова и др., 1986], метод иммунолокализаиии фитогормонов [Веселов, 1998]. Все морфолого-анаомические исследования были проведены на сорте Жница. Статистическую обработку полученных данных вели с использованием программы Microsoft Office Excel 2010. Обоснованность выводов и достоверность результатов работы обеспечены значительным объемом экспериментального материала, обработанного с применением статистических методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние концентрации 2,4-Д в индукционной питательной среде Potato И на частоту образования полиэмбриоидов у изученных сортов яровой

мягкой пшеницы

На основании методологического подхода, разработанного для пшеницы [Горбунова и др., 2001], методом твердофазного ИФА провели анализ содержания эндогенного ауксина ИУК в пыльниках изучаемых сортов пшеницы перед инокуляцией на питательную среду Potato II. На основании полученных данных изучаемые объекты условно разделены на высокоауксиновые (Скала, Башкирская 26, Экада 70) и низкоауксиновые (Жшща, Салават Юлаев) (табл. 1).

В ходе дальнейшей работы определяли оптимальную концентрацию экзогенного синтетического ауксина 2,4-Д в среде Potato II для максимального формирования полиэмбриоидов. Для этого пыльники инокулировали in vitro на варианты индукционной питательной среды Potato II, различающиеся только концентрацией 2,4-Д: 0.0-2.0 мг/л, с «шагом» в 0.5 мг/л. Экспериментально установлено, что максимальное формирование полиэмбриоидов у высокоауксиновых сортов Скала, Башкирская 26 и Экада 70 наблюдалось на среде с более низкой концентрацией 2,4-Д в 0.5 мг/л, у низкоауксиновых сортов Жница и Салават Юлаев - на среде с более высокой концентрацией 2,4-Д в 1.0 мг/л (табл. 2).

В ходе дальнейшей работы определяли оптимальную концентрацию экзогенного синтетического ауксина 2,4-Д в среде Potato II для максимального формирования полиэмбриоидов. Для этого пыльники инокулировали in vitro на варианты индукционной питательной среды Potato И, различающиеся только концентрацией 2,4-Д: 0.0-2.0 мг/л, с «шагом» в 0.5 мг/л. Экспериментально установлено, что максимальное формирование полиэмбриоидов у высокоауксиновых сортов Ската, Башкирская 26 и Экада 70 наблюдалось на среде с более низкой концентрацией 2,4-Д в 0.5 мг/л, у низкоауксиновых сортов Жница и Салават Юлаев - на среде с более высокой концентрацией 2,4-Д в 1.0 мг/л (табл. 2).

Таблица 1

Содержание эндогенного ауксина ИУК в пыльниках изученных сортов яровой мягкой пшеницы перед инокуляцией на индукционную питательную среду Potato II

Сорт Содержание эндогенной ИУК, нг/г сухой массы

2012 г. 2013 г.

Скала 329,6 ±48,2 415,8±25,4

Экада 70 327,9±32,3 345,2±9,3

Башкирская 26 282,9 ±3,9 234,7±10,5

Салават Юлаев 72,3±8,5 56,5±15,3

Жница 57,6 ±11,2 61,6±12,6

Примечание', все показатели значимы при Р = 95 %.

Таблица 2

Влияние концентрации 2,4-Д в индукционной питательной среде Potato II на частоту образования полиэмбриоидов у изученных сортов пшеницы

Сорт Частота образования полиэмбриоидов (%) при концентрации 2,4-Д (мг/л)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Скала 1,9 ± 0,73 39,6 ±1,82 14,3 ± 1,8' 2,8 ± 1,12 -

Экада 70 0,8 ± 0,13 21,1 ± 2,83 9,4 ± 1,72 - -

Башкирская 26 3,2 ± 0,53 10,5 ±2,7' 4,2 ± 1,5' 1,6±0,33 -

Салават Юлаев - 3,8 ± 1,33 12,6 ±3,42 4,9 ± 1,83 -

Жница - 9,8 ± 2,53 23,3 ±1,б3 6,3 ± 1,8' -

Примечание: 1 - значимо при Р = 99.9%, 2 - при Р = 99%, 3 - при Р = 95%. Полужирным шрифтом выделены максимальные значения частоты образования полиэмбриоидов у каждого исследованного сорта пшеницы

Для подтверждения зависимости частоты образования полиэмбриоидов от концентрации 2,4-Д в индукционной питательной среде PotatoII был проведен корреляционный анализ. Между проанализированными признаками наблюдались достоверные и значимые корреляции. Значения коэффициента корреляции г для сортов пшеницы составили: -0.64 (Скала), -0.98 (Экада 70), -0.88 (Башкирская 26), -0.58 (Сапават Юлаев), -0.63 (Жница).

Таким образом, экспериментально установлено, что индукция образования полиэмбриоидов зависит как от содержания ИУК в пыльниках перед инокуляцией на индукционную питательную среду Potato II, так и от концентрации 2,4-Д в составе среды, то есть от адекватного баланса между эндогенным и экзогенным ауксинами. Концентрацию 2,4-Д, оптимальную для получения максимального количества полиэмбриоидов, можно прогнозировать на основании определенных физиологических показателей пыльников (в данном случае - содержание эндогенной ИУК), инокулируемых на индукционную питательную среду Potato II.

Фенотипы полиэмбриоидов, формирующихся в культуре in vitro изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы В ходе культивирования in vitro пыльников изучаемых сортов яровой мягкой выявлено несколько фенотипов полиэмбриоидов. При анализе полученных фенотипов использовали классификацию и терминологию, приведенные в работе

[Fischer et al., 1997], согласно которым среди проанализированных образцов можно выделить 2 класса фенотипов.

I. Класс фенотипов «Множественные меристемы побега. Сиамские зародыши спина-к-спине». Характеризуется образованием в апикальной части полиэмбриоидов 2-5 щитков, обращенных друг к другу дорзальной стороной и частично конгенитально латерально сросшихся в базальной части. Такие полиэмбриоиды представляют собой полимерные структуры, в которых каждая единица имеет дорзовентральное строение и терминальное положение щитка относительно апекса побега (рис. 1). В данном классе можно выделить следующие категории полиэмбриоидов: (1) пентамерные (рис. 1а), (2) тримерные (рис. 16) и (3) димерные (рис. 1в), с соответствующим количеством щитков; щитки имеют соответствующее число апикальных меристем побегов. У пентамерных и тримерных полиэмбриоидов щитки располагаются радиально относительно продольной оси эмбриоида (рис. 1а, б), у димерных - супротивно по отношению друг к другу (рис. 1в). Пентамерные полиэмбриоиды, как правило, представлены вариантами с разной степенью сближения и срастания щитков, колеоптилей и апикальных меристем побегов в различных комбинациях.

Рис. 1. Пентамерный (я), тримерный (б) и димерный (е) полиэмбриоиды из класса фенотипов «Множественные меристемы побега. Сиамские зародыши спина-к-спине».

СЭМ. Условные обозначения: КП - корневой полюс, Щ - щиток

II. Класс фенотипов «Множественные меристемы побега. Сердечковидные сиамские зародыши». В апикальной части полиэмбриоидов также образуется нескольких щитков, но с другой симметрией расположения. В этом классе фенотипов можно выделить следующие категории: (1) полиэмбриоиды с двумя щитками и (2) полиэмбриоиды с тремя-пятью щитками, расположенными в одной плоскости относительно первичной оси эмбриоида. Щитки и соответствующие им апикальные меристемы побегов смещены на одну сторону полиэмбриоида и расположены в одной плоскости. Вся полимерная структура (как и слагающие ее единицы) имеет дорзовентральное строение и терминальное положение щитков относительно апексов побега. В первой категории щитки могут быть частично или полностью латерально сросшимися (рис. 2а). Во второй категории щитки, как правило, срастаются латерально полностью по всей длине с образованием единого синтетического щитка и единого синтетического колеоптиля, которые лишь слегка разделены в своей дистальной части (рис. 26).

(3) Полиэмбриоиды с двумя шитками, расположенными супротивно и ориентированными друг к другу вентральными сторонами. При каждом щитке имеется по одной апикальной меристеме побега, которые занимают терминальное положение относительно щитков (почти как у зародышей двудольных растений, но с двумя апикальными меристемами побегов) (рис. 2в).

Рис. 2. Полиэмбриоиды из класса фенотипов «Множественные меристемы побега. Сердечковидные сиамские зародыши»: димерный (а) и тримерный (б) со щитками, смещенными на одну сторону, и димерный (в) с супротивно ориентированными щитками. СЭМ. Условные обозначения: Ап - апекс побега, Кл - колеоптиль, КП - корневой полюс, Щ - щиток

При анализе двух классов фенотипов установлено, что во все годы исследований количественно преобладали полиэмбриоиды из класса «Множественные меристемы побега. Сиамские зародыши спина-к-спине» (рис. За), a среди них - пентамерные варианты (рис. 36). По этой причине акцент в работе был сделан на изучение этого варианта развития. При изучении морфогенеза полиэмбриоидов in vitro в качестве контроля рассматривали развитие зиготического зародыша in planta.

2013

I фенотип «Сиамские зародыши спина-к-спине»

«Сердечковидные сиамские зародыши»

2012

димерные Ц9 тримерные ^пентамерные /}

Рис. 3. Количественное соотношение полиэмбриоидов из двух классов фенотипов (а) и в пределах класса «Множественные меристемы побега. Сиамские зародыши спина-к-спине» (б)

Морфогенез зиготического зародыша in planta

При изучении морфогенеза зародышей использовали терминологию, предложенную Т. Б. Батыгиной [1974, 1987]. Зародыш в своем развитии проходит следующие фазы: инициальная клетка —» бластомеризация —» органогенез —> сформированный зародыш. Инициальная клетка зародыша - зигота - имеет типичную для злаков грушевидную форму и неравномерную вакуолизацию (базальная часть более вакуолизирована, чем апикальная, рис. 4а), что обуславливает положение плоскости первого асимметричного деления, в результате которого образуются две клетки - более мелкая апикальная и более крупная базальная. С этого момента начинается фаза бластомеризации зародыша, в ходе которой зародыш становится многоклеточным и приобретает четко выраженную

дорзовентральную симметрию (рис. 46-в). Затем зародыш вступает в фазу органогенеза, которая начинается с формирования единственной семядоли — щитка (рис. Ад, е). Практически одновременно с этим в апикальной части зародыша начинает формироваться эпидерма, а в основании апикальной части — зона таблитчатых меристематических клеток — инициалей апикальной меристемы корпя и колеоризы (рис. 4з). Далее наблюдается активизация клеточных делений в зоне инициации апикальной меристемы побега, в результате чего между ней и щитком появляется бороздка. Щиток постепенно занимает терминальное положение, а формирующаяся апикальная меристема - латеральное положение (рис. 4ж, з). Органы формируются за счет антиклинальных и периклинальных делений эпидермальных и субэпидермальных клеток. Эпидерма развивается в базипеталыюм направлении. В ходе дальнейшего развития дифференцируется колеоптиль, охватывающий развивающуюся апикальную меристему побега в виде кольца (рис. 4и, к). Немного позднее в щитке дифференцируется прокамбий, формируется примордий первого листа, в зоне таблитчатых меристематических клеток эндогенно закладываются апикальная меристема первого зародышевого корня и инициали колеоризы (рис. 4л, д<). Далее колеоптиль приобретает вид полого конуса, формируются эпибласт, вырост щитка — лигула и корневой чехлик (рис. 4н, о). Затем на апикальной меристеме побега закладываются примордии листьев и пазушные почки, а в основании первого зародышевого корня - инициали адвентивных корней. В полностью сформированном зародыше выделяются щиток, лигула, колеоптиле, эпибласт, колеориз, дифференцированная почечка, состоящая из апекса побега и нескольких листовых примордиев, первый зародышевый корень и адвентивные корни (рис. 4п,р).

Морфогенез полиэмбриоидов in vitro.

Морфогенез полнэмбрноидов из класса фенотипов «Множественные меристемы побега. Сиамские зародыши спина-к-спине».

Инициальная клетка полиэмбриоида - сильновакуолизированная микроспора (рис. 5а). После инокуляции на питательную среду in vitro в сильновакуолизированных микроспорах происходили структурные изменения, в результате которых микроспоры теряли свою полярную организацию. На 3-е сутки культивирования in vitro в таких деполяризованных микроспорах происходили симметричные митотические деления с образованием сначала двух равных ядер, затем двух равных клеток. С этого момента начиналась фаза бластомеризации полиэмбриоидов. В ходе дальнейших неупорядоченных делений формировались многоклеточные полиэмбриоиды (все еще находящиеся внутри оболочки микроспоры), все клетки которых были сходными по размеру и структуре, а сами полиэмбриоиды имели глобулярную форму (рис. 56, в).

После высвобождения полиэмбриоида из оболочки микроспоры начиналось постепенное становление его полярности и формирование апикалыю-базальной оси полиэмбриоида. Клеточные деления концешрировались преимущественно в апикальной части, которая значительно увеличивалась в размерах, приобретала глобулярную форму и радиальную симметрию (рис. 5г). Базальная часть состояла из вакуолшированных клеток, образующих удлиненную «ножку» полиэмбриоида. В это же время в полиэмбриоиде начинались формирование эпидермы, а также выделение зоны таблитчатых меристематических клеток в основании апикальной части, на границе с ножкой (рис. 5г). Затем наблюдалось продолжение увеличения размеров апикальной части, а также удлинение их базальной части, в результате чего полиэмбриоиды приобретали грибовидную форму.

Рис. 4. Морфогенез зиготического зародыша пшеницы in planta в фазах: инициальная клетка (а), бластомеризация (6-г), органогенез (<)-«), сформированный зародыш (п-р). а-

г, е, з, к, м, о, р - СМ, постоянные препараты; д, ж, и, л, н, п - СЭМ. Условные обозначения. АдКр - адвентивный корень, АМК - апикальная меристема первичного корня, АМП -апикальная меристема побега, АпЧ — апикальная часть, БзЧ - базальная часть, ВС -вентральная сторона, ДС - дорзальная сторона, Зг - зигота, Кл - колеоптиль, Кр - первый зародышевый корень, Крз - колеориза, КС - клеточная стенка, КЧ - корневой чехлик, Jlr -лигула, Мкп - микропиле, ПЛ - первый лист, ПрТ- прокамбиальный тяж, С — суспензор, ТМК - таблитчатые меристематические клетки, Щ - щиток, Эб - эпибласт, Эп - эпидерма. Время указано в сутках после опыления

обмс<зша

ОЛиЧ /

100 мкм

100 мк-м

Рис. 5. Морфогенез полиэмбриоидов in vitro из класса фенотипов «Множественные меристемы побега. Сиамские зародыши спина-к-спине» в фазах: инициальная клетка (а), бластомеризация (б~е), органогенез (ж-о), сформированный полиэмбриоид (п-р). а-г, е, з, к, м,о,р- СМ, постоянные препараты; д, ж, и, л,н,п- СЭМ. Условные обозначения. АМК - апикальная меристема корня, АМП - апикальная меристема побега, АПрТ - анастамоз проводящей ткани, АСТк - анастамоз сосудистой ткани, АпЧ - апикальная часть, БзЧ -базальная часть, Кл - колеоптиль, Кр - корень, Крз - колеориза, КЧ - корневой чехлик, МП -многоклеточный полиэмбриоид, Лг - лигула, ОАпЧ - основание апикальной части, ОбМс -оболочка микроспоры, ПВТ - проваскулярная ткань, ПЛ - первый лист, ПЭ - полиэмбриоид, СВМ - сильновакуолизированная микроспора, Св - связник, СТк - сосудистая ткань, ТМК -таблитчатые меристематические клетки, Щ - щиток, ЦЦ - центральный цилиндр, Эп -эпидерма. Время указано в сутках от момента инокуляции пыльников in vitro

В ходе дальнейшего развития полиэмбриоиды вступали в фазу органогенеза, которая начиналась с инициации множественных щитков по окружности апикальной части в ее среднем участке. При этом апикальная часть полиэмбриоидов становилась ребристой, между ребрами формировались впадины (рис. 5д, ё). Щитки и соответствующие им апексы побегов закладывались на ребрах, в местах максимального искривления поверхности апикальной части (рис. 5ж, з). Согласно данным гистологического анализа инициальная меристематическая зона клеток, в которой закладываются щетки и апексы побегов, едина и окружает глобулярную апикальную часть полиэмбриоида по кольцу (рис. 5д, з).

Таким образом, при переходе к органогенезу происходили смена симметрии и полярности, приводящие к увеличению размеров апикальной меристемы побега, возникновению на ней множественных точек роста и формирование полимерных структур, имеющих множественные органы в апикальной части. Сама полимерная структура - полиэмбриоид - имела радиальную симметрию, но каждая из единиц, составляющих полимерную структуру, имела дорзовентральную симметрию (терминально расположенный щиток и латерально расположенную апикальную меристему побега) и были объединены друг с другом общим корневым полюсом.

Иногда щитки закладывались асинхронно и моглн быть сближены, что обуславливало разные варианты и степень их слияния (рис. 5и). Заложение щитков и апексов побегов происходило с участием как дермальных, так и субдермальных инициалей. По направлению к формирующимся щиткам и апикальным меристемам побегов от меристематической зоны таблитчатых клеток, расположенной на границе с удлиненной ножкой полиэмбриоида, начинали формироваться тяжи клеток прокамбия (рис. 5к). В верхней части полиэмбриоида клетки становились паренхимными, в них появлялся крахмал. Самые периферические клетки окончательно формировали эпидермис (рис. 5к, м).

Начальные этапы органогенеза полиэмбриоидов сопровождались ростом щитков в ширину и в высоту. Рост щитков в высоту (в дорзовентральной плоскости) приводил к подъему их дорзалыюй стороны над верхушкой первичной оси полиэмбриоида, которая оказывалась расположенной в углублении (рис. 5л), а их разрастание в ширину - к нависанию валиков щитков над апикальными меристемами побегов и над базалыгой частью полиэмбриоидов, что особенно хорошо заметно при их просмотре снизу (рис. 5и, л). Одновременно с этим происходило увеличение объема апикальной меристемы побега (рис. 5и, л). Далее продолжалось дальнейшее развитие прокамбиальных тяжей, соедшгающих множественные апексы побегов и щитки с зоной базально расположенных таблитчатых меристематических клеток; в апикальной части полиэмбриоидов между ними прослеживалось образование анастомозов (рис. 5к, м). Начиная с этой стадии развития становилась отчетливо заметной разная степень частичного слияния щитков и апикальных меристем побегов между собой. Кроме того, щитки часто имели неравные размеры и сильно различались по степени развития (рис. 5и).

В ходе дальнейшего развития в основании каждого щитка, с его вентральной, стороны, формировались колеоптили, которые, как правило, имели линейную или спиралевидную разомкнутую структуру (рис. 5л), а не кольцевидную как у зиготических зародышей (рис. Аи, л). На этой стадии развития уже была четко видна апикальная меристема первичного корня (рис. 5л).

Продолжала развиваться проводящая система полиэмбриоидов, которая имела сложную структуру. К каждому щитку и соответствующему ему апексу побега отходил свой проводящий пучок, при этом все пучки были связаны с другими

пучками соседних щитков с дорзальной стороны анастомозами (рис. 5к, м).

В ходе дальнейшего развития на апикальных меристемах побега происходило заложение первых листовых примордиев (рис. 5н, о). В случаях более сильной степени срастания отдельных щитков соответствующие им меристемы побегов оказывались заключенными в единый синтетический, весьма протяженный в ширину колеоптиль, в апикальной части которого были различимы разделенные между собой свободные верхушки колеоптилей. Достаточно часто развитие апикальных меристем побегов сопровождалось фасциациями - слиянием нескольких меристем и закладывающихся на них листьев в одну пластинчатую структуру, на верхушке которой прослеживались следы свободных частей объединяющихся зачатков. На этой стадии развития в каждом полиэмбриоиде присутствовали сформированные первичные корни, имеющие типичное для корней злаков строение: наличие центрального цилиндра, перицикла, первичной коры (с эндодермой) и дерматогена, имеющих общие инициали (открытый тип меристемы корня). В некоторых случаях наблюдалось обособление корневых чехликов от колеоризы (рис. 5о). По мере заложения на апикальных меристемах побегов зачатков первых листьев, в их основании, в области развивающихся проводящих пучков щитка закладывались адвентивные корни.

Далее в полиэмбриоиде на апексе побега последовательно закладывались последующие зачатки листьев, формировалась лигула (рис. 5п, р). Каждая отдельная единица такого сформированного полиэмбриоида (рис. 5п, р) имела почти все присущие зиготическому зародышу пшеницы органы (рис. 4л, р) и подобно ему характеризовалась дорзовентральной симметрией.

Развитие полиэмбриодов из класса «Множественные меристемы побега.

Сердечковидные сиамские зародыши»

На самых ранних этапах развитие полиэмбриоидов данного класса фенотипов протекало сходным образом с таковым у полиэмбриоидов предыдущего класса фенотипов. Различия начинали проявляться после выхода полиэмбриоидов из оболочек микроспор и формирования у них апикально-базальной оси симметрии. В отличие от описанного выше класса фенотипов «Сиамские зародыши спина-к-спине», где клеточные деления равномерно распределялись по всему объему апикальной части полиэмбриоида, у фенотипов данного класса наблюдалось иное распределение клеточных делений, приводящих к двум другим вариантам развития.

1. Клеточные деления концентрировались только на одной стороне апикальной части полиэмбриоида, в результате чего формировалась структура, имеющая дорзовентральную симметрию. В ходе развития в апикальной части полиэмбриоидов инициировались щитки, которые были смещены на одну сторону полиэмбриоида и занимали терминальное положение по отношению к инициалям соответствующих им меристем побегов (рис. 2а, б). Таким образом, в данном случае, во время перехода к органогенезу также происходила смена полярности и симметрии: радиальная симметрия глобулярного полиэмбриоида сменялась на ди-, три- или пятимерную дорзовентральную симметрию полимерной структуры -полиэмбриоида, но иного типа. Менялась и топография проводящей системы: проводящие пучки каждого отдельного щитка формировали между собой анастамозы и срастались в плоскости, параллельной дорзальной поверхности полиэмбриоида, при этом на срезах, сделанных в дорзовентральной плоскости полиэмбриоида, топография проводящих пучков его отдельных составляющих единиц была сходна с таковой зиготического зародыша (рис. 4р). Последовательность заложения органов в полиэмбриоидах данного фенотипа была

такой же, как у «Сиамских зародышей спина-к-спине».

2. После формирования апикально-базальной оси полиэмбриоида и достижения его апикальной частью радиальной симметрии происходила инверсия мест инициации органов: инициация щитков происходила в латеральных положениях по отношению к терминально инициирующимся апикальным меристемам побегов. При этом вначале происходило уплощение верхушки апикальной части полиэмбриоида, а затем по ее окружности инициировались щитки. Разрастание щитков вверх и в ширину приводило к тому, что их вентральная сторона нависала над первичной осью полиэмбриоида с формированием углубления, в котором в складке щитков закладывались меристемы побега (рис. 2в).

Таким образом, проведенное исследование показало, что формирование полиэмбриоидов из разных классов фенотипов происходило за счет увеличения объема апикальной меристемы и смены симметрии и полярности исходного моноэмбриоида при переходе от фазы бластомеризации к фазе органогенеза, приводящих к возникновению в его апикальной части множественных точек роста -сближенных и частично объединенных между собой в'процессе развития. К моменту перехода к фазе органогенеза в апикальной части полиэмбриоидов формировалась единая периферическая кольцевая зона меристематических клеток, каждая из которых могла дать начало зачатку щитка и соответствующей ему апикальной меристемы побега. Формирование такой зоны можно рассматривать как особый случай кливажной полиэмбрионии, осуществляемой на ранних этапах развития и приводящих к возникновению полимерных структур, состоящих из нескольких объединенных между собой общим корневым полюсом единиц -моноэмбриоидов.

В ходе развития полиэмбриоидов наблюдались различные варианты срастаний щитков, соответствующих им апикальных меристем побегов и колеоптилей, нарушения филлотаксиса (отклонения угла дивергенции). Исходя из таких признаков как увеличение размеров апикальной меристемы побега, последующий распад на несколько самостоятельных апексов, нарушение филлотаксиса [Данилова, 1961; Чуб, 2010] можно сделать вывод, что структурный механизм формирования полиэмбриоидов различных классов состоит в кливажной полиэмбрионии и последующей фасциации образующихся органов. Различные типы фасциаций (радиальные или линейные) единиц, составляющих полиэмбриоиды, обуславливали различные типы их симметрии и топографию органов (дорзально, латерально или вентрально по отношению друг к другу).

Иммунолокализация эндогенной ИУК в полиэмбриоида* in vitro и зародышах in planta

При изучении иммунолокализации эндогенной ИУК акцент в работе также был сделан на анализ полиэмбриоидов с фенотипом «Множественные меристемы побега. Сиамские зародыши спина-к-спине», ввиду их количественного преобладания.

Анализ локализации эндогенной ИУК в клетках полиэмбриоидов на стадии многоклеточной структуры показал, что иммуногистохимически окрашивается цитоплазма всех клеток, за исключением их самого внешнего слоя, где интенсивность иммуногистохимического окрашивания была очень слабой, распределение эндогенной ИУК в окрашенных клетках было равномерным.

В полиэмбриоидах со сформированной апикально-базальной осью полярности и находящихся на стадии перехода к органогенезу выявлено равномерное окрашивание клеток эпидермы и собственно апикальной части полиэмбриоида.

Клетки базальиой части окрашивались более интенсивно, чем клетки апикальной части. Такая же картина наблюдалась в зоне таблитчатых меристематических клеток, расположенной в основании апикальной части полиэмбриоида и топографически соответствующей зоне будущей инициации корня и колеоризы.

На начальных этапах органогенеза (в момент инициации щитков) появлялся четкий градиент иммуногистохимического окрашивания: интенсивно окрашивались клетки апикальной части, таблитчатые меристематические клетки в ее основании, клетки прокамбиальных тяжей, формирующихся в направлении от базальной зоны таблитчатых меристематических клеток к местам инициации щитков и апикальных меристем и клетки дистального участка базальной части полиэмбриоида (наиболее интенсивно) (рис. 6а).

Рис. 6. Иммуногистохимическая локализация ИУК в клетках полиэмбриоидов (а, б - 17-е, д, е — 30-е сутки культивирования in vitro) и зародышей (в, г - 8-е, ж, з - 10-е сутки после опыления) в фазе органогенеза, а, в, д, ж - срезы, обработанные иммунной сывороткой, б, г, е, з - контрольные срезы, обработанные нормальной сывороткой. СМ, постоянные препараты. Условные обозначения: АМП - апикальная меристема побега, АпЧ — апикальная часть, БзЧ - базальная часть, Кл - колеоптиль, ПрТ - прокамбиальный тяж, С -суспензор, ТМК - таблитчатые меристематические клетки, Щ - щиток, Эп - эпидерма

На этой стадии развития наблюдалось гомогенное распределение эндогенной ИУК во всех клетках апикальной части полиэмбриоида, при этом клетки эпидермы окрашивались с такой же интенсивностью, что и клетки собственно апикальной части (рис. 6а). Далее, во время инициации апикальных меристем побега наиболее интенсивное иммуногистохимическое окрашивание обнаруживалось в клетках щитков, в клетках соответствующих им апикальных меристем побегов и клетках кольцевидной системы тяжей прокамбия, отходящих к щиткам и формирующимся апикальным меристемам побегов, в клетках эпидермы формирующихся органов

(рис. 6д). Остальные клетки апикальной части полиэмбриоида окрашивались менее интенсивно. Такая же картина сохранялась и в ходе дальнейшего развития.

Анализ локализации эндогенной ИУК в клетках многоклеточного зародыша в фазе бластомеризации перед переходом к органогенезу показал, что иммуногистохимически окрашивалась цитоплазма всех клеток апикальной части, включая и внешний слой (где уже началось формирование эпидермы), при этом интенсивность окрашивания клеток базальной части (в области суспензора) была очень слабой.

На начальных этапах органогенеза, во время инициации щитка и апикальной меристемы побега наблюдался четкий градиент иммуногистохимического окрашивания клеток зародыша. Наиболее интенсивно окрашивались клетки щитка и зоны таблитчатых меристематических клеток, расположенной в основании апикальной части зародыша и топографически соответствующей зоне будущей инициации корня и колеоризы. Клетки формирующейся апикальной меристемы побега также окрашивались, но менее интенсивно. Клетки эпидермы окрашивались только в области собственно зародыша. Клетки базальной части и суспензора не окрашивались (рис. бе). Градиент иммуногистохимического окрашивания клеток зародыша сохраняется и далее, во время инициации колеоптиля. При этом наиболее интенсивное иммуногистохимическое окрашивание отмечается в клетках щитка (особенно в клетках формирующегося прокамбиального тяжа), клетках апикальной меристемы побега, апикальной меристемы корня и формирующегося колеоптиля. Клетки суспензора не окрашиваются (рис. 6ж).

Таким образом, данные по иммунолокализации ИУК в полиэмбриоидах и зародышах на стадии перехода к органогенезу и на начальных этапах органогенеза (этап на котором в полиэмбриоидах происходит смена типов полярности и симметрии) различались. В то время как в зародыше четко прослеживался градиент окрашивания с пика.\ш в клетках инициалей органов, в полиэмбриоидах при переходе к органогенезу все клетки апикальной части окрашивались равномерно (рис. 6а и 6s), что и обуславливало инициацию множественных щитков и соответствующих им апикальных меристем побегов.

Заключение

К настоящему времени накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных по различным аспектам формирования и развития эмбриоидов, сходных по строению с зиготическими зародышами, в том числе у пшеницы [Эмбриологические основы ... , 2005; От микроспоры ... , 2010]. В то же время выявлен особый тип эмбриоидов с измененным типом полярности и симметрии - иолиэмбриоиды. Данные об их генезисе, а также о структурных и физиологических механизмах их формирования практически отсутствуют.

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что гормональный статус пыльников, инокулируемых на индукционную питательную среду, - важнейший фактор формирования полиэмбриоидов. Было показано, что максимальная частота образования полиэмбриоидов определяется адекватным балансом эндогенного (ИУК в инокулируемых пыльниках) и экзогенного (2,4-Д в составе питательной среды Potato II) ауксинов. Тем самым подтверждается роль природных и синтетических ауксинов как обязательных участников координации процессов морфогенеза, оказывающих существенное влияние на деление и дифференциацию клеток [Datta, 2001;Медведев, Шарова, 2011].

С использованием методического подхода, состоящего в сопоставлении данных СЭМ и СМ, нами впервые изучено полное и детальное развитие полиэмбриоидов

in vitro от инициальной клетки до сформированной структуры. Установлено, что в своем развитии полиэмбриоиды in vitro проходят фазы, характерные для зиготических зародышей и сходных с ними по строению эмбриоидов. Выявлены особенности формирования полиэмбриоидов in vitro: изменение полярности и симметрии, состоящее в формировании в апикальных частях полиэмбриоидов множественных щитков и соответствующих им апикальных меристем побега, ориентированных различным и обычно объединенных одним общим корневым полюсом, а также частые конгенитатьные срастания нескольких органов (щитков, колеонтилей или апикальных меристем побегов) в единую синтетическую структуру. Нами впервые выявлены структурные механизмы формирования полиэмбриоидов - кливажная полнэмбрионня и различные типы фаспиаций (радиальная или линейная) составляющих их единиц, обуславливающих различные типы симметрии полиэмбриоидов.

С помощью метода иммунолокализации фитогормонов [Веселое, 1998] установлено, что гомогенное распределение ИУК в апикальной части полиэмбриоидов на стадии перехода от фазы бластомеризании к фазе органогенеза - одна из возможных причин формирования множественных щитков и соответствующих им апикальных меристем побегов. Такие данные еще раз подтверждают важную (и, по-видимому, определяющую) роль ауксинов в формировании паттернов трехмерной организации растительного организма и становления его полярности и симметрии. Переход от гомогенного распределения эндогенной ИУК к гетерогенному - основной фактор смены типов полярности и симметрии, а направленные потоки ауксина - основные индукторы органогенеза у растений [Медведев, 2012; Розов и др., 2013].

В целом, изучение различных аспектов формирования полиэмбриоидов in vitro представляет несомненный интерес для решения ряда вопросов в области морфогенеза растений - одной из сложнейших проблем биологии развития растений.

ВЫВОДЫ

1. Получение полиэмбриоидов in vitro в культивируемых пыльниках изученных сортов яровой мягкой пшеницы определяется как содержанием эндогенного аукснна ИУК в пыльниках, так и концентрацией экзогенного синтетического ауксина 2,4-Д в составе индукционной питательной среды. Максимальная частота образования полиэмбриоидов в условиях выполненных экспериментов in vitro определяется подбором адекватного баланса между эндогенным и экзогенным ауксинами.

2. Полиэмбриоиды в своем развитии in vitro проходят следующие фазы: инициальная клетка —► бласгомеризация —> органогенез —<• сформировашгый полиэмбриоид.

3. Морфогенез, in vitro полиэмбриоидов характеризуется рядом особенностей:

а) изменение полярности и симметрии на стадии перехода к органогенезу, состоящее в формировании в апикальной части полиэмбриоида множественных щитков и соответствующих им апикальных меристем побега, ориентированных различным образом по отношению друт к другу (дорзалыю, вентралыю или латерально) и обычно объединенных одним общим корневым полюсом;

б) конгенитальные срастания нескольких органов (щитков или апикальных меристем побегов) в единую структуру.

4. Структурный механизм формирования полиэмбриоидов состоит в кливажной полиэмбрионии и различных типах фасциации (радиальной или линейной)

составляющих их единиц, обуславливающих различные типы симметрии полиэмбриоидов.

5. Гомогенное распределение эндогенного ауксина ИУК в клетках апикальной части полиэмбриоидов in vitro на стадии перехода от фазы бластомеризации к фазе органогенеза обуславливает формирование множественных щитков и соответствующих им апикальных меристем побегов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ

Сельдимирова, O.A. К вопросу о формировании полиэмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы / O.A. Сельдимирова, Н.Р.Галин // Известия Самарского научного центра Российской академии паук. 2011. Т.13. № 5(3). С.188-190.

Сельдимирова, O.A. Цито-гистологический анализ особенностей морфогенеза полиэмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы / O.A. Сельдимирова, II.P. Галин // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. 2013. №1. С. 39-41.

Зайцев, Д.Ю. Иммунолокализация цитокиншюв в клетках корней, формирующихся в каллусах пшеницы зародышевого происхождения / Д.Ю. Зайцев, O.A. Сельдимирова, II.P. Галин, H.H. Круглова // Известия Самарского НЦ РАН. 2013. Т. 15. №3(6). С.1606-1609.

Сельдимирова, O.A. Структурные механизмы становления симметрии у микроспориальных эмбриоидов пшеницы: данные сканирующей электронной микроскопии / O.A. Сельдимирова, Г.Е. Титова, II.P. Галин, H.H. Круглова // Известия Самарского НЦ РАН. 2013. Т.15 №3(6). С.1676-1679.

Публикации в других изданиях

Галин, Н.Р. Цитологический анализ формирования эмбриоидов с множественными апикальными меристемами побега в культуре in vitro пыльников пшеницы / И.Р. Галин // Апомиксис и репродуктивная биология: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения С.С. Хохлова: Саратов: Изд-во Саратовского университета. 2010. С. 136-138.

Сельдимирова, O.A. Индукция эмбриоидов с множественными апикальными меристемами побега как биотехнологический способ получения гаплоидов яровой мягкой пшеницы / O.A. Сельдимирова, И.Р. Галин // Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология: Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых. Брянск: Ладомир, 2010. С. 102-106.

Сельдимирова, O.A. Ультраструктурный анализ клеток меристематической зоны в каллусах андроклинного происхождения у пшеницы / О.А.Сельдимирова, II.P. Галин // Материалы международной конференции, посвященной 50-летнему юбилею лаборатории эмбриологии и репродуктивной биологии БИН РАН. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2010. С. 117-119.

Галин, И.Р. К вопросу о разработке биотехнологии получения гаплоидов пшеницы на основе феномена эмбриоидогении / И.Р. Галин// Трансфер инновационных биотехнологий в селекции растений, экологии, растениеводстве, животноводстве: Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых. Брянск: Ладомир, 2012. С. 34-37.

Галин, И.Р. 2,4-Д как индуктор формирования полиэмбриоидов пшеницы в культуре in vitro / И.Р. Галин // Ломоносов-2012: Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых М., 2012. С.233-234.

Галин, II.P. Оптимизация метода иммунолокализации фитогормонов применительно к зародышевым каллусам пшеницы in vitro / И.Р. Галин, Д.Ю. Зайцев II II (X) Международная ботаническая конференция молодых ученых в Санкт-Петербурге: Материалы. СПб., 2012. С.76.

Галин, И.Р. Влияние концентрации 2,4-Д на выход полиэмбриоидов пшеницы в культуре in vitro / И.Р. Галин, O.A. Сельдимирова // Биомика: Материалы III Всероссийской школы-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии. Уфа, 2012. С.28-29.

Seldimirova, O.A. Die Morphogenese von Folyembryoiden in der In-Vitro-Kultur der Staubgefasse des Weizens / O.A.Seldimirova, I.R.Galin // European Applied Scienses: modern approaches in scientific researches. Stuttgart. Germany. 2013. V.l. P. 10-13.

Галин, H.P. Паттерны формирования микроспориальных эмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы: влияние 2,4-Д / И.Р. Галин // Инновационные направления современной физиологии растений: Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием. М., 2013. С.193.

Галин, И.Р. Иммунолокализация ауксинов в формирующихся андроклинных эмбриоидах пшеницы / И.Р. Галин, O.A. Сельдимирова // Проблемы и перспективы исследований растительного мира: Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых. Ялта, 2014. С. 213.

Галин И.Р. Оценка изменчивости андроклинных растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы с использованием изоферментных маркеров / И.Р. Галин // Ломоносов-2014: Материалы Международного молодежного научного форума. М.: МАКС Пресс, 2014. http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov 2014/section 2 2485.htm

Подписано к печати 03.02.2015 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 045. Гарнитура «ТтезНешЯотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. г. Уфа, ул. Карла Маркса, 12, корп. 5, т/ф: 272-76-00, 272-91-23