Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ факторов риска развития бокового амиотрофического склероза

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ факторов риска развития бокового амиотрофического склероза"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГУ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 577.21: 612.6

Кондратьева Екатерина Александровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФАКТОРОВ РИСКА РАЗВИТИЯ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА

03.00.26 - «молекулярная генетика»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2003

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук П.А. Сломинский Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор В.И. Скворцова Официальные оппоненты:

доктор биологических наук A.B. Поляков

кандидат медицинских наук A.B. Карабанов

Ведущее учреждение:

Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится <ГР» ^^¿йОРЗг. Власов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01. при Г.У. МГНЦ РАМН по адресу: г. Москва, 115478, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Г.У. Медико-Генетического Научного Центра РАМН

Автореферат разослан 003г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор биологических наук, профессор Л.Ф. Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Актуальность изучения молекулярных основ мультифакториальных неврологических заболеваний связана с высокой частотой их встречаемости, тяжелым течением, приводящим к инвалидизации и, нередко, к летальному исходу (Иллариошкин и др., 2002). Изучение роли i-енетических факторов в развитии таких заболеваний представляет собой сложную задачу, в решении которой делаются лишь первые шаги. Это связано с большим количеством генов, вовлеченных в их патогенез, сложным механизмом формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических и эпигенетических факторов.

Боковой амиотрофический склероз (БАС) - нейродегенеративное заболевание, при котором избирательно поражаются корковые мотонейроны, мотонейроны спинного мозга и мозгового ствола. Оно развивается практически на фоне полного здоровья, сопровождается прогрессирующей мышечной атрофией, множественными парезами с постепенным распространением на новые группы мышц. Уже через несколько лет после начала наступает тяжёлая инвалидизация и летальный исход главным образом вследствие пареза дыхательных и диафрагмальных мышц. В связи с этим, заболевание представляет огромную социальную и клиническую проблему.

Распространенность БАС в мире составляет 3-7/100 тыс. человек. В большинстве случаев заболевание развивается спорадически, семейная форма выявляется у 5-10% больных (Majoor-Krakauer et al., 2003). При семейной форме БАС причиной заболевания являются мутации в генах SOD1 и ALSIN (Rosen et al., 1993, Yang et al., 2001) - однако для большинства случаев БАС генетические факторы, обусловливающие специфическую гибель мотонейронов, остаются неизвестными. На основании клинико-биохимических данных предложены несколько механизмов патогенеза заболевания, основными среди которых являются: оксидантный стресс, эксайтотоксичность, нарушение процессов детоксикации и изменение структуры цитоскелета. В связи с этим, особый интерес представляют гены, продукты которых участвую^ п пбман«.<эепиши*а« i

форм кислорода в клетке, рецепции и обратном транспорте нейромедиаторов, различных фазах детоксикации ксенобиотиков, определяют цитоархитектонику нейрона.

В связи с этим весьма актуальным является поиск мутаций в кандидатных генах у больных БАС и анализ ассоциаций между их полиморфными вариантами и развитием заболевания. Такой анализ даст возможность установить вовлеченность в патогенез заболевания конкретных генов-кандидатов и в дальнейшем выявлять лиц с повышенным риском развития БЛС (Баранов и др., 2000).

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение молекулярно-генетических маркеров антиоксидантной системы, системы детоксикации и цитоскелетных белков мотонейрона при БАС и оценка возможностей использования этих маркеров в качестве критериев риска развития и прогноза течения заболевания.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Провести поиск мутаций в кодирующей области и участках экзон -интронных соединений гена медь-цинк зависимой супероксидцисмутазы у больных спорадическим БАС. Провести анализ гаплотипов по полиморфным маркерам, тесно сцепленным с геном 50Б1.

2. Провести анализ А9У полиморфизма сигнальной последовательности митохондриальной супероксидцисмутазы.

3. Исследовать делеционный полиморфизм генов системы детоксиации: глутатион-8-трансферазы Т1 и глутатион-Б-трансферазы М1.

4. Провести анализ Б/Ъ полиморфизма гена тяжёлой цепи нейрофиламентов.

5. Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов изученных генов с основными клиническими характеристиками заболевания: возрастом и вариантом начала, типом прогрессирования.

Научная новизна

Впервые в группе больных боковым амиотрофическим склерозом из России проведен комплексный молекулярно-генетаческий анализ ряда генов, предположительно вовлеченных в патогенез заболевания.

Показано, что развитие спорадической формы БАС в российской популяции может быть связано с миссенс мутациями в гене 8СЮ1 - у одного больного выявлена миссенс мутация 012Я в гетерозиготном состоянии и у двух больных выявлена миссенс мутация Б90А в гомозиготном и гетерозиготном состоянии. Впервые показано, что развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у носителя мутации В90А в гетерозиготном состоянии в составе «скандинавского гаплотипа» гена 8001.

Впервые показано, что в/Ь полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (КЛЕРН) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в русской популяции. Относительный риск развития БАС у гомозигот по Я аллелю составляет 4,2. Генотип Эв гена ЫЕРН у больных БАС также ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания, в связи с чем данный генотип может выступать в качестве прогностического фактора.

Практическая значимость Полученные данные позволяют оценить роль ряда генетических систем в развитии бокового амиотрофического склероза и являются основанием для разработки методов молекулярно-генетической идентификации лиц с повышенным риском развития данного заболевания. Результаты работы могут быть использованы в дальнейших молекулярно-генетических и клинико-неврологических исследованиях при БАС и других наследственных и мультифакториальных неврологических заболеваниях.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации в гене 80Б1 выявлены у 5,7% больных из России со спорадическим БАС.

2. Развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у гетерозиготного носителя мутации Б90А в составе «скандинавского гаплотипа» гена 80Б1.

3. Полиморфные варианты генов марганец зависимой супероксидцисмутазы (SOD2) и глутатион-8-трансфераз типов М1 и Т1 (GSTT1 и GSTM1) не ассоциированы с развитием бокового амиотрофического склероза у больных из России.

4. S/L полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (NEFH) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в изученной популяции. Генотип SS гена NEFH у больных БАС ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания.

Апробация работы Результаты исследования были представлены на 11 Международном симпозиуме по Боковому амиотрофическому склерозу и другим Болезням двигательного нейрона (ALS/MND) (Орхус, Дания, 2000), П (4) Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000), II Российской конференции молодых ученых России, ММА им. Сеченова (Москва, 2001), VIII Всероссийском съезде неврологов (Казань, 2001), 6 Конгрессе Европейской федерации неврологических сообществ (Вена, Австрия, 2002), на ежегодном съезде Европейского Общества Генетики Человека (Страсбург, Франция, 2002), на ежегодном конгрессе по геному человека, HGM- 2003 (Канкун, Мексика), VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2003), ежегодных научных конференциях Института молекулярной генетики РАН (2000-2003г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц и 15 рисунков. Библиографический указатель включает 153 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа была выполнена на образцах ДНК 51 больного спорадическим БАС. Клиническое обследование больных, включая подробный анализ ■ анамнестических и генеалогических данных, проводилось на кафедре фундаментальной и клинической неврологии Российского Государственного

Медицинского Университета. Среди больных БАС было 29 мужчин (56,9%) и 22 женщины (43,1%). Возраст начала заболевания колебался от 28 до 72 лет, составляя в среднем 55±10,9 лет. Оценка неврологического и функционального дефицита у больных проводилась с использованием шкалы Норриса (Norris et al., 1989). Шкала включает в себя 34 параметра, куда входят данные, получаемые путем опроса, проведения функциональных тестов и неврологического осмотра. Каждый параметр оценивался от 3 до 0 баллов в порядке убывания в зависимости от степени тяжести неврологических нарушений. В норме суммарная оценка по шкале составляет 98-100 баллов. Для нашей выборки больных величина падения суммарного клинического балла в течение первого года заболевания составила 25,4±15,2 балла.

Выделение геномной ДНК проводилось из лейкоцитов венозной крови методом стандартной фенол - хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989). Полимеразпую цепную реакцию (ПЦР) проводили с помощью программируемого амплификатора «МС2» («ДНК-технология», Россия) с использованием ДНК-полимеразы Taq («Силекс», Москва). Для амплификации исследованных локусов использовались праймеры, описанные ранее.

Особенности анализа исследованных локусов.

1. Поиск мутаций в гене SOD1 проводился методом PCR-SSCP анализа. Разделение ПЦР продуктов осуществляли в 8% неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 8% глицерин, при 4°С. Визуализация ПЦР продуктов проводилась путем стандартной авторадиографии. При наличии аномального SSCP паттерна фрагменты подвергали прямому секвенированию по методу Сенгера с использованием авторадиографии или на автоматическом секвенаторе «ДНК ABI PRISM 3100-Avant». В случае обнаружения при прямом секвенировании нуклеотидных замен, по возможности, подбирали информативную эндонуклеазу для подтверждения выявленного изменения. Рестрикцию проводили согласно протоколу фирмы-производителя фермента (Fsp 4HI: «СибЭнзим», Россия; Hsp AI: «Fermentas», Литва). Результаты рестрикционного анализа оценивали в 8% ПААГ с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия. В качестве маркера использовали рис 19, рестриктированную по Hinfl.

Для анализа гаплотипа по полиморфным маркерам, тесно сцепленных с геном SOD1, использовали 5 микросателлитных маркера - D21S263, D21S223, D21S63, D21S262, D21S261, расположенных на расстоянии 0,1, 0,2, 0,82, 0,82 и 0,47 сМ от гена SOD1 (Al-Chalabi et al., 1998). Последовательность праймеров для амплификации соответствующих участков взята из базы данных The Genome Database (http:/www.gdb.org). Для анализа образцов использовался денатурирующий 6% ПААГ. В качестве маркеров использовались препараты ДНК с известным гаплотипом, любезно предоставленные P.M.Andersen. Визуализация ПЦР продуктов проводилась путем стандартной авторадиографии.

2. Анализ A9V полиморфизма гена SOD2, связанный с транзицией С на Т в 1183 положении гена, осуществляли с использованием метода SSCP анализа. При этом выявляли три типа паттернов, которые соответствовали по результатам секвенирования генотипам СС, СТ и ТТ (А/A, A/V и V/V).

3. Определение аллельных вариантов генов GSTM1 и GSTT1 проводили с помощью электрофореза ПЦР продуктов в 6% ПААГ. Присутствие нормального аллеля (+) определялось наличием на электрофореграмме продукта амплификации размером 271 п.о. для гена GSTM1 и 315 п.о. для GSTT1. Отсутствие соответствующих фрагментов указывало на гомозиготность индивидуума по делеционному аллелю одного из генов (генотип 0/0). В качестве маркера использовали рис 19, рестриктированную по Hinfl.

4. При анализе S/L полиморфизма гена NEFH ПЦР проводили с использованием меченного праймера, электрофорез проводили в 8% неденатурирующем ПААГ в течение 6 часов при силе тока 15 шА. Это позволило электрофоретически разделить ПЦР продукты длиной порядка 1430 п.о. с разницей между S и L аллелями 18 п.о. Визуализация ПЦР продуктов проводилась путем стандартной авторадиографии.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с использованием пакета компьютерных программ: STAT1STIKA 6.0, БИОСТАТИСТИКА 4.03, RxC (Rows and Columns) (Roff et al., 1989). Использовались электронные базы данных PubMed, OMIM, NCBI (http:Avww.ncbi.nlm.nih.gov); The ALS Online ' Database (http:Avww.alsod.org), The Genome Database (http:Avww.gdb.org).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ кодирующей области и участков экзон - интронных соединений гена медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы (вОШ).

При ББСР анализе гена 80Б1 было выявлено три аномальных паттерна полос в различных участках гена у восьми больных.

Один аномальный паттерн был выявлен при анализе 4 экзона гена 8001 и встретился у двух больных (рис.1).

Анализ первичной последовательности ДНК 4 экзона гена SOD1 у этих

к замене аспарагиновой кислоты на аланин в 90 положении аминокислотной последовательности белка (Б90А). При этом одна больная оказалась гомозиготной, а другая гетерозиготной по мутации Э90А (рис.2).

Рис. 1. ББСР анализ 4 экзона гена 8001. 1: Контроль

2, 3: Больные БАС. Стрелкой указаны фрагменты с аномальным ББСР паттерном.

пациенток выявил одну и ту же миссенс мутацию: замену А1078—>С, приводящую

Рис.2.

Фрагмент секвенирования 4 экзона гена SOD] у больной БАС, гомозиготной по мутации D90A. Место нуклеотидной замены А на С указано точкой.

Замена А на С приводит к формированию нового сайта рестрикции для фермента Рзр4Н1, который уже присутствует в «нормальном аллеле». Это существенно упрощает идентификацию данной мутации (рис.3.).

113 1W Норна --QCTQA-GCCGC-

¡12_ 7e I iei

D90A

QCTQO

-GCCGC-

,—r=7 pi—

I F»p4H1 I | Ftp4HI |

Рис. 3. Схема рестрикцтнного анализа фрагмента 4 экзона гена SOD1 в случае аллеля дикого типа и при наличии мутации D90A.

221п.н.—Рис. 4. Рестрикционный анализ

4 экзона гена SOD1 у больных с

** iff "—п,и' гомозиготной и гетерозиготной " " • —101 пн. „ . г

85 , _7бпн мутациеи D90A.

1: маркер; 2: контроль;

65 п я. ► -' гомозигота по мутации D90A;

1 2 3 " ^D Н гетеРозигота п0 мутации D90A.

В обоих случаях у этих пациенток выявлены признаки поражения центральных и периферических мотонейронов на уровне поясничного и шейного утолщений с восходящим типом распространения. У больной с мутацией D90A в гомозиготном состоянии заболевание медленно прогрессирует уже более 20 лет, при сравнительно раннем возрасте начала - 49 лет. Из анамнеза жизни больной известно, что ее родители состояли в близкородственном браке, причем никто в роду подобным заболеванием не страдал. Это может свидетельствовать о скрытом носительстве мутантного аллеля у родителей, который в гомозиготном состоянии привел к развитию заболевания. Т.е. в данном случае речь идет о семейной форме БАС с аутосомно- рецессивной формой наследования. У больной, гетерозиготной по мутации D90A, заболевание началось позднее - в возрасте 55 лет, но характеризуется быстрым прогрессированием. Таким образом, мутация D90A в гомо- и гетерозиготном состоянии ведет к разным вариантам течения БАС.

Известно, что мутация D90A в отличие от остальных мутаций гена SOD1, для которых описан только аутосомно-доминантный тип наследования, может наследоваться как по аутосомно-доминантному, так и по аутосомно-. рецессивному типу. Считается, что мутация D90A с рецессивным характером наследования имеет единое происхождение и берет свое начало в северных

районах Швеции. Это подтверждается анализом гаплотипов по полиморфным маркерам, тесно сцепленным с геном вСЛМ. У всех больных с этой мутацией в Скандинавии она ассоциирована с одним и тем же так называемым "скандинавским" гаплотипом (А1-СЬа1аЫ е1 а1., 1998). В тоже время доминантно наследуемая мутация Б90А ассоциирована с различными гаплотипами гена 8СЮ1.

Анализ полиморфного гаплотипа гена 8СЮ1 у нашей больной, гомозиготной по мутации В90А, также показал полное соответствие "скандинавскому" гаплотипу. Это говорит о вероятном происхождении мутации из Скандинавии (табл. 1.).

Этот же анализ был проведен у больной, гетерозиготной по мутации 1Э90А, и ее отца, у которого рестрикционный анализ 4 экзона гена ЯОВ1 также выявил наличие мутации В90А в гетерозиготном состоянии. Результаты анализа позволяют утверждать, что и в этих случаях данная мутация ассоциирована со «скандинавским» гаплотипом (табл.1).

Гаплотип Гаплотип Гаплотип отца

больной, больной, больной,

гомозиготной гетерозиготной гетерозиготной

по Р90А по 090А по 090А

Б218263 1 1 1 2 1 5

Э218223 3 3 3 2 3 3

Б21863 10 10 10 10 10 13

Ш18262 4 4 4 5 4 6

Б218261 2 2 2 2 2 2

Таблица 1. Анализ гаплотипа по полиморфным маркерам, тесно сцепленным с геном 50£>/ у больной, гомозиготной по 090А; у больной, гетерозиготной по П90А и ее отца.

Таким образом, частота мутантного аллеля Б90А на фоне «скандинавского» гаплотипа в нашей выборке больных составила 3%.

В северных районах Швеции и Финляндии, среди населения, рецессивный аллель Б90А встречается с частотой 1-2% (Андерсен, 2001). Мы провели исследование частоты встречаемости мутации Б90А в ряде российских

популяций. Были проанализированы случайные выборки из коренного населения следующих популяций: русские (Курская область) (п=75), русские (Новгородская область) (п=100), русские (Холмогоры) (п=50), белорусы (п=115). В результате был выявлен только один гетерозиготный носитель мутации в новгородской популяции. Частота аллеля Б90А составила 0,15%. Это говорит о том, что у славян мутация Б90А является редкой.

Проведение гаплотипирования гена 8СГО1 у гетерозиготного носителя мутации 090А из новгородской популяции оказалось невозможным, но выявление мутации именно в Новгороде косвенным образом подтверждает ее скандинавское происхождение, поскольку именно новгородцы с древних времен чаще контактировали с выходцами из Скандинавии. И в более поздний период эта часть России была областью активных контактов между русскими и шведами - например, в период русско-шведских войн конца ХУП-начала XVIII вв.

Существует предположение, что мутация Б90А с рецессивным характером наследования прочно сцеплена с протективным фактором, который нивелирует проявления мутантного аллеля. Только будучи в гомозиготном состоянии, она приводит к развитию заболевания. При этом для всех пациентов, гомозиготных по Б90А характерен однородный и «мягкий» фенотип, длительное течение заболевания (Андерсен, 2001). Надо отметить, что аналогичный фенотип наблюдается у нашей больной, гомозиготной по Б90А.

Считается, что у гетерозиготных носителей мутации Э90А на фоне "скандинавского" гаплотипа заболевание не развивается. Однако полученные нами данные говорят о том, что у носителя мутации 090А в гетерозиготном состоянии на фоне скандинавского гаплотипа может наблюдаться развитие заболевания. В связи с низкой частотой встречаемости мутации Б90А в случайных выборках из России, маловероятно, что выявление данной мутации у больной БАС в гетерозиготном состоянии является случайным совпадением и не связано с развитием патологического процесса.

Скорее всего, проявление этой мутации в гетерозиготном состоянии зависит от других генетических и эпигенетических факторов. Одним из таких факторов может быть полиморфизм генов системы детоксикации. Например, при дальнейшем анализе полиморфизма генов ввТТ! и ввТМ! (п.З.) у больной,

гетерозиготной по D90A, было выявлено, что оба гена представлены нулевыми аллелями: GSTTl(0/0) и GSTM1(0/0) - то есть у нее отсутствуют одни из ферментов, выполняющих в клетке функцию детоксикации. У отца больной, также гетерозиготного по мутации D90A, клиническая картина БАС (несмотря на возраст более 90 лет) полностью отсутствовала. При этом у него наблюдается более благоприятный генотип по системе генов GST: GSTT 1(0/0), GSTM1(+).

У одного больного при анализе гена ЗОБ1 была выявлена миссенс мутация в 1 экзоне, являющаяся заменой в гетерозиготном состоянии в на С в 117 позиции гена. Эта мутация приводит к замене глицина на аргинин в 12 положении аминокислотной последовательности белка (рис. 5.).

Asp Oly

Pro

G A cjiG CCCA

Рис. 5. Фрагмент секвенирования 1 экзона гена SOD1 с мутацией G12R.

Ранее данная мутация была описана у больного с семейным анамнезом БАС из Италии, у которого заболевание отличалось медленным типом прогрессирования. Кроме этого, мутация 0211 была описана еще у четырех больных БАС также из Италии (йеИега й а1., 2001).

У нашего больного в течение первого года заболевание также развивалось медленно, но потом начало быстро прогрессировать. Однако, несмотря на разный характер прогрессирования, и в том, и в другом случае наблюдался поясничный дебют заболевания с преобладанием пирамидного синдрома. Таким образом, можно сделать предположение, что мутация 012Я определяет скорее вариант начала заболевания, чем его скорость прогрессирования.

При дальнейшем анализе гена 8СШ1 нами впервые была выявлена замена А на С в 35 положении нитрона 3. Она встретилась у 5 больных, причем во всех случаях в гетерозиготном состоянии (рис. 6.).

Э С |}р ТА

1_1_

| Рис. 6. Фрагмент секвенирования

3 интрона с заменой 1УБЗ+35А>С.

С помощью программ SpliceView (Institute of Advanced Biomedical Technologies (ITBA)) и Splice Site Prediction (Berkeley Drosophila Genome Progect) был проведен анализ влияния этой замены на предполагаемый характер сплайсинга пре мРНК. Однако каких-либо изменений выявлено не было. Скорее всего, эта замена не ведет к исчезновению или появлению новых сайтов сплайсинга в области экзона 3.

Замена А на С в 35 положении 3 интрона приводит к появлению сайта рестрикции для фермента HspAI (рис.6.). С помощью рестрикционного анализа проведено исследование частоты встречаемости данной замены в различных популяциях России (табл. 2.).

Популяция Частота аллеля IVS3+35C, %

Русские (Архангельская область) п=47 3,19

Русские (Курская область), п=57 1,75

Якуты, п=75 2,67

Больные БАС (Русские), п=51 4,90

Таблица 2. Частота встречаемости аллеля IVS3+35C в различных популяциях России.

В результате было выявлено, что аллель IVS3+35C встречается с частотой от 1,8% до 3,2% в случайных выборках разных этнических групп. Несмотря на то, что частота аллеля в группе больных несколько выше - 4,9%, данные различия не являются достоверными. Скорее всего, выявленная замена является редким нормальным полиморфизмом и не ассоциирована с развитием бокового амиотрофического склероза.

Таким образом, в результате анализа кодирующей области гена SOD1 у 51 больного БАС, у трех больных (5,7%) были выявлены мутации. Это свидетельствует о том, что значащие мутации в кодирующей области этого гена не играют ведущей роли в патогенезе спорадического БАС в русской популяции. Частота встречаемости мутаций SOD1 у больных БАС не отличается от общемировых показателей: 4% у пациентов из Скандинавии, 3% и 7% в разных выборках пациентов из Великобритании (Andersen et al., 1996; Jackson et al, 1997).

Еще раз нашла свое подтверждение гипотеза о том, что часть больных спорадическим БАС с мутациями SOD1 могут иметь «скрытый» семейный анамнез заболевания (Williams et al., 1988).

2. Анализ полиморфизма сигнальной последовательности SOD2.

Ранее был выявлен полиморфизм сигнальной последовательности фермента митохондриальной супероксиддисмутазы, представляющий собой замену в 9 положении аланина на валин (A9V). Предполагается, что полиморфизм, влияет на вторичную структуру сигнального пептида, и играет важную роль в переносе фермента из цитоплазмы в митохондриальный матрикс, определяя его компартментализацию (Shimoda-Matsubayashi et al., 1996).

Результаты анализа A9V полиморфизма гена SOD2 представлены на

рис.7.

Бальные БАС Кэнтрапь

Рис. 7. Варианты генотипов гена 50И2 в группе больных БАС и контроле. При сравнении соответствующих частот аллелей и генотипов в анализируемых выборках было установлено, что различия между ними не являются статистически достоверными (р>0,05) (табл.3).

Распределение генотипов по А/У полиморфизму гена 8СЮ2 в группе больных и группе контроля соответствовало уравнению Харди-Вайнберга (Х2=0,0; р=1 и х2=0,16; р=0,9 соответственно).

Россия Швеция

Больные БАС N = 51 Контроль N = 50 Больные БАС N = 72 Контроль N=136

А 46,1% 45% 54% 41%

V 53,9% 55% 46% 59%

А/А 21,6% 18% 29,2% 15,5%

A/V 49% 54% 48,6% 50,7%

V/V 29,4% 28% 22,2% 33,8%

Таблица 3. A9V полиморфизм SOD2 у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом и в контроле.

Данные результаты отличаются от полученных ранее при аналогичном исследовании, которое проводилось в группе шведских пациентов. Van Landeghem GF et al. были выявлены достоверные различия в распределении частот генотипов между группой из 72 больных БАС и группой контрольных лиц из 136 человек. Причем, индивидуумы, гомозиготные по аллелю А, имели больший риск развития заболевания (Van Landeghem et al., 1999).

В другом проведенном ранее аналогичном исследовании в группе из 20 больных БАС американцев по сравнению с 10 лицами контрольной группы была выявлена преимущественная гомозиготность по носительству аллеля V. Возможно, данные результаты следует оценивать критически ввиду малой

контрольной группы и несоответствия исследуемой группы уравнению Харди-Вайнберга (ТотЫуп е1 а1., 1998).

В отличие от двух вышеописанных случаев, в нашей популяции, напротив, частота аллельных вариантов и генотипов по А9У полиморфизму сигнальной последовательности фермента митохондриальной супероксиддисмутазы не отличается достоверно у больных БАС и в случайной выборке. Противоречивый характер результатов по сравнению с ранее проведенными исследованиями может свидетельствовать о том, что данный полиморфизм обладает определенной этнической специфичностью. Таким образом, в нашей популяции не выявлено ассоциации данного полиморфизма с развитием БАС.

Далее был проведен анализ возможной связи полиморфизма гена 8СЮ2 с характером развития патологического процесса. Для этого был проведен корреляционный анализ между генотипом гена 80Б2 и величиной потери суммарного клинического балла в первый год развития заболевания. В результате, между этими показателями достоверных различий выявлено не было (критерий Ньюмена Кейлса, р>0,05). Следовательно, данный полиморфизм в группе русских больных не связан с тяжестью клинических проявлений бокового амиотрофического склероза.

3. Анализ полиморфных аллелей генов глутатион-в-трансфераз М1 и Т1

У больных спорадическим БАС был проведен анализ делеционного полиморфизма генов в8ТМ1 и 08ТТ1. Результаты анлиза предаавлены в табл.4. Из приведенных данных видно, что в контрольной популяции и у больных БАС были обнаружены генотипы + и 0/0 для обоих анализируемых генов. При сравнении частоты гомозигот по делеции гена 08ТТ1 (0/0 генотип) было установлено, что в обеих исследуемых выборках она практически не отличается. В то же время при анализе гена 08ТМ1 наблюдалось отличие в частоте встречаемости генотипа 0/0 у больных БАС и в контрольной выборке - в группе больных его частота оказалась выше (38,5%) по сравнению с контрольной группой (24%). Однако данные различия не являются статистически достоверными (х2=2,488, р<0,2).

Далее был проведен анализ частоты комбинации различных генотипов генов ввТЛ и 08ТМ1 в двух выборках. В результате были обнаружены все возможные сочетания генотипов: С8ТП+Л38ТМ1+; 08ТТ1+/08ТМ1(0/0); 08ТТ1(0/0)/С8ТМ1+ и 08ТТ1(0/0)/08ТМ1(0/0) (табл. 4.). Наличие комбинации генотипов 08ТТ1(0/0)/08ТМ1(0/0) свидетельствует о том, что оба фермента присутствуют в неактивной форме. Сочетание генотипов ввТЛ (0/0)/С8ТМ1 (0/0) в группе больных встречается чаще - 9,8% по сравнению с контролем - 2%, а частота 08ТТ1+/08ТМ1+ напротив, выше в контрольной группе. Однако наблюдаемые отличия в комбинации различных генотипов в группе больных БАС и контрольной выборке не являются статистически значимыми (табл. 4.).

Больные БАС N=51 Контроль N=50 Критерий х2 Р

08ТТ1(+) 78,4% 88,0% 1,558 Р<0,25

С8ТТ1(0/0) 21,6% 12,0% 1,558 Р<0,25

08ТМ1(+) 60,8% 76,0% 2,488 Р<0,2

ОБТМ 1(0/0) 39,2% 24,0% 2,488 Р<0,2

СвТЛ (0/0)/ ввТМ 1(0/0) 9,8% 2% 2,652 Р<0,2

С8ТТ1(+)/ С8ТМ1(0/0) 29,4% 22% 0,634 Р<0,5

08ТМ1(+)/ ОвТТ! (0/0) 11,8% 10% 0,060 Р<0,9

С8ТМ1(+)/ С8ТТ1(+) 49% 66% 2,675 Р<0,2

Таблица 4. Сравнительный анализ частоты генотипов (+) и (0/0) и (

комбинаций генов СЯТМ! и С8ТТ1 в группе больных БАС и контрольной выборке. "

Ранее подобные исследования по анализу генов 08ТМ1 и 08ТТ1 при БАС проводились в Великобритании и была выявлена слабая ассоциация между гомозиготностью по делеционному аллелю гена ОвТП и развитием БАС, 1

I

причем эта ассоциация наблюдалась только у мужчин ^гоотЬе^еп а1., 1999). ,

Таким образом, из полученных результатов следует, что в группе русских '

больных боковым амиотрофическим склерозом не выявлено ассоциации данного полиморфизма с развитием заболевания, что, в целом, соответствует данным,

полученным на других выборках больных. В то же время большая встречаемость комбинации генотипов С8ТТ1(0/0)/С8ТМ1(0/0) в группе пациентов может рассматриваться как фактор, усугубляющий действие других патогенетических факторов при БАС. В частности, данный генотип был выявлен у больной, гетерозиготной по мутации Б90А гена 8001. Как уже говорилось выше, считается, что мутация Б90А в гетерозиготном состоянии на фоне «скандинавского» гаплотипа не приводит к развитию заболевания.

4. Анализ полиморфизма гена тяжелой цепи нейрофиламентов.

При БАС выявлено аномальное скопление и агрегация нейрофиламентов в перикариуме и аксонах мотонейронов, что является характерной чертой патологии; отмечены также нарушения аксонального транспорта и структуры цитоскелета мотонейронов. Нейрофиламенты представляют собой сополимер, состоящий из лепсой, средней и тяжелой цепей. Мы провели анализ Б/Ь полиморфизма гена тяжелых цепей нейрофиламентов (ЫЕРН) у больных БАС и у здоровых представителей из московской популяции. 8 аллель соответствуе 44 лизин-серин-пролиновым (КвР) повторам в С-концевом домене белка, Ь аллель-45 повторам (А1-СЫаЫ е1 а1., 2003).

На рис. 8. изображен фрагмент элекгрофоретического анализа полиморфизма гена ЫЕРН. На дорожках 1 и 2 видны два фрагмента: верхний соответствует длинному аллелю (Ь), нижний - короткому аллелю (в). В данном случае наблюдается генотип гена ИЕРН. Дорожка 3 содержит только верхний фрагмент, что указывает на гомозигсггность по Ь аллелю. На дорожке 4 есть только нижний фрагмент, что свидетельствует о гомозиготности по 8 аллелю.

I. ^^

Б аллель'

12 3 4

Рис. 8. Фрагмент электрофоретического анализа полиморфизма гена ИЕРН. Дорожки 1, 2: генотип ЬБ; дорожка 3: генотип ЬЬ; дорожка 4: генотип 55.

Результаты анализа частоты Ь и 8 аллелей представлены в табл. 5.

Больные БАС N=51 Контроль N=50 х2 Р

ь 50% 62% 2,455 Р=0,12

Б 50% 38% 2,455 Р=0,12

IX 33,3% 32% 0,005 Р=0,95

33,3% 60% 6,184 Р=0,013

33,3% 8% 8,361 Р=0,004

Таблица 5. Полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов у больных БАС и в контроле.

Распределение генотипов по Э/Ь полиморфизму гена ИЕРН в группе больных и группе контроля соответствовало уравнению Харди-Вайнберга (Х2=3,28; р=0,21 и ^=2,\9\ р=0,37 соответственно).

Как видно из таблицы 5, аллели Ь и в встречаются как в группе больных, так и в группе контроля. При этом значения частот аллелей в соответствующих группах не имеют достоверных различий (р>0,05).

Далее был проведен сравнительный анализ частоты встречаемости генотипов гена МЕРН в группе больных и в контроле. Результат анализа показал, что генотип ББ у больных БАС встречается чаще - 33,3%, чем в случайной выборке - 8%. При этом наблюдаемые различия носят высоко достоверный характер (Критерий %2; 8,361, р=0,004) (табл.5.). Эти данные позволяют предположить, что ЭЭ генотип является фактором риска развития БАС.

Ранее подобное исследование проводилось у больных БАС из Великобритании и Скандинавии. Частоты Ь и Б аллелей между группой пациентов и контроля достоверно не отличались, что совпадает с результатами нашего исследования (табл. 6.). При анализе генотипов гена ИЕРН у больных БАС из Скандинавии и Великобритании и здоровых индивидуумов, достоверных различий также выявлено не было. В обеих популяциях между группой больных и контроля наблюдается почти одинаковое распределение частот генотипов гена ИЕРН (табл. 6.) (А1-С11а1аЫ а а1., 1999).

Великобритания Скандинавия

Больные БАС N = 205 Контроль N = 202 Больные БАС N = 321 Контроль N=159

ь 60% 59,7% 62,5% 58,8%

Б 40% 40,3% 37,5% 41,2%

IX I 38% 36,2% 39,6% 34,6%

Ьв 44% 47% 45,8% 48,4%

88 I 18% 16,8% 14,6% 17%

Таблица 6. Полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов у больных БАС из Великобритании и Скандинавии и в контроле.

Таким образом, можно сделать предположение, что 8в генотип представляет собой фактор риска, который обладает определенной этнической специфичностью. В частности, 8в генотип гена МП-Н можно рассматривать как фактор риска развития БАС, характерный для нашей популяции.

Относительный риск развития БАС у гомозигот по в аллелю составляет 4,2, границы доверительного интервала: [1,49; 11,69]. Поскольку границы доверительного интервала лежат справа от единицы, то относительный риск статистически значимо повышен в группе больных по отношению к группе контроля (Реброва и др., 2002).

Далее был проведен анализ возможной связи полиморфизма гена ЫБРН с характером развития патологического процесса. Для этого величина потери суммарного клинического балла (КБ) в течение первого года развития заболевания оценивалась в группах больных с генотипами IX, ЬБ и вв. Проведенный анализ показал, что в среднем, самое низкое значение потери суммарного КБ наблюдается в группе больных с генотипом IX (18,8±12,4), а самое высокое с генотипом ББ (31,0±16,3). Промежуточное значение наблюдалось у больных с генотипом ЬБ (24,7±12,1). Более того, между группами больных с генотипами IX и Б8 были получены статистически значимые отличия по величине падения суммарного КБ (критерий Ньюмена-Кейлса, q=3,671, р<0,05) (рис. 9.).

Рис. 9. Величина потери суммарного клинического балла по шкале Норрисау больных с различными генотипами гена ЫЕРН.

Как уже было сказано выше, суммарный КБ отражает уровень неврологического и функционального дефицита у больных БАС. Следовательно, величина его потери за год позволяет судить о скорости развития патологического процесса у пациента. В связи с этим, можно заключить, что быстропрогрессирующий характер заболевания достоверно чаще наблюдается у больных с генотипом ЭЭ. И, напротив, для больных с генотипом IX характерно «мягкое», медленное развитие заболевание.

Таким образом, из полученных результатов следует, что наличие ББ генотииа гена ЫЕРН с одной стороны повышает риск развития БАС. С другой стороны, если развитие заболевания уже наступило, у больных с ББ генотипом оно будет носить более тяжелый и быстропрогрессирующий характер, чем у больных с другими вариантами генотипов гена КЕРН.

Известно, что КБР повторы С-концевого домена играют важную роль в процессах фосфорилирования/дефосфорилирования различных цепей нейрофиламентов и тем самым влияют на их взаимодействие между собой и с другими белками цитоскелета. «Укороченный» С-концевой домен может обладать сниженным аффинитетом к белкам цитоскелета и тем самым приводить к нарушению цитоархитектоники аксона и нейрона в целом.

ВЫВОДЫ

1. У больных боковым амиотрофическим склерозом (БАС) проведен анализ мутаций в кодирующей области гена медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы (8001). У трех больных (5,7%) выявлены две миссенс мутации: 01211 (у одного больного) и 090А (у двух больных - в гомозиготном и гетерозиготном состоянии).

2. Впервые показано, что развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у гетерозиготного носителя мутации 090А в составе «скандинавского гаплотипа» гена 8001.

3. В интроне 3 гена БОБ! описан новый однонуклеотидный полиморфный сайт - ГУ83+35 А>С, не ассоциированный с развитием БАС. Аллель 1У83+35 С встречается с частотой 4,9% у больных и с частотой от 1,8% до 3,2% в случайных выборках из Курской, Архангельской областей и Якутии.

4. Изучение полиморфных вариантов генов марганец зависимой супероксид дисмутазы (80Б2) и глутатион-Б-трансфераз типов М1 и Т1 (ввТЛ и в8ТМ1) показало отсутствие их ассоциации с развитием БАС у больных из России.

5. Впервые показано, что в/Ь полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (МЕБН) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в русской популяции. Частота ББ генотипа в группе больных составляет 33,3%, в контрольной выборке - 8% (х2=8,361, р=0,004). Относительный риск развития БАС у гомозигот по Б аллелю составляет 4,2.

6. Обнаружено, что генотип вЭ гена ИЕРН у больных БАС также ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания. Динамика нарастания неврологического и функционального дефицита у ББ гомозигот достигает 31,0± 16,3 баллов/год по шкале Норриса, тогда как у IX гомозигот она составляет 18,8+12,4 баллов/год (р<0,05).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Shadrina M.I., Levitsky G.N., Kondratyeva Е.А., Slominsky P.A., Skvortsova V.I., Limborska S.A. SOD1 mutation screening in sporadic ALS patients from Russia. Am J Hum Genet 1999 Oct; 65(4): A490.

2. Скворцова В.И., Лимборская C.A., Сломинский П.А., Левицкая Н.И., Левицкий Г.Н., Шадрина М.И., Кондратьева Е.А. Спорадический боковой амиотрофический склероз, ассоциированный с Асп90Ала мутацией медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы в России. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. М. 2000, №1, стр. 44-47.

3. Slominsky Р.А., Shadrina M.I., Kondratyeva Е.А., Tupitsina T.V., Levitsky G.N., Skvortsova V.I., Limborska S.A. CuZn-superoxide dismutase gene in sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients from Russia: Asp90Ala (D90A) mutation and novel rare polymorphism IVS3+35 A>C. Hum. Mutat. 2000 Sep;16(3):277-278.

4. Skvortsova V.I., Limborska S.A., Slominsky P.A., Levitskaya N.I., Levitsky G.N., Shadrina M.I., Kondratyeva E.A. Sporadic amyotrophic lateral sclerosis, associated with the D90A CuZn-superoxide dismutase mutation in Russia. 11 International Symposium in ALS and other motor neurone disorders, 2000, Suppl 3, Vol.1, p.25.

5. Кондратьева E.A., Сломинский П.А., Шадрина М.И., Левицкий Г.Н., Скворцова В.И., Лимборская С.А. Asp90Ala мутация в гене CuZn-содержащей супероксиддисмутазы у больных спорадическим боковым амиотрофическим склерозом из России. Второй (четвертый) российский съезд медицинских генетиков. Тезисы докладов. Курск: изд-во КГМА, 2000. т. l.c.112.

6. Кондратьева Е.А., Шадрина М. И., Тупицина Т.В., Левицкий Г.Н. Анализ генетических факторов в развитии спорадического бокового амиотрофического склероза у пациентов из России. Материалы II Российской конференции молодых ученых России. 2001г., Москва, ММА им. Сеченова. ИД "Гэотар-Мед", 2001,с. 132.

7. Skvortsova V.I., Limborska S.A., Slominsky Р.А., Levitskaya N.I., Levitsky G.N., Shadrina M.I., Kondratyeva E.A. Sporadic ALS associated with the D90A Cu,Zn superoxide dismutase mutation in Russia. European Journal of Neurology. 2001, 8:167-172.

8. Levitsky G.N., Slominsky P.A., Levitskaya N.I., Brusov O.S., Kondratyeva E.A., Limborska S.A., Skvortsova V.l. Homozygosity for short allele (SS) of heavy neurofilament subunit gene is associated with ALS and increased CuZnSOD activity in erythrocytes. 6th EFNS Congress, Vienna. European Journal of Neurology 2002, Vol. 9, Suppl. 2, p. 14.

9. Levitsky G.N., Slominsky P.A., Levitskaya N.I., Lisko A.I., Kondratyeva E.A., Limborska S.A., Skvortsova V.l. A9V signal sequence dimorphism of MnSOD gene and the progression rate in Russian ALS patients. 6th EFNS Congress, Vienna. European Journal of Neurology 2002, Vol. 9, Suppl. 2, p. 64.

lO.Shadrina M., Kondratyeva E., Slominsky P., Levitsky G., Skvortsova V., Limborska S. An association between ALS and the NFH gene polymorphism. Eur. J. Hum. Genet. V.10, S.l, p. 74,2002.

11.М.И. Шадрина, E.A. Кондратьева, П.А. Сломинский, Н.И. Левицкая, Г.Н. Левицкий, В.И Скворцова, С.А. Лимборская. "Полиморфные маркеры генов глутатион S-трансфераз Ml и Т1 и болезнь двигательного нейрона у пациентов из г. Москвы". Генетика, 2002, 11,1566-1568.

12. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А., Брусов О.С., Карахан В.Б., Герасимова М.М., Левицкая Н.И., Левицкий Г.Н., Шадрина М.И., Кондратьева Е.А., Алехин A.B., Сердюк A.B., Ботвинко Т.М. Ассоциация гомозиготности по короткому аллелю (S) гена тяжелых нейрофиламентов с болезнью двигательного нейрона и развитием оксидантного стресса. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2003, №2, стр. 38-44.

13.МЛ. Shadrina, P.A. Slominsky, E.A. Kondratyeva, A.L. Zherebtsova, A.Alekhin, V.l. Skvortsova, S.A. Limborska. Molecular genetic analysis of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients from Russia. Human Genome Meeting. Cancun, Mexico 2003. Programme and Abstract Book. №64, p.29.

14. Левицкий Г.Н., Алехин A.B., Сердюк A.B., Кондратьева Е.А., Скворцова В.И., Лимборская С.А. Структурный диморфизм A9V сигнальной последовательности гена марганцевой супероксидцисмутазы и скорость прогрессирования болезни двигательного нейрона. Материалы VI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей. Санкт- Петербург, 2003, стр.100.

i

Отпечатано в типографии «Эребус-Принт» по адресу: Москва, ул. Маршала Соколовского, д Тираж 100 экз. Заказ № 1507-16.

2-oqi - A

P 1 ? 3 6 б

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кондратьева, Екатерина Александровна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Клиническая характеристика и эпидемиология бокового амиотрофического склероза.

2. Особенности семейной формы бокового амиотрофического склероза.

3. Современные представления об этиопатогенезе бокового амиотрофического склероза.

1. Оксидантный стресс как основной этиопатогенетический механизм развития бокового амиотрофического склероза.

2. Эксайтотоксичнасть.

3. Нейрофиламенты и развитие БАС.

4. БАС как инфекционное заболевание.

5. Аутоиммунная гипотеза патогенеза БАС.

6. Генетические факторы риска развития бокового амиотрофического склероза.

6.1. Ген медь- цинк зависимой супероксиддисмутазы.

6.1.1. Общая характеристика 8001.

6.1.2 .Мутация Б90А.

6.1.3. Мутации 8001 и развитие оксидантного стреса.

6.2. Ген марганец зависимой супероксиддисмутазы.

6.3. Гены системы детоксикации: глутатион-8-трансферазы типов Т1 и М1.

6.4. Генетические дефекты цитоскелета мотонейронов.

Материалы и методы.

I. Общая характеристика больных.

И. Молеулярно- генетические методы исследования.

1. Выделение ДНК из клеток крови человека.

2. Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3. Введение радиоактивной метки в праймеры для ПЦР амплификации.

4. Электрофорез в полиакриламидном геле.

4.1. Исходные растворы для проведения электрофореза.

4.2. ББСР анализ.

4.3. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

4.4. Рестрикционный анализ фрагментов гена ЗОИ!.

4.5. Анализ полиморфизма генов глутатион-Б-трансфераз Т1 и М

4.6. Анализ полиморфизма гена тяжелой цепи нейрофиламентов.

4.7. Анализ гаплотипов по полиморфным маркерам, тесно сцепленным с геном SOD1.

III. Статистическая обработка результатов.

Результаты и обсуждение.

1. Общая характеристика больных.

2. Анализ гена SOD1.

3. Анализ полиморфизма сигнальной последовательности SOD2.

4. Анализ полиморфных маркеров генов глутатион-8-трансфераз М1 и Т1.

5. Анализ полиморфизма гена тяжелой цепи нейрофиламентов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ факторов риска развития бокового амиотрофического склероза"

Последнее десятилетие связано с появлением целого ряда новейших технологий и множеством фундаментальных открытий в области молекулярной генетики и молекулярной биологии, а также успешной реализацией Международной программы «Геном человека». Это способствовало значительному прогрессу в понимании природы многих наследственных заболеваний человека. В основном это относится к моногенным заболеваниям, имеющим простой менделевский характер наследования. В тоже время молекулярно-генетический анализ мультифакториальных болезней, или болезней с наследственной предрасположенностью, представляет собой гораздо более сложную задачу, в решении которой делаются лишь первые шаги. Это связано с большим количеством генов, вовлеченных в патогенез таких заболеваний и сложным механизмом формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды (3, 11).

Среди мультифакториальных заболеваний человека особое место занимают заболевания нервной системы. Актуальность изучения молекулярных основ мультифакториальных неврологических заболеваний связана с высокой частотой их встречаемости, тяжелым течением, сопровождающимся инвалидизацией и приводящим в большинстве случаев к фатальному исходу (10).

Одно из таких заболеваний — боковой амиотрофический склероз (БАС). Это нейродегенеративное заболевание, которое сопровождается избирательной гибелью мотонейронов головного и спинного мозга. Оно развивается практически на фоне полного здоровья, носит прогрессирующий характер и уже через несколько лет после начала приводит к тяжёлой иивалидизации и фатальному исходу. Распространённость БАС в мире составляет 3—7/100 тыс. человек. В большинстве случаев боковой амиотрофический склероз представляет собой спорадическое заболевание мультифакториальной этиологии. У 510% больных, однако может выявляться положительный семейный анамнез (97).

Ранее, при изучении факторов риска БАС, большое значение придавали образу жизни пациента, воздействию вирусных агентов, аутоиммунным процессам и др. Однако, наличие семейных форм БАС и клинической гетерогенности внутри одной родословной свидетельствуют о вовлеченности генетических факторов в развитие заболевания. В 1993 г. Rosen и коллектив исследователей показали, что, примерно четверть семейных случаев БАС связана с мутациями гена медь-цинк зависимой супероксидцисмутазы (SOD1) (123). При спорадической БАС мутации SOD1 встречаются у 5-7% больных. Однако для большинства случаев БАС, которые в основном представлены спорадическими формами, роль генетических факторов в развитии заболевания остается неизвестна. Предполагается наличие генетически обусловленного нейротоксического фактора, или, скорее, комбинации факторов, которые специфически воздействуют на мотонейроны.

Согласно данным литературы, существует несколько основных гипотез развития БАС. Это оксидантный стресс, эксайтотоксичность, нарушение процессов детоксикации, механизма аксонального транспорта и структуры цитоскелета мотонейронов, воздействие вирусов, иммунные нарушения и др (97).

В настоящее время одним из важнейших звеньев патогенеза заболевания считают оксидантный стресс (64). Это повреждающее действие, которое оказывают на клетки свободные радикалы вследствие увеличения их продукции, ослабления ферментативных механизмов антиоксидантной защиты либо сочетания этих факторов. В связи с этим, особый интерес представляют гены, продукты которых участвуют в сложном обмене активных форм кислорода в клетке. В первую очередь к ним относятся гены, кодирующие ферменты супероксиддисмутазы: медь-цинк зависимую супероксиддисмутазу, локализованную в цитоплазме и марганец зависимую супероксиддисмутазу, локализованную в митохондриях (68).

Детоксикация ксенобиотиков является одним из ключевых метаболических процессов в организме. Важная роль в процессах детоксикации принадлежит ферментам глутатион- в- трансферазам Т1 и М1 (90).

При БАС страдает система аксонального транспорта и трофики мотонейронов, в связи с чем особый интерес представляют гены, кодирующие цитоскелетные белки, в частности белки нейрофиламентов (46).

На данном этапе изучения роли генетической составляющей в патогенезе бокового амиотрофического склероза одним из значимых методов является анализ генетических ассоциаций - исследование полиморфизма в генах кандидатах и его связи с заболеванием. Такие исследования дают возможность установить вовлеченность в патогенез заболевания конкретных генов-кандидатов и на основе этого в дальнейшем выявить группы лиц с риском развития БАС (3).

В связи с этим целью настоящей работы было: -Изучение молекулярно-генетических маркеров антиоксидантной системы, системы детоксикации и цитоскелетных белков мотонейрона при БАС и оценка возможностей использования этих маркеров в качестве критериев риска развития и прогноза течения заболевания.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Провести поиск мутаций в кодирующей области и участках экзон -интронных соединений гена медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы у больных спорадическим БАС. Провести анализ гаплотипов по полиморфным маркерам, тесно сцепленных с геном 8СЮ1.

2. Провести анализ А9У-полиморфизма сигнальной последовательности митохондриальной супероксиддисмутазы.

3. Исследовать делеционный полиморфизм генов системы детоксиации: глутатион-8-трансферазы Т1 и глутатион-8-трансферазы М1.

4. Провести анализ 8/Ь-полиморфизма гена тяжёлой цепи нейрофиламентов.

5. Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов изученных генов с основными клиническими характеристиками заболевания: возрастом и вариантом начала, типом прогрессирования.

Научная новизна

Впервые в группе больных боковым амиотрофическим склерозом из России проведен комплексный молекулярно-генетический анализ ряда генов, предположительно вовлеченных в патогенез заболевания.

Показано, что развитие спорадической формы БАС в российской популяции может быть связано с миссенс мутациями в гене 80Б1 - у одного больного выявлена миссенс мутация С12К в гетерозиготном состоянии и у двух больных выявлена миссенс мутация Б90А в гомозиготном и гетерозиготном состоянии. с

Впервые показано, что развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у носителя мутации Б90А в гетерозиготном состоянии в составе «скандинавского гаплотипа» гена БООЬ

Изучение полиморфных вариантов генов марганец зависимой супероксиддисмутазы и глутатион-8-трансфераз типов М1 и Т1 не выявило ассоциации с развитием БАС у больных из России.

Впервые показано, что Э/Ь полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (ЫЕРН) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в русской популяции. Относительный риск развития БАС у гомозигот по Э аллелю составляет 4,2.

Обнаружено, что генотип БЭ гена КЕРН у больных БАС также ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания, в связи с чем данный генотип может выступать в качестве прогностического фактора.

Практическая значимость Полученные данные позволяют оценить роль ряда генетических систем в развитии бокового амиотрофического склероза и являются основанием для разработки методов молекулярно-генетической идентификации лиц с повышенным риском развития данного заболевания. Результаты работы могут быть использованы в дальнейших молекулярно - генетических и клинико- неврологических исследованиях при БАС и других наследственных и мультифакториальных неврологических заболеваниях.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации в гене Б001 выявлены у 5,7% больных из России со спорадическим БАС.

2. Развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у гетерозиготного носителя мутации 090А в составе «скандинавского гаплотипа» гена БОБ!.

3. Полиморфные варианты генов марганец зависимой супероксиддисмутазы (8СЮ2) и глутатион-8-трансфераз типов М1 и Т1 (08ТТ1 и 08ТМ1) не ассоциированы с развитием бокового амиотрофического склероза у больных из России.

4. в/Ь полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (ЬГЕБН) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в изученной популяции. Генотип 88 гена ЫЕШ у больных БАС ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Кондратьева, Екатерина Александровна

Выводы

1. У больных боковым амиотрофическим склерозом (БАС) проведен анализ мутаций в кодирующей области гена медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы (80В1). У трех больных (5,7%) выявлены две миссенс мутации: 01211 (у одного больного) и Б90А (у двух больных- в гомозиготном и гетерозиготном состоянии).

2. Впервые показано, что развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у гетерозиготного носителя мутации Б90А в составе «скандинавского гаплотипа» гена 8001.

3. В интроне 3 гена 80Э1 описан новый однонуклеотидный полиморфный сайт - 1У83+35 А>С, не ассоциированный с развитием БАС. Аллель 1У83+35 С встречается с частотой 4,9% у больных и с частотой от 1,8% до 3,2% в случайных выборках из Курской, Архангельской областей и Якутии.

4. Изучение полиморфных вариантов генов марганец зависимой супероксиддисмутазы (80Э2) и глутатион-8-трансфераз типов М1 и Т1 (08ТТ1 и С8ТМ1) показало отсутствие их ассоциации с развитием БАС у больных из России.

5. Впервые показано, что 8/Ь полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (ЫЕРН) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в русской популяции. Частота 88 генотипа в группе больных составляет 33,3%, в контрольной выборке - 8% л

X —8,361, р=0,004). Относительный риск развития БАС у гомозигот по 8 аллелю составляет 4,2.

6. Обнаружено, что генотип ЭБ гена КЕБН у больных БАС также ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания. Динамика нарастания неврологического и функционального дефицита у Эв гомозигот достигает 31,0±16,3 баллов/год по шкале Норриса, тогда как у IX гомозигот она составляет 18,8±12,4 баллов/год (р<0,05).

Заключение

В российской выборке больных боковым амиотрофическим склерозом проведен прямой поиск мутаций в гене БОШ, являющимся каузативным при БАС, проведен анализ полиморфизма в 4 генах, предположительно вовлеченных в патогенез заболевания.

У трех больных выявлены миссенс мутации гена ЭСЛМ: С12К (у одного больного) и Б90А (у двух больных — в гомозиготном и гетерозиготном состоянии). Обе мутации 090А находятся в составе «скандинавского гаплотипа» гена, что подтверждает теорию общего основателя этой мутации из северной Швеции или Финляндии. Согласно теории, заболевание развивается только при наличии мутации Б90А в гомозиготном состоянии. Таким образом, развитие БАС у больной, гетерозиготной по Э90А может косвенным образом свидетельствовать о наличии дополнительного модифицирующего генетического или эпигенетического фактора, который сыграл ключевую роль в патогегезе заболевания у этой больной.

А9У полиморфизм сигнальной последовательности марганец-зависимой супероксиддисмутазы, как предполагают, влияет на эффективность переноса фермента из цитоплазмы в митохондриальный матрикс, определяя его компартментализацию. Вероятно, это может приводить к дефициту фермента в митохондрии и повышенной оксидантной нагрузке органеллы со множеством негативных последствий для клетки. Анализ данного полиморфизма в русской выборке больных не показал ассоциации с развитием заболевания.

Нарушение процессов детоксикации клетки рассматривается в качестве одного из возможных механизмов патогенеза БАС. Гены С8ТТ1 и ОБТМ!, относящиеся к системе детоксикации организма, наиболее интересны для исследования, так как оба характеризуются делеционным полиморфизмом - при наличии нулевого аллеля не происходит образования белкового продукта. Результаты анализа полиморфизма генов 08ТТ1 и 08ТМ1 у больных из России не показали ассоциации с развитием заболевания. Однако большая встречаемость комбинации генотипов 08ТТ1(0/0)/08ТМ 1(0/0) в группе пациентов может рассматриваться как фактор, усугубляющий действие других патогенетических факторов при БАС.

Аномальное скопление и агрегация нейрофиламентов в перикариуме и аксонах мотонейронов является характерной чертой патологии при БАС; отмечены также нарушения аксонального транспорта и структуры цитоскелета мотонейронов. Нейрофиламенты представляют собой сополимер, состоящий из легкой, средней и тяжелой цепей. В гене тяжелых цепей нейрофиламентов описан в/Ь полиморфизм, который был проанализирован у больных БАС из России. 8 аллель соответствует 44 лизин-серин-пролиновым (К5Р) повторам в С-концевом домене белка, Ь аллель - 45 повторам. При этом установлено, что 88 генотип гена определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в русской популяции. В дальнейшем, анализ этого полиморфизма может быть использован в качестве одного из маркеров для выявления лиц с повышенным риском развития БАС. Кроме того, было обнаружено, что у больных БАС с 88 генотипом гена МЕЕН достоверно чаще наблюдается более тяжелое клиническое течение заболевания. Таким образом, 88 генотип гена ЫЕРН у больных БАС может выступать в качестве прогностического критерия характера течения заболевания.

Известно, что К8Р повторы С- концевого домена играют важную роль в процессах фосфорилирования/дефосфорилирования различных цепей нейрофиламентов и тем самым влияют на их взаимодействие между собой и с другими белками цитоскелета. Благодаря этому нейрофиламеиты осуществляют свою структурную функцию и функцию аксонального транспорта. «Укороченный» С- концевой домен может обладать сниженным аффинитетом к белкам цитоскелета и тем самым приводить к нарушению цитоархитектоники аксона и нейрона в целом.

Таким образом, полученные данные указывают на важную роль генетических факторов в развитии не только семейной, но и спорадической формы БАС, и обосновывают необходимость расширения и углубления генетических исследований при этом тяжелейшем неврологическом заболевании. Постоянно растущий массив данных о возможных генах-кандидатах БАС и характере мутаций в них расширяет наши представления о механизмах этиопатогенеза заболевания. Спектры мутаций и аллельных вариантов генов-кандидатов сильно различаются у разных этнических групп. В связи с этим, в каждом случае необходимо не только точно установить характер генных изменений, но и оценить их встречаемость в популяции. Лишь на базе этих знаний возможна разработка методов молекулярно-генетической идентификации лиц с повышенным риском развития этого заболевания, в частности, для российской популяции. Результаты данной работы являются хорошим для этого основанием.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кондратьева, Екатерина Александровна, Москва

1. Андерсен ПМ. Генетика бокового амиотрофического склероза. Журнал неврологии и психиатрии. 2001; 3:54-63.

2. Ашмарин ИП, Антипенко АЕ, Ашапкин ВВ и др. Нейрохимия. Москва: Изд. Института биомедицинской химии РАМН, 1996: 470 с.

3. Баранов B.C., Баранова В.Е., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены "предрасположенности". (Введение в предиктивную медицину). С-Пб, "Интермедика", 2000, 272 стр.

4. Владимиров ЮА, Азизова ОА, Деев АИ и др. Свободные радикалы в живых системах. Итоги науки и техники. Серия БИОФИЗИКА, Москва 1991, 29.

5. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М., "Медиина". - 2001.

6. Давиденков С.Н. Генетика бокового амиотрофического склероза. Советская неврология, психиатрия и психогигиена 1933; 2 (8-9): 4451.

7. Захарова М.Н. Боковой амиотрофический склероз и оксидантный стресс. Автореф. докт. дисс. М, 2001.

8. Захарова М.Н., Завалишин И.А., Брусов О.С., Павлова O.A. Глутатион-зависимые ферменты при спорадической форме бокового амиотрофического склероза. Нейрохимия, 1998; 15 (3): 271-274.

9. Иващенко Т.Е., Сиделева О.Г., Петрова М.А. Генетические факторы предрасположенности к бронхиальной астме. Генетика 2000; 36(9): 15.

10. Иллариошкин СН, Иванова-Смоленская ИА, Маркова ЕД. ДНК-диагностика и медико- генетическое консультирование в неврологии. М. Медицинское информационное агенство 2002: 591.

11. И Киселев JXJ1. Геном человека и биология XXI века. Вестник РАН 2000; 70: 412-424.

12. Реброва ОЮ. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ STATISTICA. М. Медиа Сфера, 2002: 312.

13. Чемерис АВ, Ахунов ЭД, Вахитов ВА. Секвенирование ДНК. М.: Наука, 1999.

14. Abe К, Aoki М, Ikeda М, Watanabe М, Hirai S, Itoyama Y. Clinical characteristics of familial amyotrophic lateral sclerosis with Cu/Zn superoxide dismutase gene mutations. J Neurol Sci 1996; 136: 108-116.

15. Al-Chalabi A, Andersen PM, Chioza В et al. Receissive amyotrophic lateral sclerosis with the D90A SOD1 mutation shares a common founder: evidence for a linked protective factor. Hum Mol Genet 1998; 13: 20452050.

16. Al-Chalabi A, Andersen PM, Nilsson P et al. Deletions of the heavy neurofilament subunit tail in amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet 1999; 8: 157-164.

17. Al-Chalabi A, Enayat ZE, Bakker MC et al. Association of apolipoprotein E s4 allele with bulbar-onset motor neuron disease. Lancet 1996; 347: 159-160.

18. Al-Chalabi A, Miller CJ. Neurofilaments and neurological disease. BioEssays 2003; 24: 346-355.

19. Alexianu ME, Ho BK, Mohamed AH, La-Bella V, Smith RG, Appel SH. The role of calcium-binding proteins in selective motor neuron vulnerability in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 1994; 6: 846858.

20. Almer G, Vukosavic S, Romero N et al. Inducible nitric oxide synthase up- regulation in transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 1999; 72: 2415-2425.

21. Alter M, Kurland LT, Molgaard CA. Late progressive muscular atrophy and antecedent poliomyelitis. In: Human Motor Neuron Diseases. Ed. Rowland LP, 1982; 303-309.

22. Andersen PM, Forsgren L, Binzer M et al. Autosomal recessive adult-onset ALS associated with homozygosity for Asp90Ala CuZn-superoxide dismutase mutation. A clinical and genealogical study of 36 patients. Brain 1996; 119: 1153-1172.

23. Andersen PM, Nilsson P, Keranen M-L et al. Phenotypic heterogeneity in MND-patients with CuZn-superoxide dismutase mutations in Scandinavia. Brain 1997; 10: 1723-1737.

24. Andersen PM. Amyotrophic Lateral Sclerosis and CuZn-Superoxide Dismutase. A clinical, genetic and enzymatic study. Doctoral thesis Umea University: Umea, Sweden 1997.

25. Andreassen OA, Ferrante RJ, Klivenyi P, Klein AM, Shinobu LA, Epstein CJ, Beal MF. Partial deficiency of manganese superoxide dismutase excacerbates a transgenic mouse model in a myotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 2000; 47: 447-455.

26. Aoki M, Lin CI, Rothstein JD et al. Mutations in the glutamate transporter EAAT2 gene do not cause abnormal EAAT2 transcripts in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 1998; 5: 645-653.

27. Aran FA. Researches sur une maladie non encore décrite du système musculaire (atrophie musculaire progressive). Arch Gèn Mèd 1850; 24: 535; 172-214.

28. Armon C, Kurland LT, Daube J, O'Brien PC. Epidemiological correlates of sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neurology 1991; 41: 1077-1084.

29. Bahmayer S, Moreau-Dubois MS, Brown P et al. Serum antibodies to neurofilament in patients with neurological and other disease and in healthy controls. J Neuroimmunol 1983; 5: 191-196.

30. Baranova H, Bothorishvilli R, Canis M, Albuisson E. et.al. Glutatione S-transferase Ml gene polimorphism and susceptibility to endometriosis in a Franch hjhulation. Mol Hum Reprod 1997; 3(9): 775-80.

31. Beal MF, Ferrante RJ, Browne SE, Matthews RT, Kowall NW, Brown RHJr. Increased 3-nitrotyrosine nitration in both sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis . Ann Neurol 1997; 42: 644-654.

32. Beckman JS, Larson M, Smith CE, Koppenol WH. ALS, SOD and peroxynitrite. Nature 1993; 364: 584.

33. Bensimon G, Lacomblez L, Meininger V et al. A controlled trial of riluzole in amyotrophic lateral sclerosis. N Engl J Med 1994; 330: 585591.

34. Berger MM, Kopp N, Vital C, Redl B, Aymard M, Lina B. Detection of cellular localization of enterovirus RNA sequences in spinal cord of patients with ALS. Neurology 2000; 54: 20-25.

35. Bogdanov MB, Ramos LE, Xu Z, Beal MF. Elevated hydroxyl radical generation in vivo in animal model of amyotrophic lateral sclerosis. J Neurichem 1998; 71:1321-1324.

36. Bonnefont-Rousselot D, Lacomblez L, Jaudon M, Lepage S, Salachas F, Bensimon G, Bizard C, Doppler V, Delattre J, Meininger V. Blood oxidative stress in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sei 2000; 178(1): 57-62.

37. Bowling AC, Barkowski EE, McKenna-Yasek D et al. Superoxide dismutase concentration and activity in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 1995; 64: 2366-2369.

38. Bowling AC, Schulz JB, Brown RH, Beal MF. Superoxide dismutase activity, oxidative damage, and mitochondrial energy metabolism infamilial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 1993; 61: 2322-2325.

39. Bristol LA, Rothstein JD. Glutamate transporter gene expression in amyotrophic lateral sclerosis motor cortex. Ann Neurol 1996; 39: 676-679.

40. Browne SE, Bowling AC, Baik MJ, Gurney M, Brown RH Jr, Beal MF. Metabolic dysfunction in familial, but not sporadic, amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 1998; 1: 281-287.

41. Bruijn LI, Houseweart MK, Kato S, Anderson KL, Anderson SD, Ohama E, Reaume AG, Scott RW, Cleveland DW. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD-1 mutant independent from wild type SOD-1. Science 1998; 281: 1851-1854.

42. Capano CP, Pernas-Alonso R, Porzio U. Neurofilament homeostasis and motoneurone degeneration. BioEssays 2001; 23:24-33.

43. Caroscio JT, Calhoun WF, Yahr MD (1994) Prognostic factors in motor neuron disease a prospective study of longevity. In: Rose FC (ed) Research progress in motor neuron disease. Pitman, London, pp. 34-43.

44. Chance PF, Rabin BA, Ryan SG et al. Linkage of the gene for an autosomal dominant form of juvenile amuotrophic lateral sclerosis to chromosome 9q34. Am J Hum Genet 1998; 3: 633-640.

45. Charcot JM, Joffroy A. Deux cas atrophie musculaire progressive avec lésions de la substance grise et des faisceaux antéro-latéraux de la moële épinere. Arch Physiol Norm Path 1869;2: 744-60.

46. Chio A, Brignolio F, Meinen P, Schiffer D. Phenotypic and genotypic heterogeneity of dominantly inherited amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neurol Scand 1987; 75: 277-282.

47. Cleveland DW. From Charcot to SOD1: mechnisms of selective motor neuron death in ALS. Neuron 1999; 24: 515-520.

48. Cohen O, Kohen R, Lavon E, Abramsky O, Steiner I. Serun CuZn-SOD activity is reduced in sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. J Neurol Sei 1996; 143(1-2): 118-120.

49. Corder EH, Saunders AM, Strittmatter WJ et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science 1993; 5123: 921-923.

50. Crow JP, Ye YZ, Strong M, Kirk M, Barnes S, Beckman JS. Superoxide dismutase catalyzes nitration of tyrosines by peroxynitrite in the rod and head domains of neurofilament-L. J Neurochem. 1997a; 69(5): 1945-53.

51. Cudkowicz ME, McKenna-Vasek D, Sapp PE et al. Epidemiology of mutations in superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis. Ann. Neurol. 1997; 2: 210-221.

52. Cudkowicz ME, McKenna-Yasek D, Chen C et al. Limited corticospinal tract involvement in amyotrophic lateral sclerosis subjects with the A4V mutation in the Cu/Zn superoxide dismutase gene. Ann Neurol 1998; 6: 703-710.

53. Deapen DM, Henderson BE. A case-control study of amyotrophic lateral sclerosis. Am J Epid 1986; 123: 790-799.

54. Deng H-X, Hentati A, Tainer JA, Iqbal Z, Cayabyab A, Hung W-Y, Getzoff ED, Hu P, Herzfeldt B, Hallewell RA, Pericak-Vance MA, Siddique T. Amyotrophic lateral sclerosis and structural defects of CuZn-superoxide dismutase. Science 1993; 261: 1047-1051.

55. Engelgardt JI, Tajti J, Appel SH. Lymphocytic infiltrates in the spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. Arsh Neurol 1993; 1: 30-36.

56. Ensembl Human Genome Browser, http ://www.ensembl. org/.

57. Estevez AG, Crow JP, Sampson JB, Reither C, Zhuang Y, Richardson GJ, Taprey MM, Barbieto L, Beckman JS. Induction of nitiric-oxide dependent apoptosis in motor-neurons by zinc-deficient superoxide dismutase. Science 1999;286: 2498-2500.

58. Ferrante RJ, Browne SE, Shinobu LA, Bowling AC, Baik MJ, McHarvey U, Kowall NW, Brown RHJr, Beal MF. Evidence of increased oxidative damage in both sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 1997; 69: 2064-2074.

59. Figlewicz DA, Krizus A, Martinoli MG et al. Variants of the heavy neurofilament subunit are associated with the development of amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet 1994a; 3:1757-1761.

60. Figlewicz DA, Rouleau GA, Krizys A and Julien JP. Polimorphism in the multi-phosphorylation domain of the human neurofilament heavy-subunit-encoding gene.Gene 1993; 132:297-300.

61. Forman HJ, Fridovich I. On the stability of bovine superoxide dismutase. The effects of metals. J Biol Chem 1973; 248: 2645-2649.

62. Fridovich I. Superoxide dismutases. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 1986; 58: 61-97.

63. Gellera C, Castellotti B, Riggio MC, Silani V. Superoxide dismutase gene mutations in Italian patients with familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis: identification of three novel missense mutations. Neuromuscul Disord 2001; 11(4): 404-10.

64. Getzoff ED, Tainer JA, Stempien MM, Bell GI, Hallewell RA. Evolution of CuZn superoxide dismutase and the Greek key B-barrel structural motif. Proteins: structure, function and genetics 1989; 5: 322-336.

65. Giess R, Holtmann B, Braga M et al. Early onset of severe familial amyotrophic lateral sclerosis with a SOD1 mutation: potential impact of CNTF as a candidate modifier gene. Am J Hum Genet 2002; 70: 12771286.

66. Goto JJ, Zhu H, Sanchez RJ. Loss of in vitro metal ion binding specificity in mutant copper-zinc superoxide dismutases associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem, 2000; 275 (2): 1007-1014.

67. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science 281: 1309-1312.

68. Hadano S, Hand CK, Osuga H et al. A gene encoding a putative GTPase regulator is mutated in familial amyotrophic lateral sclerosis 2. Nat Genet 2001; 29: 166-173.

69. Hand CK, Khoris J, Salachas F et al. A novel locus for familial amyotrophic lateral sclerosis, on chromosome 18q. Am J Hum Genet 2001; 70: 1.

70. Hayward C, Colville S, Swingler RJ, Brock DJH. Molecular genetic analysis of the APEX nuclease gene in amyotrophic lateral sclerosis. Neurology 1999; 52: 1899-1901.

71. Hentati A, Bejaoui K, Pericak-Vance MA et al. Linkage of recessive familial amyotrophic lateral sclerosis to chromosome 2q33-q35. Nat Genet 1994; 7: 425-428.

72. Hentati A, Pericak-Vance MA, Ahmad A et al. Linkage of a common locus for recessive amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet 1997; 61: A279.

73. Hillel AD, Miller RM, Yorkston K, McDonald E, Norris FH. Amyotrophic lateral sclerosis severity scale. Neuroepidemiology 1989; 8(3): 142-50.

74. Hirano A, Donnefeld H, Sasaki S, Nakano I. Fine structural observations of neurofilamentous changes in amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol 1984; 43: 461-470.

75. Ikeda M, Abe K, Aoki M et al. Variable clinical symptoms in familial amyotrophic lateral sclerosis with a novel point mutation in the CuZn-superoxide dismutase gene. Neurology 1995; 45: 2038-2042.

76. Ince PG, Shaw PJ, Slade JY, Jones C, Hudgson P. Familial amyotrophic lateral sclerosis with a mutation in exon 4 of the CuZn-superoxide dismutase gene: pathological and immunohystochemical changes. Acta Neuropathol 1996; 92: 395-403.

77. Iwasaki Y, Ikeda K, Kinoshita M, Decreased cerebrospinal fluid superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis. Lancet 1993; 342: 1118.

78. Jackson M, Al-Chalabi A, Enayat ZE et al. Copper/Zinc-Superoxide Dismutase 1 and Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis: Analysis of 155 Cases and Identification of a Novel Insertion Mutation. Ann Neurol 1997; 42: 803-807.

79. Johnston JF, Dalton MJ, Gurney ME et al. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 12571-12576.

80. Julien J-P. Amyotrophic lateral sclerosis: unfolding the toxicity of the misfolded. Cell 2001; 104: 581-591.

81. Kennedy PGE. On the possible role of viruses in the etiology of motor neuron disease: a review. J Royal Soc Med 1990; 83: 784-787.

82. Kisby GE, Milne J, Sweet C. Evidence of reduced DNA repair in amyotrophic lateral sclerosis brain tissue. Neuro Report 1997; 8: 13371340.

83. Kulinsky VI. Detoxication of xenobiotics. Soros Educ J 1999; 1:8-12.

84. Lebovitz RM, Zhang H, Vogel H, Cartwright J, Dionne L et al. Neurodegeneration, myocardial unjury, and perinatal death inmitochondrial superoxide dismutase deficient mice. Proc Natl acad Sci USA 1996; 93: 9782-9787.

85. Lee MK, Marszalek JR, Cleveland DW. A mutant neurofilament subunit causes massive, selective motor neuron death: implications for the pathogenesis of human motor neuron disease. Neurology, 1994; 13: 975988.

86. Leigh PN, Dodson A, Swash M et al. Cytoskeletal abnormalities in motor neuron disease. An immunocytochemical study. Brain 1989; 112: 521-535.

87. Li Y, Copin JC, Reola LF, Calagui B, Gobbel GT et al. Reduced mitochondrial manganese- superoxide dismutase activity exacerbates glutamate toxicity in cultured mouse cortical neurons. Brain Res 1998; 814: 164-170.

88. Maeda T, Kurashihi K, Matsinaga M, Inoue K, Inoue M. On intra-familial diversities of a familial amyotrophic lateral sclerosis with a point mutation of CuZn-SOD (Asn86Ser). No-To-Shinkei 1997; 49 (9): 847-51.

89. Majoor-Krakauer D, Willems PJ, Hofman A. Genetic epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis. Clin Genet 2003; 63: 83-111.

90. Manetto V, Sternberger NH, Perry G et al. Phosphorylation of neurofilaments is altered in amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol 1988; 47: 642-653.

91. Martyn CN. Poliovirus and motor neuron disease. J Neurol 1990; 237 (6): 336-338.

92. Masu Y, Wolf E, Holtmann B, Sendtner M, Brem G, Thoenen H. Disruption of the CNTF gene results in motor neuron degeneration. Nature 1993; 365: 27-32.

93. Medina L, Figueredo-Cardenas G, Rothstein JD et al. Differential abundance of glutamate transporter subtypes in amyotrophic lateral sclerosis. ALS- vulnerable versus ALS- resistant brain stem motor cell groups. Exp Neurol 1996; 142(2): 287-295.

94. Mitchell JD, Gatt JA, Phillips TM, Houghton E, Rostron G, Wignall C. CuZn-superoxide dismutase, free radicals and motor neuron disease. Lancet 1993; 342: 1051-1052.

95. Moulard B, Sefiani A, Laamri A, Malafosse A, Camu W. Apolipoprotein E genotyping in sporadic amyotrophic lateral sclerosis: evidence for a major influence on the clinical presentation and prognosis. J Neurol Sci 1996; 139: 34-37.

96. Mui S, Rebeck GW, McKenna-Yasek D, Hyman BT, Brown RH. Apolipoprotein E s4 Allele Is Not Associated with Earlier Age at Onset in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Neurol 1995; 38: 460-463.

97. Mulder DW, Kurland LT, Offord KP, Beard CM. Familial adult motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis. Neurology 1986; 36: 511517.

98. Nataraj AJ, Olivos-Glander I, Kusukawa N, Highsmith WE Jr. Singlestrand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation detection. Electrophoresis 1999; 20(6): 1177-85. Review.

99. Nicholl DJ, Bennett P, Vanacore N, Fabbrini G.et al. A study of five candidate genes in Parkinson's disease and related neurodegenerative disorders. European Study Group on Atypical Parkinsonism. Neurology 1999; 53(7): 1415-21.

100. Oldstone MBA. Viruses can cause disease in the absence of morphological evidence of cell injury: implications for uncovering new diseases in the future. J Infect Dis 1989; 139: 337-343.

101. Olkowski ZL. Mutant AP endonuclease in patients with amyotrophic lateral sclerosis. NeuroReport 1998; 9: 239-242.

102. Oteiza PI, Uchitel OD, Carrasquedo F, Dubrovski AL, Roma JC, Fraga CG. Evaluation of antioxidants, protein, and lipid oxidation products in blood from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurochem Res 1997 Apr;22(4):535-9.

103. Parboosingh JS, Rouleau GA, Meninger V, McKenna-Yasek D, Brown RH, Figlewicz DA. Absence of mutations in the Mn superoxide dismutase or catalase genes in familial amyotrophic lateral sclerosis. Neuromusc Disord 1995a; 1: 7-10.

104. Pardo CA, Xu Z, Borchelt DR et al. Superoxide dismutase is an abundant component in cell bodies, dendrites, and axons of motor neurons and in a subset of other neurons. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 954958.

105. Plaitakis A, Constantakis E, Smith J. The neurotoxic amino acids glutamate and aspartate are altered in spinal cord and brain in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 1988; 24:446-449.

106. Przedborsky S, Donaldson DM, Jakowez M, Kish SJ, Guttman M, Rosoklija G, Hays AP. Brain superoxide dismutase, catalase and glutathione perocxidase activities in amyotrophic lateral sclerosis patients. Ann Neurol 1996b; 39: 158-165.

107. Przedborsky S, Donaldson DM, Murphy PL, Hirsch O, Lange D, Naini AB, McKenns-Yasek D, Brown RH. Blood superoxide dismutase, catalase and glutathione perocxidase activities in amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurodegeneration 1996a; 5: 57-64.

108. Radunovic A, Leigh PN. CuZn superoxide dismutase gene mutations in ALS. Correlation between genotype and clinical features. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1996; 61: 565-572.

109. Reaume AG, Elliott JL, Hoffmann EK et al. Motor neurons in CuZn-superoxide-deficient mice develop normally but exhibit enhanced cell death after axonal injury. Nat Genet 1996; 13: 43-47.

110. Robberecht W, Aguirre T, Bosch LVD, Tilkin P, Cassiman JJ, Matthijs G. D90A heterozygosity in the SOD1 gene is associated with familial and apparantly sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neurology 1996; 47: 1336-1339.

111. Robberrecht W., Sapp P., Viaene M.K., Rosen D, McKenna-Yasek D, Haines J, Horvitz R, Theys P, Brown R. CuZn-superoxide dismutase activity in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 1995; 62: 384-387.

112. Roff DA, Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA polymorphisms: X2 and problem of small samples. Mol Biol Evol 1989, 6:539-545.

113. Rooke, K., Figlewicz, D.A., Han, F.Y.and Rouleau, G.A. (1996) Analysis of the KSP repeat of the neurofilament heavy subunit in familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurology 1996; 46: 789-790.

114. Rosen DR, Siddique T, Patterson D et al. Mutations in CuZn superopxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 1993; 362: 59-62.

115. Rosenblum JS, Gilula NB, Lerner RA. On signal sequence polymorphisms and diseases of distribution. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 4471-4473.

116. Rothstein JD, Martin LJ, Kuncl RW. Decreased glutamate transport by the brain and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. E Engl J Med 1992; 326: 1464-1468.

117. Rothstein JD, Tsai G, Kuncl RW, Clawson L, Cornblath DR et al. Abnormal excitatory amino acid metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 1990; 28: 15-25.

118. Rouleau GA, Clark AW, Rooke K, Pramatarova A, Krizus A, Suchowersky O, Julien J-P, Figlewicz D. SOD1 mutations is associated with accumulation of neurofilaments in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 1996; 39: 128-131.

119. Rowland LP. What s in name? Amyotrophic lateral sclerosis, motor neuron disease, and genetic heterogeneity. Ann Neurol 1998; 43: 691-694.

120. Salagovic J., Kalina I., Stubna J., Habalova V., Hrivnak M., Valansky L., Kohut A., Biros E. Genetic polymorphism of glutathione S-transferases Ml and T1 as a risk factor in lung and bladder cancers. Neoplasma 1998, 45 (5): 312-317.

121. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. Cold Spring Habor laboratory Press. 1989. - P 923.

122. Sasaki S, Maruyama S, Yamane K et al. Ultrastructure of swollen proximal axons of anterior horn neurons in motor neuron disease. J Neurol Sci 1990; 97: 233-240.

123. Seidegard J, Pero RW, Markowits MM, et al. Isozyme of glutatione S-transferase (class Mu) as a marker of the susceptibility to lung cancer: a follow up study. Carcinogenesis 1999; 11(1): 33-6.

124. Shaw PJ, Ince PG, Falkous G, Mantle D. Oxidative damage to protein in sporadic motor neuron disease spinal cord. Ann Neurol 1995; 38: 691695.

125. Shaw PJ, Williams R Serum and cerebrospinal fluid markers in ALS. Amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders. 2000; Suppl 2: 61-67.

126. Shimoda-Matsubayashi S, Matsumine H, Kobayashi T, Nakagawa-Hattori Y, Shimizu Y, Mizuno Y. Structural dimorphism in themitochondrial targeting sequence in human manganese superoxide dismutase gene. Biochem Biophys Res Commun 1996; 226: 561-565.

127. Shy ME, Rowland LP, Smith T et al. Motor neuron disease and plasma cell dyscrasia. Neurology 1986; 36: 1429-1436.

128. Siddique T, Figlewicz DA, Pericak-Vance MA, Haines JL. Linkage of a gene causing familial amyotrophic lateral sclerosis to chromosome 21 and evidence of genetic-locus heterogeneity. New Eng J Med 1991; 324: 1381-1384.

129. Siddique T, Hong ST, Brooks BR et al. X-linked Dominant locus for late-onset familial amyotrophic lateral sclerosis. Am Soc Hum Genet meeting 1998; Oct: Abstr 1785.

130. Strong MJ, Hudson AJ, Alword WG. Familial amyotrophic lateral sclerosis, 1850-1989: a statistical analysis of the world literature. Canad J Neurol Sci 1991; 18:45-58.

131. Stroombergen MC, Waring RH. Determination of glutathione S-transferase mu and theta polymorphisms in neurological disease. Hum Exp Toxicol 1999; 18(3): 141-5.

132. The ALS/FALS Datebase Website, http://www.alsod.org/.

133. Tomblyn M, Kasarskis EJ, Xu Y, St Clair DK. Distribution of MnSOD polymorphisms in sporadic ALS patients. J Mol Neurosci 1998; 1: 65-66.

134. Tomkins J, Usher P, Slade JY et al. Novel NF-H insertion in ALS. Neuroreport 1998; 9: 3967-3970.

135. Uchino M, Ando Y, Tanaka Y, Nakamura T, Uyama E, Mita S, Murakami T, Ando M. Decrease in CuZn- and Mn-SOD activities in brainand spinal cord of patients with amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci 1994; 127(1): 61-67.

136. Van Landeghem GF, Tabatabaie, Beckman L, Beckman G, Andersen PM. Mn-SOD Signal Sequence Polymorphism Associated with Sporadic Motor Neuron Disease. Eur J Neurol 1999; 6: 639-644.

137. Vechio JD, Bruijn LI, Xu Z, Brown RH, Jr, Cleveland D. Sequence variants in human neurofilament proteins: absence of linkage to familal amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 1996; 40: 603-610.

138. Veltema AN, Ross RAC, Bruyn GW. Autosomal dominant adult amyotrophic lasteral sclerosis: a six-generation Dutch family. J Neurol Sci 1990; 97: 93-115.

139. Wiedau-Pazos M, Goto JJ, Rabizadeh S, Gralla EB, Roe JA, Lee MK, Valentine JS, Bredesen DE. Altered reactivity of superoxide dismutase in familial amyotrophic lateral sclerosis. Science 1996; 271: 515-518.

140. Williams DB, Floate DA, Leicester J. Familial motor neuron disease: differing penetrance in large pedigrees. J Neurol Sci 1988; 86: 215-230.

141. Wong NKY, He BP, Strong MJ. Characterization of neuronal intermediate filament protein expression in cervical spinal motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol 2000; 59:972-982.

142. Wong PC, Pardo CA, Borchelt DR, Lee MK et al. An adverse property of a familial ALS-linked SOD1 mutation causes motor neuron disease characterized by vacuolar degeneration of mitochondria. Neuron 1995; 14: 1105-1116.

143. Xu S., Wang Y., Roe B. et al. Characterisation of the human class Mu glutation S-transferase gene cluster and the GSTM1 deletion. J. Biol. Chem. 1998; 273 (6): 3517-3527.

144. Yang Y, Hentati A, Deng HX et al. The gene encoding alsin, a protein with three guanine- nucleotide exchange factor domains, is mutated in aform of recessive amyotrophic lateral sclerosis. Nat Genet 2001; 29: 160165.

145. Yim MB, Chock PB, Stadtman ER. Enzyme function of copper-zinc superoxide dismutase as a free radical generator. J Biol Chem 1993; 268: 4099-4105.