Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Культура изолированных зародышей в создании новых селекционных форм тюльпанов

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Культура изолированных зародышей в создании новых селекционных форм тюльпанов"

На правах рукописи КОЛОкШЦ Татьяна Михайловна

Р Г 3 од

УДК 635.91.075: 582.572.226-152

2 3 ИЮН 1997

КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДИМ В СОЗДАНИИ НОВЫХ СЕЛЕКЦИОННЫХ ФОРМ ТЮЛЬПАНОВ

'Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степ-эки кандидата сельскохозяйственных наук

Москва 1997

Работа выполнена во ВНИИ цветоводства и субтропических культур в 1993-1996 гг.

Научный руководитель - кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник В.С.Мохно.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор И.В.Дрягина, кандидат биологических наук В.А.Высоикий.

Ведущая организация - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева.

Защита состоится...................... 1997 г.

в часов на.заседании диссертационного совета К 120.89.01

при Всероссийском научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080, Московская обл., Одинцовский район, п/о Лесной городок, ВНШССОК, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИССОК.

я б

Автореферат разослан ......................1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 120.89.01 -

кандидат сельскохозяйственных наук В.А.Епихов

ОНЦАЯ хщкгерштш работы

Актуальность темы. Тюльпан - культура, которая по праву занимает одно из ведущих мест в отечественном цветоводстве. Это во многом связано с высокими декоративными качествами цветка и комплексом биологических особенностей тюльпана, которые позволяют получить весьма эффективную срезочную цветочную продукцию в условиях закрытого и открытого грунта, и также использовать его как горшечную культуру, при этом для выгонки требуются незначительные энергетические затраты. В озеленении же, при умелом подборе сортов -это ярко окрашенный наряд садов, парков, скверов и клумб в течение 2-2,5 весенних месяцев.

Промышленное цветоводство в нашей стране базируется на сортах тюльпанов, завезенных из-за рубежа. •

На основании результатов интродукции и сортоязучения тюльпанов установлено, что в условиях влажно-субтропического климата они имеют целый ряд недостатков : сильно поражаются вредителями, грибными болезнями, вирусом пестрения, многие зарубежные высокодекоративные сорта имеют низкий коэффициент ..размножения.

Эти причины значительно снижают эффективность в.озделывания тюльпанов в Черноморской зоне, где температурные условия и световой режим позволяют получать цветы на срез почти в течение полугода - в декабре-феврале в теплицах и легких пленочных укрытиях, в феврале-апреле - в условиях открытого грунта. В связи с этим актуальным .стал вопрос, создания отечественных сортов тюльпанов, менее требовательных в культуре, более устойяивых к вредителям и болезням и более урожайных во влажно-субтропической зоне Черноморского побережья России в сравнении с существующими.

Получение сортов и форм сельскохозяйственных культур, устойчивых к неблагоприятным экологическим факторам, различным заболеваниям и вредителям - важнейшая задача селекции.

Вовлечение в селекционный процесс диких и полудиких видов - путь расширения генетического базиса и один из приемов решения поставленной задачи. Однако известно, что при межвидовых и разно-геномных скрещиваниях, в том числе .и тюльпанов, лимитирующим фактором является развитие зародыша, которое останавливается из-за слабого развития эндооперма. В результате образуются маложизнеспособные или нежизнеспособные гибридные семена.

В преодолении трудностей, связанных с получением устойчивых гибридных форм при отдаленной гибридизации тюльпанов, а такжввсЬШ С длительным ювенильным периодом, затягивающим получение сорта до 20-25 лет, существенную помазь может оказать метод культуры изолированных зародышей.

Цель ц задачи иоследдаций. Целью настоящей работы явилось изучение возможностей использования метода культуры изолированных зародышей тюльпанов для получения полноценных растений селекционных форм от отдаленных скрещиваний и сокращения'сроков селекционного процесса.

Для этого решались следующие задачи :

1. Подбор условий стерилизации исходного растительного материала ;

2. Изучение сроков изоляции зародышей, наиболее благоприятных для успешного их развития /и и^го';

3. Определение оптимальных факторов культивирования зародышей для обеспечения наибольшего коэффициента размножения и формирования ынкролуксвиц о целью повышения сохранности гибридных генотипов в ускорения их размножения :

- состав питательной среды ;

- регуляторы роста ; углеводы ;

- световой и температурный режимы ;

4. Разработка схемы технологического процесса получедия полноценных гибридных сеянцев из изолированных зародышей тюльпанов.-Научная новизна исследований. Впервые в нашей стране показана возможность использования метода культуры зародышей в селекции тюльпанов. Для этого подобраны питательные среды, режимы культивирования зародышей от введения в условия ¡ь п'Но до формирования микролуковиц, что послужило основой для разработки технологической схемы получения полноценных гибридных сеянцев из изолированных зародышей 'тюльпанов.

Показано преимущество в получении новых йибридных форм тюльпанов в сравнении с традиционной схемой при включении этого метода в селекционный процесс.

Практическая ценность работы. Разработанные методические приемы и последовательность операций при выратрвании - расте-

ний и микролуковиц тюльпанов ¡ч у'Лго позволяет получить полноценные гибридные сеянцы из недоразвитых зародышей в отдаленных комбинациях скреп^вания и сохранить генофонд.

Использование модифицированных питательных сред в сочетании с различными режимами культивирования обеспечивает получение от одного зародыша до 10 и более проростков и до 30 микролуковиц генетически однородного материала, что повышает сохранность но-' вообразований и ускоряет их размножение.

Модифицированный применительно к тюльпанам метод культуры изолированных зародышей повышает эффективность селекционных исследований и рекомендован селекционерам для практического применения.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на расширенных заседаниях методического совета ВНИИ цветоводства и субтропических культур (1993-1996 гг.).заседаниях

ученого совета ШШЦиСК, на научно-практической конференции молодых ученах "Основные проблемы научного обеспечения развития цветоводства, садоводства и субтропического растениеводства в условиях рыночной экономики" (Сочи, 1996),

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.Получена приоритетная справка JS 96II637I/I3 от 08.08.96 на изобретение "Способ получения полноценных растений и микролуковиц из изолированных зародышей тюльпанов".

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и рекомендаций, списка литературы. Текст диссертации изложен на 139 листах машинописного текста, со' держит 25 таблиц, 16 рисунков. Список используемой литературы включает 232 наименования, в том числе 83 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОЛУ' ИССЛЕДОВАНИЙ

Основная экспериментальная работа проводилась в биотехнологической лаборатории отдела селекции Всероссийского научно-исследовательского института цветоводства и субтропических культур (г.Сочи) в течение 1993-1996 гг на селекционном материале, полученном к.с.-х.н. В.С.Мохно. Выращивание исходных родительских форм тюльпанов и гибридизация проводились в полевых условиях открытого грунта опытно-производственного хозяйства "Хостинское".

В качестве исходного материала использовали зародыши тюльпанов от II комбинаций скрещивания, в том числе 5 отдаленных и раз-ногеномных, с участием 12 сортов зарубежной селекции, принадлежащих, согласно международной классификации 1987 г. к 5 классам, и двух сеянцев селекции ВНИИЦиСК из класса Т. Ьм/wa nhio-aa и его гибриды. Всего за период исследований в культуру ткани было введено 870 зародышей.

Основным методом исследований являлся метод культуры зародышей ин витро (А.И. Здруйковская-Рихтер, 1974; В.А. Высоцкий,

Г.А.Плотникова, 1988).

В процессе выполнения работы придерживались принципов соблюдения асептики, принятых в лаборатории культуры тканей и органов (Р.Г.Бутенко, 1964). Фазы развития зародышей определяли путем промеров с помощью стереоскопического микроскопа МНЗ-Ю по методике Поддубной-Арнольди (1952) в пылезащитной камере с ламинарным потоком воздуха.

В экспериментах использовали минеральные основы питательных сред Мурасиге и Скуга, Мурасиге и Скуга улучшенной А.Е.Рыбажо (1608845), Уайта, Ван-Гофа, дополненные сахарозой в количестве 20-60 г/л, агаром 5,5 г/л, тиамином, пирвдоксином, никотиновой кислотой от 0,1-1,0 мг/л, аскорбиновой кислотой 0,5-1,0 мг/л.

Для развития зародышей и регенерации побегов использовали регуляторы роста из группы цитокининов - б-бензидааминопурин (6-БАП), ауксинов -нафтилунрусную кислоту (НУК), }, -индолил-уксусную кислоту (ИУК)-индолшшасляную кислоту (ИМК).

Культивирование зародышей проводили в фитостатном. помешеяии нри температуре 23-1^С, освешенности 3 тысячи люкс, 16-часовом • фотопериоде. Повторность опытов - 10-30 эксплантов в зависимости ■ от типа опыта.

Для формирования микролукавиц в культуре ткани из питательной среды полностью исключались цитокивины, аукаины НУК и ИУК заменялись на ИЖ с одновременным изменением температурного и светового режимов в течение 12 недель.

Основываясь на биологии развития растений тюльпанов, разработка технологии культивирования изолированных зародышей в условиях ия витро была разбита на 4 этапа.

1 этап. Введение в культуру ин вятро, получение проростков.

2 этапЛолученда регенерирующих побегов и дополнительных пророст- ■ ков.

3 этап. Получение бульбообразуюпщх побегов. '

4 этап. Получение микролуковиц.

В ходе проведения экспериментов учитывались : эффективность стерилизации, фазы развития зародышей к моменту изоляции, их способность к формированию гибридных растений, физические условия культивирования для обеспечения оптимального выхода полноценных растений. Полученные результаты обрабатывали методом дисперсионного анализа по Н.А.Плохинскому (1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. ПОЛУЧЕНИЕ СТЕРЛЛШОЙ КУЛЬТУРЫ/ . Большое значение на данном этапе имеет отработка приемов стерилизации растительного материалами которого зависит инфици-рованность эксплаятов, их состояние и степень развития. Для подбора вешаств, обеспечивающих высокую степень стерильности были использованы растворы дегмина и хлорамина "Б" в концентрациях 0,1 и 0,2 % при экспозициях 15, 20 минут в различных сочетаниях. Стерилизация растительных объектов 0¡2 % раствором дегмина 20 минут или ОД % раствором хлорамина "Б" 15 минут дала лучшие результаты. Дегмин 0,2 % концентрации обеспечивал получение наибольшего процента чистых культур и их последующее хорошее развитие, в то время как 0,1 % его концентрация при этой же экспозиции не давала такого эффекта. Хлорамин "Б" оказался более жест- ' ким стерилизующим агентом и вызывал некроз тканей до 28,9 %, что снижало выход нормально развитых культур. Поэтому при использовании его для стерилизации оптимальной оказалась 0,1 % концентрация при экспозиции 15 минут (табл.1).

Таблица I

Результаты отработки режимов стерилизации изолированных зародышей тюльпанов для введения в культуру ткани

Стерилизующее¡Концент-вешество !рация,% ■! Экспо зи-!ция,мин. ¡Число кон¡Число не-!таминир,%¡крезов,% •¡Развитие ¡эксплантов

Дегмин ОД 15 8,6 5,6 нет

Дегмин ОД 20 . 0 И,4 хор.

Дегмин 0,2 15 39,1 II,4 • удовл.

Дегмин 0,2 20 2,9 8,6 хор.

Хлорамин од 15 2,9 0 . хор.

Хлорамин од 20 0 5,7 хор.

Хлорамин 0,2 15 2,9 8,6 слаб.

Хлорамин ; 0,2 20 0 28,8 слаб.

2. ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ЗАРОДОЕЙ НА НАЧАЛЬНОМ ЭТАПЕ

КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Получение полноценных растений из изолированных зародышей на искусственной питательной среде зависит от многих факторов, в том числе от фаза их развития в момент изоляции и исходных родительских форм.

В создании современных сортов тюльпанов, привлеченных нами в селекционный процесс, принимали участие виды, для которых характерно замедленное развитие и дифференциация зародыша. 3 связи с этим попытки извлечь их, начиная с 12 по 32 день после опыления, не дали положительных результатов. Ни в одной из исследуемых комбинаций (Анна Клайр х Эрмитая, Айдаакс х Анна Клайр, Торонто х Флайр) в эти сроки зародыши не просматривались. Лишь в комбинации Эприкот Бьюти х Яоганн Гутенберг на 49 день были обнаружены единичные зародыши в глобулярной фазе развития размером до I мм. Однако вычленение их из семяпочек было затруднено.

В этой же комбинации даже на 56 день после опыления наблюдалась глобулярная фаза развития зародыша, что подтверждает факт принадлежности тюльпанов к группе с замедленной дифференцировкой зародыша в эмбриогенезе. Оптимальным сроком изоляции зародышей для комбинаций Торонто х Мадам Лефебер, Эприкот Еьюти х Жаклин, Торонто х 1489 оказался 53-56 день, когда у основной их мэосы преобладала торпедовидная фа за;,развития и размер достигал 1,5 -3 мм. Процент приживаемости в этих случаях колебался от 48,7 до 90,3 (табл.2). При этом отмечено, что в отдельных комбинациях

Таблица 2

Влияние степени дифференциации зародышей тюльпанов' на развитие ин витро у разных генотипов

Комбинация окрашивания

.'Размер ¡Прижил.¡Размер¡Зародыши, !зароды-¡зародыш!заро- ¡образо-!ша при \% !дыш. ¡вавшие !введе- ! ¡через ¡микроду-.¡.дм^.ш!_1.5 мэяу&аау^.

М I4

Торрнто х Мадам Лефебер до I 85,7 10-30 9,5

Эприкот Бьюти х Еаклин до I 55,S 12-25 5,6

Эприкот Бьюти х ЙогашГутенберг до I 50,0 12-65 25,0

Крисмэс Ыарвел х 1489 до I 14,3 8-18 3,6

Торонто х 'Ладам Лефебер 1,5-3 90,3 10-45 16,1

Торонто х 1489 1,5-3 48,7 10-40 15,4

Эприкот Бьюти х Лаклин 1,5-3 66,7 17-50 39,9

зародыши одного возраста находились в разных фазах развития. Так, в комбинации Торонто х Мадам Лефебер число зародышей в глобулярной фазе составило 38,1 %, а в фазе ранней торледы - 61,9 %, з комбинации Эприкот Еьюти х Жаклин соответственно 31,5 $ и 68,4 %, что свидетельствует о гетерозиготности в потомстве.

- 9 -

Приживаемость зародышей,.находящихся в момент введения ин витро з глобулярной фазе развития, оказалась ниге, чей у более развитых размером 1,5-3 мм. Однако от некоторых из них удалось получить регенеранты до 30 мм, которые в дальнейшем сформировали микролуковицы, хотя процент их был цебольшой-5,6 и 9,5. В комбинациях, где в качестве материнских форм использовались Торонто и Эприкот Бьюги, приживаемость зародышей достигала 55,6-85,6 %, увеличение размеров шло значительно медленнее, чем у развитых зародышей. В то же время в разногеномной комбинации Эприкот Быоти х ЙогаЩГутенберг, несмотря на слабое развитие зародышей в момент введения в культуру, их рост я дальнейшее формирование луковиц было значительно вга-шча, 25,0 %.

Исследование развития зародышей тюльпанов показала, что независимо от генотипа их рост в тканях материнского растения идет очень медленно. Кроме того, в отдаленных и разногеномных комбинациях скрешивания, когда формирование семян завершено, встречаются зародыши как в глобулярной, так и в торпедовидной фазе развития. Вследствие этого извлечение зародышей из семяпочек а выращивание их в контролируемых условиях затруднено. Хотя при более тщательном подборе питательных сред и условий культивирования возможно получение от них полноценных растений. 3. Влияние минерального состава питательных сред на

развитие зародышей ин витро.

Результаты изучения влияния минерального состава питательных сред на начальном этапе развития зародышей в контролируемых условиях в комбинациях Арабик Мистерия х • Куин оф Шеба и Торонто х Флайр показали, что их приживаемость и развитие были лучше на среде Ван-Гофа половинной и полной. Наблюдалось значительное растяжение тканей в вертикальном направлении, количество

- 10 -

эксплантоз с дифференцированной тканью достигало 77,8 % в комбинации Арабик Мистерия х Куин оф Шеба и 80,0 % в комбинации Торонто х Флайр (табл.3).

Таблица 3

Влияние мгнерального состава различных питательных сред на развитие зародышей тюльпанов

Использованные среды

¡Арабик Мистерия х

¡Шд.^..1Да'?д........

¡прики-!зародыши образо !лось ¡вавшие пророст-

!заро- )м, 1 -

!дышей,!с йорф.[с дифф.

.„',......1 МЫ.

Торонто х Флайр

прижи!зародыши образо-лось ¡вавшие Проростки, заро-! %

дыше^!с морф.!с дифф.

. Л.....!.гшама..!жайьк,..

Мурасиге полн. 80,0 80,0 20,0 66,7 75,0 25,0

- Скуга (квнтр.)

полов. 86,7 83,3 16,7 73,3 66,7 33,3

Уайта полн. 66,7 66,7 33,3 53,3 66,7 33,3

полов. 53,3 50,0 0 40,0 100,0 0

Ван-Гофа полн. 100,0 22,2 77,8 86,7 20,0 80,0

полов. 93,3 43,8 57,1 80,0 33,3 66,7

Это способствовало активизации прямого органогенеза в течение 2-3 недель по сравнению со средой Мурасиге и Скуга, где он наступал на 1-2 недели позне. В то же время более длительное культивирование зародышей на среде Ван-Гофа (более грех недель), как й на среде Мурасиге и Скуга, приводило к разрастанию каллус-ной ткани, препятствовало пролиферации побегов. При вырашивания зародышей на питательной среде Мурасиге и Скуга, улучшенной А.Е. Рыбалко $1608845)) число эксплантов без каллусной ткани составило 86,7 %, что значительно превысило этот показатель на питательных

средах Ван-Гофа - 66,7 и Мурасиге и Скуга - 26,7 %. На основании полученных данных все последующие эксперименты по определению оптимальных факторов культивирования зародышей проводились аа питательной среде Мурасиге и Скуга улучшенной Л.Е.Рыбалко (М-СР).

Второй этап культивирования зародышей заключался в получении регенерирующих побегов и дополнительных проростков. Для этого минеральная основа питательной среды М-СР обогащалась регуляторами роста из группы цитокининов (кинетян и 6-ЕАП). Введение в питательную среду 6-ЕАП и кинетина в концентрациях 2,0« 3,0 мг/л оказалось оптимальным для развития побегов и получения наибольшего количества пролифелвруюяшх эксплантов. При этом содержание в среде 6-БАП в концентрации 2,0 и 3,0 мг/л обеспечивало наибольшее число образовашихся побегов - 86,7ц 93,3 %, пролифелируюших эксплантов - 92,3^92,9 %, что превосходило эти показатели на питательной среде с кинетином. Дальнейшее увеличение концентрации 6-ЕАП до 4,0 мг/л не дало существенного изменения в развитии зародышей.

Для стимуляции органогенеза в питательную среду вводили кроме цитокининов (6-ЕАП), ауксины (НУК). Присутствие в среде 6-ЕАП в концентрации 3,0 мг/л в сочетании с НУК ОД, 0,15, 0,2 мг/л присело к закладке и прорастанию дополнительных почек, что обеспечивало образование конгломератов побегов, достигавших 118,2-123,1 % от числа развившихся растений (табл.4). На питательной среде, обогащенной 6-БАП - 3,0 мг/л и НТК - 0,15 мг/л(получено наибольшее число полноценных растений-92,9 % я дополнительных проростков-123Д

Углеводы являются источником энергии для поддержания процессов жизнедеятельности, а также регуляторами осмотического давления среды. В.-качестве источника углеводов использовалась

Таблица 4'

Влияние совместного действия ауксинов и цитокининов на ■ развитие регенерантов из изолированных зародышей (Айсберг х- св.опыление, среда М-СР)

Концентрация регуляторов ! Партчедо пегеддрвдтрв, %_

роста, мг/л ! Всего !_и з я и х

! ! полноценных! дополнител."

1 Астений Гцобегов

Контроль (без регуляторов роста) 10.0 61,5 0

б-ЕАП-2,0 + НУК-ОД 2X1,1 75,0 111,1

б-БАП-2,0 + НУК-0Д5 220,0 76,9 120,0

б-ЕАП-2,0 + НУК-0,2 209,1 78,6 109,1

б-ЕАП-3,0 + НУК-ОД 218,2 91,6 118,2

б-ЕАП-3,0 + НУК-0Д5 223,1 92,9 123,1

6-БАП-З.О + НУК-0,2 220,0 83,3 120,0

сахароза в различных концентрациях. Отмечено, что при увеличении содержания сахарозы .в питательной среде от 2,0 до 6,0 % одновременно увеличивается выход полноценных растений. При этом наблюдалась взаимосвязь между концентрацией сахарозы, температурой и продолжительностью ее воздействия. Так, выраиуавание регенерантов из изолированных зародышей в комбинации Айсберг х св.опыление на питательной среде с 0,5 мг/л ИЖ и высоким содержанием сахарозы 4,0 и 6,0 % при пониженной температуре 4 - 1°С в течение 8-12 недель в темноте способствовало формированию булъбообразуюрх побегов. Наибольший их процент получен на среде с ($% сахарозой пра режиме : температура 4 ± 1°С, без освещения 12 недель.

4. ОПТИМИЗАЦИЯ ШЗИЧЫЖИХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ дая ПОЛУЧЕНИЯ ШКРОЛШВИЦ ИН ВИТРО.

В процессе выращивания зародышей на искусственной питательной среде с целью получения микролуковиц ин витро, изучалось влияние различных физических параметров на их развитие (температура, световой режим, продолжительность воздействия).

Наблюдения, проведенные за состоянием регенерантов после прохождения холодной обработки, при световом режиме 16/8 и температурах 17 - Л и 23 £ 1°С показали, что процесс формирования микролуковиц был растянут по времени. Так, в комбинации Айсберг х св.опыление культивирование зародышей после 8-недельного охлаждения (температура 4 - 1^3, темнота) при световом режиме 16/8 и температурах 17 * Л и 23 - Л вызывало формирование основного количества микролуковиц в течение 3-4 недель соответственно 25,9% 43,4 % (табл.5), а в комбинации Арабик Мистерия х Куин оф Шеба

Таблмца 5

Влияние физических факторов на формирование микролуковиц ин витро в различных комбинациях скрещивания

Температура¡Световой ¡Продолж. 0 ¡режим ¡культиви-( С) ! свет/тема¡рования,

¡час.

X

г

!недель г

т

-г

Зародыши образовавшие микроом

ДУШИ!. „ ,и ,_____

комбинация Айс-.'комбинация Ара-бергх х св.опыле!бик Мистерия х М? ........... КИЧ .РФАбд_

X

после 8-недельного охлаждения, при температуре 4 - 1°С,в темноте 17 ± Г- 16/8 3-4 25,9 19,3

17 ± I .. 16/8 10-12 35,6 32,4

23 - I ' 16/8 . 3-4 43,4 29,1

23 ± I 16/8 Ю-12 58,2 54,1

_I . ?_2_й_5

после 10-12-неделыюго охлаждения,при температуре 4 £ 1°С,в темноте

17 ± I ; 16/8 3-4 49,1 35,6

17 ± I"■ 16/8 10-12 69,1 65,4

23 ± I '" 16/8 3-4 77,3 64,9

23 - I ' 16/8 10-12 97,3 92,1

после 16- -недельного охлаждения,при температуре 4 ± 1°С,в темноте

17 ± I- 16/8 3-4 45,7 34,2

17 ± I 16/8 10-12 68,9 62,9

23 2: I 16/8 3-4 70,9 63,5

23 ± I 16/8 10-12 92,5 89,4

19,3 %, 32,4 %. Нахождение регенерантов при температуре 4 £ 1°С в темноте в течение 10-12 недель и посдедушее их культивирование на свету 16/8 в течение 3-4 недель при температуре 17 - 1°С и 23 ^ также вызывало формирование основного количества микролуковиц, но их число было значительно выше. В комбинации Айсберг х св.опшшнне при температуре 17 - 1°С оно-составило 49,1$, в комбинации Арабик {¿истерия х Куин оф Шеба - 35,6 %. Начало образования микролуковцц характеризовалось уменьшенном числа реге-нерируирх побегов за счет их увяданья и нарастанием размеров и количества бульбообразуюших побегов на 10 день культивирования при температуре 23 ~ 1°С. При'температуре 17 - 1°С этот процесс наступал на 12-15 день.

Оптимизация физических условий культивирования для обеспечения максимального получения полноценных растений из изолированных зародышей показала, что 10-12-недельное содержание регенерантов при температуре 4 - является оптимальным для последуюшего

формирования микролуковиц.

Выравнивание регенерантов в течение 10-12 недель при низкой температуре и последующий тепловой режим 23 - Л в течение 1012 недель вызывало формирование микролуковиц у 92,1-97,2 % зародышей, при этом основное их количество 74,9-77,3 % образовалось в.первые 3-4 недели.

Содержание регенерантов обеих комбинаций при температуре 4 - 1°С в течение 16 недель не способствовало увеличению числа зародышей, образовавших .ТЩодкдадЩ ;как при 3-4-недельном последующем тепловом режиме, так и при IO-12-недельном культивировании.

Таким образом, нами установлено, что изолированные зародыши тюльпанов могут формировать гибридные растения а микролуковицы ин витро. Отмечено влияние генотипов на этот процесс, а также условий культивирования, которые должны включать основные этапы:

- получение проростков при температуре 23 - 1°С, 16-часовом фотоперлоде, в течение 2-3 недель ;

- получение регенерирующих побегов и дополнительных проростков размером не менее 30 мм при температуре 23 - Л, 16-часовом фотопериоде в течение 12-20 недель ;

- получение булъбообразувших побегов при температуре 4 - Л в течение 10-12 недель ;

- формирование микролуковвд ин витро при температуре

23 - 1°С, 16-чассшом фотопериоде до 10-12 недель в зависимости от генотипа (рис.1).

5. УСЛОВИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРОЛУКСШЦ В ОТКШТОМ ГРУНТЕ.

В результате проведенных экспериментов из изолированных зародышей было вырашено ин витро 1,4 тыс.микролукавиц тюльпанов, диаметр которых колебался от 3 до 20 мм, масса от 27,5 до 4600 шг.

<7 Р

<3)

а

А

СП

9

о

стерилизация исходного матер.

вычленение зородыша

рост побегов, размножение, при £ / V."_

<ротоп^риое.У /<$•

гемо5орлг

лерез&д в ерунтоАую культуру

ь

предпосадочная "одеатавю лерево-б условии

¡ПГ/ГО Й

пкмнота

6сО

Формирование мифалуяовац

тЬ

<рс?то лериоЗ

милралилъяии

ЛукоВиг^ы 7 года аыращивомия

рис. 3.3.7. Технологическая схема выращивания растений тюльпанов из культуры изолированных зародышей

- IQ -

5.1. Условия хранения до посадки.

В связи с отсутствием опыта по вкрашиванюо микролуковиц тюлышнсш из изолированных зародышей в условиях открытого грунта, был проведен подбор режимов их подготовки к переходу ин внес.-

Полученные результаты показали, что хранение луковиц в течение шести недель в комнатных условиях оказалось менее благоприятным для их дальнейшего развития в открытом грунте, всхожесть составила 36,4 % у луковиц размером менее 5 мм и 50,0 % - размером 5-10 мм.

Сокращение продолжительности хранения мвкролуковиц в комнатных условиях до четырех недель и последующая их холодная обработками температура 4 - I°G дали наилучшие результаты, увеличив процент всхожести до 75,0-85,7. При этом у луковиц до посадки отмечено образование корневых бугорков, в отдельных случаях наблюдалось даже развитие мочковатой корневой системы и проростков.

Перенос же луковиц из фитостагного помещения, с температурой 23 - 1°С в холодный режим хранения при температуре 4 -на шесть недель вызывал снижение всхожести до 52,4-66,7 % в зависимости от размера луковиц.

5.2. Перенос растений в нестерильные условия.

Выраиршание микролуковиц в открытом грунте проводилось в

пластмассовых язрках, заполненных предварительно пропаренной почвосмесью. Испытывали влияние субстратов торфа, песка и перлита в различных сочетаниях на всхожесть растений, выраженных ин вятро. Лучшие результаты получены на субстрате торф + пасок в объемном соотношении 3:1, Всхожесть составила 72,9 % против 64,4 % на субстрате торф + перлит 3:1 у луковиц весом 300-500 мг и 13,5-21,4 у луковиц весом менее 300 мг. В последующем в нестерильные условия переносили не отдельные лукавицы, а гнезда.

Зго позволило в делом повысить процент всхожести до 56,7-66,2, хотя средний вес лукавиц до посадки в некоторых гнездах составлял 59,1-62,5 мг.

Таким образом, использование различных приемов при переносе растений в открытый грунт (предпосадочная подготовка макролуковиц, увеличение веса посадочных образцов за счет сохранения гнезд) может повысить выход полноценных растений, сократить потери гибридного материала.

6* ^АШЯЯ ДИАГНОСТИКА' ДЕРСПЖТ1ВНЫХ ГИБРИДОВ

В настоящее время в открытом грунте продолжают развитие 735 гибридов, вырашенных из. изолированных зародышей.

На имеющемся материале начато изучение ранней' диагностики перспективных гибридов тюльпанов. С этой целью, наблюдалось их развитие как на ранних этапах в культуре ин витро, так и процессе выращивания в открытом грунте.

Сравнительный анализ развития растении и образования луковиц тюльпанов разных комбинаций скрещивания в полевых и лабораторных условиях показал, что в условиях ин витро число регенеран-тов, дополнительных побегов и выход луковичек значительно превосходят эти же показатели в полевых условиях. Количество дополнительных побегов ин витро колебалось от 124 до 189 % (табл.6). Причем от одного зародыша в отдельных комбинациях образовалось более чем 30 микролуковиц, что является важным показателем при отборе перспективных форм на раннем этапе селекционного процесса. По данным исследований В.С.Мохно (1972-1990 гг.), в условиях ин вивр;..двухлетние сеянцы развивают по одновд- побегу и выживаемость их колеблется в пределах 2-60 % от числа посеянных семян* Выход луковиц и их вес через 1,5 года после введения зародышей в отлътупу в комбинации Айсбеиг х св.опыление соответствовал

Таблица 6

Развитие растений я образование луковичек тюльпанов разных комбинаций скрещивания в полевых и лабораторных условиях

Условия выраШосеяно се- .'Проросло се'.Обра зова лось ¡Выход луко-! Вес луковичек, грамм пшваняя !мяа,изолиро-!мян,рвгеэе-!дополнительн. !вичек,$ от — „«нI .гаиши^пиа

__1ЗДН0 ваида«ИНТОВ. % ¡добего?. % , ¡ИСХОДИ, ¡максимальный! минимальный

¿Лав ли Серпрайз х Т.Кауфмана}* el. опыление

полевые ян витро .

полевые ин витро

полевые ин витро

полевые ин витро

полевые иш.аитро

200 300

200 101

200 148

200 78

100 23

25,7 0 1,9

78.0 124,3 142,3 Торонто х Флайр

51,6 0 17,4

89.4 138,8 129,7 Арабик Мистерия х Куин оф Шеба

80,3 О 18,3

96.1 133,8 142,2

Анна Клайр х Эрмитаж

49.0 0 12,7

91.5 189,4 206,4 Айджакс х Анна Клайр

24,5 О II.9

87.1 126,0 108,6

0,24 2,03

0,35 0,50

0,28 0,50

0,39 0,70

0,34 0,20

0.06 0,04

0,12 0,02

0,13 0,15

0,17 0.03

0,11 0,06

0

1

трехлетним луковицам тюльпанов, полученных из гибридных семян.

По результатам наблюдений за развитием сеянцев из изолированных зародышей тюльпанов видно, что период от посадки до прорастания луковиц у основной их массы в комбинации Арабик Мистерия х Куян оф Шеба в первый год выращивания в открытом грунте составил 24 дня, а продолжительность вегетации достигала 117 дней. Нарастание размеров листовой пластинки к концу вегетация у разных гибрв- . доз сильно варьировало и не коррелировало с исходным весом луковиц. Гибрид Д-1643-13 с весом луковицы 0,4 г имел листовую пластинку длиной 14,5 см и шириной 0,5 см, а гибрид Ц-1643-16 с весом луковицы 4,8 г развил лист длиной 12,0 см и шириной 2,0 см. При этом нарастание веса луковицы у гибрида Ц-1643-13 было в два с лишним раза больше, чем у гибрида Ц-1643-16 - 250,0 % против 120,8 %. Выделялись .гибриды Ц-1643-23/1 и Ц-1643-23/2, выраженные из одного зародыша. Для них характерно нарастание листовой пластинки до 10,0, 12,0 см в длину и 1,3 см в ширину. Прирост веса луковиц составил соответственно 200,0 и 114,8 %. Изученные гибриды характеризовались также хорошо развитой мочковатой корневой системой, достигавшей 2-2,5 см.

В то же время отмечены гибриды Ц-1643-26/1, Ц-1643-26/2, Ц-1643-26/3, также выращенные от одного зародыша, которые имели такие показатели нарастания вегетативной массы и веса лукавиц при выращивании в условиях открытого грунта, которые ставят под сомнение их перспективность.

Наблюдения за развитием 2-3-летних сеянцев, полученных из изолированных зародышей будут продолжены. На основании накопленных данных возможно определение коррелятивной связи изучаемых признаков с ценными свойствами будущих сортов. Это позволит вести отбор перспективных форм уже в первые годы роста гибридных сеянцев,что

значительно ускорит селекционный процесс, так как при использовании его традиционной схемы первичный отбор начинается на 8-10 год.

ВЫВОДЫ

1. В качестве стерилизующих вешеств при введении в культуру ткани изолированных зародышей тюльпанов лучшими являются 0,1 % раствор хлорамина "Б" при экспозиции 15 минут или 0,2 % дегмин при экспозиции 20 минут.

2. Установлено, что изоляцию зародышей от материнского растения возможно проводить не ранее чем на 53-56 день после опыления, что свяааво с замедленной. дифференциацией зародыша..

-3. Лучшую жизнеспособность проростков и увеличение процента их выхода в культуре ин витро обеспечивает использование зародышей размером 1,5-3 ш.

4. Оптимальной средой для введения зародышей в культуру ин витро установлена среда Ван-Гофа.

5. Для развития изолированных зародышей' тюльпанов на этапе получения регенерирующих побегов и дополнительных проростков наиболее эффективными регуляторами роста являются 6-бензилсаминопурян

в концентрации ^Омг/л в сочетании с 0,15 мг/л НУК.

6. На формирование бульбообразуюпшх побегав стимулируюшее действие оказывает двенадцатияедельное охлаждение дря температуре 4 - 1°С в сочетании с 6 ? содержанием сахарозы в питательной среде.

7. формирование микролуковиц ин витро происходит при культивировании зародышей в течение 10-12 недель при температуре 4 ± х°С и последующем тепловом режиме 23 £ в течение 10-12 недель,, при этом основное их количество образуется в первые 3-4 недели.

8. На продолжительность формирования микролуковиц тюльпанов

в культуре ткани оказывают влияние физические условия культивирования ( температура, освещенность, продолжительность их воздействия ) и генотип исходных родительских форм.

9. При переносе микролуковиц тюльпанов из изолированных зародышей в условия открытого грунта обязательно их предпосадочное хранение в течение 4-недель при температуре 23-25°С и 2-х недель при температуре 4 - 1°С.

10. Выявлено, что высокая всхожесть растений обеспечивается микролуковииами весом не менее 300-400 мг на субстрате торф + песок в объемном соотношении 3:1.

11. Выращивание зародышей тюльпанов через культуру ин вит-ро по сравнению с нолевыми условиями увеличивает число регенеран-тов в 2-3 раза, дает дополнительных побегов до 189,4 % и выход луковичек возрастает более чем в 100 раз в зависимости от генотипа.

12.Нз основании полученных результатов .разработана и рекомендована для практического применения технологическая схема выращивания растений тюльпанов из культуры изолированных зародышей.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДО ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

С целью создания новых селекционных форм, получения полноценных растений и микролуковиц из изолированных зародышей в культуре ин витро и ускорения селекционного процесса тюльпанов предлагается следующая последовательность операций.

1. Для освобождения от внешней инфекции и получения стерильной культуры коробочки перед вычлеаением из них зародышей следует промывать последовательно в проточной водопроводной воде в течение 1-1,5 часа, мыльном растворе 0,5 часа, крепком растворе пбрманга-ната калия 15-20 минут при периодическом встряхивании. После каждого из доследующих двух этапов - промывка в проточной водопроводной воде 10-15 минут. Подготовленные таким образом коробочки далее следует простерилизовать 0,2 $ дегмином. в течение 20 минут, затем в стерильных условиях провести 4-5-кратную промывку стерильней дистиллированной водой, после чего на 2-3 секунды погрузить в 96 % спирт л обжечь в пламени спиртовки.

2. Зародыши размером 1,5-3 мм изолируются от материнского растения и культивируются на искусственных питательных средах.

Состав рекомендуемых сред изложен в приложениях 1,2.

3. Куяьтивйрование изолированных зародышей в ин витро целесообразно проводить в 4 этапа :

1 этап - введение в культуру и получение проростков на питательной

среде Ван-Гофа, при т гз^С,освещение 16/8,в течение 2-3

доДсЛЬ•

2 этап - дорашявание проростков до размера не менее 30 мм и получе-

ние дополнительных при температуре 23 - 1Яз, 16-часовом фотопзриоде освещенности 3 тысячи люкс в течение 12-20 недель на модифицированной питательной среде Мураслге и Скуга дополненной ¡'бЗензалшицспуршш в концентрации 3,0 мг/л и альфанафтилуксусной кислотой в концентрации 0,15 мг/л.

3 этап - получение бульбообраэуютих побегов в темноте при темпера-

туре 4 - Л в течение 12 недель на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга обогащенной индолилшс-ляной кислотой (ИЖ) в концентрации 0,5 мг/л.

4 этап - получение микролуковиц..ин витро при температуре 23 - 1°С, 16-часовом фотопериоде, освещенности 3 тысячи люкс на модифицированной питательной среде гйурасиге и Скуга, дополненной ИМК в концентрации 0,5 иг/л. Хранение микролуковиц перед посадкой в условиях открытого грунта проводить в течение 4 недель при температуре 23-25°С и 2-х недель при температуре 4 - 1°С.

Высадку следует проводить в специальные ящики, применяемые для посева семян или выращивания рассада заполненные стерильным субстратом, состоящим из торфа и песка в объемном соотношении 3:1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУНШКОВАНШХ ПО ТМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Коломиец Т.М, Опыт использования культуры изолированных зародышей в селекции тюльпанов. // Известия ТСХА, М. 1997. в. I.

2. Коломиец Т.М. Метода биотехнологии в селекции тюльпанов // БД НШГЭИагропрома "Депонированные рукописи" № 249ВС96, 1997.

3. Коломиец Т.М. Использование методов биотехнологии в селекции тюльпанов. // Аграрная наука. М. 1997. в. I.

4. Коломиец Т.М. Мохне B.C. Способ получения полноценных растений

и ыикродуковиц тюльпанов из изолированных зародышей. // Приоритетная справка № 96II637I/I3 от 8.08.96. (В стадии рассмотрения).