Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модельные системы для изучения температурной и гормональной регуляции накопления м РНК хлоропластных белков

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Модельные системы для изучения температурной и гормональной регуляции накопления м РНК хлоропластных белков"

ИОСКОВСКИЯ ОРДЕНА ЛШНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВ СТО КРАСНОГО 8НАЫЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫ! УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.1ШОН ОСОБА

БИСШСГИЧЕСКй! ФАКУЛЬТЕТ »

На правах рукописи

Мостафа Ибрагим Сарват Ахмед

МСДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ТЕМПЕРАТУРНОЙ. И. ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ НАКОПЛЕНИЯ „РНК ХЛОРОПЛАСТНЫХ БЕЛКОВ.

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1991

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии раотевий им.К.А.Тимирявева АН СССР в биохимической лаборатории экспреооии геноиа растений.

Научный.руководитель - доктор биологических наук,

профососр О.Н.Кулаева.

Официальные оппоненты « доктор биологических наук Т.И.Трунова

доктор биологических наук Н.П.Юрина

Ведущее учреждение .Московская ссльскохозястсвснная акайгмия им. К. Я. Тимирязева

СХ/Ло/Л- «

8ацита состоится 0 "ноября 1991 года на заседания Специализ рованногр ПРИ Московском Государственном

университете им, М.ВЛомоносова по адресу: П9899, г.Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

: с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологичес факультета МГУ им. М.В,Ломоносова.

Автореферат разослан * 199т года.

!

, Учёный секретарь Специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы становится очевидные, что фитогормонам принадлежат сучествеявая роль в ответе растений аа отрессовые воздействия к адаптации к экстремальный условиям (Сатарова и Творус, 1971; Бутенко и др. 1982; Бочарова и др.1988; Шевелуха и др. 1983, I9ö5; Кулаева и Чайлахян, 1904; Sachs and НО 1986; Lanka. 1986; Цуромцев И др. 1987; Творус И др. 1987). Это открывает перспективу научения способов вациты растений от неблагоприятных условий о помощью фитогормонов и синтетических биорегуляторов. В этой связи определенный интерес представляю* • цитокинины (Кулаева, 1973) и полученные на основе поиска их синтетических аналогов - картолины (Баскаков и др. 1988), а- также абсцизовая кислота а брассиностероиды. Цитокинины повышают устой- ( чизость растений к самым различный неблагоприятным воздействиям, включая рентгеновское облучение (Свешникова и др. 1970), повышенные концентрации солей (Бессонова я др.1985), низкие температуры (Туканов и др.1976), грибная и вирусная инфекции, действие антибиотиков и других химических агентов (Кулаева, 1973), недостаток света (Чернядьев, 19о9).

Картолины обладают специфическим спектром физиологической активности, существенно отлмчащийся от цитокининов (Баскаков и др. .1988, Еурханова и др. 1984). Картолин повышает устойчивость клеток и целых растений к отрицательным температурам (Бутенко и др. 19Ь2; Бочарова и др. 1983; фаизуллин и др.,1986; Трунова и др. 1988)., к засухе (Шевелуха и др. 1983, 1985, 1987; Шареккова и др. 1983; Творус и др. 1987; Кислякова и др. 1989), к заражению мучнистой росой (Шакирова и др. 1985).

АБК участвует в реакции растения на стрессовые воздействия (Кулаева я Чайлахян 1984, Кефели и др. 1989',,Яосаковская и др. 1989). Этот гормон накапливается в тканях растений в ответ на . .

водный дефицит ( VTrigth 1969, 1977; Herfen it al. ,1981 ;i9öi;; Uundy et al. ,1988; Gomez et al, 1988)пониженные температуры { Chen et al 1983; Zhang et al 1986), вирусную инфекцию ( W ha ah am et al. ,1980,1986 ), затемнение (Guinn, 1982). Способность к синтезу АБК в ответ на обезвоживание коррелирует у ряда растений с устойчивостью к аасухе. АБК увеличивает адаптацию КЛеТОК К ааСОЛеНИЮ ( La Roaa et al., 1985).

Ерассиностероиды повышают устойчивость растений к неблагоприятным условиям внешней среды ( Mitchell et al., 1970 ? Gregory 1981, Капдан и др. ХЭЬ7; Кулаева и др. 19а9, Балина и Кулаева, 1990).

Приведенные сведения делали целесообразным изучить возможность антистрессового действия перечисленных типов биорегуляторе] г.а проростки пшеницы в условиях 3®. Тепловой шок является одним из характерных стрессовых факторов в растениеводстве таких южных стран как Египет, поэтому он был выбран нами для изучения.

Поскольку ваша вадача состояла в разработке модельной системы для изучения действия антистрессовых биорегуляторов на экспре сию хлеропластного генома, представлялось интересным в первую очередь исследовать соединения, активирующие развитие хлоропласт вого аппарата: цитокинивы (Курсанов и др. 1964, Микулович и др. 1969, Кулаева 1973, ХсЯслова и др. 197b, Каравайко и др^ 1970) я картолины (Шевелуха и др. lSb3, I9»5, ISö7, Кислякова и др. 19Ь9

Цель, и задачи исследования. Цель работы состояла в поиске физиологически активных соединений, защищающих проростки п^ниць k от И, разработке модельной системы для изучения защитного дейса вия этих соединений и исследовании их влияния иа акспресоию хло]

пластных и ядерных генов, ответственных за формирование хлорогш » ♦

- 2 -

стов у нормальных и стрессированных проростков.

Для сравнения была разработана такае модельная система для изучения температурной и гормональной регуляции экспрессии геноз в изолированных сеиядолях люпина.

Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить температурные характеристики реакции на тепловой шок у проросткоз пиеници.

2. Разработать иодельнуа .систему оценки антистрессового действия биорегуляторов при тепловой поко.

3. Исследовать в этой системе цитокишгаы, абсцизовую кислоту,' брассиносхероиды и карталин-2.

4. Изучить действие препаратов, проявивших антистрессовую активность на экспрессию генов хлоропластных белков.

5. Использовать другие иоделыше системы с двудольными растениями для изучения температурной я гормональной регуляции накопления ЦРНК хлоропластных белков.

1ерВ5тес.йал. и.ддакигсадвая. цеиападь-раДодц..

Разработана иодельная систеиа для изучения антистрессового действия биорегуляторов на проростки пшеницы в условиях ТШ. Показана эффективность антистрессового действия К-2. Найдены оптимальные условия для проявления его защитного действия. Обнаружено стимулирующее действие К-2 на накопление иРНК генов хлоропластных белков, как хлоропластного, так и ядерного геномов в условиях ТШ.

Полученные результаты открывают перспективу дальнейших исследований защитного действия биорегуляторов в стрессовых условиях на экспрессию хлоропдастного и ядерного геномов.

Усовершенствование другой модельной системы (изолированные семядоли люпина жёлтого) для изучения гормональной регуляции формирования хлоропластного аппарата показало/ что эта система такзе

- 3 -

может быть использована в дальнейшей для исследования действия фнтотормонов в условиях DU. Эта система используется в настоящее время в работе, проводимой ИФР АН СССР совместно с ивститутои боганики Шонхенокого университета.

Разработанные модельные системы в виду простоты, надёжности и воспроизводимости йогу* найти применение для студенческих практикумов в университетах и cjtx институтах.

Апрпбяпия работы. Основные результаты работы были представлены на 14-ой международной конференции по регуляторам роста рао-тений (Амстердам, 1991).

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит ■ . ив введения, обзора литературы, описания объектов и методов иссле-; дования, изложения полученных результатов и их обсувдения, заключения, выводов и списка использованной литературы.

Диссертационная работа изложена на föß страницах машинописного текста, содержит £ таблицы рисунков. Список цитируемой литературы включает наименований, из которых -/ТС на иностранных языках.

ЦАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами нааих исследований были проростки пшеницы 2-х сортов: "иосковская-ЗЗ" ( Tritloum vulgare, I ) и "Опал *2 69" (Tritioum aestivua, L ), на них отрабатывалась модельная, система для изучения биорегуляторов антистрессового действия. Их вы. . бор определялся большой практической значимостью пшениц и актуальностью исследования препаратов, повышающих их устойчивое... в етрессовых условиях. Большая часть работы была выполнена на высокопродуктивной, но малоустойчивом сорте "Опал te 69". Подбор препаратов антистрессового действия для-таких сортов особенно важен.

Семена пшеницы стерилизовали'0,3% раствором KllaO^ (10-15 jura.), замачивали в дистиллированной воде, раскладывали в кюветы

- Ч -

и проращивали па увлажненной фильтровальной бумаге при 23°С на свету, в течение 72 часов. Обработка проростков фитогормояами и выбор юс концентраций описывается в экспериментальной части. Проростки подвергались тепловому шоку (I час), после чего они продолжала расти при нормальной температуре (23°С). Через определенные интервалы времени (24, 72, 96 час) в проростках определяли накопление биомассы надземных органов, корней и содержание хлорофилла, Специальные опыты были поставлены по предпосевной обработке семян ппеницы биорегуляторами. Разработанная и охарактеризованная модельная система была применена для исследования влияния биорегуляторов антистрессового действия па содержание транскриптов генов хлоропластных белков в послеаоковый период. Это позволяло получить представление о защитном действии биорегуляторов на хло-ропластный геном.

Отдельные опыты по влиянию стресса и фяи'огориояов на экспрессию хлоропластных генов были поставлены также на изолированных семядолях люпина желтого ( Ьир1пив 11^виэ ), которые были привлечены ввиду их высокой чувствительности и фитогормонам (Заякин, 1990). Цитокинин активирует развитие в них хлоропластного аппарата, а АБХ - ингибирует этот процесс.

Семена люпина проращивали на влажной фильтровальной бумаге л темноте, при 28°С в течение 72 чаев. У 8-х суточных проростков отрезали семядоли и выдерживали их 24 часа в темноте на воде. Затем изолированные' семядоли перекладывали на растворы исследуемых веществ на 12 часов и далее переносили на свет. Длительность теплового шока для семядолей люпина составляла 2 часа.

У проростков и семядолей периодически определяли сырой вес и содержание хлорофилла. Хлорофилл экотрагиррвали 8с$ ацетоном, измеряли оптическую плотность при 665 ни и >649 им и рассчитывали

по формуле (Аверина, Шлнк, 1972). Нуклеиновые кислоты экстрагировали по методу Шмидта и тангауаера ( Schmidt,.тьапьаиввг, 1945) в модификации Вольгина и Партье (Woilghien, r&r.tbier, 1964) иа растительного материала, предварительно обработанного по методу Нечаевой (Нечаева, 1966). Тотальную РНК выделяли методов фенольной депротеинизации с последующим осаждением РНК 2U Li-Jl (Weathoff et al. 1981).

Методы молекулярного клонирования: рестрикция плазмвдной ДНК, электрофоров РНК, ДНК, НЖ-трансляция, трансформация клеток s.ooli осуществлялись so стандартный методикам (Маниатис и др. 19Й4). Для определения количества транскриптов исследуемых генов ■ проводили дот- гибридизацию и иозерн-гибридизацию. При дот-гибридизации тотальную РНК, изолированную из растительного материала i нанесенную на нитроцеллюлозвый фильтр (НЦФ) гибридизовали с

ар

моченными Р с ~лцоадью ник-трансляции плавмидными ДНК, содержании исследуемые хлоропластвые гены. Гибридизация проводилась в стандартных условиях, с формамидом, при « 42°С (Каниатис я др. 19^4). В процессе иозерн-гибрвдизации, тотальная РНК предваритедь но фракционировалась в ЭЛАГ, с поел едущим перенесением РНК ва вейлоновый фильтр (НФ) методом "блоттинга ( Alwine у.с. et al., , 1979) и затеи гибридизовалась с указанными выше юшзмидами флюо-рограммы сканировались на денситометре1' "Chromatogxazni' Densitometer, cd-50" (Deaaga., ФРГ). Гены, клонированные в соста-. ве различите плазмид, представлены профессором 1еррманн ом (Мюнхенский университет, ФРГ), sa что мы выражаем ему глубокую зго-дарность.

Опыты проводились в З-х-5-ти химических повторностях я 3-х

биологических. j

• •

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Хеипевахудвая характеристика роста яоднвй а,, проростков дшеаш,н.а..вакоплевия в них хворофилла.

При разработке «сдельной системы, для изучения реакции проростков ппеницы на стресс, было исследовано влияние теплового шока в широкой диапазоне температур (от 85 до 46°С) на последующий рост биомассы корней и побегов и накопление хлорофилла в проростках ппеницы двух сортов - "Московская 85" и "Опал Кг 69". Как показывает рис.1А, ТШ в течение I часа при нагреве до 40° и выше, существенно угнетал рост корней, которые оказались наименее реэи-стентды к ТШ. Рост побегов и накопление хлорофилла подавлялись в аеныаей степени и при более высоких .температурах (рис.1.Б,В). М при 42-44°С существенна икгибировал эти процессы, а при 46° вызывал последующую гибель проростков пшеницы "Московская-85". Гибель проростков оорта "Опал » 69й происходила после ТШ при 45°.

Полученные характеристики позволили выделить для дальнейшей работы 2 интервала температур: 4О440С, которые выаывали угнетение роста и биосинтеза хлорофилла и 45°-46°С, после которых происходила гибель большей часта проростков. Это позволило перейти к изучению, в первом диапазоне температур," снижения ингибирующего действия ПП на рост и накопление хлорофилла под влиянием биорегуляторов, а во втором диапазоне - на снижение под воздействием биорегуляторов % гибели проростков от ТШ.

2. Взияниб, биорегуляторов ва. адрас.ср.еэистея.тиоояг - пров.рсгкса лиев ими,

На основе проделанной работы мы перешли к изучению антистрессового действия биорегуляторов на проростки ппеницы в условиях ТШ. Изучалось антистрессовое действие следующих биорегуляторов: синтетического цитокинина - б-бензиламинопурина '(-6-БАП) в концентра- 7 -

ОКЕМА ОПЫТА

Т Ш

23 —4—

3 су?.

м

1 ЧАС

2 3 А

.. „ СУТКИ HjO

А ВЕС КОРНЯ МГ <о 4

43 42 43 44 43

РИС. I

23

33

49 42 43 44 43

А. ХЛОРОФИЛЛ, МГ/Г

IfiOO ,

ДО дм

ТЕМПЕРАТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЙСТВИЯ ТШ НА РОСТ КОРНЕЙ ( А ) И ПОБЕГОВ С Б ) И СОДЕРЖАНИЕ ХЛОРОФИДДА ( В )

У ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ СОРТА ОПАЛ_ ПРОРОСТКИ БРАЛИ ДЛЯ АНАЛИЗА ЧЕРЕЗ 2,3,4 СУТОК ПОСЛЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА( ЦИФРЫ НА КРИВЫХ'

23

г "' 35

40 42 43 44 43'

_ а -

цвях 1(Гв-1СГ811, абсцизовой кислоты (АБК) (М^-КГ5«), гомобрао-оинолида (1СГ10-1(Г7И) я картолина-2 (К-2) (КГ^-Ю'^). Схема опытов по подбору условий обработки растительного материала биорегуляторами показала на рис.2.

Нам не удалось обнаружить защитное действие 6-БАП, АБК и го-цобрассинолида на проростки пшеницы в условиях ТШ при наученных постановках опытов. К-2 проявил защитный аффект. Ыы исследовали влияние К-2 (1СГ^-Ю~^М) при различных постановках опытов: его давали до, во время и после нагрева проростков (рис.2). Предоставленный до и в течение ТШ X час), К-2 способствовал гибели проростков. После нагрева К-2 был иало эффективен. Положительный эффект был получен когда К-2 (Ю"^И) давали до и после-нагрева. На 8-ий день после Ш в контроле ва воде оставалось 80% живых проростков, а в присутствии К-2 (Ю"5И) - 85%. Специальный контроль был поставлен на препарат-Твин-ьо, в котором растворялся К-2. Твин-йО не оказывал защитного действия. 8шдитный эффект К-2 при указанной постановке опытов не был стабильным.

Неблагоприятным было также угнетение роста, корней неотресси-рованных раотений. Кроме того, длительная обработка проростков К-2 могла приводить к его накоплению в тканях растения* что крайне нежелательно. Поэтому в последующем мы исследовали возможность обработки К-2 семян. Ранее было показано, что при обработке карто- '.'¡' л ином семян ячменя повышалась засухоустойчивость растений (Творус и др. 1987), а также их термотолерантнооть (Ефремов, Кулаева,1990). ! Обработка картолином повышала морозоустойчивость раотений (Бутен- | ко и др.,1982, Бочарова и др.,1963, Трунова и др.,198а). Поэтому ! мы считали целесообразным изучить влияние К-2 на стрессрезиотент-ность проростков пшеницы в условиях ТШ при обработке препаратом семян. ' .'<'„/ '

Полученные результаты показали, что набухание, семян пшеницы

23 проростки

предшоковый период

3 сут. В

3 сут. HjO

3 сут. HjO 1 сут. н,0 2 сут. Б

послешоковый период

4в 72 * ПО ЧАСМ

предшоковый период

Н20

семена

«2°

зч| зч|высушивание! 3с*1

Б 23*

ТШ 45

1ч

послешоковый период

23* Н20

|—I I ■ ■ 1 0 1 2 S 4

сутки

обработка семян

рост проростков

рис. 2

схема обработки проростков и семян пшеницы биорегуляторами ( б >.

copia "Опал Кг 69" в растворе К-2 в течение 8-х часов, с последу це& 8-х час. аэрацией семян и их высушиванием в мягких условия сорбентом воды, приводило к существенному ■ хорошо воспрс.:- зод1 , мому повышению термотолерантности проростков,(рис; 8). Оптимум ! ' защитного действия К-2 проявлялся при его концентрация :

схема опыта

08ра60тка семян

23

т ш

23

3 сут. «2°

я выживания

юо

1 час 45е

2 3

"аО

сутки

рис. 3

-б - 8 - 4

ю ю га

м

концентрационная зависимость действия картолина-2 на выживаемость проростков пшеницы сорта ( опал 69 ) подсчет выживших проростков проводили через двое i 1 ) и трое ( 2 ) суток после тш. , на оси абсцисс дана концентрация картолина 2 ( м ).

Поврвждащев действие ТШ на проростки развивалось во времена (рис.3). На 8-и сутки проростки ив необработанных К-2 сеиян полностью погибал», тогда как 60% проростков из обработанных К-2 (Ю_5М) семян оставались живыми (рис.3).- При обработке семян, К-2 оказывал стимулирующее влияние на рос* побегов как контрольных, так и подвергнутых ТШ проростков. Эта активация проявлялась в концентрациях К-2 от Ю"6 до 1СГ51» и составляла около 50% у отрессированных н 40? у контрольных проростков (рис.4). К-2 увеличивал также накопление хлорофилла на 50-70%, как у контрольных проростков, которые росли при нормальной температуре, так н у яро-роотков, подвергнутых,Т1 (рис.5). На рост корней обработка семян картолином-2 существенно не влияла. Итог этого раздела работы

схема опыта

обработка семян

23

Т ш

I . I

23

3 сут.

мр

1 час 42*

2 3 HjO

сутки

д йес побега, мг 40

30 20

Ю

О

А вес побега, МГ 60 40

20

О

HJ5

ю* ю1

рис. 4

П

-«

I ■!

- » - &

hjd ю ю

м

влияние картолина-2 на рост побегов пшеницы сорта опал 69 j - контрольные проростки без тш 2 - проростки после тш

АНАЛИЗ через 2 (низ ( я > суток после tul

состоит в той, что были найдены условия эффективного повышения стрессрезистентности проростков паенаци а условиях ТШ с помоцьв обработки семян 1-2,

Важным для конечной цели работы явилось то, что при ТШ, с использованием высокой, но не летальной температуры (42°, I час) К-2 активировал накопление хлорофилла, а следовательно я диффе-

ренцировку хлоропластного аппарата в стрессированных проростках. • • » ■

Это позволяло перейти к решению основной задачи навей работы -

■ - - П- ... .

Д ХЛОРОФИЛЛ, мг/г

Д ХЛОРОФИЛЛ, мг/г

1,000

,500

-4 ■ ■■ -е -5

нр га юм

1,000

,500

--

- 6 - 6 Н20 ю ю м

рис. 5

влияние КАРТОЛИНА-2 НА НАКОПЛЕНИЕ ХЛОРОФИЛЛА в ПРОРОСТКАХ ПШЕНИЦЫ СОРТА ОПАЛ 69

ОБОЗНАЧЕНИЯ ТЕ ЖЕ . ЧТО НА РИС. 4

исследовании аащитного действия К-2 на активность хлороплаотн'—о генома в условиях стресса.

Шиита, оОвайоти .оеияя-дшв,одом,„каатолидаг2.на. иявошмййе1.хвдаам>ипхов .гедов .хлорд.пдаохянх.1<?елк.оаж

Разработанная модельная система была применена для исследования влияния К-2 на экспресоию генов хлоропластных белков как хло-ропластного, так и ядерного происхождения. В качестве хлоропластных геяов были выбраны гены, представленные в таблице I.

/ . Таблица I. Рекомбикантные плазивды со встроенными хлоропластными генами.

Ген Размер Вектор фрагмен- (плаз-та Л.Н. мида)

Продукт гена

рва Л

раЪ А

рвЪ В

рэЬ С

- рвЪ Б

раЬ Е аТр А

гЬо X.

1098

769

1160

837

889

194 780'

1690

рис

18

рис18 Р8*64

РИС

19 ;

рис рис

19 19

рВЙ

325

Р?О0 хлорофшш "а".'- связывающий апо-протеин, Ар 83 ьа.

Полипептид Д^ (гербицид - связывающий), 32кЛ.

Р630 хлорофилл "а" - связывающий апо-протеин, аг 56 к4.

'.. хлорофилл "а" " 44 к(1.'

Полипептид Д2 (подобный гербицид-свя8ы-ваидему Д1) 32 к&.

апопротеин цитахрома 25591 Ю м. Ч- субъединица АТР-синтетазного комплекса.

БС РБМС, 54 кй. .

Кроме того, было изучено накопление транскриптов ядерного, гена, кодирующего хлоропла'отный белок - 33 к'&. Была исследована, динамика накопления транскриптов указанных генов методом дот-гибрид1">ации. Гибридизовали тотальную РНК, ваделенну» из проростков пшеницы и нанесённую на нитроцеллюлозный фильтр, с мечеными ^Р в процессе ник-трансляции плазмидными ДНК, .содержащими после-дуемые гены. Результаты дот-гибридизации показали, что К-2 увели чивал накопление транскриптов генов хлоропласта белков в уолох -- тп. Особенно ярко стимулирущее действие К-2 проявилось на накопление транскриптов генов рза а и гЬо ь (рис.6 А,Б).

- 14-У:'-."

хот 23 с

60 40 20

О -20

ГЕН (рм А)

23

X ОТ 23 С

БО

ГЕН ( rbc L )

о

с

"Г!42)44.44

С

РИС. б

РЕЗУЛЬТАТЫ СКАНИРОВАНИЯ РА ДИОАВТОГРАФОВ.ПОЛУЧЕН -НЫХ ПРИ ДОТ-ГИБРИДИЗАЦИИ МЕЧЕННЫХ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК, СОДЕРЖАЩИХ ГЕНЫ psa А(А) rbc L(6) И ЯДЕРНОГО ГЕНА. КОДИРУЮЩЕГО ХЛОРОПЛАСТ-НЫЙ БЕЛОК 33 Kd (В) С СУММАРНОЙ РНК. ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ КОНТРОЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ ( 1 ) И ПРОРОСТКОВ ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ОБРАБОТАННЫХ К-? СЕМЯН ( 2 ) ПШЕНИЦЫ СОРТА ОПАЛ 69 . НА ОСИ АБСЦИСС-ТЕМПЕРАТУРЫ ТШ .

X ОТ 23 С

40

20 О -20

w-

23

»40^444«

о

С

ЯДЕРНЫЙ ГЕН. 33 Kd БЕЛОК

К-2 вызывал небольшое увеличение содержания транокриптов этих генов при 40°С, но максимум его действия проявлялся при Вызванное картолином накопление цРНК этих генов составляло при 42-46°С - 50-6С5& от их содержания при 28°С. К-2 приводил также к накоплению транокриптов ядерного гена, кодирующего хлороплаот-ный белок 83 (рис.б, В). Следовательно, влияние К-2 на процес сы, определяющие содержание транокриптов (синтез и стабильность ЦРНК) проявляется как в хлоропластном, так и в ядерно-цитоплавма-тическом компартментах, хотя температурная зависимость вызванного К-2 накопления транокриптов хлоропластных и ядерного гена несколь ко различается.

Влияние, фижетормоков да ,,экспрессию, генов хлоропластных

белков в изолированных сеияаолях люпина жёлтого.

Убедившись в эффективности разработанной нами на проростках пшеницы модели для изучения действия биорегуляторов в стрессовых условиях на экспрессию генов хлоропластных белков, мы попытались усовершенствовать другую модельную систему, предложенную для изучения гормональной регуляции позеленения изолированных семядолей люпина жёлтого (Заякин, 1990), чтобы выяснить её возможности для изучения гормональной и температурной регуляции экспрессии хлоропластных генов. Позеленение изолированных семядолей люпина жёлтого, как и ряда других растений, резко активируется цйтокйнином к1 ингибируется АБК (Заякин, 1990). Мы провели большую серию опытов по оптимизации этой системы. Система была оптимизирована по возрасту проростков для изоляции семядолей, продолжительности инкуб: ции семядолей на растворах гормонов и температуре, при которой проводились опыты. В результате мы убедились, что действие циток нина и АБК может быть обнаружено уже через 3 часа прединкубации лированкьа семядолей на растворе фитогорионов. Оно чётко вира жено через 6 часов и достигает своего максимума через 12 часов. I

[озтоиу для опытов была выбрана предннкубация изолированных семя-,олей люпина на растворе цитокинина и АБК в течение 12 часов рис. 7 ). В результате была получена высокочувствительная систе-га, в которой активация позеленения семядолей цитокинином проявля-[ась как в ускорении начала этого процесса, так и в его интенсификации. АБК полностью ингибировала позеленение семядолей в течение * часов оовещения (рис.7).

Продление опыта до 36 часов сохраняло направленность дейст-зия обоих фитогорыонов, но при этой снижался как % активирования 1роцесса под действием цитокинина, так и % его ингибирования под 1ействиеи АБК. Влияние б-БАП и АБК на рост семядолей было крайне злабым (рис.7 Б). Их действие было направлено в этой недельной зистеме на регуляцию формирования хлоропластного аппарата. Другие гормоны - гиббереялин и ауксин активностью в этой системе не облапали, т.е. действие б-БАП и АБК было специфичныи. Усовершенствовал-пая модельная система была использована в опытах по изучении влия-айя фитогормонов на содержание ЦРНК хлоропластных генов. Опыты проводили по следующей схеме: семена стерилизовали концентрированной н2зо4 (40 мин.), нарушали семянной покров, частичным его обрезанием, для ускорения прорастания. Далее, сечена проращивали Б-е суток в темноте, изолировали семядоли, выдерживали юс 24 часа в темноте на воде, для истощения эндогенных фитогормонов. Затеи семядоли инкубировали в присутствии 6-БАП (2,2*10"^ М), АБК (7,6'10~511) иди на воде в темноте 12 часов и переносили на свет. РНК из семядолей выделяли через 2, 4, б, 8, 12, 14, 18 час. после ,. начала освещения. РНК использовали для дот-гибридизации и нозерн-гибридизации с содержащими хлоропластные гены меченными плазмида-ми. Это позволило оценить, количественные изменения в содержании МРНК хлоропластных генов в ходе позеленения семядолей на свету. Опыты с дот-гибридизацией показали, что в изученный период оодер-

ХЛОРОФИЛЛ, мкг/г

80

200 О .

2 А

3

О 2 4 6 8 ЧАСЫ ВЕС 1 СЕМ. МГ

0 2 4 6 8 ЧАСЫ

РИС. 7

ВЛИЯНИЕ 6-БАП И АБК НА СОДЕРЖАНИЕ ХЛОРОФИЛЛА С А ) И РОСТ ( Б ) ИЗОЛИРОВАННЫХ СЕМЯДОЛЕЙ ЛЮПИНА.

СЕМЯДОЛИ ИЗОЛИРОВАЛИ ИЗ 3 СУТОЧНЫХ ПРОРОСТ-КОЗ ЛЮПИНА, ИНКУБИРОВАЛИ 24 ЧАСА В ТЕМНОТЕ НА ВОДЕ . ДАЛЕЕ ИНКУБИРОВАЛИ 12 ЧАСОВ В ТЕМНОТЕ НА : 5

1 . ВОДЕ« 2 . 6-БАПЧ 2.2 . 10 М ) , 3 . АБК ( 7,6 . КГМ ) • ЗАТЕМ СЕМЯДОЛИ ПЕРЕНОСИЛИ НА СВЕТ .

ВРЕМЯ ИНКУБАЦИИ НА СВЕТУ ПОКАЗАНО НА ОСИ А5СЦИСС .

нание транскриптов выбранных генов не изменялось и фитогормоны не влияли на их содержание. Очевидно, экспрессия этих генов в < иядолях люпина происходила на более ранней стадии. Небольшое в: яние фи тог ори он ов было обнаружено лишь на накопление транскрип' гена рзь а (рис.Ь). Результаты, полученные методой дот-гибрк; зации были подтверждены в опытах с нозерн-гибридизацией. При - 1Ь -

ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ВЕЛИЧИНА 20

15 ГО 5

0 4 8 12 14 16 18 ЧАСЫ

РИС. б

ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТРАНСКРИПТОВ ГЕНА рвЬ А ПРИ ИНКУБАЦИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ СЕМЯДОЛЕЙ ЛЮПИНА НА СВЕТУ СЕМЯДОЛИ ПРЕДИНКУБИРОВАЛЦ. 1 НА ВОДЕ. 2 НА РАСТВОРЕ Б-БАП С 2,2.10 М ),3 НА РАСТВОРЕ АБК I 7,6. Ю"3М ). ПРЕДСТАВЛЕНЫ РЕЗУЛЬТАТЫ ДЕНСИТОГРАФИИ ФЛЮОРОГРАММ НИТР0ЦЕЛЛЮЛ03НЫХ ФИЛЬТРОВ. СОДЕРЖАЩИХ ПРОДУКТЫ ДОТ-ГИБРИДИЗАЦИИ МЕЧЕННОЙ ДНК ГЕНАр«ь а С ТОТАЛЬНОЙ РНК СЕМЯДОЛЕЙ НА ОСИ АБСЦИСС УКАЗАНО ВРЕМЯ ИНКУБАЦИИ СЕМЯДОЛЕЙ НА СВЕТУ ( СМ. СХЕМУ ОПЫТА )

нопольаовавии этого метода, суммарный препарат РНК фракционировался в ЭЛАГ, переносился на нейлоновый фильтр и затеи гибридизовал-оя о содержащей исследуемый ген меченной ^Р плазмидой. Это позволяло обнаружить не только ЦРНК, но и непроцессированные пре-цРНК в продукты деградации „РНК, Полученные.результаты показали отсутствие в препаратах продуктов деградации цРНК. Мы не обнаружили также непроцессированные цРНК. Этим методом было выявлено увеличение содержания ЦРНК для гена рвь а через 12-48 часов дейотвия цитокинина.

Мы посмотрели влияние 6-БАП и АБК на накопление транокриптов

% ИЗМЕНЕНИЯ

12 3 46 С°

РИС. 9

ВЛИЯНИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА И ФИТОГОРМОНОВ НА СОДЕРЖАНИЕ ТРАНСКРИПТОВ ХЛОРОПЛАСТНОГО ГЕНА рэЬ А В ИЗОЛИРОВАННЫХ СЕМЯДОЛЯХ ЛШИНА ЖЕЛТОГО.

ПРЕДСТАВЛЕНЫ РЕЗУЛЬТАТЫ НОЗЕРН-ГИБРЙДИЗАЦИИ МЕЧЕННОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕН рзЬ А С и РНК ДАННОГО ГЕНА . НА ОСИ АБСЦИСС ПРЕДСТАВЛЕНЫ ТЕМПЕРАТУРЫ ТШ . СЕМЯДОЛИ ПРЕДИНКУБИРОВАЛИ 1. НА РАСТВОРЕ АБК < 7.6 . Ю'5, М ) .2. НА 80ДЕ , 3. НА РАСТВОРЕ 6- БАП ( 2,2 . 10 ~3М ). НА ОСИ ОРДИНАТ - к СОДЕРЖАНИЯ ТРАНСКРИПТОВ ГЕНА ряЬ А ОТНОСИТЕЛЬНО КОНТРОЛЯ ( Н20 . 28 С ).

хлоропластных генов в условиях ТШ. Опыты проводились по обычной схеие и после прединкубации семядолей на растворах фитогормонов, их подвергали в течение 2-х часов ТШ при 40-4б°С. После этого иэ семядолей выделяли РНК и содержание ЦРНК в препаратах определяли иеюдс ;оэерн-гибридизации. Полученные результаты показали, что фитогорионы не влияли на содернание ЦРНК рзъ а гена при 2Ь°С (рис.9). Я! вызывал некоторое увеличение содержания ЦРНК в семядолях при <Ю-44°С и резкое снижение - при 4б°С (рис.9). Это согл суется с полученными ранее данными на семядолях тыквы (Кузнецов м /,р. 1991), 6-БАП активировал накопление цРНК при 40°С, а АБК

препятствовала ее накоплению при 40°-44°С. Оба гормоны не препятствовали резкой убыли цРНК при 46°С (рис.9). Таким образом, содержание цРНК раЬ а гена в семядолях люпина существенно изменяется под действием температуры. Гормоны оказывают влияние на это изменение при выооких, но не летальных температурах и не влияют при

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким обрааом, была разработана модельная сиотема для изуче- ¡' ния антистрессового действия картолина-2 на проростки пшеницы, подвергнутые тепловому шоку. На данной системе покаэано, что защитнее действие картолина-2 проявляется на уровне содержания ЦРНК генов хлороплаотшя белков, как хлоропластного, так и ядерного происхождения. Это открывает перспективу дальнейших исследований влияния ! картолина-2 на экспрессию хлоропластного и ядерного геномов в стрессовых условиях. Поскольку содержание ЦРНК в клетках определяется не только скоростью их синтеза, но также процеосингом и дег- ; радацией, исследование влияния картолина-2 в стрессовых условиях на каждый иа. этих процессов представляет большой интерес.

Параллельно вами была усовершенствована другая модельная аистема для изучения гормональной и температурной регуляции экспрессии хлоропластных генов в ходе позеленения изолированных семядолей люпина жёлтого. Установлено, что активация цитокинииом позе- ■

г

денения семядолей и подавление этого процесса абсцизовой кислотой происходит не на уровне влияния фитогормонов на количество цРНК иоропластных генов. Это выдвигает задачу изучения действия фито- • гормонов в денной системе на трансляционном уровне.

Таким образом, каадая из изученных модельных систем может внести свой вклад в исследование регуляции экспрессии хлоропласт-аых генов у растений.

выводы

1. Получена характеристика действия теплового шока в широкой диапазоне температур (35° - 46°С) не рост проростков пшеницы двух сортов (Цосковская-35, "Опал й 69'') и накопление в них хлорофилла.

2 Разработана ¡¿сдельная система для изучения антистрсосового действия биорегуляторов па проростки пшеницы в условиях теплового шока.

3. Показана эффективность защитного действия при тепловой шоке па проростки пшеницы синтетического биорегулятора картолина-2. Найдены оптимальные условия для проявления его защитного дейот вкя.

Изучено влияние теплового шока и картолина-2 на накопление Ц?НК больного числа хлоропл&стных генов, включая гены белков фотосистем I и П, АТФ-синтетозного комплекса и большой субь-единицц РБФК, а также ядерного гена,'кодирующего полипептид 33 и.

5..Установлено, что обработка семян картолином-2 вызывала накошн ние в проростках пиеиицы в условиях теплового шока ЦРНК генов хлоропластвых белков как хлоропластного, так и ядерного проис хоздения. Это открывает перспективу дальнейшего изучения зощи кого действия биорегуляторов на синтез и стабильность ЦРНК хлоропластньос белков.

6. Усовершенствована модельная система для изучения регуляторног действия цитокинина и АБК на позеленение изолированных семядс лей люпина жёлтого.

7. Показано, что гормональная регуляция позеленения семядолей ю ш;на в разработанной системе происходит не на уровне накопле! транскриптов хлоропластньсс генов.Модельная система представл]

- 22- .

интерес для изучения действия фитогормонов на экспрессии слоропластных генов в условиях теплового шока.

Работа, опубликованной по материала« диссертации;

- O.N.Kulaeva; V.V.Kusnetaov; il.I.Sarwat; G.Я.СЬегерпета; I.ài.Kuklna 1991. Cytoklnin and heat shook regulation of chloroplaat genes tranaoripts accumulation. - In: oonferenoe on Fiant Grouth. Subataaaea IPGSA. Amsterdam. July 21-26. p.114.