Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Митотические обмены в гиперплоидном пронуклеусе самца Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Митотические обмены в гиперплоидном пронуклеусе самца Drosophila melanogaster"

!'ГЗ 0/1

На правах рукописи УДК 575.116.12:595.773.4

ВОЛКОВА ЕЛЕНА ИГОРЕВНА

МИТОТИЧЕСКИЕ ОБМЕНЫ В ГИПЕРПЛОИДНОМ ПРОНУКЛЕУСЕ САМЦА Вго5оркИа те1апо§(Шег.

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук, Омельянчук J1.B. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Васильева JI.A.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук, Гусаченко A.M.

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится_1997 г.

на_заседании диссертационного совета по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

.Д. Груздев

Феномен митотического кроссинговера у ВгояорМ1а те1апо§а.ч1ет был обнаружен и описан около 60 лет назад. Митотические обмены интенсивно изучались и были успешно использованы в качестве инструмента для исследования многих важных проблем генетики дрозофилы. В частности, индуцированные митотические обмены в соматической ткани, используемые как экспериментальная модель, обеспечили значительный прогресс в генетике развития, а изучение митотических обменов в зародышевой линии самцов позволило понять механизм магнификации рибосомальных генов.

Актуальность работы. Первое деление дробления у дрозофилы организовано совершенно особенным образом. Во-первых, оно по времени пересекается с мейозом, во-вторых, существует явление гономерии - пространственной разобщенности отцовских и материнских хромосом до анафазы первого деления дробления. В первом делении дробления формируются хромосомные перестройки, индуцированные в зрелых спермиях самцов, и проявляется материнский эффект репарационных мутаций. На этой стадии происходят потери хромосом, обмены между сестринскими хроматидами внутри кольцевой хромосомы, генетически индуцированные обмены в ХУ компаундах и ряд других событий. Чем обусловлены эти уникальные особенности первого деления дробления во многом неясно, поскольку до сих пор не существовало удобной генетической системы для подобного исследования. Поэтому, когда было обнаружено (Омельянчук, 1991), что в первых делениях дробления, при нерасхождении аутосомы 2 у самцов дрозофилы происходят индуцированные радиацией митотические обмены, появилась возможность, используя эту генетическую модель, изучить особенности поведения и структуры хромосом на ранних стадиях эмбриогенеза. Генетическая система, в которой были зафиксированы эти обмены, позволяла характеризовать их частоту и распределение по районам аутосомы 2. Приуроченность обменов к первым делениям давала возможность сопоставить эти события с другими феноменами, наблюдаемыми на ранних стадиях, в частности, с процессом формирования транслокаций.

Цель настоящей работы. На основании детального генетического анализа закономерностей формирования ранних митотических обменов выявить особенности структуры и поведения хромосом в первых делениях дробления.

Конкретные задачи исследования.

1. Провести генетический анализ коллекции перестроек, для выявления линий, в которых бы наблюдалась высокая частота нерасхождения акроцентрической аутосомы с метацентриком в мейозе у самцов.

2. Определить стадию, на которой происходят ранние митотические обмены, возникающие при облучении гиперплоидного спермия.

3. Провести анализ частот митотических обменов и их распределения по районам аутосомы 2.

4. Определить характер митотических обменов (полные, неполные).

5. Сравнить влияние материнского эффекта репарационной мутации тизЮ401 (аллель гена те141) на формирование митотических обменов и транслокаций.

Научная новизна. В работе впервые дана подробная характеристика митотических обменов, возникающих при облучении гиперплоидных спермиев самцов дрозофилы. Показано, что эти обмены происходят раньше, чем обмены между облученными хромосомами самца и интактными хромосомами самки, то есть в первом делении дробления после репликации хромосом самца. Установлено, что обмены являются полными и локализуются преимущественно в прицентромерных районах аутосомы 2, то есть в районах, которые впоследствии компактизуются в гетерохроматин. Обнаружен эффект отрицательной интерференции митотических обменов. Показано различие генетического контроля митотических обменов и образования транслокаций при материнском эффекте мутации тю104 в одной ткани на одной и той же стадии онтогенеза.

Практическая ценность. Данные, полученные в настоящей работе, расширяют представления об особенностях поведения и структуры хромосом на первых этапах эмбриогенеза дрозофилы. В работе предложена генетическая система для регистрации митотических обменов и транслокаций на одной стадии онтогенеза, которая может быть использована в качестве тест-системы для характеристики репарационных мутаций.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах, содержит 9 таблиц, 7 рисунков, список литературы из 187 наименований. Работа содержит следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, заключение, выводы и список цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии мух, использованные в работе. Подробное описание фенотипа мутаций можно найти в справочнике Lindsley and Zimm (1992), описание структурных перестроек - в работе (Чадов, Чадова, 1985). Список линий из коллекции акроцентриков приведен в работе (Омельянчук, Понимаскин, 1991а). Анализ частот нерасхождения аутосом у самцов проводили по методике, описанной в работах (Чадов и др., 1986а, 19866). Сравнение частот митотических обменов проводили по критерию достоверности разности выборочных долей (метод ф ("фи") Фишера для долей 0.2 > р > 0.8) (Плохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В генетической системе, в которой были зафиксированы ранние митотические обмены (Омельянчук, 1991), лимитирующим фактором для их дальнейшего изучения оказалась небольшая частота нерасхождения акроцентрика с метацентрической хромосомой в мейозе у самцов (то есть небольшая доля гиперплоидных спермиев). Поэтому на первом этапе работы было проведено исследование линий, содержащих различные акроцентрики аутосомы 2, для того, чтобы найти линию, в которой наблюдался бы больший процент нерасхождения. Самцы каждой из этих культур были тестированы на мейотическое нерасхождение правого акроцентрика с метацентриком, содержащим балансер, при помощи тестера F(2L)2, рт; C(2R), сп, и на нерасхождение левого акроцентрика с метацентриком при помощи тестера C(2L)RM, b; F(2R)1, +.

Частоты нерасхождения акроцентриков с метацентриком в мейозе у самцов для 15 из 22 проанализированных линий данной коллекции представлены в Таблице 1. Культуры ТЕ5 и к7а, содержащие вновь синтезированные 2L акроцентрики, демонстрируют существенное увеличение 2/F(2L) нерасхождения по сравнению с контролем. В культурах С112 и F23 увеличивается 2/F(2R) нерасхождение.

Полный спектр гамет по второй хромосоме для перестроек F23, С112, к7а, N6 был изучен при помощи описанных выше тестеров и тестера на эуплоидные гаметы: структурно-нормальная хромосома 2 с маркерами рт рк сп. Данные этого эксперимента представлены в Таблице 2. В качестве контроля в первой строке таблицы приведены частоты гамет линии дикого типа у самцов (Чадов и др., 19866).

Таблица 1. Частоты нерасхождения левых и правых акроцентриков коллекции (в процентах) (из статьи Омельянчук, Волкова, 1994а).

^^■гестср линия ¥(2Ц,рг; С(2Я), сп (нерасхождение 2Я) С(2Ь), Ь; Р(2Н.), + (нерасхождение 2Ь)

Акроцентрики 2Ь

ТР6 6.5+ 0.8 1.3 ± 1.3

ТР12 9.3+ 3.3 8.3+ 3.5

Э13 10.5+ 1.7 1.2 ± 0.5

С112 16.4+ 2.4 0

Р23 21.0+ 2.9 1.6+ 0.9

ТР1 4.5 ± 1.5 0

ТЕ5 1.2 ± 1.0 14.3+ 2.6

Р14 10.0+ 1.7 4.1 ± 1.1

ТР4а 2.5+ 1.2 2.2+ 1.2

С122 11.8 ± 2.3 8.2 ± 1.5

к7а 5.7 + 3.0 26.5+ 3.3

Акроцентрики 211

Р9 8.1 ± 2.1 0.5+ 0.3

¥1 0.3 ± 0.2 0

Р8 9.0+ 2.3 0

Р11 12.6+ 2.3 0

Таблица 2. Частоты эуплоидных и анеуилоидных гамет (в процентах) для линий N6, к7а, Р23, С112. (из статьи Омельянчук, Волкова, 1994а).

^^^тестер линия^^ рт рк сп расхождение С(2Ь), Ь;Р(2И.),+ нерасхождение2Ь Р(2Ь),рг; С(2Я), си нерасхождение 2Я

дикий тип 73.7+3.0 12.6 + 2.2 1.4 ± 1.0

N6 39.5+ 1.4 18.9 ± 1.6 7.5 ± 0.8

к7а 25.5+ 2.0 32.5 + 2.6 1.6 + 0.2

Р23 54.5+ 1.6 6.2 ± 0.8 24.2 ± 1.4

С112 20.8+ 1.7 2.5 + 0.4 19.4 + 1.0

Сравнение частот, проведенное по критерию Фишера, показало достоверность различий (Р=0.999) для линий N6 и к7а при нерасхождении 2L, и для линий F23 и С112 при нерасхождении 2R. Способ синтеза культур ТЕ 15, С112 и F23 был таков, что они могли содержать разное количество гетерохроматина в правом плече, структура же гетерохроматина слева от центромеры была одинакова (Омельянчук, Понимаскин, 1991а). Из наших данных следует, что, изменяя размер гетерохроматинового блока, расположенного справа от центромеры в 2L акроцентриках, можно изменить расхождение как самого акроцентрика с метацентрической хромосомой, так и расхождение акроцентрика противоположного плеча. Это может означать, что помимо мажорного сайта спаривания, расположенного у основания 2L плеча (МсКее et.al., 1993), в мейотическом спариваний у самцов есть сайты, расположенные в гетерохроматине 2R плеча.

Линии N6, k7a, F23 и СП2 хорошо подходили для дальнейшей работы. В линии к7а увеличение нерасхождения, по-видимому, было связано с материалом Y-хромосомы. Акроцентрики в культурах F23 и С112 значительно увеличивали частоту нерасхождения правого акроцентрика, и для последующих опытов мы произвольно выбрали последний - (2112.

Раднационио-нндуцированный митотический кроссинговер в пшерплоидном пронуклеусе самца

Двухдневных гетерозиготных самцов, содержащих аутосому 2, меченую рт сп срх sp, и акроцентрики F(2L)C112, Ь рт; F(2R)1, +, облучали гамма-лучами ®°Co в дозе 3000 сГр и скрещивали с самками F(2L)2, рт; C(2R)RM, сп. После 2-х суточного спаривания самок отделяли от" самцов и пересаживали в новые пробирки для откладки яиц - это приводило к тому, что яйца оплодотворялись только зрелыми спермиямй. Акроцентрик F(2L)C112, Ъ рт, как было показано выше, увеличивает нерасхождение акроцентрика 2R' с метацентриком до 19.4%, то есть значительно увеличивается доля гиперплоидных спермиев. Потомки самцов, несущих гиперплоидный спермий, были двух типов. Потомки регулярного класса имели фенотип рт. Потомки исключительного класса дополнительно к маркеру рт, были гомозиготны по части маркеров цепочки сп с рх sp. Исключительные потомки представляли собой результат обменов, произошедших между неразошедшимися гомологичными хромосомами самца. Поскольку гиперплоидный спермий был гетерозиготен по этим маркерам, обмены могли возникнуть только на стадии четырех хроматид после репликации хромосом самца, то есть являлись митотическими (Рис.1).

N

3000 сГр

рг сп с рх ер -о-

Ь рг

-о о-

??

рг

рг

С

СП

меиоз

рг СП с рх яр -о-

репликация хромосом и обмен в гиперплоидном пронуклеусе

меиоз, репликация хромосом самки

рг рсп с рх 5р

рг сп/с рх ер

рг

рг

слияние пронуклеусов

рг сп с рх ер О

рг СП рг с рх 5Р

=88==

рг

сегрегация

рг в сп с рх Бр -о о-

рг с рх ер

рг

+ с рх ер

Рис. 1. Схема регистрации митотических обменов при нерасхождении правого акроцентрика с метацентриком. Показан результат обмена в районе сп-с (исключительный потомок фенотипа рг с рх Бр).

В другом эксперименте самцов, гомозиготных по цепочке маркеров рт сп с рх яр, облучали также, как и в предыдущем случае, и скрещивали с самками Р(2Ь)С112, Ь рт; Р(211)1, + / Су О, йрм Су рт сп2. Среди развившегося потомства искали обмены между облученной отцовской хромосомой рт сп с рх зр и пришедшим от матери акроцентриком Р(2Я)1, + . Схема опыта была такова, что контакт облученной отцовской аутосомы 2 и материнского акроцентрика Р(211)1,+ мог произойти только после анафазы первого деления дробления (вследствие явления гономерии). Такая постановка опыта была аналогична экспериментам Абелевой с соавт. по регистрации аналогичных обменов в Х-хромосоме (Абелева, Мяснянкина, 1976а).

В первом эксперименте среди 1269 особей были зарегистрированы 2 особи рт сп с рх лр, 1 особь - ртсрх яр, 1 -ртспсрх и 3 - рт сп с. Во втором скрещивании среди 1038 потомков не было обнаружено исключительных особей. Типы обменов на стадии четырех хроматид, соответствующие наблюдаемым фенотипам, представлены на Рис. 2.

Схема первого опыта была такова, что обе хромосомы, вовлеченные в обмен, были облучены и принадлежали отцу. Во втором эксперименте контакт облученной отцовской второй хромосомы и материнского акроцентрика Р(2Ь) мог произойти только после анафазы первого деления дробления. Частота обменов при нерасхождении правого акроцентрика составила Ггк = 11/1269 = 0.86 • Ю-2. Обмены между облученной отцовской и необлученной материнской хромосомами не были зарегистрированы (1=0). Так как в первом эксперименте были облучены две хромосомы, а во-втором -одна, достоверность различий определяли между величинами Ггя / 2 и Г Сравнение, проведенное по критерию Фишера для выборочных долей <0.2, показало, что частоты достоверно различаются (Р=0.95). В экспериментах Абелевой с соавт. (Абелева, Мяснянкина, 1976 а, б) обмены между облученными хромосомами самца и интактными хромосомами самки были зафиксированы в Х-хромосоме. Частота их составила 7 / 3378 = 2.1 • 10"3 при аналогичной дозе облучения. Тот факт, что подобные обмены не были зарегистрированы в нашем эксперименте, скорее всего означает, что частота таких обменов в X-хромосоме выше, чем в аутосоме 2. Таким образом, митотические обмены при облучении гиперплоидного спермия происходят чаще, чем обмены во втором делении дробления между облученной отцовской и необлученной материнской хромосомами. Следовательно, обмены, возникающие при облучении гиперплоидного спермия, происходят раньше - в первом делении, после репликации хромосом самца.

Фенотип

Тип обмена

рг сп с рх sp (2)

рг ^сп с рх sp

рг .сп с рх sp

Z

рг с рх sp (1)

рг СП ерх (1)

рг сп с (3)

-оРГ- СП С рх sp

о /

ро СП с рх sp

СП с рх sp

J V

рг0 СП с рх sp

-ШЬ- СП с рх sp

ZZI

Рис. 2. Схема 4-х хроматидных обменов в правом акроцентрике, соответствующих наблюдаемым фенотипам (в скобках указано число исключительных потомков каждого класса).

Был проведен анализ митотических обменов, образующихся при нерасхождении левого акроцентрика. Зрелых самцов net dp b I F(2L)2, pr, F(2R)1, + облучали на источнике гамма-излучения 131Cs в дозе 3000 сГр и скрещивали с самками C(2L)RM, Ъ; F(2R)1, сп с sp. В потомстве этого скрещивания получались самцы регулярных классов : net dp b / ¥(2L)2, pr; F(2R)1, cn csp и C(2L)RM, b; F(2R)1, +/ F(2R)1, cn с sp, а также самцы первого класса с обменами в 2L плече между

метацентриком net dp b и акроцентриком F(2L)2, pr , число которых подсчитывали. Аналогично облучали и скрещивали самцов net b j рт сп / F(2L)k7a, dp; F(2R)1, cn с sp, содержащих транслокацию Y-хромосомы в район прицентромерного гетерохроматина 2L плеча, которая увеличивала нерасхождение левого акроцентрика. В потомстве собирали и подсчитывали самцов, не содержащих маркеров Ь, сп, с nsp.

В первом опыте было собрано 336 самцов дикого фенотипа и 4 самца рт. Небольшое количество регулярных потомков облусловлено низкой частотой нерасхождения акроцентрика F(2L)2, рт. Во втором опыте среди 1900 самцов дикого фенотипа, были найдены рекомбинантные потомки: 5 самцов dp сп, 2 - net сп, 3 - net j b pr сп. Типы обменов между левым акроцентриком и метацентриком аутосомы 2, обнаруженные в этих экспериментах, показаны на Рис.3.

Частота обменов при нерасхождении левого плеча составила £гь = 4 / 340 = 1.2 • Ю-2 (при использовании стандартного акроцентрика), и fa = 10- / 1900 = 0.5 • Ю-2 (при использовании акроцентрика к7а, содержащего материал Y хромосомы). По данным Омельянчука, впервые обнаружившего эти события, частота обменов 5 / 359 = 1.4 • 10"2 (Омельянчук, 1991). Частоты достоверно не различаются, что указывает на хорошую воспроизводимость результатов.

На основании этих данных можно сделать некоторые заключения об особенностях митотических обменов в гиперплоидном пронуклеусе самца. Во-первых, в правом плече было .обнаружено большое число двойных обменов (см. Рис.2). Наблюдаемая частота двойных обменов Ггяд = 4 / 1269 = 0.3 • Ю-2 значительно превышает ожидаемую f0 = Ю 4 - 10 е, рассчитанную, исходя из предположения о независимом характере обменов. Двойные обмены были зафиксированы в опытах Абелевой с соавт. (Абелева, Мяснянкина, 1976а) и в эксперименте, описанном в работе (Омельянчук, 1991). Известно, что в мейозе у дрозофилы частота возникновения двойных обменов значительно ниже ожидаемой - это явление называется положительной интерференцией. В нашем случае наблюдается обратная картина - феномен, который мы назвали отрицательной интерференцией. Мы предполагаем, что в основе этого явления лежит тесный соматический синапсис хромосом: пары обменов возникают внутри одной непрерывной зоны спаривания, облегчающей воссоединение индуцированных радиацией разрывов. Вопрос о спаривании хромосом в ранних митотических циклах у дрозофилы до сих пор остается открытым.

Фенотип Тип обмена

пе1 с1р Ь

рг(4)

пе! сп (2)

пе1 dp Ь

рг

т

¿-—о

рг

пе1 Ь ] рг сп о

аР сп(5) _пе^Рь * р/

йр -4,

пе! Ь j рг сп о

пе1\ Ь 3 рг сп

1\Ь1

Ур

ар "Ч

де1 Ь j рг ^сп

пе1 Ь

пе1 Ь j рг сп (3) -— ___ЁЕ_

] рг\сп с*Р Ц

Рнс.З. Типы обменов между левым акроцентриком и метацентриком хромосомы 2, соответствующие наблюдаемым фенотипам (в скобках указано число особей данного фенотипа). У-хромосома обозначена волнистой линией.

Факт наличия митотических обменов в первом делении дробления свидетельствует о том, что спаривание на этих стадиях происходит. Наличие значительного числа двойных обменов указывает на то, что это спаривание чрезвычайно эффективно - тесный синапсис гомологов создает условия, при которых потенциальные повреждения, возникшие в хромосомах под действием облучения, могут реализовываться в митотические обмены.

Анализ результатов проведенных экспериментов показывает, что основная масса обменов происходит в области прицентромерного гетерохроматина, а вне его встречаются лишь одиночные обмены (см. Рис. 2 и 3). Известно, что количество ДНК в районе прицентромерного гетерохроматина в аутосоме 2 составляет около 30% (Жимулев, 1993). На это количество ДНК, по нашим данным, приходится до 70% митотических обменов (Таблица 3).

Таблица 3. Распределение числа обменов по районам аутосомы 2 (ц-м - центромера).

Район хромосомы net-dp dp-b b-pr рт- ц-м -СП сп-с с-рх px-sp

Число обменов 2 0 0 18 1 3 1

Такое распределение обменов является типичным для митотических обменов в соматической ткани и зародышевой линии самцов дрозофилы. Однако, известно, что в первых делениях дробления дрозофилы гетерохроматин, как компактная цитологическая структура, отсутствует (ЭДавзоуа е1.а1., 1991). Поэтому наши данные о преимущественной локализации обменов в прицёнтромерных районах, с одной стороны, свидетельствуют о том, что не компактность структуры гетерохроматина, а какие-то другие его свойства, обуславливают преимущественное распределение митотических обменов в прицентромерных районах хромосомы. С другой стороны, это говорит о том, что уже на ранних стадиях эмбриогенеза районы хромосом, которые впоследствии станут гетерохроматиновыми, уже обладают определенными особенностями.

Существенную роль в процессе образования митотических обменов играет соматическое спаривание. Анализ литературных данных о митотических обменах в соматической ткани указывает как на высокую частоту митотических обменов в гетерохроматине, так и на особую роль гетерохроматина в соматическом спаривании хромосом. Что касается наших данных об аналогичных свойствах гетерохроматина на ранних стадиях развития, то они свидетельствуют о том, несмотря на отсуствие типичной для гетерохроматиновых районов компактной структуры в ранних делениях дробления, его функциональные свойства уже сформированы на этих стадиях.

Суммируя наши данные о повышенном митотическом кроссинговере р гетерохроматине в первом делении дробления

дрозофилы и данные об отрицательной интерференции обменов в правом плече аутосомы 2, можно заключить, что синапсис хромосом, приводящий к обменам, наиболее силен в области прицентромерного гетерохроматина. Соматическая конъюгация, начинаясь в области гетерохроматина, может распространяться далее в область эухроматина, то есть гетерохроматин не только чаще образует зону синапсиса, но и является инициатором синапсиса эухроматина.

Природа радиационно-индуцированных митотических обменов

В первом делении дробления происходит формирование транслокаций, индуцированных облучением зрелых спермиев. Помимо полных транслокаций, представляющих собой воссоединение всех четырех разорванных концов хромосом, существенную часть (2040%) составляют "неполные" транслокации, когда воссоединяются только два разорванных конца (Омельянчук, Понимаскин, 19916). На основании этого можно предполагать существование аналогичного процесса при формировании индуцированных митотических обменов. Для того, чтобы определить, являются ли обмены в гиперплоидном пронуклеусе полными, был поставлен следующий эксперимент.

Половозрелых самцов, несущих вторую хромосому, меченую кп с рх sp, и акроцентрики F(2L)C112, b рт и F(2R)1,+, облучали на источнике гамма-излучения 137 Cs в дозе 3000 сГр и скрещивали с виргинными самками с цепочкой маркеров во второй хромосоме рт сп sea кп с рх sp. Часть самцов скрещивали с этими самками, не облучая, для контроля выживаемости яиц. После 2-х суточного спаривания самок отделяли от самцов (при этом самки были оплодотворены только облученными зрелыми спермиями) и пересаживали на свежий корм. Собирали потомство, находя в нем исключительных (отличных от регулярных кп с рх sp и рт) потомков. Количество потомков подсчитывали с помощью взвешивания. В

необлученном контроле подсчитывали количество отложенных яиц и количество вылетевших из них имаго.

Всего было проанализировано 48270 потомков. Вылет потомства из яиц в контроле составил 20.1%, таким образом в опыте было собрано 48270 / 0.201= 240 000 яиц. Частота нерасхождения правого акроцентрика С112 с метацентриком у самцов составляет 19.4%. Поэтому число яиц, оплодотворенных гиперплоидными спермиями, в опыте составило 240 000 • 0.194=46560. Выживаемость яиц при данной дозе, связанная с доминантными леталями, составляет 3139% (Омельянчук и др., 1993а). Таким образом, 14480 - 18160 яиц были оплодотворены гиперплоидными по правому плечу спермиями

и не несли доминантных леталей. В Таблице 4 представлены фенотипы и количество исключительных особей, полученных в данном эксперименте. Среди классов, приведенных в верхней части таблицы, для установления типа полученных обменов был проведен выборочный цитологический анализ политенных и митотических хромосом (Таблица 5).

Только в культурах NG30 и NG29 произошли равные обмены между метацентриком и правым акроцентриком. Причем в NG29 обменная хромосома выживала в гомозиготном состоянии. Частота наблюдаемых равных обменов в нашем эксперименте составила fp = 2 / (14480 + 18160) = 1.3 + 1.1 • Ю-4. Частота потерь различных хромосом дрозофилы при облучении 3000 сГ - f„ = 3.2 + 1.8 • 10"3 (Омельянчук и др., 1993а). Частота равных полных обменов в 2R плече по нашим данным f2R = 0.86 • Ю-3. Сравнение частот fn • f 2R с частотой обменов fp, полученных в настоящем эксперименте, не позволяла сделать однозначный выбор между заключением о том, что эти два обмена неполные, и возможностью случайного совмещения двух событий: полного обмена и потери хромосом. Таким образом, анализ результатов настоящего исследования показал, что, в целом, митотические обмены являются полными (т.е. все четыре разорванных конца воссоединяются), и лишь с очень низкой частотой (порядка Ю-4) могут образовываться неполные обмены.

Влияние мутации musl04 на частоту митотических обменов, возникающих при облучении гиперплоидного спермин

Был проведен эксперимент по исследованию влияния мутации по пострепликативной репарации musl04D1 (аллель гена mei41 (1-53.8)) на митотические обмены в гиперплоидном пронуклеусе. Относительно этой мутации известно, что она увеличивает частоту хромосомных перестроек, в частности, транслокаций (Омельянчук и др., 19936).

Самок w musl04; C(2L)RM, b; F(2R)1 cn с sp скрещивали с облученными самцами net dp b / F(2L)2, pr, F(2R)1, +. Облучение и оплодотворение проводили как описано выше. В потомстве собирали самок, гомозиготных по одному или нескольким маркерам из цепочки net dp b pr. В качестве контроля к этому опыту проводилось аналогичное скрещивание с тем отличием, что хромосома w mus№4 была заменена хромосомой дикого типа. В этом случае учет обменов осуществлялся по самцовому потомству, так как вследствие отсутствия глазного маркера w была возможность различать все маркеры цепочки net dp b pr.

Таблица 4. Исключительные особи, полученные в эксперименте (из статьи Омельянчук, Волкова, 19946)

Фенотип Количество особей

дикий mutt 6

lot с 5

at kn с рх sp 4

kn 1

kn с рх 1

рт kn с рх sp 6

рг СП 4

рт рх sp 1

рт сп kn с рх sp 1

Таблица 5. Цитологический анализ исключительных потомков (из статьи Омельянчук, Волкова, 19946).

Линия Фенотип Политенная хромосома 2 Митотическая хромосома 2

NG16 NG28 NG15 дикий тип дикий тип дикий тип Df(2) 42B;58F нормальный эухроматин то же Два свободных плеча то же »

NG19 дикий тип » »

NG25 сп кп с рх зр » метацентр ик

NG24 спкп с рхзр » то же

NG101 сп кп с рх йр делеция области »

NG30 кп с нормальный эухроматин »

NG29 кп с то же »

NG100 кп с сложная перестройка 34С; 35В; 53F; 54В сложная перестройка

В опыте, среди 380 регулярных самок были обнаружены 2 особи net, 1 особь рг, 3 особи Ъ рг и 7 особей w. Появление особей последних двух классов не являлось результатом искомых обменов, а представляло собой либо результат многократных обменов, либо делеций. Таким образом, частота обменов составила 3 / 380 = 0.79 • Ю-2 . В контроле, среди 304 самцов были найдены 4 самца рг и 1 самец Ъ рт. Частота этих событий составила 4 / 304 = 1.32 • Ю-2. Сравнение частот обменов, проведенное по критерию Фишера, показало недостоверность различий. Это означало, что продукт гена musl04 , участвуя в процессе репарации повреждений, приводящих к формированию транслокаций, не участвует в процессе формирования индуцированных митотических обменов. Этот вывод совпадает с результатами работы (Becker, 1978) для другого аллеля мутации mei4l. Однако, наше сравнение является более корректным, поскольку оно было проведено в одной и той же ткани, на одной стадии онтогенеза.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что митотические обмены в хромосомах самца, возникающие при облучении гиперплоидных спермиев, формируются раньше, чем обмены между облученными хромосомами самца и интактными хромосомами самки. Они происходят в первом делении дробления, после репликации хромосом самца.

2. Показано, что существует отрицательная интерференция между обменами внутри плеча, что можно объяснить наличием непрерывной зоны соматического синапсиса, обеспечивающего эффективное прохождение обменов. Лимитирующим фактором обменов является формирование зоны синапсиса, а не наличие разрывов ДНК, ведущих к обменам.

3. Анализ распределения митотических обменов показал, что в прицентромерных районах они происходят чаще, чем следует ожидать, исходя из оценки количества ДНК, что указывает на то, что повышенный митотический кроссинговер в прицентромерных районах хромосом не связан с компактной структурой этих районов.

4. Показано, что неполные обмены при митогическом кроссинговере не образуются. Это свойство отличает эти обмены от перестроек хромосом (в частности, транслокаций) и указывает на существование механизма, сходного с мейотическим, гарантирующего взаимность обмена.

5. Показано, что при материнском эффекте мутации по пострепликативной репарации тш10401 частота митотических обменов не изменяется по сравнению с контролем. Так как в аналогичной системе тшЮ'Г1 увеличивает частоту образования транслокаций, можно утверждать, что генетический контроль формирования перестроек и митотических обменов различен.

6. Предложен метод тестирования эффекта репарационных мутаций, который позволяет проводить сравнение влияния этих мутаций на митотические обмены и транслокации в одной и той же ткани, на одной стадии онтогенеза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Омельянчук Л.В., Волкова Е.И. Радиационно-индуцированый митотический кроссинговер в пронуклеусе самца дрозофилы // Генетика. 1993. Т.29.№ 8. С.1328-1331.

2. Омельянчук Л.В., Волкова Е.И. Роль гетерохроматина в мейотическом спаривании хромосом самцов ОговорИНа ше1апо§ав1ег // Генетика. 1994. Т.ЗО. № 6. С.791-795.

3. Омельянчук Л.В., Волкова Е.И. Природа радиационно-индуцированных обменов между гомологами в гиперплоидном мужском пронуклеусе дрозофилы // Генетика. 1994. Т.ЗО. № 7. С.934-937.

4. Омельянчук Л.В., Волкова Е.И. Повышенный митотический кроссинговер в гетерохроматине в первом делении дробления у ОгоБорЬИа те1аш^а51ег // Генетика. 1995. Т.31. № 6. С.804-808.

5. Омельянчук Л.В., Волкова Е.И. Различие с генетическом контроле процессов формирования индуцированных хромосомных аберраций и митотических обменов II Генетика, в печати.