Молекулярно-генетическая и иммунофенотипическая характеристика мезенхимных стромальных клеток из миелоидных органов крыс в онтогенезе

Кожевникова, Мария Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая и иммунофенотипическая характеристика мезенхимных стромальных клеток из миелоидных органов крыс в онтогенезе
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая и иммунофенотипическая характеристика мезенхимных стромальных клеток из миелоидных органов крыс в онтогенезе"

На правах рукописи

КОЖЕВНИКОВА Мария Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ МИЕЛОИДНЫХ ОРГАНОВ КРЫС В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О034аоэ А

Москва 2009

003458919

Работа выполнена в лабораториях Гистогенеза и Молекулярно-генетических механизмов онтогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Старостин Валерий Иванович

кандидат биологических наук, Микаелян Арсен Суренович

доктор биологических наук, профессор,

Бродский Всеволод Яковлевич

кандидат биологических наук, Копанцев Евгений Павлович

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится ч<ЯYv> Jtt&cyf-Z. 2009 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26; htlp://idbras.comcor.ru; e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан « 2008 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук e-mail: ele0806@yandex.ru

/ /

Е.Б. Абрамова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время мезенхимные стромальные клетки (МСК) рассматриваются как мультипотентные тканеспецифические стволовые и родоначальные клетки взрослого организма, способные осуществлять направленную дифференцировку в определенные типы клеток соединительной ткани, такие как остеобласты, хондробласты, адипоциты и стромальные клетки, организующие кроветворное микроокружение (Dominici et а].,

2006). По общему признанию, основы экспериментального изучения и клинического применения МСК были заложены отечественным исследователем А. Я. Фриденштеймом в 60-х гг. XX века (Friedenstein et al., 1966). МСК обнаружены в различных органах и тканях половозрелого организма, тем не менее, основным источником этих клеток на протяжении всего постнатального онтогенеза считается костный мозг. МСК также найдены в составе кроветворной стромы эмбриональных органов гемопоэза, в частности, в печени. Присутствие МСК в составе стромы кроветворных органов в разные периоды онтогенеза тесным образом связано с исключительной ролью этих клеток и их производных в формировании и поддержании кроветворного микроокружения, так называемой "ниши" кроветворной стволовой клетки (КСК). Сравнительный анализ МСК различной органной принадлежности важен для получения глубокого и всестороннего представления о биологии этих клеток в целом. Мы полагаем, наиболее подходящим критерием для проведения подобного сравнительного исследования является функциональная близость МСК. Это определило выбор органов-источников данных клеток: печень зародышей и зрелый костный мозг. Первый является транзиторным, а второй дефинитивным органами миелоидного кроветворения. При этом популяция МСК из костного мозга рассматривается нами в качестве контроля, т.к. общеизвестно, что клетки этой популяции отвечают всем критериям МСК, а сам костный мозг, как уже было сказано, является основным источником этих клеток в постнатальном периоде онтогенеза. Мы полагаем также, что изучение МСК из разных кроветворных источников в сравнительном аспекте позволит не только охарактеризовать исследуемые клеточные популяции с необходимой полнотой и определенностью, но и предоставит возможность судить об их идентичности.

Интерес к подобному сравнительному анализу возник недавно, поэтому публикации, посвященные этой проблеме, малочисленны. Показано, что МСК из печени зародышей обладают большим пролиферативным потенциалом по сравнению с костномозговыми МСК (Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al.,

2007), а также, по некоторым данным, несут на своей поверхности маркеры эмбриональных стволовых клеток, такие как Oct4 и Nanog (Guillot et al., 2007). Вместе с тем, сведения о дифференцировочных потенциях МСК в составе печени зародышей остаются неполными и противоречивыми. Так, рядом авторов подтверждена способность этих клеток дифференцироваться в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях (Campagnoli et al., 2001; Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al., 2007), тогда как другими исследователями нали-

чие таких множественных потенций ставится под сомнение (in't Anker et al., 2003; Fromigue et al., 2008).

Цель Ii задачи исследования. Все вышесказанное позволило наметить основную г/ель диссертационной работы - сравнительный молекулярно-генетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля, остео-генных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга крыс.

Для достижения поставленной цели исследования были сформулированы следующие основные задачи:

1. Охарактеризовать изучаемые клеточные популяции с позиции общепринятых критериев МСК по экспрессии специфических поверхностных антигенов CD73, CD90, CD105.

2. Изучить динамику экспрессии указанных маркеров на разных сроках культивирования.

3. Провести иммунофенотипическое и гистохимическое исследование остеогенных потенций МСК из двух источников.

4. Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры ос-теогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК.

5. Провести иммунофенотипическое и гистохимическое исследование адипогенных потенций МСК из двух источников.

6. Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры адипогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые проведена комплексная оценка антигенного профиля МСК из печени зародышей крыс в период ее высокой кроветворной активности в сравнении с МСК из зрелого костного мозга. Показано, что обе клеточные популяции обладают сходным иммунофенотипом, а именно экспрессируют специфические поверхностные антигены CD90, CD73, CD105. Выявлено, что по мере увеличения сроков культивирования МСК из обоих источников наблюдается снижение экспрессии таких маркеров как CD73 и CD105.

Впервые проведен сравнительный молекулярно-генетический, иммунофенотипический и гистохимический анализ остеогенных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей в сравнении с МСК из костного мозга половозрелых крыс. В сходных экспериментальных условиях in vitro МСК печеночного происхождения обладают менее выраженными потенциями к адипогенезу. Они также не способны к завершению остеогенной дифференцировки, а именно к формированию зрелых остеобластов и минерализованного межклеточного мат-рикса. Кроме того, МСК из печени зародышей обладают более низким уровнем экспрессии генов, вовлеченных в реализацию как остеогенной, так и адипогенной программ дифференцировок, по сравнению с костномозговыми МСК.

Сравнительный анализ изученных популяций представляет общебиологический интерес, поскольку позволяет получить более целостное представле-

ние о системе МСК. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курса лекций по биологии развития и биологии стволовых клеток, а также учитываться при проведении биомедицинских исследований.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007 г.); II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007 г.); конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н. К. Кольцова (Москва, 2006, 2007 гг.); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием (Новосибирск, 2008 г.); на XV Школе "Актуальные проблемы биологии развития" (Звенигород, 2008 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Из них статей в рецензируемых журналах - 4, тезисов докладов и материалов конференций - 6.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах, содержит 52 рисунка, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 230 цитируемых источников.

Материалы и методы исследования

В работе использованы неинбредные крысы Wistar в возрасте 3-4 мес., весом 150-200 г и зародыши крыс на 16-е сут эмбрионального развития. Для каждого эксперимента получали клетки от 3-4 половозрелых животных и 12—44 зародышей.

Выделение и культивнрование МСК. Для получения культуры МСК из костного мозга половозрелых крыс содержимое диафизов бедренных и больше-берцовых костей вымывали культуральной средой а-МЕМ (Sigma, США). Полученные образцы костного мозга суспендировали и пропускали через фильтр, d=40 мкм (BD Biosciences, США). Подсчет клеток в суспензии осуществляли с использованием камеры Горяева. После подсчета числа клеток суспензию (5 х 106 кл/мл) помещали в культуральные флаконы (Greiner, Германия) и культивировали в стандартной ростовой среде а-МЕМ с добавлением 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 10% сыворотки плодов коровы (Биолот, Россия), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (HyClone, США). Спустя 24 ч после посева первичной культуры неприкрепившиеся клетки удаляли, а прикрепившиеся дважды промывали 0.01 М раствором PBS (Sigma, США) и проводили смену среды. В дальнейшем среду меняли через 3-4 сут в течение 14-15 сут. При достижении 90-95% конфлуентного монослоя, клетки пересевали по куль-туральным флаконам с использованием 0.25% раствора трипсина (Биолот, Россия) в 1 мМ ЭДТА (Биолот, Россия).

Для получения культуры МСК из печени зародышей у беременных крыс иссекали рога матки и помещали их в охлажденную культуральную среду 199

(Sigma, США) с добавлением 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Под бинокулярной лупой извлекали зародыши, выделяли печень, приготовляли клеточную суспензию механическим дезагрегированием с помощью шприца с иглами уменьшающегося диаметра и фильтровали. Клеточную суспензию трижды отмывали ростовой средой а-МЕМ центрифугированием при ~80g. После последнего центрифугирования клетки ресуспендировали. После подсчета в камере Горяева клеточную суспензию помещали в культуральные флаконы и культивировали по описанной выше методике для МСК из зрелого костного мозга.

Индукция остеогенной дифференцировки МСК in vitro. Для индукции остеогенеза МСК 2-3-го пассажей культивировали в ростовой среде а-МЕМ с добавлением Ю"8 М дексаметазона (Sigma, США), 50 мкг/мл фосфата аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия) и 10 мМ ß-глицерофосфата (Sigma, США) {остеогенная среда) со сменой среды через 3-4 сут в течение 16-21 сут. Уровень экспрессии мРНК генов маркеров остеогенной дифференцировки оценивали каждые 2, 5, 7, 12, 16, 21 сут культивирования в контрольной (ростовая среда без добавления индукторов - контрольная культура/контроль) и остеогенной (остеогенная культура/опытная кулыпура/опыт) средах.

Индукция адипогенной дифференцировки МСК in vitro.Для индукции адипогенеза МСК 2-3 пассажей культивировали в ростовой среде с добавлением 10'6 М дексаметазона, 0.5 тМ индометацина (Sigma, США) и 100 нг/мл инсулина (Sigma, США) (адгтогенная среда) со сменой среды через 3-4 сут в течение 10-16 сут. Уровень экспрессии мРНК генов маркеров адипогенной дифференцировки оценивали каждые 3, 5, 7, 10 сут (МСК из костного мозга) и 2, 7, 12, 16 сут (МСК из печени зародышей) культивирования в контрольной (ростовая среда без добавления индукторов - контрольная культура/контроль) и адипогенной (адипогеиная кулыпура/опытная кулыпура/опыт) средах.

Гистохимические исследования. Для визуализации минеральных отложений во внеклеточном матриксе клетки окрашивали ализариновым красным S (Sigma, США) (Пирс, 1962). Активность щелочной фосфатазы оценивали с использованием набора "Alkaline Phosphatase Kit" (Sigma, США) по протоколу фирмы-производителя. Для визуализации жировых включений клетки окрашивали жировым красным О (Sigma, США) или смесью Судана III и IV (Пирс, 1962). Ядра клеток докрашивали гематоксилином. Гистохимические реакции анализировали с помощью микроскопа Olympus АН-3 (Япония).

Иммуноцнтохимические исследования. Иммунофенотипическую характеристику МСК проводили с применением антител к CD90 (Abeam, Великобритания), CD73 (BD Pharmingen. США), CD45 (BioLegend, США), CD34 (Santa Cruz, США) и CD 144 (Abeam, Великобритания). В качестве положительных контролен для фенотипических маркеров кроветворных клеток CD45 и CD34 использовали отпечатки селезенки половозрелых крыс, для маркера эндотели-альных клеток CD 144 - криостатные срезы селезенки этих же животных. Ос-теогенные потенции МСК изучали с помощью антител к белкам внеклеточного матрикса коллагену 1 типа (Sigma, США), остеокальцину (QED Bioscience, США), костному сиалопротеину (Chemicon, США) и фактору транскрипции Os-

terix (Abeam, Великобритания). Адипогенные потенции МСК изучали с помощью антител к ядерному рецептору PPAR5 (Cayman Chemical, США) и маркеру зрелых адипоцитов ALBP (Abeam, Великобритания). Иммуноцитохимическую реакцию анализировали под микроскопом Leica DM RXA2 (Германия). Анализ изображения проводился с помощью компьютерной программы Image J.

Молекулярно-генетические исследования. Выделение тотальной РНК из МСК осуществляли с помощью реактива TRI® Reagent (Sigma, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Синтез кДНК проводили на тотальной РНК (5 мкг) с использованием обратной транскриптазы M-MLV и олиго(дТ)15 (Силекс, Россия). Предварительно тотальную РНК обрабатывали ДНКазой "Turbo" (Ambion, США) для исключения контаминации геномной ДНК. При конструировании праймеров использовалась программа DNAStar (США) и данные о структуре исследуемых генов, полученные из международной базы данных NCBI (США). Для исключения получения ПЦР-продукта на матрице хромосомной ДНК праймеры конструировали на основе нуклео-тидной последовательности из разных экзонов. Для количественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК была предварительно нормирована по GAPDH. ПЦР проводили на матрице кДНК с использованием Col-oredTaq полимеразы (Силекс, Россия) и специфических праймеров (Литех, Россия) на амплификаторе Eppendorf Mastercycler (Германия). ПЦР-продукты разделяли электрофоретически в 1 %-ном агарозном геле (Amresco, США) с добавлением бромистого этидия (Sigma, США). Оценку интенсивности свечения ПЦР продуктов проводили на УФ-трансиллюминаторе (BIO-RAD, США) с помощью программы для анализа электрофоретического изображения QuantityOne (BIO-RAD, США).

Статистическая обработка результатов исследования. Подсчет сред-неквадратической (стандартной) ошибки среднего числа "костных узелков" на мм2 площади культуралыюго флакона основан на экспресс-методе статистической обработки с использованием таблиц Стрелкова (Стрелков, 1999).

Результаты исследования и их обсуждение

Сравнительная оценка антигенного профиля МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга. Для подтверждения принадлежности изучаемых клеточных популяций к системе МСК нами проведен сравнительный анализ экспрессии позитивных и негативных маркеров МСК на разных сроках их культивирования в соответствии с рекомендациями Международного общества клеточной терапии (Dominici et al., 2006).

Рис. 1. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов негативных маркеров МСК С£>¥5, СОНЬ, СО!9 и С0144 в клеточных популяциях из КМ (а) и ПЗ (б) на 1-ом (1п), 2-ом (2п) и 3-ем (Зп) пассажах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-рсакции в нуклеотидных парах (н.п.).

В качестве негативных маркеров были выбраны следующие: общий лейкоцитарный антиген СБ45, маркер ранних кроветворных предшественников СП34, антиген В-лимфоцитов СП 19, маркер моноцитов/макрофагов и грану-лоцитов СБПЬ и маркер эндотелиаль-ных клеток СБ 144. Иммунофлюорес-центный анализ первичных культур из костного мозга (КМ) и печени зародышей (ПЗ) выявил примесь СБ45- и СВ34-иммунопозитивных клеток. С помощью ПЦР-анализа во всех исследованных культурах МСК на 1-2 пассаже детектирована мРНК генов СЭ45, СВ11Ь и СБ 144, что указывает на присутствие в составе изучаемых популяций макрофагов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток на ранних этапах их культивирования. В обеих культурах на 1-ом и после-

дующих пассажах не обнаружена мРНК гена СБ19. Начиная с 3-го пассажа, обе популяции МСК лишены примесей кроветворных и эндотелиальных клеток, что подтверждается не только данными иммуноцитохимии, но и ПЦР-анализа (рис. 1). Вероятно, в процессе пассирования происходит их элиминация, а созданные условия культивирования способствуют предпочтительному росту МСК.

В качестве позитивных маркеров МСК были выбраны следующие поверхностные антигены: мембранный гликопротеин СЭ90, экто-5'-нуклеотидаза С073 и рецептор трансформирующего фактора роста р СО 105. В начальные сроки культивирования (1-3 пассажи) практически все клетки популяции МСК из КМ положительно окрашивались на маркеры СЭ90 и СБ73 (рис. 2, а, в). Маркер СЭ90 также выявлен почти во всех клетках популяции из ПЗ (рис. 2, б). Вместе с тем, поверхностный антиген СБ73 был обнаружен лишь приблизительно в 60% клеток печеночного происхождения (рис, 2, г). Возможно, это связано с неодинаковым органным происхождением клеток, что, в свою очередь, может вносить свой вклад в фенотипическую характеристику МСК.

Анализ динамики экспрессии фенотипических маркеров МСК на протяжении длительного срока культивирования выявил, что на 8-11-ом пассажах практически все клетки культуры МСК из КМ и ПЗ экспрессировали маркер СП90, что хорошо согласуется с данными ПЦР-анализа (рис. 3, а, б). Нами впервые показано, что экспрессия поверхностного антигена С1Э73 в культурах печеночных МСК 8-11-го пассажей сохранялась лишь в отдельных клетках, составляющих минорную субпопуляцию среди С074-иммунонегативных клеток (рис. 3, в).

Рис. 2. Экспрессия поверхностных антигенов СО90 (а, б) и С073 (в, г) в культурах МСК из зрелого КМ (а, в) и ПЗ (б, г) 3-го пассажа, а', б', в', г' - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных РАРГ

CD9» В Ц <1)73 íj&íi, У а

< IWU+DAPI |CD!>0+DAP1 ЕЯ CTVWDAPI 5 й * El

Рис. 3. Экспрессия поверхностных антигенов CD90 и CD73 в культурах МСК из КМ (а) и ПЗ (б, в) 11-го (а, б) и 9-го (в) пассажей, а', б', в' - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI.

Полученный результат находится в полном соответствии с данными ПЦР-анализа (рис. 4). Снижение содержания мРНК гена CD73 также наблюдалось при долгосрочном культивировании МСК из зрелого КМ. С использованием специфических праймеров нами выявлено снижение уровня экспрессии еще одного гена - CD105, в обеих клеточных популяциях МСК (рис. 4).

Итак, можно с определенностью утверждать, что анализируемые клеточные популяции характеризуются сходным фенотипом, а именно экспрессируют поверхностные антигены CD90, CD73 и CD105, что определенно доказывает их принадлежность к системе МСК и, начиная с 3-го пассажа, практически лишены примесей других типов клеток.

(6) m 2n 3n 9n 11n

Pue. 4. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов позитивных маркеров МСК CD90, CD73 и CD105 в клеточных популяциях из КМ (а) и ПЗ (б) на 1-ом (7я), 2-ом (2и), 3-ем (Зп), 8-ом (8п), 9-ом (9и) и 11-ом (lin) пассажах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нуклеотидных парах (н.п.).

Молекулярно-генетнческий и морфологический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте.

Оценка активности щелочной фосфатазы в колониях-клонах (КОЕ-ф) в первичных культурах МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга. В рамках выполненного исследования нами была проанализирована активность щелочной фосфатазы в колониях-клонах (КОЕ-ф) первичных культур МСК из двух источников. Этот фермент широко применяется в качестве маркера самых ранних предшественников остеогенных клеток. В большинстве колоний КОЕ-ф из КМ выявлялась высокая активность щелочной фосфатазы, тогда как в колониях печеночного происхождения количество клеток с положительной реакцией на фермент было существенно ниже. Полученный результат отражает крайне низкую степень коммитирования печеночных МСК в остеогенном направлении на стадии КОЕ-ф. Напротив, уже в составе первичной культуры костномозговых МСК присутствует достаточное число клеток, потенциально способных, по нашему мнению, к остеогенезу.

Остеогенез в пассируемой культуре МСК из костного мозга. В культуре МСК из КМ 2-3-го пассажа остеогенез имел очаговый характер. Первые пре-зумптивные очаги остеогенеза - участки скопления клеток с отложениями внеклеточного матрикса, появлялись уже на 10-12 сут эксперимента, что подтверждалось иммуноцитохимически с использованием антител к коллагену I типа и костному сиалопротеину (рис. 5).

Слабое окрашивание ализариновым красным Б культуры костномозговых МСК на 10-е сут инкубации в остеогенной среде свидетельствовало о начале минерализации внеклеточного матрикса в предполагаемых очагах остеогенеза (рис. 6, б). Максимальная активность щелочной фосфатазы также наблюдалась в пределах презумптивных очагов остеогенеза (рис. 6, г).

ЩФ

Рис. 5. Экспрессия коллагена I типа (Col I) (а) и костного сиалопротсина (BSP) (б) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на 11- (а) и 12-е (б) сут инкубации клеток в остеогенной срсдс. а', 6' - совмещение изображений результата иммуномсчсния и ядер клеток, окрашенных DAPI.

Рис. 6. Скопления соединений кальция и положительно окрашенных на щелочную фосфатазу (ЩФ) клеток (указаны стрелками) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на 10-е сут инкубации в контрольной (а, в) и остеогенной (б, г) средах, а, б - окраска ализариновым красным S (Alizarin Red S).

Ядра докрашены гематоксилином.

На 16-21 сут культивирования в остеогенной среде уже полностью сформированы так называемые "костные узелки" - массивные скопления внеклеточного минерализованного матрикса и полигональных клеток, похожих на остеобласты. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к коллагену I типа и костному сиалопротеину выявило присутствие этих белков преимущественно в пределах "костных узелков", где их количество было значительно выше, по сравнению с начальными сроками культивирования клеток в остеогенной среде (рис. 7).

Рис. 7. Экспрессия коллагена I типа (Col I) и костного сиалопротсина (BSP) в "костных узелках" в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 16-е сут инкубации клеток в остеогенной среде.

а", б", в" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных

DAPI (а\ б').

Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркера зрелых остеобластов остеокальцина выявил присутствие этого белка также преимущественно в пределах "костных узелков" (рис. 8). С помощью фазово-контрастной микроскопии показано, что клетки, экспрессирующие остеокальцин, обладали кубической или полигональной формой, а их ядра были смещены к периферии, т.е. по морфологии напоминали функционально зрелые остеобласты (рис. 8, а). Ни в

одной из контрольных культур экспрессия остеокальцина, костного сиалопро-теина и коллагена I типа не обнаружена.

Рис. 8. Экспрессия остсокапьцина (ОС) в пределах "костных узелков" в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 16-е сут инкубации клеток в остеогснной среде, а - фазово-контрастная микроскопия; а" - совмещение изображений результата иммуномсчсния и ядер клеток, окрашенных 0АР1.

Минерализованный костный матрикс, хорошо заметный при фазово-контрастной микроскопии (рис. 9, б), положительно окрашивался ализариновым красным 5 (рис. 9, г, е). Среднее число таких "костных узелков" составило 0.72 ± 0.17 на мм2 площади культурального флакона.

фазовый контраст Ч» ■' •' •':*:;::. " : Чг. ' .. - Г" ■ ' i • , • - f4 , • ■ ЕЯ Alizarin Red S 500 iJm AfeirjjRed s -;^ - V-;-"- ,'. „ ■ ft. Л "i* . ? V • • 200 (jm . д 1 it

m Alizarin Red f ■¿mj,,1''. - 200 [jm e * ' . .. 1

Рис. 9. Участки минерализованной костной ткани (отмечены стрелками) в культуре МСК из КМ 2-го пассажа. 16 сут инкубации клеток в контрольной {а, в, д) и остсогенной (б, г, е) средах. а, б - фазово-контрастная микроскопия; в, г, д, е- окраска ализариновым красным S (Alizarin Red S); д, е-ядра докрашены гематоксилином.

Кроме того, нами впервые выявлен ряд особенностей временного и топографического паттерна распределения фактора транскрипции Osterix в культуре МСК из КМ на разных сроках культивирования в остеогенной среде. Показано, что экспрессия этого фактора значительно усиливалась в местах предполагаемых очагов остеогенеза, когда сами очаги еще не были обособлены морфологически, и достигала максимального значения в окончательно сформированных "костных узелках" (рис. 10).

Рис. 10. Экспрессия фактора транскрипции С^епх (Овх) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа на 2-е (а), 10-е (б) и 16-е (в) сут культивирования в остеогенной среде, а", б", в" - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных ЭАР1 (а', б', в').

Остеогенез в пассируемой культуре МСК из печени зародышей. В сравнимых экспериментальных условиях в культуре МСК из ПЗ наблюдались некоторые морфогенетические преобразования, отчасти напоминающие таковые в остеогенной культуре МСК из КМ. Уже к 10-ым сут инкубации в остеогенной среде клетки формировали скопления, сходные с "костными узелками" (рис. 11).

Рис. 11. Фазово-контрастная микроскопия МСК из ПЗ на 10-е (а, б) и 16-е (в, г) сут культивирования в контрольной (а, в) и остеогенной (б, г) средах. Стрелками указаны участки скопления клеток, напоминающие "костные узелки".

Рис. 12. Экспрессия коллагена I типа (Col I) (а) и костного сиалопротсина (BSP) (б) в МСК из ПЗ 3-го пассажа. 14-е сут инкубации клеток в остеогенной среде, а', б' - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI.

friz

■

'—-tr

В пределах таких клеточных скоплений наблюдались массивные отложения межклеточного вещества, при этом сами клетки сохраняли фибробластопо-добную морфологию. Иммунофлуоресцентный анализ выявил в клеточных скоплениях отложения коллагеновых волокон I типа и костный сиалопротеин (рис. 12). Под действием остеогенных индукторов в культуре МСК из ПЗ также происходило незначительное усиление экспрессии щелочной фосфатазы. Тем не менее, число клеток, положительно окрашенных на щелочную фосфатазу, а также интенсивность самой реакции, были заметно ниже, чем в МСК из КМ.

Как известно, основным морфологическим признаком поздних этапов остеогенной дифферен-цировки in vitro является минерализация внеклеточного матрикса. Однако во всех исследованных культурах печеночных МСК гистохи-мически отложения кальция выявлены не были, за исключением крайне малочисленных положительно окрашенных ализариновым красным S участков (рис. 13). Среднее число таких участков было ничтожно мало и составило всего 2х10"4± 0.28 на мм2 площади куль-турального флакона. В клеточных скоплениях, напоминающих "костные узелки", остео-кальцин также не обнаружен.

Иммуноцитохимическое окрашивание с использованием антител к Osterix выявило этот фактор лишь в единичных клетках опытной культуры МСК печеночного происхождения. Отсутствие кальцификации внеклеточного матрикса и экспрессии фактора транскрипции Osterix, а также сохранение клетками фиб-робластоподобной морфологии в пределах клеточных скоплений указывают на неспособность печеночных МСК в заданных условиях культивирования завершить терминальную фазу остеогенной дифференцировки. Полученные данные иммуноцитохимии и гистохимии подтверждены с помощью ПЦР-анализа. Максимальный уровень экспрессии генов остеокальцина ОС и щелочной фосфатазы ALP в культуре МСК из КМ приходился на более поздние сроки культивирования клеток в остеогенной среде (9-16 сут эксперимента), что сопряжено с периодом накоплением соединений кальция во внеклеточном матриксе культуры. Напротив, в культуре печеночных МСК содержание мРНК этих генов оставалось крайне низким на протяжении всего эксперимента по индукции остеогенной дифференцировки, что еще раз указывает на неспособность этих клеток осуществлять минерализацию внеклеточного матрикса в созданных условиях in vitro (рис. 14).

Рис. 13. Клеточные скопления в культуре МСК из ПЗ, напоминающие "костные узелки". 16-е {а, б) и 21-е сут (в, г) культивирования клеток в контрольной (а, б) и остеогенной (в, г) средах. Окраска ализариновым красным S (Alizarin Red S). Ядра докрашены гематоксилином.

2сут 5сут

(а)

9сут

12сут 16сут

(б)

2сут 5с ут 9сут 12сут 16сут

ALP con ALP ex ОС con ОС ex GAPDH con GAPDH ex

Puc. 14. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов ОС и ALP в культуре МСК из КМ (а) и ПЗ (б) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ех) средах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-рсакции в нуклеотидных парах (н.п.).

Интересные результаты получены при изучении профиля экспрессии гена RUNX2 (рис. 15). В МСК из КМ на протяжении всего периода культивирования в остеогенной среде, за исключением начальных сроков (2-5 сут), отмечался высокий уровень экспрессии гена RUNX2. Вместе с тем, в популяции МСК печеночного происхождения содержание мРНК этого гена оказалось значительно ниже и не претерпевало существенных изменений на протяжении всего эксперимента. В обеих популяциях МСК также отмечен высокий уровень экспрессии генов коллагена I типа COLI Al и остеопонтина ОР (рис. 15).

2сут 5сут

(а)

9сут

12сут 16сут

2сут 5сут

(в) 9сут

12сут 16сут

ОРсоп ОР ех COL1A1 con COL1A1 ex RUNX2con RUNX2 ex GAPDH con GAPDH ex

д CS Д

W—Щ ч

Puc. 15. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов RUNX2, COL1A1, ОР в культуре МСК из КМ (а) и ПЗ (б) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ех) средах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-рсакции в нуклеотидных парах (н.п.).

Следует обратить внимание, что остеопонтин, в отличие от маркера функционально зрелых остеобластов остекальцина, в основном экспрессирует-ся незрелыми остеогенными клетками. Поэтому повышенное содержание мРНК гена ОР в опытной культуре печеночных МСК не является достаточным признаком реализации программы остеогенной дифференцировки. Кроме того, остеопонтин считается одним из ключевых ингибиторов процесса минерализации внеклеточного матрикса. Возможно, высокий уровень содержания мРНК этого гена на протяжении всего срока культивирования МСК печеночного происхождения является одной из причин подавления процессов образования и роста кристаллов гидроксиапатита in vitro.

Молекулярно-генетический и морфологический анализ адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте.

Появление первых жировых клеток в культуре МСК из ПЗ приходилось на более поздние сроки инкубации клеток в индукционной среде, а сама диф-ференцировка протекала менее интенсивно, чем в культуре МСК из КМ (рис.

Рис. 16. Адипоциты с множественными липидными включениями в культуре МСК из КМ 2-го пассажа. 10-е сут культивирования в контрольной (а, б, в) и адипогенной (г, д, е) средах. а, б, г, д - окраска Суданом III и IV, ядра докрашены гематоксилином; в, е - фазово-контрастная микроскопия.

100 рт

100 рт ^ • 100 um - в —

Рис. 17. Адипоциты с множественными липидными включениями в культуре МСК из ПЗ 2-го (е) и 3-го (а-д) пассажей. 16-е сут культивирования в контрольной (а, г) и адипогенной (б, в, d, е) средах, а, б, в - окраска жировым красным О (Oil Red О); г, д, е - окраска Суданом III и IV; ядра докрашены гематоксилином.

Интересно отметить, что в культуре печеночных МСК группы зрелых адипоцитов морфологически были обособлены от остальных клеток, сохраняющих фибробластоподобную морфологию и не содержащих липидные включения. Последние также обнаруживались и среди адипоцитов внутри группы (рис. 17, е).

В контрольных культурах МСК из обоих органов дифференцированные адипоциты не выявлены (рис. 16, а-в, рис. 17, а, г), хотя единичные клетки с морфологией фибробластов содержали в цитоплазме мелкие суданофильные включения.

При культивировании костномозговых МСК в стандартной ростовой среде 14-21 сут возможно появление спонтанной дифференцировки клеток в ади-погенном направлении (рис. 18, а, б). Кроме того, формирование зрелых адипоцитов наблюдалось также в стандартной остеогенной среде (рис. 18, в, г). В последнем случае, жировые клетки выявлялись в непосредственной близости от очагов остеогенеза (рис. 18, г).

Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к фактору транскрипции РРАЯ6 и маркеру зрелых адипоцитов АЬВР на поздних сроках культивирования МСК из КМ (16-е сут эксперимента) выявило значительное усиление экспрессии перечисленных маркеров в опыте по сравнению с контролем (рис. 19). Следует отметить, что как в контроле, так и на ранних сроках культивирования костномозговых МСК в индукционной среде экспрессия АЬВР преимущественно регистрировалась в ядрах (рис. 18, в). В ходе дальнейшей инкубации клеток в адипогенной среде цитоплазматическая локализация этого белка становилась более заметной (рис. 19, г).

Ядерная локализация АЬВР объясняется его ролью как транспортера жирных кислот в ядро клетки, где последние могут выступать в качестве специфических лигандов для ядерного рецептора РРАЯу. Полученные результаты находятся в хорошем соответствии с имеющимися данными литературы, где также продемонстрирована преимущественная ядерная локализация белка

Рис. 18. Мультилокулярныс адипоциты при культивировании МСК из КМ 4-го (а, б) и 2-го (в, г) пассажей в стандартной ростовой среде (а, б) и в остеогенной среде (в, г) на 18-е (в) и 21-е (г) сут эксперимента. Стрелками указан очаг остеогенеза (красная стрелка) и зрелые адипоциты (желтые стрелки), а, б - фазово-контрастная микроскопия; в - окраска Суданом III и IV с докрашиванием ядер гематоксилином; г - окраска гематоксилин-эозином.

ALBP на ранних этапах дифференцировки преадипоцитов (Helledie et al., 2000, 2002).

контроль PPARfi PPARft+DAPI • <9 if » М 0 в» griM* »-о»" контроль А1.ВР ALBP+DAPI Е1

опыт PPARd • , ^ « шя „ « VPARd+DAPl л * » , 1 ГИ V " ' опыт я т iLBP м*. » • „ т - * .¿ПВРН*»АИ т », » . т * В •

Рис. 19. Экспрессия фактора транскрипции РРАЯб (а, б) и маркера зрелых адипоцитов АЬВР (в, г) в культуре МСК из КМ 3-го пассажа. 10-е сут культивирования клеток в контрольной (а, в) и опытной (б, г) средах, а', б', в', г' - совмещение изображений результата иммуноме-чения и ядер клеток, окрашенных ОАР1.

По данным иммунофлуоресцентного анализа содержание фактора транскрипции РРА115 лишь в отдельных МСК печеночного происхождения было сопоставимым с таковым в костномозговых МСК (указаны стрелками на рис. 20, б).___

контроль PPAR8 PPAR8+DAPI па контроль ALBP ALBP+DAPI

опыт PFAR6 У PPARft+DAPI X с И - опыт AI.BP * .U.BP+DAPI « И ^

Рис. 20. Экспрессия фактора транскрипции PPARS (а, б) и маркера зрелых адипоцитов ALBP (в, г) в культуре МСК из ПЗ 3-го пассажа на 16-е сут культивирования клеток в контрольной (а, в) и опытной (б, г) средах, а', б', в', г'-совмещение изображений результата иммуноме-чения и ядер клеток, окрашенных DAPI.

На 16-е сут инкубации МСК из ПЗ в адипогенной среде содержание ALBP в клетках было значительно ниже по сравнению с МСК из КМ, т.к. белок, в основном, располагался в ядрах, за исключением некоторых клеток, в которых ALBP обнаруживался также и в цитоплазме (указаны стрелками на рис. 20, г).

Следующий этап работы посвящен изучению адипогенных потенций МСК на молекулярно-генетическом уровне. В МСК костномозгового происхождения максимальный уровень экспрессии генов PPARö, PPARy и ALBP приходился на 7-10 сут инкубации клеток в адипогенной среде, что совпадает по времени с возрастанием численности терминально дифференцированных ади-поцитов в культуре (рис. 21, а). Отмечено также, что на 10-е сут культивирования МСК из КМ в контрольной среде содержание мРНК гена PPARy было практически сопоставимым с таковым в опыте. Как известно, ядерный рецептор PPARy обладает антимитотической активностью, которая обуславливает выход адипогенных клеток из клеточного цикла, что является обязательным условием их дальнейшей дифференцировки (Gregoire et al., 1998). По-видимому, достижение клетками контрольной культуры 100% конфлуентности к поздним срокам культивирования, а также присутствие в добавляемой к среде сыворотке различных цитокинов, являются достаточным условием для выхода ранних предшественников адипоцитов из клеточного цикла и дальнейшей реализации программы адипогенеза этими клетками. Данный процесс, возможно, сопровождается повышением уровня экспрессии гена PPARy в клетках контрольной культуры. Косвенным доказательством присутствия в контроле преадипоцитов разной степени зрелости является спонтанная адипогенная дифференцировка, иногда наблюдаемая при культивировании костномозговых МСК в стандартной ростовой среде, т.е. без индукторов. На 7-10 сут культивирования костномозговых МСК в адипогенной среде также детектирована мРНК гена LEP, кодирующего гормон лептин (рис. 21, а).

(а) (б)

2 сут 5 сут 7 сут 10 сут 2 сут 7 сут 12 сут 16 сут

PPARycon PPARy ex PPAR6 con PPARü ex ALBP con ALBP ex LEP con LEP ex GAPDH con GAPDH ex

Pnc. 21. Данные ПЦР-анализа по экспрессии генов PPARy PPARS, ALBP и LEP в культурах МСК из КМ (а) и ПЗ (о) на разных сроках культивирования клеток в контрольной (con) и опытной (ех) средах. Справа обозначен молекулярный вес фрагментов ПЦР-реакции в нук-леотпдпых парах (н.п.).

Напротив, более низкий уровень экспрессии гена ALBP, незначительное содержание мРНК гена PPARS, а также практически полное отсутствие мРНК гена LEP в опытных культурах печеночных МСК полностью подтверждают результаты гистохимии и иммуноцитохимии, согласно которым адипогенные потенции этих клеток в заданных условиях культивирования выражены слабее (рис. 21, б). Вместе с тем отмечено, что на 16-е сут инкубации МСК из ПЗ в

адипогенной среде уровень экспрессии гена PPARy увеличивался и становился сравнимым с таковым в МСК из КМ. Полученный результат свидетельствует о влиянии индукторов адипогенеза на дифференцировочный статус МСК печеночного происхождения.

В совокупности, полученные экспериментальные данные позволяют заключить: исследованные клеточные популяции из двух кроветворных органов, печени зародышей и зрелого костного мозга, отвечают критериям МСК, однако их остеогенные и адипогенные потенции в сравнимых экспериментальных условиях культивирования неодинаковы, что, вероятно, объясняется разными программами развития этих клеток в онтогенезе.

Выводы

1. МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга обладают сходным иммунофенотипом, т.е. экспрессируют специфические поверхностные антигены CD90, CD73, CD 105.

2. В обеих клеточных популяциях МСК, начиная с 8-го пассажа, наблюдается снижение экспрессии CD73 и CD105, что, возможно, является признаком клеточного старения.

3. МСК из печени зародышей, в отличие от МСК из зрелого костного мозга, под влиянием индукторов остеогенеза не способны к реализации терминальных этапов остеогенной дифференцировки, несмотря на некоторые морфологические преобразования.

4. Временной и топографический характер распределения ключевого регулятора остеогенной дифференцировки Osterix в культуре МСК из зрелого костного мозга свидетельствует о строгой привязанности экспрессии этого фактора транскрипции к презумптивным и сформированным очагам остеогенеза in vitro.

5. Под влиянием остеогенных индукторов в МСК из зрелого костного мозга заметно повышалось содержание мРНК генов ОС, ALP и RUNX2, тогда как в МСК из печени зародышей уровень экспрессии перечисленных генов оставался сравнительно низким.

6. Адипогенная дифференцировка МСК из печени зародышей выражена слабее по сравнению с таковой МСК из костного мозга, что проявляется в невысокой численности зрелых адипоцитов, более позднем их формировании, а также в менее интенсивной экспрессии фактора транскрипции PPAR5 и маркера зрелых адипоцитов ALBP.

7. Под влиянием адипогенных индукторов в МСК из печени зародышей отмечали пониженное содержание мРНК гена ALBP, крайне низкий уровень экспрессии гена PPARS, а также отсутствие мРНК гена LEP, в сравнении с выраженной экспрессией указанных генов в МСК из зрелого костного мозга.

Список ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ 110 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

Кожевникова М. Н.. Микаелян А. С., Паюшина О. В., Старостин В. И. 2008. Сравнительная характеристика мезенхимных стромальных клеток из костного мозга крысы на ранних и поздних этапах культивирования. Известия РАН. Серия биол. №2: 156-162.

Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Молекулярно-генетические основы регуляции остеогенной дифференцировки мезенхимных стромальных клеток. Известия РАН. Серия биол. №.3: 261-271.

Кожевникова М. Н.. Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Сравнительная им-мунофенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных стромальных клеток из дефинитивных и транзиторных кроветворных органов. Доклады Академии Наук. 422 (№2): 265-267.

Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Старостин В. И. 2008. Молекулярно-генетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля, остео-генных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей и костного мозга половозрелых крыс. Цитология. 51 (в печати).

Тезисы конференции:

Кожевникова М.Н., Паюшина О.В., Микаелян A.C. Морфогенетические преобразования мезенхимных стромальных клеток (МСК) крыс в ранние и поздние сроки культивирования // Симпозиум с международным участием "Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза". Москва, 9-11 октября 2007. Сборник тезисов, стр. 83-84.

Кожевникова М.Н., Старостин В.И., Микаелян A.C. Анализ адипогенной и остеогенной дифференцировок мезенхимных родоначальных клеток костного мозга и эмбриональной печени крысы in vitro II Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез, 2007, 38(4): 315.

Кожевникова М.Н., Паюшина О.В., Микаелян A.C. Сравнительная характеристика мезенхимных стромальных клеток из костного мозга крысы на ранних и поздних пассажах // Тезисы докладов И Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Цитология, 2007, 49(9): 756-757.

Кожевникова М.Н., Микаелян A.C., Старостин В.И. Сравнительная иммунофе-нотипическая и функциональная характеристика мезенхимных стромальных клеток из дефинитивных и эмбриональных кроветворных органов // Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез, 2008, 39(4): 314315.

Кожевникова М.Н., Микаелян A.C. Молекулярно-генетический и иммунофено-типичеекий анализ антигенного профиля и остеогенных потенций мезенхимных стромальных клеток из печени зародышей и костного мозга половозрелых крыс // IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008. Сборник тезисов, стр. 217.

Кожевникова М.Н., Микаелян A.C., Старостин В.И. Сравнительный молеку-лярно-генетический и гистохимический анализ адипогенных потенций мезенхимных стромальных клеток из зародышевой печени и зрелого костного мозга крыс // XV Школа "Актуальные проблемы биологии развития". Звенигород, 1924 октября 2008. Сборник тезисов, стр. 41.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 06-0448209), гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ НШ - 1134.2008.4.

Заказ № 62/12/08 Подписано и печать 05 12.2008 Тираж 90 экз Усл. п л 1,25

ООО "Цпфровичок", тел (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 mvw.cfr.ru; е-таИ:irifo@cfr.ni

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кожевникова, Мария Николаевна

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. МСК: основные аспекты биологии.

1.1.1. История открытия МСК.

1.1.2. Терминология.

1.1.3. Критерии МСК.

1.1.4. Источники МСК.

1.1.5. Методы выделения МСК.

1.1.6. Условия культивирования МСК.

1.1.7. Морфологическая, функциональная и биохимическая неоднородность популяции МСК.

1.1.8. Антигенный фенотип и профиль экспрессии генов МСК.

1.1.9. Возможные направления дифференцировки МСК. Явление пластичности.

1.1.10. Перспективы практического использования МСК в современной медицине.

1.2. Общая характеристика МСК из печени зародышей как транзиторного органа миелоидного кроветворения в эмбриогенезе.

1.2.1. Роль МСК и их производных в создании кроветворного микроокружения. Миграционные свойства МСК.

1.2.2. Предпосылки изучения МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте.

1. 3. Молекулярно-генетические основы дифференцировки МСК.

1.3.1. Роль сигнальных белков и транскрипционных факторов в клеточной дифференцировке.

1.3.2. Молекулярно-генетические аспекты остеогенной дифференцировки МСК.

1.3.3. Молекулярно-генетические аспекты адипогенной. дифференцировки МСК.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Антигенный профиль МСК из печени зародышей и зрелого. костного мозга.

3.1.1. Оценка экспрессии негативных маркеров МСК на разных сроках культивирования.

3.1.2. Оценка экспрессии позитивных маркеров МСК на разных сроках культивирования.

3.2. Молекулярно-генетические и морфологические аспекты остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном плане.

3.2.1. Гистохимический и иммуноцитохимический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга.

3.2.2. Сравнительный молекулярно-генетический анализ экспрессии генов, ответственных за реализацию остеогенеза в культурах МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга.

3.3. Молекулярно-генетические и морфологические аспекты адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном плане.

3.3.1. Гистохимический и иммуноцитохимический анализ адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга.

3.3.2. Сравнительный молекулярно-генетический анализ экспрессии генов, ответственных за реализацию адипогенеза в культурах

МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Сравнительная оценка антигенного профиля МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга.

4.2. Молекулярно-генетический и морфологический анализ остеогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте.

4.3. Молекулярно-генетический и морфологический анализ адипогенной дифференцировки МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном аспекте.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая и иммунофенотипическая характеристика мезенхимных стромальных клеток из миелоидных органов крыс в онтогенезе"

Актуальность проблемы. Познание механизмов регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки, несомненно, остается одним из основополагающих направлений в биологии развития, интенсивно и плодотворно изучаемых как на клеточном, так и на субклеточном уровнях с привлечением самых разнообразных подходов и методов. Мезенхимные стромальные клетки (МСК) являются одной из часто используемых экспериментальных моделей для изучения морфогенетических процессов в связи с несложностью их выделения, культивирования, высокой пролиферативной активностью и широкими потенциями к дифференцировке. Неоспоримые преимущества названной модели также заключаются в том, что она позволяет изучать процессы клеточной пролиферации и дифференцировки на молекулярно-генетическом уровне, что особенно актуально сейчас, когда внимание исследователей сместилось с изучения морфологических аспектов клеточного развития на события, происходящие на уровне гена.

В настоящее время МСК рассматриваются как мультипотентные тка-неспецифические стволовые и родоначальные клетки взрослого организма, по своим потенциям к дифференцировке близкие к клеткам эмбриональной мезенхимы. МСК способны осуществлять направленную дифференцировку в определенные типы клеток соединительной ткани, такие как остеобласты, хондробласты, адипоциты и стромальные клетки, создающие кроветворное микроокружение (Owen, 1988; Owen, Friedenstein 1988; Dominici et al., 2006). По общему признанию, основы экспериментального изучения и клинического применения МСК были заложены отечественным исследователем А. Я. Фриденштейном в 60-х гг. XX столетия (Friedenstein et al., 1966, 1968).

МСК обнаружены в различных органах и тканях половозрелого организма (Meirelles et al., 2006), тем не менее, основным источником этих клеток на протяжении всего постнатального онтогенеза считается костный мозг (Bianco et al., 2001; Pittenger, Marshak, 2001; Pittenger, 2008). MCK также найдены в составе кроветворной стромы эмбриональных органов гемопоэза, в частности, в печени зародышей (Charbord et al., 2002; Mendes et al., 2005). Присутствие MCK в составе стромы кроветворных органов в разные периоды онтогенеза тесным образом связано с исключительной ролью этих клеток и их производных в формировании и поддержании кроветворного микроокружения, так называемой "ниши" кроветворной стволовой клетки (КСК) (Metealf, Moore, 1971; Van Den Heuvel et al., 1987; Mendes et al., 2005).

Сравнительный анализ MCK различной органной принадлежности важен для получения глубокого и всестороннего представления о биологии этих клеток в целом. Мы полагаем, что наиболее подходящим критерием для проведения подобного сравнительного исследования является функциональная близость МСК. Это определило выбор органов-источников данных клеток, которыми стали печень зародышей и зрелый костный мозг, т.к. МСК в составе этих органов выполняют сходную функцию, участвуя в организации кроветворного микроокружения в разные периоды онтогенеза. Мы полагаем также, что изучение МСК из разных кроветворных источников в сравнительном аспекте позволит не только охарактеризовать исследуемые клеточные популяции с необходимой полнотой и определенностью, но и предоставит возможность судить об их идентичности, как это показано для кроветворных стволовых клеток (КСК). Известно, что в онтогенезе процесс кроветворения последовательно развертывается в разных органах. Согласно современной концепции миграционной теории, КСК, впервые возникнув в желточном мешке и области аорта-гонадо-мезонефроса, последовательно заселяют тран-зиторные и дефинитивные кроветворные органы по мере формирования в них соответствующего микроокружения (Metealf, Moore, 1971; Van Den Heuvel et al., 1987; Mendes et al., 2005). Нами не исключается наличие подобной последовательной миграции из одних временно существующих кроветворных органов в другие в процессе индивидуального развития и для МСК, чему есть ряд экспериментальных подтверждений (Van Den Heuvel et al., 1987; Mendes et al., 2005).

Однако, рассматривая МСК как важный компонент кроветворного микроокружения, необходимо учитывать, что сами МСК должны находиться под влиянием специфических локальных внутриорганных факторов. Следовательно, несмотря на возможную гистогенетическую близость МСК из различных кроветворных источников, возможно также наличие некоторых фе-нотипических и функциональных особенностей между этими клетками. Планируя проведение сравнительного изучения МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга, мы допускали, что такие различия реально существуют.

Рассмотрение весьма немногочисленной литературы, посвященной сравнительной характеристике МСК из указанных источников, косвенно подтвердило наши предположения. Показано, что МСК из печени зародышей обладают большим пролиферативным потенциалом по сравнению с костномозговыми МСК (Campagnoli et al., 2001; Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guil-lot et al., 2007), а также, по некоторым данным, несут на своей поверхности маркеры эмбриональных стволовых клеток, такие как Oct4 и Nanog (Guillot et al., 2007), что хорошо укладывается в современные представления о биологических свойствах клеток эмбрионального происхождения. Вместе с тем, сведения о дифференцировочных потенциях МСК в составе печени зародышей остаются неполными и противоречивыми. Так, рядом авторов подтверждена способность этих клеток дифференцироваться в адипогенном, остео-генном и хондрогенном направлениях (Campagnoli et al., 2001; Gotherstrom et al., 2003, 2005; Guillot et al., 2007), тогда как другими исследователями наличие таких множественных потенций ставится под сомнение (in't Anker et al., 2003a; Fromigue et al., 2008).

Таким образом, всесторонний подход к решению этих проблем требует глубокого изучения фенотипических и функциональных особенностей МСК в составе печени зародышей и зрелого костного мозга в сравнительном плане с помощью комплексного экспериментального подхода, предусматривающего проведение исследований на молекулярно-генетическом уровне.

Мы остановили свой выбор на дифференцировке МСК в двух направлениях: остеогенном и адипогенном. Эти направления дифференцировки приводят, в конечном счете, к развитию двух типов клеток - остеобластов и ади-поцитов, чьи функции in vivo достаточно разобщены. Остеогенные клетки причисляются к механоцитам, выполняющим прежде всего опорную функцию вместе с продуцируемым ими межклеточным веществом, тогда как ади-поцитам приписывается преимущественно энергетическая и трофическая функции. Несмотря на такую функциональную разобщенность, есть все основания предполагать, что остеобласты и адипоциты происходят от общего бипотентного предшественника в составе популяции МСК (Richard et al., 1996; Gimble et al., 1996; Nuttall, Gimble, 2000). К этому следует добавить, что клетки обоих типов объединяет выполняемая ими исключительно важная функция - секреторная, благодаря которой они играют незаменимую роль в формировании и поддержании кроветворного микроокружения (Tavassoli, 1974; Zhang et al., 2003; Haylock, Nilsson, 2006; Benayahu èt al., 2007).

Цель и задачи исследования. Все вышесказанное позволило наметить основную цель диссертационной работы - сравнительный молекулярно-генетический и иммунофенотипический анализ антигенного профиля, остео-генных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга крыс. Для достижения цели исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Охарактеризовать изучаемые клеточные популяции с позиции общепринятых критериев МСК по экспрессии специфических поверхностных антигенов СТ>1Ъ, СБ90, СБ 105.

2. Изучить динамику экспрессии указанных маркеров на разных сроках культивирования.

4. Сравнить уровень экспрессии генов, кодирующих маркеры остеогенной дифференцировки, в изучаемых популяциях МСК.

Научная новизна. На экспериментальной модели - культуре МСК из печени зародышей крыс, впервые проведена комплексная оценка антигенного профиля и динамики экспрессии специфических маркеров МСК в ходе культивирования в сравнении с таковыми из зрелого костного мозга. Показано, что исследованные клеточные популяции обладают сходным иммунофе-нотипом, а именно экспрессируют специфические поверхностные антигены С090, СБ73, СБ 105. Выявлено, что по мере увеличения сроков культивирования МСК из обоих источников наблюдается снижение экспрессии таких маркеров как СБ73 и СОЮ5.

Впервые проведен подробный иммунофенотипический и гистохимический анализ остеогенных и адипогенных потенций МСК из печени зародышей в сравнении с таковыми МСК из костного мозга половозрелых крыс. В сходных экспериментальных условиях МСК из печени зародышей обладают менее выраженными потенциями к адипогенезу и не способны к завершению остеогенной дифференцировки, а именно к формированию зрелых остеобластов и минерализованного межклеточного матрикса, в отличие от выраженных адипо- и остеогенных потенций МСК из зрелого костного мозга.

Впервые проведен сравнительный анализ экспрессии ряда генов, кодирующих маркеры остеогенной и адипогенной дифференцировок, на разных сроках культивирования МСК из обоих источников в соответствующих индукционных средах. Выявлено, что МСК из печени зародышей характеризуются более низкой экспрессией генов, вовлеченных в реализацию как остеогенной, так и адипогенной программ дифференцировок, по сравнению с МСК из зрелого костного мозга.

Теоретическое и практическое значение. Для решения поставленных в работе задач реализован комплексный подход, позволивший в сходных экспериментальных условиях сравнить МСК из транзиторного (печень зародышей) и дефинитивного (зрелый костный мозг) органов миелоидного кроветворения. Подобный сравнительный анализ представляет общебиологический интерес, поскольку позволяет получить более целостное представление о системе МСК. Кроме того, полученные сведения позволяют судить о фено-типическом сходстве МСК из двух источников, но не их идентичности, проявляющейся в различной степени реализации той или иной программы дифференцировки в сравнимых условиях культивирования. Неодинаковые инду-цибельные свойства МСК из печени зародышей и зрелого костного мозга могут быть связаны с разной органной принадлежностью этих клеток, в частности, с влиянием специфических локальных внутриорганных факторов.

Проведенное сравнительное изучение МСК из печени зародышей в сравнении с таковыми из зрелого костного мозга имеет также важное практическое значение. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курса лекций по биологии развития и биологии стволовых клеток, а также учитываться при проведении биомедицинских исследований.

В заключение автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям, д.б.н. В.И. Старостину и к.б.н. A.C. Микаеляну, оказавшим неоценимую помощь в организации экспериментальных исследований, принявшим непосредственное участие в их проведении и теоретическом анализе. Автор искренне признателен д.б.н. Р.Д. Зиновьевой за ценные критические высказывания и консультации. Автор также выражает благодарность сотрудникам лабораторий Гистогенеза и Молекулярно-генетических проблем онтогенеза за помощь в организации экспериментов и обсуждении полученных результатов.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Кожевникова, Мария Николаевна

ВЫВОДЫ

2. В обеих клеточных популяциях МСК, начиная с 8-го пассажа, наблюдается снижение экспрессии CD73 и CD 105, что, возможно, является признаком клеточного старения.

6. Адипогенная дифференцировка МСК из печени зародышей выражена слабее по сравнению с таковой МСК из костного мозга, что проявляется в невысокой численности зрелых адипоцитов, более позднем их формировании, а также в менее интенсивной экспрессии фактора транскрипции PPARS и маркера зрелых адипоцитов ALB Р.

7. Под влиянием адипогенных индукторов в МСК из печени зародышей отмечали пониженное содержание мРНК гена АЬВР, крайне низкий уровень экспрессии гена РРАЯд, а также отсутствие мРНК гена ЬЕР, в сравнении с выраженной экспрессией указанных генов в МСК из зрелого костного мозга.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кожевникова, Мария Николаевна, Москва

1. Аклюев И. Г., Сергеев В. Г. 2002. Нейроиммуноэндокриноло-гия жировой ткани. Успехи физиологических наук. 33: 3-16.

2. Анохина Е. Б., Буравкова Л. Б. 2007. Гетерогенность стро-мальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга крыс. Цитология. 49: 40-47.

3. Кожевникова М. Н., Микаелян А. С., Паюшина О. В., Старостин В. И. 2008. Сравнительная характеристика мезенхим-ных стромальных клеток из костного мозга крысы на ранних и поздних этапах культивирования. Известия РАН. Серия биол. №2: 156-162.

4. Паюшина О. В., Домарацкая Е. И., Старостин В. И. 2006. Мезенхимные стволовые клетки: источники, фенотип и потенции к дифференцировке. Известия РАН. Серия биол. №1: 6-25.

5. Паюшина О. В., Хныкова О. Н., Буторина Н. И., Кожевникова М. Н., Старостин В. И. 2009. Спонтанный миогенез в первичной культуре эмбриональной печени крысы. Доклады Академии Наук (в печати).

6. Пирс Э. Гистохимия. М.: Изд-во ин. лит-ры, 1962, 962 с.

7. Старостин В. И., Домарацкая Е. И. 2001. Хондро- и остеоге-нез в эктопических трансплантантах печени зародышей мыши. Онтогенез. 32: 114-117.

8. Стрелков Р. Б. Таблицы Стрелкова и экспресс-метод статистической обработки данных. -М.: ПАИМС, 1999, 96 с.

9. Abdallah B. M., Kassem M. 2008. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Therapy. 15: 109-116.

10. Anjos-Afonso F., Bonnet D. 2007. Nonhematopoietic/endothelial SSEA-1+ cells define the most primitive progenitors in the adult murine bone marrow mesenchymal compartment. Blood. 109: 1298-1306.

11. AmriE. Z., BoninoF., Ailhaud G., AbumradN. A., Grimaldi P. A. 1995. Cloning of a protein that mediates transcriptional effects of fatty acids in preadipocytes. Homology to peroxisome prolifera-tor-activated receptors. J Biol Chem. 270(5): 2367-2371.

12. Asian H., Zilberman Y., Kandel L., Liebergall M., Oskouian R. J., Gazit D., Gazit Z. 2006. Osteogenic differentiation of noncultured immunoisolated bone marrow-derived CD105+ cells. Stem Cells. 24: 1728-1737.

13. Aubin J. E., Liu F. The osteoblast lineage. In: Principles of bone biology / Eds. Bilezikian J. P., Raisz L. G., Rodan G. A. - San Diego: Academic Press, 1996, p. 51-68.

14. Baxter M. A., Wynn R. F., Jowitt S. N. et al. 2004. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. Stem Cells. 22: 675-682.

15. Benayahu D., Akavia U. D., Shur I. 2007. Differentiation of bone marrow stroma-derived mesenchymal cells. Current Medicinal Chemistry. 14: 173-179.

16. Bendall A. J., Abate-Shen C. 2000. Roles for Msx and Dlx ho-meoproteins in vertebrate development. Gene. 247: 17-31.

17. Bennett C. N., Ross S. E., Longo K. A., Bajnok L., Hemati N., Johnson K. W., Harrison S. D., MacDougald O. A. 2002. Regulation of Wnt signaling during adipogenesis. J Biol Chem. 277(34): 30998-31004.

18. Bennett C. N., Longo K. A., Wright W. S., Suva L. J., Lane T. F., Hankenson K. D., MacDougald O. A. 2005. Regulation of osteohistogenesis and bone mass by WntlOb. PNAS. 102: 33243329.

19. Bialek P., Kern B., Yang X., Schrock M., Sosic D., Hong N., Wu H., Yu K., Ornitz D. M., Olson E. N., Justice M. J., Karsenty G. 2004. A twist code determines the onset of osteoblast differentiation. Dev Cell. 6(3): 423^135.

20. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P. G. 2001. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19: 180-192.

21. Bonab M. M., Alimoghaddam K., Talebian F., Ghajfari S. H., Ghavamzadeh A., Nikbin B. 2006. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7(14).

22. Bruder S. P., Jaiswal N., Haynesworth S. E. 1997. Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified humanmesenchymal stem cells during extensive subcultivation following cryopreservation. J. Cell. Biochem. 64: 278-294.

23. Burns J. S., Abdallah B. M., Guldberg P., Rygaard J., Schroder

24. H. D., Kassem M. 2005. Tumorigenic heterogeneity in cancer stem cells evolved from long-term cultures of telomerase-immortalized human mesenchymal stem cells. Cancer Res. 65: 3126-3135.

25. Campagnoli C., Roberts I., Kumar S., Bennett P. R., Bellantuono1., Fisk N. M. 2001. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. Blood. 98: 2396-2402.

26. Caplan A. I. 1991. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9: 641-650.

27. Caplan A. L, Dennis J. E. 2006. Mesenchymal stem cells as tro-phicmediators. Journal of Cellular Biochemistry. 98: 1076-1084.

28. Chagraoui J., Lepage-Noll A., Anjo A., Uzan G., Charbord P. 2003. Fetal liver stroma consists of cells in epithelial-to-mesenchymal transition. Blood. 101: 2973-2982.

29. Charbord P., Oostendorp R., Pang W., Hérault O., Noel F., Tsuji T., Dzierzakand E., Péault B. 2002. Comparative study of stromal cell lines derived from embryonic, fetal, and postnatal mouse blood-forming tissues. Exp. Hematology. 30: 1202-1210.

30. Chateauvieux S., Ichante J., Delorme B., Frouin V., Pietu G., Langonne A., Gallay N., Sensebe L., Martin M. T., Moore K. A., Charbord P. 2007. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiol Genomics. 29: 128-138.

31. Chen J., Li Y., Wang L., Zhang Z, Lu D., Lu M., Chopp M. 2001. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrowstromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32: 10051011.

32. Chen D., Zhao M., Mundy G. R. 2004. Bone morphogenetic protein. Growth Factors. 22: 233-241.

33. Cheng S. L., Shao J. S., Charlton-Kachigian N., Loewy A. P., Towler D. A. 2003. Msx2 promotes osteogenesis and suppresses adipogenic differentiation of multipotent mesenchymal progenitors. J. Biol. Chem. 278: 45969-45977.

34. Colter D. C, Class R., DiGirolamo C. M, Prockop D. J. 2000. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. PNAS. 97: 3213-3218.

35. Darlington G. J., Ross S. E. MacDougald O. A. 1998. The role of C/EBP genes in adipocyte differentiation. J Biol Chem. 273: 30057-30060.

36. Day T. F., Guo X., Garrett-Beal L., Yang Y. 2005. Wnt/beta-catenin signaling in mesenchymal progenitors controls osteoblast and chondrocyte differentiation during vertebrate skeletogenesis. Dev Cell. 8(5): 739-750.

37. De Bari C., Dell'Accio F., Tylzanowski P., Layten F. P. 2001. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum. 44: 1928-1942.

38. Delorme B., Chateauvieux S., Charbord P. 2006. The concept of mesenchymal stem cells. Regenerative Med. 1: 497-509.

39. Delorme B., Charbord P. 2007. Culture and characterization of human bone marrow mesenchymal stem cells. In: Hauser H. and Fussenegger M., editors. Tissue engineering. 2nd ed. Totowa: Humana Press. P. 67-81.

40. Dennis J. E, Merriam A., Awadallah A., Yoo J. U., Johnstone B., Caplan A. I. 1999. A quadripotential mesenchymal progenitor cellisolated from the marrow of an adult mouse. J Bone Miner Res. 14 (5):700-9.

41. Dexter T. M., Spooncer E., Simmons P., Allen T. D. Long-term marrow culture: an pverview of techniques and experience. In: Long-term bone marrow culture / Eds. Wright D. G., Greenberger J. S. - New York: Alan R. Liss., 1984, p. 57-96.

42. O'Donoghue K., Chan J., de la Fuente J., Kennea N. Sandison A., Anderson J. R., Roberts I. A., Fisk N. M. 2004. Microchimerism in female bone marrow and bone decades after fetal mesenchymal stem-cell trafficking in pregnancy. Lancet. 364: 179-182.

43. O'Donoghue K., Chan J. 2006. Human fetal mesenchymal stem cells. Curr. Stem Cell Res. Ther. 1: 371-386.

44. Ducy P. 2000. Cbfal: a molecular switch in osteoblast biology. Dev. Dyn. 19:461-471.

45. Ducy P., Karsenty G. 1995. Two distinct osteoblast-specific cis-acting elements control expression of a mouse osteocalcin gene. Mol. Cell Biol. 15: 1858-1869.

46. Durand C., Robin G, DzierzakE. 2006. Mesenchymal lineage potentials of aorta-gonad-mesonephros stromal clones. 91: 1172— 1179.

47. Dzierzak E. 2001. Haemoglobin disorders. A dynamic system. Lancet. 358 (Suppl):S31.

48. El-Jack A. K., Hamm J. K. , Pilch P. F., Farmer S. R. 1999. Reconstitution of insulin-sensitive glucose transport in fibroblasts requires expression of both PPARgamma and C/EBPalpha. J Biol Chem. 274(12): 7946-7951.

49. Erices A., Conget P., Mingue 11 J. J. 2000. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br. J. Haematol. 109: 235-242.

50. Fajas L. 2003. Adipogenesis: a cross-talk between cell proliferation and cell differentiation. Annals Med. 35: 79-85.

51. Fernandez M., Simon V., Herrera G., Cao C., Del Favero H., Minguell J. J. 1997. Detection of stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients. Bone Marrow Transplant. 20(4): 265-271.

52. Fink T., Abildtrup L., Fogd K., Abdallah B. M., Kassem M., Ebbesen P., Zachar V. 2004. Induction of adipocyte-like pheno-type in human mesenchymal stem cells by hypoxia. Stem Cells. 22:1346-1355.

53. Fickert S., Fiedler J., Brenner R. E. 2003. Identification, quantification and isolation of mesenchymal progenitor cells from os-teoarthritic synovium by fluorescence automated cell sorting. Osteoarthritis Cartilage. 11: 790-800.

54. Friedenstein A. J., Piatetzky-Shapiro I. L, Petrakova K. V. 1966. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J. Embryol. Exp. Morphol. 16:381-390.

55. Friedenstein A. J., Petrakova K. V., Kurolesova A. I., Frolova G. P. 1968. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6: 230247.

56. Friedenstein A. J., Chailakhyan R. K., Lalykina K. S. 1970. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet. 3: 393-403.

57. Friedenstein A. J., Gorskaja J. F., Kulagina N. N. 1976. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp. Hematol. 4: 267—274.

58. Friedenstein A. J., Chailakhyan R. K., Gerasimov U. V. 1987. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 20(3): 263272.

59. Fromigue O., Hamidouche Z., Chateauvieux S., Charbord P., Marie P. J. 2008. Distinct osteoblastic differentiation of murinefetal liver and bone marrow stroma-derived mesenchymal stem cells. J. Cell. Biochem. 104: 620-628.

60. Geoffroy V., Kneissel M., Fournier B., Boyde A., Matthias P. 2002. High bone resorption in adult aging transgenic mice over-expressing cbfal/runx2 in cells of the osteoblastic lineage. Mol Cell Biol. 22 (17):6222-33.

61. Gimble J. M., Robinson C. E„ WuX., Kelly K. A. 1996. The function of adipocytes in the bone marrow stroma: an update. Bone. 19(5): 421-428.

62. Gotherstrom C., Ringden O., Westgren M., Tammik C., Le Blanc K. 2003. Immunomodulatory effects of human foetal liver-derived mesenchymal stem cells. Bone Marrow Transplantation. 32: 265272.

63. Gotherstrom C., West A., Liden J., Uzunel M., Lahesmaa R., Le Blanc K. 2005. Difference in gene expression between human fetal liver and adult bone marrow mesenchymal stem cells. Haema-tologica. 90:1017-1026.

64. Grimaldi P. A. 2001. The roles of PPARs in adipocyte differentiation. Progress in Lipid Research. 40: 269-281.

65. Gregoire F. M, Smas C. M, Sid H. S. 1998. Understanding adipocyte differentiation. Physiological reviews. 78: 783-809.

66. Gronthos S., Graves S. E., Ohta S., Simmons P. J. 1994. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors. Blood. 84: 4164^4173.

67. Gronthos S., Zannettino A. C., Hay S. J., Shi S., Graves S. E., Kortesidis A., Simmons P. J. 2003. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J. Cell Sci. 116: 1827-1835.

68. Guan H. P., Ishizuka T., Chid P. C., Lehrke M., Lazar M. A. 2005. Corepressors selectively control the transcriptional activity of PPARgamma in adipocytes. Genes Dev. 19: 453-461.

69. Guillot P. V., Gotherstrom C., Chan J., Kurata H., Fisk N. M. 2007. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem Cells. 25: 646-654.

70. Guillot P. V., De Bari C., Dell'Accio F., Kurata H., PolakJ., Fisk N. M. 2008. Comparative osteogenic transcription profiling of various fetal and adult mesenchymal stem cell sources. Differentiation. 76: 946-957.

71. Guo J, Lin G. S., Bao C. Y, Hu Z. M., Hu M. Y 2007. Antiinflammation role for mesenchymal stem cell transplantation in myocardial infarction. Inflammation. 30: 97-104.

72. Gupta N„ Su X, Popov B., Lee J. W., Serikov V., Matthay M.A. 2007. Intrapulmonary delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves survival and attenuates endotoxin-induced acute lung injury in mice. J Immunol. 179: 1855-1863.

73. Hardy S. A., Maltman D. J., Przyborski S. A. 2008. Mesenchymal stem cells as mediators of neural differentiation. Curr. Stem Cell. Res. Ther. 3(1): 43-52.

74. Harting M., Jimenez F., Pati S., Baumgartner J., Cox C. Jr. 2008. Immunophenotype characterization of rat mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 10: 243-253.

75. Haylock D. N., Nilsson S. K. 2006. Osteopontin: a bridge between bone and blood. Br. J. Haematol. 134(5): 467-474.•87. Helledie T., Antonius M., Sorensen R. V., Hertzel A. V., Bernlohr

76. D. A., Kolvraa S., Kristiansen K., Mandrup S. 2000. Lipid-binding proteins modulate ligand-dependent trans-activation byperoxisome proliferator-activated receptors and localize to the nucleus as well as the cytoplasm. J. Lipid Res. 41: 1740-1751.

77. Hu H., Hilton M. J., Tu X., Yu K., Ornitz D. M., Long F. 2005. Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development. Development. 132(1): 49-60.

78. Hwang C. S., Mandrup S., MacDougald O. A., Geiman D. E., Lane M. D. 1996. Transcriptional activation of the mouse obese (ob) gene by CCAAT/enhancer binding protein alpha. PNAS. 93(2): 873-877.

79. Ishii M., Han J., Yen H. Y., Sucov H. M., Chai Y., Maxson R. E. Jr. 2005. Combined deficiencies of Msxl and Msx2 cause impaired patterning and survival of the cranial neural crest. Development. 132: 4937-4950.

80. Javason E. H., Colter D. C., Schwarz E. J., Prockop D. J. 2001. Rat marrow stromal cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells. Stem cells. 19: 219-225.

81. Jiang Y., Vaessen B., Lenvik T., Blackstad M., Reyes M., Verfaillie C. M. 2002. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp. Hematology. 30: 896-904.

82. Karsenty G., Wagner E. F. 2002. Reaching a genetic and molecular understanding of skeletal development. Developmental Cell. 2: 389-406.

83. Kanatani N., Fujita T., Fukuyama R., Liu W., Yoshida C. A., Moriishi T., Yamana K., Miyazaki T., Toyosawa S., Komori T. 2006. Cbf beta regulates Runx2 function isoform-dependently in postnatal bone development. Dev Biol. 296(1): 48-61.

84. Kassem M., Anker sen L., Eriksen E. F, Clark B. F, Rattan S. I. 1997. Demonstration of cellular aging and senescence in serially passaged long-term cultures of human trabecular osteoblasts. Osteoporosis Int. 7: 514-524.

85. Keilhoff G., Goihl A., Langndse K., Fansa H„ Wolf G. 2006. Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into Schwann cell-like myelinating cells. Eur. J. Cell Biol. 85(1): 11-24.

86. Kern S., Eichler H., Stoeve J., Kluter H., Bieback K. 2006. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24(5): 1294— 2301.

87. Kershaw E. E., Flier J. S. 2004. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89(6): 2548-2556.

88. Kim I., Saunders T. L., Morrison S. J. 2007. Soxl7 dependence distinguishes the transcriptional regulation of fetal from adult hematopoietic stem cells. Cell. 130: 470^183.

89. Klees R. F., Salasznyk R. M., Kings ley K., Williams W. A., Boskey A., Plopper G. E. 2005. Laminin-5 induces osteogenic gene expression in human mesenchymal stem cells through an ERK-dependent pathway. Mol. Biol. Cell. 16(2): 881-890.

90. Kobayashi H., Gao Y., Ueta C., Yamaguchi A., Komori T. 2000. Multilineage differentiation of Cbfal-deficient calvarial cells in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 273: 630-636.

91. Kobayashi T., Kronenberg H. 2005. Minireview: transcriptional regulation in development of bone. Endocrinology. 146: 10121017.

92. Koerner J., Nesic D., Romero J. D., Brehm W., Mainil-Varlet P., Grogan S. P. 2006. Equine peripheral blood-derived progenitors in comparison to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24: 1613-1619.

93. Komori T. 2002. Runx2, a multifunctional transcription factor in skeletal development. J. Cell. Biochem. 87: 1-8.

94. Komori T. 2003. Requisite roles of Runx2 and Cbfb in skeletal development. Bone Miner. Metabolism. 21: 193-197.

95. Komori T. 2005. Regulation of skeletal development by the Runx family of transcription factors. J Cell Biochem. 95(3):445-453.

96. Komori T. 2006. Regulation of osteoblast differentiation by transcription factors. J. Cell. Biochem. 99: 1233-1239.

97. Kuznetsov S. A., Krebsbach P. H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M., Benayahu D., Robey P. G. 1997. Single colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J Bone Miner Res. 12: 1335-1347.

98. Kuznetsov S. A., Mankani M. H., Gronthos S., Satomura K., Bianco P., Robey P. G. 2001. Circulating skeletal stem cells. The Journal of Cell Biology. 153: 1133-1140.

99. Lazarus H. M, Haynesworth S. E., Gerson S. L., Caplan A. I. 1997. Human bone marrow-derived mesenchymal (stromal) progenitor cells (MPCs) cannot be recovered from peripheral blood progenitor cell collections. J. Hematother. 6: 447-455.

100. Lee M. H., Kwon T. G., Park H. S., Wozney J. M., Ryoo H. M. 2003. BMP-2-induced Osterix expression is mediated by Dlx5 butis independent of Runx2. Biochem. Biophysical Res. Com. 309: 689-694.

101. Lee R. H„ Kim B., Choi I., Kim H., Choi H.S., Suh K, Bae Y.C., Jung J.S. 2004. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cellular Physiology and Biochemistry. 14: 311-324.

102. Le Blanc K. 2003. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 5: 485^489.

103. Li an J. B., Javed A., Zaidi S. K, Lengner C., Montecino M., van Wijnen A. J., Stein J. L., Stein G. S. 2004. Regulatory controls for osteoblast growth and differentiation: role of Runx/Cbfa/AML factors. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 14: 1—41.

104. Liu L., DiGirolamo C. M., Navarro P. A., Blasco M. A., Keefe D. L. 2004. Telomerase deficiency impairs differentiation of mesenchymal stem cells. Exp Cell Res. 294(1): 1-8.

105. Logan C. Y, Nusse R. 2004. The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20: 781-810.

106. MacDougald O. A., Hwang C. S., Fan H., Lane M. D. 1995. Regulated expression of the obese gene product (leptin) in white adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9034-9037.

107. Masters J. R., Stacey G. N. 2007. Changing medium and passaging cell lines. Nature protocols. 2: 2276-2284.

108. Mandrup S., Lane M. D. 1997. Regulating adipogenesis. J. Biol. Chem. 272: 5367-5370.

109. Meirelles L., Chagastelles P. C., Nardi N. B. 2006. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J. Cell Science. 119: 2204-2213.

110. Meirelles L. S., NardiN. B. 2003. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion and characterization. Brit. J. Haematol. 123: 702-711.

111. Mendes S. C., Robin C., DzierzakE. 2005. Mesenchymal progenitor cells localize within hematopoietic sites throughout ontogeny. Development. 132: 1127-1136.

112. Metcalf D., Moore M. A. S. Haemopoietic cells. Amsterdam, London: North-Holland, 1971, p. 550.

113. Moore K. A., Lemischka I. R. 2006. Stem cells and their niches. Science. 311(5769): 1880-1885.

114. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. 2000. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J. Cell Sci. 113: 1161-1166.

115. Nathan S., Das De S., Thambyah A., Fen C., Goh J., Lee E. H. 2003. Cell-based therapy in the repair of osteochondral defects: a novel use for adipose tissue. Tissue Eng. 9: 733-44.

116. Nakahara H., Bruder S. P., Haynesworth S. E., Holecek J. J, Ba-ber M. A, Goldberg V. M, Caplan A. I. 1990. Bone and cartilageformation in diffusion chambers by subcultured cells derived from the periosteum. Bone. 11: 181-188.

117. Nakashima K., Zhou X., Kunkel G., Zhang Z., Deng J. M., Behringer R. R, Crombrugghe B. 2002. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108: 17-29.

118. Noort W. A., Kruger M., Wilpshaar J., Wiillemze R., Falkenburg J. H. F. 1999. A candidate mesenchymal stem cell from human fetal lung tissue. Blood. 94: 42a (abstact).

119. Nuttall M. E., Gimble J. M. 2000. Is there a therapeutic opportunity to either prevent or treat osteopenic disorders by inhibiting marrow adipogenesis? Bone. 27(2): 177-184.

120. Owen M. 1988. Marrow stromal stem cells. J. Cell Sci Suppl. 10: 63-76.

121. Owen M., Friedenstein A.J. 1988. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp. 136: 42-60.

122. Panepucci R. A., Siufi J. L., Silva W. A. Jr., Proto-Siquiera R., Neder L., Orellana M., Rocha V., Covas D. T., Zago M. A. 2004. Comparison of gene expression of umbilical cord vein and bone marrow-derived MSC. Stem Cells. 22: 1263-1278.

123. Pantoja C., Huff J. T., Yamamoto K. R. 2008. Glucocorticoid signaling defines a novel commitment state during adipogenesis in vitro. Mol Biol Cell. In print.

124. Petersen B. E., Bowen W. C., Patrene K. D., Mars W. M., Sullivan A. K., Murase N., Boggs S. S., Greenberger J. S., GoffJ. P. 1999. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science. 284: 1168-1170.

125. Phinney D. G., Kopen G., Righter W., Webster S., Tremain N., Prockop D. J. 1999. Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells. J. Cell Bio-chem. 75: 424^136.

126. Phinney D. G, Isakova I. 2005. Plasticity and therapeutic potential of mesenchymal stem cells in the nervous system. Curr Pharm Design. 11: 1255-1265.

127. Phinney D. G. 2007. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations. Cell Cycle. 6: 2884-2889.

128. Phinney D. G., Prockop D. J. 2007. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair current views. Stem Cells. 25: 2896-2902.

129. Pittenger M. F., Mackay A. M., Beck S. C., Jaiswal R. K., Douglas R., Mosca J. D., Moorman M. A., Simonetti D. W., Craig S., Marshak D.R. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284: 143-147.

130. Pittenger M. F., Marshak D. R. Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow. In: Stem cell biology. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, pp. 349-373.

131. Pittenger M. F. 2008. Mesenchymal stem cells from adult bone marrow. Methods Mol Biol. 449: 27^14.

132. Prockop D.J., Sekiya /., Colter D.C. 2001. Isolation and characterization of rapidly self renewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells. Cytotherapy. 3: 393-396.

133. Quirici N., Soligo D., Bossolasco P., Servida F., Lumini C., Delil-iers G. L. 2002. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies. Exp Hema-tol. 30:783-791.

134. Rasmusson I., Ringden O., Sundberg B., Le Blanc K. 2005. Mesenchymal stem cells inhibit lymphocyte proliferation by mitogensand alloantigens by different mechanisms. Exp Cell Res. 305: 3341.

135. RichardD. J., Kassem M., Hefferan T. E., Sarkar G., Spelsberg T. C., Riggs B. L. 1996. Isolation and characterization of osteoblast precursor cells from human bone marrow. J Bone Miner Res. 11 : 312-324.

136. Robledo R.F., Rajan L., Li X., Lufkin T. 2002. The Dlx5 and Dlx6 homeobox genes are essential for craniofacial, axial and appendicular skeletal development. Genes Dev. 16: 1089-1101.

137. Rochefort G. Y., Delorme B., Lopez A., Hérault O., Bonnet P., Charbord P., Eder V., Domenech J. 2006. Multipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by hypoxia. Stem Cells. 24(10): 2202-2208.

138. Rodda S. J., McMahon A. P. 2006. Distinct roles for Hedgehog and canonical Wnt signaling in specification, differentiation and maintenance of osteoblast progenitors. Development. 133: 32313244.

139. Rosen, E. D., Walkey C. J., Puigserver P., Spiegelman B. M. 2000. Transcriptional regulation of adipogenesis. Genes Dev. 14: 1293-1307.

140. Rosen E. D., Hsu C. H., Wang X., Sakai S., Freeman M. W., Gonzalez F. J., Spiegelman B. M. 2002. C/EBPalpha induces adipogenesis through PPARgamma: a unified pathway. Genes Dev. 16(1): 22-26.

141. Ross M. H., Kaye G. I., Pawlina W. Adipose tissue. In: Histology / Ed. Scogna K. H. - Philadelphia et al.: Lippincott Williams & Wilkins, 2003, p. 156-162.

142. Ross S. E., Hemati N., Longo K. A., Bennett C. N., Lucas P. C., Erickson R. L., MacDougald O. A. 2000. Inhibition of adipogene-sis by Wnt signaling. Science. 289(5481): 950-953.

143. Salasznyk R. M., Williams W. A., Bos key A., Bat or sky A., Plopper G. E. 2004. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J. Biomed. Biotechnol. 2004(1): 24-34.

144. Satomura K., Krebsbach P., Bianco P., Gehron , Robey P. 2000. Osteogenic imprinting upstream of marrow stromal cell diffrentia-tion. J. Cell Biochem. 78: 391^103.

145. Schmidt A., Ladage D., Steingen C., Brixius K., Schinkothe T., Klinz F.J., Schwinger R.H., Mehlhorn U., Bloch W. 2006. Mesenchymal stem cells transmigrate over the endothelial barrier. European Journal of Cellular Biology. 85: 1179-1188.

146. Schofield R. 1978. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells. 4: 7-25.

147. Sharpless N. E, DePinho R. A. 2007. How stem cells age and why this makes us grow old. Nat Rev Mol Cell Biol. 8: 703-713.

148. Silva W. A. Jr., Covas D. T., Panepucci R. A., Proto-Siqueira R., Siufi J. L., Zanette D. L., Santos A. R., Zago M. A. 2003. The profile of gene expression of human marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells. 21: 661-669.

149. Spiegelman B. M. 1998. PPAR-y: adipogenic regulator and thia-zolidinedione receptor. Diabetes. 47: 507-514.

150. Sodek J., Ganss B., McKee M. D. 2000. Osteopontin. Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 11: 279-303.

151. Spees J. L., Gregory C. A., Singh H., Tucker H. A., Piester A., Lynch P. J., Smith J., Prockop D. J. 2004. Internalized antigens must be removed to prepare hypo-immunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molec. Ther. 9: 747- 756.

152. Stein G. S., Lian J. B. 1993. Molecular mechanisms mediating proliferation/differentiation interrelationships during progressive development of the osteoblast phenotype. Endocrine Reviews. 14: 424-442.

153. Stenderup K., Justesen J., Clausen C., Kassem M. 2003. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerate senescence of bone marrow stromal cells. Bone. 33: 919-926.

154. Stevens A., Lowe J. S. Musculoskeletal system. In: Histology. -St. Louis et al.: Mosby, 1993, pp. 226-248.

155. Tang Q. Q., Otto T. C., Lane M. D. 2003. Mitotic clonal expansion: a synchronous process required for adipogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 100(1): 44^19.

156. Tavassoli M. 1974. Differential response of bone marrow and ex-tramelullary adipose cells to starvation. Experientia. 30: 424^25.

157. Tavassoli M. 1978. Cytochemistry of marrow and extramedullar adipocytes in monolayer cultures. Scand. J. Haematol. 20(4): 330-334.

158. Terada N., Hamazaki T., Oka M., Hoki M., Mastalerz D. M, Na-kano Y, Meyer E. M., Morel L., Petersen B. E„ Scott E. W. 2002. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion-. Nature. 416(6880): 542-545.

159. Tontonoz P., Hu E., Spiegelman B. M. 1995. Regulation of adipocyte gene expression and differentiation by peroxisome proliferator activated receptor gamma. Curr Opin Genet Dev. 5(5): 571— 576.

160. Tropel P., Noel D., Platet N., Legrand P., Benabid A. L., Berger F. 2004. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow. Exp. Cell. Res. 295: 395-406.

161. Van Den Heuvel R., Versele S., Schoeters G., Vanderborght O. 1987. Stromal stem cells (CFU-f) in yolk sac, liver, spleen and bone marrow of pre- and postnatal mice. Br. J. Haematology. 66: 15-20.

162. Wagner W., Ho A. D. 2007. Mesenchymal stem cell preparations comparing apples and oranges. Stem Cell Rev. 3: 239-248.

163. Walczak R., Tontonoz P. 2002. PPARadigms and PPARadoxes: expanding roles for PPARg in the control of lipid metabolism. 43: 177-186.

164. Wang I. N„ Lu H. H. 2006. Role of cell-cell interactions on the regeneration of soft tissue-to-bone interface. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 1: 783-786.

165. Wang H. S„ Hang S. C., Peng S. T., Huang C. C., Wei H. M., Guo Y. J., FuY. S., Lai M. C., Chen C.C. 2004. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord. Stem Cells. 22: 1330-1337.

166. Wexler S. A. Donaldson C., Denning-Kendall P., Rice C., Brand-ley B., Hows J. M. 2003. Adult bone marrow is a rich source ofhuman mesenchymal "stem" cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br. J. Haemotol. 121: 368-374.

167. WolfN. S., Bertoncello I., Jiang D„ Priestley G. 1995. Developmental hematopoiesis from prenatal to young-adult life in the mouse model. Exp. Hematol. 23: 142-146.

168. Woodbury D„ Schwarz E. J., Prockop D. J., Black 1. B. 2000. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J. Neurosci. Res. 61: 364-370.

169. Wright W. E, Shay J. W. 2002. Historical claims and current interpretations of replicative aging. Nat Biotechnol. 20: 682-688.

170. Zamurovic N., Cappellen D., Rohner D., Susa M. 2004. Coordinated activation of Notch, Wnt, and Transforming growth factor-p Signaling Pathways in Bone Morphogenic Protein 2-induced osteogenesis. J. Biol. Chem. 279: 37704-37715.

171. Zhang H., Miao Z, He Z., Yang V., Wang Y., Feng M. 2005. The existence of epithelial-to-mesenchymal cells with the ability to support hematopoiesis in human fetal liver. Cell. Biol. Int. 29: 213-219.

172. Zimmermann S., Voss M., Kaiser S., Kapp U., Waller C. F., Martens U. M. 2003. Lack of telomerase activity in human mesenchymal stem cells. Leukemia. 17: 1146-1149.

173. Zuk P. A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J. W., Katz A. J., Benhaim P., Lorenz H. P., HedrickM. H. 2001. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7: 211-228.

174. Zuk P. A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D. A., Huang J. I., Mizuno H., Alfonso Z. C., Fraser J. K, Benhaim P., Hedrick, M. H. 2002. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13: 4279^1295.

175. Yamaguchi A., Komori T., Suda T. 2000. Regulation of osteoblast differentiation mediated by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and Cbfal. Endocr Rev. 21(4):393-411.

176. Ye Z. Q., Burkholder J. K., Qiu P., Schultz J. C., Shahidi N. T., Yang, N. S. 1994. Establishment of an adherent cell feeder layer from human umbilical cord blood for support of long-term hematopoietic progenitor cell growth. PNAS. 91: 12140-12144.

177. Yin T., Li L. 2006. The stem cell niches in bone. J. Clin. Invest. 116(5): 1195-1201.

178. Ying Q. L., Nichols J., Evans E. P., Smith A. G. 2002. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416(6880): 545-548.

Информация о работе

Кожевникова, Мария Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Молекулярно-генетическая и иммунофенотипическая характеристика мезенхимных стромальных клеток из миелоидных органов крыс в онтогенезе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы