Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-биохимические критерии оценки физиологического статуса личинок миазных мух (OESTRIDAE, HYPODERMATIDAE,GASTROPHILIDAE, SARCOPHAGIDAE)

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-биохимические критерии оценки физиологического статуса личинок миазных мух (OESTRIDAE, HYPODERMATIDAE,GASTROPHILIDAE, SARCOPHAGIDAE)"

к'

РГБ ОД

* ь . г '"О

На правах рукописи

КАПУСТИНА Яна Александровна

МОРФО-БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА ЛИЧИНОК МИАЗНЫХ МУХ (ОЕвТНГОАЕ, НУРОБЕКМАТГОАЕ, ОАвТКОРНИЛБАЕ, 8АКСОРНАОГОАЕ)

03.00.19 — Паразитология, гельминтология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тюмень 1999

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной энтомологии и арахнологии Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор

Геннадий Сергеевич Сивков

Научный консультант:

доктор биологических наук Владимир Николаевич Домацкий

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Вера Яковлевна Пустовалова кандидат биологических наук Николай Максимович Столбов

Ведущая организация:

Уральская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится 14 января 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 020.86. 01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной энтомологии и арахнологии (625041, г. Тюмень, ул. Институтская, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВЭА.

Автореферат разослан 11 декабря 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор \ Н. В. Солопов

ЬвРд. 0

"/72Н 6Ш.Э

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Рациональное ограничение численности насекомых — паразитов животных составляет одну из существенных задач современной паразитологии. Успешное решение проблемы возможно лишь при углубленном изучении закономерностей биологии, в том числе и физиологии насекомых, которая представляет не только теоретический фундамент современных знаний об общих свойствах насекомых, но также является научной основой прикладных энтомологических дисциплин — сельскохозяйственной, лесной, медицинской и интересующей нас ветеринарной энтомологии (Тыщенко, 1986).

Энтомозы сельскохозяйственных животных — паразитарные заболевания, вызываемые насекомыми как в фазе имаго, так и в фазе личинки. Из этой группы заболеваний ветеринарная энтомология большое значение придает энтомозам, вызываемым личиночной фазой отряда двукрылые (Díptera) семейств Hypodermatidae, Gastrophilidae, Oestridae, Sarcophagidae. Вред, причиняемый хроническим течением данных инвазий, бесспорен. Заболевания характеризуются воспалительными процессами в месте локализации паразита, общей интоксикацией организма хозяина, снижением продуктивности животных. Ежегодные потери от недополучения мяса, молока и снижения качества кожевенного сырья составляют сотни миллионов рублей.

В разработке мер ограничения численности насекомых паразитов особое значение придается изучению системы «паразит-хозяин», что на настоящем этапе является центральной задачей паразитологии. В отом аспекте выделяются две основные задачи: изучение влияния паразита на организм хозяина и изучение влияния хозяина на физиологический статус паразитирующих насекомых. Если первый вопрос достаточно хорошо изучен (Дядечко, Ямов, 1966; Бартнинкас, 1960; Калинина, 1977; Мамаев, 1972; Сивков, 1980; Соломаха, 1981; Аязбаев, 1990; Алпаев, 1992; Зубков, 1993; Толоконников, 1995; Солопов, 1996; Сивков, Белецкая, 1996), то второй освещают немногие работы (Краковецкая, 1985, Ямов, Колесник, Калинина, 1977; Сивков,1978; Марченко, 1989).

Одним из важнейших показателей физиологического статуса насекомого является состояние его внутренней среды, которая

непосредственно соприкасается со всеми органами и тканями. Изучению гемолимфы насекомых посвящены фундаментальные работы по физиологии насекомых (Кузнецов, 1948; Шовен, 1953; Тьнценко, 1976, 1986), а также многочисленные работы по состоянию внутренней среды насекомых (Богоявленский, 1932; Заварзин, 1945; Штейнхауз, 1953; Сиротина, 1965; Поливанова, 1968; Запольских, 1976; Беляева и др., 1975; Бороздина, 1971; Кочетова, 1976; Батурин, 1978; Краковецкая, 1985; Крючкин, 1996; Дубовский и др., 1997).

В тоже время, гемолимфа личинок миазных мух семейств Hypodermatidae, Gastrophilidae, Oestridae, Sarcophagidae остается практически не изученной, за исключением работ по гемолимфе подкожного овода северного оленя (Бороздина, 1971; Краковецкая, 1985). Также в настоящее время не существует единого методологического подхода к изучению физиологического состояния личиночных стадий паразитических насекомых, вызывающих миазы животных, что и явилось предпосылкой для определения направления работы.

Цель исследований — Разработать методологические подходы изучения физиологического статуса личиночных стадий паразитических насекомых, вызывающих миазы животных. Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить морфологический (качественный и количественный) состав и гемоцитарную формулу гемолимфы личинок мух семейств Hypodermatidae (Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi), Oestridae (Oestrus ovis), Gastrophilidae (Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis), Sarcophagidae (Wohlfahrtia magnifica).

2. Изучить возрастные изменения гемоцитарной формулы для личинок данных видов.

3. Определить основные биохимические показатели гемолимфы данных видов семейств Hypodermatidae, Gastrophilidae, Oestridae, Sarcophagidae и показать их возрастную динамику.

Научная новизна. Впервые определены основные критерии интегрированной тест-системы комплексной оценки физиологического статуса личинок миазных мух, включающие показатели морфологического состава, гемоцитарной формулы, биохимического состава и белковых фракций личинок миазных мух. Впервые

определены: количественный состав гемолимфы личинок Oestrus ovis, Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis; морфологический состав гемоцитов личинок Oestrus ovis, Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus'inermis; Wohlfahrtia magnifica и значительно дополнен для Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi; возрастная динамика в количественном и качественном составе форменных элементов, а также возрастная динамика в биохимическом составе гемолимфы личинок данных видов. Впервые методом электрофореза на полиакриламидном геле выделены белковые фракции гемолимфы личинок Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi и установлен уровень белкового полиморфизма и средней гетерозиготности для данных видов.

Практическая значимость работы. Исследования выполнены в соответствии с научно-технической программой РАСХН «Ветеринарная медицина», задание 03. Для комплексной оценки физиологического состояния личинок насекомых, паразитирующих на домашних животных и их популяций, предлагается интегрированная тест-система, основанная на морфо-биохими-ческих исследованиях гемолимфы. Материалы исследований вошли в методические рекомендации «Морфо-биохимические критерии оценки физиологического статуса личинок мух, паразитирующих на домашних животных», а также используются в учебном процессе биологического факультета ТГУ, факультетах: ветеринарной медицины, зоотехническом, агроэкологии, биологические ресурсы и аквакультуры ТГСХА по курсу «Зоология» и «Паразитология».

Положения выносимые на защиту. Качественный и количественный состав форменных элементов гемолимфы мух семейств Hypodermatidae, Oestridae, Gastrophilidae, Sarcophagidae и его возрастную динамику необходимо учитывать при определении физиологического статуса насекомых. Состав белковых фракций гемолимфы личинок характеризует состояние отдельной особи, а также уровень белкового полиморфизма и гетерозиготности популяций. Биохимический состав гемолимфы личинок данных видов и его возрастная динамика является показателем физиологического состояния личинок миазных мух.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Всероссийской конференции — Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий (Курган, 1998), а также на межлабораторном заседании ВНИИВЭА (1999), на заседаниях Ученых Советов ВНИИВЭА (1997-1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано восемь научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 23 рисунками, 9 фотографиями. Список литературы включает 182 источника, в том числе 47 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в лаборатории энтомозов животных Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной энтомологии и арахнологии, на кафедре экологии и генетики Тюменского государственного университета, а также на кафедре паразитологии Тюменской государственной сельскохозяйственной академии.

Объектом исследований явилась гемолимфа личинок подкожного овода крупного рогатого скота (Hypoderma bovis De Geer), подкожного овода северного оленя (Oedemagena tarandi), овечьего овода (Oestrus ovis L.) желудочных (Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis) оводов и вольфартовой мухи (Wohlfahrtia magnifica).

Материал отбирали у необработанных инсектицидами животных. Личинок овечьего овода собирали во время вскрытия голов при убое овец на Курганском мясокомбинате, в хозяйствах Тюменской и Курганской областей. Личинок 1 возраста находили на носовой перегородке, в носовых ходах и носовых раковинах, в лабиринте решетчатой кости; личинок 2 и 3 возраста — в лобных пазухах и подроговых пространствах. Вскрытие голов проводилось по методике Г. С. Сивкова (1981). Личинок подкожного овода

собирали на мясокомбинатах и в хозяйствах Тюменской и Курганской областях по методике В. 3. Ямова (1966), при убое животных: со шкур при их снятии (личинок 2 и 3 возрастов), в эпидуральном жире спинномозгового канала при распиле туш (личинок 1 возраста), а также из свищей при осмотре крупного рогатого скота в хозяйствах (личинок 2 и 3 возрастов). Личинок желудочных оводов собирали в желудках лошадей при убое в СПК «Рассвет» Упоровского р-на и в АПФ «Лукойл-Каскара» (д. Янтык). Личинок 2 и 3 возраста подкожного овода северного оленя (Оес1ета§епа 1агапсИ) собирали при убое оленей в оленста-дах Тазовского района ЯН АО. Личинок вольфартовой мухи 1-3 возрастов из ран овец в хозяйствах Тюменской и Курганской областей. Вид и возраст личинок определяли по К. Я. Грунину (1953).

Личинок промывали холодным 0,85% раствором ЫаС1, просушивали фильтровальной бумагой и быстро замораживали в лед-солевой смеси и перевозили замороженными. При приготовлении проб для электрофореза у размороженных личинок из надреза тела брали несколько капель гемолимфы, смешивали с равным объемом 40%-го раствора сахарозы. Для разделения белков применяли метод электрофореза в 7,5%-ом полиакриламидном геле. При разработке метода наши исследования показали, что за прототип методики изучения белковых фракций гемолимфы личинок насекомых, в частности личинок мух, можно взять методику электрофореза, которая обычно используется для изучения белков тканей позвоночных животных. В частности, для разделения белков гемолимфы можно использовать 7,5% ПААГ, электродную трис-ЭДТА-борат-ную буферную систему (рН=8,0) и гелевую трис-ЭДТА-боратную буферную систему (рН=8,6), которую предлагают для изучения белков сыворотки крови человека (Боброва, Пак, 1998). Разделение проводили в камере для вертикального гель-электрофореза типа АВГЭ-2, конструкции венгерской фирмы «Хайу-Калур», с использованием ЭДТА-боратного буфера рН 8,3. По сравнению с камерой конструкции Трувеллера-Нефедова (Трувеллер, Нефедов, 1974), эта камера, формируя гель высотой около 10 см, позволяет выявить до 20 белковых фракций, в то время как камера Трувеллера-Нефедова только 6.

Экспериментальным путем установили следующий режим фореза: 120У при Т 11-16 С. Растворы и буферные смеси готови-

ли по прописям Девиса (1964). Гелевые блоки окрашивали на общий белок с помощью амидочерного и бромфенолового синего.

Статистическая обработка осуществлена по Лакину (1990). Полиморфизм и среднюю гетерозиготность подсчитывали по Жи-вотовскому (1991).

Для приготовления мазков гемолимфы, обработанных в физиологическом растворе и спирте личинок накалывали в межсегментарное пространство с брюшной стороны сбоку. Выходящую каплю гемолимфы помещали на предметное стекло и готовили мазок обычным способом. Высохшие на воздухе мазки гемолимфы фиксировали 30 минут в смеси Никифорова. Окраску проводили азур-эозином по Романовскому-Гимза, также производилась окраска на липиды Суданом черным.

Морфологическую дифференцировку гемоцитов производили по результатам общих размеров клеток; ядерно-плазменного соотношения; общей формы клеток; наличия псевдоподий или ци-топлазматических выпячиваний; степени и характера гранулярности; базофилии цитоплазмы; вакуолизации; наличия сфер и кристаллов. При определении типов клеток использовали номенклатуру форменных элементов из классификации Тыщенко (1986).

Определение количественного соотношения типов гемоцитов выполнено на 30 микропрепаратах для каждого вида с учетом всей площади мазка не менее 200 клеток. Количество гемоцитов подсчитывали в камере Горяева, размеры клеток определяли при помощи окулярной линейки.

Общий белок определяли по Лоури (Lowry et al, 1951) и рефрактометрически (Стадниченко, 1987); мочевую кислоту — по реакции окислительного азотсочетания с 4-хлор-З-метил-фенолом и 4-аминоантипирином (био-тест «Lachema»); мочевину — диацетилмонооксимовый метод; натрий, калий — плазменным фотометром; магний — в безбелковом фильтрате с титановым желтым; кальций — по реакции взаимодействия с индикаторным реактивом Арсеназо-N (набор «Кальций-Ново»; фосфор — по взаимодействию с ванадат-молибдатным реактивом в модификации Коромыслова и Кудрявцевой; медь — по реакции с батокуприном (био-тест «Lachema»); железо — по реакции взаимодействия с хромогеном без депротеинизации (набор «Vital diagnostics»); гемоглобин — солянокислым — гемати-

новым методом по Сали (Стадниченко, 1989); содержание глюкозы — по цветной реакции с орто-толуидиновым реактивом; триглицериды — по Сардеса и Маннингу, спектрофотометри-чески; липопротеиды — по Бартлетту-Ушеру минерализацией липидов с помощью хлорной кислоты, спектрофотометрически. Полученные результаты подвергали статистической обработке по Лакину (1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Форменные элементы гемолимфы личинок миазных мух семейств Hypodermatidae, Oestridae, Gastrophilidae, Sarcophagidae

Гемолимфа личинок видов мух, перечисленных семейств, несмотря на некоторое различие в типах гемоцитов в целом имеет общий план строения и представлена, как и у большинства, насекомых межклеточным веществом (плазмой) и форменными элементами (гемоцитами). Полиморфизм насекомых, их широкий адаптационный диапазон проявляются и в индивидуальных особенностях функциональной морфологии гемоцитов, которые могут быть использованы в качестве таксономического критерия (Запольских, 1987). Такие исследования личинок бабочек семейства Noctuidae позволили в некоторых случаях идентифицировать виды по особенностям морфологии гемоцитов (Arnold, 1982).

В процессе изучения гемолимфы личинок мух семейств Oestridae (Oestrus ovis), Hypodermatidae (Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi), Gastrophilidae (Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis), Sarcophagidae (Wohlfahrtia magnifica), были выделены следующие типы форменных элементов: прогемоциты, плазмоциты, гранулоциты, эноцито-иды, сфероциты, адипогемоциты. Гемоцитарная формула гемолимфы личинок изученных видов содержит все основные типы гемоцитов (по классификации В. П. Тыщенко (1986)).

Классификация гемоцитов личинок овечьего овода (Oestrus ovis) включает в себя шесть типов клеток: прогемоциты, плазмоциты, гранулоциты, эноцитоиды, сфероциты, адипогемоциты. Классификация гемоцитов личинок подкожных оводов (Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi) включает в себя пять типов клеток: прогемоциты, плазмоциты, гранулоциты, эноцитоиды, сфероци-

ты. Классификация гемоцитов личинок желудочных оводов (Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis) включает в себя четыре типа клеток: прогемоциты, плазмоциты, гранулоциты, эноцитоиды. Классификация личинок вольфартовой мухи (Wohlfahrtia magnifica) состоит также из четырех типов: прогемоциты, плазмоциты, сфероциты, гранулоциты.

Адипогемоциты встречаются только в гемолимфе овечьего овода, что в данном случае, очевидно, является их видовой особенностью, т. к. у всех остальных видов, из клеток, содержащих вакуо-лизированные включения, присутствуют лишь сфероциты, которые выполняют, по всей видимости, ту же функцию накопления питательных веществ, некоторые авторы даже объединяют эти два типа клеток в один (Jones, 1962; Тыщенко, 1986). У всех изученных нами видов, прогемоциты типичны по своей морфологии (размер клетки — 5x5 мкм; размер ядра 3x3 мкм), плазмоциты же гетеро-генны, что проявляется и в размерах клеток (14,5x11,5 мкм у овечьего овода; 18x14 мкм у подкожного овода крупного рогатого скота; 9x10 мкм у подкожного овода северного оленя; 7x7 мкм у желудочных оводов; 20x20 мкм у вольфартовой мухи). Гранулоциты встречаются в гемолимфе у всех личинок, описанных видов, но гранулоциты у G. pecorum (19,5 мкм х 16 мкм) имеют свои особенности — наряду с белковыми гранулами эти клетки содержат вакуо-лизированные включения, дающие положительную окраску на ли-пиды, очевидно поэтому в гемолимфе желудочных оводов не встречаются сфероциты. Для остальных изученных видов сфероциты обычны. Эноцитоиды типичны для всех видов оводов, в гемолимфе же личинок Wohlfahrtia magnifica не встречаются. В целом гемолимфа личинок Oestrus ovis, Hypoderma bovis, Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis, Wohlfahrtia magnifica — имеет схожий план строения гемоцитов.

По количественному составу форменных элементов гемолимфы личинок Oestrus ovis, Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi, Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis, Wohlfahrtia magnifica, имеются достоверные различия. Наиболее высокое содержание гемоцитов в 1 мкл гемолимфы у личинок сем. Hypodermatidae — 7512±252 у Hypoderma bovis, и 6100±272 у Oedemagena tarandi; у личинок Oestrus ovis —

3183±127; у личинок Wohlfahrtia magnifica — 5440±261; у личинок семейства желудочных оводов от 3233 до 4388.

Преобладающим клеточным элементом гемолимфы личинок всех видов оводов являются гранулоциты. Однако, на фоне этой тенденции, процентное содержание гранулоцитов в гемолимфе личинок данных видов различается. Если в гемограмме Oestrus ovis гранулоциты составляют 50,25±4,04%, то в гемограммах Hypoderma bovis и Oedemagena tarandi — 35,48±4t93 % и 38,67±2,47% соответственно; у желудочных оводов содержание гранулоцитов в гемограмме находится в пределах от 62,13±2,43% у Gastrophilus intestinalis и до 70,01± 2,90% у Gastrophilus inermis. У личинок вольфартовой мухи основным типом гемоцитов являются сфероциты, они составляют 67,89±3,21% в гемограмме.

Сфероциты в гемограмме личинок овечьего овода и подкожных оводов крупного рогатого скота и северного оленя составляют 14,28±0,91%, 11,87±1,83 % и 17,83±0,92% соответственно, а в гемограмме желудочных оводов лошадей данный тип клеток отсутствует.

Процент эноцитоидов в гемолимфе личинок подкожных оводов крупного рогатого скота и северного оленя почти в два раза выше, чем в гемолимфе личинок желудочных оводов и овечьего овода. Так, у Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi он составляет соответственно 12,87±0,47% и 11,00±0,24%, а в гемолимфе личинок Oestrus ovis — 5,59±0,29%; Gastrophilus pecorum — 6,46±0,29%, Gastrophilus intestinalis — 6,50±0,37%, Gastrophilus nasalis — 7,17±0,45%, Gastrophilus inermis — 5,84±0,42%.

Общая тенденция, к преимущественному содержанию в гемограмме гемоцитов с внутриклеточными включениями, одинакова у всех видов оводов и вольфартовой мухи. Наши данные о преимущественном содержании гемоцитов с включениями совпадают с данными других авторов ( Кузнецов, 1949; Беляева, 1979; Тыщенко, 1986). Данный факт свидетельствует о значительном накоплении личинками запаса питательных веществ, что является основной задачей личиночной фазы всех насекомых, а оводов в особенности, т. к. для них характерна афагия имаго. Во время развития личинок гемоциты накапливают запасные питательные вещества (Тыщенко, 1976). Вероятно, одной из основных функций гемоцитов с включениями является функция трофическая. (Грунин, 1957, Грунин, 1962).

Чем активнее жизненный цикл насекомого или его стадии, тем активнее меняется комплекс его гемоцитов (Запольских, 1979). За счет размножения и роста гемоцитов без включений происходит обновление всего комплекса клеточных элементов. Главной особенностью прогемоцитов является способность их к митотическому делению и дальнейшей дифференцировке -эти клетки малодиффе-ренцированы и имеют универсальный характер (Климбищук, 1972). Прогемоциты активно участвуют в процессах восстановления состава гемолимфы, и в таких случаях соотношение их резко возрастает. Самое высокое содержание прогемоцитов у личинок семейства подкожных оводов (32% — у подкожника крупного рогатого скота и 38% у подкожника северного оленя), у остальных изученных видов содержание прогемоцитов составляет порядка 20%.

Таким образом, гемолимфа представленных видов личинок миазных мух, имея схожее морфологическое строение гемоцитов, различается в количественном их содержании и в процентном соотношении их морфологических типов. Приведенные характеристики клеток гемолимфы и их количественные соотношения с учетом доверительных интервалов могут служить показателем нормального состояния популяций данных видов.

Следует внести ясность в вопрос о пригодности гемоцитарной формулы для оценки физиологического состояния насекомого. Ряд авторов (Сиротина, Черная, 1965; Берим, Козловская, 1973; Калю-га, 1971; Миселюнене, 1976; Кочетова, 1976; Тыщенко, 1986; Запольских, 1979; Алиева, Черногуз, 1980) рекомендуют ее к применению, оценивая как надежный метод оценки популяций насекомых, тогда как другие (Приставко, 1979) считают, что это не дает убедительных результатов и соотношение между различными типами форменных элементов — зыбкий показатель, так как варьирует чрезвычайно широко. По результатам наших исследований и обобщив литературные данные, можно сказать, что у личинок миазных мух действительно некоторые типы гемоцитов варьируют настолько широко, а в некоторых случаях совсем не обнаруживаются в гемолимфе, что не могут быть использованы как объективный показатель. В то время как прогемоциты, плазмоциты и грану-лоциты изученных нами видов личинок мух, являются обязательными и постоянными клеточными элементами гемолимфы. Поэтому на практике за объективный показатель, при оценке физиологи-

ческого статуса личинок миазных мух с помощью гемоцитарной формулы, следует брать соотношение между процентом гемоцитов без внутриклеточных включений (прогемоциты, плазмоциты) и процентом гемоцитов с включениями (гранулоциты, сфероциты, эно-цитоиды, адипогемоциты).

Возрастные изменения в морфологическом и количественном составе гемоцитов гемолимфы мух, семейств Нурос1егта^с1ае, Оев^с^е, Gastгophilidae, Sarcophagidae

В зависимости от возраста достоверно (Р>0,05) меняется морфологический состав гемолимфы личинок Так у личинок воль-фартовой мухи 1 возраста обнаруживается только два типа клеток: прогемоциты и сфероциты. Тогда как у личинок 2 и 3 возраста присутствуют все четыре типа клеток: прогемоциты, плазмоциты, сфероциты и гранулоциты. Для сфероцитов личинок 1 возраста характерна меньшая степень дифференциации — цитоплазма у них окрашивается интенсивнее и более однородна, значительно меньшее количество включений и их размер.

У личинок овечьего овода наблюдается следующая картина: в первом возрасте в гемолимфе не встречаются адипогемоциты, во втором и третьем возрасте они составляют 8,00±0,86 и 10,17± 0,79 клетки ( исходя из 200 ). Все остальные типы клеток встречаются в каждом возрасте. У личинок подкожных и желудочных оводов все типы форменных элементов присутствуют во всех возрастах.

Общее количество и соотношение форменных элементов гемолимфы личинок меняется в зависимости от их возраста. У всех изученных видов прослеживается четкая тенденция к увеличению количества свободных форменных элементов с возрастом личинки. Процент гемоцитов без включений (прогемоцитов, плаз-моцитов) в гемограмме гемолимфы личинок миазных мух с возрастом уменьшается, а процент гемоцитов с включениями (сфероцитов, адипогемоцитов и гранулоцитов) увеличивается. Процент эноцитоидов остается, примерно, одинаков (разница не достоверна) во всех возрастах.

Например, у личинок первого возраста вольфартовой мухи в 1 мкл гемолимфы находится 3370±71 гемоцита, а во втором и третьем 5930±154 и 7020±201 соответственно. У мух данного вида прослеживается прямая зависимость количества форменных эле-

ментов от возраста личинки. У личинок овечьего овода, подкожного овода крупного рогатого скота, подкожного овода северного оленя, у всех изученных видов семейства желудочных оводов прослеживается аналогичная картина (таблица 1).

Что касается изменений с возрастом соотношения форменных элементов гемолимфы, то у личинок первого возраста всех изученных нами видов преобладающим типом являются прогемоциты, во втором и третьем возрасте количество прогемоцитов соответственно убывает. Прогемоциты являются первоначальной формой гемо-цита о чем говорится у многих авторов (Кузнецов, 1949; Беляева, 1979; Тыщенко, 1986;; Кочетова, 1976; Запольских, 1979). С возрастом они дифференцируются в другие морфологические типы ге-моцитов (плазмоциты, сфероциты, эноцитоиды, гранулоциты, ади-погемоциты), т. е. все другие морфологические типы гемоцитов возникают за счет роста, деления и преобразования прогемоцитов. Этим и объясняется преобладающее их количество у личинок первого возраста. Основной функцией личиночной фазы оводов является накопление как можно большего запаса питательных веществ. Поэтому, у личинок старших возрастов преобладают форменные элементы, содержащие запасные питательные вещества — гранулоциты, сфероциты, адипогемоциты.

Таблица 1

Возрастные изменения в количественном содержании форменных элементов гемолимфы миазных мух

Виды личинок Количество гемоцитов в 1 мкл гемолимфы

Возраст личинок

I II III

Oestrus ovis 2413±341 4521±222 6028±129

Wohlfahrtia magnifica 3370±21 5930±601 7020±36

Hypoderma 2504±86 7800±105 10600±99

bovis

Oedemagena tarandi 3050±56 6250±175 9000+231

Gastrophilus pecorum 2200±64 3600±91 5040±78

Gastrophilus intestinalis 2530±58 4000±74 5400±120

Gastrophilus nasalis 2100±129 3500±245 5800±48

Gastrophilus inermis 3000±189 4100±274 5200±291

Циклические изменения общего количества и соотношения свободных форменных элементов в гемолимфе позволяет судить о некоторых особенностях биологии. Так падение концентрации гемоци-тов — главного компонента защитной системы организма насекомых, приводит к резкому уменьшению резистентности организма (Алиев, Черногуз, 1980). Исходя из этого положения, можно сказать, что личинки мух, изученных видов, наиболее уязвимы в первом возрасте и перед самым окукливанием, а наиболее устойчивы во втором и третьем. Этот вывод, полученный путем сравнения возрастных изменений в гемограмме личинок, совпадает с данными, полученными в результате непосредственного изучения выживаемости личинок мух, паразитирующих на домашних животных. Такие данные встречались в работах Г. С. Сивкова (1975) по овечьему оводу, Н. В. Солопова (1981) по подкожному оводу северного оленя, В. 3. Ямова (1991) по подкожному оводу крупного рогатого скота, В. Н. Домацкого (1987) по вольфартовой мухе.

Установлено, например, что овода в фазе личинки третьего возраста обладают значительными адаптационными свойствами. Так, при содержании личинок северного подкожника на льду в течение 1-2 суток фазы куколки достигало 84,7%, после 3-4 суток экспозиции — 56,6±5,9%, 5-6 суток — 7,2±0,7%, и только после 7 суток отмечалась гибель всех экземпляров (Солопов, 1996). Выпавшие личинки хорошо переносят заморозки и кратковременное затопление — пребывание в воде до 14 часов не причиняет личинкам вреда (Савельев, 1967). К воздействию энтомо-цидных факторов наименее устойчивы личинки первого возраста, поскольку они располагают минимальными резервами пластических и энергитических веществ, необходимых для инактивации ларвицидов (Соломаха, 1981). В момент проникновения личинок через кожу и в первые дни нахождения в теле хозяина 85% личинок гибнет (Дядечко, Ямов, 1966). К числу отложенных подкожным оводом крупного рогатого скота яиц на животное, не обнаруживается больше 20% личинок при вскрытии. По-видимому, основная масса их погибает в первый период жизни после выхода из яиц (Дядечко, Ямов, 1966).

Возрастная структура личинок вольфартовой мухи, вследствие постоянной реинвазии ран, представлена в 70% случаев всеми возрастами. При этом личинки первого возраста составля-

ют 18,4±2,1%, второго — 32,1±2,8% и третьего — 49,5±3,6% от общего количества (Домацкий, 1998).

Таким образом, возрастные изменения форменных элементов личинок миазных мух идут с тенденцией увеличения форменных элементов с внутриклеточными включениями и одновременным снижением содержания гемоцитов без включений, что связано с накоплением личинками в процессе развития питательных веществ. Общее количество свободных форменных элементов в гемолимфе личинок миазных мух с возрастом также возрастает.

Белковые фракции гемолимфы личинок миазных мух (Hypodermatidae, Gastrophilidae)

По результатам исследования белковых фракций гемолимфы личинок семейств Hypodermatidae (Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi), Gastrophilidae (Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis) методом электрофореза на полиакриламидном геле выделяется следующее количество фракций: у Hypoderma bovis 12 зон (12 у личинок второго возраста и 10 у личинок третьего); у Oedemagena tarandi 9 зон у личинок как первого, так и второго возраста; у личинок Gastrophilus pecorum — 12 зон, Gastrophilus intestinalis — 11 (9 у личинок третьего возраста, 11 у личинок второго), Gastrophilus nasalis 5 (пять у личинок второго и четыре у личинок третьего). В ряде зон обнаруживается полиморфизм по элек-трофоретической подвижности и числу фракций.

По электрофоретической картине белковых спектров, изученных видов, прослеживается зависимость: чем ближе между собой виды, тем более схожи между собой их белковые спектры. При сопоставлении спектров белков гемолимфы личинок оводов разных видов, обнаруживается больше сходств между двумя видами подкожных оводов, чем между желудочными и подкожным оводами.

Полиморфизм личинок семейств Hypodermatidae, Gastrophilidae выражается следующими цифрами: Hypoderma bovis — 50,0%; Oedemagena tarandi — 33,3%; Gastrophilus pecorum — 41,6%; Gastrophilus intestinalis — 54,5%; Gastrophilus nasalis — 40,0%. Среди изученных видов наименьший полиморфизм (33,3%) обнаруживается у личинок подкожного овода северного оленя, и не превышает 54,5% (у Gastrophilus intestinalis). В среднем доля

полиморфных локусов составляет 43,9% что согласуется с литературными данными для беспозвоночных животных в целом — 46,9% (Айала, Кайгер, 1988).

По уровню средней гетерозиготности получены следующие данные: Hypoderma bovis — 7,8%; Oedemagena tarandi — 9,68%; Gastrophilus pecorum — 8,54%; Gastrophilus intestinalis — 6,3%; Gastrophilus nasalis — 8,8%. Средняя гетерозиготность на локус понижена у оводов по сравнению со средней гетерозиготностью беспозвоночных животных. Она равна 8,2% против 13,4% (Айала, Кайгер, 1988).

Таким образом, белковые фракции, в разных семействах и у различных видов личинок миазных мух, различаются по элект-рофоретической подвижности и уровню белкового полиморфизма. Различия проявляются ярче у разных семейств, чем у родственных видов.

Биохимический состав гемолимфы личинок мух семейств

Hypodermatidae, Oestridae, Gastrophilidae, Sarcophagidae

Гемолимфа мух семейств Hypodermatidae, Oestridae, Gastrophilidae, Sarcophagidae была исследована по 14 основным показателям: общий белок, глюкоза, гемоглобин, железо, кальций, фосфор, магний, натрий^ калий, мочевина, мочевая кислота, медь, триглицериды, ß-липопротеиды.

У личинок желудочных оводов присутствует гемоглобин: у Gastrophilus intestinalis — 30 г/л; Gastrophilus pecorum — 25 г/л; Gastrophilus nasalis и Gastrophilus inermis — меньше 25 г/л. Из классов липидов у семейства Hypodermatidae обнаружены в плазме триглицериды, в остальных семействах этот класс липидов не фиксируется, ß-липопротеиды характерны для всех представленных видов. Содержание макроэлементов представлено на рис. 1. Из микроэлементов обнаруживаются следовые количества меди у личинок всех видов и следовые количества железа у видов семейств Hypodermatidae, Oestridae, Sarcophagidae; у личинок семейства Gastrophilidae — содержание железа варьирует от 27,94 мкмоль/'л до 31,73 мкмоль/л. Мочевина и мочевая кислота не обнаруживаются в гемолифе личинок Wohlfartia magnifica, у всех остальных видов присутствуют и с возрастом их содержание в гемолимфе достоверно не различается.

Рис. 1. Содержание макроэлементов в гемолимфе личинок вольфартовой мухи, овечьего,

подкожных и желудочных оводов

С возрастом в гемолимфе личинок миазных мух происходит накопление энергетически важных веществ (общего белка, глюкозы, триглицеридов, p-липопротеидов). Так, например, в семействе Hypodermatidae общий белок увеличивается с 2,62 до 4,9 г % у Hypoderma bovis и с 2,04 до 5,23 г % у Oedemagena tarandi. Глюкоза увеличивает содержание в четыре раза (с 2,11 до 8,05 ммол/л у Hypoderma bovis), а триглицериды примерно в семь раз ( с 0,95 до 7,57 ммоль/л). Содержание кальция возрастает к третьему возрасту (до 11,80 мг%) и падает перед окукливанием (до 9,56 мг%), содержание фосфора, наоборот, перед окукливанием повышается (до 8,0 мг%>. у Hypoderma bovis и до 9,01 мг% у Oedemagena tarandi). Количество натрия повышается с возрастом (120,0 мг% в первом возрасте и 272,0 мг% — в третьем), а калия понижается (25,78 мг% и 15,5 мг% соответственно), содержание магния немного повышается к третьему возрасту (до 38,69 мг%). Мочевая кислота и мочевина остаются на одном уровне (43 мкм/л и 14,47 ммоль/л) на протяжении всех возрастов личинок. Во всех остальных семействах возрастная динамика аналогична.

Содержание макроэлементов подчиняется следующей тенденции — Na>Mg>K>Ca, т. е. соответствует соотношению, характерному для насекомых — зоофагов, натриево-калиевый коэффициент выше единицы, что также характерно для насекомых-зоофагов (Тыщенко, 1976).

Таким образом, изменения биохимического состава гемолимфы личинок семейств Oestridae (Oestrus ovis), Hypodermatidae (Hypoderma bovis, Oedemagena tarandi), Gastrophilidae (Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis), Sarcophagidae (Wohlfahrtia magnifica) подчиняются следующей закономерности: с возрастом идет накопление в гемолимфе энергетически важных веществ (глюкоза, общий белок, триглицериды, р-липопротеиды).

ВЫВОДЫ

1. Основными критериями интегрированной тест-системы комплексной оценки физиологического статуса личинок миазных мух являются показатели состояния внутренней среды (гемолимфы): морфология гемоцитов, количественное их содержание, показа-

тели гемоцитарной формулы, биохимического состава, а также электрофоретическая картина белков гемолимфы.

2. Гемолимфа личинок Oestrus ovis содержит прогемоциты, плазмоциты, гранулоциты, сфероциты, адипогемоциты, эноци-тоиды; Hypoderma bovis и Oedemagena tarandi — прогемоциты, плазмоциты, гранулоциты, сфероциты, эноцитоиды; Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis, Gastrophilus nasalis, Gastrophilus inermis— прогемоциты, плазмоциты, гранулоциты, эноцитоиды; Wohlfahrtia magnifica — прогемоциты, плазмоциты, гранулоциты, сфероциты. Морфология прогемо-цитов, эноцитоидов, сфероцитов — типична для всех изученных видов, морфология плазмоцитов, гранулоцитов гетероген-на у разных семейств.

3. Количественный состав форменных элементов ,в 1 мкл гемолимфы следующий: у Oestrus ovis — 3183±127; Hypoderma bovis — 7512±252 и Oedemagena tarandi. — 6100±273; Gastrophilus pecorum— 3233±72; Gastrophilus intestinalis — 4388±173; Gastrophilus nasalis — 3800±73; Gastrophilus inermis — 4100^111; Wohlfahrtia magnifica — 5440±261.

4. Гемограмма личинок всех семейств крайне чувствительна к влиянию внешних и внутренних факторов, что показывает широкое варьирование процентного содержания каждого типа ге-моцитов. При оценке физиологического статуса насекомого с помощью гемоцитарной формулы, за объективный показатель, следует брать соотношение между процентом гемоцитов без внутриклеточных включений (прогемоциты, плазмоциты) и процентом гемоцитов с включениями (гранулоциты, сфероциты, эноцитоиды, адипогемоциты).

5. Качественное и количественное содержание гемоцитов варьирует в зависимости от возраста личинки. Прослеживается достоверная тенденция к уменьшению количества свободных форменных элементов с возрастом личинки, а также четкая тенденция к уменьшению в гемограмме с возрастом гемоцитов без внутриклеточных включений (прогемоцитов, плазмоцитов), и, наоборот, увеличению с возрастом гемоцитов с включениями (сфероцитов, гранулоцитов, адипогемоцитов). Процент эноцитоидов остается примерно одинаков (разница не достоверна) во всех возрастах.

6. С возрастом в гемолимфе личинок миазных мух происходит накопление энергетически важных веществ (глюкозы, общего белка, триглицеридов, р-липопротеидов.). Содержание мочевой кислоты и мочевины не меняется с возрастом. Содержание макроэлементов подчиняется следующей тенденции — Ыа>М£>К>Са, т. е. соответствует соотношению, характерному для насекомых-зоофагов, при натриево-калиевом коэффициенте выше единицы. Обнаруживаются следовые количества меди и железа во всех изученных семействах, кроме семейства ОаБ1;горЬШс1ае, где железо содержится на уровне 30 мкмоль/л.

7. Белковые фракции в разных семействах и у разных видов личинок миазных мух различаются по электрофоретической подвижности и уровню белкового полиморфизма. Различия проявляются ярче у личинок разных семейств, чем у родственных видов. В среднем доля полиморфных локусов согласуется с данными для беспозвоночных животных в целом (43,9% против 46,9%), при понижении средней гетерозиготности на локус (8,2% против 13,4%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе исследований гемолимфы предлагается интегрированная система оценки физиологического статуса личинок миазных мух, как отдельных особей, так и популяций. А так же оценки уровня гетерозиготности и белкового полиморфизма популяций, на основе изучения спектра белковых фракций гемолимфы. Результаты исследований могут быть использованы в практической работе научно-исследовательских учреждений биологического и ветеринарного профилей, а также в процессе обучения студентов биологических и ветеринарных факультетов. Подготовлены методические рекомендации «Морфо-биохимические исследования гемолимфы личинок миазных мух».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лычагин Е. А., Капустина Я. А., Сивков Г. С., Домацкий В. Н. Морфологический состав гемолимфы личинок вольфартовой мухи// Проблемы энтомологии и арахнологии. Тюмень, 1997. Вып. 38. С. 83-87.

2. Капустина Я. А., Сивков Г. С. Качественный и количественный состав форменных элементов гемолимфы личинок овечьего овода // Проблемы энтомологии и арахнологии. Тюмень, 1998. Вып. 39. С. 56-66.

3. Сивков Г. С., Капустина Я. А. Сравнительная характеристике форменных элементов гемолимфы личинок овечьего (Diptera, Oestridae: Oestrus ovis) и подкожного (Diptera, Hypodermatidae: Hypoderma bovis) оводов // Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий / Всерос. конф. Курган, 1998. С. 284-285.

4. Капустина Я. А. Особенности форменных элементов гемолимфы личинок подкожного овода (Diptera, Hypodermatidae: Hypoderma bovis)// Проблемы энтомологии и арахнологии. Тюмень, 1999. Вып. 40. С. 19-32.

5. Капустина Я. А., Жигилева О. Н. Электрофоретический анализ белков гемолимфы личинок: Hypoderma bovis, Gastrophilus pecorum, Gastrophilus intestinalis // Проблемы энтомологии и арахнологии. Тюмень, 1999. Вып. 40. С. 32-37.

6. Капустина Я. А., Лычагин Е. А., Домацкий В. Н. Гемограмма личинок вольфартовой мухи// Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе. М., 1999. С. 245.

7. Сивков Г. С. Капустина Я. А., и др. Ассоциативные инвазии лошадей Тюменской области// Проблемы энтомологии и арахнологии. Тюмень, 1999. Вып. 41. С. 125-130.

8. Сивков Г. С., Домацкий В. Н., Капустина Я. А. Морфологический состав гемолимфы овечьего, подкожного и желудочного оводов // Паразиты и паразитозы. Новосибирск, 1999. С. 74-77.

Соискатель í\ /^ч Я. А. Капустина