Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лектиноподобные белки хлорофилл-белковых комплексов Dunaliella salina

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Лектиноподобные белки хлорофилл-белковых комплексов Dunaliella salina"

РГБ ОД

2 2 МАЙ 1SC5

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

УДК 581.1

ФАЛЬКОВИЧ Татьяна Наумовна

ЛЕКТИНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ХЛОРОФИЛЛ-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ DUNALIELLA SALINA.

Специальность 03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. КАТимирязева Российской Академии Наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Пронина Н.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Ерохин Ю.Е. Володарский А.Д.

Ведущее учреждение - Московский Государственный

Защита состоится " 13 " июня 1995 г. в 13 часов на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (К 002.45.01) при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. КАТимирязева РАН.

Университет им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан ",

Ученый секретарь Специализированного совета, канд. биол. наук

М.И.АЗАРКОВИЧ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ. Первичные процессы фотосинтеза, включающие поглощение квантов света пигментами светособирающей антенны, перенос энергии возбуждения к фотохимически активным формам хлорофилла реакционных центров, разделение и стабилизацию в них зарядов - происходят в пигмент-липопротеиновых системах фотосинтетического аппарата. Естественно, что без выявления общих закономерностей и индивидуальных особенностей организации отдельных компонентов ХБК и их взаимодействия, невозможно понять принципы построения фотосинтетического аппарата и механизмы преобразования энергии света при фотосинтезе.

Структурная организация фотосинтетических мембран достаточно широко исследована. Основное внимание уделено структуре ХБК фотосистем и электрон-транспортной цепи хлоропласта. В настоящее время широко исследуются процессы взаимодействия и самосборки отдельных компонентов мембран (Москаленко, Ерохин, 1983; Ладыгин и др., 1983; Москаленко и др., 1987; Heber et al., 1978). Самосборка и функционирование ХБК в составе пигмент-липопротеиновых ассоциатов мембран происходят при взаимодействии входящих в их состав белков с окружающим липидным матриксом и основаны на гидрофобных и гидрофильных контактах, ионных, ковалентных и водородных связях.

Сокращения: ХБК - хлорофилл-белковый комплекс, ФС1 фотосистема I, РЦ1 - реакционный центр фотосистемы I с ближайшим окружением, CCKI - светособирающий комплекс фотосистемы I, ФСП -фотосистема II, Хл - хлорофилл, SDS - додецил сульфат натрия, СопА -Конканавалин А.

Один из возможных способов подобных взаимодействий может быть также основан на принципах молекулярного узнавания. Данные по локализации лектиков в мембранах растительных клеток (Bowles et al., 1979; Купцова и др.,1989; Выскребенцева и др., 1990; Алексидзе и др., 1991) позволяют предположить возможность участия пектинов в самосборке и поддержании структурной организации мембран. В связи с этим представляет значительный интерес изучение участия пектинов как углевод-связывающих белков неимунной природы, основной функцией которых является функция молекулярного узнавания, в организации липопротеиновых комплексов фотосинтетических мембран.

Удобным объектом для изучения структурной организации фотосинтетических мембран, самосборки и функционирования ХБК являются одноклеточные зеленые водоросли - эукариотические организмы, структурно-функциональная организация

фотосинтетического аппарата которых сходна с таковой у высших растений. Это связано с целым рядом особенностей микроводорослей, таких, как возможность культивирования в интенсивных полностью контролируемых условиях, наличие одного хлоропласта в клетке, короткий жизненный цикл.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью настоящей работы явилось исследование ХБК Dunaliella salina и идентификация лектиноподобных полипептидов.

Достижение цели исследования потребовало решения следующих основных задач:

1. Разработать метод определения лектиновой активности с использованием клеток микроводорослей.

2. Осуществить постепенную разборку тилакоидных мембран и исследовать полипептидный состав, молекулярные и спектрофлюориметрические характеристики ХБК D. salina.

3. Идентифицировать полипептиды, способные взаимодействовать с углеводами в составе мембран хлоропластов, и исследовать углеводную специфичность лектиноподобных белков D. salina.

4. Провести сравнительный анализ гомологии известных аминокислотных последовательностей пектинов и полипептидов ХБК хлоропласта.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые показано существование в CCKI D. salina лектиноподобных полипептидов, установлена их способность связываться с галактозой и ее производными.

Впервые исследованы полипептидные и спектральные характеристики CCKI D. salina.

Предложен новый способ определения пектиновой активности с использованием в качестве тест-объекта клеток микроводорослей -альгоагглютинация, применение которого вероятно позволит осуществлять поиск новых пектинов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на 9-ом Конгрессе Европейского общества физиологов растений (Брно, 1994); 14-ом Съезде Европейского общества по новым методам в сельскохозяйственных исследованиях (Варна, 1994); расширенном семинаре Института физиологии растений РАН (Москва, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 4 глав экспериментальной части, заключения

и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков и 7 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основным объектом исследования служила одноклеточная галофильная зеленая водоросль Dunalieíla salina Teod. ÍPPAS D-209 из коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН - IPPAS (Семененко, 1991). Объектами исследования служили также Chlorella vulgaris IPPAS С-1 и Chlamydomonas reinhardtii CW-15 IPPAS D-221.

Культивирование водорослей проводили в накопительном режиме в стерильных условиях при круглосуточном освещении, оптимальной для каждой культуры температуре и непрерывном барботировании газо-воздушной смесью, содержащей 1.7-2% СО£ (Владимирова, Семененко, 1962).

Скорость роста культур определяли по упакованному объему клеток (packed cells volume - PCV; Kodama et al., 1993) и спектрофотометрически по оптической плотности при 750 нм (D750) на спектрофотометре "Specol".

Дезинтеграцию клеток осуществляли в гомогенизаторе со стеклянными бусами (Семененко, Касаткина, 1972).

Выделение субхлоропластных фракций проводили по методу, предложенному Bruce and Malkin (1989) и Knoetzel et al. (1992). Схема выделения представлена на рис. 1.

Выделение комплексов ФС! и ФСИ проводили солюбилизацией мембран хлоролластов октилглюкозидом и холатом натрия и центрифугированием при 60 ООО об/мин, 1 ч. Фотосистемы солюбилизирова-ли Тритоном Х-100 и центрифугировали 10 мин при 38 000 д.

СУСПЕНЗИЯ

супернатант

разрушение

ц/ф ЗВОООд, 5 мин

осадок

супернатант о ц

осадок

Тритон Х-100 ц/ф 38000д, Юмин

Фа-

лин, гр. плотности сахарозы

ц/ф 27000об/мин,17ч

ФСП

I

Доде цилм аль т о зид + цвиттергент лин.гр.плотности сахарозы

ц/ф бОО.ООоб/мин, Зч

ССК1

РЦ1

СС!

ФС

Тритон Х-100 + ЭБЭ

препаративный электрофоров

О-РЦ! С

в - ссга а - ссга

Элюция

Рис. 1.

Схема выделения субхлоропластных фракций из 0.5з//ла.

Очистку ФС1 проводили центрифугированием фракции, обогащенной ФС1 17 ч при 27 ООО об/мин в линейном градиенте плотности сахарозы (0.4 - 1.0 М).

Разделение ФС! на CCKI и РЩ достигалось двумя способами: (1) обработкой ФС1 цвиттергентом и додецил-(3-0-мальтозидом с последующим центрифугированием 3 ч при 60 ООО об/мин в линейном градиенте плотности сахарозы (0.1-1.0 М); (2) действием Тритона Х-100 и SDS в соотношении Тритон'.БОЭ'.Хл, 5:5:1 по массе и разделением с помощью препаративного электрофореза в плоском геле толщиной 2 мм в течение 12 ч.

Определение молекулярных масс полипептидов осуществляли с помощью электрофореза в SDS-ПААГ по методу Laemmli (1970).

Содержание хлорофилла определяли спектрофотометрически в метанольных экстрактах(Маг(ше11,1986).

Спектр низкотемпературной флюоресценции измеряли при 77 К (Ikeuchi et al„ 1991).

Содержание белка в полученных фракциях определяли по методу Bradford (1976).

Пектиновую активность определяли с помощью гем- и альгоагглютинации методом микротитрования по Такачи (Kishinevsky et al„ 1988).

Углевод-связывающую специфичность определяли по способности различных углеводов к подавлению гемагглютинирующей активности (Kishinevsky et al., 1988).

Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей проводили с использованием компьютера IBM PC/AT и пакета программ IBI/Pustell Sequence Analysis Programs (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ С ПОМОЩЬЮ КЛЕТОК МИКРОВОДОРОСЛЕЙ - АЛЬГОАГГЛЮТИНАЦИЯ.

В связи с тем, что пектины служат ценным инструментом в биологических и медицинских исследованиях, актуальным является поиск новых способов тестирования пектиновой активности, которые позволят выявить ранее неизвестные лектины.

Микроорганизмы широко используются для определения пектиновой активности, однако фотосинтезирующие клетки микроводорослей до сих пор не применялись для тестирования пектинов. Можно предположить, что благодаря огромному разнообразию видов, возможности культивирования в полностью контролируемых условиях, одноклеточные водоросли послужат удобным объектом для поиска специфичных пектинов.

Для определения пектиновой активности использовали одноклеточные зеленые водоросли - Chlamydomonas reinhardtii CW-15, мутант, лишенный клеточной стенки; Chlorella vulgaris, имеющую целлюлозную клеточную стенку; Dunaliella salina, природную форму, лишенную клеточной стенки. Реакцию альгоагглютинации в присутствии коммерческого препарата СопА сравнивали с наиболее распространенным способом тестирования пектинов гемагглютинацией.

Активность СопА по агглютинации клеток микроводорослей, сравнимая с активностью реакции гемагглютинации, была получена в случае использования С. reinhardtii С\Л/-15(табл. 1). Высокое значение концентрации СопА при агглютинации клеток С. vulgaris могло быть связано с тем, что клеточная стенка ограничивает доступ

к углеводным детерминантам, связывающим пектины. Клетки D. salina, несмотря на отсутствие клеточной стенки, не взаимодействовали с СолА, вероятно из-за свойств оболочки этих водорослей или отсутствия углеводных участков, специфичных к СопА.

Таблица 1. Сравнительная характеристика вызываемой СопА агглютинации клеток различных культур микроводорослей и эритроцитов кролика.

Тест-объект Титр агглютинации отн.ед. Минимальная агглютинирующая концентрация лектина, мкг/мл

Эритроциты кролика 4096 0.244

Chlamydomonas reinhardtii CW-15 1024 0.980

Chlorella vulgaris 4 250

Dunaliella salina _ _

Реакция альгоагглютинации имела меньшую чувствительность по сравнению с реакцией гемагглютинации, однако позволяла судить об активности через 1 час, тогда как гемагглютинации - через 2 часа после начала реакции.

Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности использования фотосинтезирующих микроорганизмов в качестве тест-объекта для определения лектиновой активности и указывают на наличие в плазмалемме С. гвШагсЛИ углезодсвязывающих участков, специфичных к маннозе.

ЛЕКТИНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ХЛОРОФИЛЛ-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ DUNALIELLA SAUNA.

Исследование возможной роли "узнавания" в самосборке хлоропластных мембран выдвигает на первый план задачи выделения и очистки отдельных компонентов, изучения их молекулярных и спектральных характеристик.

Выделение и характеристика хлорофилл-белковых комплексов D. salina.

Фракции, обогащенные ФС| и ФСИ, были получены с помощью солюбилизации хлоропластных мембран D.salina Тритоном Х-100 с последующим дифференциальным центрифугированием (рис. 1). Фракция, обогащенная ФС1 (рис. 2, трек 1), содержала преимущественно полипептиды с молекулярными массами около 60 кДа, фракция, обогащенная ФСИ (рис. 2, трек 2), - белки около 30 кДа. Полипептидный состав полученных фракций характерен для комплексов ФС1 и ФСИ из высших растений и одноклеточных водорослей.

Чистая фракция ФС1 (рис. За,б, трек 1), состоящая из полипептидов с молекулярными массами около 60 кДа и от 29 до 18 кДа, была получена с помощью центрифугирования фракции, обогащенной ФС1, в градиенте плотности сахарозы. Отношение Хл а/Ь равнялось 4.8. Спектр низкотемпературной флюоресценции характеризовался двумя пиками - 686 и 706 нм (рис. Зв).

Разделение ФС1 на CCKI и РЦ1 осуществляли обработкой цвиттергентом и додецил-р-О-мальтозидом и фракционированием в градиенте плотности сахарозы. CCKI содержал узкую яркую полосу с молекулярной массой 29 кДа, а также широкую мажорную полосу,

94 67 43 30.20.114.4 94 67 43 30 20.114.4.

Рис. 2.

Денситограымы белковых фракций, полученных при разделении суммарйЬр' 'фракции мембран хлоропластов D.salina с помощью солюбилизации Тритоном Х-100 и центрифугирования 38 ООО д. 1 - фракция, обогащенная ФС1, 2 - фракция, обогащенная ФСИ.

соответствующую, возможно, двум полипептидам с молекулярными массами 27 и 28 кДа (рис. За,б, трек 2). Отношение Хл а/Ь составляло 3.6. Максимум низкотемпературной флюоресценции находился при 685 нм (рис. Зв). РЦ1 (трек 3), содержал все те же белки, что и ФС1 (трек 1), за исключением полипептидов от 27 до 29 кДа, характерных для ССК1. Отношение Хл а/Ь - 13, максимум флюоресценции 713 нм (рис. Зв).

Представленные характеристики полипептидного состава, отношения Хл а/Ь и значения максимумов низкотемпературной

м

34 ~~~. 67. '

43 «N#»1

Зййй;'-',

30 •

20.1 «Ё^:

14.4

12 3

13

650 ■ 700 750

ДЛИНА ВОЛНЫ (нм)

М 94 67 43

30 20.1 14.4

Рис. 3.

Электрофореграммы (а), денситограммы (б) и спектры низкотемпературной флюоресценции (в) белковых комплексов О.заНпа, полученных с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

1 - ФС1; 2 - ССК1; 3 - РЦ1; м - метчики: фосфорилаза Ь (94), альбумин (67), овальбумин (43), карбоангидраза (30), ингибитор трипсина (20.1) и лактальбумин (14.4 кДа).

флюоресценции присущи комплексу ФС1 и составляющим его компонентам, и свидетельствуют о чистоте полученных ХБК (Ладыгин, Лебедев, 1986).

При .разделении комплекса ФС1 с помощью препаративного электрофореза, помимо РЦ1 (зона D, рис. 1), удалось получить два CCKI (зоны А и В). Зона С была представлена минорными компонентами и в дальнейшем, к сожалению, не исследовалась.

Подкомплекс CCKI-A представлен главным образом полипептидом с молекулярной массой 28 кДа и следовыми количествами белков 29 и 24 кДа. CCKl-В содержал мажорные полипептиды 28 и 29 кДа и минорный белок 24 кДа (рис. 4а,б). Полипептид с молекулярной массой 24 кДа возможно являлся одной из субъединиц РЦ|, мигрирующей вместе с CCKI, как это описано при выделении CCKI из ячменя (Knoetzel et al., 1992). Максимум низкотемпературной флюоресценции комплексов CCKI-A и CCKI-B соответствовал 685 нм (рис.4в).

Известно, что CCKI у многих объектов состоит из двух подкомплексов с максимумами низкотемпературной флюоресценции около 680 и 730 нм. Отсутствие у D. salina CCKI с максимумом флюоресценции выше 700 нм может быть особенностью объекта, либо следствием наличия у комплексов одинаковых белков, т.к. зоны А и В при разделении располагались очень близко друг от друга (рис. 1), и оказалось невозможно чисто разделить комплексы, состоящие из полипептидов со столь близкими молекулярными массами.

Таким образом, в ходе постепенной разборки тилакоидных мембран D. salina выделены и исследованы электрофоретически и спектрофлюориметрически белковые фракции, обогащенные ФС1 и ФСН, а также содержащие: чистую ФС1, РЦ1 и CCKI D. salina. Электрофоретические характеристики ФС1 и РЦ1 полностью

м А В

94 67 43 30 10.1 14-1 04 ¿7 43 30

67 •

4з

30 'Ч^^Ё^-Йий

20.1 '

• I 'I

14.4 'ЙШ4

Рис. 4.

Электрофореграммы (а), денситограммы (б) и спектры низкотемпературной флюоресценции (в) белковых комплексов ФС1 О.эаНпа, полученных после разделения ФС1 в препаративном электрофорезе, м - метчики, А - ССК1-680А, В - ССК1-680В

ДЛИНА ВОЛНЫ (нм)

соответствовали описанным ранее для этого объекта (Bruce and Malkin, 1988). Полипептидный состав CCKI D. salina исследован впервые. Установлено, что CCKI включает два подкомплекса: CCKI-А, содержащий белок 28 кДа, и ССК1-В, состоящий из полипептида(ов) 29 (28) «Да.

Идентификация лектиноподобных полипептидов в хлорофилл-белковых комплексах D.salina.

Для идентификации лектиноподобных белков в хлоропластах D.salina все фракции хлоропластных мембран, полученные при постепенной разборке мембран до отдельных комплексов и индивидуальных белков, тестировали на проявление лектиновой активности.

Таблица 2. Лектиновая активность субхлоропластных фракций D.salina.

Фракция Белок, Титр Активность,

мг/мл белок/титр

ФС1* 0.67 524288 1.20Х10"6

ФСИ* 0.72 128 5.63x10-3

ФС1 0.17 64 2.73X10"3

CCKI 0.14 1024 7.08Х10"5

РЦ1 0.12 — —

ФС1* - фракция, обогащенная ФС1

ФСК* - фракция, обогащенная ФСИ

Величина лектиновой активности фракции, обогащенной ФС1, почти в 5000 раз превышала это значение для фракции, содержащей преимущественно полипептиды ФСП (табл. 2). Исходя из этого, было сделано заключение, что лектиноподобные полипептиды D. salina входят преимущественно в состав ФС1.

Очистка ФС1 и разделение ее центрифугированием в градиенте плотности сахарозы показала, что пектиновой активностью обладают полипептиды, входящие в состав ССК1. Белки РЦ1 не проявляют агглютинирующей активности (табл. 2).

Увеличение удельной гемагглютинирующей активности ССЮ по сравнению с ФС1 также свидетельствует о локализации лектиноподобных белков у О.заПпа в ССК1. Снижение агглютинирующей активности по мере очистки ФС1 могло быть обусловлено присутствием сахарозы во фракции ФС1, т.к. в предварительных экспериментах было установлено, что в растворах сахарозы пектиновая активность снижается.

Таблица 3. Агглютинирующая активность белковых фракций, выделенных из О-яа/ша с помощью препаративного электрофореза.

Фракция Белок, Титр Активность,

мг/мл белок/титр

ФС1 0.34 128 2.95х10-3

ССК1-680А 0.020 256 1.17x10-4

ССК1-680В 0.026 256 1.02x10-4

РЦ1 0.021 — _

ССК1-680А и ССК1-680В, полученные с помощью препаративного электрофореза, проявляли близкую по значениям агглютинирующую активность (табл. 3), а РЦ1, как и в случае выделения в градиенте плотности сахарозы, не обладал пектиновой активностью. Как было показано выше (рис. 4), ССК1-680А состоит из мажорного полипептида с молекулярной массой 28 кДа и следов белка 29 кДа, ССК1-680В содержит примерно в равной концентрации полипептиды 28 и 29 кДа. Исходя из этого можно сделать вывод, что белок 28 кДа несомненно обладает пектиновой активностью. Не исключено,

однако, наличие агглютинирующей активности и у полипептида 29 кДа.

Как известно, пектинами называются углеводсвязывающие белки, способные обратимо агглютинировать клетки, или преципитировать полисахариды или гликоконьюгаты. Для подтверждения пектиновой природы полипептидов ССЮ О.заИпа была исследована их углеводная специфичность. Агглютинирующая активность фракции, обогащенной ФС1, ингибировалась О-галактозой и О-галактозамином и не ингибировалась рядом других углеводов (табл. 4). Поскольку агглютинирующая активность полипептидов ФС1 обусловлена белками ССК1, можно сделать заключение, что полипептиды ССК1 являются галактозоспецифичными.

Таблица 4. Действие различных углеводов на гемагглютинирующую активность пектина из О.БаНпа.

Углевод Минимальная концентрация, ингибирующая гемагглютинацию, мМ

О-Галактоза 25

О-Галактозамин 12.5

й-глюкоза -

2-Дезокси-О-

глюкоза -

Р-Манноза -

Арабиноза -

й-Рибоза -

Фруктоза -

Сахароза -

Э-целлобиоза -

1-Фукоза -

Поиск гомологии аминокислотных последовательностей лектинов и полипептидов хлорофилл-белковых комплексов

хлоропласта.

Поскольку полипептиды ССК1 обладают пектиновой активностью и способны узнавать и связываться с галактозными лигандами, можно предположить существование гомологичных аминокислотных последовательностей у полипептидов ССК и лектинов. В настоящее время установлены первичные структуры как белков ССК, так и лектинов, в том числе, их углеводсвязывающих сайтов, из многих растительных объектов.

Сравнение известных аминокислотных последовательностей углеводсвязывающих сайтов лектинов бобовых позволило представить консенсус, ответственный за связывание с углеводами следующим образом: ОТХХМХХ\Л/ (где X - позиции неконсервативных аминокислот) (рис. 5). На рисунке представлены последовательности только гапактозо-специфичных лектинов, хотя следует отметить, что углеводную специфичность определяют неконсервативные аминокислоты.

Последовательность, гомологичная сайту связывания лектинов с углеводами, обнаружена у большинства белков ССК1 и ССКП на С-конце. Гомология составляет от 20 до 50 %, что является довольно большой величиной, если принять во внимание, что сравнивались эволюционно очень далеко отстоящие друг от друга белки. Гомология между углеводсвязывающим сайтом лектинов и белками РЦ не выявлена.

Эти результаты хорошо согласуются с представленными выше экспериментальными данными о локализации лектаноподобных полипептидов в ССК1. Не менее важным представляется

установленный факт отсутствия углеводсвязывающего сайта у полипептидов РЦ1, что показано в результате анализа аминокислотных последовательностей и исследования лектиновой активности этого комплекса.

Рис. 5.

Гомология аминокислотных последовательностей

углеводсвязывающих сайтов лектинов и белков светособирающих комплексов.

лектины бобовых:

Cytisus scoparius CSII DTYYNSAW

Bauhlnia purpurea BPA DTWPNTEWS

Griffonia simplicifolia GS4 DTWINKDWN

Phaseolus vulgaris PHA-L DTLYNVHW

Phaseolus vulgaris PHA-E DTLYNKDW

Erythtina corallodendron ECorL DTFSNP W

Dolichos biflorus DBA DTLSNSGW

Glycine max SBA DTFRNS W

белки ССК томата:

CCKI-I

CCKI-II

CCKI-III

CCKI-IV

ССКИ-1

CCKII-II

CP29-I

CP24-I

DTXXNXXW

DPWHNNIGD DPGHATIFA DPWNNNVLT DPWHNTIIQ DPVNNNAWA DPVANNAWA DPFGNNLLT не обнаружена

Компьютерное исследование профилей гидрофобности углеводсвязывающих сайтов лектинов и гомологичных им участков аминокислотных последовательностей полипептидов ССК показало, что эти участки представлены, в основном, гидрофобными аминокислотами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

На основании установленного нами факта существования лектиновой активности у полипептида(ов) CCKI D. salina можно представить, что углеводсвязывающие центры лектиноподобных полипептидов CCKI взаимодействуют с остатками галактозы, входящими в состав галактолипидов липидного бислоя тилакоидных мембран, образуя единый глико-липопротеиновый комплекс хлоропласта (рис.6).

В пользу этой гипотезы свидетельствуют следующие факты:

- наличие гемагглютинирующей активности у полипептидов, входящих в состав CCKI D. salina;

- специфичность лектиноподобных белков CCKI D. salina к галактозе и, следовательно, их способность "узнавать" и связывать галактозу;

- характеристика липидного состава тилакоидных мембран, основными компонентами которых являются галактолипиды;

- обнаружение гомологии аминокислотных последовательностей углеводсвязывающих сайтов лектинов и белков ССК;

- локализация гидрофобного углеводсвязывающего сайта полипептидсв ССК на границе липидного бислоя и люмена (Kuhlbrandt et al., 1994), что не препятствует его взаимодействию с гидрофильными детерминантами;

- широкий оптимум рН для проявления лектиновой активности (Datta, 1991) и вытекающая из этого возможность функционирования лектинов даже при кислом значении рН люмена на свету;

- топология белков CCKI на границе ХБК с липидным бислоем и ориентация галактозных остатков галактолипидов в межмембранное пространство.

СН2ОН

Рис. 6.

Схема возможных взаимодействий полипептидов CCKI, обладающих лектиноподобными свойствами, с галактолипидами липидного бислоя тилакоидных мембран хлоропласта.

Таким образом, липид-белковое взаимодействие через галактозу лектиноподобных галактозоспецифичных полипептидов CCKI е.. галактолипидами липидного бислоя мембран тилакоидов может иметь существенное значение для понимания особенностей липид-белковых взаимодействий в тилакоидных мембранах по принципу молекулярного узнавания и рассматриваться, как еще один механизм самосборки и функционирования мембран хлоропластов.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан способ определения пектиновой активности с использованием клеток микроводорослей - альгоагглютинация. Способность лишенного клеточной стенки мутанта Chlamydomonas reinhardtii CW-15 агглютинировать в присутствии Con А указывает на

наличие в плазмалемме углеводсвязывающих участков, специфичных к маннозе.

2. Осуществлена постепенная разборка тилакоидных мембран D. salina и изучен полипептидный состав, спектральные и флюоресцентные характеристики хлорофилл-белковых комплексов. Впервые установлено, что CCKI D. salina включает полипептиды с молекулярными массами 29, 28 (и 27) кДа и, возможно, состоит из двух подкомплексов с максимумом низкотемпературной флюоресценции около 685 нм.

3. Исследована способность комплексов фотосинтетичесих мембран D. salina проявлять пектиновую активность и показано, что лектиноподобные белки ХБК локализуются преимущественно в CCKI. Установлено, что полипептиды РЦ1 агглютинирующей активностью не обладают.

4. Исследована углеводная специфичность белков ФС1 и показано, что лектиноподобные полипептиды CCKI являются галактозоспецифичными.

5. Проведен анализ гомологии полных аминокислотных последовательностей белков ССК и углеводсвязывающих сайтов пектинов и показано, что полипептиды светособирающих комплексов ФС1 и ФС11 содержат участок, гомологичный сайту связывания пектинов с углеводами, тогда как у белков реакционных центров эта последовательность отсутствует.

6. Обнаружение в ХБК хлоропласта галактозоспецифичного лектиноподобного белка и наличие гомологии между белками ССК и углеводсвязывающими участками пектинов позволяют предположить участие липид-белкового взаимодействия, опосредованного через пектины, в организации фотосинтетических мембран через

образование единого глико-липопротеинового комплекса хлоропласта.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

Л. Фалькович Т.Н., Пронина Н.А., Купцова Е.С., Семененко В.Е. (1991) Способ определения пектиновой активности. А.С. N 1778698.

2. Аллахвердиев С.И., Пронина Н.А., Фалькович Т.Н., Климов В.В., Семененко В.Е. (1993) Фотоинактивация фотохимической активности препаратов фотосистемы 2, изолированных из клеток Dunaliella salina.l Физиология растений. Т.40. N.2.C.199-203.

3. Фалькович Т.Н., Пронина Н.А., Семененко В.Е. (1993) Определение пектиновой активности с использованием клеток микроводорослей в качестве тест-объекта - метод альгоагглютинации. /Физиология растений. Т.40. N.3.

4. Фалькович Т.Н., Пронина Н.А., Семененко В.Е. (1994) ЛектинопОдобные свойства полипептидов светособирающего комплекса фотосистемы 1 Dunaliella salina.l Физиология растений. Т.41(2), С.184-189.

5. Falkovich T.N., Pronina N.A and Semenenko V.E. (1994) Lectin-like polypeptides of the light-harvesting complexes of Dunaliella satina IPPAS D-209. Abstracts 9 Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiol./ Biologia Plantarum. V.36, P.138.

Подп. к печ. 10.05.95 Объем 1,5 пл. Зак. 157 Тир. 100

Типография МПГУ имени В.И.Ленина

РГ6 ид

2 9 МАЙ 1995

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

На правах рукописи УДК 581. 036

АСАФОВА Елена Ьлацимировна

ВЛИЯНИЕ КАЛЬЦИЯ НА РАСТВОРИМЫЕ БЕЛКИ, СВЯЗАННЫЕ И СВОБОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ

ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ ЗАКАЛИВАНИИ

03. 00. 12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1995

Работа выполнена в Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина

Научный руководитель - Заслуженный деятель науки

Республики Татарстан, доктор биологических наук, профессор Л.П. Хохлова

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

Ф. Г. Каримова;

кандидат биологических наук, В. М.Пахомова

Ведущая организация - биологический НИИ

Санкт-Петербургского государственного университета

Згщита состоится _1995 р. в "_" час. на

заседании специализированного Совета К. 002.10.01 по присуждению ученой степени ¡сандидата биологических наук (специальность - физиология растений) при Казанском институте биологии КНЦ РАН по адресу: 420503, Казань, а/я 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского института биологии КНЦ РАН. ,

Автореферат^ разослан "У^" 1995 г.

Ученый секретарь Совета, кандидат биологических наук Н.Л.Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важной проблемой современной экологической физиологии растений является изучение механизмов устойчивости растений к различным неблагоприятным условиям, в том числе к действию морозов. Среди факторов, положительно влияющих на низкотемпературное закаливание и морозоустойчивость растений, особое внимание необходимо уделить кальцию. Кальциевые удобрения способствуют лучшей перезимовке озимых культур (Авдонин,I960), полезны» биохимическим изменениям и увеличению холодостойкости кукурузы (Колоша, 1962,1963). Ионы кальция повышают жизнеспособность культуры клеток листьев озимой пшеницы после действия отрицательных температур (Рошегоу,Andrews, 1985,1986) и увеличивают сопротивляемость изолированных протопластов закаленных клеток коры бузины красной к вредным последствиям замерзания - сокращению объема и обезвоживанию (Исабеков, Красавцев, 1989).

Физиологическое значение кальция связывалось с его субстратной роль» (Бушуева, 1964) ввиду компартмектализации катиона в клеточных стенках, вакуолях (Kauss, 1987; Kinzel, 1989), мембранах и органеллах (Moore, Akerman, 1984), а также в связи с наличием хелатированного кальция, ассоциированного с белками/ органическими кислотами, нуклеотидами (Левицкий, 1990).

Пусковым механизмам, лежащим в основе многих процессов роста и развития растений (митоза и цитокинеза, клеточного растяжения, полярного роста, движения протоплазмы, секреции и др.), в 80-е годы была дана более глубокая трактовка на основании появления данных, свидетельствующих об участии ионов кальция в регуляции клеточного метаболизма растений в качестве вторичного посредника (Marine, 1985; Hepler, Wayne, 1985; Poovaiah, 1987). Восприятие и передача таких внешних стимулов, как свет, гормоны и гравитация, сопрождается возникновением в клетках растений кальциевого сигнала, означающего увеличение концентрации свободного Саа+ в ци-тозолэ (Hepler, 1938). Зти данные позволяют считать, что значение кальция в повышении устойчивости растений может быть связано с его мессенджерной функцией э системе "сигнал - клеточный ответ". Высказано предположение об участии кальция в трансдукции температурного сигнала как вторичного посредника при холодовом повреждении (Minorsky, 1985) и закаливании (Хохлова и др. ,3993а)

растений. Однако механизмы функционирования Са2+ в процессах адаптации растений к температурным условиям существования остаются недостаточно изученными.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении закономерностей действия Саг+ на содержание растворимых белков, их компонентный и аминокислотный состав и уровень свободных аминокислот как важных составляющих механизма закаливания и морозоустойчивости растений.

При проведении исследований были поставлены следующие задачи:

1) изучить динамику общего содержанья Са2+ в тканях и изменение проницаемости клеточных мембран в условиях длительного осеннего и кратковременного контролируемого закаливания озимой пшеницы при внесении в почву кальциевых удобрений и использовании различных Са2+-содержащих сред:

2) исследовать влияние Са2+ на содержание растворимых бел-коб, их полиморфизм и аминокислотный состав;

3) изучить аккумуляции свободных аминокислот а тканях в связи с разной обеспеченностью кальцием закаленных и промороженных растений;

4) установить Елияние ингибиторов и активаторов поступления Саг+ в клетки на растворимость белкового комплекса и накопление свободного пролина при низкотемпературном воздействии.

Научная новизна. Впервые проведены систематические исследования, связанные с изучением физиологической роли Са2г в процессе низкотемпературного закаливания растений. При изучении динамики общего содержания Са2+ в тканях и экзоосмоса электролитов из них в условиях длительной осенней адаптации, а также после краткосрочного контролируемого закаливания и промораживания ус-тановлэно регуляторное влияние проницаемости мембран на содержание Са2+.

На основании впервые установленной прямой корреляции между, уровнями Саг+ и растворимых белков сделано заключение о том, что изменение содержания белкоз в процессе низкотемпературного закаливания растений относится к Са2+-зависимым физиолого-биохими-ческим реакциям. Показано индуцированное кальцием повышение гетерогенности растворимых белков и содержания гидрофильных аминокислот в их составе в период устойчивой адаптации оастений к

низким температурам. Отмечено сохранение относительной доли связанного пролина на постоянном уровне в белках растений, обеспеченных кальцием, в течение продолжительной естественной адаптации, что может свидетельствовать об увеличении в составе растворимых белков пролинсодержащих фракций. Обнаружено, что Са21 у незакаленнкх растений вызывает накопление свободных аминокислот, а у закаленных - более позднюю их аккумуляцию в осеннее время по сравнению с контролем.

Впервые продемонстрирована тесная отрицательная корреляция между содержанием Саг+ и свободного пролина в растениях во время закаливания, которая нарушалась после промораживания. Обсуждаются разные механизмы накопления свободного пролина при действии низких закаливающих и повреждающих температур. Предполагается, что одной из причин аккумуляции пролина к концу осеннего закаливания является уменьшение общего содержания Са2+ в тканях растений, которое.ограничивает использование аминокислоты для синтеза растворимых белков. После промораживания растений доминирующей причиной резкого увеличения содержания свободного пролина может быть деструкция белков.

На основании полученных данных в работе дается физиологическое обоснование приспособительной роли Саг+ в развитии морозоустойчивости растений.

Практическая значимость.Проведенные исследования вносят новое в понимание механизмов закаливания растений с участием Са~* и способствуют выяснению первичных температурозависимых реакций клеточного метаболизма, лежащих в основе адаптации и устойчивости озимых культур к действию морозов. Некоторые из полученных результатов могут найти применение при тестировании морозоустойчивости озимой пшеницы. Целесообразно также использовать теоретические обобщения при чтении спецкурсов по физиологии устойчивости и стрессолсгии растений.

Применение кальциевых удобрений, приводящее к увеличению накопления растворимых бетков, обладающих криопротекторными защитными свойствами, создает предпосылки для повышения выживаемости и, в конечном итоге, продуктивности растений озимой пшеницы.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптаиии"(Чернигов, 1991г.), Международной конференции "Успехи

современной криобиологии"(Харьков, 1992г.), отчетных научных конференциях Казанского университета (1991,1992,1995гг.), на совместном с Гиссенским университетом семинаре " Механизмы адаптации растений к холоду" (Германия, 1Э94г.).

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводоз, списка литературы и приложения. Работа изложена на - стр. машинописного текста, содержит 23 рис. ,18 таблиц. Список цитированной литературы включает наименований, из них - на иностранных языках.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили с растениями озимой пшеницы (Triti-cum aestivum L.) сорта Мироновская 808. Для опытов использовали надземную часть раскустившихся .растений и побеги 7-дневных проростков, выращенных, соответственно, в полевых и контролируемых условиях. Схема мелкоделяночных опытов включала два варианта: контроль - перед посевом в почву вносили NH4N03 и опыт вместо NH4N03 - Са(М03)2. Общий фон внесенных минеральных удобрений у растений обоих вариантов-М60Р10К30 (1990г.) и N80P10K30(199ir.). Доза Саг+ составила, соответственно, 85,7 и 115 кг на 1 га. Пробы отбирали bö время осеннего закаливания растений в течение октября и ноября месяцев. В контролируемых условиях проростки выращивали в кюветах при интенсивности света ЮОВт/м2 и 10-часовом фотопериоде: контроль- на бидистиллированной воде, опыт - на растворе СаС12 и Nae[Са(ЗДТА)] (0,25мЮ pH 6,5-6,7. Закаливание проводили в термокамере Т25(1.1)("Grönland", Германия) при 2-3°С в течение 3 суток, промораживание при -9°С 5 часов. Для активации и подавления поступления Са2+ применяли ЭГТА (1мМ) - хелатор Са2+, А23187 (8мкм)- ионофор Са2+, верапамил (Юмкм) и нифедипин (1мкм) - блокаторы потенииалзависимых Саг+-каналов. Вещества добавляли в среду вырашивания за 24 часа до закаливания или промораживания.

Содержание Са2+ определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотомэтрии на AAS-3 ("Karl Zeiss",Германия) после сухого озоления растительного материала в муфельной печи при 500°С в течение 4-5 часов и последующего перевода Саг+ в раствор 20%-ной

HCl (Церевитинов,"Современные методы исследования качества пищевых продуктов", 1976).

Растворимые белки выделяли из 5 г растительного материала путем гомогенизации кусочков ткани с 0,01 М трис-глициновым буфером pH 8,0,содержащим 1ХПВП (поливикилпиррапидон ),0,1мН PMSF, отношение кавески к буферу составляло 1:5. Экстракцию проводили при 2-4°С з течение 1,5 часов. Осаждение белков проводили 20%-ной охлажденной ТХУ. Белки отмывали в холодных условиях последовательно: 2% ТХУ, дважды ацетоном и эфиром до получения бесцветного осадка. Количественное определение белков проводили по методу Lowry (1951).

Белки анализировали по методу Laemmli (1970), используя одномерный электрофорез в плоском полиакриламидном геле в присутствии ДЦС-Na. Градиент концентраций геля 10 и 20%. Злектрофорег-раммы фиксировали в 10%-ком растворе ТХУ, окрашивали 0,1%-кым раствором Кумасси R-250. Гели денсчтометрировапи при 580 нм на спектрофотометре "Hitachi-557" (.Япония) и рассчитывали относительное количество полипептидов и их молекулярные массы в кило-даль тонах.

Для изучения аминокислотного состава растворимые белки гид-ропизовали в запаянных ампулах с 6н. HCl (145°С,5ч). После вскрытия ампул раствор выпаривали досуха на кипящей водяной бане,сухой остаток растворяли в цитратном буфере pH Я,2.

Свободные аминокислоты экстрагировали ступенчато этанолом с последующим разделением фракций хлороформом (Рядчиков, 1978). Количественное и качественное определение связанных и свободных аминокислот проводили методом ионообменной колоночной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе Т - 339 ("Ко-vo", ЧССР).

Проницаемость мембран контролировали по выходу электролитов из тканей путем определения электропроводности водных вытяжек после 2-часовой экспозиции тканей в бидистиллированной воде с помощью реохордного моста ВМ 401 Е фирмы "Tesla" (Чехословакия). Электропроводность выражали в процентах от максимально возможного выхода электролитов из мертвых тканей (Барашкова, Алексеева, 1973). Морозоустойчивость проростков тестировали по общепринятой методике путем прямого промораживания при -10°С в течение 5 часов и подсчета выживших растений после отращивания.

Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента при 5%-ном уровне значимости. Биологическая повторность опытов 2-3-кратная, аналитическая - 3-4-кратная. На рисунках приведены средние арифметические величины всей суммы биологических и аналитических повторностей и их стандартные ошибки.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изменение содержания Саг+ в тканях растений при действии низких закаливающих и повреждающих температур: связь с проницаемостью мембран

Из результатов полевых опытов следует, что после длительной низкотемпературной адаптации в осенний период происходило снижение содержания Саг+ в тканях раскустившихся растений и уменьшение выхода электролитов из них.(рис.1). Установленная прямая зависимость между этими показателями при действии низких температур свидетельствует о влиянии проницаемости мембран на уровень катиона в клетках растений. Снижение проницаемости мембран, о которой судили по уменьшению электропроводности водных вытяжек тканей, может быть также одним из механизмов адаптации, способствующих сохранению ионного гомеостаза клеток (Лыгин и др., 1990). В связи с этим, можно предположить', что происходящее в условиях естественной закалки снижение уровня Саг+ в растениях озимой пшеницы обусловлено падением поглощения катионов из-за уменьшения проницаемости клеточных мембран.

В лабораторных опытах после кратковременного закаливания и промораживания содержание Са2+ в проростках возрастало (рис.1). Основной причиной более интенсивного поступления Саг+- в клетки считается индуцированная холодовым повреждением деполяризация мембранного потенциала плазмалеммы и, как следствие, увеличение времени'пребывании потенциалзависимых каналов в открытом состоянии ШпогБку, 1985). Одновременно усиливался и выход электролитов из тканей проростков (рис.1), указывающий на повышение проницаемости клеточных мембран. Однако вытекание ионов из клеток не всегда связано с повреждением мембран и, возможно, отражает процессы начальной адаптации клеток к внешним воздействиям (Мелехов, Анев, 1990). Следовательно, и в этих опытах подтверждена

1 2

11.1 25.1 1.Н 15. Л 22.11 Цм »25*С »2°С.ЗСУТ. -9"С.5Ч ♦7,>• +5,1° -7,1е ♦0,5* -0,8° 1°.С

2

11.Х 25.1 1.11 15.11 22.11 Дт» +25»С ««С Зс?Т -9«С 5ч +7,9* й.1" -7,1е +С.5* -0.8» 1°.С

Рис.1. Влияние низких температур на содержание Саг+ в тканях растений и выход электролитов из них: 1- контроль (-Са2+), 2- опыт (+Саг+)

положительная связь между содержанием Са2+ в тканях и выходом электролитов из них. Повышение уровня Саг+ в проростках, наблюдаемое в контролируемых условиях закаливания и промораживания,

может быть следствием противоположных изменений, а именно, уси-„ ¡>1 ' лекия поступления Са" в клетки в результате увеличения проницаемости мембран.

Таким образом, происходящее в период холодовой адаптации изменение проницаемости и модификация транспортных свойств мембран приводят к изменению уровня Саг+ в растениях.

- 10 -

3.2. Влияние Са2+ и низких температур на содержание и гетерогенность растворимых белков

В процессе длительной низкотемпературной адаптации в природных условиях обнаружено изменение содержания растворимых беп-ков в тканях озимой пшеницы (рис.2). В начале закаливания происходило. уменьшение их количества, которое может быть следствием

1990

1991

со

1 50 <о

т 40

2. 30 аз т |*20 Я >. К о

&С." О ¡3 О

I

10.1 23.1 1.11 ♦7,9° -0.4° -0.9°

26.11 -9,2"

301

ь

5 (в

о ц

О.Ш (ФО

и ^ 10

«о оо

ос- „ оз о

10.1 +7,9»

23.1 1.П ■0.4° -0.9°

22.11 1а?а -0,8° 10.С

Рис.2. Динамика содержания растворимых белков и гидрофильных аминокислот в.их составе в тканях раскустившихся растений во время осеннего закаливания: 1 -контроль (-Саг+), 2 - опыт (Са(ГЮ3)г)

снижения синтеза белков в связи с торможением осенней вегетации при похолодании. В конце осеннего периода отмечена стабилизация уровня растворимых белков цитоплазмы. Подобные фазные изменения подтверждают главную сущность явления адаптации, отражающую са-мсрегулируемость метаболизма и способствующую повышению устойчивости (Удовенко, 1979). По данным полевых опытов, показано более раннее накопление растворимых белков в тканях опытных растений по сравнению с контрольным вариантом.. В ходе исследований впервые выявлена однотипность изменений содержания растворимых белков и общего Са2+ в условиях осеннего закаливания и установлена прямая корреляционная связь между данными показателями. Коэффициенты корреляции составили: для контрольного варианта - +0,81, для опытного - +0,75 (опыт 1990г.), +0,75 и +0,67 (опыт 1991г.), соответственно.

Данная положительная корреляция была установлена также при контролируемом закаливании (табл.1), и более высокое содержание растворимых белков у растений, выращенных на среде с Саг+, соответствует и большему количеству иона в тканях.

Таблица 1

Влияние контролируемого закаливания (+2°С,Зсут.) на содержание Саг+, растворимых белков и свободного пролина в тканях проростков при использовании разных Саг+-содержащих сред, мг/г сух.веса

Варианты Соц^ржание Содержание раств. белков Содержание своб.пролина

Н20 СаС12 СаС1г+А23187 (8мкм) СаСЬ+ЭГТА (1мМ) 0,082+0,01 , 0,148+0,001* 0, 233+0,034 0,148+0,007 23, 91+0.35. 26, 34+0,87* 34,03+1,60 26,32+0,21 0,27+0,02. 0,17+0,06'\ 0,05+0,001 0,15+0,02

Примечание: * Р > 0,99

Для подтверждения выявленной зависимости был проведен ряд дополнительных экспериментов. После добавления в среду выращивания кальциевого ионофора'А23187 отмечено увеличение содержания как Сас+ в тканях закаленных проростков, так и растворимых белков (табл.1). Однако применение хелатора Са2+- ЗГТА, как известно, изменяющего уровень внутриклеточного Саг+, не приводило к изменению изучаемых показателей в тканях проростков (табл.1). Отсутствие эффекта ЗГТА, возможно, обусловлено его недостаточной

концентрацией. При выращивании проростков в условиях дефицита Caz+, создаваемого использованием раствора сложной комплексной соли NagССа(ЗДТА)], поступление катиона в ткани уменьшалось, при этом более низким становился и уровень растворимых белков (рис.3). Такая же зависимость имела место и в других вариантах опыта, когда перед закаливанием в среды выращивания добавляли блокаторы Са2+- верапамил (Юмкм) и нифедипин (1мкм) (рис.3).

Увеличение накопления растворимых белков в растениях озимой пшеницы является, на наш взгляд, отражением положительного влияния Саг+ на процессы низкотемпературного закаливания. На это указывают и данные по оценке устойчивости проростков к морозу. При подсчете числа выживших после отращивания растений показано, что морозоустойчивость опытных проростков была в 4 раза выше контрапьных. Имея в виду существующее представление о непосредственном участии растворимых белков в залуске и формировании механизмов морозоустойчивости растений (Зверева, Трунова, 1985; Войников, 1988; Титов. 1989; др. ), полученные данные могут указывать на приспособительную роль Саг+. Индуцированное Саг\ накопление растворимых белков может происходить как в результате усиления их синтеза, так и уменьшения распада. При этом участие Саг+ в регуляции белкового обмена, возможно, осуществляется посредством функционирования этих катионов в качестве вторичного

а б в г

Рис.3. Влияние закаливания на содержание Са ' и растворимых белков в тканях проростков при выращивании на разных средах: 1- СаС12, 2- ^[Са(ЭДТА)]. а - +25°С, б - +2°С,3 сут. ,в-+2°С,Зсут.+верапамил (Юмкм), г -+2°С,Зсут.+нифедипин(1мкм)

посредника.

Действие ионов Са2+ на процессы'низкотемпературной адаптации связывается также с изменением спектра растворимых белков. Электрофоретический анализ показал увеличение числа белковых зон с низкими молекулярными массами в растениях опытного варианта (табл.2): 17,18кД (опыт 1990г.) и 17.19,21.22кД (опыт 1991г.). Накопление этих компонентов может иметь приспособительйое значение, так как низкомолекулярные белковые фракции обладают способностью прочно удерживать воду, стабилизировать клеточные структуры при воздействии низких температур (Бабенко, Нигрецкая, 1971) и регулировать направленность метаболизма при адаптации. В белках опытных растений отмечено также появление полипептидов со средними молекулярными массами: 30,32, 35кД (1990г.) и 35,37кД (1991г.). Одновременно имела место тенденция к исчезновению некоторых высокомолекулярных компонентов. Следует отметить также более высокую разнокачественность растворимых белков в средней части спектра (появление двух компонентов -25 и 45 кД) у опытных

Таблица 2

Относительное содержание полипептидов растворимых белков тканей раскустившихся растений, % от суммы всех полипептидов (полевой опыт)

-7,9° С

М. м.

кД

1.11.1990г., -0, 4 С

1.11.1991г.

Контроль, (без Саг+)

Опыт Са(Шз)2

Контроль (без СаГ )

Опыт СаШ0з)г

И

17

18 19 21 22 25 27 30 32 35 37 45 48 67

69

70 76 79

9,40

12,08 7,11 10, 34

11,64 8,27 б, 34 27,25

3,13 2,20 5, 47

4,24 1,15 1,08

8, 47 6,71 4,06 3,89 6,08

10,17. 7,51 20, 56

9, 04 13,14

3,21

2,09 5,61 8, 32 9.14

10,07 3,18 28, 37 11,34 10,81

7, 44

8, 17

5,18 3.4!

6, 70

2, 47 4,14

3, 27 3,14 4,70 3,26 6,12

10, 72 2,17 22,13

14,34 18,04

- 14 -

проростков при контролируемом закаливании.

Таким образом, белки тканей растений, получивших кальциевое питание, являются более гетерогенными. Накопление фракций низко-и среднемолекулярных полипептидсв в клетках опытных растений может происходить как в результате их синтеза, так и в результате распада крупных белковых молекул при действии низких температур. Увеличение полиморфизма растворимых белков относится к важнейшим молекулярным защитно-приспособительным процессам (Барашко-ва, 1971; Войников, Корытов,1991), составляющим основу индуцибель-ных систем при холодовой адаптации растений (Кузнецов,1992).

В условиях естественного осеннего и контролируемого закаливания и промораживания происходило изменение содержания связанных с растворимыми белками аминокислот, которое зависело от уровня самих белков и было, вероятно, обусловлено процессами как новообразования, так и деградации белковых молекул при пониженных температурах. Показано, что .основную долю в цитоплазматичес-ких белках проростков и раскустившихся растений озимой пшеницы составляют аспарагиновая, глутаминовал кислоты, лизин, аргинин, лейцин (50-55%). Динамика гидрофильных аминокислот в составе растворимых белков в ходе осенней адаптации так же, как и динамика содержания белков, носила фазный характер (рис.2). Положительное влияние Саг+-удобрений заключалось в усилении гидрофиль-ности белков в период наибольшего накопления их в тканях опытных растений по сравнению с контрольными (в конце октября и начале ноября при действии невысоких положительных и отрицательных температур). Можно предположить, что вновь появившиеся в этих условиях белковые структуры оказываются более гидрофильными. Согласно литературным сведениям, гидрофильные аминокислоты могут создавать своеобразную защитную оболочку на поверхности'белков, увеличивая их устойчивость (Петровская-Баранова, 1983). На наш взгляд, накопление гидрофильных аминокислот в растворимых белках опытного варианта могло способствовать развитию их большей термоустойчивости по сравнению с контрольными и сохранению более высокого уровня белков в тканях опытных растений после завершения закаливания.

В ходе проведения экспериментальной работы выявлено сходство изменений количества пролина в составе растворимых белков проростков и взрослых растений (рис.4). При закаливании положи-

+25°С +2°С.ЗСУТ. -9°С.5Ч

Рис.4. Влияние низких температур на содержание пролйна в составе растворимых белков: 1- контроль (-Саг+), 2- опыт

(+Саг+)

тельными температурки в естественных и лабораторных условиях более высокое содержание пролина было установлено для белков контрольных растений. Однако в белках растений опытного варианта обнаружено сохранение относительной доли связанного пролина на некотором постоянном уровне на протяжении всего осеннего закаливания. Таким образом, положительное действие Саг+ может состоять в увеличении пролинсодержащих фракций в составе растворимых белков цитоплазмы при длительной адаптации растений к низким температурам. Это может представлять эффективный механизм защиты бел-

ков от криоповреждений.

3.3. Влияние Саг+ и низких температур на содержание свободных аминокислот

Адаптация растений озимой пшеницы к закаливающим температурам в осеннее время сопровождалась увеличением общего количества свободных аминокислот (рис.5). Добавление Саг+ в среду выращивания или внесение кальциевых удобрений в-почву способствовало накоплению свободных аминокислот в проростках при оптимальных условиях и в тканях раскустившихся растений в начале осеннего периода. В дальнейшем аккумуляция свободных аминокислот в процессе низкотемпературной адаптации происходила вне зависимости от ионов Саг+. В условиях естественного закаливания повышение содержания свободных аминокислот в растениях контрольного варианта отмечено в середине осеннего периода, а в опытных растениях ■>■ в конце. Причиной более позднего увеличения количества свободных аминйкислот в растениях опытного варианта может быть сохранение в их тканях пула растворимых белков в начале и середине процесса закаливания. В свою очередь, более высокое содержание свободных аминокислот в опытных растениях в начале адаптации может предотвращать разрушение.цитоплазматических белков по мере нарастающего воздействия низких температур.

В наших исследованиях показана зависимость динамики содержания свободного тирозина от уровня растворимых белков и количества связанного с ними тирозина в проростках и взрослых растениях при закаливании. Для всего хода осенней адаптации вычислена отрицательная корреляция между изменениями количества свободного и связанного тирозина, ' особенно значимая для контрольного варианта. Коэффициенты корреляции составили в контроле -0,89, в опыте -0,65. Промораживание вызывало более интенсивное накопление аминокислоты вследствие глубоких превращений белковых веществ.

Пролин привлекает внимание физиологов и биохимиков, так как неспецифическая аккумуляция этой аминокислоты считается типичным стрессовым ответом (Агафонов и др., 1975; Шезякова, 1983; Рекос-лавская, 1989; Ра1Шс11,1990; Кузнецов и др., 1991). Многими исследователями признается роль свободного пролина в криоадаптации и развитии морозоустойчивости озимых культур (Проценко, Руба-

11.1 25.1 l.II 15.11 22.11 Itn ♦7,9» «5,1» -7.1' +0.5" -0.8е t".C

♦25°С t2°C.3cjT. -ЗТ.Г-Ч

11.I 25.1 l.II ♦7,9" ♦5,1° -7,1»

15.II 22.11 ♦0.5« -0,8»

О Im t»,C

♦25"C ♦З'С.ЗСН. -9t. 54

Рис.5. Влияние низких температур на содержание свободных аминокислот и пролина в тканях растений:

1- контроль (-Са^), 2- опыт (+Саг+)

нвк,1967; Перуанский, Стаценко, 1931; Барашкова, Бурень,1990; Dorffling et al. ,1990; Стаценко,1994).

Согласно полученным нами данным, характерным процессом, происходящим в растениях озимой пшеницы под влиянием длительного и кратковременного закаливания и промораживания, является аккумуляция свободного проль'на (рис.5). К концу осеннего закаливания его относительное количество превышало начальные значения более, чем в 2-3 раза. При этом динамика накопления этой аминокислоты у опытных растений по сравнению с контрольными имела меньшую амп-

литуду колебаний в ответ т смену температуры в осеннее время. Выявлена тесная отрицательная связь между содержанием пролина и общего Са2 + в тканях во время естественного закаливания растений. Коэффициенты корреляции составили: • для контрольного,вариан-

о ,

та -0,87, для опытного —0,94. Повышенному содержанию Са у растений, получивших дозу кальциевых удобрений, соответствовало меньшее количество пролина. Обратная корреляция, установленная между этими показателями, подтверждена в контролируемых условиях закаливания, и более высокие темпы накопления пролина были характерны для проросткоЕ, выращенных на среде без Са2+ (рис.5). После промораживания такая связь нарушалась, и, несмотря на повышенное содержание Са2+ в тканях опытных проростков,количество свободного пролина было одинаковым в растениях обоих вариантов. Следовательно, резкое увеличение свободного пролинг. (в 13-14раз по сравнению с оптимальными условиями) после промораживания не зависело от содержания кальция в тканях.

Для подтверждения выявленной зависимости был проведен ряд дополнительных экспериментов с использованием ЭГТА и А23187. Увеличение уровня катиона в закаленных проростках после применения ионофора А23137 приводило к меньшему накоплению пролина в тканях (табл.2). При добавлении ЭГТА уровень Са2+ в закаленных проростках не изменялся и, как следствие, количество пролина в тканях оставалось неизменным. Накопление пролина в промороженных проростках происходило независимо от направленной модификации уровня Са2+ в тканях.

3. 4. Связь между аккумуляцией свободного пролина и

содержанием растворимых белков опосредуется через кальций ,

Впервые в наших исследованиях установлена обратная связь между содержанием свободного пролина и растворимых белков в тканях озимей пшеницы во время длительного осеннего (табл. 3) и кратковременного контролируемого закаливания . Увеличение уровня аминокислоты в проростках при закаливании (+2°С,Зсут.) сопровождалось уменьшением количества растворимых белков в них. Промораживание (-9° С, 5ч) еще более усиливало этот процесс. Все это позволяет считать, что концентрация пролина в клетках растений при

низких температурах контролируется уровнем растворимых белков.

Таблица 3

Коэффициенты корреляции между показателями раскустившихся растений (опыт 1991г.)

ш Контроль, (без Са*4) Опит СаШ0з)г

1 2 3 4 2 + Между содержанием Са и свободного пролина 2 Между содержанием Са и растворимых белков Между содержанием растворимых белков и свободного пролина Частны0 коэффициент корреляции г(хг)у -0,87+0,12 +0, 75+0, 22 -0, 72+0, 24 -0, 74 -0,Й4+0,06 +0, 67+0, 33 -0, 68+0,27 -0, 05

Примечание

г-свободного пролина.

Поэтому основной причиной накопления свобоцноги пролика в закаленных растениях, по-видимому, является ограничение в его использовании в результате замедления синтеза белков. О последнем свидетельствует уменьшение включения меченых аминокислот в белки проростков озимой пшеницы в ответ на постепенное снижение температуры от +18°С до -3°С (Петрова, 1984). Доминирующей причиной резкого возрастания количества аминокислоты в условиях продолжительного действия отрицательных температур и контролируемого промораживания может быть распад белков. Такая возможность допускается в связи с ранее установленным фактом об активизации протеолитических ферментов, накоплении свободных аминокислот и уменьшении содержания белков в тканях озимых культур после устойчивого воздействия слабых морозов (Проценко, Руианюк, 1967). 3 свою очередь, накапливающийся пролин может оказывать активирующее действие на гидролитические ферменты, которые вызывают усиление деградации белковых макромолекул (Вовчук и др.,1994).

В то же время в наших опытах выявлена положительная корреляция между количеством бепков и ионов Саг+. При этом растения, обеспеченные Са2+, как после краткосрочного, так и длительного закаливания содержали больше растворимых белков и меньше свободного пролина. Отсюда.можно предположить, что связь между Са2+ и свободным пролином опосредуется через растворимые белки, о чем свидетельствуют значения частных тройных коэффициентов керреля-

- РО -

ции (табл.3). В связи с этим, причиной накопления пролина в клетках после длительного закаливания растений в осенний период может быть снижение содержания Са2+, которое ограничивает использование аминокислоты для синтеза растворимых белков. При повреждающем воздействии отрицательной температуры аккумуляция пролина коррелирует со значительным уменьшением содержания растворимых белков, но происходит независимо от содержания Саг+ в тканях. Поэтому, доминирующей причиной резкого увеличения его количества является, вероятно, деструкция белков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что низкотемпературное закаливание растений сопровождается функциональной и структурной реорганизацией клеток, обеспечивающей их жизнедеятельность и устойчивость в изменившихся условиях.

Снижение экзсосмоса ионов из тканей во время длительного естественного закаливания полевых растений, а также возрастание выхода электролитов из тканей проростков после кратковременного контролируемого закаливания и промораживания указывают на регу-ляторное изменение барьерных свойств плазмалеммы в процессе низкотемпературной адаптации, которое может сопровождаться перестройкой Са2*-транспортирующих систем. В связи с этим, можно предположить, что увеличение количества Са2+ в тканях проростков после краткосрочного закаливания и промораживания связано с усилением его транспорта в результате деполяризации мембранного потенциала в период начальной стрессовой реакции организма (Пяты-гин, Опритов, 1992) и увеличением времени пребывания потенциалза-висимых кальциевых каналов в открытом состоянии (МтогБку, 1985). Снижение же содержания Саг+ в растениях в осеннее время может быть обусловлено противоположными процессами, вызывающими уменьшение времени "жизни" и/или числа Саг+-каналов и тем самым замедление поступления Сг2+ в клетки.

Совокупность полученных данных позволяет высказать соображение о выполнении кальцием в процессах низкотемпературного закаливания растений адаптогенной роли, которая выражается в поло: жительном влиянии Са2+ на содержание растворимых белков, повышение их гетерогенности и количества связанных гидрофильных амино,-

кислот, а также на аккумуляцию свободных аминокислот в тканях активно вегетирующих растений (до закаливания). Заслуживают вни-мзние и данные, свидетельствующие об ускоренных и эффективных темпах формирования термоадаптизных реакций в растениях, обеспеченных Са2+ (более раннее накопление растворимых белков, меньшая амплитуда колебаний свободного пролина и сдвиг аккумуляции свободных аминокислот на более поздние этапы адаптации, сохранение в белках относительной доли связанного пролина).

В плане проведенных исследований механизмы действия Саг+ могут быть весьма разнообразны. Так, по современным представлениям, увеличение концентрации свободного Са2+ в цитозоле после действия раздражителя может служить сигналом запуска стресс-реакции организма на уровне генетического аппарата (Poovaiah, 1987; Бияшева и др. ,1993), вызывать фосфорилирование мембранных и растворимых белков растений через систему Са2+- кальмодулин (Veluthambi, Foovaiai), 1984; Каримова,Жуков, 1991; Fallon etal., 1993). Положительную корреляцию между содержанием катиона и белков можно объяснить и с точки зрения существования буферной системы цитозоля, '.сотпрая включает связывающие Са2+ растворимые белки. Механизм действия Са2+ на белковый комплекс может'быть также связан со свойством катиона выступать в роли агента, модифицирующего структуру мембранных систем (Гордон,1973; Бауман, 1977), и влиять на стабильность и активность рибосомального аппарата (Питерман, 1967). К тому же нельзя исключить возможность опосредованного влияния Са2+ на синтез белков через улучшение его энергообеспеченности. Существует много данных о необходимости Са2+ для сопряжения окисления с фссфорилированием ('Гитоса, Зайцева, 1976; Караджов и др. ,1987), в том числе и как компонента мессенджерной системы митохондрий (Marme,1985), для поддержания метаболических состояний митохондрий (Зайцева, Зубкова, 1979), в то время как дефицит катиона вызывает разобщенное дыхание (Бушу-ева. Семихатова, 1965). Вероятность появления дополнительных источников энергии для новообразования белков в клетках 'кальциевых' растений в ходе адаптации к низким температурам вполне реальна в связи с имеющимися сведениями о стимуляции дыхания под влиянием Са2+(Рим Мен Чхор, Хохлова, 1990), обусловленной, по-видимому, повышением сродства митохондрий к катиону и усилением его аккумуляции в этих органеллах (Хохлова и др., 1988,1993*.

На основании выявленных в ходе адаптации закономерностей изменения содержания кальция, растворимых белков и свободных аминокислот можно допустить, что Са2+ опосредует обратную зависимость между количеством растворимых белков и свободного проли-на в растениях озимой пшеницы при закаливании низкими температурами. В связи с этим нами развивается представление о разных механизмах накопления свободного пролина при действии закаливающих и повреждающих температур. По-видимому, одной из причин аккумуляции пролина к концу осеннего закаливания является уменьшение содержания Саг+, которое ограничивает использование аминокислоты для синтеза растворимых белков.' После действия криостресса основной причиной накопления свободного пролинг является, вероятно, деструкция белков.

ВЫВОДЫ

1. Снижение уровня Саг+ в тканях раскустившихся растений озимой пшеницы в результате длительного закаливания низкими температурами в осенний период может быть следствием замедления поглощения катионов из-за уменьшения проницаемости мембран. Повышение же содержания Са2+ в тканях проростков в условиях непродолжительного контролируемого закаливания (+2°С,Зсут.) и промораживания (-9°С,5ч), напротив, связано с усилением поступления Са2+ в клетки вследствие увеличения проницаемости мембран.

2. В процессе осенней адаптации растений к низким температурам выявлена фазность изменений общего содержания Са2+ и растворимых белков, проявляющаяся в уменьшении значения этих показателей в начале закаливания и их стабилизации в кенце. Положительная корреляция между количеством Са2+ и растворимых белков, установленная в естественных и контролируемых условиях закаливания, указывает на то, что накопление растворимых белков относится к Саг+-зависимым физиолого-биохимическим процессам.

3. На этапе устойчивой адаптации к низким температурам у растений, получивших Сас+-питание и содержащих больше растворимых белков, отмечено повышение гидрофильности, а также гетерогенности этих белков в низко- и среднемолекулярной областях спектра, возможно, обусловленное их новообразованием или распадом высокомолекулярных компонентов.

4. Основную массу в составе растворимых белков закаленных растений составляют аспэрагиновая, глутаминовея кислоты., аргинин, лизин, лейцин, а наименьшую - серин и тирозин. Сохранение относительной доли связанного пролина в белках опытных растений на протяжении длительного закаливания к низким температурам в осеннее время может свидетельствовать об увеличении среди растворимых белков пролинсодержащих фракций.

5. Саг+ вызывает в тканях незакаленных растений накопление свободных аминокислот, которые могут использоваться для синтеза растворимых белков и сохранения их пула во время закаливания. Отражением последнего является более поздняя аккумуляция свободных аминокислот у растений спытного варианта. На примере тирозина подтверждена обратная взаимосвязь количественных изменений связанных и свободных аминокислот.

6. Показано индуцированное закаливанием увеличение более чем в 2-3 раза количества свободного пролина, отрицательно коррелирующее с содержанием общего Саг+ и растворимых белков в тканях. Одной из причин аккумуляции пролина может быть уменьшение содержания Саг+, которое ограничивает использование этой аминокислоты для синтеза растворимых белков при закаливающих температурах. Накопление свободного пролина в тканях после промораживания растений происходило независимо от ионов Саг+,а основной причиной резкого увеличения его количества (в 13-14 раз по сравнению с оптимальными условиями) является, вероятно, деструкция белков.

7. Совокупность полученных дачных позволяет заключить,, что ионы Саг+ в процессах низкотемпературного закаливания растений выполняют адаптогенную.роль, обеспечивающую, по-видимому, включение индуцибельных систем, контролирующих синтез, накопление, полиморфизм растворимых белков и обогащение их пролином, а также участие катиона в стабилизации мембран и регуляции уровня крио-защитных веществ (на примере свободного пролина). При повреждающих температурах термоадаптивные функции Саг+ ослабевают.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Асафова Е. В., Хохлоза Л.П., Абдуллина Г.А., Гайдукова 0. В. Влияние осеннего закаливания и условий кальциевого питания на содержание и аминокислотный состав растворимых белков озимой

пшеницы/Деп. в ВИНИТИ.- 1991,- N3961,- В.91.- 19с,- Библ.21 назв.

2. Хохлова Л.П., Асафова Е.В., Бслогуб 0.В. Активность Саг+-транспортирующих систем и физические свойства мембран пру адаптации растений к низким гемперагурам//Тезисы докл. II Международ. конфер."Успехи современной криобиологии". - Харьков, 1992. -С.З.

3. Асафова Е.В., Хохлова Л. П., Абдуплина Г.А. Влияние кальция на содержание свободного пролина у озимой пшеницы в условия* низкотемпературной адаптации/В сб. Водообмен и устойчивость растений,- Казань: Изд-во Казан.ун-та. - 1993.- С.66-74.

4. Асафова Е.Б., Хохлова Л.П., Абдуллина Г.А. Влияние кальция на содержание растворимых белков и пролина в растениях озимой пшеницы при действии низкой температуры//Тез. докл.II съездг Украинского общества физиологов растений,- Киев,1993,- т.1.-С.7.

5. Хохлова Л.П., Асафова Е. Е. Влияние кальция на содержание пролина и растворимых белков в растениях при низкотемпературном воздействии// Физиология растений.- 1994.- т.41,N4,- С.447-453.

Сдано в набор 12.05.95 г. Подписано в печать 15.05.95 г. Форм.бум. 60 х 84 I/I6. Пей.л. I. Тираж 100. Заказ 201.

Лаборатория оперативкой полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5