Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическая трансформация пиридинкарбоновых кислот и их производных

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологическая трансформация пиридинкарбоновых кислот и их производных"

. » :

МОСКОВСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА. БИОЛОГИЧЕСКИ;! ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи 7ДК 576.303.53.

Оюунпэшг Аюушйн МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ТРАЕСФОРШЙЯ ПИРИШШКАРБШО-

вых кислот и иг произзолных.

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации ва соискание ученой степей« кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета.и в лаборатории органического синтеза химического факультета Московского университета им. К.В.Ломоносова.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Н.С.Егоров.■

Научный консультант - доктор химических наук, ведупий научный сотрудник П.Б.Тэрзнтьев. Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л.А.Головлева, кандидат биологических наук -Е.В.Доагялеьич.

Ведущее учреадение - Институт макробиологии РАН.

Защита диссертации состоится июня 1993 года в 'Л<Г часов на заседании специализированного ученого совета Д 053.05.68 при Московском университете имени {¿.В.Ломоносова по адресу: 119899,г.Моснва,Воробьевы горы, МГУ,биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 1993 года.

Ученый секретарь

специализированного совета "З^шлО Пискункова Н.Ф. кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. В последнее время осооое внимание фармакологов привлекают гидроксипроизводные азотистых гетеро-пиклов.в связи с тем,что среди них обнаружена кногае высокоактивные лекарственные препараты,действующие на центральную нервную систему,проявляющие антисклеротические и антивирусные /анти-иИЧ/ свойства.повышенное внимание оказывает в частности исследованию гидроксиплридинкарооновых кислот и их производных, однако химический синтез таких соединенна сложен.зачастую многостадиен и требует использования дороги и дефицитных реагентов.

В синтетической органической химии все большее место за последние года начинают занимать микробиологические методы синтеза сложных по структуре соединений. Эти методы отличает мягкость условий проведение реакции,одвостадийность процесса,его регио-и стереоспецифичность и исключение необходимости траты дорогих и зачастую агрессивных реагентов.

В связи с этим особенно актуальной становится проблема разработки более простых .дешевых и экологически чистых ышфобиодо-гических методов получения гвдроксишридинкарбоновых кислот.

Цель и задачи исследования. Целью настоящее работы было™ изучение возможности окисления пиридинкарооновнх кислот и их производных до соответствующих гддроксизамещенных представителями оактерии родов Рзеийояопая.АгЬЬхоЬас^ег и ЕЬоЗосоооив , утилизирующими соответственно;нартами и.пиридиновые основания, катаболизм юторцх; начинается с реакции гйдроксилнрования ароматического, ти гетероароыатического. крльцаг'/Старовойтов,1975, Хасаева,1968,Агапова.1991/.

Научная новизна. Из пяти испытанных.музейных штаммов бактерий выявлены два - НЬойососсис орасйв ВКК АС-1333П и Раеийо-

шоаав Г2и^огевсепв Р?Е10<ЗладаШЕе гвдроксилирувдей активностью по отношению к никотиновой кислоте и ее производным.

Впервые показано,что при трансформации этилового эфира никотиновой кисяотн этиш штаммами бактерий в качестве интерш -диатов образуются этиловые эфиры-2- и 6-гидроксиникотиновые кислоты.А при трансформации нитрила никотиновой кислоты - со-

У

ответствуицая н - окись и 4-гидроксиникотинонитрол.

Практическая певвость. Полученные результаты могут быть полезны для использования Ыюйоеоосш орасиз Ао-13331) и Рвеидо- " попав Ииогеасепз РГЕ1 в биотехнологии-при получении с хорошими внходаки 2-гидаокси- а 6-гидроксипроизводных этилового эфира никотиновой кя слоты,4-гндрохсипроазводного нитрила никотиновой кислоты и 2,3- и 3,4-дигидроксштридгнов.

Публикации. По материалам диссертация опубликовано 3 работы.

Структура и обьем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста,содержит 14 таблиц и 21 рисунок,состоит из введения,обзора литературы,экспериментальной части,заключения и выводов.Список литературы содержит библиографических ссылок.

ЕШШЖШГ'МЬЕАЯ ЧАСТЬ.

Обьееты и методы исследования.

В работе использовали штаммы АгЬЬгоЪас^ег cryзtallopoiete8 ВКМ Ас-Ю93|Лл^Ьго'Ьас1ег сху^а11оро1е*ег БКН Ас-1334,Юк>аосое-оив орвсов вхн Ас-1 3330 .утилизирующие 2,о-,2,4-диметалпириди-ны и пиридин соответственно /получены из ВКМ ИБФМ РАН/ДгШго-Ьас-ъег вр.281, деградирующий пиридин, /получен из коллекции кафедры микрооиологни М1У/Д>аеиаоаспа8 Пиогезоепв ?ГЕ1, дег-радируший наиталин /получен от Старовойтова и.и. ,ИВШ РАН/.

в качестве субстратов для трансформации использовали нико-тийовую.пиколиновую и изоникотиновуга кислоты /{.ярки ХЧ/.З-гид-роксипаридин фирмы НЕЮ; ,£тяловые эфиры,нитрилы в амиды всех трех изомерных кислот,а также 2,3-дагидроксипиргдан били синтезированы в лаборатории органического синтеза химического факультета ЮТ по соответствующими методика!®.

Рз. г1иогевсепз РШ ' внрачиваяк на жидкой синтетической среде /ШУ следующего состава,/г/л/: К^ВЮ^- 10>0,

ЗШ2Р04-1,0,^8110^-3,0,Ь'5304-7Н20-0,05,РеЗЭ4-7Н20-0,05,СаСЬ^бН20-

0,05,С!и304- 5Н20-0,03,Н3304-0,004, гаЭОд- К20-Э,02,Яа304' Н20-0,03,КаЫо04- 21^0 - 0,03, Ш.С1-бН20 - 0,0305 наргалин- 10,0,вода дистэдированная,рН=7,и и поддерживали на пгаризованнол среде того же состава в ларах нафталина.

Штаммы артрооактеров и родококка выращивали ка жидкой модифицированной среде шуклы /¿¿/ состава, /г/л/: КН2Р04-2,65,Мго04- 7Н20-0,2о,Ил304- Н20-0,002,Ре30^7Н20-0,01, СаС12 НзО-0,02, 1ГаМо04- 0,001 , вода »сталированная,

рН=7,0-?,2.

В качестве единственного источника углерода я азота в среду л2 дооавляли: 2,6-диметилпиридин /а,и г/л/ лг» д.мт^а!-Хорсгё^ев А.с-1096, пиридин /1,5 Г/Л/ Дляд.иувггИорШеЪеа Ас-13з4с и ЕЬ.орасиа Ао-13331>, ^,4-диметилтгарядин /1,0 г/л/ ЯМ .дгИгоЪаеЪет зр.281

Для получения большого количества ояомассы,необходимой для проведения реакции трансформации,штаммы артрооактеров и родококка выращивали яа среде ли, содержащей сукциват натрия /10,0 г/л/ и сулырат ахыокяя /1 г/л/.

Культуру ергрооактеров и родококка поддергиваю на МПА. пультивирование бактерий проводили в коябаг объемом 750 юг.

с 100 ил среды на качалке /220 об/?.-ин/,при 28-30 С.

Рост бактерий определяли нефелометричесет и выражали в г/л сухой биомассы,рассчитанной по калибровочной кривой.

Трансформации субстратов осуществляли как растущими культурами так и суспензией клеток.

Бри трансформациийрастущей культурой субстраты в количестве 50-100 кг/л вносили в среду в начале или в конце экспоненциальной фаза роста.При трансформации суспензиями клеток их отделяли от среды центрифугированием при 10 тыс.об/мин в течении 30 мин при 0°С,отбывали 0,1М фосфатным.буфером /РН=?,0/, ресуспендировали в 100 мл буфера того же состава и добавляли 100-500 мг/л трансформируемого субстрата.Шютность клеточной суспензии в буфере составляла от 2 до 5 г/л сухой биомассы. Трансформацию проводили при 28-30°С на качалке /220 об/мии/ в течении 48 часов.

Продукты трансформации выделяли из отделенной от клеток среды или буфера экстракцией горячим хлороформом в экстракторе для тяжелых жидкостей в течении 36 часов. Полученную смесь продуктов трансформации разделяли с помощью тонкослойной препаративной / им колоночной/ хроматографии Лроматогракмы просматривали в УФ-свете,отдельные хроматографические зоны вырезали. Индивидуальные вещества с сорбента элюировали метанолом. Строение выделенных продуктов трансформации доказывали на основании совокупности их физико-химических свойств.Ыасс-спектры веществ снимали на приборе ЫХ-1321А при энергии ионизации 70 аВ с прямым вводом вещества в ионный источник ,УФ-спектры сняты на приборе Н1ЛасЫ-20э-2о, ИК-спектры в вазелиновом масле на приборе та -20, ПМР-спектры растворов веществ в СДС?3 регистрировали на приборе Згикег- 200,внутренний стандарт-тетраметилсилан.

-5-

РЕЗУЛЬТАТЬ! И Ж ОЕСУЩНИЕ.

1. Трансформация пирихинкарбоновнх кислот н юс производных .растущими культурами и суспензиями ¡деток бактерий.

Штзши Л. сгув1:а11ор:>:!.с1:сз Ло-ЮЭЭД.агуз^аНоэзхзЪев Ао-1334С,Аг^оЬ?сг2т яр, 281 .нзг. ораоая Ло-иэзя не мог-

ли, использовать исследуемые никотиновую /НК/,нзоникотиновую /ЖК/, паколиноЕуп /ПК/ кислоты и ах этиловые эфиры,нитрилы и амиды с качестве субстратов для роста.н в куяьтуральной жидкости не были обнаружена продукты их тразсфорчашм.

При вырадиЕакли штг^мов артробвктероь и родонокка на средах, содеряапгих шфилчн,2,4- и 2,6-диметилпирадинн,в культураяъннх жидкостях былз обнаружены лкпь известные продукта гэдроксялвро-вглкл этих субстратов / к -оксад пиррдива.З-гидроксипнрЕдия, 3-к1дроксл-2,6-дакотзлп^идин, 3-гидрокса--2,4 • диаетилпзридин /Хгсаепа, 1988,Агапова, 3991/,а оскорные целевые субстрат;;- пи-рад2пкг.рбоновне кислота к их нктрщш вцдз&ялнсь з неизменённом виде.Однако этиловые эфиры и амиды пиридикарбоновых кяслот подвергались все же частичному или псиному гидролизу до самих кислот.

Таким образом,попытки использовать растущие культуры этих штампов бактерий для гидроксилзрованзя тфзданкгрбоновых кло-лот и кх производных оказались безуспешными.

Суспензии клеток всех трех стамйов артробактеров, выраценню: как на сирлдане и диметюппфидчвау:гчк я на сукцянг.те патрия, еэ проявили трансформирующей активности по отнояьнао к иссле-дуеглс^ нгта су^стратегг.В ктк^гдиопных г^пкостях оставались только исгодиие кислоты и их производные в неззкененннх количествах /1,2,6,8/.

Клеточная суспензия НЬ, орасия д.с-133313» выраданного на сре-

де с пиридином.оказалась также не активна по отношению к этим субстратам,однако осуществляла их трансформацию,если была получала из культуры родококка, выращенного на среде с сухцина-тоы натрия и сульфатом аммония.

Использование суспензии клеток Рз.Пиогезсепз ?£21 для трансформации тгаридкнкарбэновых кислот и их производных оказалось з ряде случаев также успешным.

1.1. Трансформация никотиновой кислоты.

В литературе описан процесс метаоолязыа никотиновой кислоты микроорганазваш рода Рае-айотоа.аз (ВеЬгаап; 31;аш-ег,1957. Саи1;-Мег,Е1иеаЬе гг, 1971), при котором в'следовых количествах оо-разуется 2,&-дигидроксиш!рид1Ш.Но образование его вдет через окЕСдитальноз декарооксилврование гвдроксиникотиновои кислоты. При трансформации никотиновом кислоты штаммами ЕЬ.орасиа Ао-13331) и Рз.Я.иогазаедз Р£Е1 мы не обнаружили гидропсиншсо-тиновув кислоту.Поэтому можно предположит:.,что в данном случае б процессе трансформации никотиновая кислота подвергается окислительному декарооксшгарозаниэ с образованием З-гвдроксишзри-дива,который далее окисляется до ¡¿,3-дигидроксшшридана /2,3-ДГШУ'.что характерно для этих культур:

СО ОН

- си.

2

КЬ.,0расиз

/О/

ОН

он

ш

3-1Ш

2,3-Д'ОП

Тайлиоа 1.

Трансформация пиридинкарбоковых кислот суспензиями клеток разных бактерий.

Шта\агы бактерий ПК инк ПК

КК 3-ГОП 2,3- дгоп инк примеси ПК пиридин

1 2 1 2 1 2 1 2 1 ; 2 1 2 1 2

А, сгт^аНо-ро±^ез Ао-1098 + + - - - + + ! _ 1. + + -

А.сг ув1;г11о-poieteo Ао— 1334В + '+ • + 1 1 + + - -

АгЗДгоЪа^е: зр.281 + + - - - + , + \ ! 1 + + - -

КЬ.орасиз • Ао-13330 + а) 44 38 - 13 1 + |+ - - + + - -

Рззийолиопав' Яяот езеепз РГ21 80 - - - 18 70 - + - 70 с Я 3 3 -

Примечание: 1- метки,полученныз из культур бактерий,выращенных на средах с лиридЕном или димзтилпиргдинами для артро-баггеров и родококка и с нафталином для пссвдомояад. 2- клетки,полученные из культур бактерий,вырзшенянх на средах с сухцинатом натрия и сульфатом аммония. а) - выход продуктов в % от внесенного в среду субстрата. АУ-обнарухено,количество не определено, /=?/ - не обнаружено.

Строенае винченных веществ доказано по совокупности физи-ко-хитчесюс и спектральных свойств /табл.3/.

3-гвдроксяшридин выл обнаружен в инкубационной жидкости лишь прл трансформация никотиновой кислоты Rh.ораоаг,-1333D /табл. 1/.Отсутствие срзди продуктов ерадачормацзи-Щсти в случае использование штамма Ps.fluoresoeua PfEl З-гидроксияири-дина видимо,кокно объяснить его более быстрым окислением до дигадрокслпроизводпого.

Следует откетать ,что азокикоткновая и плколннозая кислоты не подвергались Еффекггивзоз трансформации указаннкж пташгыи.В инкубационных авдкостях оставались только исходные кислотн.а в случае пккалиновой кислоты часть ее превращалась в пиридин в результата слабого декарСоксилирования /табл.1/.

1.2. Трансформация этиловых зфвров пириданкарбоновых кислот»

Штаммы Rh.opacus A.c-1333D 11 Pa.fluorescena PfEl успешно осуществлиш также трансформацию этилозого эфира никотиновой кислоты /SHE/ до изомерных этиловых эфиров 6-гидрокси- и 2-гид-роксивикстияовшс кислот / Э-6-ГШК и Э-z-LOtlK/ с оощиыи выходами в расчете от внесенного субстрата 12,2 и 41JS соответственно /табл.2/.В расчете на вступивший в трансформации субстрат эти выходы составляли 50 и .Такой метод расчета выходов связан с тем,что этиловый эфир никотиновой кислоты гадролизовал-ся в условиях опыта и в отсутствии бактерий,образуя никотиновую кислоту в количестве до 30£ от исходного субстрата. Кроме того, около 10* ЭНК улетучивается при упаривании хлороформенных экстрактов. При препаративном осуществлении процесса трансформации ЗНК эти потери могут быть исключены.*

Строение полученных веществ доказано на основании совокупности их -спектральных свойств /табл.3/.

Превращение этилового эфира никотиновой кислоты этими бактериям: мсяно представить следующей схемой:

ЭБК Э-б-ГСЙК Э-2-ГШК НК

Кроме того.из ишеубацаонной жидкости ГЛэй.орасиз в следовых количествах были выделены три соединения /табл»2/. которые по данным хроматографической подвижности и(м^сс-спектрапьного

Таблица 2

_Трансформация этилового эфира никотиновой кислоты

суспензияш клеток разных бактерои.

Штгшы оактарай Продукты трансдроряацкЕ

ш НК Э-2-ГиНД Э-б-ГСЖК 3-1-ОЦ '¿,3- И 3,4-ДГОП

А. с з^^аИороа.-е£ев Ао-Ю93а^ + 1 следы - - - -

А. схуа*а11ор!г1е-Ъеа Ас-1334Э + следа - - -

зр.231 + . следы - - -

Ь) Рв . Пиог ево ехш МЕ1 в 30 11/6,0/ 30,0/16/ - -

а) ВЬ.ора сиз АО-1333В - 80 9,0/12,6/ ла/ 4,о/ следи следы

примечание: оактерии выращивали: а-на среде с сухпинатом натрия ,о-на среде с нафталин ом, в- выход продуктов в % от внесенного субстрата /в щуг сух.оиом./,/+/- оонаружево,количество не определено, /-/ - не оонарухено.

иалзза цдекифщироваля как З-гцдроксишфддин /3-гОЦ/,;2,3-ди-гидроксшшрздаш /2.3-ДГ011/ л 3,4-ДГШ.

таолица з.

Физико-химические характеристики продуктов трансформации этилового эсрира никотиновой кислоты.

Продукты трансформации /мм/ в :ис-¡■еме 0 ■ГФД-; мах ш в этаноле ИК/см / ШР г-.вд. /культ./ масс-спектр ГЛ /z. /интенси ЮСТЬ % т. кэксък. иону/ э-1/

^С=0 2Н 4Н ЬН ÖH см

1 2 3 4 ь й 7 « У LÜ 11

Никогиновш кислота и, 12 253 ¿400-ЗШ I71b ]

Этиловый эфир-^-гвд- рОКСЕНИКОТИ- новой кислоты 0,20 277 28Ы) -2950 1740 0 (Д) "?37 «гр> Ш 1(И i 1 167/100/ 13У/37/, 122/ 23/ У5/33/

Этиловый эфир-б-гад-роксиникотн-новой кислоты . 0,46 250 27Ш-ИИи lö/b-Г/Зи СЛ) $9 (ЯД) «) 0 и 167/хОи/ 13У/37/ 111/17/ 122/100/ У4/35/

3-гддрокси-пяридин • 0,35 277 - - - - - - - -

2,з-дигид-роксипири- дин 0,22 297 - - . - - - - - 111/lOu/ уз/е/ , .83/ Ь2/у/ Ь0/18Л ЬЭ/ЭЬ/

а,4-дипщ-роксиплри-дин и, 15 273 - - - - - - 111/10U/ У4/23/ еЗ/zl/ ао/41/

Примечание: /-/ - не определяли, а)- система-1и:10:й-пет-ролейвыи э4ир:эталацетат:этанол,в)- в воде.

Процессн гидроксилирования этилового эфира ннкотпнсзоп кио-лоти до сих пор не били известны.Представленные нага здесь данные являются оригинальными.Они икеют практический интерес, поскольку 2-гидроксшткот1шовая кислота используется для профилактики атеросклероза,тогда как 6-гидроксинзомер обладает гипаяипЕметеской активностью.

При трансформации этялосых эфиров гыколановоЛ и кзониксгикс-вой кислот m-aiMava Rh. орзсиз и Рз, Пиогезгепз в инкуба-пкснпых жидкостям методом• тонкослойной хроматогргфии били обнаружены лишь соответствующие исходные эфирн и следы найдена-фицированных продуктов, то есть 2фяры как и соответствующие км кислоты не подвергаются гвдроксилированшо этими вгаммами.

1.2.1. Трансформация этилового эфира никотиновой кислоты

диссопиантами Rh. орасиз AO-1333D.

В процессе работы по трансформации никотиновой кислоты кэнти-лового эфира никотиновой кислоты клетками Bh.opacus Ас-1333В при повторении опытов мы столкнулись с уменьшены» выходов продуктов гидроксилирования.При исследовании популяции ЯЬ. ораоия быта обнарузсзна способность родококка к рзсщепленип на л М-вариангы,огличаодиеся по колониазно-дарфало-

гическиы особенностям.что свойственно этзаа бактериям /килько и др. ,1990/.

Из трах вариантов родококка только клетки к -варианта способны бшга актьлно утшгЕзировать пиридин в качестве единственного ноч'очннза углерода,езота л энергия при его значительной козцентр?ДЕЯ /1,5 г/л/.Плохг55 рост S- и М-варавитовв присутствие пяридиза mo¿j:o обьяскзть вероятно его токсичностью для них в таких концентрациях.Из литературы известно.что клетки

й -варианта родококка наиболее устойчивы к действию различных физико-химических факторов,что обусловлено большей толщиной их клеточной оболочки,в липидах которой максимальная насыщенность жирных кисло? /Милько Д990/.В то же время у М-вариантов, обладающих минимальной толщиной клеточной стенки,повышено образование экзоферментов и веществ,выделяемых в среду.Этот вариант родококка может. быть наиболее -чувствителен к токсичным субстратам.

По нашим данным все три варианта родококка отличались по своей способности трансформировать ЗЕК.Так, при трансформации ЗНК Я -вариант штамма гидрохсидирует субстрат до 2- и 6-гидрок-сизфиров,тогда как М-вариант при атом образует лишь следовые количества этилового эфира-6-гидроксиникотиновой кислоты,2,3-и 3,4-дигидроксшшрвдинов. э -вариант по сравнению с двумя другими вариантами родококка был практически не активен /табл.4/.

. Таблица 4.

Трансформация этилового эфира никотиновой кислоты суспензиями клеток диссодиантов ЕЬ.ораеиа Ас-13330

Варианты -НЬ.ораепз Продуктк трансформации

Ж Э-2-ГСЯК г-б-тонк 3-ГШ 2,3- дгш 3.4- дгш

Е- 9,0?12,5у 3,2/4,5/ - - -

Н- + - следы

* 3~ + - следы - - -

Примечание: /+/- обнаружено,количество нэ определено, /-/- не обнаружено, а)- выход продуктов в > от внесенного субстрата / в иг/г сухой биомассы/.

-131.2.2. Влияние некоторых факторов на процесс трансформации

этилового эфира никотиновой кислоты суспензией клеток R -ва-рлаята яъ.орасцз Ао-1333В.

С целью повышения выхода гидроксипроизводннх оНК.как практически ценнкх веществ,мы изучали влияние продолжительности инкуоации суспензии клеток с субстратом, концентрации суостра-та,кислотности среди,аэрации .возраст культуры на процесс трансформации энк.

Гфи использовании для трансформации ЭНК клеток пз культур р. -варианта родокохка, выведенных на среде с пиридином и находящихся в различных фаззх роста .превращение субстрата ке нао-лвдалось /таол.5/.В то se время процесс гвдроксилирования ЗНК протекая активно з случае использования клеток из той же культуры родококка .выращенной на сродэ с сукцннатом натрия и суяь-

Таблица й.

Трансформация ЭНК суспензией клеток из культур й -варианта Rb.opa.ous разного возраста.

Возраст клоток /час./ продукты трансформации

1. 2

7 - . -

16 - SHK, нк

23 ЭНК, нк -

24 знк, нк, s-s-гоак

30 SHK, нк -

31 - Э-2-Г0НК, ir-6-ГСИК

42 - Э-г-ГШК, Э-tí-rOHK.

4« ¡¡Ня., НК

примечание:Клетки из культур: 1- выращенных на среде с пиридином, 2- выращенных на среде с сукцинатом натрия и сульфатом аммония, /-/ - не определяли.

фатом аммония.При этом наиоольшее количество этиловых эфиров гидроксиникотиновых кислот образовывалось при использовании для трансформации клеток из культуры ргдококка,н¿ходячь2ся в конце экспоненциальной /31 час./ и начале стационарной фазы роста /табл.5,рис.1/.Клетки из культуры родококка,находящиеся в конце стацаонарной фазы роста /42 час./ гидроксплпроголи SEK не очень едтизно по сравнении с клеткааз,находящихся в начала стационарной фазы роста.В инхубацаонннх жидкостях обнаружены лишь сяоднТидроксиэфнров.

ния /час/

рис.1. Кривая роста К -варианта

1- на среде с пиридином

2- на среде с суишаток натрия и сульфатом аммония. Резкое различие в активности ферментных систом клеток,выращенных в присутствии или отсутствии пиридина, объясняется вероятно,тем,что как было показано ранее /Агапова, 1991/

шташ Eh.opacus Ac-1333D в процессе роста на пиридине окисляет зго до полигидроксипирвдинов и дигидроксипиринов.Последние же икгибярувт некоторые оксигеназы /Cain et.al., 1972/.

В результате клетки родококка,выращенные на среде с пиридином,

v

теряет свою гддрокешглрующую активность.

В результате исследования влияния продолжительности трале-формации на образование гидроксиафиров баю установлено,что продукты траясформЕщш появляются в среде на вторые сутки ин-кубацЕИ.К концу трэтьих суток они исчезают.

Исследование нала влияния рН буфзра на процесс трапорорпа-циз ЗНК родсхохкои показало,что величина рН буфера шест существенное значение для процесса окисления.Действительно,при низких значениях рН /рН=з-5/ гздрсксшгароваяие ЭШ совсем не наалюдалось .В то не время наиоалыгие выходы продуктов трансформации ошш получены при рН=7-Ъ.По всея видимости фиксация молекул наших субстратов на оелковоя части молекулы фермента происходит с участием атома азота гетерокольца.я кислой среде са счет лротонарования эта часть меяекулн теряет свои основные свойства,что исключает возможность взаимодействия с

ферментом.

© ®

Н' С1

РИ<7 pfl>7

изучение влиянии количества добавляемого в реакционную смесь субстрата на выход продуктов трансформации SKK н -вариантой штамма Eh.opacus Ao-1333D показало,что при малых кон-

дентрациях субстрата /до 50 мр/л/ в инкубационной жидкости удается обнаружить лишь никотиновую кислоту. Отсутствие продуктов гидроксилирования связано,возможно,с -частичным гидролизом исходного эфира,его-испарением,а также трудностью выделения малых количеств метаболитов /в абсолютном выражении/ и частичной адсорбцией их на клетках. Увеличение концентрации субстрата до 100-250 мг/л приводит к~резкому увеличению количеств выделяемых продуктов трансформации ШК, однако дальнейшее повышение начального содержания ЭНК до 500 ыг/л,напротив^ -почти полностью дезактивирует клетки.

При изучении влияния аэрации на выход продуктов гидроксили -рования SEK R -вариантом родококка оыло установлено,что в отсутствии перемешивании иякубационнои смеси процесс трансформации ЗЕК вообще не шел.В случае перемешивания на качалке : при большей аэрацвл/100 и 200 мл буфере/ в инкубационных жидкостях обнаружены оба" продукта трансформации .тогда как при меньшей аэрации /300 и 400 ш буфера в колбах обьемом 750 ш/ об- ' разуется только б-гидроксиизомер в следовых количествах.

1.3. Трансформация нитридов пиридинкарбоновых кислот.

Этаже штаммы Pa.fluorescens u Bh.opacus осуществляли трансформацию и нитрила никотиновой кислоты. 11 -вариант нь, opacas Ас-1333Х> гидрокснлировал нитрил никотиновой кислоты /ЕНК/ до 4-гадроксияикотинонитрила /4-Г0НН/, хотя и с небольшим выходом /табл.§/. Ps.fluoresceno pfE1 окислял ННК только с образованием И -оксида нитрила никотиновой кислоты с относительно хорошим выходом /45#/.То есть процесс трансформации нитрила яикотиновой кислоты протекал цо схеме:

Л'-оксид НТК

Строение этих продуктов трансформации убедительно доказано анализом их спектральных свойств./табл.7/.

Таблица 5.

Продукты трансформации нитрилов шрщщнкарбоновнх кислот суспзнзиями клеток разных бактерий.

Бактерии няк нинк НПК

ннк эксид ЗНК гсш1- НиНК моно- гидшат НИНК НИК —

А, схувЪа11оро1е--Ьва Ас-1098 + - + - + -

А.сгуа1а11оро!в-*еа Ас-13341) + - - + - + -

Аг№гоЪаеЪет з т>. 281 + - - + - . + -

Rh.opac.i3 Ас-13331> следы - а) 16 + - + -

Рв.£1иогевсегш : 2*31 следы 45 - + следы + -

Примечание: выход продуктов в * от внесенного субстрата, /+/- обнаружено,количество не определено, /-/ - не обнаружено.

Таалица V.

Физико-химические характеристики продуктов трансформации нитрила никотиновой кислоты.

1. продукты R-f /т.'./ в системе а УФ л мах нм • в зтг ноле ИЕ/см-1/ ОМРа.ад/мулвт., масс-спектр m/z. /интенсивность в % к максим, иону

трансформации .ÜB М-0 2Н 4Н ш Ш

4-гидрок- зиникотино- яитрил 0,58 - 2250 3380 - - - - - 120/43/ 94/45/ 92/22/ ЬЪ/12/ 64/10/

А'-оксид нитрила никотиновой кислоты 252 2240 - .250 Я? езо сто 0W) 'Zük V0 120/100/ 93/12/ 104/5/ 103/4/ 77/8/ 76/8/

Примечание: /-/ - не определено

Отметим ,что образование 4-гвдрохсинккогинояитрила является

первым одасаннам в литературе случаем мпкробаатогического гвдроксилировавия нитрилов азотистых гетероциюгов.А производные .М-оксида ЕНК обладают биологической активностью./ кшю-вака е1.а1.,1Э85/. ' •

Используемые наш бактерии охазазясь не активными по отношению к нитрилам пиколивовой и изоникотиновой кислот и лишь в случае трансформации нитрила изоникотиновой кислоты /ЕИЯК/ в инкубационной годности были обнаружены следы соединения,имеющего молекулярную кассу 120,фрагкзнгация молекулярного иона позволяла предположить для него структуру - моногидрата НИНК /2-глдрокси-4-циано-1,2-дигидрош5ридина /табл.б/.

-191.4. Трансформация никотинамида.

В противоположность HHK.ee амид при трансформации НЬ..ора-сив и Ро.Г1иогеэоеиа лишь быстро гидролизовался до никотиновой кислоты.Количество образовавшейся кислотн в инкубационной смеси не определялось.Однако в случае родококка никотиновая кислота частично подвергалась окмлатаи>ному дехарбоксилироза-нию до 3-гидроксинаридина с дальнейииы окислением до 2,3-дигпд-роксипзрндина, которые были обнаружены в следовых количествах /табл.8/. Трансформацию никоткеашда /НА/

ысигно представлть следующей схе?лой:

З-ГОП 2,3-ДГ0П

Таблица 8.

результаты трансформации никотинамида суспензиями клеток разных бактерий.

Бактерии Субстрат Продукты трансформации

НА НК з-гш 2,3-ДГШ

"а) следы - -

А.сгузга^оэд^реа 80 следы - -

Аг1;ЬгоЪа^ег.-з:>. В2 следы . - -

НЬ. орзоизгАс-13331). - + следы следы

Рз.Пиогезеепз следи + - -

Примечание: /-(-/-обнаружено,количество не определено, /-/ - не обнаружено, а- выделено,в %

-¿01.5. Трансформация З-гидроксипиридияа. Поскольку,как уже говорилось вшге при трансформации никотиновой кислоты и ее эфира штаммами Pe.fluore3oeas u FJ-.. opacus в инкуоационных жидкостях.обнаруживается 3-Г011 и ¿,3-ДГШ,представляюсь вакнш вкяспить возможность использование эгих бактерии для цалевого препаративного синтеза дигидроксипирсс:-вов.Для йтого мз предоставили "в качестве субстрата штшдаы Рз. fluoreaoeas и М-вариалт7 Кх. ораочв 3-гвдрокспиргдиЕ.

3 результате установлено,что оба штамма превращали суострат в смесь изомерных '¿,3- к 3,4-ЛГОД с общьльГшходаыЗ 1Ъ и 44й соответственно /табл.9/.Однако.есхи з случае .'¿-варианта Eh. opacus количество 3t4-B30«sepa в смеси в три раза превышало содержание ¿,3-ДГиП,то в случаз £s.fluorescein оба продукта гддрсксилированая образовывались в ра^лах кадпчествях.Кроме того,в условиях эксцоршаон^а /пр~ рН=7,0/ а ин^убгцкэннс^ гид-кости онл обнаружен У. -оксвд-й-гндрокоипирид,ила.

Таодьца 9..

иралсформацня -З-гидрокиширидика суспзнзияма клеток м-2а -раанга KL.opacus AC-1333D Ц Ps.fluorescsns PfS1.

---О

Бактерьа Выходе продуктоь трансформации

г.з-лгся 3,4-ДГОП

Та.Ииотеяоела 1Г21 9,0/8,0/ ю.о/ю.о/

Eh.opaeuo Ac-1333D 12,0/17,5/ 32,0/47,0/

Примечание: выход, продуктов в ¡6 от внесенного субстрата

/в иг/г сухоя оиомассы/.

- л-

Более подрооное изучение влияния условии трансформации 3-ГШ штаммом ?в.Г1иогеоседв показало,что при рН буфера о, о-о,о такой к -оксид был единственным продуктом трансформации,тогда как при рК¿8,0 он не ооразовывался вовсе.

Процесс трансформации 3-ГОТ этими штаммами осуществляется по схеме:

ИЬ.орасиз

рН=7,0

З-ГОП

рН=8,0 ТзТПйогёзсём рН=5,0

*

О

Ы- оксид-З-ГОП

Таким образом выявленные нага два активных штамма Рз.п.ио-гезоеаз Р£21 и БЬ.орасиз Ас-13331) /его М-вариант/ могут быть с успехом использованы для препаративного синтеза изомерных . 2,3- и 3,4-дигидроксипиридинов.Последние и их комплексы с Ре" и другие производные,как следует из литературы,обладают противораковыми, антитироидальными, антиокислитель ними и тератогенными свойствами. .

1. Из пяти испытанных музейных штаммов оахтерий выявлены два штамма Нм'йососсиа орасиз ВКК Ас-1333Д и Рзеийотопаз ?1ио-гозсепз РГ21 , ооладапцих гидроксилирущей активностью по

отношекию к никотиновом кислоте и ее производным.

2. Наибольшей гидроксилирующей активностью по отношению

к никотиновой кислоте ооладает штамм Hh.opacus вкк Ао-1333Х>, который превращает этот -субстрат в 3-гидрокси- и 2,3-дигид-роксипиридины /выходы "38 и 13% соответственно/.

3. Этиловый эфир никотиновой кислоты наиболее эффективно гидроксшшрует штамм Pe.fiuqxeoeeas TfEl с образованием изомерных 2- и 6-гидроксипроизводных /выходы И и 30£ соот-ветственно/.Изучено влияние некоторых факторов /рН,аэрация,концентрация субстрата и др./ на процесс транрформации этилового эфира никотиновой кислоты штаммом Hh.opacus ВКЫ Ao-1333D.

4. При трансформации нитрила никотиновой кислоты Eh.opaous йКЫ АС-1333Д гидроксилпрует суострат с образованием 4-гидрок-синикотинонитрила /выход 16%/, a Ps.fluorescens píei осуществляет только Л -оксидирование гетероцшсла с выходом и-оксида 45%.

о.Популяция штамма Eh. opacas вкм AO-1333D расщепляется на R-i s_ ' и М-варианты,которые отличаются по способности трансформировать пиридивсодерхащие субстраты.Наиоольшеи трансформирующая активностью обладают r- и м-варианты.

6. При трансформации этилового э®ара. никотиновои кислоты клетки Я- варианта Hh.opaou8 ВШ AO-1333D гидроксилируют субстрат с ооразованием изомерных 2- и ь-гидрокишроизводных, клетки М-вариантов - с ооразованием двух изомерных.диолов 2,3-и 3,4-дигвдроксалирадинов.

7. Штаммы Pa.íluoreac едз PfE1 u Hhod.opacus БЕК AC-1333D /М-вариант/ трансформируют 3-гидрокслпиридин,превращая его в изомерные ¿¿,3- и 3,4-дигидроксипиридины с общими выходами 19 и А4% соответственно.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Зефиров И. С..Оюунцацэг А.,Пискункова Н.Ф..Модянова Л.В., 'Герентьев 11.Ь. .Булахов Г.А. .Свешников Н.Н.. "Трансформл-ция бактериями лирлдинкарбоновых кислот и их производных" Микробиология,1993,в печати.

2. Зефиров Н.С.,Модякова I.В. .Оюунцацэг А. .Пискункова Н.Ф., Терентьев Б.Б..Багров В.В..Овчаренко В.В.."Трансформация 3-гидронсиляридина штампами Рзеийошопаа Пиоггзсепэ и НЬо<1ососс!1я орасиз Химия гетероциклических соединений, 1993,е печати«

3. Агапова С.Р. .Андреева А.Л. .Оюунцэцэг А. "Изучение плазмвдно-го состава микроорганизмов-деструкторов пиридиновых оснований". Проблемы современной биологии: Тр.20 научн.конф.мол. ученых биол.фак. Ш7,Москва,24-28 апр. 1989,М. ,Щ7,1989,ч.2, с.93-9б.Деп. в ВИНИТИ,5.02.90.