Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МИКРООРГАНИЗМЫ В ПРОЦЕССЕ САМООЧИЩЕНИЯ ШЕЛЬФОВЫХ ВОД СЕВЕРНОГО КАСПИЯ ОТ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "МИКРООРГАНИЗМЫ В ПРОЦЕССЕ САМООЧИЩЕНИЯ ШЕЛЬФОВЫХ ВОД СЕВЕРНОГО КАСПИЯ ОТ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ"



МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи УДК 628.394.4; 576.8(26)

Куликова Ирина Юрьевна

МИКРООРГАНИЗМЫ В ПРОЦЕССЕ САМООЧИЩЕНИЯ ШЕЛЬФОВЫХ ВОД СЕВЕРНОГО КАСПИЯ ОТ НЕФТЯНОГО

ЗАГРЯЗНЕНИЯ

Специальность 03.00.18 - гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Л

1'абота выполнена в лаборатории микробиологического мониторинга кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор И.С. Дзержинская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.П. Садчиков доктор биологических наук, И,Е. Иванова

Ведущая организация:

Институт биологии внутренних вол PAI t

Зашита диссертации состоится 4 марта 2004 года в 15 часов 30 мин. па заседании диссертационного совета Д.501J001,55. В Московском Государственном Университете им. MB. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьёвы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ,

Автореферат разослан 3 февраля 2004 г.

Учёный секретарь диссерташю иного Совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одним из негативных факторов воздействия на водную среду и биологические ресурсы является широкомасштабное освоение нефтяных месторождений в морях, имеющих важное рыбохозяйствекное значение. Нефтяные углеводороды в силу своей биологической активности относятся к наиболее опасным загрязняющим веществам, длительное воздействие которых может нарушать сложившееся равновесие экосистем.

В отличие от ксенобиотиков углеводороды нефти непрерывно поступают в морскую среду за счет подводных выходов нефти из морских месторождений на дне. Такие же или близкие по составу углеводороды продуцируются в результате биосинтетических процессов в живых организмах (Миронов, 1973, 1985; Патин, 1997; Немнровская, 2000). Поэтому многие углеводороды являются естественными компонентами органического вещества незагряз пенных водных экосистем, а природные микробные ценозы генетически адаптированы к их разрушению. В силу высокой пластичности обменных процессов микробные популяции являются мощным фактором процессов самоочищения природных вод от нефтяного загрязнения (Коронеллн и др., 1993; Ильинский, 2000).

Самоочищение экосистем, за!рязненных нефтью и нефтепродуктами, является стадийным биогеохимнческим процессом трансформации загрязняющих веществ, где микробное окисление углеводородов - ведущий фактор процесса элиминации нефти. В результате деятельности микроорганизмов происходит трансформация нефти до простых соединений и, тем самым, включение углеводородных компонентов в обший круговорот углерода в океане.

Северный Каспий является уникальной акваторией, годролого-гндрохнмический режим которой формируется сложными процессами, обусловленными частой штормовой активностью, конвергенцией вод, мелководно-стью, изменчивостью солености и влиянием речного стока.

I—

ЦНСМСХА ручной литере

Именно в ситуации освоения нефтяных месторождений на шельфе Северного Каспия представляет интерес изучение в этой акватории процесса самоочищения и микроорганизмов, обладающих способностью разрушать нефтяные углеводороды.

Цель н задачи исследования Целью настоящей работы является исследование микроорганизмов процесса самоочищения шельфовых вод Северного Каспия от нефтяного загрязнения.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Выявить в исследуемой акватории районы с повышенным содержанием нефзяных углеводородов

2. Изучить распределение и численность физиологических групп микроорганизмов, гипотетически способных к окислению нефти

3. Исследовать в моделях самоочишающую способность морской воды при различной степени нефтяного загрязнения.

4. Выделить и изучить свойства активных штаммов микроорганизмов -деструкторов нефти,

5. Изучить возможность активизации процесса самоочищения внесением выделенных микроорганизмов.

6. Идентифицировать наиболее активный и жизнеспособный штамм. Научная новизна В работе показано, что шельфовые воды Северного

Каспия в районе освоения месторождений углеводородного сырья обладают способностью к самоочищению от нефтяного загрязнения. Впервые выделен и изучен новый штамм РЬуНоЬаиегшт тугзтасеагит, способный к деструкции нефтяных углеводородов.

Практическая значимость Результаты комплексных микробиологических и гидролого-гидрохимических наблюдений в районе освоения нефтяных месторождений на шельфе Северного Каспия являются составной частью мониторинга морской среды при проведении буровых работ. Подана заявка о вы-

даче патента на изобретение «Штамм РкуНоЬааегтт тугзшасеагит ОК5-1 для деструкции нефтяник, углеводородов солоноватоводных к пресных экосистем» (приоритет от 31.10.03 № 2003131668). Материалы диссертационной работы входят в раздел «Оценка воздействия на окружающую среду» индивидуальных рабочих проектов по строительству поисково-разведочных скважии ОАО «Лукойл» в северной части Каспийского моря, а также используются в учебном процессе в институте «Биология и природопользование» Астраханского государственного технического университета.

Апробация работы. Основные положения и материалы диссертации были представлены на Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2001), на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы аквакультуры и функционирования водных экосистем» (Киев, 2002), на V Международном конгрессе «Вода: экология и технология» (Москва, 2002), на Международной конференции «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002), на XII Международной конференции молодых ученых «Биология внутренних вод: проблемы экологии и биоразнообразия» (п. Борок, Ярославская обл., 2002), на международной научной конференции «Проблемы мониторинга экосистем Каспийского моря» (Махачкала, 2002), на I -м совещании по формированию прогрзммы исследовании «Мониторинг и биологическая реабилитация загрязненных нефтью и нефтепродуктами территорий» (Астрахань, 2002), на конференции «Биотехнология в охране и реабилитации окружающей среды» (Москва, 2003), на Международной конференции «Ры бохозя йствен н ая наука на Каспии: задачи и перспективы» (Махачкала, 2003), на |шумно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава Астраханского государственного технического университета в 2001-2003 гг.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений, изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована б таблицами и 18 рисунками. Список использованной литературы включает 240 источников, из них 78 на иностранных языках.

Автор выражает благодарность научному руководителю доктору биологических наук, профессору И.О. Дзержинской, а также сотрудникам кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для написания работы послужили весенние и осенние экспедиционные исследования в 2000-2001 г.г. на шельфе Северного Каспия на лицензионном участке ОАО (Лукойл» и экспериментальные исследования на моделях в лаборатории микробиологического мониторинга кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ.

Объектом исследования являлась морская вода и гетеротрофные микроорганизмы в районе структур «Хвалынска^» и «Ракушечная» Северного Каспия (рис. 1). Всего было исследовано 528 проб морской воды с поверхностного и придонного горизонтов 66 станций. В лабораторньк условиях были поставлены микроэкосистемы на естественной и стерильной морской воде в количестве 39 сосудов.

Отбор проб морской воды для исследований и проведение гидрохимических и микробиологических анализов осуществлялись в соответствии с ГОСТами и общепринятыми методиками (Родина, 1965; Романенко, Кузнецов, 1974; Киселев, 1976; ГОСТ 17.1.3.07-82; ГОСТ 17.1.5.05-85; Кузнецов, Дубинина, 1989; Унифицированные методы анализа вод, 1976; Руководство по химическому анализу поверхностных вод суши, 1977; Руководство по методам бноло-

гнческого анализа морской воды и донных отложений, 1980; руководство Новикова и др., 1981; Руководство по химическому анализу морских вод, 1993).

Для моделирования процесса естественного самоочищения морской воды от нефти использовали метол микроэкосистем (Одум, 1986) в модификации И.С.Дзержинской (1987), созданной с учетом имеющихся тестов на токсичность (Методики биологических исследований, 1971; Методические указания, 1973; Методические рекомендации, 19S5). Микроэкосистемы были смоделированы на естественной и стерильной морской воде с добавками от 0,1 до 2 % каспийской нефти. О самоочищающей способности воды судили по изменению суммарного содержания нефтяных углеводородов флюориметричес ки м методом на приборе Флюорат - 02 - 3 М (Сборник методических указаний, 1997), деструкции растворенного органического вещества (но показателю БПК), а также косвенным показателям - численности бактерий, трансформирующих загрязняющие вещества (сапрофитных и углеводородокисляющих).

Микроорганизмы, способные к деструкции нефтяных углеводородов, были выделены из проб воды Северного Каспия на минеральной среде Миллса с соавторами (Mills et al., 1978) с добавками каспийской нефти через накопительные культуры по общепринятой методике (Руководство по методам биологического анализа морской воды и донных отложений, 1980). Изучение свойств выделенных штаммов проводили по определителям (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1984-1989; мо но [рафии Нестеренко с соавт., 1985; монографии Смирнова и Киприановой, 1990).

Для активизации процесса самоочищения использовался метод гнотобио-тических микроэкосистем (Одум, 1986), поставленных на морской воле, с внесением 1 % стерильной каспийской нефти и чистых культур в виде суспензии. Сухой вес биомассы и количество жизнеспособных внесенных клеток определяли но общепринятым методикам (Д.МеЙнелл, Э.Мейнелл, 1967). Активность

исследуемых штаммов оценивали по изменению суммарного количества нефтяных углеводородов флюорнметрнческим методом.

Для определения филогенетического положения наиболее активного и жизнеспособного штамма проводился анализ последовательности (сиквенс) его I6S рибосом нога гена, который был выполнен в Центре «Био инженерия» института микробиологии РАН. Построение филогенетического дерева исследуемого штамма производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON {Van de Peer, De Wächter, 1994).

Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью пакета статистического анализа программы Microsoft Excel 2000, учебного пособия Лакина (1973), а также программы STAT1STICA -99.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспедиционные исследования с целью изучения микроорганизмов процесса самоочищения шельфовых вод Северного Каспия от нефтяного загрязнения проводили на структурах «Хвалынска»» и «Ракушечная» (рис. 1).

Структура «Хвалынская» находится в юго-восточной части Северного Каспия, для которой характерна значительная степень обмена вод с водами Среднего Каспия. Глубины станций на структуре «Хвалынская» составляли от 7,0 до 39,5 м, средняя глубина - 23,1 м. В районе глубоководных станций располагалась самоподъемная плавучая буровая установка «Астра», используемая для проведения поисковых буровых работ.

Структура «Ракушечная», примыкающая к взморью рек Волга и Терек, где сказывается влияние выносных течений, менее глубоководная - от 3,5 до 13,5 м, средняя глубина-7,1 м.

Примечание: цифрами обозначены номера станций отбора проб води Pur, I. Схема расположения станций отбора проб на шельфе Северною Касли«

Гидрометеорологические условия в период проведения экспедиционных работ весной и осенью на исследуемых структурах были типичны для данного района Каспийского моря. Температура воды весной от 7,7 до 17,6 °С, осенью - 12,7 - 23,2 °С. Соленость воды в весенний период была в интервале от 1,7 до 12,8 %о, осенью -4,2-12,5 %о. Максимальные значения солености воды отмечены на глубоководных станциях в районе буровой установки. Содержание кислорода в воде весной составляло от $,6 до 15,0 мг/л, осенью - от 3,0 до 6,9 мг/л.

Распределение нефтяных углеводородов в исследуемой акватории

Содержание нефтяных углеводородов в воде за время всех экспедиций составляло от 2 до 347 мкг/л, в среднем от 23,4 до 52 мкг/л н от 5,8 до 43,7 мкг/л в поверхностном и придонном горизонтах соответственно (рис. 2).

Рис. 2. Средняя концентрация углеводородов в поверхностном и придонном горизонтах вол Северного Каспия

По данным весенней экспедиции 2000 г. содержание углеводородов в воде варьировало от 7,1 до 238 мкг/л, осенью 2000 г. от 2 до 347 мкг/л. Весной 2001 г* их концентрация в воде составляла от 2 до 138 мкг/л, осенью 2001 г. от 2 до 342 мкг/л при ПДК 50 мкг/л (Патин, 1997).

В исследуемой акватории отмечены области с повышенным содержанием нефтяных углеводородов в воде - юго-западный мелководный участок в районе островов Тюлений и Чечень, а также в районе буровой установки «Астра».

Вполне очевидно, что в шельфовых водах Северного Каспия присутствуют микроорганизмы, способные к деструкции нефтяных углеводородов,

Фнзиолотческие группы микроорганизмов, гипотетически способные к окислению нефтяных углеводородов

Общепринято считать, что в процессе самоочищения воды от нефтяного загрязнения участвуют не только углеводородокнеляющие, но и сапрофитные, олиго-трофные и фенолокисля ющие бактерии, относящиеся к гетеротрофам.

В воде исследуемого района отмечено преобладание бактерий в поверхностном горизонте вод по сравнению с придонным (табл. 1), что видимо, обусловлено наличием температурной стратификации и большим содержанием биогенных и органических веществ в поверхностном слое. В весенних экспедициях уровень развития всех бактерий был выше, чем в осенних, что возможно, связано с повышением концентрации биогенных и органических веществ, развитием фитопланктона при увеличении стока паводковых вод.

При этом доминирующими являлись сапрофитные микроорганизмы. Их численность колебалась от сотен клеток до 200 тыс. кл /мл (табл. 1), в среднем от 4,9 тыс. до 16,4 тыс. кл/мл.

Олиготрофы по обилию значительно уступали сапрофитам, что свидетельствует о преобладании в акватории легкодоступного органического вещества, н составлял» от сотен до 30 тыс. кл/мл (табл. 1), в среднем от 1,3 тыс. до 5,6 тыс, кл/мл.

За время экспедиционных исследований выявлены участки с максимальным обилием сапрофитов и олиготрофов - вблизи островов Тюлений и Чечень, а также в районе буровой установки. Это может быть связано с проведением поисковых буровых работ, а в мелководных участках - взмучиванием донных отложений сильными волнениями, характерными для исследуемого района.

Таблица I. Численность физиологических групп микроорганизмов в шельфовык водят Северного Каспия, гипотетически способных к окислению нефтяных углеводородов

11! Физиологические 1-руппы

сапрофиты, тыс. кл/мл олиготрофы, тыс. кл/мл феиолокисляющие, тыс. кл/мл у гл еводородокисля юише, тыс. кл/мл

поверхностный го-ризоот придонный горизонт поверхностный горизонт придонный горизонт поверхностный горизонт придонный горизонт поверхно-стнь(й горизонт придонный горизонт

весна 2000 1-200 1б,44±3,9 Р,8-150 11,17±2,5 0,3-30 5,23±0,7 0,1-30 3,5±0,62 ед.кл,-20 4,8*0,63 ед.юу.Ю 1,4 ±0,22 0,5-30 0,1-11 3,8±0,38

осень 2000 1-35 7,5±0,83 0,8-25 5,6±0,65 0,3-9 2,1 ±0,21 0.2-9 1,3±0,16 ед.кл.-15 3,6±0,39 ед.кл,-8 1,8±0,24 1-26 8,13±0,72 0,5-23 5,7±0,61

весна 2001 1-30 11,81 ±0,8 0,5-20 7,1 ±0,62 0,5-19 5,6±0,57 0,5-17 3,38±0,44 ед.кл.-12 1,48±0,24 ед.кл.-З 0,61 ±0,08 , ,1,-35 10,48±0,93 0,8-30 8,2±0,85

осень 2001 1-40 6,3±0,89 0,2-40 4,9±0,78 0,4-10 2,3 ±0,23 0.1-6 1,4±0,16 ед.кл,-12 0,9±0,25 ед.кл.-10 0,6±0,18 0.3-30 3,4±0,63 0,2-20 2,5±0,47

Примечание: в числителе - пределы колебаний численности бактерий; в знаменателе - средня* численность бактерий

Фенолокнсляющие оказались самой малочисленной группой — их численность колебалась от единичных клеток до 20 тыс, кл/мл (табл. 1), в среднем от 0,6 тыс. до 4,8 тыс. кл/мл. Максимальное обилие фенолокисляюших микроорганизмов на всех горизонтах вод отмечено в районе буровой установки.

Углеводородокисляюшие являлись постоянным компоне!пом бактериоцено-зов воды исследуемой акватории и составляли от сотен клеток до 35 тыс. кл/мл (табл. 1), в среднем от 2,5 тыс. до 10,5 тыс. кл/мл. Особенно показательна высокая численность этих бактерий в районах, где отмечено низкое содержание нефтяных углеводородов.

При этом, чем выше количество сапрофитов и олиготрофов, тем больше среди них и бактерий, способных к окислению углеводородов. Можно предположить, что между обилием сапрофитных и олиготрофных бактерий с одной стороны и углево-дородокисляюших — с другой, существуют определенные связи.

Расчет парных коэффициентов корреляции показал, что численности сапрофитов и олиготрофов имеют функциональную связь (R=0,54-0,85), отмечена связь угле водородокисляющих и фенолокнсляющих с остальными группами (R=0,31-0,86). Обнаружение этих связей, как считает В.В. Ильинский (2000), может свидетельствовать как об эвригетеротрофности бактернопланкгона (т.е. о его способности к росту, как на бедных, так и на богатых органических средах), так и о том, что способность к росту на питательных средах, независимо от их состава, определяется состоянием микробного сообщества в конкретной акватории. Отсюда следует, что с ростом численности жизнеспособных бактерий в любой акватории возрастает и величина той части их популяции, которая способна к окислению углеводородов.

Изучение углеводородокисляющих микроорганизмов в морских водах обычно связывают с загрязнением их нефтью и нефтепродуктами. Некоторыми отечественными исследователями было предложено использовать их численность для того, чтобы картировать за<рязненность морских вод нефтью (Цыбань, 1976, 1980; Миронов, 1971, 1980), а саму группу микроорганизмов, способных к росту на нефти и нефтепродуктах считать «индикаторной». Однако известно, что углеводородокис-ляющие бактерии широко распространены в природе, их пищевые потребности раз-

нообразны и среди них нет узкоспециализированных форм (Шлегель, 1972; 1987). Согласно современным представлениям (Ильинский, 2000; Бсрдичевская и др., 1991; Янушка, 1990; Салманов, 1999) углеводородокисляющие являются постоянным компонентом микробиоценозов, независимым от уровня загрязнения нефтепродуктами.

Корреляционный анализ показал, что нефтяные углеводороды не входят в число факторов влияющих на численность гетеротрофных бактерий, в том числе уг-леводородокисляющих. Следовательно, эта группа микроорганизмов не может служить надежным индикатором нефтяного загрязнения морской среды.

Вполне очевидно, что гетеротрофные бактерии в исследуемой акватории обладают способностью участвовать в процессе самоочищения вода от нефтяного загрязнения, в противном случае началась бы аккумуляция этих соединений в воде.

Моделирование процесса естественного самоочищения морской воды от

нефти

В модельных экосистемах, созданных для исследования способности самоочищения морской воды от нефтяного загрязнения в первые сутки нефть является фактором, подавляющим развитие некоторых санрофнтов, не растущих на средах с нефтью. Для углеводородокиедяющих нефтяное загрязнение вносит дополнительный источник углерода, и численность этих бактерий возрастает (табл. 2).

Установлено, что максимальная деструкция нефти в морской воде наблюдается в течение первых трех суток (рис. 3) и совпадает с логарифмической стадией развития бактерий. В первом варианте эксперимента (0,1 % нефти) убыль нефтяных углеводородов составила 28,3 %, во втором (I % нефти) - 31,6 %, в третьем (2 % нефти) - 35,7 %, в контроле со стерильной морской водой от 3 до 5 %

Через 10 суток отмечен второй пик развития сапрофита в, для углеводородо-кисляющих - это экспоненциальная фаза роста - их численность возрастает на порядок. Во всех опытных вариантах БПК увеличивается в сравнении с контролем. При этом убыль нефтяных углеводородов составила: в первом варианте 41,9 %, во втором - 55 %, в третьем - 54,6 %, в контроле — от 5 до 7 %.

Показатели Варианты экспернме нта Точки отбора проб в микроэкосистемах, имитирующих щения морской воды от нефтяного заг процесс естественного самоочи-рязнения, сутки

0 1 3 5 10 15 20 30

Численность са-профитов, кл/мл Контроль 9,5X3 О4 4,4Х 10' з,зх ю4 ),6Х 10' 3,1Х )04 2,8Х Ю3 2,8Х )03 2,5 X 101

I вариант 9,5 X 104 6,5 X 10' 3,2Х 105 1,4Х Ю4 2,5Х 10* их ю4 3,1Х 10' 7,1X10*

2 вариант 9,5Х 10" 7,6 X 10' 1,7Х 105 1,8Х Ю4 4,4Х 10* 1,5Х 104 3,2Х 10* 1.7Х Ю4

3 вариант 9,5 X 10" 8,7Х Ю3 3,2Х 105 3,5Х 104 2,IX 10* 1,4Х 104 2,6Х 10* 2,3 X 104

Численность угле-водородо-кисляю-щих, кл/мл Контроль 1,6Х 10' 1,8Х Ю3 1,6Х 10' 1,2Х 10' 1^2Х 104 1,2Х Ю4 1.2Х 104 1,1Х 10'

1 вариант 1,6Х 103 1,8X104 1,7Х 10* 4,ЗХ Ю4 9,9Х 10* 9,0Х 106 6,IX ю5 2,7Х 103

2 вариант 1,6Х 103 2.6Х Ю4 их 10* 2.9Х Ю4 5,7Х 10' 9,4 X Ю6 8,4Х Ю1 3,1Х ю3

3 вариант 1.6Х 105 3,6Х Ш4 2, IX 10* 4,7Х 10ч 7,0Х 10' 9,9Х 106 9,9Х 105 4,ОХ 103

БПКпйлт мг Ог /л Контроль 6,88 7,5 6,3 4,72 5 3,26 3 2,59

1 вариант 6,88 8,5 10,7 3,66 9,5 9 8,5 2,5

2 вариант 6,88 9,84 п,з 3,5 10,4 10 9 3

3 вариант 6,88 10,1 12,1 4 11 11 10 2,6

Примечания: I вариант - микроэкосистемы с 0,1 % нефти

2 вариант- микроэко системы с 1 % нефти

3 вариант- микроэкосистемы с 2 % нефти

входная

3 сут.

Юсут.

20сут,

ЭОсут

- 1 в^нант (Э.1% ндфгн]

(1% чла-'«;

Сне. 3. Динамика нефтяных углеводородов в мнкроэкосистсма*

На 20 сутки экспозиции в опытных вариантах отмечен третий пик развития сапрофитов и снижение численности углсводородокисляющих при повышении физиологической активности, определяемой но БПК. К ггому времени в первом варианте убыль нефтяных углеводородов составила 50,7 %, во втором - 64,7 в третьем - 70,9 %, в контроле - от 7 до 9 %. Периодические колебания численности микроорганизмов свидетельствуют о том, что внесенная нефть не только не оказывает инги-бирующего влияния на микробиоценозы морской воды, но и стимулирует их развитие.

Спустя 30 суток экспозиции в мнкроэкоснсгемах с внесением нефти отмечено снижение численности всех исследуемых групп бактерий и БПК. При этом деструкция нефтяных углеводородов шла медленнее, видимо, это связано с тем, что к этому времени остаются труднодоступные нефтяные фракции. Убыль нефтяных углеводородов составила 53,2 % в первом, 70 Д % во втором и 7& % в третьем вариантах опыта, в контроле от 9 до 11 %,

Таким образом, установлено, что в модельных микроэкосистемах наблюдается процесс самоочищения морской воды, который активен при различной степени нефтяного загрязнения.

Выделение и изучение свойств микроорганизмов—деструкторов нефти

Из шельфовых вод Северного Каспия выделены два штамма микроорганизмов, доминирующие при высеве на плотные среды с нефтью и нефтепродуктами.

Штамм № 1 при культивировании на МПА образует выпуклые, блестящие, слизистые, круглые с ровным краем колонии, 1-2 мм в диаметре. Пигментация колоний от светло-розовой до красной. На МПЕ образует однородную муть и осадок, на жидкой среде Миллса с нефтью в стационарных условиях появляется пленка розового цвета. Штамм представляет собой грамварнабельные прямые, подвижные, не образующие спор палочки. Культура является аэробной, оксидззоположительной, каталазоположительной, галотолерантной (рост до 20 % ЫаС1), не гидролизует крахмал, казеин, пектин и целлюлозу, не разжижает желатин, не образует сероводород и индол, восстанавливает нитраты в нитриты, образует кислоту из глюкозы, не окисляет лактозу. Выделенный микроорганизм не имеет аргиннндегидролазу, лизин - и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланикдезамшшы, (3-галактозидазы, не утилизирует цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой.

Штамм № 2 при культивировании на МПА растет в виде бесцветных плоских колоний с расползающимися краями. Представляет собой прямые подвижные тонкие грамотрицательные палочки, не образующие спор. Культура является аэробной, оксидазоположительной, каталазоположительной. Рост на МПБ сопровождается образованием мути, хорошо растет на МПБ с 7 % №С1, не растет на бульоне с 10 % содержанием соли. На среде Миллса рост сопровождается появлением пленки. Выделенный микроорганизм имеет аргиннндегидролазу, но не имеет лизин- и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилалакиндезаминазы, £ -галактозидазы. Не образует сероводород и индол, не утилизирует цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой. Усваивает глюкозу, арабннозу, мальтозу, не усваивает маннит, сахарозу, лактозу, инозит, сорбит. Не способен к ленитрификацин, не способен к анаэробной ферментации глюкозы, в аэробных условиях окисляет глюкозу до кислоты. Не разжижает желатин.

Выделенные штаммы хорошо растут на жнаких и плотных средах с нефтью и нефтепродуктами, что позволило использовать их в качестве активных деструкторов

нефтяных углеводородов в микроэкосистемах, созданных для активизации процесса самоочищения морской воды от нефтяного загрязнения.

Активизация процесса самоочищения внесением выделенных микроорганизмов

В модельные экосистемы, созданные для активизации процесса самоочищения, вносились суспензии выделенных штаммов в количестве 106 бактериальных клеток в 1 мл при сухом весе биомассы штамма На 1 - 92,4 мг/л, штамма № 2 - 83,3 мг/л.

Рнс. 4. Активизация процесса самоочишеиня от нефтяных углеводородов в микрожоснсте-мах внесением активных штаммов.

В результате эксперимента установлено, что в микроэкосистемах наиболее активное окисление нефтяных углеводородов наблюдалось в течение первых 3 суток и через 30 суток экспозиции их убыль составила с внесением штамма № 1 - 96 %, штамма № 2 - 89,4 %, смеси штаммов - 96,6 %, в контроле - 70,3 % (рис. 4). Следова-

тельно, штамм № 1 активизирует процесс естественного самоочищения морской воды на 25,7 %, штамм № 2 - на 19,1 %, смесь штаммов - на 26,3 %.

Таким образом, оба штамма показали высокую деструкционную способность по отношению к нефтяным углеводородам. Однако, при длительном культивировании в лаборатории в одинаковых условиях штамм № 2 оказался нежизнеспособным, что делает его непригодным для целей экологической биотехнологии, поэтому только со штаммом № ] проводился филогенетический анализ для установления его таксономического статуса.

В результате ан&чиза определена значительная часть последовательности гена

163 рРНК (1375 нуклеотидов) выделенного штзмма, что соответствовало позициям

с 55 по 1465 по номенклатуре Е.соП,

РНу11оЬас1епит тугзтасеагит НМ35 | 'щРИу11оЬас)епит тугз/пасеагит 1АМ 13584 1 РЬуИоЬааегтт туп'тасеапт 1АМ 13587 1-Штамм № I

1 Рзе и<1ат1>юЬас!ег $аИсу1шоХ1(1ап$ ВЫ 12т

~ АццаписгоЫит <&/7глч7 ЭЭМ 11603т

-ОфхаЛЬасыг /маНае 05МП099Т

\Aminobacter атто\огат 05М7048Т ^"^СИеЫоЬааегкеШ:П Э5М6450Т

Ат'тоЪааег пЩсчаепъЬ О5М7050т Ат'тоЬаМег а%апоетт Р5М7051Т \fesorhizobhim сИасоете РЯ5 МеяогЬкоЫит !оИ иБОА 3467т

■ I

«Г А;

Г %

МехогЫюЫит скеп иРМ-Са7т МеБОгНкоЫит патЪапете и50А 3592т Ме$огЫ;оЬтт тесИгеггапеит 11РМ-СаЗбт

**\\Ме$ог1и:оЬшт атогрИае АССС 19665х МехогЫ2оЫит р1ип/апит ЬКЮ 11892т Мезог1й:оЫит А иакип 1Р0152437

Рис. 5. Филогенетическое положение штамма Л» 1

Филогенетический анализ показал, что изучаемый штамм относится к а-подклассу протеобактерий, к кластеру членов семейства Phyllobacteriacea. Внутри этого семейства изучаемый штамм был ближе всего к представителям единственного вида рода Phyllobacterium - P. myrsinacearum, обнаруживая с ним 97,0 - 97,5 % сходства последовательностей (рис. 5).

Таким образом, исследования по установлению таксономического статуса штамма № I позволили отнестл его к виду Phyllobacterium myrsinacearum.

В связи с тем, что впервые доказана деструкционная способность штамма Phyllobacterium myrsinacearum по отношению к нефтяным углеводородам, подана заявка о выдаче патента на изобретение «Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 для деструкции нефтяных углеводородов солоновато водных и пресных экосистем» (приоритет от 31.10.03 № 2003131668).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные ранее микробиологические исследования Каспийского моря (Буткевич, 1938; Евдокимов, 1937; Осницкая, 1954; Крисе, 1956; Цыбань, 1976; Попова, 1978; Эфендиева, 1979; Салманов, 1981, 1999; Иванов, Сокольский, 2000) касались деятельности различных групп микроорганизмов, обших вопросов продукции и деструкции органического вещества.

В настоящее время в связи с освоением месторождений углеводородного сырья на шельфе Северного Каспия особый интерес представляет изучение микроорганизмов процесса самоочищения воды от нефтяного загрязнения.

Наши исследования позволили установить, что микроорганизмы шельфовых вод Северного Каспия принимают активное участие в процессе самоочищения от нефтяного загрязнения. Об этом свидетельствует наличие микроорганизмов различных физиологических групп в районах с повышенным уровнем нефтяного загрязнения, а также их способность к деструкции нефтяных углеводородов.

Были выявлены участки акватории с повышенным содержанием нефтяных углеводородов - в районе плавучей буровой установки и островов Тюлений и Чечень. Здесь же обнаружено максимальное обилие сапрофитов и олиготрофов. Это может

быть связано с проведением поисковых буровых работ, а в мелководных участках -взмучиванием донных отложений сильными волнениями, характерными для исследуемого района.

Углеводородокисляющие бактерии являлись постоянным компонентом бакте-риоценозов воды исследуемой акватории.

Проведенный корреляционный анализ позволил установить, что численность углеводородокисляющих бактерий не может служить количественным показателем загрязнения водной среды нефтяными углеводородами, что подтверждает мнение других авторов (Янушка, 1990; Салманов, 1999; Ильинский, 2000).

Процесс естественного самоочищения морской воды активен при различной степени нефтяного загрязнения, что подтверждается экспериментальными данными. Причем, максимальное разрушение нефти бактериями происходит в течение первых трех суток в период логарифмической стадии их роста, что согласуется с литературными данными (Goma et al., 1973; Репу, 1973; ZoBeíl, 1973; Спонти, 1979).

Штаммы, доминирующие в пробах воды Северного Каспия, показали высокую способность к деструкции нефтяных углеводородов в модельных экосистемах. Так штамм № 1 активизирует процесс естественного самоочищения воды на 25,7 %, штамм № 2-на 19,1 %, смесь штаммов — на26,3 %.

На основе филогенетического анализа более жизнеспособный штамм № 1 идентифицирован как Phyllobacterium myrsinaceamm. По данным литературы (Knosel, 1962; Lambert et al, 1990; Megan M.McCoy, 2000; Rojas et. al., 2001; Mergaert et ai, 2002) этот вид встречается в узелках листьев мангровых растений, корнях сахарной свеклы и почве. Информации о нем как о деструкторе нефти и нефтепродуктов не обнаружено. Подана заявка о выдаче патента на изобретение, которое предназначено для использования в экологической биотехнологии, микробиологии при разработке способов биологической очистки водных экосистем бактериальным штаммом Phyllobacterium myrsinaceamm от загрязнения нефтью и нефтепродуктами.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в шельфовых водах Северного Каспия наблюдается процесс самоочищения от нефтяного загрязнения, в

основе которого лежит деятельность микроорганизмов, таких как РЬу11оЬас1егшт ту^тасеагшп, способных к деструкции нефтяных углеводородов.

ВЫВОДЫ

1. Содержание нефтяных углеводородов в воде Северного Каспия за период исследований составляло от 2 до 347 мкг/л с повышенным уровнем загрязнения в районе буровой установки и вблизи островов Тюлений и Чечень.

2. Численность сапрофитов в районе исследований составляла от сотен клеток до 200 тыс. кл/мл, олиготрофов - до 30 тыс. кл/мл, углеводородокисляющих - до 35 тыс. кл/мл. фенолокисляю щих - от единичньк клеток до 20 тыс. кл/мл,

3. Максимальное количество сапрофитов и олиготрофов отмечено на станциях вблизи островов Тюлений и Чечень, а также в районе буровой установки, где зарегистрирована также максимальная численность фенолокисляющих бактерий. Это связано с проведением поисковых буровых работ, а в мелководных районах -взмучиванием донных отложений сильными волнениями, характерными для исследуемого района. Распределение углеводородокисляющих бактерий носило равномерный характер.

4. Корреляционные связи между численностью исследуемых групп микроорганизмов свидетельствуют об эвригетерогрофности бактериопланктона, обилие которого определяется конкретной гидролого-гидрохимической ситуацией. Значимых корреляционных связей между численностью углеводородокисляющих бактерий и содержанием нефтяных углеводородов в воде не отмечено, что не позволяет использовать данную группу микроорганизмов в качестве индикаторов нефтяного загрязнения,

5. (Три моделировании естественного самоочищения морской воды максимальное разрушение нефти происходит в течение первых трех суток. Убыль нефтяных углеводородов через 30 суток экспозиции в первом варианте (0,1% нефти) составила 53,2 %, во втором (1% нефти) - 70,3 %, в третьем (2% нефти) - 78 %, в контрольных вариантах со стерильной водой от 9 до 11%.

6. Бактериальные штаммы, выделенные из шельфовых код Северного Каспия, показали высокую способность активизировать процесс естественного самоочншення морской воды от нефти — штамм № 1 на 25,7 %, штамм № 2 - на 19,1 смесь штаммов - на 26,3 %. На основе филогенетического анализа наиболее активный и жизнеспособный штамм № 1 идентифицирован как Phyllobacterium myrsinacearum, не известный ранее как деструктор нефтяных углеводородов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Сопрунова О.Бт Куликова И.Ю. Исследование процессов бактериального разрушения нефтепродуктов в морской воде /I Труды Международ. Форума по проблемам науки, техники и образования. Том 3. - М.: Академия наук о Земле, 2001.-С. 22-24.

2. Куликова И.Ю. Самоочищение морских вод от нефтяного загрязнения И Проблемы аквакультуры и функционирования водных экосистем. Сборник матер. Междунар. науч.- практич. кокф. молодых ученых. Киев, 2002, - С. 15S-160.

3. Куликова И.Ю. Микробиологическое самоочищение морской воды or нефтяных остатков // Вода: экология и технология. Материалы V Международ, конгресса (ЭКВ АТЕК, 2002.). - Москва, 2002. - С. 89.

4. KuHkova I. Microbiologic self-purification of marine water from petroleum residue //5 th International Congress Ecwatech - 2002. Water: Ecology and Technology, -Moscow, 2002. - P. 60.

5. Куликова И JO. Самоочищение морских вод от нефтяного загрязнения // Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах. Материалы Междунар. конференции. - Москва, МГУ, 2002. - С. 130.

6. Куликова И.Ю. О самоочищении Северного Каспия от нефтяного загрязнения// Биология внутренних вод: проблемы экологии и биоразнообразия. Тезисы докладов XII Междунар. конференция молодых ученых, п. Борок, 2002. -С. 179.

7. Куликова И.Ю. Особенности токсичного действия нефти на водные микробиоценозы И Современные проблемы водной токсикологии. Сборник тез.

докл. Всеросс. конф. с участием специалистов из стран ближнего н дальнего зарубежья, п. Борок, 2002, - С. 91.

Куликова И.Ю. О самоочищении Северного Каспия от нефтяного загрязнения //Биология внутренних вод: проблемы экологии и биоразнообразия. Матер. Междунар. конференции молодых ученых, п. Борок, 2002. -С. 124-131.

9. Куликова И.Ю. Микробиологический мониторинг северной части Каспийского моря И Проблемы мониторинга экосистем Каспийского моря. Сборник матер. Международ, науч. конф. Махачкала, 2002. - С. 22-23.

Ю.Куликова И.Ю. Использование микроорганизмов в процессах деструкции нефти И Мониторинг и биологическая реабилитация загрязненных нефтью н нефтепродуктами территорий. Матер. 1- го совещания. Астрахань. -М.: МАКСПресс, 2002. - С.39.

11.Дзержинская И.С„ Куликова И.Ю. Биодеградация нефтяных углеводородов микроорганизмами морской воды // Биотехнология в охране и реабилитации окружающей среды. Труды Между нар. биотехнологического центра МГУ, М.: Изд-во ФИАН, 2003. - С. 86-90.

12.Куликова И.Ю. Оценка воздействия нефтяного загрязнения на микробиологическое состояние воды Северного Каспия // Рыбохозяйственная наука на Каспии: задачи и перспективы. Сборник статей Междупар. конф. Астрахань. -Изд-во КаспНИРХ, 2003. - С. 98-100.

13.Дзержинская И.О., Куликова И.Ю., Сопрунова О.Б. Штамм РЬу11оЬас1егшт тугзтасеашга для деструкции нефтяных углеводородов солоновато-водных и пресных экосистем, - Заявка на выдачу патента на изобретение № 200313)668, приоритет от 31 октября 2003 г.