Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетический анализ путей и механизмов кариотипической эволюции саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Orthoptera, Acrididae)

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетический анализ путей и механизмов кариотипической эволюции саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Orthoptera, Acrididae)"

На правах рукописи

МОЛ ЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧ ЕСКИЙ АНАЛИЗ ПУТЕЙ II МЕХАНИЗМОВ КАРИОТИПИЧЕСКОЙ ЭВОЛЮЦИИ САРАНЧОВЫХ ПОДСЕМЕЙСТВА СОМРНОСЕШТЧАЕ (ОКТИОРТЕКА, АС1Ш>ШАЕ)

03.02.07-Генетика 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

8 НОЯ 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

005054539

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Федерального бюджетного государственного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск.

Официальные оппоненты:

Научные руководители: Рубцов Николай Борисович,

доктор биологических наук, профессор.

Бугров Александр Геннадьевич,

доктор биологических наук, доцент,

Жданова Наталья Сергеевна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник.

Федеральное бюджетное государственное учреждение науки Инстатут цитологии и генетики СО РАН

Гусаченко Анна Михайловна

кандидат биологических наук, доцент кафедры цитологии и генетики НГУ. Федеральное государственное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет", г. Новосибирск

Федеральное государственное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет", г. Томск

Защита диссертации состоится « L» OE^rSt-Tjaj»- 20 \Q г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, д. 10, тел. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан сJU-iTbZjbX 20 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

Ведущее учреждение:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Саранчовые широко распространены в Голарктике и представляют одну in наиболее богатых по видовому разнообразию таксономических групп в отряде прямокрылых насекомых (Uvarov, 1966; Otte, 1981). Сочетание высокой стабильности кариотипов с интенсивными процессами дивергенции видов делает саранчовых уникальной модельной группой для изучения молекулярных механизмов эволюционных процессов. Базовый тип хромосомного набора у представителей этого семейсгва представлен 23 акроцентрическимн хромосомами у самца и 24 акроцешрическими хромосомами у самки при хромосомном определении пола ХОб'/ХХ? (2rv=22+X0¿/22+XX$). Этот вариант хромосомного набора характерен для большинства видов семейства Acrididae, однако а подсемействе Gomphocerinae описано большое количество видоз, в кариагил которых включает 3 пары крупных мегаценгрических хромосом. Остальные хромосомы, в том числе Х-хромосома, -акроцентризси разной длины (2п=16+Х0с?/16+ХХ?) (Cabrero, Camacho, 1986; Бугров и др., 1991). Предполагается, что такой тип хромосомного набора является производным от исходного 23-хромосомного предкового кариотипа в результате трех цешрических слияний (Robertson, 1916; White, 1973). Об этом может свидетельствовать наличие в подсемействе видов с 23 хромосомами (Santos et al., 1983; Cabrero, Camacho, 19S6; Бугров и др., 1991), а также видов с промежуточным числом хромосом- Chorthippus hammarstroemi (2п=2(Н-Х0с?/ХХ£) и Eremippus sobolevi (2n=18+X0t?/XX$) (Бугров и др., 1993). Считается, что эволюция кариотипов саранчовых проходила с уменьшением числа хромосом за счет робергсоновских слияний (White, 1973; Hewitt, 1979), поэтому можно предположить, что подсемейство Gomphocerinae является кариотииически наиболее продвинутым таксоном в семействе Acrididae.

Несмотря на богэтую историю сравнительных кариологических исследований саранчовых, возможности линейной дифференциации хромосом саранчовых нракгически отсуствовали. Длительное время цитогенегики были ограничены методами рутинного и С-дифферетшального окрашивания хромосом, что затрудняло выяснение путей и механизмов кариогипической эволюции саранчовых. До сих пор стоит вопрос, является ли наблюдаемая стабильность кариотипов следствием малого количества изменений в геноме группы, либо она является результатом ограниченных возможностей использованных методов.

Другой отличительной особенностью саранчовых является то, что они обладают самыми большими по размеру геномами среди насекомых. Размер гепомов саранчовых варьируег от 6000 до 20000 миллионов пар нуклеотидов (Bensasson et aL, 2001). Большинство работ по изучению организации ютомов эукариот было выполнено на видах с геномами небольших или средних размеров. Хромосомная организация крупных геномоз остается слабо изученной. Основная часть генома эукариот представлена повторенными последовательностями ДНК. Состав и распределение повторенных последовательностей в геномах саранчовых остаются практически неизученными. Одним из типов повторенных последовательностей являются

кластерированные повторы, которые образуют С-позитивные блоки и играк значительную роль в структурно-функциональной организацш! генома. Как был покачано ранее, эти блоки проявляют высокую внутри- и межвидовую изменчивость п размеру и локализации, однако у саранчовых данных по молекулярному составу эти блоков и темпам их изменчивости крайне мало.

Методы молекулярной цитогенегики позволяют решать вопросы, связанные эволюционной трансформацией хромосомных наборов. Эти методы успешн применяются в исследованиях ряда таксонов позвоночных (Ferguson-Smith, Trifono 2007), растений (Schubert et а!., 2001) и насекомых (Panzera et al., 2010). Они был частично адаптированы и использованы также для исследований хромосом саранчовы (Lopez-Leon et al., 1995, 1999; Lopez-Fernandes et al., 2004; Cabrero et al., 1997; Cabrero i al., 2003a,b; Bugrov et al., 2003, 2004, 2007). Однако их применение ограничивалос лишь небольшим набором видов и последовательностей ДНК. Большинство виде подсемейства Gomphocerinae остались за рамками этих исследований. Апаш: локализации молекулярно-цитогенетических маркеров в хромосомах саранчовы подсемейства Gomphocerinae позволило по-новому взглянугь на вопрос! кариоггипической эволюции не только в пределах этого таксона, но и всего семейств настоящих саранчовых (Acrididae) в целом. Изучение молекулярной композиции С позитивных блоков у саранчовых подсемейства Gomphocerinae представляет собо значительный вклад в понимание организацш! и эволюции геномов саранчовых позволило лучше понять общие принципы организации больших по размеру генома эукариог.

Цель настоящего исследования: описать распределение повторенны последовательностей ДИК в хромосомах видов подсемейства Gomphocerinae и оценит их возможную роль в кариотишмеской эволюции саранчовых.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Дать детальное описание кариотипов видов подсемейства Gomphocerinae используя С-дифференциальное окрашивание митотических хромосом и эмбриональных клеток изучаемых видов.

2. Провести сравнительный анализ локализации кластеров повторешгы последовательностей гомологичных рибосомальной и теломерной ДНК в хромосома ряда видов подсемейства Gomphocerinae.

3. Провести оценку уровня гомологии ДНК С-позитивных районов близки видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae.

Научная новизна. Впервые описаны особенности локализации С-позитивпы блоков в митотических хромосомах 15 видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae.

Впервые определена локализация кластеров рибосомных и теломерных повторе в митотических хромосомах 13 ранее не изученных видов саранчовых.

Впервые было показано наличие субблоков, различающихся обогащенностьь различными повторенными последовательностями ДНК, в прицмгтромерных С позитивных блоках хромосом S. scalaris и A. sibiricus.

Практическая ценность. Полученные данные являются весомым вкладом в изучение кариотипического разнообразия видов саранчовых и дают новую информацию об организации их геномов. Особенности локализации ряда кластеров рДНК позволяют использовать их в качестве маркеров гомеологичных хромосом у близких видов. Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе. Полученные ДНК-библиотеки будут служить основой для дальнейшего изучения повторенных последовательностей, локализующихся в прицентромерных районах разных видов, что позволит лучше попять механизмы эволюционных процессов. Положения, выносимые на защиту.

Крупные прицентромерные С-позитивные блоки хромосом саранчовых могут состоят из субблоков, отличающихся по молекулярному составу. Различия в размере и комбинации таких субблоков обуславливают хромосомо-специфичную организацию прицентромерных районов хромосом близких видов саранчовых

Наличие интерстициальных теломерных сайтов не характерно для саранчовых подсемейства Gomphocerinae

Апробация. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2005, 2007; XII съезд Русского энтомологического общества, Краснодар, 2007; Отчетная конференция, посвященная памяти академика Ю.П. Алтухова, Москва, 2008; 17th International Chromosome Conference 2009. Boone, 2009; Международная конференция KARYO V, Новосибирск, 2010; 18 International Chromosome Conference 2011, Manchester, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов.

Личный вклад автора. Вся работа была выполнена автором самостоятельно либо при его непосредственном участии. Помощь в проведении FISH и приготовлении микродиссекционных ДНК зондов оказывали Карамышева Т.В. и Рубцов Н.Б.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список использованной литературы (168 источников). Работа изложена на 122 страницах, содержит 8 рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Самцы и самки 15 видов саранчовых были отловлены в полевые сезоны 2006-2011 на территории Российской Федерации и Республики Казахстан.

Приготовление препаратов, проведение С-дифференциальной окраски хромосом и флуоресцентной гибридизации in situ. Препараты хромосом были приготовлены по методике, описанной в статье Бугрова с соавторами (Bugrov et al., 2003). С-дифференциальную окраску проводили в соответствии с классическим

протоколом Самнера (Sumner, 1972). Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) проводилась по стандартной методике, (Rubtsov et al., 2000, 2002). В качестве зонда для выявления кластеров рибосомных генов были использованы фрагмент гена 18s рДНК человека, клонированный в плазмиде pHrl3 (Malygin, 1992), и фрагменты гена 18s rDNA саранчовых, амплифицированные в ПЦР со специфичными праймерами (табл. 1).

Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных для амплификации фрагментов рибосомных генов.

Название Последовательность Размер продукта

18S-lf 5'-ATGGTTCCTTAGATCGTACCC-3' 741 п.н.

18S-lr 5'-TTGTCAAAGTAAACGTGC-3'

18S-2f 5-GCATGGAATAATGGAATAGGAC-3' 667 п.н.

18S-2r 5'-AGAACATCTAAGGGCATCAC-3'

18S-3f 5'-TGATAGCTCTTTCTTGATTCGG-3' 506 п.н.

18S-3r 5'-AGTTTGGTCATCTTTCCGGT-3'

28S-2f 5'-TGGAGCAATTTCACGACCCGTC-3' 600 п.н

28S-2r 5'-GCGTTTGGTTCATCCCACAG-3'

28S-3f 5'-TGAACCAAACGCCGAGTTAAGG-3' 650 п.н

28S-3r 5-ATTCCAGGGAACTCGAACGCTC-3'

28S-4f 5'-TTCTGCATGAGCGTTCGAGTTC-3' 700 п.н.

28S-4r 5-TGGGCAGAAATCACATTGCGTC-3'

В качестве зонда, для выявления теломерных повторов использовался продукт нематричной ПЦР с праймерами 5'-ТААССТААССТААССТААСС-3' и 5'-TTAGGTTAGGTTAGGTTAGG-3' ,(Ijdo et al., 1991; Sahara et al., 1999).

Получение микродиссекционных ДНК-проб. Приготовление микродиссекционных ДНК-проб проводилось по стандартному протоколу (Rubtsov et al., 2000). Амплификация библиотек проводилась в ПЦР с частично вырожденным праймером 6MW (Telenius et al., 1992) в два этапа. На первом этапе проводили 8 низкотемпературных циклов с ферментом Sequenase Version 2.0. После чего проводили 33 высокотемпературных цикла с AmpliTaq Stoffel Fragment ДНК полимеразой (Rubtsov et al., 2000).

Мечение проводили введением в ДНК дигоксигенина,или биотина в дополнительных циклах ПЦР. Детекция ДНК-проб осуществлялась с помощью овечьих антител к дигоксигенину, конъюгированных с родамином, и авидина, конъюгированного с FITC. Общая окраска ДНК осуществлялась красителем DAPI.

Микроскопический 'анализ. Результаты С-дифференциальной окраски анализировались на микроскопе Axioplan 2 Plus (Carl Zeiss, Германия), оборудованном CCD-камерой AxioCam HRcr (Carl Zeiss, Германия) и программой AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Результаты FISH визуализировали с помощью люминесцентного микроскопа Axioplan 2 Plus (Carl Zeiss, Германия), оборудованном CCD-камерой (CV МЗОО, JAI) и пакетом обработки изображений ISIS4 (MetaSystems GmbH, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика кариотипов и особенности локализации С-позитивных блоков. У исследованных видов было обнаружено 4 типа хромосомных наборов: 2n=14+neo-Xneo-YáVneo-XneoX?, 2n=16+X0áVXXy, 2п=20+Х0с?/ХХ9 и 2п=22+Х0с?/ХХ$. У 23-хромосомных видов кариотип состоял из акроцентрических хромосом: 2 пары крупных хромосом (LI, L2), 6 пар хромосом среднего размерного класса (МЗ-М8) 3 пары мелких хромосом (S9-S11) и Х-хромосомы - самой крупной из хромосом среднего размерного класса Остальные хромосомные наборы представляли собой результат одной, трех или четырех центрических слияний. Использование митотических хромосом из эмбрионов саранчовых позволило выявить более тонкую организацию гетерохроматиновых блоков. Для видов Omocestus viridulus, Mesasippus kozhevnikovi, Stauroderus scalaris, Chorthippus jacobsoni, Chorthippus intermedius, Chorthippus hammarshtroemi, Chorthippus albomarginatus были выявлены интеркалярные блоки, которые ранее не были описаны при анализе мейотических хромосом (Santos et al., 1983; Gosalvez et al., 1997; Cabrero, Camacho, 1986; Бугров и др., 1991).

Результаты С-дифференциальной окраски представлены в таблице 2. Выявленные С-позитивные районы относились к трем типам. Первый тип -прицентромерный гетерохроматин. Они присутствует у всех видов, но их размеры варьируются от очень небольшого, как у Podismopsis altaica, до большого, например, очень крупные блоки, составляющие почти треть хромосомы у S. scalais (Рис. 1 а, б). Крупные гетерохроматиновые блоки могут содержать в себе небольшие участки С-негативного материала. Это было показано для Aeropus sibiricus (Рис. 1 в) и М. kozhevnikovi, Однако не все крупные С-позитивные блоки содержат С-негативный материал. Примером таких блоков являются крупные С-позитивные районы S.scalaris (Рис. 1 б).

Второй тип - интеркалярные С-позитивные районы. Они наблюдались как в двуплечих, так и в акроцентрических хромосомах. Как видно из таблицы 2, в двуплечих хромосомах они чаще всего локализовались в проксимальной части хромосом L2 и L3. В акроцентрических хромосомах интерстициальные С-позитивные блоки обычно располагались в середине хромосомы либо в ее проксимальной части. В большинстве случаев в одной хромосоме наблюдался один интеркалярный С-позитивный блок, и только у Chorthippus karatavicus и Ch. hammarstroemi было больше одного блока (Рис. 1 г, д). У А. sibiricus и М. kozevnikovi в хромосомах на ранней стадии конденсации прицентромерные блоки состоят из набора мелких блоков, отделенных узкими С-негативными участками (Рис. 1 в), что может быть объяснено тем, что в зависимости от степени конденсации хромосом интеркалярные гетерохроматиновые блоки могут сливаться с прицентромерными в один более крупный прицентромерный, что лучше видно на митотических хромосомах.

Третий тип - теломерный гетерохроматин был обнаружен только у 5 видов. В хромосомах видов с кариотипом 2n=16+X0¿VXX$ блоки локализовались

Рисунок 1. С-дифференциальная окраска метафазных хромосом саранчовых подсемейства Gomphocerinae. Цифрами указаны номера хромосом, а - Р. altaica,, б - S. scalaris, стрелкой указан полиморфный С-позитивный блок, в - прометафазные хромосомы A. sibiricus, стрелки указывают на С-негативные блоки внутри прицентромерных С-позитивных блоков, г — СИ karalavicus, большие черные стрелки указывают на полиморфный С-позитивный блок, большие серые стрелки указывают на теломерные С-позитивные блоки на субметадентрической хромосоме, стрелки указывают на интеркалярные С-позитивные блоки, д - СИ. hammarstroemmi, стрелками указаны интеркалярные С-позитивные блоки, е —М. kozHevnikovi, стрелкой указаны хромосомы с полиморфным теломерным С-позитивным блоком, с - S. eurasius, стрелокой указаны половые хромосомы, ж — СИ. albomarginatus стрелки указывают на интеркалярные С-позитивные блоки, большие стрелки указывают на теломерные С-позитивные блоки, з— A. fusca.

преимущественно в акроцентрических хромосомах. Только у Ch. karatavicus теломерные С-позитивные блоки были обнаружены в коротком плече двуплечей хромосомы L3 (Рис. 1 г). Часто теломерные С-позитивные блоки в коротких хромосомах являлись полиморфными (Табл. 1).

Таким образом, на материале митотических хромосом из эмбрионов саранчовых удалось не только выявить те же гетерохроматиновые блоки, которые выявляются на мейотических хромосомах, но и получить дополнительную информацию о мелких и располагающихся рядом друг с другом С-позитивных блоках.

6

Таблица 2. Локализация С-позитивных районов, кластеров теломерных повторов и рибосомной ДНК в хромосомах саранчовых подсемейства (ЗотрИосегтае.

Трибы Виды NF 2n SD С-позитивные блоки FISH

Cen Int Tel Telomeric DNA 18s rDNA

Gomphocerini Aeropus sibiricus 23 17 XO 1-8, X - - Ail ter; int 6 Cen 1-8, X

Arcypterini Arcyptera fusca 23 23 XO 1-11,X 3,5,11» 2,5-10 Aliter Int 3,5

Gomphocerini Chorthippus albomarginatus 23 17 XO 1-8, X lq*, 2p, 3p**, 5 5,8 Aliter Int 2p, 3p*

Gomphocerini Chorthippus apricarius 23 17 XO 1-8, X 2p, 3p** - Aliter Int 2p, 3p*

Gomphocerini Chorthippus biguttulus 23 17 XO 1-8, X 2p, 3p, 4,5 7,8 Aliter Int 2p, 3p*; cenX

Gomphocerini Chorthippus hammarstroemi 23 21 XO 1-10, X lp, 5,X 9 Aliter Int lp, 5

Gomphocerini Chorthippus intermedius 23 17 XO 1-8,X 2p, 3p, 4 - AU ter Int 2p, 3p*; cenX

Gomphocerini Chorthippus jacobsoni 23 17 XO 1-8, X 2p, 3p* - Aliter; cen (1,2,3) Int 2p,3p

Gomphocerini Chorthippus karatavicus 23 17 XO 1-8, X 4,5,6, X 3p, 4-8,7* AU ter Cen 2p, tel 3p

Gomphocerini Gomphocerippus rufus 23 17 XO 1-8, X 2,3**,5 7,8 AU ter Int 2; cen 2,3,X, 4,5

Gomphocerini Mesasippus kozhevnikovi 23 23 XO 1-11,X 5,6 11 AU ter Int 5,6

Stenobothrini Omocestus viridulus 23 17 XO 1-8, X 3p, lq - Aliter Int3q

Chiysochroantini Podismopsis altaica 23 17 XO 1-8, X 5 - Aliter Int 2p, 3q, 5

Gomphocerini Stauroderus scalaris 23 17 XO 1-8, X lq* - Aliter Cen 1-8, X, int 3p**

Stenobothrini Stenobothrus eurasius 23 16 XY 1-7,X, Y 3p - Aliter CenX

NF - число хромосомных плеч, 2п - число хромосом, S.D. - система определения пола, Сеп - прицентромерный, Int-интеркалярный, Tel - теломерный, Тег -терминальный; 1-11 - номера хромосом, р - короткое плечо хромосомы, q - длинное плечо хромосомы, * — обнаружено не у всех особей, ** - размеры различаются между особями,- - не обнаружено.

Локализация рибосомной ДНК. Результаты локализации кластеров рибосомной ДНК (рДНК) представлены в таблице 2. Сравнительный анализ распределения районов локализации рДНК у саранчовых показал, что в трибе Gomphocerini было выявлено 2 типа локализации рДНК: первый тип - проксимальный интеркалярный гетерохроматин субмегацентрических хромосом L2, L3 у 17-хромосомных видов и реже прицентромерный гетерохроматин Х-хромосомы (Рис. 2 г); второй тип локализации — прицентромерный гетерохроматин всех хромосом (Рис. 2 а, в). В трибе Gomphocerini большое число видов имеют кариотип 2п=16+Х0с?/ХХ$, однако также имеются виды с кариотипами 2п=22+Х0с?/ХХ$, 2п=2()+Х0с$7ХХ $ и 2п=18+Х0с?/ХХ$. Среди изученных видов у Ch. hammarstroemmi (Рис. 2 е) и М. kozhevnikovi (Рис. 2 д) хромосомные наборы состояли из 21 и 23 хромосом, соответственно, и у них было выявлено по два сайта локализации рДНК. У 23-хромосомного М. kozhevnikovi кластеры рДНК локализованы в интеркалярных гетерохроматиновых блоках акроцентрических хромосом среднего размера. У 21-хромосомного Ch. hammarstroemi один кластер рДНК был локализован в проксимальном С-позитивном блоке акроцентрической хромосомы среднего размера, а второй в проксимальном интеркалярном С-позитивном блоке короткого плеча субметацентрической хромосомы. У 17-хромосомных видов рДНК локализуется в коротких плечах двуплечих хромосом.

Таким образом, в трибе Gomphocerini рибосомные кластеры, вероятно, маркируют гомеологичные хромосомы, которые участвовали в робертсоновских слияниях, сформировавших 17-хромосомный кариотип. У Ch. intermedins (Рис. 2 ё) и Ch. karatavicus места локализации кластеров рДНК находились в гомеологичных плечах метацентрических хромосом, но у Ch. intermedins кластеры рДНК помимо интеркалярного С-позитивного блока в хромосоме L2 локализовались и в прицентромерных С-позитивных районах хромосом L2 и L3. У Ch. karatavicus один из кластеров рДНК присутствовал в прицентромерном С-позитивном блоке хромосомы L2, а второй - в теломерном С-позитивном блоке хромосомы L3. Возможно, у данных видов произошла парацентрическая инверсия, которая переместила кластер рДНК в новое место.

Второй тип локализации рДНК, который наблюдался у A. sibiricus (Рис. 2 а) и S. scalaris (Рис. 2 в), вероятно, является производным от первого, о чем может свидетельствовать наличие рДНК в некоторых прицентромерных районах хромосом Gomphocerippus rufns (Рис. 2 б). Можно предположить, что кариотип G. rufus, представляет собой переходный между кариотипами видов с первым типом распределения и вторым типом распределения рДНК. Скорей всего, существует больше видов со вторым типом распределения рДНК.

Несмотря на большое число выявленных мест локализации рДНК, активных ЛОР у этих видов было обнаружено от 1 до 3. Лопез-Леон с соавторами (Lopez-Leon et al.,1999) отмечают, что в геноме S. scalaris присутствует огромное количество

* « * ■

Рисунок 2 Флуоресцентная гибридизация in situ 18S рДНК-пробы (зеленый) и теломерной ДНК-пробы (красный) с метафазными хромосомами (синий) саранчовых подсемейства Gomphocerinae. Буквами и цирами обозначены размерный класс и номера хромосом, a -Aeropus sibiricws, б - Gomphocerippus rufus, в - Stauroderus scalaris, г - Chorthippus jacobsoni, д - Mezasippus kozhevnikovi, e - Chorthippus hammarshlroemi, ё - Chorthippus imermedius, ж - Aeropus sibiricus. Стрелками указана локализация теломерный повторов в хромосоме Мб, з - Chorthippus jacobsoni. Стрелками указано положение рибосомной ДНК в хромосоме L2, головками стрелок указано положение центромеры.

неактивных рибосомиых генов. Испанские исследователи в цитированной выше работе предполагают, что выявленные кластеры рибосомных повторов в хромосомах 5. хссйаг 'т являются молчащими копиями генов. Однако с уверенностью говорить о том, что это целые гены нельзя. Можно предположить, что обилие рДНК объясняется присутствием нефункционирующих фрагментов рибосомных генов.

Локализация рДНК часто сильно отличается у разных видов, что свидетельствует о высокой мобильности указанных кластеров в ходе кариотипической эволюции. Одним из перемещающих механизмов могут являться хромосомные

структурные перестройки, такие как инверсии, транслокации, слияния и разделения хромосом. В данном случае кластеры рДНК представляют собой хорошие молекулярные маркеры, позволяющие выявить пути преобразования кариотипов в ходе эволюционного процесса. Однако в некоторых случаях кластеры рДНК изменяют свою локализацию без видимых структурных изменений кариотипов. Есть несколько точек зрения на подобную мобильность кластеров рДНК. Одна из них - активность мобильных элементов, которые при транспозиции переносят либо копии рибосомных генов, либо фрагменты этих генов в новое место. Согласно другой гипотезе копии рибосомных генов сами обладают потенциалом к транспозициям (Schubert, 1984; Schubert, Wobus, 1985). При любом варианте транспозиции рДНК не может быть использована в качестве адекватного маркера хромосомных перестроек, поэтому для сравнительных цитогенетических исследований необходимо использовать дополнительные молекулярные маркеры.

Локализация теломерных повторов. ITS могут служить хорошими молекулярными маркерами реорганизации хромосом, так как часто они находятся в горячих точках хромосомных перестроек. У изученных видов основным местом локализации теломерных повторов являлись концы хромосом (Табл. 2, Рис. 2). Уровень полиморфизма по количеству теломерных повторов в терминальных районах хромосом внутри вида очень высок и не позволяет оценить характерные для отдельных плеч размеры кластеров этих повторов.

ITS ранее были описаны у 11 видов саранчовых, из которых 7 принадлежало подсемейству Gomphocerinae (Lopez-Fernandez et al., 2004). В настоящей работе были изучены два вида - A. fusca и S. scalaris, для которых в цитированной работе были обнаружены ITS. Локализация теломерных повторов у остальных видов ранее не изучалась. Несмотря на то, что у A. fusca и S. scalaris испанскими исследователями были обнаружены ITS, нам не удалось их обнаружить в хромосомах особей наших популяций. У всех исследованных в данной работе видов кластеры теломерных повторов были выявлены на концах всех хромосом. Различия в результатах между данной работой и работой испанских коллег могут быть вызваны несколькими причинами. Во-первых, ITS, описанные ранее, могут являться специфичными для испанских популяций. Во-вторых, может существовать гетерогенность по размеру ITS. Количество теломерных повторов в ITS хромосомах изученных популяций могло быть недостаточным для выявления этих последовательностей с помощью FISH. В-третьих, распластанные препараты митотических хромосом отличаются от давленых препаратов мейогических хромосом. При раздавливании материал семенников образует относительно толстый слой, и хромосомы часто лежат в окружении постороннего материала, который может являться источником неспецифического сигнала при FISH.

Из всех изученных видов ITS были выявлены только у двух видов. У A. sibiricus выявленный кластер локализовался в середине Мб хромосомы (Рис. 2 ж). Кластер присутствовал у части исследованных образцов. У гетерозиготных особей гибридизационный сигнал на конце длинного плеча хромосомы, несущей

интерстициальный кластер, был слабее, чем на гомологе, не несущем этот кластер. Данный ITS, скорее всего, является результатом парацентрической инверсии в Мб хромосоме A. sibiricas, которая перенесла часть кластера теломерных повторов в середину хромосомы. Другим видом, у которого были обнаружены ITS, является эндемик гор северного Тянь-Шаня Ch. jacobsoni (Рис. 2 г). Эти теломерные повторы присутствуют во всем С-позитивном материале прицентромерных блоков двуплечих хромосом, однако удельная интенсивность флуоресцентного сигнала в этих блоках ниже, чем в терминальных районах. Можно предположить, что слияние предковых хромосом произошло с сохранением ITS, затем в ходе эволюции молекулярной композиции прицентромерных С-позитивных блоков двуплечих аутосом произошло перемешивание теломерных повторов с другими типами повторенных последовательностей. У других видов с 17 хромосомами теломерных повторов в прицентромерном районе двуплечих хромосом обнаружено не было. С одной стороны, слияния хромосом в указанных видах могли идти с потерей теломерных повторов, с другой стороны, теломерные повторы могли быть элиминированы в процессе эволюции.

У вида Ch. jacobsini была обнаружена перестроенная хромосома L2 в гетерозиготном состоянии. Из 41 исследованного эмбриона данная перестройка была обнаружена только у одного. Перестроенная хромосома является субметацептрической, в то время как исходная хромосома - метацентрическая. Общая длина перестроенной хромосомы меньше длины исходной хромосомы примерно на 7% (Рис. 2 з). Кластер рДНК находится в ее длинном плече, тогда как в не перестроенном гомологе - он локализован в коротком.

Таким образом, использованные в данной работе молекулярные маркеры позволили установить гомеологичные хромосомы, участвовавшие в робертсоновских слияниях, которые сформировали 17-хромосомный кариотип. Благодаря использованию этих маркеров, удалось получить свидетельства происходящих в кариотипах саранчовых хромосомных перестроек и предположить, что парацентрические инверсии являются не редким событием в кариотипической эволюции саранчовых. Однако для подтверждения этой гипотезы необходимо привлечь дополнительные маркеры, такие как, эволюционно консервативные гены гистоновых белков, 5S рРНК или анонимные клонированные последовательности.

Распределение повторенных последовательностей из прицентромерных С-позитивных районов хромосом саранчовых. Состав ДНК прицентромерных С-позитивных районов у саранчовых сильно различается даже между таксономически близкими видами. Приготовленная из прицентромерного района аутосомы Ch. apricarius микродиссекционная ДНК-библиотека (САР-cen ДНК-библиотека) гибридизовалась с прицентромерными районами всех хромосом этого вида (Рис. 3 а). Однако при гибридизации in situ пробы с хромосомами близких видов - Ch. albomarginatus, Ch. karataviciis и S. scalaris флуоресцентный сигнал выявлялся в

Рисунок 3. Флуоресцентная гибридизация САР-cen ДНК-пробы с хромосомами близких видов: а -

СИ. apricarius; б -S. scalaris; в Ch. albomarginatus; г СИ. karatavicus.

эухроматине, в то время как С-позитивные районы, в том числе и непосредственно прицентромерные районы, оставались не мечеными (Рис. 3 б-г). При кросс-гибридизации С-негативный материал давал гораздо более сильный сигнал, чем С-позитивный. из-за обилия диспергированных повторов в эухроматиновых районах, которые, по-видимому, более эволюционно консервативны, чем повторенные последовательности С-позитивных блоков. Не исключено, что в С-позитивных районах имеются гомологичные последовательности, но количество этих последовательностей недостаточно, чтобы быть обнаруженными с помощью FISH.

Особенной оказалась организация очень крупных С-позитивных блоков. При гибридизации ДНК-библиотеки, полученной из Х-хромосомы А. sibiricus, (ASI-X ДНК-библиотека) с хромосомами А. sibiricus флуоресцентный сигнал наблюдался в периферических частях прицентромерных С-позитивных районов всех акроцентрических хромосом и в дистальной части прицентромерного блока короткого

Рисунок 4. Гибридизация микродиссекционных ДНК-библиотек из прицентромерных районов X-хромосом. a A. sibiricus, зеленый - ASI-X ДНК-библиотека, красный - теломерная ДНК-проба, б -А. sibiricus, зеленый - 18s рДНК-проба, красный - ASI-X ДНК-проба, в - S. scalaris, зеленый - 18s рДНК-проба, красный - SSC-X ДНК-проба.

плеча субметацентрической хромосомы L3 (Рис. 4 а). Гибридизационный сигнал наблюдался и в интерстициальных районах X, М4 и в коротком плече хромосом Ь2.Слабый сигнал наблюдался и в терминальных районах длинного плеча хромосом L1, М4, Мб и X. Фоновый флуоресцентный сигнал наблюдался во всех эухроматиновых районах. Несмотря на то, что в хромосомах LI и L2 имеются крупные прицентромерные С-позитивые блоки, гомологии с ASI-X ДНК-пробой обнаружено не было. При совместной гибридизации 18S рДНК-пробы и ASI-X ДНК-пробы с хромосомами A. sibiricus часть прицентромерного блока, не дававшая гибридизационного сигнала с ASI-X ДНК-пробой гибридизовалась с 18S рДНК-пробой (Рис. 4 6).

Микродиссекционная ДНК-библиотека SSC-X, полученная из прицентромерного С-позитивного блока S. scalaris, давала гибридизационный сигнал по всей длине всех хромосом, но в районах прицентромерного гетерохроматина сигнал был значительно сильнее. При совместной гибридизации SSC-X ДНК-пробы и 18s рДНК-пробы было показано, что большая часть сигнала от микродиссекционной ДНК-пробы колокализуется с рибосомной ДНК в центральной части гетерохроматиновых блоков всех хромосом (Рис. 4 в). Однако сигнал от микродиссекционной пробы наблюдался и в периферических частях гетерохроматиновых блоков, не несущих рибосомные повторы. Были обнаружены части С-позитивных блоков, в которых не были выявлены

последовательности гомологичные последовательностям из использованных ДНК-библиотек. Наличие интенсивных сигналов в терминальном районе короткого плеча хромосомы Ь2, в дистальных терминальных районах хромосом М5 и Мб и в дистальной части хромосомы Мб свидетельствует о присутствии в эухроматине крупных кластеров повторенных последовательностей, гомологичных последовательностям из ББС-Х ДНК-библиотеки. Кроме кластеров повторенных последовательностей в эухроматиновой части хромосом присутствовали диспергированные повторенные последовательности.

Крупные гетерохроматиновые блоки не являются гомогенными по молекулярному составу. Например, у А. ягЫпсш прицентромерный гетерохроматин состоит из трех зон: зоны рДНК, зоны повторенных последовательностей гетерохроматина и промежуточной зоны, где происходит взаимное проникновение этих двух типов повторов. Как было показано на хромосомах других видов, в прицентромерных районах новые повторы при амплификации смещают старые на периферию гетерохроматинового блока (НеткоГГ, 2002). Возможно, встроившиеся в прицентромерный район повторы рДНК в результате активной амплификации сместили на периферию блока повторы, населявшие эти районы до инсерции повторов рДНК. Отсутствие в хромосомах 1Л, Ь2 повторов, гомологичных повторам из микродиссекционной ДНК-пробы говорит о том, что в метацентрических и акроцентрических хромосомах эволюция прицентромерных повторов идет по-разному. Вероятно, в результате слияния прицентромерный гетерохроматин эволюционировал независимо от прицентромерного гетерохроматина акроцентрических хромосом. Амплификация рДНК и различных повторенных последовательностей в С-позитивном районе двуплечих хромосом сопровождалась элиминацией повторенных последовательностей, гомологичных последовательностям из акроцентрических хромосом, что привело к вытеснению этих повторов. Другим механизмом дивергенции состава прицентромерных блоков могла быть амплификация новых повторенных последовательностей в акроцентрических хромосомах. Выявленный в прицентромерном районе хромосомы ЬЗ район, содержащий повторенные последовательности, характерные для акроцентрических хромосом, свидетельствует о том, что слияние предковых хромосом, давших хромосому ЬЗ, произошло позднее. Стоит отметить, что некоторые типы повторов, присутствующие в прицентромерном С-позитивном блоке, также кластеризуются в С-негативных районах хромосом. К сожалению, пока не ясно, что представляют собой эти повторы. Это могут быть как мобильные элементы, так и сателлитные повторы. Дальнейшее секвенирование ДНК-,микродиссекционной ДНК библиотеки -,позволит выяснить природу этих повторов.

Молекулярный состав прицентромерных С-позитивных блоков сильно различается у близких видов. Более того, молекулярный состав С-позитивных районов разных хромосом в кариотипе одного вида может также сильно различаться, что свидетельствует о быстрой эволюции прицентромерного гетерохроматина. Не

исключено, что такая дивергенция гетерохроматиновых районов могла стать причиной репродуктивной изоляции видов на раннем этапе видообразования.

ВЫВОДЫ

1. На высоком уровне разрешения описано распределение С-позитивных блоков в митотических хромосомах из нейробластов эмбрионов. Выявлена внутренняя ранее не известная организация С-позитивных районов в кариотипе ряда видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae. Показано, что прицентромерные С-позитивные блоки А. stbiricus и M. kozhevnikovi состоят из более мелких С-позитивных блоков, разделенных узкими участками С-негативного хроматина. Впервые были выявлены и описаны короткие эухромагановые плечи Х-хромосом у P. poppiusi и Ch. hammarshtroemi.

2. У всех исследованных видов кластеры теломерных пенгамеров (TTAGG)„ локализуются в терминальных районах хромосом. Наличие ITS не характерно для изученных видов. ITS, обнаруженный в акроцентрической Мб хромосоме A. sibiricus, вероятно, является результатом парацентрической инверсии.

3. Выявлены два типа распределения кластеров рДНК в хромосомах саранчовых трибы Gomphocerini. Особенности локализации ряда кластеров рДНК позволяют использовать их в качестве маркеров гомеологичных хромосом у близких видов.

4. Даже у близких видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae прицентромерные С-позитивные блоки сильно различаются по молекулярному составу, что свидетельствует о высокой скорости эволюции ДНК этих районов. Показано, что прицентромерные гетерохроматиновые блоки, гомогенные при С-дифференциальном окрашивании, метут состоять из нескольких субблоков, обогащенных различными повторешгыми последовательностями ДНК.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Джстыбаев И. Е., Карамышева Т.В., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Кросс-гибридизация повторенных последовательностей ДНК прицентромерного гетерохроматина Chorthippus apricarius (I..) с хромосомами саранчовых трибы Gomphocerini. // Евразиатский энтомологический журнал, 2010, Т. 9, №3 стр. 433-436

2. Дзюбенко В.В., Бугров А.Г., Джстыбаев И.Е., Рубцов I I.K. Добавочные хромосомы как маркёры формирования популяционной структуры плавучей кобылки Eyprepocmmis plorans Charpantier, 1825 (Orthoptera, Acrididae) //Евразиатский энтомологический журнал, 2010, T. 9, №3 стр. 437-440

3. Jetyhayev I.E., Bugrov A.G., Karamysheva T.V., Camacho J.P.M., Rubtsov N.B. Chromosomal localization of ribosoma! and telomeric DNA provides new insights on the evolution of Gomphocerinae grasshoppers // Cytogenetic and genome research, 2012 (D01:10.1159/000341571)

4. Дхсетыбасв U.E. Цитогенетические особенности популяции бурого конька Chorthippus apricarius (L.) (Orthoptera, Acrididae) из Южного Казахстана // Материалы Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс": Биология. - Новосибирск, Новосибирский госуттерситег, 2005. - С. 19.

5. Бугров А.Г., Джетыбасв И.Е., Карамьплева Т.В., Рубцов Н.Б. Молекулярная композиция С-позитивных районов хромосом саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Orthoptera, Acrididae) // Проблемы и перспективы общей энтомологии. Тезисы докладов XII съезда Русского энтомологического общества. Краснодар, 9-15 сентября 2007 года. - Краснодар, 2007 - С. 42-43.

6. Бугров А.Г., Карамышева Т.В., Джегыбаев И.Е., Дзюбеико ВВ., Рубцов II. Б. Происхождение, эволюция и распространение в популяциях саранчовых повторенных и дуплицированных последовательностей ДНК // Программа фундаментальных исследований РАН №11 «Биоразнообразие и динамика генофондов». Материалы отчётной конференции, посвященной памяти академика Ю.П. Алтухова. - Москва, 2008. - С. 100-101.

7. Jetybayev I., Bugrov A., Karamysheva Т., Rubtsov N., Comparative analysis of localization of rDNA clusters an telomeric repeats (TTAGG)n in C-positive and C-negative chromosome regions of Gomphocerinae grasshoppers (Acrididae; Orthoptera) // Chromosome research (2009) 17:533-577. Materials of 17л International Chromosome Conference 2009

8. Джегыбаев И.Е., Карамышева T.B., Дзюбеико B.B., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Возможности и ограничения молекулярно-цитогенетических методов в исследовании хромосом саранчовых // Тезисы международной конференции KARYO V, Новосибирск, 2010

9. Джетыбасв И. Е., Лосева Е.М., Морозкин Е.С., Лактаонов ПЛ., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Гибридизация in situ и LA-PCR - новый метод получению микродиссекционных ДНК-проб хромосом саранчовых //Тезисы международной конференции KARYO V Новосибирск, 2010

10. Джетыбаев И. Е., Карамышева Т.В., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Молекулярные маркеры в сравнительной цитогенетике саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Acridida, Orthoptera) //Тезисы международной конференции KARYO V Новосибирск, 2010

И. Jetybayev I.E., Bugrov A.G., Belavin Р.А., Tatkov S.I., Shvalov A.N. Rubtsov N.B. Comparison of molecular composition of pericentric heterochromatin of two grasshopper species from Gomphocerini tribe (Acrididae; Orthoptera) // Materials of 18'Jl International Cliromosome Conference 2011, Manchester UK.

Подписано к печати 13.09.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 65

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Джетыбаев, Ильяс Еркинович

Оглавление.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1. Подходы и методы цитогенетического анализа.

1.1 Начальный этап изучения хромосомных наборов.

1.2 Дифференциальное окрашивание хромосом.

1.2.1 С-дифференциальное окрашивание и конститутивный гетерохроматин

1.2.2 Особенности С-дифференциального окрашиваниия хромосом саранчовых.

1.2.3 Распределение стандартных С-позитивных блоков в хромосомах саранчовых подсемейства ОошрЬосеппае.

1.2.

§ЖЖ-окрашивание активных ядрышковых организаторов.

1.3 Методы молекулярной цитогенетики.

1.3.1 Организация и эволюция рибосомных генов.

1.3.2 Мобильные элементы в кластерах рибосомных генов.

1.3.3 Локализация кластеров рДНК у-саранчовых.

1.3.4 Организация и роль теломерных повторов.

1.3.5 Распределение теломерных повторов у саранчовых.

1.3.6 Организация центромерных и прицентромерных районов хромосом.

1.3.7 Прицентромерные районы саранчовых.

1.4 Особенности организации генома саранчовых.

1.4.1 В-хромосомы саранчовых.

1.5 Эволюционные изменения хромосомных наборов.

1.5.1 Хромосомные перестройки.

1.5.2 Роль хромосомных перестроек в кариотипической эволюции.

Глава 2. Материал и методы исследования.

2.1 Список реактивов.

2.2. Материал.

2.3. Получение яйцекладок саранчовых.

2.4. Приготовление препаратов митотических хромосом из нейробластов эмбрионов.

2.5. Приготовление препаратов мейотических хромосом.

2.6. Дифференциальное окрашивание районов конститутивного гетерохроматина.

2.7. Выявление активных ядрышко образующих районов (ЯОР).

2.8. Микродиссекция метафазных хромосом.

2.9.Приготовление ДНК-библиотек из диссектированного материала.

2.10. Мечение микродиссекционных ДНК-библиотек.

2.11 Получение и мечение зондов 18S рДНК.

2.12 Получение теломерного зонда.

2.13. Флуоресцентная гибридизация in situ.

2.14. Детекция на цитологических препаратах ДНК-зонда.

2.15 Совместное выявление двух гаптен-меченых ДНК-проб на одном препарате.

2.16 Микроскопический анализ.

Глава 3. Результаты.

3.1. Локализация С-позитивных блоков у саранчовых подсемейства Gomphocerinae.

3.2.Локализация активных ЯОР у Stauroderus scalaris и Aeropus sibiricus.

3.3. Локализация теломерных повторов и рибосомной ДНК на хромосомах видов подсемейства Gomphocerinae.

3.4. Локализация последовательностей ДНК, гомологичных ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек.

3.4.1 Характеристика ДНК-библиотек.

3.4.2 Локализация последовательностей, гомологичных последовательностям прицентромерного С-позитивного блока аутосомы Ch. apricarius.

3.4.3 Локализация последовательностей, гомологичных последовательностям прицентромерного С-позитивного блока X хромосомы A. sibiricus.

3.4.4 Локализация последовательностей, гомологичных последовательностям прицентромерного С-позитивного блока X хромосомы & зса/яга.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-цитогенетический анализ путей и механизмов кариотипической эволюции саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Orthoptera, Acrididae)"

Саранчовые широко распространены в Голарктике и представляют одну из наиболее богатых по видовому разнообразию таксономических групп в отряде прямокрылых насекомых (Uvarov, 1966; Otte, 1981). Сочетание высокой стабильности кариотипов с интенсивными процессами дивергенции видов делает саранчовых уникальной модельной группой для изучения эволюционных процессов. Базовый тип хромосомного набора у представителей этого семейства представлен 23 акроцентрическими хромосомами у самца и 24 акроцентрическими хромосомами у самки при хромосомном определении пола ХО(37ХХ$ (2п=22+Х0(ЗУХХ$). Этот тип хромосомного набора характерен для большинства видов семейства Acrididae, однако в подсемействе Gomphocerinae присутствует большое количество видов с кариотипом: 2n=16+X0(37l6+XX(p). Он включает 3 пары крупных метацентрических хромосом. Остальные пары аутосом и половая X хромосома - акроцентрические хромосомы разной длины (Cabrero, Camacho, 1986b; Бугров и др., 1991). Предполагается, что такой тип хромосомного набора является производным от исходного 23-хромосомного предкового кариотипа, и образовался в результате трех центрических слияний (Robertson, 1916; White, 1973). Об этом может свидетельствовать наличие в подсемействе видов с 23 акроцентрическими хромосомами (Santos et al., 1983; Cabrero, Camacho, 19866; Бугров и др., 1991), а также видов с промежуточными хромосомными наборами - Chorthippus hammarstroemi (2п=20+Х0с?/ХХ9) и Eremippus sobolevi (2n=18+X0$/XX$) (Бугров и др., 1993). Считается, что эволюция кариотипов саранчовых проходила с уменьшением числа хромосом за счет робертсоновских слияний (White, 1973; Hewitt, 1979), поэтому можно предположить, что подсемейство Gomphocerinae является кариотипически наиболее продвинутым таксоном в семействе Acrididae. Это подсемейство включает свыше 60 родов и более 1500 видов (Uvarov, 1966; Otte, 1981), встречающихся во всей Палеарктике.

Расцвет этой группы пришелся на конец палеогена (Шаров, 1968). Большое видовое разнообразие в группе, возникшее за эволюционно- короткий период времени, делает виды подсемейства Gomphocerinae хорошими объектами для изучения путей преобразования кариотипов у саранчовых.

Несмотря на богатую историю сравнительных кариологических исследований саранчовых, возможности изучения линейной дифференциации хромосом в рамках традиционной цитогенетики длительное время были ограничены методом С-дифференциального окрашивания, что затрудняло детализацию путей кариотипической эволюции. Этот тип дифференциального окрашивания выявляет отличия по величине и локализации С-гетерохроматиновых районов хромосом у разных видов, но не дает информации о молекулярном составе этих районов. Поэтому С-позитивные блоки не могут служить надежным цитогенетическими маркерами хромосомных перестроек. До сих пор стоит вопрос, является ли наблюдаемая стабильность кариотипов следствием малого количества изменений в геноме группы, либо же она является результатом ограниченности использованных методов. Развитие методов молекулярной цитогенетики позволило использовать районо- и хромосомоспецифичные последовательности ДНК в качестве маркеров для решения задач, связанных с эволюционной трансформацией хромосомных наборов. Эти методы успешно применяются на позвоночных (Ferguson-Smith, Trifonov, 2007), растениях (Schubert et al., 2001) и насекомых (Panzera et al., 2010), а также были частично адаптированы и использованы для исследований хромосом саранчовых (Lopez-Leon et al., 1995, 1999; Lopez-Fernandes et al., 2004; Cabrero et al., 1997; Cabrero et al., 2003a,b; Bugrov et al., 2003, 2004, 2007). Однако их применение ограничивалось лишь небольшим набором ДНК-проб и видов. Большинство видов подсемейства Gomphocerinae остались за рамками этих исследований. Анализ локализации молекулярно-цитогенетических маркеров на хромосомах видов саранчовых из подсемейства Gomphocerini позволяет по новому взглянуть на вопросы кариотипической эволюции не только в пределах этого таксона, но и у всего семейства саранчовых.

Другой отличительной особенностью саранчовых является большой размер генома. Среди насекомых саранчовые обладают самыми большими геномами, размеры которых варьируются от 6000 до 20000 миллионов пар нуклеотидов (Bensasson et al., 2001). Большинство работ по изучению организации геномов было выполнено на видах с геномами небольших (например, двукрылые насекомые) или средних размеров (таких как млекопитающие), в то время как хромосомная организация крупных геномов остается слабоизученной.

Одной из составных частей генома являются повторенные последовательности. Так как число генов остается примерно одинаковым для всех видов эукариот, то можно предположить, что у саранчовых доля повторенных последовательностей значительно больше, чем у млекопитающих. Как организованы эти повторенные последовательность, и как они располагаются в хромосомах саранчовых, остается не выясненным. Одним из типов повторенных последовательностей являются кластерированные повторы. Они образуют С-позитивные блоки и играют значительную роль в структурно-функциональной организации генома. Как было показано ранее (Hewitt, 1979; Santos et al., 1983; Gosalvez et al., 1997; Cabrero, Camacho, 1986b; Бугров и др., 1991), эти блоки проявляют высокую внутри- и межвидовую изменчивость по размеру и локализации, однако данных по молекулярному составу этих блоков и их изменчивости у саранчовых крайне мало.

Таким образом, изучение молекулярной композиции С-позитивных блоков у саранчовых подсемейства Gomphocerinae будет значительным вкладом в понимание организации геномов саранчовых и позволит лучше понять общие принципы организации больших геномов.

Цель настоящего исследования: описать распределение повторенных последовательностей ДНК в хромосомах видов подсемейства ОотрЬосеппае и оценить их возможную роль в кариотипической эволюции саранчовых.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• Дать детальное описание кариотипов видов подсемейства ОошрЬосеппае, используя С-дифференциальное окрашивание митотических хромосомах эмбриональных клеток изучаемых видов.

• Провести сравнительный анализ локализации кластеров повторенных последовательностей, гомологичных рибосомной и теломерной ДНК в хромосомах ряда видов подсемейства ОошрЬосеппае.

• Провести оценку молекулярного состава С-позитивных районов близких видов саранчовых подсемейства ОотрИосеппае

Научная новизна

В настоящей работе:

-впервые были описаны особенности локализации С-позитивных блоков в митотических хромосомах нейробластов 15 видов саранчовых подсемейства ОотрИосепш.

-впервые была выявлена локализация кластеров рибосомных и теломерных повторов в митотических хромосомах 13-ти ранее не изученных видов саранчовых.

-впервые было показано наличие субблоков, различающихся обогащенностью различными повторенными последовательностями ДНК, в прицентромерных С-позитивных блоках хромосом & $са1аг[$ и А. $1Ыг1ст.

Практическая ценность

Полученные данные являются весомым вкладом в изучение кариотипического разнообразия в слабо изученной группе саранчовых, дают новую информацию об организации геномов саранчовых и могут быть использованы в учебном процессе. Полученные ДНК-библиотеки будут служить основой для детального молекулярного анализа повторенных последовательностей, локализующихся в прицентромерных районах разных видов, что позволит лучше понять эволюционные процессы. Положения, выносимые на защиту

Прицентромерные С-позитивные блоки хромосом саранчовых могут состоят из субблоков, отличающихся молекулярной композицией. В этих районах идут активные процессы молекулярной эволюции, которые приводят к значительным различиям молекулярного состава прицентромерных С-позитивных блоков хромосом близких видов саранчовых, а, в некоторых случаях, и прицентромерных С-позитивных блоков разных хромосом набора одного вида саранчовых.

Для саранчовых подсемейства Gomphocerinae не характерно наличие интерстициальных теломерных сайтов.

Особенности локализации ряда кластеров рДНК позволяют использовать их в качестве маркеров гомеологичных хромосом у близких видов.

Парацентрические инверсии могут играть значительную роль в кариотипической эволюции саранчовых.

Апробация

Результаты работы были представлены на следующих конференциях:

1. Международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс" Новосибирск, 2005, 2007 г.

2. XII съезд Русского энтомологического общества. Краснодар, 9-15 сентября 2007 года.

3. Отчётная конференция, посвященная памяти академика Ю.П. Алтухова. Москва, 2008 год.

4. 17th International Chromosome Conference 2009. Boone, 23-26 июля 2009 года

5. Международная конференция KARYO V, Новосибирск, 2010 год

6. 18th International Chromosome Conference 2011. Manchester, 29 августа-2сентября 2011 года

Публикации

1. Джетыбаев И. Е., Карамышева Т.В., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Кросс-гибридизация повторенных последовательностей ДНК прицентромерного гетерохроматина Chorthippus apricarius (L.) с хромосомами саранчовых трибы Gomphocerini. // Евразиатский энтомологический журнал, 2010, Т. 9, №3 стр. 433-436

2. Дзюбенко В.В., Бугров А.Г., Джетыбаев И.Е., Рубцов Н.Б. Добавочные хромосомы как маркёры формирования популяционной структуры плавучей кобылки Eyprepocnemis plorans Charpantier, 1825 (Orthoptera, Acrididae) //Евразиатский энтомологический журнал, 2010, T. 9, №3 стр. 437-440

3. Jetybayev I.E., Bugrov A.G., Karamysheva T.V., Camacho J.P.M., Rubtsov N.B. Chromosomal localization of ribosomal and telomeric DNA provides new insights on the evolution of Gomphocerinae grasshoppers // Cytogenetic and genome research 2012 (DOI : 10.1159/000341571 )

4. Джетыбаев И.Е. Цитогенетические особенности популяции бурого конька Chorthippus apricarius (L.) (Orthoptera, Acrididae) из Южного Казахстана // Материалы Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс": Биология. -Новосибирск, Новосибирский госуниверситет, 2005. - С. 19.

5. Бугров А.Г., Джетыбаев И.Е., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б. Молекулярная композиция С-позитивных районов хромосом саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Orthoptera, Acrididae) // Проблемы и перспективы общей энтомологии. Тезисы докладов XII съезда Русского энтомологического общества. Краснодар, 9-15 сентября 2007 года. - Краснодар, 2007 - С. 42-43.

6. Бугров А.Г., Карамышева Т.В., Джетыбаев И.Е., Дзюбенко В.В., Рубцов Н. Б. Происхождение, эволюция и распространение в популяциях саранчовых повторенных и дуплицированных последовательностей ДНК // Программа фундаментальных исследований РАН №11 «Биоразнообразие и динамика генофондов». Материалы отчётной конференции, посвященной памяти академика Ю.П. Алтухова. -Москва, 2008.-С. 100-101.

7. Jetybayev I., Bugrov A., Karamysheva Т., Rubtsov N., Comparative analysis of localization of rDNA clusters an telomeric repeats (TTAGG)n in C-positive and C-negative chromosome regions of Gomphocerinae grasshoppers (Acrididae; Orthoptera) // Chromosome research (2009) 17:533-577. Materials of 17th International Chromosome Conference

2009

8. Джетыбаев И.Е., Карамышева T.B., Дзюбенко B.B., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Возможности и ограничения молекулярно-цитогенетических методов в исследовании хромосом саранчовых // Тезисы международной конференции KARYO V, Новосибирск,

2010

9. Джетыбаев И. Е., Лосева Е.М., Морозкин Е.С., Лактионов П.П., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Гибридизация in situ и LA-PCR - новый метод получения микродиссекционных ДНК-проб хромосом саранчовых //Тезисы международной конференции KARYO V Новосибирск, 2010

10.Джетыбаев И. Е., Карамышева Т.В., Бугров А.Г., Рубцов Н.Б. Молекулярные маркеры в сравнительной цитогенетике саранчовых подсемейства Gomphocerinae (Acrididae, Orthoptera) //Тезисы международной конференции KARYO V Новосибирск, 2010

11.Jetybayev I.E., Bugrov A.G., Belavin P.A., Tatkov S.I., Shvalov A.N. Rubtsov N.B. Comparison of molecular composition of pericentric heterochromatin of two grasshopper species from Gomphocerini tribe

Acrididae; Orthoptera) // Materials of 18th International Chromosome Conference 2011, Manchester UK

Вклад автора

Вся работа была выполнена автором самостоятельно либо при ?го непосредственном участии. Помощь в проведении FISH и приготовлении микродиссекционных ДНК зондов оказывали Карамышева Т.В. и Рубцов Н.Б.

Объем и структура работы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Джетыбаев, Ильяс Еркинович

Выводы

1. На высоком уровне разрешения описано распределение С-позитивных блоков в митотических хромосомах из нейробластов эмбрионов. Выявлены ранее не описанные С-позитивных районов в кариотипе ряда видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae. Впервые были выявлены и описаны короткие эухроматиновые плечи X хромосом у P. poppiusi и Ch. hammarshtroemi.

2. У всех исследованных видов кластеры теломерных пентамеров (ТТАГГ)п локализуются в терминальных районах хромосом. Наличие ITS не характерно для изученных видов. ITS, обнаруженные в акроцентрической Мб хромосоме A. sibiricus, наиболее вероятно, является результатом парацентрической инверсии.

3. Выявлены два типа распределения кластеров рДНК в хромосомах саранчовых трибы Gomphocerini. Особенности локализации ряда кластеров рДНК позволяют использовать их в качестве маркеров гомеологичных хромосом у близких видов.

4. У близких видов саранчовых подсемейства Gomphocerinae прицентромерные С-позитивные блоки сильно различаются по молекулярному составу, что свидетельствует о высокой скорости эволюции ДНК этих районов.

5. Показано, что прицентромерные гетерохроматиновые блоки, гомогенные при С-дифференциальном окрашивании, могут состоять из нескольких субблоков, обогащенными различными повторенными последовательностями ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Джетыбаев, Ильяс Еркинович, Новосибирск

1. Бей-Биенко Г. Я., Мищенко Jl. JI. Саранчовые фауны СССР часть II М.: Изд-во Акад. наук СССР, 1951.-667 С.

2. Бугров А.Г. Закономерности структруной эволюции хромосомных наборов и филогения прямокрылых насекомых: дис. . док. биол. наук. Новосибирск. 2001. 268 С.

3. Бугров А.Г., Гусаченко А.М., Высоцкая JI.B. Кариотипы и С-гетерохроматиновые районы Саранчевых трибы Gomphocerini (Ortóptera, Acrididae, Gomphocerini) фауны СССР // Зоол. ж. 1991. -Т. 70. - №. 12.-С. 55-63.

4. Бугров А.Г., Сергеев М.Г., Высоцкая JI.B. Филогенетическое положение саранчовых рода Erimippus Uv. Цитогенетический анализ // Кариосистематика беспозвоночных животных II., С.-Пб. 1993. - С. 18-21.

5. Высоцкая JI.B. Закономерности эволюционных преобразований кариотипов саранчовых: дисс. . док. биол. наук. Новосибирск. 1993. -48 С.

6. Высоцкая JI.B. Поведение С-гетерохроматиновых районов хромосом в первой профазе мейоза у саранчового Stauroderus scalaris II Цитология, 1981.-Т. 21.-№ 11.-С. 1279-1282.

7. Высоцкая JI.B., Бугров. А.Г. распределение С-гетерохроматина в профазе мейоза у саранчовых // Цитология. 1985. - Т. 27. - № 10. - С. 1118-1122.

8. Гусаченко А.М., Высоцкая Л.В., Бугров А.Г. Цитогенетический анализ сибирской кобылки (Orthoptera Acrididae) из Горного Алтая // Доклады АН СССР. 1993 - Т. 28. - № 2. - С. 250-252.

9. Жданова Н.С, Рубцов Н.Б, Минина Ю.М. Терминальные районы хромосом млекопитающих: пластичность и роль в эволюции // Генетика. 2007. -Т. 43. - № 7. - С. 873-886.

10. Кикнадзе И.И, Гундерина Л.И, Батлер М.Дж, Вюлкер В.Г, Мартин Дж. Хромосомы и континенты // Вестник ВОГиС. 2007. - Т. 11.-№2.-С. 322.

11. Левитский Г.А. Морфология хромосом и понятие «кариотипа» в систематике // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. 1931. - Т. 27. - С.187-240.

12. Навашин С.Г. О некоторых признаках внутренней организации хромосом // Сборник статей, посвященный памяти К.А. Темирязева. М. 1916.-С. 185-214.

13. Прокофьева-Бельговская А. А., Гетерохроматические районы хромосом. М.: Наука. 1986. - 431 С.

14. Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие // Новосибирск: Новосиб. гос ун-т. 2006. - 152 С.

15. Рубцова Н.В. Молекулярно-цитогенетический анализ эволюции хромосом полевок группы "arvalis" рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia): дис. . канд. биол. наук. Новосибирск. 2003. 146 С.

16. Тарбинский, С. П. Прыгающие прямокрылые насекомые Азербайджанской ССР // М.: Л. 1940. - 245 С.

17. Шаров А. Г., Филогения ортоптероидных насекомых. М.: Наука. 1983.-217 С.

18. Abdelaziz М, Teruel М, Chobanov D, Camacho JP, Cabrero J. Physical mapping of rDNA and satDNA in A and В chromosomes of the grasshopper Eyprepocnemis plorans from a Greek population // Cytogenet. Genome Res. 2007. - V. 119, No (1-2). - P. 143-1466.

19. Alekseyev M.A., Pevzner P.A. Are there rearrangement hotspots in the human genome? // PLoS Comput Biol. 2007. - V. 3, No 11. - P. 209.

20. Allen W.R., Short R.V. Interspecific and extraspecific pregnancies in equids: anything goes // J. Hered. 1997. - V. 88. - P. 384-392.

21. Arnheim N., M. Krystal R. Schmickel G. Wilson O. Ryder et al., Molecular evidence for genetic exchange among ribosomal genes on nonhomologous chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 77. -P. 7323-7327.

22. Arrighi F.E., Hsu T.C. Localization of heterocromatin in human chromosomes // Cytogenetics. 1971. -V 10. - P. 81-86.

23. Ayala F.J., Coluzzi M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - P. 65356542.

24. Bella J.L., Gosälvez J. C-banding with specific fluorescent DNA-ligands: a new approach to constitutive heterochromatin heterogeneity // Biotech Histochem. 1991. - V. 1, No. 1. - P. 44-52.

25. Bensasson D., Petrov D.A., De-Xing Zhang Hartl D.L., Hewitt G.M. Genomic gigantism: DNA loss is slow in mountain grasshoppers // Molecular Biology and Evolution 2001. - V. 18. - No. 2. - P. 246-253.

26. Bernard P., Maure J.F., Partridge J.F., Genier S., Javerzat J.P., Allshire RC: Requirement of heterochromatin for cohesion at centromeres //. Science. 2001. - V. 294. - P. 2539-2542.

27. Boveri T. Über mehrpolige Mitosen als Mittel zur Analyse des Zellkerns // Verh. phys.-med. Ges. 1902. - V. 35. - P. 67-90.

28. Brown J.D., O'Neill R.J. Chromosomes, conflict, and epigenetics: chromosomal speciation revisited // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. -2010. -V. 11.-P. 291-316.

29. Buckler E.S., Ippolito A., Holtsford T.P. The evolution of ribosomal DNA: Divergent paralogues and phylogenetic implications .// Genetics. -1997.-V. 145.-P.: 821-832.

30. Bugrov A.G., Warchalowska-Sliwa E. Chromosome C-banding patterns in isolated population of the grasshopper Podisma pedesis (L.) (Orthoptera, Acrididae) from the Altai Mts// Folia Biol (Krakow). 2002. V. 50,No. 1-2.-P. 101-102.

31. Bugrov A.G., Warchalowska-Sliwa E., Ito G., Akimoto S. C-banded karyotypes of some Podismini grasshoppers (Orthoptera, Acrididae) from Japan // Cytologia. 2000. - V. 65, No. 4. - P. 351-358.

32. Cabrero J., Lopez-Leon M.D., Teruel M., Camacho J.P.M. Chromosome mapping of H3 and H4 histone gene clusters in 35 species of acridid grasshoppers // Chromosome Research. 2009. - V. 17. - P. 397404.

33. Cabrero J., Bakkali M., Bugrov A., Warchalowska-Sliwa E., LopezLeon M.D., Perfectti F., Camacho J.P.M. Multiregional origin of B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans II Chromosoma. -2003a.-V. 112.-P. 207-211.

34. Cabrero J., Camacho J.P.M. Cytogenetic studies in gomphocerine grasshoppers. II. Chromosomal location of active nucleolar organizing regions // Can. J. Genet. Cytol. 1986a. - V. 28. - P. 540-544.

35. Cabrero J., Camacho J.P.M. Cytogenetic Studies in Gomphocerine Grasshoppers. I. Comperative Analysis of Chromosome C-banding pattern //Heredity. 1986b. -V. 56. - P. 365-372.

36. Cabrero J., Camacho J.P.M. Location and expression of ribosomal RNA genes in grasshoppers: Abundance of silent and cryptic loci // Chromosome Research. 2008. - V. 16. - P. 595-607.

37. Cabrero J., Bugrov A., Warchalowska-Sliwa E., Lopez-Leon M.D., Perfectti F., Camacho J.P.M. Comparative FISH analysis in five species of Eyprepocnemidinae grasshoppers // Heredity. -2003b. V. 90. -P. 377-381.

38. Camacho J.P.M. B chromosomes. // Gregory T.R. The evolution of the genome. San Diego, 2005. - P. 223-286.

39. Carbone L, Vessere G.M., ten Hallers B.F. et al. A high resolution map of synteny disruptions in gibbon and human genomes // PLoS Gene'. -2006. V. 2.-P. 223.

40. Cazaux B., Catalan J., Veyrunes F., Douzery E.J.P., Britton-Davidian J. Are ribosomal DNA clusters rearrangement hotspots? A case study in the genus Mus (Rodentia, Muridae) // BMC Evolutionary Biology. 2011. - V. 11.-P. 124.

41. Chandley A.C., Jones R.C., Dott H.M., AllenW.R., Short R.V. Meiosis in interspecific equine hybrids. I. The male mule (Equus asinus X E. caballus) and hinny (E. caballus X E. asinus) II Cytogenet. Cell Genet. -1974.-V. 13.-P. 330-341.

42. Coluzzi M. Spatial distribution of chromosomal inversions and speciation in anopheline mosquitoes // Alan Liss. Mechanisms of Speciatio. -New York, 1982.-P. 143-153.

43. Comings O.E., Kovacs B.W., Avelino E., Harris D.C. Mechanisms of chromosome banding. V. Quinacrine banding // Chromosoma. 1975. - V. 50, No. 2. - P. 111-114.

44. Copenhaver G.P., Nickel K., Kuromori T., Benito M., Kaul S., Lin X., Bevan M., Murphy G., Harris B., Parnell L.D. Genetic definition and sequence analysis of Arabidopsis centromeres // Science. 1999. -V. 286. -P. 2468-2474.

45. Datson P.M., Murray B.G. Ribosomal DNA locus evolution in Nemesia: transposition rather than structural rearrangement as the key mechanism? // Chromosome Research. 2006. - V. 14, No 8. - P. 845-857.

46. Delneri D., Colson I., Grammenoudi S., Roberts I.N., Louis E.J. Oliver S.G. Engineering evolution to study speciation in yeasts // Nature. -2003.-V. 422.-P. 68-72.

47. Demerec M., Slisynska H., Mottled white 258-18 of Drosophila melanogaster II Genetics. 1937. V 22. - P. 641-649.

48. Dillon N. Heterochromatin structure and function // Biology of the Cell 2004. - V. 96. - P. 631-637.

49. Dirsh V.M. Classification of the Acridomorphoid insects. Farington: E.W. ClasseyLtd., 1975.-P. 171.

50. Dirsh V.M. Revision of the genus Eyprepocnemis Fieber, 1853 (Orthoptera, Acridoidea) // Proc. R. Ent. Soc. Lond. 1958. -V. 27, No. 3-4. -P. 33-46.

51. Dobzhansky T. Studies on hybrid sterility. II. Localization of sterility factors in Drosophila pseudoobscura hybrids // Genetics. 1936. - V. 21. -P. 113-135.

52. Dover G, Molecular drive: a cohesive mode of species evolution // Nature. 1982. - V. 299. - P. 111-117.

53. Dubcovsky J, Dvorak J, Ribosomal RNA multigene loci Nomads of the Triticeae genomes // Genetics. - 1995. - V. 140. - P. 1367-1377.

54. Eickbush T.H, Burke W.D, Eickbush D.G & Lathe W.C. Evolution of R1 and R2 in the rDNA units of the genus Drosophila //Genetica. 1997. -V. 100.-P. 49-61.

55. Eickbush T.H, Eickbush D.G. Finely Orchestrated Movements: Evolution of the Ribosomal RNA Genes // Genetics. 2007. - V. 175. -P.477-485.

56. Eickbush T.H, Malik H.S. Origins and evolution of retrotransposons //N. L. Craig. Mobile DNA II. Washington: ASM Press . 2002. P.llll-1139.

57. Fan Y, Linardopoulou E, Friedman C, Williams E, Trask B.J. Genomic structure and evolution of the ancestral chromosome fusion site in 2ql3-2ql4.1 and paralogous regions on other human chromosomes // Genome Res. -2002. V. 11.-P. 1651-1662.

58. Ferguson-Smith M.A, Trifonov V. Mammalian karyotype evolution // Nat. Rev. Gen. 2007. - V. 8, No. 12. - P. 950-962.

59. Flemming W. Beiträge zur Kenntniss der Zelle und ihrer Lebenserscheinungen // Arch. Mikroskop. Anat. 1878. - V. 16. - P. 302436.

60. Flint J, Craddock C.F, Villegas A, Bentley D.P, Williams H.J. Galanello R, Cao A. Wood W.G, Ayyub H, Higgs D.R. Healing of broken human chromosomes by addition of telomeric repeats // Am. J. Hum. Genet. 1994.-V. 55.-P. 505-512.

61. Ford C.E., Hamerton J.L. The chromosomes of man // Nature. 1956. -V. 178.-P. 1020-1023.

62. Froenicke L.Origins of primate chromosomes as delineated by Zoo-FISH and alignments of human and mouse draft genome sequences // Cytogenet Genome Res.-2005.-V. 108, No. 1-3.-P. 122-138.

63. Gascoigne K.E. and Cheeseman I.M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come // Current Opinion in Cell Biology. 2011. - V. 23. -P. 102-108.

64. Gonzalez I. L., and J. E. Sylvester Human rDNA: evolutionary patterns within genes and tandem arrays derived from multiple chromosomes // Genomics. 2001. - V. 73. - P. 255-263.

65. Gosalvez J., Lopez-Fernandez C., Morales A.E. The chromosome system in three species of the genus Arcyptera (Orthoptera: Acrididae). I. Heterochromatin variation, DNA content and NOR activity // Acrida. -1981. -V. 10, No 4.-P. 191-203.

66. Gray J.W., Lucas J.N., Pinkel D., Awa A. Structural chromosome analysis by whole chromosome painting for assessment of radiation-induced genetic damage // J. Radiat. Res. 1992. - V. 33. - P.80-86.

67. Grieder C.M., Blackburn E.H. A telomeric sequences in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis // Nature. -1989.-V. 26.-P. 331-337.

68. Hartmann S., Nason J.D., Bhattacharya D. Extensive ribosomal DNA genie variation in the columnar cactus Lophocereus II J. Mol. Evol. -2001. -V. 53.-P. 124-134.

69. Haupt W., Fischer T.C., Winderl S., Fransz P., Torres-Ruiz R.A. The CENTROMERE1 (CEN1) region of Arabidopsis thaliana: architecture and functional impact of chromatin // Plant J. 2007. - V. 27. - P. 285-296.

70. Henderson A.S., Warburton D., Atwood K.C., Location of ribosomal DNA in the human chromosome complement // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1972. - V. 69. - P. 3394-3398.

71. Henikoff S: Near the edge of a chromosome's 'black hole' // Trends Genet. 2002. - V. 18. - P. 165-167.

72. Henikoff S., Ahmad K., Malik H.S: The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA // Science. 2001. - V. 293. - P. 1098-1102.

73. Hewitt G.M., John B. Parallel polymorphism for supernumerary segments in Chorthippus parallelus (Zetterstedt) I. British populations // Chromosoma.- 1968.-V. 25, No. 3.-P. 319-342.

74. Hewitt G.M. Grasshoppers and crickets // G.M. Hewitt. Animal Cytogenetics. V.3, Insecta 1 Orthoptera. Berlin, Stuttgard. 1979. - P. 170.

75. Hewitt G. M., Evolution and maintenance of B-chromosomes // Chromosomes Today. 1973. -V. 4. - P. 351-369.

76. Holmquist G. The mechanism of C-banding: depurination and P-elimination // Chromosoma. 1979. - V. 72, No. 2. - P. 203-224.

77. Hsu T. C., Pomerat C. M. Mammalian chromosomes in vitro. II. A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture // J. Hered. 1953. - V. 44.-P. 23-29.

78. Huang S., Rothblum L.I., Chen D. Ribosomal chromatin organization // Biochem. Cell Biol. 2006. - V. 84. - P. 444-449.

79. Ijdo J.W., Baldini A., Ward D.C., Reeders S.T., Wells R.A. Origin of human chromosome 2: an ancestral telomere-telomere fusion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V. 88. - P. 9051-9055.

80. Ishii K. Conservation and divergence of centromere specification in yeast // Curr. Opin. Microbiol. 2009. - V. 12, No. 6. - P. 616-622.

81. John B., Hewitt G.M. Patterns and pathways of chromosome evolution of the Orthoptera // Chromosoma 1968. -V. 25, No. 1. - P. 4047.

82. Johnes G.H., Stamford W.K., Perry R.E. Male and female meiosis in grasshoppers. II. Chorthippus brunneus II Chromosoma. 1975. - V. 51, No. 4.-P. 381-390.

83. Kapuscinski J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe // Biotech Histochem. 1995. - V. 70, No. 5. - P. 220-233.

84. Kehrer-Sawatzki H., Cooper D.N. Molecular mechanisms of chromosomal rearrangement during primate evolution // Chromosome Res. -2008. V. 16, No. 1.-P. 41-56.

85. Keller I., Chintauan-Marquier I.C., Veitsos P, Nichols R.A. Ribosomal DNA in the Grasshopper Podisma pedestris: Escape From Concerted Evolution // Genetics. 2006. - V. 174, No. 2. - P. 863-874.

86. King M. Species evolution: the role of chromosome change // Cambridge: Cambridge Univ. Press. 1993. P. 360.

87. King R., John B. Regularities and restrictions govering C-band variation in acridoid grasshoppers // Chromosoma. 1980. - V. 76, No. 2. -P. 123-150.

88. Lamb J., Birchler C., James A. The role of DNA sequence in centromere formation // Genome Biology. 2003. - V. 4. - P. 214.

89. Lichter P., Cremer T., Borden J., Manuelidis L., Ward D.C. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries // Human Genet. 1998. - V. 80. - P. 224-234.

90. Lois D.J., Vershinin A.V. Chromosome ends: different sequences may provide conserved functions // Bioessays. 2005. - V. 27. - P. 685-697.

91. Long E.O., Dawid I.B. Repeated genes in eukaryotes // Annu. Rev. Biochem. 1980. -V. 49. - P. 727-764.

92. Lopez-Fernandez C., Pradillo E., Zabal-Aguirre Fernandez J.L., Garcia de la Vega, C. Gosalvez, J. Telomeric and interstitial telomeric-like DNA sequences in Orthoptera genomes // Genome. 2004. - V. 47. - P. 757-763.

93. Lopez-Leon M.D., Cabrero J., Camacho J.P.M. Unusually high amount of inactive ribosomal DNA in the grasshopper Stauroderus scalaris II Chromosome Research. 1999. - V. 7. - P. 83-88.

94. López-León M.D., Vázquez P., Hewitt G.M., Camacho J.P. Cloning and sequence analysis of an extremely homogeneous tandemly repeated DNA in the grasshopper Eyprepocnemis plorans // Heredity. 1995. - V. 75.-P. 370-375.

95. Losada A., Hirano T. Dynamic molecular linkers of the genome: the first decade of SMC proteins // Genes Dev. 2005. - V. 19. - P. 1269-1287.

96. Makino S. An atlas of the chromosome numbers in animals. / 2d ed. (1st American ed.) rev. and enl. from the original Tokyo ed. Ames; Iowa State College Press. 1951. P. 290.

97. Márquez L.M., Miller D.J., MacKenzie J.B., van Oppen M.J.H. Pseudogenes Contribute to the Extreme Diversity of Nuclear Ribosomal DNA in the Hard Coral Acropora // Mol. Biol. Evol. 2003. - V. 20, No. 7. -P. 1077-1086.

98. Maryanska-Nadachowska A., Warchalowska-Sliwa E., Kuznetsova V.G. The NOR and nucleolus in the spermatogenesis of Psylla alni (L.) (Homoptera) analysed by silver staining // Folia biol. (Krakow) 1992. - V. 40.-P. 21-25.

99. Mehta G.D., Agarwal M.P., Ghosh S.K. Centromere identity: a challenge to be faced // Mo.l Genet. Genomics. 2010. - V. 284. - P. 75-94.

100. Meluh P.B., Strunnikov A.V. Beyond the ABCs of CKC and SCC. Do centromeres orchestrate sister chromatid cohesion or vice versa? // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269.-P. 2300-2314.

101. Miller O.L.Jr., Beatty B.R. Visualization of nucleolar genes // Science. 1969. - V. 164. - P. 955-957.

102. Mladenov E, Iliakis G. Induction and repair of DNA double strand breaks: The increasing spectrum of non-homologous end joining pathways // Mutat. Res. 2011. - V. 711, No. 1-2. - P. 61-72.

103. Morgan T.H. The Theory of the Gene // The American Naturalist. -1917. -V. 51,No. 609.-P. 513-544.

104. Muir G., Fleming C.C., Schlotterer C. Three divergent rDNA clusters predate the species divergence in Quercus petraea (Matt.) Liebl. and Quercus robur L. // Mol. Biol. Evol. 2001. - V. 18.-P. 112-119.

105. Muller H., Isolating mechanisms, evolution and temperature // Biol. Symp.- 1942.-V. 6.-P. 71-125.

106. Murphy T.D., Karpen G.H. Centromeres take flight: alpha satellite and the quest for the human centromere // Cell. 1998. - V. 93. - P. 317320.

107. Navarro A., Barton N.H. Accumulating postzygotic isolation gene;: in parapatry: a new twist on chromosomal speciation // Evolution. 2003. - V. 57.-P. 447^59.

108. Neglia M., Bertoni L., Zoli W., Giulotto E. Amplification of the pericentromeric region of chromosome 1 in a newly established colon carcinoma cell line // Cancer Genet. Cytogenet. 2003. - V. 142. - P. 99106.

109. Ney M., Roney A.P. Concerted and Birth-and-Death Evolution of Multigene Families // Annu. Rev. Genet. 2005. - V. 39. - P. 121-152.

110. O'Brien S.J. Atlas of Mammalian Chromosomes // O'Brien S.J (el), Menninger J.C. (ed.), . Nash W.G. (ed.). New Jersey: John Wiley & Sons, 2006.-P. 714.

111. Otte D. The North American grasshoppers, volume 1: Acrididae: Gomphocerinae and Acridinae // Cambridge, Mass.: Harvard University Press, 1981.-P. 275.

112. Panzera F, Pérez R, Panzera Y, Ferrandis I, Ferreiro MJ, Calleros L Cytogenetics and genome evolution in the subfamily Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) // Cytogenet. Genome Res. 2010. - V. 128, No. 1-3.-P. 77-87.

113. Pardue M.L., Gall J.G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations // PNAS. 1969. - V. 64, No. 2. - P. 600-604.

114. Penton E.H., Sullender B.W. and Crease T.J Pokey, a New DNA Transposon in Daphnia (Cladocera: Crustacea) // Journal of Molecular Evolution. 2002. - V. 55, No. 6. - P. 664-673.

115. Penton E. H., Crease T.J. Evolution of the transposable element Pokey in the ribosomal DNA of species in the subgenus Daphnia (Crustacea; Cladocera) // Mol. Biol. Evol. 2004. - V. 21. - P. 1727-1739.

116. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. Cytogoentical analysis using quantative, high sensevity, fluorescence hybridizathion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 2934-2938.

117. Puvion-Dutilleul F., Bachellerie J.P., Puvion E. Nucleolar organization of HeLa cells as studied by in situ hybridization // Chromosoma. 1991. -V. 100. - P. 395-409.

118. Razafimandimbison S. G., Kellogg E.A., Bremer B. Recent origin and phylogenetic utility of divergent ITS putative pseudogenes: a case study from Naucleeae (Rubiaceae) // Syst. Biol. 2004. - V. 53. - P. 177-192.

119. Rieseberg L.H. Chromosomal rearrangements and speciation // Trends Ecol. Evol. 2001. - V. 16. - P. 351-358.

120. Roberto R, Capozzi O, Wilson RK et al. Molecular refinement of gibbon genome rearrangements // Genome Res. 2007. - V. 17. - P. 249257.

121. Robertson W.R.B. Chromosome studies // J. Morphol. 1916. - V. 27,No. l.-P. 179-331.

122. Santos J.L., Arana P., Giraldez R. Cromosome C-banding patterns in Spanish Acridoidea // Genetica. 1983. - V. 61. - P. 65-74.

123. Schueler M.G, Higgins A.W, Rudd M.K, Gustashaw K, Willard H.F: Genomic and genetic definition of a functional human centromere // Science.-2001.-V. 294.-P. 109-115.

124. Shaw D.D. Population cytogenetics of the genus Caledia (Orthoptera, Acridinae) I. inter and intraspecific karyopype diversity // Chromosoma. -1976.-V. 54.-P. 221-243.

125. Shaw D.D. The supernumerary segment system of Stethophyma. II. Heterochromatin polymorphism and chiasma variation // Chromosoma. -1971.-V. 34.-P. 19-39.

126. She X, Horvath J.E, Jiang Z, Liu G, Furey T.S, Christ L, Clark R, Graves T, Gulden C.L, Alkan C. et al. The structure and evolution of centromeric transition regions within the human genome // Nature. 2004. -V. 430.-P. 857-864.

127. Shimizu N. Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research // Cytogenet. Genome Res. 2009. - V. 124. - P. 312-326.

128. Sullender B.W, Crease T.J. The behavior of a Daphnia pulex transposable element in cyclically and obligately parthenogenetic populations // J. Mol. Evol. 2001. - V. 53. - P. 63-69.

129. Sumner A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin // Exp. Cell Res. 1972. -V. 75. - P. 304-306.

130. Sun X, Le, H.D, Wahlstrom J.M, Karpen G.H. Sequence analysis of a functional Drosophila centromere // Genome Res. 2003. - V. 13. - P. 182-194.

131. Sutton W.S. On the morphology of the chromosome group in Brachystola magna // Biol. Bull. 1902. - V. 4. - P. 24-39.

132. Sutton W.S. The chromosomes in heredity // Biol. Bull. 1903. - V. 4,-P. 231-251.

133. Sutton W.S. The spermatogonial divisions of Brachystola magna II Kansas Univ. Q. 1900. - V. 9. - P. 135-160.

134. Tjio J.H., Levan A. The chromosome number of man // Hereditas. -1956. V. 42, No. 1-2. - P. 1-6.

135. Topp C.N., Dawe R.K. Reinterpreting pericentromeric heterochromatin // Current Opinion in Plant Biology. 2006. - V. 9. - P. 647-653.

136. Ustinova J., Achmann R., Cremer S., Mayer F. Huge genome, long repeats: Microsatellite loci in the acridid grasshopper Chorthippus biguttulus // Journal of Molecular Evolution. 2006. - V. 62. - P. 158-167.

137. Uvarov B. Grasshoppers and locusts. A handbook of general acridology. Volume I. Anatomy, physiology, development, phase polymorphism, introduction to taxonomy // Cambrige: Cambrige University Press, 1966.-P. 481.

138. Vitkova M., Karl J., Walter T., Zrzavy J., Marec F. The evolutionary origin of insect telomeric repeats, (TTAGG)n // Chromosome Research. -2005.-V. 13.-P. 145-156.

139. Wallrath L.L., Elgin S.C. Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure // Genes & Dev. 1995. - V. 9.-P. 1263-1277.

140. Warchalowska-Sliwa E., Heller K.-G. & Maryanska-Nadachowska A. Cytogenetic variability of European Tettigoniinae (Orthoptera, Tettigoniidae): Karyotypes, C-and Ag-NOR-banding // Folia Biol. Krakyw. -2005.-V. 53.-P. 161-171.

141. Waring M, Britten R.J. Nucleotide sequence repetition: a rapidly reassociating fraction of mouse DNA // Science. 1966. - V. 154. - P. 791794.

142. Webb G.C. Chromosome organisaion in Australian plage locust Chortoicetes terminifera. I. Banding relationships of the normal and supernumerary chromosomes // Chromosoma. 1976. -V. 55. -P. 229-246.

143. Weiler K., Wakimoto B. Heterochromatin and gene expression in Drosophila. // Annu. Rev. Genet 1995. - V. 29. - P. 577-605.

144. White M.J. Models of speciation. New concepts suggest that the classical sympatric and allopatric models are not the only alternatives // Science. 1968.-V. 159.-P. 1065-1070.

145. White M.J.B. Animal cytology and evolution. 3-rd edition. London: Cambridge Univ. Press, 1973. P. 961.

146. Wichman H.A., Van den Bussche R.A., Hamilton M.J., Baker R.J. Transposable elements and the evolution of genome organization in mammals // Genetica. 1992. -V. 86, No. 1-3. - P. 287-293.

147. Wienberg J, Jauch A, Ludecke H.J. et al. The origin of human chromosome 2 analyzed by comparative chromosome mapping with a DNA microlibrary // Chrom. Res. 1994. - V. 2. - P. 405-410.

148. Wilmore P.J., Brown A.K. Molecular properties of orthopteran DNA //Chromosoma. 1975.-V. 51,No. 4.-P. 337-345.

149. Wood V., Gwilliam R., Rajandream M.A., Lyne M., Lyne R. et al. The genome sequence of Schizosachharomyces pombe II Nature. 2002. -V.415.-P. 871-880.

150. Zhang J., Wang X., Podlaha O. Testing the chromosomal speciation hypothesis for humans and chimpanzees // Genome Res. 2004. - V. 14. -P. 845-851.