Молекулярная визуализация физико-химических процессов в живых системах при помощи биосовместимых зондов: новые подходы

Богданов, Алексей Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная визуализация физико-химических процессов в живых системах при помощи биосовместимых зондов: новые подходы
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная визуализация физико-химических процессов в живых системах при помощи биосовместимых зондов: новые подходы"

На правах рукописи

Богданов Алексей Алексеевич

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ ПРИ ПОМОЩИ БИОСОВМЕСТИМЫХ ЗОНДОВ: НОВЫЕ

ПОДХОДЫ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

ии^480235

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

МОСКВА 2009

003480235

Работа выполнена в Центре Молекулярного Имаджинга Главного Госпиталя Штата Массачузеттс (г. Бостон) и Медицинском отделении Массачузетгского Университета (г. Вустер).

Официальные оппоненты:

Академик РАН и РАМН, докт. биол. наук, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич Чл.-корр. РАН, докт. физ.-мат. наук Гурский Георгий Валерьянович Докт. хим. наук, профессор Польшаков Владимир Иванович

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится «29» октября 2009 г. в 15.30 ч. на заседании Диссертационного совета Д.501.001.96 по биологическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 13, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, аудитория "Новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «_» _2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Кренделева Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микроскопическое исследование морфологии образцов тканей традиционно является одним из главнейших методических подходов в экспериментальной биологии уже на протяжении нескольких столетий. Тем не менее, потребности развития современной биологии диктуют необходимость проведения исследований биохимических процессов в интактных (живых) системах. Внедрение неинвазивных методов диагностики в экспериментальную биологию представляет собой одну из наиболее активно развивающихся областей биомедицины. Применение методов неинвазивной диагностики в биологических исследованиях позволяет: 1) получать и анализировать информацию, отражающую изменение физиологических и молекулярных параметров во времени в живом организме с высоким пространственным разрешением, т.е. вплоть до уровня визуализации отдельных клеток (шкала разрешения от 50 мкм до 2 мм); 2) одновременно регистрировать различные классы изображений, анатомически точно картирующие живые ткани и отражающие функциональный статус органов; 3) более эффективно внедрять достижения фундаментальной физико-химической биологии непосредственно в клинические испытания. В последнее время широкую известность получила неинвазивная диагностика на молекулярном уровне (т.н. «molecular imaging»), основанная либо на использовании сигнала молекулярных зондов, введенных искусственно, либо на интерпретации сигнала, вызванного присутствием эндогенных молекул живой системы. Молекулярная неинвазивная диагностика в живых системах развивается на стыке многих наук, включающих, прежде всего, медицинскую физику, биофизику, синтетическую органическую химию и молекулярную биологию. В последние годы на практике было показано, что одним из необходимых условий для успешного проведения неинвазивной диагностики на молекулярном уровне является применение молекулярных зондов (т.н. «репортеров»), которые обладают способностью генерировать специфические сигналы, отражающие наличие компонентов микроокружения зонда в живом организме. Эти сигналы регистрируются при помощи современных диагностических методов (магнитно-резонансная томография (МРТ), гамма сцинтиграфия, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), оптическая визуализация флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне). Для применения подобных зондов в живых системах необходимым условием является наличие биосовместимости, специфичности и низкой эффективной (граничной) концентрации зонда в живой ткани организма. В 90-х и начале 2000-х годов нами были разработаны несколько классов подобных биосовместимых зондов для визуализации биологически важных процессов в живых интактных системах. Наиболее широкое практическое использование и научное признание получили биосовместимые зонды для визуализации: 1) лизосомной и экстраклеточной ферментативной активности катепсинов;-

2) визуализации ангиогенеза и аномальной проницаемости стенки сосудов; 3) оксидоредуктазной (в том числе, пероксидазной) активности. Эти три класса зондов объединяет способность усиливать специфические сигналы, которые регистрируются приборами, разработанными для диагностической визуализации в живых системах. Их активность в первом случае основана на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (как излучательного, так и темного), а во втором и третьем случаях - на эффекте увеличения молярной релаксивности парамагнитных катионов (т.е. изменения способности укорачивать времена релаксации протонов воды). Это происходит за счет положительных изменений корреляционных времен в парамагнитных зондах, достигнутых либо с применением методов химической иммобилизации, либо в результате ферментативной реакции. Все три класса диагностических зондов в настоящее время успешно используются для решения нескольких фундаментальных и прикладных задач в ряде лабораторий, в том числе, в качестве коммерчески доступных макромолекулярных оптических зондов для преклинических исследований (Visen Medical, Inc.), MPT препаратов для преклинического тестирования экспериментальных лекарственных средств (Novartis Research Inst., Sanofi) или в качестве носителя для доставки биологически активных пептидов и рекомбинантных белков (Pharmaln Corp).

Целью работы явилось развитие методических подходов к визуализации специфической ферментативной активности и активации факторов транскрипции в живых системах. В качестве основных направлений работы были выбраны прикладные исследования, целью которых являлось изучение ответа живого организма на стимуляцию воспалительного каскада, в частности, модельное исследование визуализации оксидоредуктазной активности при развитии нестабильной атеромы и рака, а также активации стромы и ангиогенеза в раковых опухолях.

Задачи исследования. Для достижения целей работы были поставлены и поэтапно решены следующие задачи:

1) Разработка и синтез макромолекулярного наноносителя (PGC) для диагностических меток (НМН).

2) Изучение поведения парамагнитного аналога PGC в кровотоке нормальных животных и в экспериментальных моделях рака, ишемии головного мозга и инсульта с помощью МРТ.

3) Создание зонда для оптической визуализации протеолиза в живых системах на основе PGC.

4) Изучение и идентификация источников протеолитической активности в раковых опухолях путем флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближнем

инфракрасном диапазоне длин волн.

5) Разработка, синтез и изучение свойств парамагнитных субстратов оксидоредуктаз (пероксидаз растений и миелопероксидазы), а также тирозиназ и лакказ.

6) Разработка метода визуализации активности миелопероксидазы в модельных системах в качестве маркера нестабильной атеромы.

Научная новизна и практическая значимость. В 1992 году нами был впервые разработан и запатентован макромолекулярный синтетический парамагнитный нанозонд (Protected Graft Copolymer, PGC), с характерной длительной циркуляцией в кровотоке и относительно узким молекулярно-массовым распределением. Этот зонд был использован для визуализации обьема крови в моделях рака и тромбоза легочных артерий, а также для одновременного определения объема и скорости кровотока в головном мозге в норме и патологии при индуцированном ишемическом инсульте. Использование PGC в сочетании с МРТ показало, что этот нанозонд позволяет определить эффективность антиангиогенных терапевтических средств на ранних стадиях испытаний на экспериментальных животных. Высокоэффективное мечение PGC радиоизотопом 99шТс дало возможность провести предварительные клинические испытания (Фаза 1А) этого зонда в качестве макромолекулярного радиоизотопного маркера для вентрикулографии, а также позволило исследовать некоторые особенности метаболизма PGC в организме человека.

Важной особенностью подобных контрастирующих веществ (зондов) является сильное изменение свойств диагностических меток в ковалентно связанной форме. В то время как релаксивность парамагнитных хелатов Gd(III) (т.е. способность катионов гадолиния к сокращению времени релаксации координированных протонов воды), связанных с PGC, возрастает в несколько раз, интенсивность флуоресценции ковалентно связанных молекул инфракрасных флуорохромов резко уменьшается. Использование этого явления в исследованиях на животных впервые позволило использовать возрастание интенсивности флуоресценции в ткани в результате деградации PGC лизосомными катепсинами для полуколичественной оценки протеолитической активности в раковых опухолях. Дальнейшие исследования на моделях рака позволило идентифицировать фракции клеток опухолей с наиболее выраженной протеолитической активностью, присутствие которых связано с повышенной инвазивностью аденокарцином.

В начале 2000-х годов нам впервые удалось показать, что каталитическую активность пероксидаз в живой ткани можно обнаруживать с помощью МРТ, при условии, если в качестве восстанавливающего субстрата были использованы парамагнитные моно- и бис-фенэтиламидные или оксииндолэтиламидные производные хелатов парамагнитного Gd(III) в качестве пероксидазо- чувствительных контрастирующих зондов. Данные производные

восстанавливают окисленные формы пероксидаз с высокой эффективностью, и в результате ферментативного окисления вступают в реакции гомоолигомеризации, а также ковалентной модификации белков, и, тем самым, повышают релаксивность хелатированного гадолиния. Релаксометрические измерения показали, что МРТ сигнал возрастает преимущественно за счет удлинения корреляционного времени реориентации спинов протонов воды (тр), взаимодействующих с локальным электромагнитным полем парамагнитного катиона. Данные контрастирующие зонды были использованы для визуализации трех классов оксидоредуктаз: 1) миелопероксидаз (т.е. эндогенных высокомолекулярных белков первичных секреторных гранул гранулоцитов); 2) пероксидаз растений, используемых в качестве меток для ферментативного обнаружения антител, связанных с антигенами в системах in vitro, а также in vivo; 3) тирозиназ; 4) лакказ. Миелопероксидаза (МПО) секретируется преимущественно нейтрофилами, при трансмиграции через стенку сосудов в ответ на локальную активацию эндотелиальных клеток. Активация происходит в результате воздействия различных эндогенных и экзогенных факторов, с высокой вероятностью приводящим к развитию ишемической болезни. Обнаружение миелопероксидаз в живой ткани организма при помощи неинвазивной диагностики позволяет проводить прямое обнаружение очагов воспаления в стенке кровеносных. сосудов, что важно для проведения оценки нестабильности атеросклеротической бляшки. Подобная оценка нестабильности при помощи МРТ была проведена нами в живых моделях спонтанного атеросклероза и экспериментального аневризма сонных артерий. Детекция миелопероксидазной активности, проведенной на основе анализа результатов томографической визуализации ферментативной активности, в отличие от определения концентрации МПО в плазме крови, позволит различать стабильные и нестабильные атеросклеротические бляшки и определять степень риска острых сердечнососудистых заболеваний. Подобная же практическая направленность наших исследований на живой модели, полученной искусственно с применением катетеризации и частичной окклюзии сонной артерии кролика, позволила произвести оценку специфичности визуализации воспаления в области расширения стенки экспериментальной аневризмы. Как и в случае атеросклеротического поражения стенок сердечно-сосудистой системы, развитие нестабильности аневризм артерий головного мозга зависит от интенсивности местных воспалительных процессов. Предсказание нестабильности аневризмы на основании МРТ визуализации с применением парамагнитных субстратов миелопероксидазы важно потому, что субарахноидальное кровоизлияние из разорвавшейся аневризмы приводит к геморрагическому инсульту с летальным исходом у 55-60% пациентов.

Обнаружение ферментативной активности иммуноконъюгатов в живых системах при помощи МРТ было впервые предложено и исследовано нами в 2001 году с применением

модельных систем с целью визуализации клеток, экспрессирующих маркеры клеточной поверхности, типичные для онкологической трансформации. Активность данных рецепторов (например, EGFR, т.е. рецептора эпидермального фактора роста) можно ингибировать антителами, которые препятствуют димеризации рецепторов и, как следствие, ингибируют рецептор-опосредованную передачу сигнала. Мы показали, что блокирующие химерные антитела, используемые в клинических испытаниях в качестве антипролиферативного средства при раке головы и шеи, можно ковалентно связывать с пероксидазами для визуализации рецепторположительных опухолей. Эксперименты, проведенные с помощью МРТ в живых моделях плоскоклеточной карциномы и глиомы человека у атимусных мышей и крыс, соответственно, показали, что после двухстадийного последовательного внутривенного введения конъюгатов антител и субстрата происходит не только общее возрастание МРТ сигнала (по сравнению с контрольным введением субстрата без конъюгатов), но и замедление скорости выведения парамагнитного МРТ контраста, связанное с образованием олигомеров и хелат-белковых конъюгатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный макромолекулярный носитель (PGC) является нанобиотехнологической системой, предназначенной для синтеза зондов-носителей диагностических меток, используемых для проведения исследований в живых системах с применением МРТ, радиоизотопных и флуоресцентных методов.

2. Связывание парамагнитных катионов PGC приводит к 2-3 кратному увеличению молярной спин-спиновой и спин-решеточной релаксации. Визуализация и биораспределение парамагнитного зонда на основе PGC в кровотоке нормальных животных свидетельствует о длительном времени полужизни при отсутствии детектируемой токсичности и иммунногенности.

3. PGC применим для визуализации и слежения за изменениями перфузируемого объема крови, отражающими особенности кровоснабжения раковой опухоли и ответ иа антиангиогенную терапию.

4. Ковалентное связывание карбоцианиновых красителей с PGC приводит к самотушению флуоресценции, позволяя разрабатывать зонды для визуализации источников протеолитической активности в раковых опухолях с применением флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближне-инфракрасном диапазоне длин волн.

5. Низкомолекулярные конъюгаты парамагнитных хелатов и соединений, содержащих монофенольные или триптаминовые остатки, являются эффективными субстратами-восстановителями пероксидаз, катализирующих образование продуктов с высокой

релаксивностью парамагнитного Gd(III). Визуализация рецепторов на поверхности клеток может быть достигнута с применением МРТ, пероксидазной амплификации и парамагнитных зондов пероксидазной активности. 6. Зонды пероксидазной активности позволяют производить визуализацию локальных очагов тканевой миелопероксидазы в модельных системах. Визуализация миелопероксидазной активности при помощи разработанных зондов позволяет определять наличие нестабильности в атероме и аневризме сосудистой стенки.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на открытом семинаре Радиологического факультета Университета штата Массачузеттс (февраль 2009 г.). Основные результаты работы были доложены на следующих международных конференциях:

Международном симпозиуме «Современные методы спектроскопии в исследовании структуры и функции биополимеров в биологии и медицине» (Май 2007, Дубна); Международного общества магнитного резонанса в медицине ISMRM: (Берлин, 1992 г.; Нью-Йорк, 1993 г.; Сан Франциско, 1994 г.; Сидней 1998 г.; Гонолулу, 2003 г.; Киото, 2004 г.; Сиаттл, 2006 г.; Берлин, 2007 г.);

Североамериканского радиологического общества RSNA (Чикаго 1992 г., 1997 г., 2003

г.);

Американской ассоциации по изучению рака AACR (Сан Франциско 2002 г.; Вашингтон, 2003 г., 2005 г.; JIoc Анджелес 2005 г., Денвер 2009 г.); Общества ядерной медицины SNM (Торонто, 2001 г.); Американского химического общества ACS (Филадельфия, 2004 г.); Academy of Molecular Imaging AMI (Орландо 2002 г., Сан Диего, 2003 г.; 2004 г. (1-е место в категории научных докладов);

The Society of Molecular Imaging SMI (Бостон, 2002 г.; Сан Франциско, 2003 г.; Сант Луис, 2004 г.; Кельн, 2005 г.; Провиденс, 2007 г.; Ницца, 2008 г.);

Гордоновской конференции по доставке лекарств (Блу Скай, Монтана 2004 г.); Международных конференциях по наномедицине и доставке лекарств (Балтимор, 2005 г.; Торонто, 2008 г.);

The Controlled Release Society CRS (Ницца, 1994 г.; Палм Бич, 2007 г.) На Нобелевском Форуме (Стокгольм, 2007 г.).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных исследований и обработки полученных результатов, а также в проведении теоретических исследований.

Основные результаты получены либо лично автором, либо под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации

Результаты исследования опубликованы в 102 работах, включающих статьи, монографии, тезисы конференций и патенты. Диссертация обобщает данные 44 основных статей.

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 28 2. страницах, содержит h 2. рисунка и 8 таблиц. Список литературы включает ЗГО источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА I. ПРИНЦИПЫ НЕИНВАЗИВНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ В

ЖИВЫХ СИСТЕМАХ

Глава посвящена анализу литературных данных. При анализе использованы обзорные статьи и монографии из различных областей применения комбинированных методов неинвазивной визуализации и направленной доставки диагностических контрастирующих веществ (KB). В обзоре подробно освещены принципы и основы фермент чувствительной диагностики в живых системах.

ГЛАВА II. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАБОТЫ II.A МЕТОД МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИИ И КОНТРАСТИРУЮЩИЕ ЗОНДЫ

Метод магнитно-резонансной томографии (МРТ) основан на эффекте "пространственной кодировки", позволяющей наблюдать эффект ядерного магнитного резонанса (ЯМР) только в определяемом исследователем пространственном фрагменте, часто называемым "срезом" объекта. Возможность достижения томографического эффекта при помощи ЯМР была впервые продемонстрирована П. Латербуром в 1973 г. Впоследствии метод МРТ был кардинально модифицирован с применением градиента внешнего магнитного поля, что позволяет достичь определенной резонансной частоты возбуждения ядерного спина строго в определяемым исследователем срезе трехмерного пространства. На этом принципе основаны современные МРТ методы. МРТ позволяет управлять процессами релаксации макроскопической магнетизации (М) в данной единице объема исследуемого объекта. Радиочастотный импульс, отклоняет вектор М от положения равновесия, т.е. от ориентации по внешнему полю Во. После отключения импульса М продолжает вращение около Во с угловой скоростью, соответствующей частоте Лармора (Рис. 1А). Благодаря процессам

релаксации вектор М возвращается в положение равновесия. Механизм возвращения Мг компонента М в положение равновесия называется спин-решеточной или Т1-релаксацией, а уменьшение Мху составляющей до нуля называется Т2- или спин-спиновой релаксацией. Т1-релаксация (т.е. переход на более низкий энергетический уровень ядра) стимулируется любым флуктуирующим магнитным полем с частотой Лармора, т.е. угловой скоростью, необходимой для достижения энергетического перехода. Флуктуирующее магнитное поле, которое создается в результате броуновского движения молекул, вызывает также случайные изменения угловой частоты спинов и «флип-флоп» переходы, которые вызывают потерю фазовой когерентности у вращающихся ядерных спинов. В результате фазовая дисперсия увеличивается и Мху составляющая уменьшается, чему способствуют негомогенности магнитного поля (Т2-эффекты).

Рис. 1. Релаксация магнетизации и контрастирующие вещества. А- во время возбуждающего радиочастотного импульса (поле В1) вектор магнетизации М отклоняется на флип угол pi и прецессирует относительно Во с угловой скоростью col (соответсвующей частоте Лармора). Проекция М на ось z' (в Декартовой системе координат х'у V) со временем возрастает (Т1 релаксация), а проекция М в плоскости х'у' уменьшается до нуля (Т2 релаксация) Б-Схема, иллюстрирующая процессы релаксации протонов молекул воды во внутренней (ВКО) и во внешней координационных оболочках хелатированного Gd(III). тм -время жизни молекулы воды во ВКО. tr - ротационное корреляционное время.

Главной целью использования KB в МРТ является ускорение процессов релаксации спинов протонов воды в окружающей ткани, т.е. укорачивание спин-решеточного Т1 и спин-спинового Т2 времен релаксации. Первое парамагнитное KB, т.е. раствор соли Мп(П), было использовано для достижения контраста в МРТ в работах Латербура в конце 1970-х годов. В настоящее время в качестве KB получили широкое применение соли гадолиния Gd(III), так как катион Gd(III) имеет 7 неспаренных f-электронов, и симметричное S-состояние, что определяет, с одной стороны, большой магнитный момент, а с другой - медленную

релаксацию электронов, что необходимо с точки зрения эффективности парамагнитного КВ. Общая теория релаксации в разбавленных растворах парамагнитных веществ была разработана Блюмбергеном, Соломоном и Морганом в 1950-х годах. Согласно этой теории, частота релаксации (релаксивность К<1д=1/Т(112), т.е. величина обратная времени релаксации) в присутствии катиона Ос1(Ш) 1/Т(1,2) =1/Тс1(1,2) +1 /Тр{1,2)= 1 /Тс1( 1,2>+ Г( 1[Ос1], где 1/Т<1(1,2> диамагнитный терм, описывающий релаксацию в отсутствие КВ; а г - т.н. молярная релаксивность, являющаяся коэффициентом пропорциональности между релаксивностью и [0(1]- концентрацией парамагнитного катиона. Обычно под релаксивностью понимают протонную релаксивность. Парамагнитная релаксация протонов воды происходит из-за диполь-дипольных взаимодействий между ядерными спинами и флуктуирующим локальным магнитным полем КВ, которое создается благодаря наличию спина у неспаренных электронов. Для того, чтобы парамагнитный эффект релаксации влиял на большое число протонов молекул, они должны находиться в непосредственной сфере воздействия поля КВ, так как это поле быстро уменьшается при удалении от парамагнитного атома. Для комплексов парамагнитных металлов подобным специфическим взаимодействием является координационное связывание молекул воды с КВ, т.е. взаимодействие во внутрнней координационной оболочке (Рис.1). Кроме внутреннеоболочечного эффекта существует также внешнеоболочечный, который зависит от стохастической поступательной диффузии протонов вблизи КВ. Кроме того, молекулы воды образуют водородные связи с хелатирующим веществом. Эти молекулы воды во вторичной координационной оболочке вносят вклад во внешнеоболочечный эффект. Таким образом, суммарная релаксивность протонов воды в упрощенном виде равна сумме релаксивностей, где Я= Лк+ К05 , К внутренняя оболочка, а ОБ внешняя оболочка. Величина обратная времени спин-решеточной релаксации во внутренней координационной оболочке (т.е. релаксивность) записывается в виде: 1/Т1=(([Ос1]'я)/55.5)(Т1т+тш)"1, где q число молекул воды связанных с вс! (число гидратации), Т1т время релаксации связанной воды и тт время жизни молекулы воды во внутренней координационной оболочке.

Релаксация связанных с хелатированным парамагнитным катионом протонов воды (Т1т) описывается с применением двух формальных механизмов: 1) диполь-дипольного, т.е. описывающего релаксацию под влиянием: а) реориентации вектора взаимодействия ядерного спина и электронного спина, б) изменениями в ориентации электронного спина и в) кинетикой обмена протонов; 2) скалярного, который не зависит от взаимной реориентации молекул, а зависит только от электронной релаксации и скорости обмена протонов воды. Таким образом, 1/Т1т = 1/Т°° + 1/Т5С . В общем случае оба компонента можно записать в виде функций общего вида: 1/Т°в =кТ О/Лмн, тс2, тС1, со23, в>\), 1/Т5С = кТ (оЛ, тй), т.е. диполь-

дипольный компонент релакснвности обратно пропорциональны шестой степени расстояния между электронным спином катиона металла и протонным спином (гсин) и сложным образом зависят от времен корреляции и ядерной и электронной частоты Лармора. Время корреляции записывается в виде: 1/тс=1/тк+1/Те+1/тга, где ротационное (спиново-вращательное) корреляционное время, т.е. время реорентации вектора металл-протон, Те - время релаксации спина электронов иона металла. Поскольку Ос1(Ш) образует ионные связи, а протоны удерживаются координационными связями на большом расстоянии от парамагнитного центра, скалярное спаривание спинов вносит крайне малый вклад в суммарную релаксацию, и, поэтому, релаксация протонов воды под влиянием парамагнитных катионов лантанидов протекает преимущественно по диполь-дипольному механизму.

Релаксация протонов в присутствии хелатированных парамагнитных катионов подвержена воздействию целого комплекса факторов. Если хелатирующее вещество препятствует образованию координационных связей между водой и катионом во внутренней оболочке, число гидратации катиона q<l, а релаксивность хелатированного катиона значительно меньше, чем релаксивность гидратированного катиона. Наиболее часто используемые на практике хелаты вс1(Ш) и Мп(П) допускают образование координационной связи с q=l. Если выполняется соотношение Т1„,«тт, то скорость обмена координированных с КВ молекул воды является единственным определяющим фактором релаксивности. Если же обратное соотношение верно, т.е. тш«Т1т, наблюдаемая релаксивность определяется исключительно скоростью релаксации координированных протонов, т.е. параметром 1/Т1га, который, в свою очередь, зависит от скорости обмена протонов воды, спиново-вращательной и электронной релаксаций.

Таким образом, анализ зависимости спин-решеточной релаксивности (1/Т1) от параметра Т|т показывает, что при создании новых КВ именно эти два фактора (т.е. скорость обмена протонов координированной воды и вращательная свобода хелатированного парамагнитного иона) оказывают наибольшее влияние на конечную релаксивность и, как следствие, на эффективность КВ в биологических системах. Модуляция релаксивности за счет перехода из свободного в связанное, т.е. иммобилизованное на макромолекуле, состояние парамагнитного КВ было использовано нами при создании полимерного парамагнитного КВ (РОС, см. Гл. НА), а также при разработке фермент чувствительных сенсоров пероксидаз (см. Гл. V).

Н.Б ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ЗОНДОВ ДЛЯ МУЛЬТИКОМПАРТМЕНТНОГО АНАЛИЗА ТКАНИ

Компартментапизация различных КВ в живой ткани в применении к МРТ может быть описана с применением упрощенной модели, в которой сосудистый, интерстициальный и

внутриклеточный компоненты представляют собой отдельные протонные пулы, находящиеся

в состоянии взаимного равновесного обмена протонами воды (Рис.2). Так как клеточные

мембраны интактных клеток во временной шкале МРТ исследования ткани представляют

собой в норме практически непроницаемые барьеры для водорастворимых КВ, данную

модель можно упростить и рассматривать обмен между кровеносным потоком (сосудистым

компонентом) и экстрасосудистым пространством. В условиях, когда изменение магнитной

восприимчивости (Дх) после введения КВ невысоко, например, при напряженности поля 0.5-

ЗТ в клинических МРТ системах, влиянием ДТ2* (связанным с уменьшением спин-спинового

времени релаксации протонов воды под влиянием микрогетерогенности поля) на релаксацию

воды обычно пренебрегают. Вследствие того, что разработанный нами зонд РвС-Сс! (см.Гл.

Гл. ПА) обладает большим гидродинамическим диаметром (5<Г)ь<10 нм), экстравазация РСС-

йс1 протекает крайне медленно. В условиях медленной скорости (низкой частоты) обмена

протонов воды между кровотоком и внешнесосудистым объемом, которая близка к

трансмембранному обмену молекулами воды в эритроцитах, т.е. 1 Гц, абсолютный объем

крови может быть рассчитан как

отношение изменений интенсивности

МРТ сигнала в ткани и в кровотоке

УВАВЗ = Д51т/Л31и. Локальное изменение

МРТ сигнала измеряется как разность

интенсивностей сигнала до и после

введения КВ. В условиях эксперимента

измерение ДБТг производится в ткани, в

то время как ДЭГв определяют в

кровеносном сосуде (вене или артерии), Рис- 2- Упрошенная схема обмена КВ и молекул

воды между компартментами ткани. Модель изображение которого получено на том бьша использована для моделирования и расчетов

же томографическом срезе. Приведенная Фракции объема крови и интерстициалыюго

пространства с использованием двух КВ (РОС-Сс1, выше формула может быть использована удерживаемого в кровотоке, и ДТПК-Ос1,

только при выполнении следующих обменивающегося между двумя компартментами). условий: 1) концентрация КВ должна быть постоянной в течение МРТ исследования (примерно 45 мин), 2) мембраны эритроцитов непроницаемы для КВ, в то время как протоны йоды быстро обмениваются через мембраны эритроцитов, 3) обен молекул воды через эпдотелиальные барьеры происходит медленно, 4) время релаксации зависит от концентрации КВ в плазме крови и произведена корректировка с учетом местных различий в уровне гематокрита. Последнее условие можно считать заведомо выполненным в большинстве случаев. Тем не менее, в случае определения объема крови в опухоли гематокрит крови в

Кровоток

РвС-вс! ДТПК-Бс!

Н20

Интерстициапьное пространство

ДТПК-Сс)

Н20

Внутриклеточное пространство

- -=- Н20

опухоли может сильно отличаться от гематокрита в основном кровотоке. При использовании градиентной системы МРТ пульсов (объемного построения с применением градиентного эха со спойлером, 3DSPGR) измеряемая интенсивность МРТ сигнала равна: SIr=M0*sina*(( 1 -exp(-TR/T 1 Р)/( 1 - exp(-TR/Tl P)*cosa) и 1 / Т1 р=( 1 -X)*( 1 /Т1 рр)+Х* (1 /Т1 rbc),

где 1/Т1рр=(1-Х)*( 1/Т1°рр) + г[КВ]; М0 - протонная плотность, а- флип угол; TR -время повторения МРТ импульса. Tip- спин решеточное время релаксации в крови после введения KB, Т1РР- спин решеточное время релаксации в плазме крови после введения KB, Т1°рр - спин решеточное время релаксации в плазме крови до введения KB, Х- фракция объема крови, занимаемая эритроцитами, г - молярная релаксивность KB, [KB] - молярная концентрация КВ.

Оба параметра, т.е. г и [KB], были определены нами экспериментально с применением плазмаионизационного метода для определения концентрации парамагнитного гадолиния. Величина параметра Т1°рр примерно равна величине времени релаксации TIrbc. Для определения величины Tip вначале нам было необходимо измерить локальный гематокрит в органах, что было достигнуто путем радиоактивного мечения эритроцитов при помощи восстановления пертехнетата ([99тТс]04') в присутствии Sn(II) и определения их биораснределения через 5 мин после внутривенного введения.

II.B САМОТУШЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И КОНТРАСТИРУЮЩИЕ ЗОНДЫ Флуоресценция, как частный случай люминесценции, наблюдается при испускании фотона при возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное энергетическое состояние молекулы. Энергия испускаемого фотона меньше, чем энергия поглощенного молекулой фотона, за счет внутримолекулярных переходов с более высокого уровня вибрационной энергии в основном состоянии молекулы в состояние термодинамического равновесия. Данные переходы вызывают спектральный эффект Стокса, т.е. сдвиг спектрального максимума флуоресценции в длинноволновую область по сравнению со спектральным максимумом возбуждающего света. Как правило, данный сдвиг невелик, и его величина особенно мала в случае многих полиароматических флуорохромов с высокими коэффициентами экстинкции и со спектральными максимумами поглощения при длинах волн возбуждающего света >.>450 нм (т.е. флуоресцеин, родамин, Texas Red, карбоциашшовые красители Су). Многие из данных флуорохромов традиционно используются для ковалентной модификации макромолекул, применяемых в микроскопии (т.е. флуоресцеин, родамин) и обладают способностью к самотушению флуоресценции. В общем случае, тушение флуоресценции в разбавленных растворах может происходить в результате действия одного или нескольких молекулярных механизмов, которые включают

химические реакции в возбужденном состоянии молекул, внутримолекулярные переходы, перенос энергии на другую молекулу, образование комплексов в основном энергетическом состоянии (т.н. статическое тушение) и тушение при столкновении молекул (т.н. динамическое тушение).

При ковалентном связывании с макромолекулами, несущими реакционоспособные группы, с увеличением плотности посадки флуорохромов (Ф) на макромолекуле флуоресценция нелинейным образом зависит от концентрации [Ф], и начинает уменьшаться при достижении определенной локальной концентрации [Ф] на макромолекуле. Данный эффект можно объяснить с точки зрения переноса энергии возбужденного состояния молекулы Ф на другую молекулу Ф (динамическое самотушение по Ферстеру или Декстеру). Вероятность самотушения зависит от расстояния между флуорохромами: W(r)=(l+(r/Ro)6))"1, где Ro-радиус Ферстера соответствующий 50% вероятности переноса W(r) = 0,5. При ковалентном связывании флуорохромов с полипептидами расстояние между отдельными молекулами Ф с высокой вероятностью меньше 4 нм, т.е. в границах Ферстеровского диапазона расстояний, при которых перенос энергии высоковероятен, т.е. в границах 1,5-6 им. Тем не менее, несмотря на то, что теория динамического самотушения Ферстера широко используется при трактовании резонансного переноса энергии, она не всегда подходит для описания эффектов самотушения в макромолекулах, содержащих более двух близко расположенных ковалентно связанных флуорохромов. Если бы расстояние Ферстера действительно однозначно определяло эффективность самотушения, то эффект самотушения наблюдался бы для любой пары Ф, находящейся на расстоянии меньше 6 нм друг от друга. Однако, известен пример коммерчески доступного красителя Alexa Fluor 488, который спектрально практически идентичен флуоресцеину, и, тем не менее, не подвержен самотушению при ковалентном связывании с идентичными иммуноглобулинами (Рис.3).

Alexa Fluor 488

флуоресцеин

350 400 450 500 550 600 650

Длина волн, нм

ä 350 400 450 500 550 600 650

Длина волн, нм

s 0 2 4 6 8 10

[Флуорохром]/[иммуноголбулин],М/М

Рис. 3. Зависимость самотушения флуорохромов от структуры молекулы. Структурно различные и спектрально-идентичные Alexa Fluor 488 (А) и флуоресцеин (Б) образуют конъюгаты с антителами (В), в которых флуорохромы гораздо сильнее подвержены самотушению в случае (Б), чем (А). Данный результат подтверждает вклад статических механизмов в эффект самотушения в ковалентных конъюгатах.

Данный пример доказывает, что т.н. статические эффекты самотушения в случае ковалентных макромолекулярных конъюгатов должны преобладать над динамическими. Образование нефлуоресцирующих комплексов вида ФФ в основном состоянии молекул сопровождается поглощением света и возвращением в основное состояние без испускания фотона. В отличие от динамического тушения, статическое тушение уменьшается, а не увеличивается с ростом температуры, т.к. константа ассоциации флуорохромов Ks=[0 Ф]/Ф<Ф зависит от температуры. Концентрация флуорохрома в растворе в упрощенном случае самотушения димеров: [Ф0] =[Ф]+[Ф Ф], где [Ф]- концентрация флуоресцентных мономеров, а [Ф Ф] концентрация нефлуоресцентных димеров. Зависимость соотношения интенсивностей флуоресценции в отсутствие эффекта самотушения Fo и наблюдаемой величины флуоресценции в присутствие эффекта самотушения F по закону Штерна-Фольмера: Fo/F=l + Ks *[Ф]. В общем случае, самотушение вызывается суммарным эффектом динамического и статического самотушения и Fo/F=l+ К„абл *[Ф], где наблюдаемая К„абЛ=( Kd+ Ks ) + Кр* Ks*[®], где Kd константа тушения Штериа-Фольмера. Данные теоретические соображения распространяются и на флуоресцентные красители с максимумом флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне световых волн. Эти флуорохромы, крайне легко образуют нефлуоресцентные «агрегаты» молекул в крайне близком, т.е. Ферсгеровском расстоянии друг от друга. Агрегацию обычно предотвращают путем специальной модификации с образованием ковалентно связанных сульфогрупп для увеличения суммарной полярности молекул. Тем не менее, благодаря небольшому спектральному сдвигу Стокса и наличию неполярных сопряженных метиловых двойных связей данные флуорохромы легко подвергаются самотушению. Данный факт был использован нами при разработке высокомолекулярных наносенсоров для визуализации протеолитической активности (Гл. II).

ГЛАВА III. МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АГЕНТЫ («НАНО-ЗОНДЫ») ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ III.A ПОЛИМЕРНЫЙ БИОСОВМЕСТИМЫЙ НОСИТЕЛЬ (PGC) ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МЕТОК Постановка задачи. МРТ позволяет достичь высокого пространственного разрешения, приближающегося к одноклеточному (шкала 80-160 мкм); и позволяет получать изображения тканей организма с характерными различиями благодаря высокому уровню контрастирования за счет различий во временах релаксации протонов. Времена релаксации различаются вследствие действия нескольких факторов: 1) концентрации протонов в ткани (спиновой плотности); 2) времен релаксации Т1 и Т2. МРТ позволяет дифференцировать различные компартменты в тканях благодаря различиям во временах протонной релаксации в результате действия следующих факторов: 1) присутствие парамагнитного железа, связанного с

апогемоглобином и трансферрином, и, в меньшей степени, марганца супероксид-дисмутазы эритроцитов, 2) благодаря наличию кровотока, т.е. циркуляции протонов воды в крови, В настоящее время известен ряд подходов, основанных на эффекте изменения протонной релаксации, вызываемых компартментализацией либо эндогенных (дезоксигемоглобин), либо экзогенных контраст генерирующих веществ. В качестве экзогенных KB в данном случае используются либо KB, содержащие нанокристаллический магнетит FejOi, либо парамагнитные хелатированные комплексы Gd(III), введенные в кровоток в виде концентрированного болуса. Данные KB способны индуцировать дальние (микрометровые) локальные возмущения магнитного поля в объеме сосудов и, следовательно, приводить к возрастанию спин-спиновой релаксивности в кровотоке (AR2*). Возрастание релаксивности в этом случае сильно зависит от изменения магнитной восприимчивости (Дх), и наличие данных изменений позволяет определять гемодинамические параметры (обьем крови). Тканевый обьем крови (т.е. обьем крови в вокселе, регистрируемый с помощью МРТ) измеряется путем интегрирования AR2* после внутривенного введения KB (логарифм изменения интенсивности МРТ сигнала пропорционален концентрации KB в вокселе).

Тем не менее, несмотря на применимость на практике, метод, основанный на изменении магнитной восприимчивости обладает несколькими недостатками: 1) абсолютные значения объема можно определить только после забора образцов крови; 2) низкомолекулярные KB, которые представляют собой единственный класс KB, разрешенных для клинического применения, быстро преодолевают эндотелиальные барьеры, что не позволяет проводить кинетические измерения в кровотоке с помощью МРТ без превышения дозы.

Необходимость неинвазивного мониторинга объема крови в качестве биомаркера ангиогенеза и антиангиогенеза при разработке новых экспериментальных методов терапии рака и воспалительных болезней требовала от нас решения задачи по разработке и применению на практике долгоциркулирующего KB, которое бы обладало биосовместимостью и позволило бы избежать приведенных выше недостатков.

Результаты и обсуждение. В 1992 г. мы разработали первый биосовместимый синтетический парамагнитный зонд с размерами наночастицы (5-10 нм). Данное KB, получившее название Protected Graft Copolymer (PGC), было успешно использовано, и мы продемонстрировали его применимость для визуализации сердечно-сосудистой системы при помощи МРТ (Рис. 4А). Мы установили, что PGC обладает высокой стабильностью в отсутствие компонентов плазмы, которые вызывают медленное расщепление PGC, способствующее его выведению из организма (Рис. 4Б-Г). Мы также показали, что PGC можно использовать для доставки контрастных агентов к поверхности эндотелия, а также в

областях локально повышенной проницаемости стенки сосудов, и, в конечном итоге, в межтканевое пространство опухолей (Табл. 1).

3 6

Время, мин

з 6

Время, мин

Рис. 4. Макромолекуляриый нано-зонд, полученный на основе биосовместимою полимера (конъюгата полилизина и полиэтиленгликоля) 11,3,8]. А-З-мерная схематическое изображение макромолекулярного контрастирующего зонда (РОС); Б-профили биораспределения РОС в модели рака молочной железы Я3230 у крыс 6-120 часов после внутривенного введения. Наблюдалось медленное выведение РвС из кровотока, и увеличение накопления в опухоли, почках и селезенке В-гельпроникающая ВЭЖХ образца РвС до и после 24 ч инкубации в нормальном физиологическом растворе, рН 7.4. РОС был мечен изотопом Г -хроматограмма образца РОС до и после 24 ч инкубации в

присутствии 50% плазмы крови человека, стрелка указывает на смещение пика элюции РОС в область макромолекул меньшего диаметра.

Таблица 1. Физико-химические и фармакокинетические характеристики PGC-Gd [1,3,8].

Параметр Gd-PGC

Формула (приблизительная) MPEG92-PL-GdDTP А187

Масса (ВЭЖХ) 560 кДа

Диаметр (корреляционая спектроскопия) 10.3±2 нм

Релаксивность (спин-решеточная), г1 18 мМ с-1

Время полужизни в кровотоке, (^п) 36 ч

Объем биораспределения 0.04 л/кг

Экстракция из кровотока, начальная Не наблюдалась

Связывание с белками плазмы Не обнаружено

Иммунный ответ (иммуноглобулины й+М, иммуноанализ) на GdДTПK, доза 0.01 ммоль Gd/кг, 2 недели после инъекции. Не обнаружен

Свойства PGC приведены в таблице 1. Полученный на основе ковалентной модификации метоксиполиэтиленгликолем 6-аминогрупп полилизина графт-сополимер PGC был впоследствии применен в ряде МРТ исследований в различных моделях (Таблица 2). Наиболее часто использовалось производное ковалентной модификации PGC диангидридом диэтилентриаминопентауксусной кислоты (ДТПК) с хелатированным Gd(III).

Таблица 2. МРТ исследования с применением долгоциркулирующего сополимера PGC, меченого катионами лантанидов (Gd или Dy).

Вид экспериментальных животных, Модель заболевания МРТ режим получения изображений Основные выводы Ссылка

CD крысы, balb/c мыши, токсикология, МРТ эффективность 1.5Т градиент эхо (3D-SPGR) Контрастирующий эффект наблюдался при внутривенной дозе 25 мкмоль Gd /кг . Нетоксичен в мышах и крысах. [1]

Кролик, модель эмболизма легочных артерий 1.5Т (3D-SPGR) PGC дает возможность контрастировать разветвление легочных артерий вплоть до 4го уровня. [2]

Крыса. Модель кровотечения стенки тонкого кишечника 1.5Т (3D-SPGR) Определен минимальный объем крови в кишечнике, детектируемый с помощью МРТ в после внутривенного введения PGC (50 мкл). [4]

Крыса. Глубокое воспаление фсморальной мышцы 1.5Т (3D-SPGR) Установлено, что MPT/PGC дает возможность наблюдать очаг воспаления 72 часа после введения PGC. Накопление PGC в очаге превышает в 8 раз уровень в нормальной мышце. [5]

Крыса. Глиома головного мозга 1.5Т (3D-SPGR) Определены условия, при которых можно точно и воспроизводимо измерять объем крови в ткани с учетом кинетики обмена протонов воды. [6]

Крыса, мышь. Модели рака. 1.5Т (3D-SPGR) Произведено определение транс-хелатирования катионов связанных с PGC и расщепление PGC в плазме крови и произведена визуализация PGC в опухолях [В]

Крыса. Глиома 1.5Т (3D-SPGR) Разработан подход к определению объема крови и общего объема межклеточного объема. В модели экспериментальной глиомы продемонстрирован эффект блокирования ангиогенеза под воздействием пептидов тромбоспондина-1 (TSP-1). [8,9,11, 14]

Крыса. Ишемия головного мозга 4.7Т (ASL, SE) Разработан новый МРТ метод для одновременного определения объема крови, скорости тока крови и степени экстракции воды из кровотока при помощи MPT/PGC-Dy. [12,15]

Мышь. Аденокарцинома молочной железы. 1.5Т 3D-SPGR Измерены различия в объеме крови опухоли MCF7 и клона с высоким уровнем экспрессии фактора роста сосудов (VEGF). [17]

Мышь Аденокарцинома простаты 1.5Т 3D-SPGR (варьирование флип угла) Предложен метод измерения объема крови и объема интерстициального пространства в опухолях при помощи PGC. [22,24]

Мышь. Аденокарцинома кишечника 9.4Т 3D-SPGR (варьирование флип угла) Количественно оценено уменьшение объема крови в опухоли на ранней стадии лечения ингибитором киназы рецептора фактора роста сосудов. [29]

Мышь. Модель диабета 1го типа (инсулит). 9.4Т 3D-GEFC (компенсация кровотока) Проведена МРТ ангиография высокого разрешения, продемонстрирована экстравазация PGC-Gd, меченого флуоресцеином, в области островков Лангерганса. [38]

Мышь. Ишемия полушария головного мозга. 9.4Т 3D-SPGR (варьирование флип угла) Измерены барьерные свойства гематоэнцефалического барьера до и после экспериментальной ишемии (инсульта). [43]

Ш.Б ПРИМЕНЕНИЕ PGC В ВИЗУАЛИЗАЦИИ АНГИОГЕНЕЗА РАКОВОЙ ОПУХОЛИ

Постановка задачи. Изменение объема крови в тканях наблюдается в результате ответа организма на различные патологические процессы (например, локальный воспалительный процесс, ишемия мозга, миокарда или почек), а также при ангиогенезе в раковых опухолях. Быстрое развитие новых методов, направленных на локальное уменьшение кровоснабжения опухоли (т.е. антиангиогенез) при терапии рака требует использования методов неинвазивного измерения кровоснабжения опухолей. Количественная оценка ангиогенеза является важной задачей при определении эффективности ингибиторов ангиогенеза и при определении степени пролиферации эндотелиальных клеток в опухоли. Несмотря на то, что кровоснабжение опухоли можно полуколичественно измерить при помощи биопсии и гистологического исследования, неинвазивные методические подходы к измерению объема крови при карципогенезе полностью отсутствовали. Известно, что ангиогенез в опухоли приводит к росту гетерогенных сосудов с атипичной проницаемостью эндотелиальных барьеров и отсутствием нормального ветвления сосудов, появлению артериовенозных шунтов и аномальной переменной направленности кровотока. Наличие приведенных выше особенностей кровоснабжения создает трудности при использовании как низкомолекулярных КВ, так и КВ, основанных на использовании глобулярных белков в качестве носителей КВ, которые, как правило, дают завышенные значения обьема крови в результате экстравазации за пределы кровеносной системы.

Мы поставили задачу определить неинвазивным путем степень кровоснабжения опухоли с применением долгоциркулирующего зонда PGC-Gd. Мы предположили, что в огличие от гистологического исследования, которое позволяет определять усредненное число кровеносных сосудов на единицу площади среза, визуализация в живых системах с применением PGC-Gd позволит 1) устранить субъективность при полуколичественной гистологической оценке кровоснабжения опухоли; 2) определять функциональный объем крови, т.е. процент общего объема ткани, который перфузируется при кровоснабжении ткаии.

Результаты и обсуждение. В отличие от низкомолекулярных парамагнитных хелатов Gd(III), а также парамагнитных конъюгатов белков, внутривенное введение PGC-Gd не сопровождалось быстрым выведением из кровотока экспериментальных животных (Рис. 4Б, Табл.1). Данный результат был подтвержден с применением МРТ исследования на модели аденокарциномы крыс R3230 (Рис. 5 А-Г). Оно показало, что PGC-Gd контрастирует как систему кровоснабжения опухоли, так и области накопления КВ через 24 часа после внутривенного введения, т.к. время его полужизни в кровотоке составляет 36 ч. С целью исследования влияния повышенных уровней экспрессии проангиогенных факторов мы использовали две линии клеток рака молочной железы: аденокарциномы MCF7 и ее генно-

инженерного варианта MV165, секретирующего фактор роста сосудов VEGF165. Эти клетки были ортотопически имплантированы в атимусных мышей с целью визуализации объема крови при помощи МРТ (Рис. 5 Д,Е). Данные измерения продемонстрировали следующее: 1) МРТ с применнеием PGC-Gd в качестве КВ. позволила достоверно определить объем крови в обоих типах опухоли, причем средняя фракция объема крови MV165 (8.9±2.1%) достоверно превышала объем крови в ткани адепокарциномы MCF7 (1.7±0.5%, р<0.001); 2) Т1-МРТ. проведенная с высоким разрешением, т.е. с размерами вокселя 0.2x0.1x1.5 мм. продемонстрировала типичную гетерогенность распределения локальной перфузии кровью вокселей в случае опухоли MV165. которая индуцирует крайне высокий уровень локального кровоснабжения за счет интенсивного ангиогенеза, индуцируемого вследствие секреции VEGF165 (Рис. 5Е).

объем крови, %

Номер МРТ среза

Рис. 5. Визуализация ангиогенеза в моделях рака с применением РСС-вс! [1,17]. А-МРТ

проекционное изображение кровоснабжения опухоли 113230 полученное с использованием М1Р алгоритма после введения макромолекулярного КВ (РОС, гадолиниевой соли); Б-то же, что и А 24 ч после введения КВ. видно выведение КВ через мочевой пузырь и накопление в тканях опухоли; В. Г-соответствующие МР томографические срезы во фронтальной проекции; Д- профили распределения Т1 взвешенного сигнала МРТ в томографических срезах опухоли МСР7 и МУ165, экспрессирующей фактор роста сосудов; Е- МРТ картирование объема крови в опухоли МУ165.

Распределение PGC-Gd в кровеносной системе позволяет оценить относительные объемы как крови, так и межклеточного пространства (МП) в раковых опухолях. Мы разработали подход, основанный на последовательном внутривенном введении двух KB: высокомолекулярного (PGC-Gd) и низкомолекулярного (СёДТПК, гадолиниевой соли диэтилентриаминопентауксусной кислоты). В случае высокой концентрации PGC-Gd дальнейшее введение дополнительного количества KB и укорачивание спин-решеточного времени релаксации протонов воды не приводит к заметному изменению сигнала в крови, т.е. происходит насыщение Т1 взвешенного МРТ сигнала. Благодаря достижению эффекта насыщения сигнала, наблюдаемого в результате увеличения спин-решеточной релаксации воды (AR1) при помощи PGC-Gd, мы смогли наблюдать и производить полуколичественный анализ как объема крови, так и объема межтканевого пространства опухоли после внутривенного введения GdflTClK. После введения второго KB (GdflTnK) МРТ сигнал ткани опухоли складывается из насыщенного Т1 сигнала крови (т.е. величины, не изменяющейся за промежуток времени, необходимый для проведения МРТ) и инкремента Т1 сигнала, являющегося следствием диффузии СсЩТПК из сосудов с высокой проницаемостью сосудистой стенки. Измерение МРТ сигнала в модели глиомы мозга у крыс (т.е. стереотаксически имплантированными клетками глиомы линии С6) показало, что фракция объема крови в опухолях составляет 1.50±0.67 (п=28), что соответствует примерно 7.5%/г ткани и достоверно (р<0.05) превышает объем крови скелетной мышцы (5%). Относительная фракция объема МП в глиоме С6 (40%) превышала в 4 раза фракцию МП в нормальной мышце (10%), причем эти данные МРТ были подтверждены результатами гистологии, которая показала, что объем МП равен 37.2±7.7%. В дальнейшем нам удалось установить, что определение фракции крови и МП при помощи МРТ можно производить при ненасыщающих, более физиологичных концентрациях PGC-Gd. МРТ подход в сочетании с терапией рака был применен в следующих моделях: 1) терапии глиомы с применением экспериментальных стабильных ретроинверсных пептидов с триптофан-богатой последовательностью, соответствующей повторам первого типа тромбоспондина-1; 2) терапии аденокарциномы кишечника (MV522) ингибитором VEGF рецепторной киназы (VEGFR2-TKI). При помощи МРТ в клиническом диапазоне напряженностей поля (1.5 и ЗТ) мы установили, что TSP-1 пептиды приводят к стабилизации роста сосудов в Сб глиоме и 9L глиосаркоме и прекращению роста опухолей мозга. Фракция объема крови после терапии оставалась постоянной, в то время как средний объем опухоли в контрольной группе был в 4 раза меньше, чем в опыте. В отличие от ангиостатического эффекта TSP-1 пептидов, индазол-содержащий ингибитор рецепторной тирозин киназы (VEGFR2-TKI) вызывал быстрое уменьшение объема крови опухоли (с 2.5±1.5% до 1.3±0.3%, р<0.05). Данное уменьшение

объема было измерено с применением МРТ метода, описанного в Гл. ИБ, после введения двух доз ингибитора киназы, т.е. через 16 часов после первой дозы. Уменьшение объема крови, сопровождавшееся апоптозом эндотелия сосудов и клеток опухоли, происходило на 7 дней раньше, чем наблюдаемое суммарное изменение объема опухолевой ткани, что говорит о том, что МРТ обладает способностью диагностировать эффективность антиангиогешюй терапии на ранней стадии лечения. Практическая значимость наших работ заключается в том, что: 1) гистологически подтвержденная обратная зависимость между плотностью сосудов в опухоли и процентом выживания пациентов после начальной стадии терапии рака может быть определена неинвазивными методами, без необходимости использования биопсии; 2) терапевтический эффект аптиангиогенезных препаратов может быть определен

количественно на ранней стадии лечения рака.

ГЛАВА IV. РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ЗОНДА ДЛЯ ОПТИЧЕСКОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ПРОТЕОЛИЗА В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ PGC Постановка задачи. Определение локализации биомаркеров в живых системах является одной из важнейших задач неинвазивной диагностики. Биомолекулы, обладающие каталитической активностью (ферменты), с одной стороны, представляют собой важный класс биомаркеров для неинвазивной визуализации, с другой стороны, наличие специфической активности создает уникальные возможности не только для идентификации биомаркера, но и для повышения чувствительности и специфичности неинвазивной детекции. Данная концепция проиллюстрирована на Рис. 6. В отличие т.н. зондов для направленной доставки, которые обычно разрабатываются с целью неинвазивной визуализации рецепторов клеточной поверхности, сенсоры ферментативной активности создаются с целью селективной визуализации продуктов каталитической реакции в живых системах (на уровне ткани или клетки). В случае направленной доставки зондов различить несвязанный (свободный) зонд от связанного зонда, как правило, не представляется возможным. Единственным исключением является т.н. подход с применением «претаргетинга», однако, он неприменим для визуализации каталитической активности. Мы ранее установили, что PGC, как и многие другие долгоциркулирующие молекулы, подвержен захвату в тканях за счет увеличенной проницаемости стенки сосуда (EPR эффект), который типичен для многих патологических процессов, индуцирующих активацию и миграцию выстилающего эндотелия. Как было отмечено выше, структура PGC позволяет «нагрузить» полимерную молекулу различными диагностическими низкомолекулярными веществами с применением как ковалентного, так и нековалентного связывания с полиаминокислотным «скелетом» молекулы. Связывание ДТПК с PGC позволило производить количественные измерения возрастания Т1 взвешенного МРТ сигнала, а также и радиоактивности PGC, если перед насыщением ДТПК катионами Gd с PGC

хелатировали катионы радиоактивного изотопа индия [И11п]. Мы предположили, что «нагрузка» РйС самозатушенным флуоресцентным красителем, позволит получить нефлуоресцентный, долгоциркулирующий макромолекулярный субстрат протеаз, который расщепляется протеазами в зоне накопления в живой ткани. Следовательно, оптимальный сенсор ферментативной активности должен иметь высокое соотношение специфического сигнала, т.е. прироста интенсивности флуоресценции, высвобождаемого протеазами, к фоновому сигналу. Именно поэтому сенсоры на основе РвС обладают преимуществами по сравнению с другими нефлуоресцентными субстратами ферментов, так как каждая молекула нанополимера «нагружена» десятками самозатушенных молекул флуорохрома. Таким образом, после введения РСС-Су5.5 в кровоток по результатам изменения флуоресценции в тканях с аномальной проницаемостью можно судить о локальном уровне протеолитической активности.

Результаты и обсуждение. Детекция фотонов, испускаемых флуоресцирующими молекулами

в живом организме

представляет собой сложную

проблему, связанную с

поглощением и рассеянием

фотонов в тканях.

Флуоресценция в ближне-

инфракрасном диапазоне

детектируется с большей

достоверностью, поскольку в

диапазоне длин волн 690-850 нм

поглощение фотонов в тканях и

крови минимально. Мы

использовали ковалентное Рис.

доставки и зондами-сенсорами. Данные классы КВ

связывание цианиновых

различаются уровнем контрастирования (т.е. соотношения

флуорохромов (р), которые интенсивностей специфического сигнала и фона) и времен

, 11 и 12, за которые эти соотношения достигаются в живых

образуют димеры и агрегаты в _ .... ...

системах. В случае КВ-сенсора, как правило, И< И и

концентрированных растворах соотношение сигнал/фон выше. КВ-сенсор способен

обнаруживать внутриклеточные (1) и экстраклеточные (2)

(например, карооцианинового

г маркеры.

красителя Су5.5) с

образованием нанополимерного зонда РСС-Су5.5, несущего большое число (п=15-20) молекул Р на каждой молекуле РвС. В данном полимерном нано-зонде образование агрегатов Су5.5 дополнительно индуцируется в результате близкого взаимного расположения Р на

"Сенсор"

"Направленная доставка"

• •

Визуализация:

6. Различия между зондами для направленной

полилизиновом "скелете" молекулы. Такое близкое расположение Г вызывает самотушение флуоресценции (см. Гл. ПА), и измеряемая суммарная интенсивность флуоресценции интактной молекулы РОС при физиологических концентрациях солей и температуре крайне мала (Рис. 7). Добавление модельных ферментов (например, трипсина или катепсина В), которые с высокой эффективностью гидролизуют пептидную связь между остатками лизина, ацилированными по е-аминогруппам, приводило к быстрому возрастанию флуоресценции (эффективная константа скорости реакции псевдопервого порядка К^+к.! )арр=2.5 10 ±0.5 10 сек"1). Возрастание флуоресценции, в данном случае, является следствием расщепления наноконъюгата на фрагменты и увеличения среднего расстояния между молекулами И. Ферментативная специфичность зонда к катепсинам была доказана в экспериментах с применением ингибиторов ферментативной активности. Нами было показано, что катепсины В, Н и Ь расщепляют полимерный зонд с высвобождением флуоресценции. Благодаря эффекту ферментативного расщепления РОС мы произвели визуализацию активность катепсинов в опухолях с применением постоянного источника возбуждающих фотонов (Рис. 8). Наблюдавшийся эффект является результатом синергизма действия нескольких факторов: 1) накопления полимерного зонда в опухоли в результате высокой проницаемости стенки сосудов; 2) высокого уровня экспрессии катепсинов в клетках стромы опухоли и в собственно раковых клетках; 3) локализации продуктов расщепления полимерного зонда в лизосомах, т.е. внутри клеток; 4) расположения опухоли (подкожная имплантация). Последующий анализ

Рис. 7. Эффект самотушемия флуоресценции и детекция протеолитической активности с помощью РСС-Су5.5 [13,16]. А- протеолитическое расщепление ианомолекулярного зонда РОС-Су5.5 по пептидной связи (стрелка) приводит к фрагментации зонда и разделению пар Су5.5-Су5.5, подверженных самотушению; Б- спектры поглощения исходного зонда и продуктов трипсинолиза, которые содержат значительно больше мономеров; В - спектры возбуждения и испускания флуоресценции до и после трипсинолиза; Г- визуализация эффекта трипсинолиза с применением возбуждающего излучения в диапазоне волн 610-650 нм и испускания флуоресценции свыше 700 им.

клеточных популяций опухолей, проведенный с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной флуориметрии показал, что именно в клетках стромы опухоли происходит расщепление зонда и высвобождение большей части ближне инфракрасной флуоресценции цианинов (Рис. 8Г).

Рис. 8. Оптическая детекция протеолитической активности в моделях рака у экспериментальных животных [13,19,20). А- изображение в видимом диапазоне света; Б-флуоресцентная визуализация расщепления РОС-Су5.5 в ксенотранспланте человеческой карциномы легкого ЬХ-1. На врезке показана покожная опухоль при анатомическом исследовании; В - визуализация расщепления РОС-Су5.5 в модели аденокарциномы молочной железы человека с различной степенью злокачественности (ОШ475 и ВТ20); Г -визуализация подкожной опухоли (9ЮРР) с применением комбинированной двухфогонной и конфокальной микроскопии после введения РСС-Су5.5. Цвегокодировка: ЕвРР ("зеленый"), Су5.5 ("красный"). Д- проточная флуориметрия клеток, выделенных из опухоли 9Ь-ОРР. Окно, отмеченное серым цветом, соответствует фракции клеток с высокой интенсивностью флуоресценции Су5.5 и низким содержанием ЕОРР (строма опухоли).

Кроме того, путем сравнения нескольких линий клеток, которые приводят к росту опухолей с различной степенью злокачественности, мы установили, что в случае ксенотрансплантированных клеток аденокарциномы молочной железы наблюдалась корреляция между степенью злокачественности раковой опухоли, уровнем экспрессии катепсина В и интенсивностью флуоресценции, измеренной с применением неинвазивной визуализации. Например, через 21 день после ортотопической имплантации в атимусных мышей опухоли недифференцированной аденокарциномы человека линии ОШ475 достигали веса 593.8 ±171.0 мг и флуоресцировали со средней интенсивностью 861 ±88, по сравнению с весом 29.5±3.3 мг и интенсивностью флуоресценции 566±36 (р<0.01) в случае дифференцированной и неагрессивной аденокарциномы ВТ20 (Рис. 8В). С помощью полуколичественного блоттинга лизатов клеток опухоли было установлено, что в опухоли Ри4475 активность катепсина В была в 1.7 раза выше, чем в аденокарциноме ВТ20. Данные различия указывают на наличие корреляции между уровнем экспрессии протеиназы, которая задействована в обеспечении миграции клеток в экстроцеллюлярном матриксе, а также сигнала, генерируемого при расщеплении самозатушенного флуоресцентного макромолекулярного зонда в тканях животных. Измерения ближне- инфракрасного сигнала с

10° 10 "г ИГ Флуоресценция ЕСРР О.Е.

поверхности пораженного органа (например, стенки кишечника), в принципе, дает возможность оценить вероятность быстрого агрессивного роста данного новообразования.

ГЛАВА V. РАЗРАБОТКА СЕНСОРНЫХ ПАРАМАГНИТНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ, ОСНОВАННЫХ НА ЭФФЕКТЕ ФЕРМЕНТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ

Постановка задачи. Разработанные нами подходы к визуализации специфической активации КВ (Глава VI) основаны на эффекте расщепления химических связей гидролазами, и применимы только для данного класса ферментов. Мы поставили задачу разработать альтернативную стратегию, который позволил бы производить визуализацию ферментативной активности, катализирующей или образование олигомеров, или образование конъюгатов с биомакромолекулами в живых системах. Ранее подобные методы не были опробованы для неинвазивной визуализации в живых тканях. Мы разработали методический подход, основанный на принципе фермент-специфической олигомеризации парамагнитных субстратов. Мы предположили, что в результате ферментативного окисления зонды-предшественники могут образовывать промежуточные продукты с высокой реакционной способностью. Эти промежуточные продукты способны к рекомбинации с образованием олигомеров, т.е. молекул с большей массой и, следовательно, с меньшей вращательной свободой парамагнитных катионов, входящих в состав олигомеров. Как было показано в Гл. П.А, корреляционное время тц, описывающее вращательную свободу хелатированного парамагнитного иона, оказывает наибольшее влияние на конечную релаксивность и, как следствие, на эффективность КВ в биологических системах.

Результаты и обсуждение. Вначале наша гипотеза была проверена с применением нового монофункционального производного гадолиниевой соли макроциклического хелата (ДОЗА), несущего тирамидную группу (Рис. 9А). Производные тирамина и окситирамина (катехоламина) способны с высокой эффективностью восстанавливать окисленную, т.е. каталитически неактивную форму пероксидаз. Роль пероксидазы в изученных нами процессах заключается в катализе образования реакционоспособных свободных радикалов, которые взаимодействуют с образованием олигомеров (гомоконъюгатов) или с образованием конъюгатов с белками (гетероконъюгатов). Образование олигомеров под воздействием пероксидаз было подтверждено ВЭЖХ и масс-спектрометрией (Рис. 9Б). По данным хроматографии, эффективный гидродинамический диаметр олигомеров соответствовал молекулам со средней массой 7 кДа, причем их профиль элюции не изменялся при десятикратном увеличении начальной концентрации субстрата. Полимеризация сопровождалась быстрым ростом спин-решеточной релаксивности (г1). Слежение за кинетикой реакций по росту релаксивности позволило определить, что полимеризация

радикалов гадолиниевой соли монотирамида ДОТА происходит с высокой скоростью (эффективная кинетическая константа реакции псевдопервого порядка Ку^+ы)арр =0.04 с"1). Мы подтвердили данные хроматографии с помощью масс-спектрометрии и показали, что в процессе реакции образуются олигомерные продукты со степенью полимеризации от 2 до 12 мономерных хелатных единиц. Эксперименты с использованием дисперсионных измерений зависимости релаксации от напряженности магнитного поля (NMRD) показали, что возрастание релаксивности в результате реакции, катализируемой пероксидазой, наблюдается во всем диапазоне напряженности магнитного поля (или диапазона Ларморовых частот) вплоть до 1.2Т (50 МГц).

При этом релаксивность особенно сильно возрастала в более высокочастотном диапазоне спектра, в котором производится большинство МРТ-измерений в клинике. Относительное изменение релаксивности было выше при физиологических температурах (37°С). Увеличение релаксивности в диапазоне 10-40 МГц типично для КВ с длинными ротационными корреляционными временами, обычно наблюдаемыми при связывании хелатированного гадолиния с белками. Например, релаксивность (R1) в случае окситирамидного производного гадолиниевой соли ДОТА (OT-flOTA(Gd) возрастала с 3.75 до 11.50 [мМ'с-1] (при напряженности поля 0.47 Т), т.е. примерно в три раза. Моделирование параметров релаксации протонов воды с применением генетического алгоритма в рамках теории Соломона-Блюмбергена-Моргана, с использованием экспериментальных данных, полученных с помощью NMRD, позволило установить, что в результате фермент-опосредованной полимеризации величина tr возрастала с 0,12 до 0,84 не, т.е. в 7 раз. Таким образом, исследование модельной реакции с участием пероксидазы показало, что олигомеризация пизкомолекулярных веществ под воздействием ферментов может приводить к увеличению релаксивности, причем преобладающим фактором является олигомеризация и лимитирование вращательной свободы хелатированного парамагнитного катиона.

Несмотря на наличие физических ограничений, которые влияют на возрастание МРТ-енгнала в присутствии хелатированных парамагнитных катионов, томографическая визуализация позволила различить образцы парамагнитного субстрата, содержащего фермент, и контрольные образцы (Рис. 9Б, врезка). В присутствии пероксидазы и перекиси водорода сигнал МРТ увеличивался на 60% в диапазоне концентраций 50-200 мкМ Gd. Для определения чувствительности данного метода, получившего название МРТ-амплификации, был определен предел обнаружения пероксидазы в растворе, который составил 50 нг фермента /мл, т.е. 1 пМоль. Зависимость МРТ-сигнала от концентрации пероксидазы в присутствии OT-flOTA(Gd) имела типичный сигмоидный характер.

А Олигомеризация

..'•'vVV

•х

тйэ»

Ковалентное связывание с белками

релаксивиости

Рис. 9. Принципы и экспериментальное подтверждение эффекта МРТ-амплификации для визуализации активности пероксидазы с применением субстратов Gd [18,27,31,39|.

А- схематическое изображение двух путей образования продуктов ферментативной реакции с высокой релаксивностью. В качестве субстратов сенсоров были использованы моно- и бис-тирамиды или триптамиды макроциклических (I) или ациклических хелатов Gd(III) ; 1>-увеличение молярной релаксивиости и возрастание MPT Т1-взвешенного сигнала (на врезке, нижний ряд) в присутствии различных концентраций монотирамида (I); В- результаты масс-спектрометрии продуктов фермент-опосредованной гомоолигомеризации монотирамида (I), свидетельствующие об образовании олигомеров со степенью олигомеризации 2-12 ; Г-результаты ЯМР дисперсионных измерений растворов мономеров и олигомеров тирамида (1) при двух значениях температуры.

Подобная зависимость, в целом, напоминала концентрационную кривую колориметрического определения пероксидазы. Для того, чтобы сопоставить чувствительность стандартного колориметрического иммуноферментного анализа модельного антигена и разработанной системы пероксидаза-парамагнитный субстрат, мы использовали систему дигоксигенин-антидигоксигенин с применением МРТ в качестве метода обнаружения фермента. Дигоксигенин-меченый Р(аЬ')2-фрагмент антитела, адсорбированный на полистироле в количестве 1-1000 нг обнаруживали антидигоксигениновыми моноклональными антителами, мечеными пероксидазой, с последующим добавлением 100 мкМ OT^OTA(Gd). При помощи

Частота прецессии. МГц

о.» ot

[Gd], мМ

23456789 10

Масса/заряд х 1000

Олигомеры

данного метода, нам удалось обнаружить фрагмент антитела с нижним пределом чувствительности 1-80 нг, причем чувствительность метода была сравнима с обычным иммуноферментным колориметрическим анализом, проведенным в аналогичных условиях.

ГЛАВА VI. ПРИМЕНЕНИЕ СЕНСОРНЫХ ПАРАМАГНИТНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ПРИ ВИЗУАЛИЗАЦИИ РЕЦЕПТОРОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ Постановка задачи. Результаты тестирования системы с применением модельного антигена показали, что МРТ-амплификация сигнала обладает достаточной чувствительностью, которая теоретически позволяет визуализировать клетки, экспрессирующие специфические антигены на поверхности. Применение неинвазивной визуализации к детекции антигенов в живых системах ранее было лимитировано низким пространственным разрешением радиоизотопных методов. Применение антител, меченых позитрон-испускающими изотопами, например l8F, дает возможность частично устранить этот недостаток, однако, время жизни изотопов недостаточно для достижения высоких уровней отношения специфического и неспецифического сигналов в ткани. Мы поставили задачу тестирования иммуноферментных конъюгатов и метода МРТ для визуализации рецепторов на поверхности клеток и в живой ткани с применением МРТ-амплификации.

Результаты и обсуждение. Мы использовали модельную систему экспрессии селектина Е на поверхности клеток эндотелия человека, индуцированной интерлейкином-1 (IL-lbeta). Данная экспериментальная система важна потому, что она позволяет моделировать процессы, происходящие на ранней стадии ответа сосудистой стенки на воспалительные и проангиогенные сигналы. Способность эндотелиальных клеток экспрессировать селектин Е в ответ на стимуляцию IL-lbeta (или фактором некроза опухоли, TNFa) была вначале проверена н эксперименте с использованием флуоресцентный микроскопии (Рис. 10А) и ,251-меченых антител. Эксперимент показал, с одной стороны, высокую аффинность F(ab')2 фрагментов антител с эффективной константой диссоциации Kq=8.5 нМ, а с другой стороны, наличие большого количества центров связывания на поверхности клеток (примерно 2 млн молекул селектина Е на клетку). В экспериментах на клеточной культуре было показано, что присутствие селектина Е на поверхности клеток эндотелия человека можно было обнаруживать по увеличению МРТ-сигнала ОТ-ДОТА(Ос1), использованного в качестве СКВ, который был специфичен к присутствию пероксидазы (Рис 10А-В). При этом сигнал увеличивался как в супернатанте, т.е. в несвязанном с клетками состоянии, так и в суспензии клеток, снятых с подложки, что подтвердило наличие связывания олигомеризованного продукта реакции, катализируемой пероксидазой.

Рис. 10. Визуализация рецепторов в живых системах при помощи МРТ 118,36,37].

А- иммунофлуоресцентное обнаружение селектина Е (ELAM-1) на поверхности IL-lbeta активированных эндотелиальных клеток; Б- контроль; В- Т1-взвешенное МРТ изображение эндотелиальных клеток: 1) положительный контроль (0.25 мкМ ДТПК(Сё); 2) активированные эндотелиальные клетки, инкубированные с антителами к селектину Е и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой и инкубированными с парамагнитным субстратом (0.25 мМ моноокситирамид D03A), 3) контроль; 4) активированные клетки, не инкубированные с субстратом; Г, Е- МРТ срезы глиомы GH36 у атимусных крыс (rnu/rnu) после внутривенного введения парамагнитного субстрата (доза - 0.2 ммоль/кг), Д, Ж- после введения конъюгатов антител против EGFR рецептора и парамагнитного субстрата пероксидаз (0.2 ммоль/кг), 3- изменение МРТ сигнала в опухоли, измеренного в течение 1 ч после введения субстрата.

Таким образом, мы показали, что индуцированная экспрессия рецепторов на поверхности клеток может быть обнаружена при помощи МРТ с применением субстратов, которые отвечают на присутствие пероксидазной активности, связанной с клетками. В то время как в системах in vitro задача визуализации рецепторной экспрессии решается достаточно несложно, и определяется лишь разрешающими возможностями МРТ и аффинностью и специфичностью антител, в живых системах задача МРТ-визуализации после направленной доставки антител и их фрагментов значительно осложнена неспецифическими эффектами, связанными с функцией клеток органов ретикулоэндотелиальной системы. Частичным решением проблемы может служить применение т.н. «претаргетинга», для чего сначала системно вводят конъюгаты антител (или других «векторных» молекул), а затем, после того как большая часть коньюгатов покидает кровообращение, вводят СКВ. Другими факторами, влияющими на результаты визуализации при помощи пероксидаз являются : 1) распределение антител, их конъюгатов, а также низкомолекулярных СКВ в организме; 2) зависимость от локального кровоснабжения, т.е. функционального объема крови; 3) местная проницаемость кровеносных сосудов; 4) локальная концентрация центров связывания на поверхности клеток; 5) кинетика удаления коньюгатов из центров накопления; 6) наличие биологического источника перекиси водорода.

Одним из возможных подходов к решению проблемы визуализации рецепторов является использование «бинарных» конъюгатов. В частности, нами было показано, что

система пероксидаза-глюкозооксидаза (П-ГО) может быть использована для подобной цели in vivo. Моноклональные антитела против мембранного белка принадлежащего к семейству L6 связывали с пероксидазой и глюкозооксидазой путем конъюгирования с образованием бисароматических ковалентных гидразоновых связей. Белок L6 обычно экспрессирован в высоких концентрациях на поверхности плоскоклеточных карцином человека (например, клеток А431, которые содержат до 2,5 105 рецепторов на клетку). На этих клетках данная система и была вначале опробирована. В качестве СКВ была использована гадолиниевая соль бис-(5-окситриптамидо)диэтилентриаминопентауксусной кислоты, (50Т-ДТПА(С(1). Это соединение эффективно восстанавливает окисленные формы пероксидазы и миелопероксидазы (см. ниже). Релаксивность (R1) продуктов реакции 50Т-ДТПА(С<1) с пероксидазой возрастала в 2,1-2,5 раза по сравнению с исходным субстратом, причем скорость возрастания R1 была в 3 раза выше, если перекись водорода генерировали непрямым методом, т.е если в качестве источника перекиси водорода использовали ГО в присутствии глюкозы. Этот результат можно объяснить быстрым восстановительным ипгибированием пероксидазы с образованием неактивных форм фермента в условиях избытка перекиси водорода. Эксперименты на культуре клеток показали, что в системе с применением П-ГО при помощи МРТ можно производить визуализацию от 0,4 до 0,04 единиц активности (100-10 нг) пероксидазы, связанной с клетками.

В экспериментах с атимусными крысами с имплантированными клетками опухоли глиомы человека (GH36), экспрессирующей рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), вводили последовательно конъюгаты антител против EGFR, а затем парамагнитный субстрат. Сразу после введения СКВ происходило резкое возрастание интенсивности Т1-взвешенного МРТ-сигнала, за которым следовала медленная фаза выведения контрастного вещества из опухоли. У животных, которым вводили конъюгат антител за несколько часов перед введением СКВ, происходило увеличение сигнала в опухоли примерно в 1.3 раза в течение первого часа после введения СКВ. Этот результат коррелирует с наблюдавшимся in vitro изменением МРТ-сигнала в реакции П-ГО с СКВ, сопровождавшейся образованием продуктов с высокой релаксивностью. Путем полуколичественного анализа МРТ изображений мы продемонстрировали наличие распределения парамагнитного продукта реакции в опухоли, которое коррелирует с местной экстравазацией антител в межклеточное пространство в ткани и связыванием клетками опухоли (Рис. 10Г-3). Таким образом, наблюдавшийся эффект контрастирования тонкой структуры опухоли у животных дает основания заключить, что неинвазивная визуализация распределения антител, направленных к маркерным молекулам в опухолевой ткани, позволяет получать МРТ изображения, применимые для картирования экспрессии рецепторов в обьеме опухоли.

ГЛАВА VII. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ (МПО) В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА НЕСТАБИЛЬНОЙ АТЕРОМЫ

Постановка задачи. Сердечно-сосудистые заболевания атеросклеротической природы (инфаркт миокарда, инсульт, заболевания периферических артериальных сосудов) являются главной причиной смертности населения в развитых странах мира. Атерогенез сосудов является сложным, многоэтапным патологическим процессом, который приводит во многих случаях к дестабилизации атеросклеротических бляшек на стенке пораженных сосудов, с развитием окклюзии сосудов и острой ишемической болезни. В последнее время, теория о преимущественно воспалительной природе атерогенеза сосудов привлекает все большее внимание исследователей. Наличие локальной повышенной миелопероксидазной активности в стенке сосуда является одним из важнейших факторов в патогенезе атеросклероза. МПО секретируется нейтрофилами и присутствует в макрофагах, локализованных в сосудистой стенке (интиме). МПО быстро восстанавливает перекись водорода, образующуюся при активации нейтрофильной и эндотелиальной НАДФН оксидазы, и индуцирует окисление метиониновых групп, хлорироваие и нитрозилировапие остатков тирозина белков, а также образование хлоргидринов ненасыщенных липидов (Рис. 11).

А бис 5-0T-flTriK(Gd)

< "Л-

МПО

гл

^^^ мпо

RI - 4.5 (mMsec)'1 Субстрат

RI - 9 (mMsec)-1 Олигомеры

RI - 25 (mMsec)1 Связывание с белками

Моноциты/

Макрофаги

Нейтрофилы

02 u

Активация НАДФН^Ч

СОД^

N0,

Н,0

2и2

МПО

Ковалентная модификация белков (LDL.HDL)

МПО в стенке сосуда (нестабильная атерома)

Рис. 11. Схема, иллюстрирующая химические реакции в стенке сосуда, катализируемые миелонероксидазой нейтрофилов (МПО) и механизмы контрастирования атеросклеротической бляшки (атеромы). A- MPT Т1 субстраты и механизмы их полимеризации. Б- в условиях воспаления миелонероксидаза приводит к олигомеризации и иммобилизации парамагнитных субстратов в матриксе бляшки. В контрольных бляшках этот процесс не наблюдается.

Данные химические процессы вызывают активацию матриксных металлопротеиназ (например, ММП7) и способствуют деградации экстроцеллюлярного матрикса, способствуют

окислению липидов лииопротеинов низкой плотности, а также аполипопротеина A-I, и активируют вторичные воспалительные процессы, приводящие к накоплению пенистых макрофагов в интиме кровеносных сосудов и к дестабилизации атеросклеротической бляшки. Мы поставили задачу произвести неинвазивную визуализацию миелопероксидазной активности стенки сосудов при помощи МРТ, основанной на эффекте МРТ- амплификации так как благодаря высокому пространственному разрешению МРТ дает возможность с высокой точностью определить локализацию очагов воспаления и потенциальной нестабильности.

Результаты и обсуждение. Мы синтезировали и испытали субстрат бис-(5-окситриитамидо)диэтилентр11аминопентауксусной кислоты, (50T-flTITA(Gd), который обладает МПО чувствительностью. Эффективность и специфичность визуализации миелопероксидазы была исследована с применением двух типов экспериментов: 1) в модельных системах, в которых каталитически МПО либо была имплантирована искусственно, либо индуцирована в искусственно вызванном очаге воспаления (в результате инфильтрации нейтрофилов и макрофагов); 2) в модели спонтанного атеросклероза кроликов с визуализацией атеромы. В первом случае в качестве индуцирующего вещества использовали липополисахарид Е. coli, который вводили в мышцу (модель миозита) или в стенку сосуда под рентгенографическим наблюдением (модель воспалительной аневризмы стенки сосуда мозга). Мы установили, что в отличие от неспецифических KB (ДТПК(Сё) или бис-тирамида ДТПК(Сё), МПО-специфические бис- или моно 5-окситриптамиды парамагнитных комплексов гадолиния накапливаются как в экспериментальных очагах воспаления, так и в атероме аорты, что позволяет производить измерение локального изменения МРТ сигнала в течение часов после введения KB в отличие от flTnK(Gd), который быстро выводится из атеромы (Рис. 12). МРТ изображения стенки аорты кролика были получены с помощью системы МРТ последовательности радиочастотных пульсов, которые включали подготовительные пульсы инверсии-восстановления, позволяющие подавить МРТ сигнал в кровотоке и одновременно усилить контраст между стенкой сосуда и близлежащими тканями. Гистологическое исследование показало, что области атеромы с выраженной анти-МПО реактивностью, обнаруженной при помощи иммуногистохимии, содержат в среднем в 3 раза больше ферментативно-активной МПО, чем нормальная стенка сосуда. Кроме того, мы обнаружили, что данные области реактивности антител совпадают с распределением максимального МРТ сигнала в стенке сосуда, что послужило независимым подтверждением наличия специфичности у сенсорного KB бис-окситриптамида ДTПK(Gd).

6nc-5-0T-flTnK(Gd)

О 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275

Время, МИН

flTflK(Gd)

фон 10 мин 120 мин 240 мин 24 Ч

У ш № ЕЕ IP

„V КШ4 гае

6Mc-5-OT-flTriK(Gd)

■ р<0.05

контроль атерома

МРТ, воксели

Рис. 12. МРТ визуализация МПО активности в модели спонтанного атеросклероза кроликов при помощи активируемых парамагнитных субстратов. А- временная зависимость усиления и стабилизации МРТ сигнала после введения контрольного (flTnK(Gd) или МПО специфического контрастирующего вещества (бис-5-OT- ^nK(Gd); Б-изменение МРТ сигнала в атеросклеротической бляшке после введиния контрольного (flTOKGd, верхний ряд) или бис-5-OT- ДTПK(Gd). Стрелками указано усиление интенсивности МРТ сигнала в бляшке стенки сосуда; В-активность МПО в образцах нормального сосуда (аорта) и в сосуде подверженному атеросклерозу; Г- сравнение распределения МРТ сигнала и иммуногистохимического окрашивания МПО на срезе сосуда; Д-корреляция между площадью МПО-положительной области среза и площадью МПО-положительного МРТ сигнала.

Наличие небольших очагов воспалительного ответа на локальную стимуляцию эндотелия, выстилающего стенки сосудов головного мозга, является одним из основных факторов, вносящих вклад в развитие нестабильной аневризмы. Детекция подобных участков является важной задачей при выявлении пациентов, нуждающихся в срочном оперативном лечении аневризмы. Мы использовали принцип МРТ амплификации для визуализации активности МПО в модели аневризмы, полученной при помощи окклюзии основания правой сонной артерии кролика. Использование ангиографического слежения за введением 0.2 мкг

липополисахарида E.coli в стенку сосуда через сверхтонкий катетер позволило создавать небольшие локальные очаги воспаления для моделирования последующей визуализации активности МПО. Данная процедура приводила к появлению небольших очагов инфильтрации клеток, положительно реагировавших с анти-МАС387, т.е. кальпротектином гранулоцитов/моноцитов и тканевых макрофагов, а также с анти-МПО антителами. Инфильтрация МПО-положительных клеток приводила к увеличению концентрации МПО в стенке сосуда с 0,12 нг/мг веса ткани до 20,3 нг/мг. При помощи МРТ с применением 50Т-ДТПА(Ос1) мы показали, что усредненный Т1 взвешенный сигнал в аневризме достоверно увеличивался с 1,16±0,01 до 1,55±0,05 (р<0.02) после введения липополисахарида (Рис.13).

контроль Л! it л. сонная артерия

л. сонная артерия

6HC-OT-flTriK(Gd)

100 200

Время, мин

контроль

—I-1-,——

100 200 300

Время, мин

аневризма

бис-ОТ-ДТПК(вс!)

Рис. 13. Визуализация и измереиия изменений МРТ сигнала в модели воспалительной аневризме при использовании KB, специфичного к миелопероксидазе нейтрофилов (МПО) [44].

А, В- Т1-взвешенное МРТ изображение сонных артерий у контрольного животного до (А) и после введения СКВ (В, а-аорта). Б-Г- животное, которому был введен ЛПС в стенку сосуда. Стрелки указывают на аневризму. Изображения были получены с использованием FFE пульсов, т.е. градиент эха). Д- отношение интенсивностей МРТ сигналов после и до введения СКВ. Отношение в аневризме статистически достоверно выше контрольных тканей (р<0.02). Е, Ж- изменение соотношения МРТ сигналов во времени в аневризме и контрольной левой сонной артерии, в которой различий между контрольным KB и МПО сенсорным KB не наблюдалось.

Данный эффект контрастирования носил специфический характер, так как измерения изменений соотношения МРТ сигнал/фон в левой сонной артерии, а также измерения после введения контрольного KB (бис-тирамида ДТПК(Ос1) не выявили различий, обнаруженных в экспериментальной группе животных (Рис 13 Ж).

Таким образом, данное МРТ исследование показало, что как в модели хронического воспалительного процесса в атеросклеротической бляшке, так и в модели острого процесса в аневризме стенки сосуда визуализация ферментативной активности МПО может быть произведена с применением неинвазивного МРТ исследования и парамагнитного зонда (сенсора) ферментативной активности.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и опробован в экспериментах на животных наномолекулярный биосовместимый контрастирующий зонд PGC-GdDTPA. МРТ с использованием PGC-GdDTPA позволяет визуализировать объем крови в живых моделях различных патологии человека (рак, ишемия головного мозга, локальное воспаление, инсульт).

2. С применением контрастирующего зонда PGC-GdDTPA осуществлена визуализация ангиогенеза раковых опухолей животных. Показано, что зонд PGC-GdDTPA позволяет с помощью МРТ измерять ранние изменения в кровоснабжении опухолей.

3. Получены производные PGC, несущие самозатушенные флуоресцентные красители. Продемонстрирован принцип неинвазивной визуализации ферментативной активности гидролаз в живых системах в ближне- инфракрасном диапазоне флуоресценции. Установлено, что специфическое расщепление опухолевыми катепсинами позволяет производить визуализацию аденокарцином и оценивать скорость их роста (злокачественность).

4. Разработаны активируемые ферментами низкомолекулярные парамагнитные контрастирующие зонды и доказан механизм увеличения релаксивности в присутствии пероксидаз. Продемонстрировано, что данные вещества могут быть использованы в качестве сенсоров пероксидаз при направленной доставке ферментов к рецепторам на поверхности опухолевых клеток.

5. Разработаны миелопероксидазочувствительные парамагнитные контрастирующие зонды, которые были применены для визуализации очагов локального воспаления стенки кровеносных сосудов.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Статьи в научных журналах:

1. Bogdanov А.А. Jr., Weissleder R., Frank H., Bogdanova A.V., Nossiff N., Schaffer В., Tsai E., Papisov M., Brady T.J. (1993) A new macromolecule as a contrast agent for MR angiography: preparation, properties and animal studies. Radiology, v. 187, pp. 701-706.

2. Frank H., Weissleder R., Bogdanov A.Jr., Brady T.J. (1994) Detection of pulmonary emboli by using MR angiography with MPEG-PL-GdDTPA: an experimental study in rabbits. Amer J Roentgenol, v. 162, pp. 1041-1046.

3. Bogdanov A.A., Jr., Callahan R.J., Wilkinson R.A., Martin C., Cameron J.A., Fishman A.J., Brady T.J., Weissleder R. (1994) A synthetic copolymer kit for radionuclide blood pool imaging. J.Nucl. Med. V. 35, pp. 1880-1886.

4. Gupta H., Weissleder R., Bogdanov A.A. Jr., Brady T.J. (1995) Detection of experimental hemorrhage by contrast enhanced MRI and comparison with scintigraphy. Radiology, v. 196, pp. 239-244.

5. Gupta H., Wilkinson R.A., Bogdanov A.A. Jr, Callahan R.J., Weissleder R. (1995) Inflammation imaging: use of a long circulating graft copolymer (MPEG-PL-DTPA) Radiology v. 197, pp. 665-669.

6. Bogdanov A.A. Jr., Martin C., Bogdanova A.V., Brady T.J., Weissleder R. (1996) An adduct of cis-diamminodichlorplatinum(II) and poly(ethylene glycol)-poly(l-lysine)-succinate: synthesis and cytotoxic properties. Bioconjugate Chem. v. 7, pp. 144-149.

7. Donahue K.M., Weisskoff R.M., Chesler D.A., Kwong K.K., Bogdanov A.A. Jr., Mandeville J.B., Rosen B.R. (1996) Improving MR quantification of regional blood volume with intravascular T1 contrast agents: accuracy, precision, and water exchange. Magn Reson Med. v. 36, pp. 858-867.

8. Bogdanov A. Jr., Wright S.C., Marecos E.M., Bogdanova A., Martin C., Petberick P., Weissleder R. (1997) A long-circulating co-polymer in "passive targeting" to solid tumors. J.Drug Targeting, v. 4, pp. 321-330.

9. Marecos E., Wiessleder R., and Bogdanov A. Jr. (1998) Antibody-mediated versus nontargeted delivery in a human lung carcinoma model. Bioconj. Chem. v. 9, pp. 184-191.

10. Callahan R.J., Bogdanov A. Jr., Fischman A.J., Brady T.J., Weissleder R. (1998) Preclinical evaluation and phase I clinical trial of a 99mTc-labeled synthetic polymer used in blood pool imaging. Amer. J. Roentgenol, v. 171, pp. 137-144.

11. Weissleder R., Cheng H.C., Marecos E., Kwong K., Bogdanov A. Jr. Non-invasive in vivo mapping of tumour vascular and interstitial volume fractions. (1998) Eur. J. Cancer, v.34, pp. 1448-1454.

12. Zaharchuk G., Bogdanov A. Jr., Marota J. J. A., Shimizu-Sasamata M., Weisskoff R.M., Kwong K.K., Jenkins B.G., Weissleder R., Rosen B.R. (1998) Continous assesment of perfusion by tagging including volume and water extraction (CAPTIVE): A steady-state contrast agent technique for measuring blood flow, relative blood volume fraction, and the water extraction fraction. Magn. Res. Med. v. 40, pp. 666-678.

13. Weissleder R., Mahmood U., Tung C., Bogdanov A. Jr. (1999) In vivo imaging of tumors with protease-activated near infrared fluorescent probes. Nature Biotechnology, v. 17, pp. 375-378.

14. Bogdanov A. Jr., Marecos E., Cheng H.-C., Chandrasekaran L., Krutzsch H.C., Roberts D.D., and Weissleder R. (1999) Treatment of experimental brain tumors with thrombospondin-1 derived peptides: an in vivo imaging study. Neoplasia, v. I, pp. 438-445.

15. Zaharchuk G. , Mandeville J.B., Bogdanov A.Jr., Weissleder R., Rosen B.R., Marota J.J., Iadecola C., Kim S.G. (1999) Cerebrovascular dynamics of autoregulation and hypoperfusion. An MRI study of CBF and changes in total and microvascular cerebral blood volume during hemorrhagic hypotension. Stroke, v. 30, pp. 2197-2204.

16. Mahmood U., Tung C.-H., Bogdanov A.Jr., Weissleder R. (1999) Near-infrared optical imaging of protease activity for tumor detection. Radiology, v. 213, pp. 866-870.

17. Lewin M., Bredow S., Sergeyev N., Marecos E., Bogdanov A. Jr., Weissleder R. (1999) In vivo assessment of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis. Int J Cancer, v. 83, pp. 798-802.

18. Bogdanov A.Jr, Matuszewski L., Bremer C., Petrovsky A., Weissleder R. (2002) Oligomerization of paramagnetic substrates results in signal amplification and can be used for MR imaging of molecular targets. Mol Imaging, v. 1, pp. 16-23.

19. Bogdanov A.Jr., Lin C.P., Matuszewski L„ Simonova M„ Weissleder R. (2002) Cellular activation of self-quenched fluorescent reporter probe in tumor microenvironment. Neoplasia, v. 4, pp. 3 228-236.

20. Bremer C., Tung C.H., Bogdanov A. Jr., Moore A., Weissleder R. (2002) Imaging of differential protease expression in breast cancers for detection of aggressive tumor phenotypes. Radiology, v. 222, pp. 814-818.

21. Kang H.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2002) Targeting of MPEG-protected polyamino acid carrier to human E-selectin in vitro. Amino Acids, v. 23, pp. 301-308.

22. Kim Y.R., Savellano M.D., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2002) Steady-state and dynamic contrast MR imaging of human prostate cancer xenograft tumors: a comparative study. Techn Cancer Res Treat., v. 1, pp. 1-7.

23. Bremer C., Mustafa M., Bogdanov A. Jr., Ntziachristos V., Petrovsky A., Weissleder R. (2003) Steady-state blood volume measurements in experimental tumors with different angiogenic burdens- a study in mice. Radiology, v. 226, pp. 214-220.

24. Kim Y.R., Savellano M.D., Savellano D., Weissleder R., Bogdanov A.Jr. (2004) Measurement of tumor interstitial volume fraction: method and implication for drug delivery. Magn. Reson.Med. v. 52, pp. 485-494.

25. Metelev V., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2004) Synthesis and properties of fluorescent NF-kB recognizing hairpin oligodeoxynucleotide decoys. Bioconj Chem., v. 15, pp. 1481-1487.

26. Chen J.W., Pham W., Weissleder R., Bogdanov A.Jr. (2004) Human myeloperoxidase: a potential target for molecular MR imaging in atherosclerosis. Magn Reson Med., v. 52, v. 1021-1028.

27. Querol M., Chen J.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) DTPA-bis-amide based MR sensor agents for peroxidase imaging. Org Lett, 17, pp. 1719-1722.

28. Reichardt W., Hu-Lowe D., Torres D., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) Imaging of VEGF receptor kinase inhibitor - induced anti-angiogenic effects in drug-resistant human adenocarcinoma model. Neoplasia, v. 7, pp. 847-853.

29. Kim Y.R., Petrovsky A., Reichardt W., Hu-Lowe D., Kang H.W., Torres D., Weissleder R„ Bogdanov A.Jr. (2005) Detection of early anti-angiogenic effects: in vivo changes of tumor blood volume in response to the experimental VEGF-receptor tyrosine kinase inhibitor. Cancer Res. v. 65, pp. 9223-9260.

30. Querol M., Chen J.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) Myeloperoxidase activity imaging using 67-Ga labeled substrate. Molecular Imaging Biol., v. 7, pp. 403-410.

31. Querol M., Chen J.W., Bogdanov A. Jr. (2006) A paramagnetic contrast agent with myeloperoxidase-sensing properties. Org Biomol Chem, v. 4, pp. 1887-1895.

32. Chen J.W., Querol M., Bogdanov A. Jr., Weissleder R. (2006) Imaging myeloperoxidase in mice using novel amplifiable paramagnetic substrates. Radiology, v. 240, pp. 473-481.

33. Runnels J.M., Zamitri P., Spencer J.A., Veilleux I., Wei X., Bogdanov A., Lin C.P. (2006) Imaging molecular expression on vascular endothelial cells by in vivo immunofluorescence microscopy. Mol Imaging, v. 5, pp. 31-40.

34. Bogdanov A.A., Jr., Lin C.P., Kang H.W. (2007) Optical Imaging of the Adoptive Transfer of Human Endothelial Cells in Mice Using Anti-Human CD31 Monoclonal Antibody. Pharm Res, v. 24, pp. 1186-1192.

35. Laguillier C., Hbibi A.T., Baran-Marszak F., Metelev V., Cao A., Cymbalista F., Bogdanov A. Jr., Fagard R. (2007) Cell death in NF-kappaB-dependent tumour cell lines as a result of NF-

kappaB trapping by linker-modified hairpin decoy oligonucleotide. FEBS Lett., v. 581, pp. 1143-50.

36. Bogdanov A. Jr., Kang H.W., Querol M„ Pretorius P.H., Yudina A. (2007) Synthesis and testing of a binary catalytic system for imaging of signal amplification in vivo. Bioconjug Chem, v. 18, pp. 1123-1130.

37. Querol M„ Bennett D.G., Sotak C„ Kang H.W., Bogdanov A. Jr. (2007) A paramagnetic contrast agent for detecting tyrosinase activity. ChemBioChem., v. 8, pp. 1637-1641.

38. Medarova Z., Castillo G., Dai G., Bolotin E., Bogdanov A., Moore A. (2007) Non-invasive Magnetic Resonance Imaging of Microvascular Changes in Type 1 Diabetes. Diabetes, v. 56, pp. 2677-2682.

39. Богданов A.A. мл., Куерол M., Чен Д. (2007) Визуализация ферментативной активности в живых системх при помощи активируемых ЯМР контрастных агентов. Биофизика, т. 52, с. 389-400.

40. Tabatadze D., Zamecnik P., Yanachkov I„ Wright G„ Pierson K., Zhang S., Bogdanov A.Jr., Metelev V. (2008) A novel thymidine phosphoramidite synthon for incorporation of internucleoside phosphate linkers during automated oligodeoxynucleotide synthesis. NN&NA, v. 27, pp. 157-172.

41. Zhang S., Metelev V., Tabatadze D., Zamecnik P., Bogdanov A.A.Jr. (2008) Fluorescence resonance energy transfer in near-infrared fluorescent oligonucleotide probes for detecting protein-DNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA, v. 105, pp. 4156-61.

42. Zhang S., Metelev V., Tabatadze D., Zamecnik P., Bogdanov A. Jr. (2008) Near-infrared fluorescent oligodeoxyribonucleotide reporters for sensing NF-kappaB DNA interactions in vitro. Oligonucleotides, v. 18, pp. 235-43.

43. Kim Y.R., Tejima E„ Huang S„ Atochin D.N., Dai G„ Lo E.H., Huang P.L., Bogdanov A. Jr., Rosen B.R. (2008) In vivo quantification of transvascular water exchange during the acute phase of permanent stroke. Magn Reson Med., v. 60, pp. 813-821.

44. Deleo M„ Gounis M., Hong В., Wakhloo A., Bogdanov A. Jr. (2009) In vivo Molecular enzyme-cpecific MR imaging of active inflammation in a pilot animal Model of carotid artery aneurysm. Radiology, в печати.

Главы и монографии:

1. Bogdanov A.A., Jr., Weissleder R., Brady T.J. Protected angiopolymers and their use in blood pool imaging. In: Torchilin VP, ed. Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents. CRC Press, Boca Raton FL, 1995, pp. 502-522.

2. Bogdanov A. Jr., Petrovsky A., Schellenberger E., Simonova M., Pham W., Josephson L., Weissleder R MRI contrast agents of the future. In: MRI: From current knowledge to new

horizons. J. Debatin, H.Hricak, H.P.Niendorf, eds. Experta Medica Int. Amsterdam, 2003, pp. 227-234.

3. Bogdanov A.A. Jr., Chen J.W., Kang H.W., and Weissleder R. Magnetic resonance signal amplification probes. In: Ernst Schering Research Foundation Workshop 49: Molecular Imaging, Bogdanov A.A. Jr., Licha K., Eds., Springer-Verlag GmbH, Heidelberg, 2005 pp. 147-157.

4. Bogdanov A.A. Jr. "Molecular probes, delivery": in Encyclopedic Reference of Imaging, Baert, A.L., Editor, 2008 Springer-Verlag, Heidelberg, p. 1966.

5. Querol M., Bogdanov A.A. Jr. Environment-sensitive and enzyme-sensitive MR contrast agents. In: "Handbook of Experimental Pharmacology. Molecular Imaging II"W. Semmler and M. Schwaiger, eds. Springer-Verlag, Heidelberg, 2008, pp. 37-56.

6. Bogdanov A.A. Jr. Optical Imaging Probes. In: "Molecular Imaging in Oncology" M.G.Pomper and J.G.Gelovani, Eds. Informa Healthcare, NY,London, 2008, pp. 245-260.

7. Юдина А.Ю., Богданов A.A. мл., Пирогов Ю.А. Магнитно-резонансная томография в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров. Под ред. Ю.А. Пирогова. Изд. Физического факультета МГУ, Москва, 2008, 143 стр.

Патенты:

1. Bogdanov A.A. Jr., Brady T.J. Medical Compositions. US Patent 5,593,658.

2. Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R., Brady T.J., Callahan R. Blood pool imaging composition and method of its use. US Patent 5,605,672.

3. Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R., Brady T.J. Graft copolymer adducts of platinum(II) compounds. US Patent 5,871,710.

4. Bogdanov A.A. Jr., Tung C.-H., Weissleder R. Noninvasive imaging of nucleic acid vectors. US Patent 6,284,220.

5. Weissieder R., Tung C.-H., Mahmood U., Josephson L., Bogdanov A.A. Jr., Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes. US Patent 6,083,486.

6. Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R. Imaging of enzymatic activity. US Patent 6,737,247.

7. Weissleder R., Tung C.-H., Mahmood U., Josephson L., Bogdanov A.A. Jr., Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes. US Patent 6,592,847.

Заказ № 97/06/09 Подписано в печать 16.06.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,75

¿Рч-ч ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru ; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Богданов, Алексей Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ПРИНЦИПЫ НЕИНВАЗИВНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ

ВЗУАЛИЗАЦИИ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Введение.

1.2. Приборное оборудование и методы молекулярной визуализации.

1.3. Компьютерные и магнитно-резонансные томографические методы.

1.4. Радионуклиды и молекулярная визуализация.

1.5. Методы оптической визуализации.

1.6. Ультразвуковая визуализация.

1.7. Зонды для молекулярной визуализации.

ГЛАВА 2. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАБОТЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

2.1. Методы магнитно-резонансной томографии и контрастирующие вещества.

2.2. Контрастирующие зонды в МРТ.

2.3. Подходы к увеличению релаксивности при разработке МРТ-контрастирующих зондов.

2.4. Сенсорные контрастирующие зонды в МРТ.

2.5. Фермент-чувствительные МРТ-контрастирующие вещества.

2.2 Сенсорные МРТ-контрастирующие вещества, основанные на эффекте химического обмена-переноса спинового насыщения (ХО-ПСН).

2.7. Применение метода МРТ и контрастирующих зондов для мультикопийного анализа ткани.

2.8. Типы флуоресцентных зондов для визуализации в живых системах.

2.9. Самотушение флуоресценции и контрастирующие зонды.

ГЛАВА 3. ОБЗОР ОСНОВНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ,

ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЕ.

3.1. Химический синтез.

3.2. Культуры клеток.

3.3. Экспериментальные животные.

3.4. Неинвазивная визуализация в животных.

ГЛАВА 4. МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АГЕНТЫ («НАНО-ЗОНДЫ») ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ.

4.1. Полимерный биосовместимый зонд (PGC) для доставки диагностических контрастирующих веществ.

4.2. Применеие PGC-зонда при визуализации интактности сосудов и при доставке контрастирующих веществ.

4.3. Сравнительные исследования в модели опухоли с использованием специфических антител и PGC-Gd-зонда.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная визуализация физико-химических процессов в живых системах при помощи биосовместимых зондов: новые подходы"

Настоящая работа посвящена развитию методических подходов к визуализации специфической ферментативной активности и активации факторов транскрипции в живых системах. В качестве основных направлений работы были выбраны прикладные исследования, целью которых являлось изучение ответа живого организма на стимуляцию воспалительного каскада, в частности, модельное исследование визуализации оксидоредуктазной активности при развитии нестабильной атеромы и рака, а также активации стромы и ангиогенеза в раковых опухолях.

Для достижения целей работы были поставлены и поэтапно решены следующие задачи:

1) Разработка и синтез макромолекулярного наноносителя (PGC) для диагностических меток (НМН).

3) Создание зонда для оптической визуализации протеолиза в живых системах на основе PGC.

4) Изучение и идентификация источников протеолитической активности в раковых опухолях путем флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн.

5) Разработка, синтез и изучение свойств парамагнитных субстратов оксидоредуктаз (пероксидаз растений и миелопероксидазы), а также тирозиназ и лакказ. Разработка метода визуализации активности миелопероксидазы в модельных системах в качестве маркера нестабильной атеромы.

Более детально актуальность и пути решения этих задач обсуждаются в соответствующих главах диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Богданов, Алексей Алексеевич

выводы

1. Разработан и опробован в экспериментах на животных молекулярный биосовместимый контрастирующий нанозонд PGC-GdDTPA. MPT с использованием PGC-GdDTPA позволяет визуализировать объем крови в живых моделях различных патологий человека (рак, ишемия головного мозга, локальное воспаление, инсульт).

3. Получены производные PGC, несущие самозатушенные флуоресцентные красители. Продемонстрирован принцип неинвазивной визуализации ферментативной активности гидролаз в живых системах в ближнем инфракрасном диапазоне флуоресценции. Установлено, что специфическое расщепление опухолевыми катепсинами позволяет производить визуализацию аденокарцином и оценивать скорость их роста (злокачественность).

5. Разработаны чувствительные к миелопероксидазе парамагнитные контрастирующие зонды, которые были применены для визуализации очагов локального воспаления стенки кровеносных сосудов.

Использование чувствительных к ферментам зондов для молекулярной визуализации позволяет рассчитывать на повышение специфичности диагностики широкого спектра заболеваний. 10.4. Заключение и выводы.

Таким образом, наши результаты позволяют сделать вывод, что усиление МРТ-сигнала за счет эффекта накопления продуктов ферментативной реакции является следствием каталитического преобразования 5-ОТ-содержащих субстратов в реакционоспособные интермедиаты и является комбинированным результатом: а) фермент-опосредованного увеличения размеров продукта катализа, б) образования ковалентных связей между разнообразными продуктами окисления молекулярных парамагнитных зондов и макромолекул, присутствующих в районах ткани, обогащенных МПО. Активируемые ферментами парамагнитные контрастирующие зонды могут быть использованы в качестве сенсоров, которые отражают особенности микроокружения молекулы сенсора как в норме, так и при патологии живых систем. Таким образом, есть основания предполагать, что парамагнитные хелатные зонды, при условии дальнейшего улучшения их сенсорных свойств, будут широко использоваться в различных областях фундаментальной и прикладной науки, связанных с визуализацией физиологических процессов животных и человека.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Богданов, Алексей Алексеевич, Москва

1. Achilefu, S. (2004). "Lighting up tumors with receptor-specific optical molecular probes." Technol Cancer ' Res Treat 3(4): 393-409.

2. Aime, S., Botta, M., Fasano, M., Geninatti Crich, S. and Terreno, E. (1999). "lh and 17o-nmr relaxometric investigations of paramagnetic contrast agents for mri. Clues for higher relaxivities." Coord Chem Rev 186: 321333.

3. Aime, S., Botta, M., Panero, M., Grandi, M. and Uggeri, F. (1991). "Inclusion complexes between b-cyclodextrin and b-benzyloxy-a-propionic derivatives of paramagnetic dota- and dtpa-gadolinium(iii) complexes." Magn Reson Chem 29(9): 923-927.

4. Aime, S., Cavallotti, C., Gianolio, E., Giovenzana, G. B., Palmisano, G. and Sisti, M. (2004). "Mannich reaction as a new route to pyridine-based polyaminocarboxylic ligands." Org Lett 6(8): 1201-1204.

5. Aime, S., Delli Castelli, D., Fedeli, F. and Terreno, E.2002). "A paramagnetic mri-cest agent responsive to lactate concentration." J Am Chem Soc 124(32): 9364-9365.

6. Anderson, H. L., Yap, J. T., Miller, M. P., Robbins, A., Jones, T. and Price, P. M. (2003) . "Assessment ofpharmacodynamic vascular response in a phase i trial of combretastatin a4 phosphate.comment." J Clin Oncol.21 (15) : 2823-2830.

7. Andre, J. P., Toth, E., Fischer, H., Seelig, A., Macke, H. R. and Merbach, A. E. (1999) . "High relaxivity for monomeric gd(dota)-based mri contrast agents, thanks to micellar self-organization." Chemistry Eur J 5(10): 29772983.

8. Aoki, T., Kataoka, H., Morimoto, M. , Nozaki, K. and Hashimoto, N. (2007). "Macrophage-derived matrix metalloproteinase-2 and -9 promote the progression of cerebral aneurysms in rats." Stroke 38(1): 162-169.

9. Arridge, S. R., Schweiger, M. , Hiraoka, M. and Delpy, D. T. (1993). "A finite element approach for modeling photon transport in tissue." Med Phys 20(2 Pt 1): 299-309.

10. Artemov, D., Bhujwalla, Z. M. and Bulte, J. W. (2004). "Magnetic resonance imaging of cell surface receptors using targeted contrast agents." Curr Pharm Biotechnol 5(6): 485494.

11. Badruddoja, M. A., Krouwer, H. G., Rad, S. D., Rebro, K. J., Pathak, P. A. and Schmainda, K. M. (2003). "Antiangiogenic effects of dexamethasone in 91 gliosarcoma assessed by mri cerebral blood volume maps." Neuro-oncol 5(4): 235-243.

12. Ballou, B. (2005) . "Quantum dot surfaces for use in vivo and in vitro." Curr Top Dev Biol 70: 103-120.

13. Ballou, B., Fisher, G. W., Deng, J. S., Hakala, T. R. , Srivastava, M. and Farkas, D. L. (1998) . "Cyanine fluorochrome-labeled antibodies in vivo: Assessment of tumor imaging using cy3, cy5, cy5.5, and cy7." Bioconj Chem22 (3) : 251-257.

14. Basu, S., Zhuang, H., Torigian, D. A., Rosenbaum, J., Chen, W. and Alavi, A. (2009). "Functional imaging of inflammatory diseases using nuclear medicine techniques." Semin Nucl Med 39(2): 124-145.

15. Becker, A., Hessenius, C., K, L., Ebert, B., Sukowski, U., Semmler, W., Wiedenmann, B. and Grotzinger, C. (2001). "Receptor-targeted optical imaging of tumors with near-infrared fluorescent ligands." Nature Biotechnol 19(4): 327-331.

16. Ben-Ari, E. T. (2003). "Nanoscale quantum dots hold promise for cancer applications." J Natl Cancer Inst 95(7): 502504.

17. Berman, D. S., Kiat, H. , Van Train, K. , Friedman, J. D. , Wang, F. P. and Germano, G. (1994) . "Dual-isotope myocardial perfusion spect with rest thallium-201 and stress tc-99m sestamibi." Cardiol Clin 12(2): 261-270.

18. Berridge, M. S. and Tewson, T. J. (1986) . "Chemistry of fluorine-18 radiopharmaceuticals." Int J Rad Appl Instrum A 37(8): 685-693.

19. Bertolino, C., Caputo, G., Barolo, C., Viscardi, G. and Coluccia, S. (2006) . "Novel heptamethine cyanine dyes with large stokes' shift for biological applications in the near infrared." J Fluoresc 16(2): 221-225.

20. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Mendrick, D. L. , Cotran, R. S. and Gimbrone, M. A., Jr. (1987). "Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule." Proc Natl Acad Sci USA 84(24): 9238-9242.

21. Bhaumik, S. and Gambhir, S. S. (2002). "Optical imaging of renilla luciferase reporter gene expression in living mice." Proc Natl Acad Sci USA 99(1): 377-382.

22. Bhaumik, S., Lewis, X. Z. and Gambhir, S. S. (2004). "Optical imaging of renilla luciferase, synthetic renillaluciferase, and firefly luciferase reporter gene expression in living mice." J Biomed Opt 9(3): 578-586.

23. Bischoff, J., Brasel, C., Kraling, B. and Vranovska, K. (1997). "E-selectin is upregulated in proliferating endothelial cells in vitro." Microcirculation 4(2): 279287.

24. Blasberg, R. G. and Gelovani Tjuvajev, J. (2002). "Molecular-genetic imaging: A nuclear medicine-based perspective in vivo imaging of molecular-genetic targets for cancer therapy." Mol Imag 1(3): 280-300.

25. Boerman, 0. C., Dams, E. T., Oyen, W. J., Corstens, F. H. and Storm, G. (2001). "Radiopharmaceuticals for scintigraphic imaging of infection and inflammation." Inflamm Res 50(2): 55-64.

26. Bogdanov, A., Jr., Kang, H. W. , Querol, M. , Pretorius, P. H. and Yudina, A. (2007) . "Synthesis and testing of a binary catalytic system for imaging of signal amplification in vivo." Bioconjug Chem 18(4): 1123-1130.

27. Bogdanov, A., Jr., Matuszewski, L., Bremer, C., Petrovsky, A. and Weissleder, R. (2002). "Oligomerization of paramagnetic substrates result in signal amplification and can be used for mr imaging of molecular targets." Mol Imaging 1(1): 16-23.

28. Bogdanov, A., Jr., Wright, S. C., Marecos, E. M., Bogdanova, A., Martin, C., Petherick, P. and Weissleder, R. (1997). "A long-circulating co-polymer in "Passive targeting" To solid tumors." J Drug Targeting 4(5): 321330.

29. Bogdanov, A. A., Jr. (2008). "Merging molecular imaging and rna interference: Early experience in live animals." J Cell Biochem.

30. Bogdanov, A. A., Jr., Callahan, R. J., Wilkinson, R. A., Martin, C. , Cameron, J. A., Fischman, A. J., Brady, T. J. and Weissleder, R. (1994). "Synthetic copolymer kit for radionuclide blood-pool imaging." J Nucl Med 35(11): 18801886.

31. Bogdanov, A. A., Lewin, M. and Weissleder, R. (1999). "Approaches and agents for imaging the vascular system." Adv Drug Deliv Rev 37(1-3): 279-293.

32. Bogdanov, A. A., Querol, M. and Chen, J. W. (2007). "visualization of the enzymatic activity in living systems using activated nmr contrast agents." Biofizika 52(3): 389-400.

33. Bogdanov, A. A. J. and Weissleder, R. (1998). "The development of in vivo imaging systems to study gene expression." Trends Biotech. 16: 5-10.

34. Bogdanov, A. J., Matuszewski, L., Bremer, C., Petrovsky, A. and Weissleder, R. (2002). "Oligomerization of paramagnetic substrates results in signal amplification and can be used for MR imaging of molecualr targets." Mol. Imag 1(1): 1623.

35. Bogdanov, A. J., Weissleder, R. and Brady, T. (1995). "Long-circulating blood pool imaging agents." Adv Drug Del Rev 16: 335-348.

36. Bogdanov, A. J., Weissleder, R. , Tsai, E., Schaffer, B., Bogdanova, A., Nossiff, N., Papisov, M. and Brady, T. (1993). Tumor neovascularity imaging by contrast-enhanced MR angiography. Proc 12th Sci Mtg Soc Magn Reson Med, NY, Berkeley, CA:SMRM.

37. Bottrill, M., Kwok, L. and Long, N. J. (2006). "Lanthanides in magnetic resonance imaging." Chem Soc Rev 35(6): 557571.

38. Boxerman, J. L. , Hamberg, L. M. , Rosen, B. R. and Weisskoff, R. M. (1995) . "Mr contrast due to intravascular magnetic susceptibility perturbations." Magn Reson Med. 34(4): 555-566.

39. Brasch, R. , Pham, C., Shames, D. , Roberts, T., van Dijke, K. , van Bruggen, N., Mann, J., Ostrowitzki, S. and Melnyk, O. (1997). "Assessing tumor angiogenesis using macromolecular mr imaging contrast media. 40 refs." J Magn Reson Imaq 7(1): 68-74.

40. Bredow, S., Lewin, M., Hofmann, B., Marecos, E. and Weissleder, R. (2000). "Imaging of tumour neovasculature by targeting the tgf-b binding receptor endoglin." Eur. J. Cancer 36: 675-681.

41. Bremer, C., Tung, C. H. and Weissleder, R. (2001). "In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition." Nat Med 7(6): 743-748.

42. Brucher, E. and Sherry, A. D. (2001). Stability and toxicity of contrast agents. The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. A. E. Merbach and E. Toth. Chichester, John Wiley & Sons, Ltd: pp 243281.

43. Burton, D. W. , Geller, J., Yang, M. , Jiang, P., Barken, I., Hastings, R. H., Hoffman, R. M. and Deftos, L. J. (2005). "Monitoring of skeletal progression of prostate cancer by GFP imaging, x-ray, and serum OPG and PTHRP." Prostate 62 (3) : 275-281.

44. Cai, W., Shin, D. W., Chen, K. , Gheysens, O., Cao, Q., Wang, S. X., Gambhir, S. S. and Chen, X. (2006). "Peptide-labeled near-infrared quantum dots for imaging tumor vasculature in living subjects." Nano Lett 6(4): 669-676.

45. Cairns, R. A. and Hill, R. P. (2004). "A fluorescent orthotopic model of metastatic cervical carcinoma." Clin Exp Metastasis 21(3): 275-281.

46. Callahan, R., Wilkinson, R., Bogdanov, A. J., Donahue, K. , Weissleder, R. and Fischman, A. (1995). Validation of plasma volume determinations in the rat using an in-Ill labeled polymer and 1-125 labeled human serum albumin. J. Nucl. Med. 36: 157P.

47. Callahan, R. J., Bogdanov, A., Jr., Fischman, A. J., Brady, T. J. and Weissleder, R. (1998). "Preclinical evaluation and phase i clinical trial of a 99mtc-labeled synthetic polymer used in blood pool imaging." Amer J Roentgenol 171 (1) : 137-143.

48. Callahan, R. J., Froelich, J. W. , McKusick, K. A., Leppo, J. and Strauss, H. W. (1982) . "A modified method for the in vivo labeling of red blood cells with tc-99m: Concise communication." J Nucl Med 23(4): 315-318.

49. Campbell, R. E., Tour, O., Palmer, A. E., Steinbach, P. A., Baird, G. S., Zacharias, D. A. and Tsien, R. Y. (2002). "A monomeric red fluorescent protein." Proc Natl Acad Sci U S A 99(12): 7877-7882.

50. Campo, M. A. and Lange, N. (2006). "Fluorescence diagnosis using enzyme-related metabolic abnormalities of neoplasia." J Environ Pathol Toxicol Oncol 25(1): 341-372.

51. Carey, M. and Smale, S. (2001). Transcriptional regulation in eukaryotes: Concepts, strategies, and techniques, CHSL Press.

52. Castano, A. P., Liu, Q. and Hamblin, M. R. (2006). "A green fluorescent protein-expressing murine tumour but not its wild-type counterpart is cured by photodynamic therapy." British J Cancer 94(3): 391-397.

53. Chang, E., Miller, J. S., Sun, J., Yu, W. W., Colvin, V. L., Drezek, R. and West, J. L. (2005). "Protease-activated quantum dot probes." Biochem Biophys Res Commun 334(4): 1317-1321.

54. Chatziioannou, A. F. (2002) . "Molecular imaging of small animals with dedicated pet tomographs." Eur J Nucl Med Mol Imaq. 29 (1): 98-114.

55. Chatziioannou, A. F. (2005). "Instrumentation for molecular imaging in preclinical research: Micro-pet and micro — spect." Proc Am Thorac Soc 2(6): 533-536.

56. Chen, J., Querol, M., Bogdanov, A. J. and Weissleder, R.2006). "Imaging myeloperoxidase in mice using novel amplifiable paramagnetic substrates." Radiology 238(8): in press.

57. Chen, J. W., Pham, W., Weissleder, R. and Bogdanov, A., Jr. (2004). "Human myeloperoxidase: A potential target foir molecular mr imaging in atherosclerosis." Magn Reson Meci 52(5): 1021-1028.

58. Chen, J. W., Querol Sans, M., Bogdanov, A., Jr. and. Weissleder, R. (2006). "Imaging of myeloperoxidase in mice by using novel amplifiable paramagnetic substrates." Radiology 240 (2): 473-481.

59. Chen, X., Conti, P. S. and Moats, R. A. (2004). "In vivo near-infrared fluorescence imaging of integrin alphavbeta3 in brain tumor xenografts." Cancer Res 64(21): 8009-8014.

60. Cherry, S. R. (2006). "The 2006 henry n. Wagner lecture: Of mice and men (and positrons)—advances in pet imaging technology." J Nucl Med 47(11): 1735-1745.

61. Clarke, S. E., Weinmann, H. J., Dai, E., Lucas, A. R. and Rutt, B. K. (2000) . "Comparison of two blood pool contrast agents for 0.5-t mr angiography: Experimental study in rabbits." Radiology 214(3): 787-794.

62. Contag, C. H. and Bachmann, M. H. (2002). "Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. 14 6 refs." Annual Review of Biomedical Engineering. 4: 235260.

63. Contag, C. H., Jenkins, D. , Contag, P. R. and Negrin, R. S. (2000). "Use of reporter genes for optical measurements of neoplastic disease in vivo. 92 refs." Neoplasia (New York) 2 (1-2) : 41-52.

64. Contag, C. H., Spilman, S. D., Contag, P. R., Oshiro, M. , Eames, B., Dennery, P., Stevenson, D. K. and Benaron, D. A. (1997). "Visualizing gene expression in living mammalsusing a bioluminescent reporter." Photochem Photobiol 66(4): 523-531.

65. Correas, J. M., Bridal, L., Lesavre, A., Mejean, A., Claudon, M. and Helenon, 0. (2001). "Ultrasound contrast agents: Properties, principles of action, tolerance, and artifacts." Eur Radiol 11(8): 1316-1328.

66. De Leon-Rodriguez, L. M. , Lubag, A. J., Malloy, C. R. , Martinez, G. V., Gillies, R. J. and Sherry, A. D. (2009). "Responsive mri agents for sensing metabolism in vivo." Acc Chem Res 42 (7) : 948-957 .

67. Dennie, J., Mandeville, J., Boxerman, J., Packard, S., Rosen, B. and Weisskoff, R. (1998) . "Nmr imaging of changes in vascular morphology due to tumor angiogenesis." Magn. Reson. Med. 40(6): 793-799.

68. Dong, Q., Hurst, D. R., Weinmann, H. J., Chenevert, T. L., Londy, F. J. and Prince, M. R. (1998) . "Magnetic resonance angiography with gadomer-17. An animal study original investigation." Invest Radiol 33(9): 699-708.

69. Drevs, J., Hofmann, I., Hugenschmidt, H., Wittig, C., Madjar, H., Muller, M. , Wood, J., Martiny-Baron, G., Unger,

70. Duimstra, J. and Meade Thomas, J. (2005). Self-immolative magnetic resonance imaging contrast agents sensitive to beta-glucuronidase. USA: patent W005115105A2 pp. 62.

71. Edinger, M., Sweeney, T. J., Tucker, A. A., Olomu, A. B., Negrin, R. S. and Contag, C. H. (1999) . "Noninvasive assessment of tumor cell proliferation in animal models." Neoplasia (New York) 1(4): 303-310.

72. Esser, P. D. (1985). "Improvements in spect technology for cerebral imaging." Semin Nucl Med 15(4): 335-346.

73. Fabbro, D., Ruetz, S., Bodis, S., Pruschy, M., Csermak, K., Man, A., Campochiaro, P., Wood, J., O'Reilly, T. and Meyer, T. (2000). "Pkc412—a protein kinase inhibitor with a broad therapeutic potential." Anti-Cancer Drug Design 15(1): 1728.

74. Fischman, A. J., Babich, J. W., Barrow, S. A., Graham, W., Carter, E., Tompkins, R. G. and Rubin, R. H. (1995). "Detection of acute bacterial infection within soft tissue injuries using a 99mtc-labeled chemotactic peptide." J Trauma 38(2): 223-227.

75. Fischman, A. J., Babich, J. W. and Rubin, R. H. (1994). "Infection imaging with technetium-99m-labeled chemotactic peptide analogs." Semin Nucl Med 24(2): 154-168.

76. Fitz Gerald, K., Holliger, P. and Winter, G. (1997). "Improved tumor targeting by disulphide stabilized diabodies expressed in pichia pastoris." Protein Eng 10: 1221-1225.

77. Foilli, S., Westermann, P., Braichotte, D., Pelegrin, A., Wagnieres, G., van den Bergh, H. and Mach, J.-P. (1994). "Antibody-indocyanin conjugates for immunophotodetection of human squamous cell carcinoma in nude mice." Cancer Res 54 (10) : 2643-2649.

78. Folkman, J. (1995). "Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. 72 refs." Nature Medicine 1(1): 27-31.

79. Forsen, S. and Hoffman, R. A. (1963). "Study of moderate rapid chemical exchange reactions by means of nuclear magnetic double resonance." J Chem Phys 39(11): 2892-2901.

80. Fossheim, S., Saebo, K. B., Fahlvik, A. K., Rongved, P. and Klaveness, J. (1997). "Low molecular weight lanthanide contrast agents: In vitro studies of mechanisms of action." J Magn Reson Imag 7(1): 251-257.

81. Fossheim, S. L., Fahlvik, A. K. , Klaveness, J. and Muller, R. N. (1998). "Paramagnetic liposomes as mri contrast agents: Influence of liposomal physicochemical properties on the in vitro relaxivity." Magnetic Resonance Imaging 17 (1) : 83-89.

82. Frank, H., Weissleder, R., Bogdanov, A. A., Jr. and Brady, T. J. (1994). "Detection of pulmonary emboli by using mr angiography with mpeg-pl-gddtpa: An experimental study in rabbits." Amer J Roentgenol 162(5): 1041-1046.

83. Frouge, C., Guinebretiere, J. M., Contesso, G. , Di Paola, R. and Blery, M. (1994). "Correlation between contrast enhancement in dynamic magnetic resonance imaging of the breast and tumor angiogenesis." Invest Radiol 29(12): 10431049.

84. Fujimori, E. (1989). "Cross-linking and fluorescence changes of collagen by glycation and oxidation." Biochim Biophys Acta 998(2): 105-110.

85. Fukumura, D., Xavier, R., Sugiura, T., Chen, Y., Parks, E. C., Lu, N., Selig, M., Nielson, G., Taksir, T., Jain, R. K. and Seed, B. (1998). "Tumor induction of vegf promoter activity in stromal cells." Cell 125(2):715-725.

86. Funovics, M., Montet, X., Reynolds, F. , Weissleder, R. and Josephson, L. (2005). "Nanoparticles for the optical imaging of tumor E-selectin." Neoplasia (New York) 7(10): 904-911.

87. Gimbrone, M. A., Jr., Topper, J. N. , Nagel, T., Anderson, K. R. and Garcia-Cardena, G. (2000). "Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. " Ann N Y Acad Sci 902: 230-239.

88. Golman, K., Olsson, L. E., Axelsson, 0., Mansson, S., Karlsson, M.• and Petersson, J. S. (2003). "Molecular imaging using hyperpolarized 13c." Br J Radiol 76(2): S118-127, 2003.

89. Gonzalez, C. F., Chou, Y. I., Ortega, H. V. and Moret, J. (1992). "Intracranial aneurysms: Flow analysis of their origin and progression." AJNR Am J Neuroradiol. 13(1): 181188.

90. Grant, C. W., Karlik, S. and Florio, E. (1989). "A liposomal mri contrast agent: Phosphatidylethanolamine-dtpa." Magn Reson Med 49(3):468-78 11(2): 236-243.

91. Gueven, N., Fukao, T., Luff, J., Paterson, C., Kay, G., Kondo, N. and Lavin, M. F. (2006) . "Regulation of the atm promoter in vivo." Genes Chromosomes Cancer 45(1):61-71 45(1): 61-71.

92. Guo, H., Krutzsch, H. , Inman, J., Shannon, C. and and Roberts, D. (1997). "Anti-proliferative and anti-tumor activities of d-reverse peptides from the second type-1 repeat od thrombospondin-1." J Pept Res 50(3): 210-217.

93. Guo, N., Krutzxch, H., Inman, J. and Roberts, D. (1997). "Thrombospondin 1 and type i repeat peptides of thrombospondin 1 specifically induce apoptosis of endothelial cells." Cancer Res 57(9): 1735-1742.

94. Gupta, H., Weissleder, R. , Bogdanov, A. A., Jr. and Brady, T. J. (1995). "Experimental gastrointestinal hemorrhage: Detection with contrast-enhanced mr imaging and scintigraphy." Radiology 196(1): 239-244.

95. Gupta, H., Wilkinson, R. A., Bogdanov, A. A., Jr., Callahan, R. J. and Weissleder, R. (1995). "Inflammation: Imaging with methoxy poly(ethylene glycol)-poly-l-lysine-dtpa, a long-circulating graft copolymer." Radiology 197(3): 665-669.

96. Gurfinkel, M., Ke, S., Wang, W., Li, C. and Sevick-Muraca, E. M. (2005). "Quantifying molecular specificity of alphavbeta3 integrin-targeted optical contrast agents with dynamic optical imaging." J Biomed Opt 10(4):41205 10(3): 034019.

97. Hama, Y., Urano, Y., Koyama, Y., Choyke, P. L. and Kobayashi, H. (2007). "Activatable fluorescent molecular imaging of peritoneal metastases following pretargeting with a biotinylated monoclonal antibody." Cancer Res 67(8): 3809-3817.

98. Hanaoka, K., Lubag, A. J., Castillo-Muzquiz, A., Kodadek, T. and Sherry, A. D. (2008) . "The detection limit of a gd3H—based tl agent is substantially reduced when targeted to a protein microdomain." Magn Reson Imaging 26(5): 608617.

99. Hardman, R. (2006). "A toxicologic review of quantum dots: Toxicity depends on physicochemical and environmental factors." Environ Health Perspect 114(2): 116-172.

100. Hashimoto, T., Meng, H. and Young, W. L. (2006). "Intracranial aneurysms: Links among inflammation, hemodynamics and vascular remodeling." Neurological Research 28: 372-380.

101. Heiskala, J., Nissila, I., Neuvonen, T., Jarvenpaa, S. and Somersalo, E. (2005). "Modeling anisotropic light propagation in a realistic model of the human head." Appl Opt 44 (11): 2049-2057.

102. Henkelman, R. M. , Stanisz, G. J. and Graham, S. J. (2001). "Magnetization transfer in mri: A review." NMR Biomed 14(2): 57-64.

103. Heyn, C., Bowen, C. V., Rutt, B. K. and Foster, P. J. (2005). "Detection threshold of single spio-labeled cells with fiesta." Magn Reson Med 53(2): 312-320.

104. Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R. and Tung, C. H. (2005) . "Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications." Bioconj Chem 16(5): 1275-1281.

105. Hoffman, R. M. (2004). "Imaging tumor angiogenesis with fluorescent proteins." Apmis 112(7-8):441-9 112(7-8): 441449.

106. Hoffman, R. M. (2005). "In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins." Curr Top Dev Biol 70: 121-144.

107. Hooper, C. E., Ansorge, R. E., Browne, H. M. and Tomkins, P. (1990) . "Ccd imaging of luciferase gene expression insingle mammalian cells." JBioluminescence

108. Chemiluminescence 5(2): 123-130.

109. Hsieh, C. L., Xie, Z., Liu, Z. Y., Green, J. E., Martin, W.

110. D. , Datta, M. W., Yeung, F., Pan, D. and Chung, L. W. (2005). "A luciferase transgenic mouse model: Visualization of prostate development and its androgen responsiveness in live animals." J Mol Endocrinol 35(2): 293-304.

111. Inglese, M. and Ge, Y. (2004). "Quantitative mri: Hidden age-related changes in brain tissue." Top Magn Reson Imaging 15(6): 355-363.

112. Iqbal, S. and Lenz, H. J. (2004) . "Angiogenesis inhibitors in the treatment of colorectal cancer." Semin Oncol 31(6 Suppl 17): 10-16.

113. Jacobs, R. E., Ahrens, E. T., Meade, T. J. and Fraser, S.

114. E. (1999). "Looking deeper into vertebrate development." Trends Cell Biol 9(2): 73-76.

115. Jain, R. (1990) . "Vascular and interstitial barriers to delivery of therapeutic agents in tumors." Cancer Metastasis Rev 9: 253-266.

116. Jain, R. (1996). "Delivery of molecular medicine to solid tumors." Science 271: 1079-1080.

117. Jain, R., Schlenger, K., Hockel, M. and Yuan, F. (1997). "Quantitative angiogenesis assays: Progress and problems." Nature Medicine 3(11): 1203-1208.

118. Jain, R. K. (2001). "Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: A new paradigm for combination therapy. 28 refs." Nature Medicine. 7(9): 987-989.

119. Johnson, G. A., Benveniste, H., Black, R. D., Hedlund, L. W., Maronpot, R. R. and Smith, B. R. (1993). "Histology by magnetic resonance microscopy." Magn Reson Q 9(1): 1-30.

120. Kawai, Y., Sato, M. and Umezawa, Y. (2004). "Single color fluorescent indicators of protein phosphorylation for multicolor imaging of intracellular signal flow dynamics." Anal Chem 76 (20) : 6144-6149.

121. Kay, J. (1994). "Statistical models for pet and spect data." Stat Methods Med Res 3(1): 5-21.

122. Kim, S. B., Ozawa, T., Watanabe, S. and Umezawa, Y. (2004). "High-throughput sensing and noninvasive imaging of protein nuclear transport by using reconstitution of split renilla luciferase." Proc Natl Acad Sci USA 101 (32) : 11542-11547.

123. Kim, Y., Savellano, M. , Weissleder, R. and Bogdanov, A. J. (2002). "Steady-state and dynamic contrast mr imaging of human prostate cancer xenograft tumors: A comparative study." Techn Cancer Res Treat 1(1-7).

124. Kim, Y. R., Savellano, M. D., Savellano, D. H., Weissleder, R. and Bogdanov, A., Jr. (2004). "Measurement of tumor interstitial volume fraction: Method and implication for drug delivery." Magn Reson Med 52(3): 485-494.

125. Kim, Y. R., Savellano, M. D., Weissleder, R. and Bogdanov, A., Jr. (2002). "Steady-state and dynamic contrast mr imaging of human prostate cancer xenograft tumors: A comparative study." Technol Cancer Res Treat 1(6): 489-495.

126. Kircher, M. F., Mahmood, U., King, R. S., Weissleder, R. and Josephson, L. (2003) . "A multimodal nanoparticle for preoperative magnetic resonance imaging and intraoperative optical brain tumor delineation." Cancer Res 63(23): 81228125.

127. Kirsch, J. E. (1991). "Basic principles of magnetic resonance contrast agents." Top Magn Reson Imaging 3(2): 118.

128. Klebanoff, S. J. (2005). "Myeloperoxidase: Friend and foe." J Leukoc Biol 77(5): 598-625.

129. Klibanov, A. L. (2006). "Microbubble contrast agents: Targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications." Invest Radiol 41(3): 354-362.

130. Klibanov, A. L. (2007). "Ultrasound molecular imaging with targeted microbubble contrast agents." J Nucl Cardiol 14(6): 876-884.

131. Klohs, W. D. and Hamby, J. M. (1999) . "Antiangiogenic agents. 32 refs." Curr Opin Biotechnol 8(4):449-54 10(6): 544-549.

132. Kohn, S., Nagy, J. A., Dvorak, H. F. and Dvorak, A. M. (1992). "Pathways of macromolecular tracer transport across venules and small veins. Structural basis for the hyperpermeability of tumor blood vessels." Lab Invest 67(5): 596-607.

133. Kornguth, S., Anderson, M., Turski, P., Sorenson, J., Robins, H. I., Cohen, J., Rappe, A. and Markley, J. (1990).

134. Glioblastoma multiforme: Mr imaging at 1.5 and 9.4 t after injection of polylysine-dtpa-gd in rats." Ajnr: American J Neuroradiology 11(2): 313-318.

135. Kurhanewicz, J., Bok, R., Nelson, S. J. and Vigneron, D. B. (2008). "Current and potential applications of clinical 13c mr spectroscopy." J Nucl Med 49(3): 341-344.

136. Landis, C. S., Li, X., Telang, F. W., Molina, P. E., Palyka, I., Vetek, G. and Springer, C. S., Jr. (1999). "Equilibrium transcytolemmal water-exchange kinetics in skeletal muscle in vivo." Magn Reson Med 42(3): 467-478.

137. Larson, D. R. , Zipfel, W. R., Williams, R. M., Clark, S. W., Bruchez, M. P., Wise, F. W. and Webb, W. W. (2003). "Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo." Science 300(5624): 1434-1436.

138. Larson-, S. M. and Schoder, H. (2009). "New pet tracers for evaluation of solid tumor response to therapy." Q J Nucl Med Mol Imaging 53(2): 158-166.

139. Lauffer, R. B. (1987). "Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for nmr imaging: Theory and design." Chem. Rev. 87: 901-927.

140. Lauffer, R. B. (1990). "Mechanisms of magnetic resonance contrast enhancement by relaxivity and magnetic susceptibility agents." Invest Radiol 25 Suppl 1: S32-33.

141. Lauffer, R. B., McMurry, T. J., Dunham, S. O. , Scott, D. M., Parmelee, D. J. and Dumas, S. (1997). Bioactivated diagnostic imaging contrast agents. Application: WO

142. WO, (Epix Medical, Inc., USA). 80 pp.

143. Laxman, B., Hall, D. E., Bhojani, M. S., Hamstra, D. A., Chenevert, T. L., Ross, B. D. and Rehemtulla, A. (2002). "Noninvasive real-time imaging of apoptosis." Proc Natl Acad Sci USA 99(26): 16551-16555.

144. Lewin, M., Bredow, S., Sergeyev, N., Marecos, E., Bogdanov, A., Jr. and Weissleder, R. (1999). "In vivo assessment of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis." Int J Cancer 83(6): 798-802.

145. Lewin, M., Bredow, S., Sergeyev, N., Marecos, E., Bogdanov, A. J. and Weissleder, R. (1999) . What is the effect of tumoral vegf overproduction on mr imaging? Proc 7th Sci Mtg Int Soc Magn Reson Med, Philadelphia, PA, ISMRM.

146. Lewin, M., Clement, 0., Belguise-Valladier, P., Tran, L., Cuenod, C. A., Siauve, N. and Frija, G. (2001). "Hepatocyte targeting with gd-eob-dtpa: Potential application for gene therapy." Invest Radiol 36(1): 9-14.

147. Li, Z., Wang, K., Tan, W., Li, J., Fu, Z., Ma, C., Li, H., He, X. and Liu, J. (2006) . "Immunofluorescent labeling of cancer cells with quantum dots synthesized in aqueous solution." Anal Biochem 354(2): 169-174.

148. Lichtenbeld, H. C., Ferarra, N., Jain, R. K. and Munn, L. L. (1999) . "Effect of local anti-vegf antibody treatment on tumor microvessel permeability." Microvasc Res 57(3): 357362.

149. Lin, Y., Weissleder, R. and Tung, C. H. (2002). "Novel near-infrared cyanine fluorochromes: Synthesis, properties, and bioconjugation." Bioconj Chem 13(3): 605-610.

150. Locke, L. W. , Chordia, M. D., Zhang, Y., Kundu, B., Kennedy, D., Landseadel, J., Xiao, L., Fairchild, K. D., Berr, S. S., Linden, J. and Pan, D. (2009). "A novel neutrophil-specific pet imaging agent: CfIfIfk-peg-64cu." J Nucl Med 50 (5) : 790-797.

151. Louie, A. Y., Huber, M. M. , Ahrens, E. T., Rothbacher, U., Moats, R., Jacobs, R. E., Fraser, S. E. and Meade, T. J. (2000) . "In vivo visualization of gene expression using magnetic resonance imaging." Nat biotechnol 23(7):879-84 18(3): 321-325.

152. Lucignani, G. (2008). "Pet-mri synergy in molecular, functional and anatomical cancer imaging." Eur J Nucl Med Mol Imaging 35(8): 1550-1553.

153. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Fradkov, A. F., Labas, Y. A., Matz, M. V. and Lukyanov, S. (2006). "Discovery and properties of gfp-like proteins from nonbioluminescent anthozoa." Methods Biochem Anal 47: 121-138.

154. Mahmood, U., Tung, C. H., Bogdanov, A., Jr. and Weissleder, R. (1999) . "Near-infrared optical imaging of protease activity for tumor detection." Radiology 213(3): 866-870.

155. Manabe, Y., Longley, C. and Furmanski, P. (1986). "Highlevel conjugation of chelating agents onto immunoglobulins: Use of an intermediary poly(1-lysine)-diethylenetriaminepentaacetic acid carrier." Biochimica et Biophysica Acta 883(3): 460-467.

156. Marchal, G. , Bosnians, H., Van Hecke, P., Speck, U., Aerts, P., Vanhoenacker, P. and Baert, A. L. (1990). "Mr angiography with gadopentetate dimeglumine-polylysine: Evaluation in rabbits." Amer J Roentgenol 155(2): 407-411.

157. Marecos, E., Weissleder, R. and Bogdanov, A., Jr. (1998). "Antibody-mediated versus nontargeted delivery in a human small cell lung carcinoma model." Bioconj Chem 9(2): 184191.

158. Martin, W. R. (2007). "Mr spectroscopy in neurodegenerative disease." Mol Imaging Biol 9(4): 196-203.

159. Massoud, T. and Gambhir, S. (2003). "Molecular imaging in living subjects: Seeing fundamental biological processes in a new light." Genes and Development 17: 545-580.

160. Massoud, T. F. and Gambhir, S. S. (2007). "Integrating noninvasive molecular imaging into molecular medicine: An evolving paradigm." Trends Mol Med 13(5): 183-191.

161. Matsouka, H., Hamada, M. , Honda, T., Kawakami, H., Abe, M. , Shigematsu, Y., Sumimoto, T. and Hiwada, K. (1994). "Evaluation of acute myocarditis and pericarditis by gd-dtpa enhanced magnetic resonance imaging." Eur Heart J 15(2): 283-284.

162. Matz, M. V., Fradkov, A. F. , Labas, Y. A., Savitsky, A. P., Zaraisky, A. G. , Markelov, M. L. and Lukyanov, S. A. (1999). "Fluorescent proteins from nonbioluminescent anthozoa species." Nat Biotechnol 17(10): 969-973.

163. Matz, M. V., Lukyanov, K. A. and Lukyanov, S. A. (2002). "Family of the green fluorescent protein: Journey to the end of the rainbow." Bioessays 24(10): 953-959.

164. Mayer, B., Spatz, H., Funke, I., Johnson, J. P. and Schildberg, F. W. (1998) . "De novo expression of the cell adhesion molecule e-selectin on gastric cancer endothelium." Langenbecks Arch Surg 383(1): 81-86.

165. McDonald, D. M. and Choyke, P. L. (2003). "Imaging of angiogenesis: From microscope to clinic." Nature Med 9(6): 713-725.

166. Medarova, Z., Castillo, G., Dai, G., Bolotin, E., Bogdanov, A. and Moore, A. (2007). "Noninvasive magnetic resonance imaging of microvascular changes in type 1 diabetes." Diabetes56 (11)': 2677-2682.

167. Merbach, A. E. and Toth, E. (2001). The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. Chichester, John Wiley & Sons, Ltd.

168. Michalet, X., Pinaud, F. F., Bentolila, L. A., Tsay, J. M., Doose, S., Li, J. J., Sundaresan, G. , Wu, A. M. , Gambhir, S. S. and Weiss, S. (2005). "Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics." Science 307(5709): 538544.

169. Miyawaki, A. and Tsien, R. Y. (2000) . "Monitoring protein conformations and interactions by fluorescence resonance energy transfer between mutants of green fluorescent protein." Methods Enzymol 327: 472-500.

170. Moats, R. A., Fraser, S. E. and Meade, T. J. (1997). "A "Smart" Magnetic resonance imaging agent that reports on specific enzymatic activity." Angewandte Chemie Int.Ed. 36: 726-731.

171. Mohler, J. and Sharief, Y. (1993) . "Flow cytometric assay of pinocytosis: Correlation with membrane ruffling and metastatic potential in the dunning r-3327 rat prostatic adenocarcinoma model." Cytometry 14 (7) : 826-831.

172. Momota, H. and Holland, E. C. (2005) . "Bioluminescence technology for imaging cell proliferation." Curr Opin Biotechnol 16(6): 681-686.

173. Monici, M. (2005). "Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications." Biotechnol Annu Revll: 227-256.

174. Moore, A., Marecos, E., Bogdanov, A., Jr. and Weissleder, R. (2000). "Tumoral distribution of long-circulating dextran-coated iron oxide nanoparticles in a rodent model." Radiology 214 (2) : 568-574.

175. Moore, A., Marecos, E., Simonova, M., Weissleder, R. and Bogdanov, A. J. (1998). "Novel gliosarcoma cell line expressing green fluorescent protein: A model for quantitative assessment of angiogenesis." Microvascular Res 56: 145-153.

176. Moseley, M., White, D., Wang, S., Wikstrom, M. G., Dupon, J., Gobbel, G., Roth, K. and Brasch, R. (1989). "Vascular mapping using albumin-(gd-dtpa), an intravascular mr contrast agent, and projection mr imaging." J Comput Assist Tomoqr 30(3) : 525-34.

177. Murray, C. , Norris, D. and Bawendi, M. (1993). "Synthesis and characterization of nearly monodisperse cde (e = s, se, te) semiconductor nanocrystallites." J. Am. Chem. Soc. 115: 8706-8715.

178. Niu, G. and Chen, X. (2008). "Has molecular and cellular imaging enhanced drug discovery and drug development?" Drugs R D 9(6): 351-368.

179. Ntziachristos, V. (2006). "Fluorescence molecular imaging." Annu Rev Biomed Enq 8: 1-33.

180. Ntziachristos, V., Bremer, C. and Weissleder, R. (2003). "Fluorescence imaging with near-infrared light: New technological advances that enable in vivo molecular imaging." Eur Radiol. 13(1): 195-208.

181. Ntziachristos, V., Tung, C.-H., Bremer, C. and Weissleder, R. (2002). "Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo." Nature Medicine 8(7): 757-760.

182. Ntziachristos, V., Tung, C. H. , Bremer, C. and Weissleder, R. (2002) . "Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo." Nat Med 8(7): 757-760.

183. Ntziachristos, V. , Yodh, A. G. , Schnall, M. and Chance, B. (2000). "Concurrent mri and diffuse optical tomography of breast after indocyanine green enhancement." Proc Natl Acad Sci USA 97(6): 2767-2772.

184. Olivo, M. and Wilson, B. C. (2004). "Mapping ala-induced ppix fluorescence in normal brain and brain tumour using confocal fluorescence microscopy." Int J Oncol' 25(1): 3745.

185. Ono, M. , Torisu, H., Fukushi, J., Nishie, A. and Kuwano, M. (1999). "Biological implications of macrophage infiltration in human tumor angiogenesis. 19 refs. ." Cancer Chemother Pharmacol 43 Suppl: S69-71.

186. Otto-Duessel, M. , Khankaldyyan, V., Laug, W. E., Rosol, M., Gonzalez-Gomez, I. and Jensen, M. C. (2006). "In vivo testing of renilla luciferase substrate analogs in an orthotopic murine model of human glioblastoma." Mol Imag 5 (2) : 57-64.

187. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K. and Umezawa, Y. (2001). "Split luciferase as an optical probe for detecting protein-protein interactions in mammalian cells based on protein splicing." Anal Chem 73(11): 25162521.

188. Palmer, G. M. , Keely, P. J., Breslin, T. M. and Ramanujam, N. (2003). "Autofluorescence spectroscopy of normal and malignant human breast cell lines." Photochem Photobiol 78(5): 462-469.

189. Paulmurugan, R. and Gambhir, S. S. (2005). "Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening ofsmall molecule-mediating protein-protein interactions in cells and living animals." Cancer Res 65(16): 7413-7420.

190. Paulmurugan, R. , Massoud, T. F. , Huang, J. and Gambhir, S. S. (2004). "Molecular imaging of drug-modulated proteinprotein interactions in living subjects." Cancer Res 64(6): 2113-2119.

191. Perman, W. H., Gado, M. H., Larson, K. B. and Perlmutter, J. S. (1992). "Simultaneous mr acquisition of arterial and brain signal-time curves." Magn Reson Med 28(1): 74-83.

192. Peters, A. M. (1998). "The use of nuclear medicine in infections. 63 refs." Br J Radiol 71(843): 252-261.

193. Peters, A. M., Osman, S., Reavy, H. J., Chambers, B., Deenmamode, M. and Lewis, S. M. (1986). "Erythrocyte radiolabelling: In vitro comparison of chromium, technetium, and indium in undamaged and heat damaged cells." J Clin Pathol 39(7): 717-721.

194. Petrovsky, A., Schellenberger, E., Josephson, L. , Weissleder, R. and Bogdanov, A., Jr. (2003). "Near-infrared fluorescent imaging of tumor apoptosis." Cancer Res. 63(8): 1936-1942.

195. Phelps, M. E. (2000). "Inaugural article: Positron emission tomography provides molecular imaging of biological processes." Proc Natl Acad Sci USA 97(16): 9226-9233.

196. Pichler, B. J., Wehrl, H. F. and Judenhofer, M. S. (2008). "Latest advances in molecular imaging instrumentation." J Nucl Med 49 Suppl 2: 5S-23S. ~~

197. Piston, D. W., Masters, B. R. and Webb, W. W. (1995). "Three-dimensionally resolved nad(p)h cellular metabolic redox imaging of the in situ cornea with two-photon excitation laser scanning microscopy." J Microscopy 178(Pt 1): 20-27.

198. Pitterle, D. M., Sperling, R. T., Myers, M. G., Jr., White, M. F. and Blackshear, P. J. (1999) . "Early biochemical events in insulin-stimulated fluid phase endocytosis." Amer J Physiol 276(1 Pt 1): E94-E105.

199. Port, M., Idee, J. M. , Medina, C., Robic, C. , Sabatou, M. and Corot, C. (2008). "Efficiency, thermodynamic and kinetic stability of marketed gadolinium chelates and their possible clinical consequences: A critical review." Biometals 21(4): 469-490.

200. Querol, M. and Bogdanov, A., Jr. (2006). "Amplification strategies in mr imaging: Activation and accumulation of sensing contrast agents (seas)." J Magn Reson Imag 24(5) : 971-982.

201. Querol, M. and Bogdanov, A., Jr. (2008). "Environmentsensitive and enzyme-sensitive mr contrast agents." Handb Exp Pharmacol(185 Pt 2): 37-57.

202. Querol, M., Chen, J. and Bogdanov, A., Jr (2006). "A paramagnetic contrast agent with myeloperoxidase-sensing properties." Org. Biomol. Chem. 4: 1887 1895.

203. Querol, M. , Chen, J. W., Weissleder, R. and Bogdanov, A., Jr. (2005). "Dtpa-bisamide-based mr sensor agents for peroxidase imaging." Org Lett 7(9): 1719-1722.

204. Racoosin, E. L. and Swanson, J. A. (1989). "Macrophage colony-stimulating factor (rm-csf) stimulates pinocytosis in bone marrow-derived macrophages." J Exp Med 170(5): 1635-1648.

205. Racoosin, E. L. and Swanson, J. A. (1993). "Macropinosome maturation and fusion with tubular lysosomes in macrophages." J Cell Biol 121(5): 1011-1020.

206. Rahmim, A. and Zaidi, H. (2008) . "Pet versus spect: Strengths, limitations and challenges." Nucl Med Commun 29(3): 193-207.

207. Reichardt, W. , Hu-Lowe, D., Torres, D., Weissleder, R. and Bogdanov, A., Jr. (2005). "Imaging of vegf receptor kinase inhibitor-induced antiangiogenic effects in drug-resistant human adenocarcinoma model." Neoplasia (New York) 7(9): 847-853.

208. Ripoll, J., Yessayan, D. , Zacharakis, G. and Ntziachristos, V. (2005). "Experimental determination of photon propagation in highly absorbing and scattering media." J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis 22(3): 546-551.

209. Rowland, D. J. and Cherry, S. R. (2008). "Small-animal preclinical nuclear medicine instrumentation and methodology." Semin Nucl Med 38(3): 209-222.

210. Roy, R. and Sevick-Muraca, E. (1999). "Truncated newton's optimization scheme for absorption and fluorescence optical tomography: Part i theory and formulation." Opt Express 4(10): 353-371.

211. Rudin, M. and Weissleder, R. (2003). "Molecular imaging in drug discovery and development." Nat Rev Drug Discov 2(2): 123-131.

212. Runnels, J. M. , Zamiri, P., Spencer, J. A., Veilleux, I., Wei, X., Bogdanov, A. and Lin, C. P. (2006). "Imaging molecular expression on vascular endothelial cells by in vivo immunofluorescence microscopy." Mol Imag 5(1): 31-40.

213. Sarikaya, I., Sarikaya, A. and Holder, L. E. (2001). "The role of single photon emission computed tomography in bone imaging." Semin Nucl Med 31(1): 3-16.

214. Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T. and Umezawa, Y. (2002). "Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells." Nature Biotechnol 20: 287-294.

215. Schellenberger, E. A., Bogdanov, A., Jr., Petrovsky, A., Ntziachristos, V., Weissleder, R. and Josephson, L. (2003). "Optical imaging of apoptosis as a biomarker of tumor response to chemotherapy." Neoplasia 5(3): 187-192.

216. Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R. and Josephson, L. (2004). "Magneto/optical annexin v, a multimodal protein." Bioconjug Chem 15(5): 1062-1067.

217. Serganova, I., Mayer-Kukuck, P., Huang, R. and Blasberg, R. (2008). "Molecular imaging: Reporter gene imaging." Handb Exp Pharmacol(185 Pt 2): 167-223.

218. Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P. and Gurfinkel, M. (2002). "Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents." Curr Opin Chem Biol 6(5): 642-650.

219. Shabani, F., McNeil, J. and Tippett, L. (1998). "The oxidative inactivation of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (timp-1) by hypochlorous acid (hoci) is suppressed by anti-rheumatic drugs." Free Radic Res 28(2): 115-123.

220. Shapiro, S. D. (1999). "Diverse roles of macrophage matrix metalloproteinases in tissue destruction and tumor growth. 25 refs." Thrombosis & Haemostasis 82(2): 846-849.

221. Shen, T., Weissleder, R. , Papisov, M. , Bogdanov, A. and Brady, T. (1993). "Monocrystalline iron oxide nanocompounds (mion): Physiochemical properties." Magn Reson Med 29: 599604.

222. Sherry, A. D. and Woods, M. (2008). "Chemical exchange saturation transfer contrast agents for magnetic resonance imaging." Annu Rev Biomed Eng 10: 391-411.

223. Shoenut, J. P., Semelka, R. C., Silverman, R. , Yaffe, C. S. and Micflikier, A. B. (1993). "Magnetic resonance imaging in inflammatory bowel disease." J Clin Gastroenterol 17(1): 73-78.

224. Signore, A., Annovazzi, A., Corsetti, F. , Capriotti, G., Chianelli, M., De Winter, F. and Scopinaro, F. (2002). "Biological imaging for the diagnosis of inflammatory conditions." BioDrugs 16(4): 241-259.

225. Sikora, M., Interewicz, B. and Olszewski, W. L. (2005). "Contemporary methods for detection of microbial infections in transplanted tissues." Ann Transplant 10(4): 11-16.

226. Sipkins, D. A., Cheresh, D. A., Kazemi, M. R., Nevin, L. M., Bednarski, M. D. and Li, K. C. (1998). "Detection of tumor angiogenesis in vivo by alphavbeta3-targeted magnetic resonance imaging." Nature Med 4(5): 623-626.

227. Sipkins, D. A., Wei, X., Wu, J. W., Runnels, J. M. , Cote, D., Means, T. K. , Luster, A. D., Scadden, D. T. and Lin, C. P. (2005). "In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment." Nature 435(7044): 969-973.

228. Skouri, H. N., Dec, G. W. , Friedrich, M. G. and Cooper, L. T. (2006). "Noninvasive imaging in myocarditis." J Am Coll Cardiol 48 (10) : 2085-2093.

229. So, M. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S. and Rao, J. (2006). "Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging." Nat Biotechnol 24(3): 339-343.

230. Sosnovik, D. E., Nahrendorf, M. and Weissleder, R. (2008). "Targeted imaging of myocardial damage." Nat Clin Pract Cardiovasc Med 5 Suppl 2: S63-70.

231. Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S. and Liotta, L. A. (1993). "Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. 189 refs." Ann Rev Cell Biol 9: 541-573.

232. Stevens, D. L., Bryant, A. E., Huffman, J., Thompson, K. and Allen, R. C. (1994). "Analysis of circulating phagocyte activity measured by whole blood luminescence: Correlations with clinical status." J Infect Pis 170(6): 1463-1472.

233. Tanaka, F., Miyahara, R., Ohtake, Y., Yanagihara, K., Fukuse, T., Hitomi, S. and Wada, H. (1998). "Lewis y antigen expression and postoperative survival in non-small cell lung cancer." Ann Thorac Surg 66(5): 1745-1750.

234. Tofts, P. S. and Kermode, A. G. (1991) . "Measurement of the blood-brain barrier permeability and leakage space using dynamic mr imaging. 1. Fundamental concepts." Magn Reson Med 17: 357-367.

235. Torchilin, V., Ed. (1995). Handbook of targeted delivery of imaging agents. Boca Raton FL, CRC Press.

236. Toth, E., Helm, L. and Merbach, A. E. (2002). "Relaxivity of mri contrast agents." Top Curr Chem 221(Contrast Agents I): 61-101.

237. Trehin, R. , Figueiredo, J. L., Pittet, M. J., Weissleder, R., Josephson, L. and Mahmood, U. (2006). "Fluorescent nanoparticle uptake for brain tumor visualization." Neoplasia (New York) 8(4): 302-311.

238. Trokowski, R., Ren, J., Kalman, F. K. and Sherry, A. D. (2005) . "Selective sensing of zinc ions with a paracest contrast agent." Angew Chem Int Ed Engl 44(42): 6920-6923.

239. Tsien, R. Y. (1998). "The green fluorescent protein." Annu Rev Biochem 67: 509-544.

240. Tsui, B. M. (1996). "The aapm/rsna physics tutorial for residents. Physics of spect." Radiographics 16(1): 173-183.

241. Tung, C. H., Bredow, S., Mahmood, U. and Weissleder, R. (1999). "Preparation of a cathepsin d sensitive near-infrared fluorescence probe for imaging." Bioconj Chem 10(5): 892-896.

242. Valadon, P., Garnett, J. D., Testa, J. E., Bauerle, M. , Oh, P. and Schnitzer, J. E. (2006). "Screening phage displaylibraries for organ-specific vascular immunotargeting in vivo." Proc Natl Acad Sci USA103(2): 407-412.

243. Veithen, A., Cupers, P., Baudhuin, P. and Courtoy, P. J. (1996) . "V-src induces constitutive macropinocytosis in rat fibroblasts." J Cell Sci 109: 2005-2012.

244. Veronese, M. L. and O'Dwyer, P. J. (2004). "Monoclonal antibodies in the treatment of colorectal cancer." Eur J Cancer 40(9): 1292-1301.

245. Vexler, V., Berthezene, Y., Clement, O., Muhler, A., Rosenau, W. , Moseley, M. and Brasch, R. (1992). "Detection of zonal renal ischemia with contrast-enhanced mr imaging with a macromolecular blood pool contrast agent." J Magn Reson Imag 2: 311-319.

246. Vexler, V. S., Clement, O., Schmitt-Willich, H. and Brasch, R. C. (1994) . "Effect of varying the molecular weight of the mr contrast agent gd-dtpa-polylysine on blood pharmacokinetics and enhancement patterns." J Magn Reson Imag 4 (3): 381-388 .

247. Wadas, T. J., Wong, E. H., Weisman, G. R. and Anderson, C. J. (2007) . "Copper chelation chemistry and its role in copper radiopharmaceuticals." Curr Pharm Pes 13(1): 3-16.

248. Wang, W., Ke, S., Wu, Q., Charnsangavej, C., Gurfinkel, M. , Gelovani, J. G., Abbruzzese, J. L., Sevick-Muraca, E. M. and Li, C. (2004). "Near-infrared optical imaging of integrin alphavbeta3 in human tumor xenografts." Mol Imag 3(4): 343-351.

249. Ward, K. M. and Balaban, R. S. (2000). "Determination of ph using water protons and chemical exchange dependent saturation transfer (cest)." Magn Reson Med 44(5): 799-802.

250. Weisskoff, R. M., Zuo, C. S., Boxerman, J. L. and Rosen, B. R. (1994). "Microscopic susceptibility variation and transverse relaxation: Theory and experiment." Magn Reson Med 31 (6): 601-610.

251. Weissleder, R. (2002). "Scaling down imaging: Molecular mapping of cancer in mice." Nature Revs Cancer 2(1): 1-8.

252. Weissleder, R. (2006). "Molecular imaging in cancer." Science 312(5777): 1168-1171.

253. Weissleder, R., Bogdanov, A., Jr., Tung, C. H. and Weinmann, H. J. (2001). "Size optimization of synthetic graft copolymers for in vivo angiogenesis imaging." Bioconj Chem 12 (2) : 213-219.

254. Weissleder, R., Bogdanov, A. and Papisov, M. (1992). "Drug targeting in magnetic resonance imaging." Mag Res Quart 8(1): 55-63.

255. Weissleder, R. , Cheng, H. C., Marecos, E., Kwong, K. and Bogdanov, A., Jr. (1998). "Non-invasive in vivo mapping of tumour vascular and interstitial volume fractions." Eur J Cancer 34(9): 1448-1454.

256. Weissleder, R., Heautot, J. F. , Schaffer, B. K. , Nossiff, N., Papisov, M. I., Bogdanov, A., Jr. and Brady, T. J. (1994). "Mr lymphography: Study of a high-efficiency lymphotrophic agent." Radiology 191(1): 225-230.

257. Weissleder, R. and Mahmood, U. (2001). "Molecular imaging. " Radiology 219(2): 316-333.

258. Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U. and Bogdanov, A., Jr. (1999) . "In vivo imaging of tumors with proteaseactivated near-infrared fluorescent probes." Nat Biotechnol 17 (4) : 375-378.

259. Weissleder, R. , Wang, Y. M. , Papisov, M., Bogdanov, A., Schaffer, B., Brady, T. J. and Wittenberg, J. (1993). "Polymeric contrast agents for mr imaging of adrenal glands." J Magn Reson Imag 3(1): 93-97.

260. Welsh, S. and Kay, S. A. (1997). "Reporter gene expression for monitoring gene transfer. 62 refs." Curr Opin Biotechnol 8(5): 617-622.

261. Wernick, M. N., Infusino, E. J. and Milosevic, M. (1999). "Fast spatio-temporal image reconstruction for dynamic pet." IEEE Trans Med Imaging 18(3): 185-195.

262. West, J. L. and Halas, N. J. (2003). "Engineered nanomaterials for biophotonics applications: Improving sensing, imaging, and therapeutics." Nanomaterials 5:28592.

263. Wolff, S. D. and Balaban, R. S. (1989). ."Magnetization transfer contrast (mtc) and tissue water proton relaxation in vivo." Magn Reson Med 10(1): 135-144.

264. Wood, M. L. and Hardy, P. A. (1993). "Proton relaxation enhancement." J Magn Reson Imag 3(1): 149-156.

265. Wu, J., Perelman, L., Dasari, R. R. and Feld, M. S. (1997). "Fluorescence tomographic imaging in turbid media using early-arriving photons and laplace transforms." Proc Natl Acad Sci U S A 94 (16) : 8783-8788 .

266. Wuest, F. (2007). "Fluorine-18 labeling of small molecules: The use of 18f-labeled aryl fluorides derived from no-carrier-added 18f.fluoride as labeling precursors." Ernst Scherinq Res Found Workshop ( 62): 51-78.

267. Yarnykh, V. L. and Yuan, C. (2002) . "Tl-insensitive flow suppression using quadruple inversion-recovery." Magn Reson Med 48 (5) : 899-905.

268. Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Turaa, R. F. and Jain, R. K. (1994) . "Vascular permeability and microcirculation of glioma and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows." Cancer Res 54: 4564-4568.

269. Zacharakis, G., Kambara, H., Shih, H., Ripoll, J., Grimm, J., Saeki, Y. , Weissleder, R. and Ntziachristos, V. (2005). "Volumetric tomography of fluorescent proteins through small animals in vivo." Proc Natl Acad Sci USA 102(51): 18252-18257.

270. Zador, Z., Stiver, S., Wang, V. and Manley, G. T. (2009). "Role of aquaporin-4 in cerebral edema and stroke." Handb Exp Pharmacol (190): 159-170.

271. Zaharchuk, G., Bogdanov, A. A., Jr., Marota, Shimizu-Sasamata, M., Weisskoff, R. M., Kwong, Jenkins, B. "Continuous volume and1. J. J. , K. K. ,

272. E. and Frangioni, for near-infrared 354-364.

273. J. V. (2002). fluorescence

274. Zenita, K., Kirihata, Y., Kitahara, A., Shigeta, K. , Higuchi, K., Hirashima, K., Murachi, T., Miyake, M. , Takeda, T. and Kannagi, R. (1988). "Fucosylated type-2 chain polylactosamine antigens in human lung cancer." Int J Cancer 41(3): 344-349.

275. Zhang, S., Merritt, M., Woessner, D. E., Lenkinski, R. E. and Sherry, A. D. (2003). "PARACEST agents: Modulating mricontrast via water proton exchange." Acc Chem Res 36(10): 783-790.

276. Zhang, S., Winter, P., Wu, K. and Sherry, A. D. (2001). "A novel europium(iii)-based mri contrast agent." J Am Chem Soc 123 (7): 1517-1518.

277. Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W., Guy, J. and Muzyczka, N. (1996). "A "Humanized" Green fluorescent protein cdna adapted for high-level expression in mammalian cells." J. Virology 70(7): 4646-4654.9 h

Информация о работе

Богданов, Алексей Алексеевич
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Молекулярная визуализация физико-химических процессов в живых системах при помощи биосовместимых зондов: новые подходы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы