Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационные особенности ДНК с разной нуклеотидной последовательностью

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Конформационные особенности ДНК с разной нуклеотидной последовательностью"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МАТЕМАТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.323

ЧУПРИНА ВАСИЛИЙ ПЕТРОВИЧ

КОНФОРМАЦИОННЫЕ ОСОБЕННОСТИ ДНК С РАЗНОЙ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ

03 00 02-БиофИзика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Пущино-1996

РГб од

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор физико-математических наук, профессор С.И.Аксенов , доктор физико-математических наук, профессор Ю.А. Лазарев доктор химических наук, профессор Г.Г. Маленков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Молекулярной Биологии им. Энгельгарда РАН

Защита состоится Ж " Шр^и] 1996 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 Московская обл., Пущино, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Теоретическиой и Экспериментальной Биофизики РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана сСаЛлЯу 1996 г

Ученый секретарь диссертационного совета, ч ^УмЫ^Ыъ*,/! . •*'' кандидат биологических наук /

П.А. Нелипович/

! /.

и

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы. "Зависят ли пространственная структура и конформационные параметры ДНК от нуклеотидной последовательности и, если зависят, то как?" - это фундаментальный вопрос, который интересует исследователей еще со времен открытия структуры Двойной Спирали ДНК Уотсоном и Криком в 1953 году. Ответ на этот вопрос является чрезвычайно важным, поскольку изменения в структуре ДНК в свою очередь могут участвовать в процессе биологического узнавания, то есть влиять на взаимодействия ДНК с белками и лигандами.

Детальное исследование пространственной структуры ДНК стало возможным только в последние 15 лет в значительной степени благодаря возможности синтезировать олигонуклеотиды с заданной последовательностью. Благодаря этому были закристаллизованы и методом рентгеноструктурного анализа расшифрованы пространственные структуры нескольких десятков двухцепочечных олигонукпеотидов. Успехи спекгросколии ЯМР высокого разрешения позволили определить трехмерную структуру ряда олигонукпеотидов в растворе. Важную роль в определении пространственной структуры играют расчетно-теоретические, методы молекулярной механики и молекулярной динамики. В настоящее время их использование стало составной частью методик построения молекулярных моделей по результатам данных, полученных с помощью методов ЯМР и рентгеноструктурного анализа.

Ко времени начала выполнения нашей работы в литературе накопилось много экспериментальных данных об особенностях свойств разных нуклеотидных последовательностей, не имевших объяснения в терминах тонкой структуры двойной спирали. Хотя факт зависимости ее конформации от последовательности был твердо установлен в рентгеноструктурных исследованиях волокон полинуклеотидов и кристаллов олигонуклеотидных дуплексов, остаются не ясными многие детали такой зависимости и возникает вопрос, не является ли эта

зависимость следствием межмолекулярных взаимодействий в кристаллах. Не были понятны причины аномальности свойств участков ДНК, содержащих только степы А-А, Т-Т и А-Т (но не Т-А). Вопрос о закономерностях и причинах возникновения изгибов двойной спирали широко обсуждался, но не был решен.

Хотя в центральной части дуплекса d(CGCGAATTCGCG) в кристалле Дикерсоном (Dlckerson et al., 1981) было обнаружено упорядоченное образование из молекул воды, названное "водным хребтом", роль этого хребта в стабилизации аномальной В-конформации и возможность его возникновения в растворах не была установлена. Методом ЯМР были исследованы несколько олигонуклеотидных дуплексов, но методика исследования зависимости конформации двойной • спирали от нуклеотидной последовательности не была отработана. Решению этих задач и посвящена диссертация.

2. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение методом ЯМР и расчетно-теоретическими методами пространственной структуры ДНК и ее зависимости от нуклеотидной последовательности. В ходе проведенной работы были решены следующие задачи:

1. Определение, методом молекулярной механики с использованием данных ЯМР, структуры (dA)n:(dT)„ фрагментов дуплексов в растворе и уточнение структуры poly(dA)-poly(dT) в волокнах.

2. Исследование, методами Монте-Карло и молекулярной динамики, зависимости структуры гидратной оболочки гликозидного желоба ДНК от нуклеотидной последовательности и конформации. Изучение роли водного хребта Дикерсона в образовании аномальной конформации участков ДНК, содержащих степы А-А, Т-Т и А-Т.

3. Построение модели изгибов оси спирали ДНК, содержащих А/Т-участки, и модели дуплекса d(GAATTTAAATTC)2 в растворе, объясняющей целый ряд экспериментальных данных.

4. Определение зависимости структурных параметров ДНК в растворе от последовательности.

3. Научная новизна работы.

Впервые, методом молекулярной механики с использованием данных ЯМР, определена пространственная структура (dA)n:(dT)„ -фрагментов дуплексов в растворе. Проанализированы различные факторы, которые могут определять структурные черты этих участков, и показано, что именно вода в гликозидном

2

желобе ДНК может играть существенную роль в формировании аномальной конформации с зауженным желобом.

Впервые, на основании расчетов, показана зависимость структуры гидратной оболочки гликозидного желоба от его ширины и нуклеотидной последовательности.

На основании построенной структуры (с1А)п:(сГГ)п -фрагментов предложена модель изгибов оси спирали ДНК, содержащей А/Т- участки. Эта модель позволила обьяснить и предсказать целый ряд экспериментальных результатов. Определенная методами ЯМР и молекулярной динамики структура с1(СААТТТААААТТС)2 в растворе находится в хорошем согласии с предложенной моделью изгибов.

Впервые разработан и применен оригинальный подход к извлечению информации о структуре двойной спирали ДНК в растворе из сравнения ЯМР-спектров различных олигонуклеотидов, который позволяет избежать проблем, возникающих в процессе восстановления трехмерной структуры нуклеиновых кислот по данным спектроскопии ЯМР. Благодаря этому подходу впервые удалось с полной определенностью установить сам факт наличия связи между нуклеотидной последовательностью и структурой ДНК в растворе. Впервые выявлены межпротонные расстояния, характеризующие зависимость конформации двойной спирали от нуклеотидной последовательности.

4. Практическая ценность. Исследования, проведенные в ходе работы над диссертацией, позволяют сформулировать новые теоретические представления о зависимости конформации двойной спирали ДНК от нуклеотидной последовательности и о проявлениях этой зависимости в экспериментальных данных. Выявленные в диссертации корреляции между нуклеотидной последовательностью и структурой ДНК в растворе могут быть использованы при построении моделей биологического функционирования ДНК.

Закономерности, связывающие изменения конформационных параметров с нуклеотидной последовательностью ДНК, могут использоваться для предсказания пространственной структуры ДНК с определенной последовательностью, а также структуры комплексов ДНК с лигандами.

5. Апробация работы^ Результаты работы докладывались на: -институтских семинарах и годовых конференциях НИВЦ АН СССР (ИМПБ

РАН);

-Симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и в клетке", Пущино 1985;

-Международном симпозиуме по физико-химии ДНК и молекулярным механизмам функционирования генома, Тбилиси 1987;

-Международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот, Брно, Чехословакия 1988;

-Международном симпозиуме по изгибам ДНК, Кембридж, Великобритания 1988;

-Седьмом Международном совещании по биомолекулярной стереодинамике, Олбани, США, 1989;

-Гордоновской конференции по нуклеиновым кислотам, Ньюпорт, США 1990;

-Восьмом Международном совещании по биомолекулярной стереодинамике, Олбани, США, 1991;

-Советско-Германском симпозиуме "Белково-нуклеиновые взаимодействия: структурные и фармакологические аспекты", Ленинград, 1991;"

6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 статей в ведущих международных журналах.

Диссертация состоит из трех глав и изложена в форме научного доклада.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. СТРУКТУРА ФРАГМЕНТОВ ДВОЙНОЙ СПИРАЛИ ДНК, СОСТОЯЩИХ ИЗ ПАР А:Т БЕЗ СТЕПА Т-А. РОЛЬ ВОДНОГО ХРЕБТА, ОБРАЗУЮЩЕГОСЯ В ГЛИКОЗИДНОМ ЖЕЛОБЕ, В ВОЗНИКНОВЕНИИ КОНФОРМАЦИОННОЙ АНОМАЛИИ.

1.1. Структура d(A)n с)(Т)п-участков ДНК и полинуклеотида poly(dA) poly(dT) по результатам расчетов с использованием данных ЯМР в растворе.

На основании проведенного теоретического конформационного анализа с использованием данных ЯМР (Behling and Kearns, 1986) нам впервые удалось построить непротиворечивую модель структуры полинуклеотида poly(dA)poly(dT) в растворе. Обнаружено, что экспериментальным данным удовлетворяет целое семейство низкоэнергетических структур, отличающихся от классической В-формы Арнотта и названное В'-формой. Для полученных структур характерен зауженный гликозидный желоб (расстояние между ближайшими атомами фосфора комплементарных цепей около 9-9,5А), тогда как в классической B-форме Арнотта желоб довольно широкий (12 А). В соответствии с экспериментальными данными (Rhodes and Klug, 1981; Рeck and Wang, 1981) при расчетах угол спирального вращения, т, был фиксирован и равен 36". Конформационные параметры полученных низкоэнергетических структур отличались в довольно больших пределах: найдены структуры с как большим пропеллером (- 20°) и малым наклоном пар оснований к оси спирали (-0°), так и наоборот, с меньшим пропеллером (-10°), и существенным наклоном пар оснований (- -7° и более).

Позднее исследования, выполненные другими авторами ( Katahira et al., 1988, Nadeau and Crothers, 1989, Celda et al., 1989), подтвердили реалистичность наших структур.

(а)

(б)

Рис. 1. (а) Стереоизображение найденной низкоэнергетической конформации полинукпеотида ро1у(с1А) ро1у(с1Т), (наклон пар -7°, пропеллер 12°).; (б) стереоизображение классической В-формы Арнотта. Видна разница в ширине гликозидного желоба.

1.2. Моделирование гидратации гликозидного желоба ДНК. Зависимость структуры гидратной оболочки от ширины желоба и последовательности.

Проведенные нами исследования по данному вопросу в значительной степени были стимулированы полученными Дикерсоном с соавторами (Корка, М.1.. е) а1., 1983) рентгеноструктурными данными, свидетельствующими о том, что молекулы воды образуют двуслойный водный хребет (рис. 2) в зауженном гликозидном желобе ААТТ-участка додекамера й(ССССААТТСССС). Важно подчеркнуть, что упомянутые исследователи определили только расположение кислородов молекул воды, при этом разрешение для данной структуры в кристалле было довольно низким, поэтому не ясна была структура водородных связей между атомами ДНК и молекулами воды.

Проведенные нами анализ экспериментальных данных и теоретические конформационные расчеты позволили сформулировать нам в 1985 году гипотезу о существовании подобного водного хребта в сахарном желобе на АЯ- участках и о его существенной активной роли в заужении этого желоба.

Рис. 2. Двухслойный водный хребет Дикерсона в центральной части ¿(СвССААТТСбСб) (Корка е1а1 , 1933)

Для того, чтобы подтвердить гипотезу о существовании водного хребта в растворе и определить сетку водородных связей, нами были проведено моделирование гидратной оболочки фрагментов ДНК. В процессе расчетов использовались фиксированные конформации - полученная нами структура полинуклеотида ро1у(с!А)-ро|у(с1Т) с зауженным желобом (В'-форма) и его же структура в классической В-форме Арнотта.

Для моделирования гидратной оболочки мы применяли метод Монте-Карло. В расчетах учитывалось 30 молекул воды на одну нуклеотидную пару. Для обеих информации средние энергии и среднее число водородных связей вода-вода и вода-ДНК были близки. Однако, гидратные оболочки получились совершенно разными. Так, гидратная оболочка гликозидного желоба ро1у(с1А)-ро1у(<Л") в полученной нами В'-форме похожа на водный хребет Дикерсона, обнаруженный им в центрапьной части додекамера с!(СОСССААТТСОСС). Подобный хребет не наблюдался для В-формы Арнотта, которая характеризуется более широким желобом.

Согласно нашим расчетам получилось, что первый слой водного хребта, к которому можно отнести все водные мостики между комплементарными цепями, состоящие из одной молекулы воды, образуется с довольно большой (большей 60%) вероятностью; при этом полная вероятность образования водородной связи молекулами воды с атомом N3 аденина равна 86% и с атомом 02 тимина - 74%. Молекулы воды, входящие в состав первого слоя, расположены таким образом, что образуются бифуркатные водородные связи: один и тот же атом водорода молекулы воды образует Н-связь с атомом 02 тимина (или атомом N3 аденина), и с атомом 04' дезоксирибозы следующего вдоль цепи нуклеотида. Схема таких связей приведена на рис. 3, а вероятности образования каждого типа водных мостиков - в Таблице 1. Другие типы водных мостиков в гликозидном желобе В'-формы практически не образуются.

Таблица 1. Вероятности образования водных мостиков, состоящих из одной молекулы воды, в гликозидном желобе В'- ДНК при 300 К.

атомы М3...02 Ю...04'(Т) М3...04'(Т) 04'(А)...04'(Т)

обозначения расстояния

3,37 А 5,3 А 5,12 А 5,82 А

вероятность 0,62 0,66 0,13 0,001

Вероятности образования мостиков ^(А)...Н-0-Н...04'(Т) и №3(А)...Н-0-Н. ...02(Т), близки. Поэтому, весьма вероятно, что молекула воды, связанная водородной связью с атомом N3 аденина, образует с помощью другого водорода связь одновременно с атомами и 02 тимина соседней пары и 04' следующего по цепи сахара (см. рисунок 3); подобное расположение воды соответствует энергетическому минимуму системы, состоящей из полинуклеотида ро1у(с!А) ро1у(с1Т) и 2-х молекул воды на нуклеотид (см. следующий параграф).

Второй слой водного хребта образуется в том случае, если имеются водные мостики, состоящие из 3-х молекул воды, между центрами N3 или 02 соседних пар, на которых образуются два соседних мостика первого слоя воды. Вероятность образования второго слоя водного хребта составляет около 20%.

Рис. 3 Схема водных мостиков первого слоя водного хребта в гликозидном желобе полинуклеотида ро1у(с1А) ро1у(с!Т) в В'-конформации.

Подобный хребет не образуется в В-форме, для которой характерен более широкий гликозидный желоб. Так, вероятность образования мостика между N3 аденина одной пары оснований и 02 тимина другой всего около 10%. В В-форме с большей вероятностью (около 20%) образуются мостики, состоящие из,одной молекулы воды, соединяющие атомы N3 (или 02) одного нуклеотида и 04' соседнего в той же цепи (рис. 4); подобные мостики наблюдались и в кристаллах олигонуклеотидных дуплексов.

Нами было проведено также моделирование методом Монте-Карло гидратных оболочек структур, построенных по результатам рентгеноструктурных исследований полинуклеотидов ро1у(с1А)-ро1у(сП"), ро1у(с!А)ро1у(с1и) и ро1у(с1А-с11)-ро1у(с1Т-с1С) в волокнах. Эти структуры также характеризуются зауженным гликозидным желобом. Результаты расчетов свидетельствуют об образовании водного хребта и в этих структурах.

Рис. 4. Схема образования водных мостиков, состоящих из одной молекулы воды, в гидратной оболочке полинуклеотида ро1у(с1А)ро|у(аТ) в В-форме. Указаны средние вероятности образования мостиков в процентах.

Рис. 5. Траектории кислородов воды первого гидратного слоя в гликозидном желобе дуплекса с1(ССААССТТСС), полученные в результате МД-моделирования (показаны только для тех молекул воды, которые удалены менее, чем на 3.2А, от гидрофильных атомов).

Другим методом изучения гидратации является молекулярно-динамическое моделирование (МД-моделирование). Этим методом мы исследовали гидратацию кристаллической структуры двухцепочечного декамера с1(ССААССТТ6С) (рис. 5). Моделирование показало, что наблюдается два основных типа гидратации гликозидного желоба, зависящих от ширины желоба.

В зауженной части гликозидного желоба (в средней части декамера, содержащей СО-степ, кратчайшее расстояние между атомами фосфора комплементарных цепей равняется 10,2А) наблюдается водный хребет, подобный обнаруженному Дикерсоном в средней части додекамера с!(СОСОААТТСОСО). Отметим, что в данном случае он наблюдается в области, содержащей пары в:С. Молекула воды, расположенная меиеду двумя центральными парами С'.в, в процессе МД-моделирования меняла положение и образовывала водородные связи с разными донорами и акцепторами Об и 016 (рис 5). В частности, образовывались водородные связи с атомом N3(016) (50%), атомом N3(06) (40%), и атомом N2(06) (40%). Наиболее вероятным из наблюдавшихся водных мостиков, был мостик, состоящий из одной молекулы воды, одновременно образовывавшей водородные связи с N3(016) и №Н2(06) (25%). Однако, данная молекула не образовывала водного мостика с атомами N3 обоих гуанинов 06 и 016 на протяжении всей молекулярно-динамической траектории. Картина будет выглядеть несколько иначе, если рассматривать образование водных мостиков при несколько иных критериях образования водородных связей. Так, при увеличении предельного расстояния для Н-связи между N и О воды до 3,5А, вероятность мостика между N3(016) и N2(06) увеличивается до 30%, образуются новые мостики, например 04'(в16)...№(в6) (20%). Мостик N3(06)...N3(016) при предельном расстоянии между N3 и О воды равным 3,2А не образуется, но вероятность образования данного мостика в при предельных расстояниях, равных 3,5А уже достигает 30%, а 3,8А - 90%. Эти данные свидетельствуют о том, что сетка водородных связей, предлагаемая на основании рентгеноструктурного анализа, не всегда реализуется, и простого критерия отбора водородных связей по расстояниям между акцепторами водородов не достаточно. Менее утопленные в гликозидном желобе молекулы воды, лежащие в плоскости пары оснований, которые в моделях водного хребта обычно считаются молекулами второго слоя, при наличии пар 0:С, как в данном декамере, могут на самом деле не только принадлежать второму слою, т.е. образовывать водородные связи с молекулами воды первого слоя, а образовывать Н-связи непосредственно с аминогруппой и,

значит, являться молекулами первого слоя. Причем, и в том и в другом случае расположение атомов кислородов этих молекул воды весьма похоже.

В расширенных же частях гликозидного желоба (который к концам декамера достигает ширины 12.6А), каждое основание гидратировано индивидуально, и молекулы воды, в основном, лежат в плоскости оснований. В области, где желоб имеет промежуточную ширину, предпочтительное расположение молекул воды смещено от плоскости основания в 3' - 5' направлении. С уменьшением ширины желоба примерно посередине между двумя парами оснований оказываются две молекулы воды. При дальнейшем заужении остается только одна молекула воды, и гидратная оболочка напоминает водный хребет, представленный на рис. 2.

Полученные результаты подтверждают предположение о том, что на

I

расположение кислородов молекул воды (только их и могут отождествить проведенные рентгеноструктурные исследования олигонуклеотидных дуплексов) в гликозидном желобе в основном влияет ширина этого желоба, а не нуклеотидная последовательность. Однако расположение атомов водородов и сетка водородных связей зависят также и от последовательности.

Интересно отметить, что средняя часть данного декамера характеризуется большим углом спирального вращения (> 40°), что характерно для С и О-форм в волокнах. Это наводит на мысль, что в волокнах водный хребет является характерной чертой не только В'-формы, но также С- и Р-форм. Действительно, анализ доступной поверхности со стороны гликозидного желоба ро!у(с1А-с1Т) •ро1у(с!А-сЛ") в О-форме показал, что в желоб стерически хорошо вписывается двуслойный водный хребет.

1.3. Водный хребет, как одна из наиболее вероятных причин аномальности структуры АЯ-участков.

Мы провели расчеты низкоэнергетических конформаций полинуклеотида ро1у(с!А)ро1у(<Я) и его комплекса с водным хребтом Дикерсона. При этом молекулы воды первого слоя изначально располагались так, чтобы они образовывали мостики между атомами 02 тимина и N3 аденина соседних пар, т.е. как при расчетах методом Монте-Карло (см. предыдущий параграф). Соответственно, каждая молекула второго слоя образовывала водный мостик и связывала кислороды двух соседних молекул воды первого слоя. На каждую пару комплементарных нулеотидов приходилось по две молекулы воды: по одной первого и второго слоев.

В Таблице 2 приведены информационные параметры некоторых низкоэнергетических структур, а в Таблице 3 - компоненты энергии взаимодействия ДНК с водным хребтом. Результаты расчетов свидетельствуют о том, что подобное расположение хребта энергетически выгодно, и такой водный хребет приводит к заужению сахарного желоба примерно до 9А и уменьшению расстояния МЗ(А)...02(Т) примерно до З.ЗА, а также к отрицательному наклону пар оснований и увеличению пропеллера, тогда как ДНК со случайной последовательностью имеет ширину желоба около 12А и расстояние МЗ(А)...02(Т) около 4А. Расширение желоба при наличии в нем хребта приводит к существенному ухудшению энергии взаимодействия дуплекса ро1у(с!А) ро1у(с1Т) с водным хребтом. Так, ухудшение этой энергии примерно на 3 ккал/моль на пару обусловлено двумя основными причинами. Первая - ухудшение взаимодействия молекул первого слоя с полинуклеотидом, а именно, с сахарами

Таблица 2. Конформационные параметры структур полинуклеотида ро|у(с)А) ро1у(с)Т) и его комплексов с водным хребтом.

1 2 3 4

V. 183 179 181 174

^ -101 -103 -105 -102

(X -69 -61 -65 -50

р 178 181 180 188

V 61 54 58 41

? 128 132 133 137

X -120 -118 -120 -112

р 141 146 145 149

о 1,1 1,0 1,0 «0,8

-0 1 -5,3 -6,0 -6

Т\Л/ 7,5 7,5 6,1 10

д,„02(Т) 3,7 3,3 3,4 3,32

1 10,8 9,4 9,5 9,23

а 3,23 3,23 3,34 3,23

1 36,0 36,0 36,0 36,0

е, а, р, у, 5 - торсионные углы сахаро-фосфатного остова, х - гликозидный угол. О -сдвиг центра пары по отношению к оси спирали, Т1_- наклон длинной оси пары оснований по отношению к оси спирали, Т\Л/ - пропеллер оснований в паре, I. - кратчайшее расстояние между атомами фосфоров противоположных цепей, с! - расстояние между парами оснований вдоль оси спирали, т - угол спирального вращения. Расстояния приведены в ангстремах, углы - в градусах.

1 - это низкоэнергетическая конформация полинуклеотида с фиксированными с!=3,23А и т =36°; 2 - низкоэнергетическая конформация комплекса полинуклеотида с водным хр&бтом и фиксированными 6=3,23А, т =36°; 3 - низкоэнергетическая конформация того же комплекса, оптимизированная по всем конформационным переменным, 4 - структура кальциевой соли полинуклеотида в волокнах ( Алексеев Д.Г. и др.., 1986)

Таблица 3. Некоторые компоненты энергии взаимодействия полинуклеотида ро1у(с1А)ро1у(сП") с водным хребтом.

Е1А Е1Т Е2А Е2Т

E2s Егь E3sp Езь E4d E7gp Ess Еэь Еэар Еэь Егзз Е34ь Eres Ейэь

-0,7 -0,2 -0,2 -3,5 -0,5 -0,2-2,0-0,3-0,1 -2,3 -1.3 -1.0 -1,6 -0,9

-5,1 -4,9 -2,3 -2,5

Расчеты проводились для гексамера : d(A)6d(T)6.

Е1А, Е1Т - энергии взаимодействия молекулы воды первого слоя с цепями, состоящими из аденинов и тиминов, соответственно; Е2А, Е2Т - энергии взаимодействия молекулы воды второго слоя с цепями, состоящими из аденинов и тиминов, соответственно; Ens - энергия взаимодействия N-oro сахара с молекулой воды первого слоя хребта; ENSp - энергия взаимодействия фрагмента сахаро-фосфатного остова, связанного с N-ым основанием, с молекулой воды первого слоя; ENb - энергия взаимодействия N-oro основания с молекулой воды первого слоя; E23s и E78S - энергии взаимодействия молекулы воды второго слоя с фрагментом сахаро-фосфатного остова 2-го нукпеотида и остатком сахара 3-го нуклеотида (Е2зэ ) и с фрагментом сахаро-фосфатного остова 7-го нукпеотида и остатком сахара 8-го нуклеотида (E78s ); Е34ь и Еда., - энергии взаимодействия молекулы воды второго слоя с 3-м, 4-м и 8-м, 9-м нуклеотидами, соответственно. В нижней строке приведены суммы компонент энергии 3-ей строки.

противоположных цепей, причем, в основном, это относится к энергии взаимодействия кислородов ОТ Сахаров 2-го, 8-го нукпеотидов с молекулами воды первого слоя (молекулы воды первого слоя изображены на рисунке 6 (б)).

Рис. 6. Стереоизображения низкоэнергетических конформаций (а) полинуклеотида ро!у(£1А)ро1у(с1Т); (б) - комплекса полинуклеотида с молекулами водного хребта, (структура 3 в Таблице 2). Суммарный заряд на фосфатной группе предполагался равным -0,6.

В энергетически оптимальной конформации комплекса (рис.66) расстояния методу 01' (А2), 01'(Т8) и водородами молекулы воды первого слоя, соответственно, равны 2,0А и 3,0А, что свидетельствует о возникновении стабилизирующих комплекс электростатических взаимодействий и водородных связей. Заметим, что само по себе образование водородных связей между водородами молекулы воды первого слоя и атомами 02(Т) и МЗ(А) не приводит к заужению гликозидного желоба и формированию аномальной структуры. Действительно, при расширении желоба эти водородные связи сохраняются, и энергия взаимодействия молекулы воды первого слоя с соответствующими тимином и аденином не ухудшается. В структуре с расширенным желобом (до ~12А ) , расстояние 02(Т)...ЫЗ(А) составляет около 4А, тогда как в структуре с зауженным желобом ~ З.ЗА.

Другая причина ухудшения энергии взаимодействия связаны с изменением энергии Ван-дер-Ваа'льсового взаимодействия молекул воды второго слоя (на рис.66 молекулы второго слоя выделены жирным) с участками сахаро-фосфатного остова нуклеотидов 2, 3, 7 и 8. Как видно из рисунка 66, молекула воды второго слоя в структуре с зауженным желобом образует многочисленные Ван-дер-Ваальсовские контакты с остовами 2, 3, 7 и 8 нуклеотидов, образующих стенки сахарного желоба, и молекула воды оказывается с обеих сторон зажата сахаро-фосфатным остовом. Расширение желоба приводит к потере этих контактов. Таким образом, улучшение энергии взаимодействия водного хребта с сахаро-фосфатным остовом ро1у(с1А)ро1у(с1Т) приводит к формированию аномальной структуры с зауженным желобом, напоминающей структуру средней части кристаллического додекамера сКССССААТТССССЬ , для которого подобный водный хребет и был впервые обнаружен.

Кроме того, расчеты показали, что наличие водного хребта приводит к дополнительному закручиванию дуплекса ро1у(с!А) ро1у(с1Т). Так, угол спирального вращения при расчетах полинукпеотида без хребта равен -33° (заряды на фосфатах равны -0,6). При наличии же хребта угол спирального вращения увеличивается до 36°, что находится в соответствии с экспериментальными данными.

Теоретические оценки показывают, что заузить гликозидный желоб легче всего (требуется меньше энергии) на участках, не содержащих пар в:С и ТА-степов, т.е. имеющих последовательности следующих типов: АА...А, ТТ...Т и А...АТ...Т. Мы называем их АЯ-участками. Можно предположить, что водный

хребет способствует заужению гликозидного желоба только на этих участках, а на других, как следует из наших расчетов, энергетически это не выгодно. Кроме того, при наличии пары й:С водороды молекул воды первого слоя хребта не могут образовывать Н-связи одновременно с обеими цепями и тем самым заужать желоб.

Наша гипотеза об аномальной структуре полинуклеотида ро1у(с)А) ро1у(с1Т) позволяет объяснить целый ряд экспериментальных данных для растворов:

1. Только АЛГ-последовательности имеют в растворе угол спирального вращения, равный 36°, тогда как для других последовательностей эта величина меньше и находится в пределах 33,5°-34,5°.

2. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что вероятность расщепления ДНК ДНК-азой I и ОН-радикалом определяется последовательностью нукпеотидов. Так, на А/Т- последовательностях, вероятность расщепления существенно меньше, чем на других последовательностях, что хорошо коррелирует с шириной сахарного желоба. Более того, только для АЯ-участков характерно, что при нагревании вероятность расщепления сильно увеличивается. Этот факт легко объясняется наличием водного хребта, который при нагревании разрушается и, следовательно, не стабилизирует более зауженный желоб. Желоб расширяется, и спираль на А/Т-участке раскручивается.

3. Как свидетельствуют данные экспериментов по расщеплению ДНК ДНК-азой-1, а также эксперименты по определению угла спирального вращения в суперспирализованных кольцевых ДНК, для образования аномальной структуры длина АЯ-участка должна быть не менее 4-х пар оснований. Это - минимальная величина фрагмента как для формирования самого сахарного желоба, так и для реализации особенностей взаимодействия водного хребта с желобом.

4. Данные экспериментов по гель-электрофорезу ДНК, свидетельствующие о различной подвижности последовательностей [вАЛ^С],, и [ОТдАдС],,.

5. При изменении условий и в растворе, и в волокнах полинукпеотид ро1у(с!А)-ро!у(сГГ), в отличие от других полинукпеотидов, остается в конформации, принадлежащей В-семейству.

В заключение можно отметить, что нами было показано, что бифуркатные связи между аминогруппой аденина и карбонильными кислородами двух соседних тиминов, не могут являться основным фактором, ответственным за аномальность А-треков.

ГЛАВА 2. ИЗГИБ ОСИ СПИРАЛИ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ А/Т-УЧАСТКИ.

2.1 Низкоэнергетические конформации дуплексов, содержащих фрагменты с!(А)„-с1(Т)п.

Большое количество экспериментальных данных свидетельствует о том, что ДНК, содержащая А/Т-участки, изогнута. Как показано, в ряде случаев наличие изгибов ДНК может иметь биологическое значение.

На основании теоретических конформационных расчетов с использованием аномальной конформации АУТ-участка нами предложена структурная модель, позволяющая объяснить данные экспериментов по изгибам ДНК, содержащей А/Т-участки. Расчеты проводились для дуплексов, состоящих из 4-х пар нуклеотидов, в которых концевые пары были зафиксированы в низкоэнергетических конформациях, характерных для аномальных А/Г-структур или типичных для В-формы. Таким образом, можно считать, что рассматриваемая структура состоит из двух жестких дуплексов, соединенных между собой нежестким участком (пары 2 и 3), см. рис.7. В Таблице 4 приведены конформационные параметры регулярных двойных спиралей, используемых в наших расчетах в качестве жестких концевых фрагментов.

Рассчитывались следующие самокомплементарные фрагменты, содержащие А/Т -участки: АпТт, Т„Ат, А„ССТт, АпСОТт, ТтССАп, ТтСОА„. Очевидно, что в силу самокомплементарности и наличия симметрии 2-го порядка, эти фрагменты, если и имеют изгиб, то только в центре симметрии и строго в узкий или широкий желобы. Что касается фрагмента АпТт, то на АТ-степе гликозидный желоб может быть легко заужен, поэтому фрагмент остается неизогнутым. Согласно нашим энергетическим оценкам, участок с последовательностью АпТт не имеет изгиба. Все же остальные фрагменты изогнуты в широкий желоб в центре симметрии. На рис. 8 приведены зависимости энергии тетрамера ТТАА, ДЕ, от величины изгиба оси спирали, [1, для разных конформации концевых нуклеотидов.

Рис. 7. Стереоизображение самокомплементарного двухцепочечного фрагмента ТюАю с изгибом в 18 градусов между осями спиралей К1 и К2. Изгиб происходит строго в направлении широкого желоба, концевые фрагменты зафиксированы в аномальной конформации IV (см. Табл 4).

Таблица 4. Некоторые конформационные параметры регулярных двойных спиралей, используемые в расчетах в качестве концевых участков

№ Полимер 1 О Т1. "ПЛ/ 6 т « Р у г е

1 (ЙА)„-(с1Т)„ 9,5 0,95 -4,2 9,5 3,26 36,0 -62 179 56 129 181 -103

II (с!А)лат)п 9,5 0,97 -5,4 7,5 3,26 36,0 -62 181 55 132 179 -103

III (с!А)„' (с1Т)„ 9,4 0,89 -7,8 5,4 3.35 36 0 -61 183 54 133 178 -103

IV (<1А)П'(«1Т)„ 9,6 1,01 -2,3 10,3 3,21 36,0 -63 177 57 129 183 -104

V (<ЗА)„' (сГГ)„ 10,8 1,07 -0,2 7,5 3,23 36,0 -69 178 61 128 183 -101

VI (с1А)п'({1Т)п 11,9 2,18 -0,3 0,4 3,41 33,2 -67 185 55 133 182 -104

VII (ЬС)П' (ЙС)п 11,8 1,98 -0,7 -0,5 3,33 33,9 -68 185 56 133 181 -103

расстояния приведены в ангстремах, обозначения те же, что и в таблице 2.

АЕ

ккал ' моль

RT

-18

-6 F

Большой желоб

Рис. 8. Зависимость энергии тетрамера ЛЕ от величины изгиба 0. Отрицательные значения угла изгиба (5 означают, что изгиб направлен в широкий желоб. Кривая а - это расчеты с концевыми нуклеотидами, зафиксированными в конформации II, а кривая b - в конформации V (Табл. 4), c,d - данные из литературы (Ulyanov N.B. and Zhurkin V.B.,1984); с - получена для CCGG, приведена для сравнения, d - концевые фрагменты имеют TL~4°, TW -8°. Заужение гликозидного желоба в концевых фрагментах приводит к сдвигу кривых влево, в сторону более сильных изгибов, что указано стрелками.

Кривая а - это расчеты с концевыми парами, зафиксированными в конформации II, которая является аномальной В'- конформацией с шириной сахарного желоба, равной 9,5А. Кривая b - концевые пары имеют конформацию V, в которой характерен более широкий желоб (10,8 А) и меньший наклон пар (Табл. 4) т.е. конформация концевых фрагментов ближе к обычной В-форме, что, как видно из рисунка 8, приводит к уменьшению величины изгиба. Использование конформации VI для граничных фрагментов приводит к полному исчезновению стабильного изгиба (на рис. 8 эти данные не показаны). Другими словами, наши расчеты демонстрируют, что именно наличие аномальной структуры приводит к изгибам. Однако, вариации в последовательности модулируют величину изгибов. Так, например, угол изгиба на последовательностях ТТАА и TCGA больше, чем на AGCT.

Рис. 9. Стереоизображение конформаций фрагментов й(ТТССААААТТТТССАА) (вверху) и ¿(ААССТТТТААААССТТ) (внизу) повторов [вА4Т4С]п и [СТ4А4С]„, соответственно. Эти структуры были построены из низкоэнергетических конформаций фрагментов А„Тт, Т„Ап„ АпвСТт, АлССТт, Т„ССА„, ТтССА„. Структура |СТ4А4С]П (внизу) практически прямая, тогда как [СА4Т4С]„ (вверху) сильно изогнута, что объясняет большую разницу в их электрофоретической подвижности. Стрелками указаны места изгибов.

Полученные результаты позволяют качественно объяснить парадокс Хагермана о принципиальной разнице в электрофоретической подвижности между повторами [СА4Т4С]„ и [СТ4А4С]п, что свидетельствует о значительном изгибе на первом повторе и отсутствии такового на втором. Действительно, согласно нашим расчетам, на повторе [СА4Т4С]П должны существовать значительные изгибы на обоих концах А4Т4 -участка, но не в середине. В то же время, на повторе [СТ^С],, имеется дополнительный изгиб в ТА-области, т.е. в середине, который в результате приводит к распрямлению этого дуплекса (см. рис. 9). Из рис. 8 также видно, что из-за тепловых флуктуаций угол изгиба может изменяться в пределах нескольких 'градусов относительно равновесного значения. Например, при комнатной температуре изменению энергии в пределах (ЧТ72 соответствуют колебания значения угла -7°.

Рис. 10. Стереоизображение фрагмента G,0T10, угол изгиба в области GT- степа равен 9", направление изгиба, «-197, обусловлено разностью наклона пар на стыке фрагментов с парами А:Т и парами G.C. Структура получена минимизацией энергии фрагмента из 4-х пар■ d(GGTT)d(CCAA), соответствующие пары помечены цифрами 1-4.

В случае несамокомплементарных последовательностей, как свидетельствуют расчеты участков G„T„ и С„АП, где Сп (или Оп)-участки имеют обычную конформацию В-типа (VII из табл. 4), кроме возможной компоненты изгиба, направленной в широкий желоб, имеется компонента в направлении цепи, имеющей аномальную структуру на 5-конце (см. рис. 10 и рис. 11). Так же, как и в самокомплементарных нуклеотидах, наличие пиримидин-пуриновых или пурин-пиримидиновых степов может модулировать величину и направление изгибов. Направление изгибов имеет тенденцию поворачивать в сторону гликозидного желоба при наличии пиримидин-пуринового степа (ССАА) и в сторону негликозидного желоба при наличии пурин-пиримидинового степа (GGTT). Однако, точного направления изгибов в этих случаях определить подобными расчетами нельзя.

Одной из основных причин изгибов может быть возможность сохранения при наличии изгиба благоприятных стэкинг-взаимодействий на стыке (месте соединения) двух фрагментов, имеющих различные конформации.

малый желоб

Рис. 11. Схематическое представление направления изгибов для фрагментов СпАт и С„Тт, показаны только степы СА и ЭТ. Ось К1 нижнего фрагмента с!(Аг)с1(Т„) перпендикулярна плоскости рисунка; проекция оси К2 (направление изгиба) представлена в виде пунктирной стрелки.

2.2. Структура дуплекса <)(СААТТТАААТТС)г в растворе на основании данных ЯМР- спектроскопии, расчетов и анализа кристаллических данных.

Для определения пространственной структуры олигонуклеотида с)(СААТТТАААТТС)г были проведены эксперименты 1Н ЯМР-спектроскопии (получены спектры ядерного эффекта Оверхаузера, ЯЭО), выполнены расчеты методами молекулярной механики и молекулярной динамики с ограничениями, а также последующая подгонка теоретически рассчитанного спектра к экспериментальному для уточнения пространственной структуры. Проведенные исследования показывают, что данный фрагмент находится в конформации В-типа с сахарами в С2'-эндо области, причем сахара у пуринов имеют больший угол псевдовращения, чем у пиримидинов. Расстояние между атомом АН2(п) одной цепи и атомом Н1'(т+1) комплементарной цепи (где пит комплементарные нуклеотиды), обозначаемое в дальнейшем X, является одним из главных характерных расстояний для аномальной структуры А/Т-последовательностей. Показано, что это расстояние, большое (> 4.5А) на "[А-участке фрагмента с^СААТТТАААТТСЬ, плавно уменьшается на 3'- и 5'-концах участка ТТТААА и изменяется согласно правилам, сформулированным нами, см. раздел 3.2.

НГ-Н4' (А)

В. О

7.6

7.2 6.8

ррт

Рис,12. Спектр ЯЭО области Н6Ы8-Н1' для времени смешивания 180 мсек; внутринуклеотидные пики отмечены номерами нуклеотидов; A3. А9, А2, А8. А7 -химические сдвиги протонов АН2. вертикальные линии соединяют внутринуклеотидные кросс-пики Н6/Н8 - Н2" (внизу) и Н6 Н8 - Н2' (вверху) Горизонтальные линии соединяют кросс-пики TH6(i) -Tme(i) и Н6 H8(i-1)-TMe(¡)

Полученный спектр ОЭЯ был предварительно обработан: протоны дуплекса были идентифицированы по их химическим сдвигам (см. рис. 12 и табл. 5), а пики, составляющие спектр, были приписаны взаимодействиям определенных пар протонов. Затем было вычислено около 250 расстояний, соответствующих неперекрывающимся пикам.

Таблица 5. Химические сдвиги необменивающихся протонов с|(СААТТТАААТТС)2 при 30°С

I остаток Н6/Н8 Н2/Н5/СН3 Н1' Н2' Н2" НЗ' Н4'

1 01 7,70 - 5,42 2,33 2,58 4,70 4,07

А2 8,07 7,26 5,84 2,65 2,82 4,95 4.31

АЗ 8,05 7,57 6,10 2,48 2,82 4,91 4,37

]Т4 7,00 1,18 5,79 1.87 2,42 4,72 4,10

Т5 7,26 1,41 5,93 1,98 2,41 4,75 4,05

¡16 7,14 1,71 5,50 1,80 2,19 4,73 3,96

1 А7 8,08 6,62 5,66 2,57 2,72 4,90 4,26

АЗ 7,93 6,82 5,74 2,48 2,71 4,90 4,31

А9 7,92 7,44 5,98 2,39 2,74 4,83 4,31

! Т10 6.97 1.12 5.77 1.84 2.40 4.68 4.06

|Т11 7 22 1,43 6,00 1,98 2,39 4,75 4,03

С12 7,35 5,38 6,09 2,14 2,14 4,44 3,87

Эти расстояния были использованы для определения пространственной структуры фрагмента с*(СААТТТАААТТС)2 методами молекулярной механики и молекулярной динамики с ограничениями. Полученные результаты показывают, что всех этих экспериментальных данных недостаточно, чтобы определить, изогнут данный фрагмент или нет. Оказалось, что существует довольно много различных конформаций, одинаково хорошо удовлетворяющих данным экспериментов. Часть структур характеризуется значительным изгибом в сторону негликозидного желоба на ТА-степе, другие же - практически прямые. На рис.13 в качестве примера представлены две различные структуры. Таким образом, сам факт соответствия вычисленного по структуре спектра экспериментальному не позволяет непосредственно различать прямые и изогнутые структуры.

Для ответа на вопрос, изогнут ли данный фрагмент или нет, требуются дополнительные данные. В качестве таких дополнительных данных были использованы ограничения на межатомные расстояния Н1'(п+1) - Н1'(т+1) и Р(п+2) - Р(1ти-2) (далее в тексте Н1'-Н1' и Р-Р), характеризующие ширину гликозидного желоба. Расчеты проводились с помощью программ, реализующих метод молекулярной динамики.

Рис. 13. Стереоизображения изогнутой (вверху) и прямой структур дуплекса с*(СААТТТАААТТС)2. Обе структуры были получены с использованием одного и того же набора экспериментальных ограничений на межпротонные расстояния, их вычисленные спектры ЯЭО согласуются с экспериментальным.

Был сгенерирован ряд структур, удовлетворяющих данным ЯМР, но с разными значениями расстояний НТ-Н1' и Р-Р на ТА-степе, причем были использованы различные процедуры вычислений, различные потенциальные функции и стартовые конформации. Оказалось, что угол изгиба не зависит от стартовой конформации, то есть структуры с одним и тем же углом изгиба получаются как

из прямой, так и изогнутой стартовых структур, если используются одни и те же значения расстояний Н1'-Н1' и Р-Р. На рисунке 14 представлены данные, демонстрирующие корреляцию между углом изгиба и шириной гликозидного желоба на ТА-степе: чем шире гликозидный желоб, тем сильнее дуплекс с!(СААТТТАААТТС)2 изогнут в сторону широкого негликозидного желоба.

Рис. 14. Корреляция между углом изгиба р и межцепочечными расстояниями Н1'(п+1) -Н1'(т+1) (слева) и Р(п+2) - Р(т+2) (справа) на центральном ТА-степе дуплекса с1(СААТТТАААТТС)2,

С другой стороны, как следует из анализа данных по кристаллам, имеется очень хорошая корреляция между шириной гликозидного желоба и расстоянием АН2(п)-Н1'(т+1) ( далее обозначаемым X). Таким образом, учитывая тот факт, что на ТА-степе данного дуплекса расстояние X увеличено, можно сделать вывод о том, что дуплекс с1(ОААТТТАААТТС)2 характеризуется расширенным гликозидным желобом в ТА-области и изгибом в направлении негликозидного желоба в центре дуплекса.

ГЛАВА 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ СТРУКТУРЫ ДНК В РАСТВОРЕ ОТ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ С ПОМОЩЬЮ АНАЛИЗА ДАННЫХ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ.

В течение последнего десятилетия ЯМР-спектроскопия, особенно двумерная спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО), является одним из основных источников информации о структуре ДНК в растворе.

В этой главе представлены результаты поиска закономерностей в спектрах ЯЭО для серии различных олигонуклетидов между измеряемыми межпротонными расстояниями и последовательностью. Кроме того, дополнительно была предпринята попытка установить соответствие между измеряемыми межпротонными расстояниями и непосредственно структурными параметрами двойной спирали ДНК. Нами были проанализированы спектры ЯМР (двумерные спектры ОЭЯ) более, чем десятка двухцепочечных олигонуклеотидов. В результате этого удалось сформулировать эмпирические правипа, описывающие зависимость определенных структурных параметров ДНК в растворе от последовательности.

3.1. Зависимость конформации Сахаров от последовательности в ДНК В-типа в растворе.

Известно, что внутрисахарные межпротонные расстояния НТ-Н4' являются наиболее чувствительными к конформации сахара, а именно к углу псевдовращения Р. На рисунке 15 приведены зависимости расстояний Н1'-Н4' и Н2"-Н4' от угла Р для модели сахара, построенной на основании большого количества экспериментальных данных (Беглов и др., 1987). Кроме того, на этом рисунке кружочками отмечены данные для Сахаров в кристаллических структурах (высокого разрешения) В-формы ДНК. Анализ данных спектроскопии ЯЭО для восьми дуплексов свидетельствует о том, что в ДНК в растворе конформации Сахаров пуринов заметно отличаются от конформации Сахаров пиримидинов.

2.0

—г-

60

О НГ-Н4' (А)

..... 23'

- 38*

.....55"

I ■ I ■ I ■ I '

120 180 240 300 360

фаза псевдовращения (градУ

в Н2"-Н4'(А|

..... 25*

-38*

----- 55*

6 О 120 180 240 300 360

фаза псевдовращения (град)

Рис. 15. Зависимость расстояний Н1'-Н4' (вверху) и Н2"-Н4' (внизу) от угла псевдовращения Р для модели сахара (Беглов и др., 1990). Зависимости приведены для амплитуд псевдовращения 25°, 38° и 55"; кружки соответствуют данным для Сахаров в кристаллических структурах (высокого разрешения) ДНК в В-форме.

Анализ спектров свидетельствует о том, что расстояния Н2"-Н4' больше 3,5 А, поскольку соответствующие кросс-пики очень слабы, следовательно, сахара

должны находится в С2'-эндо области (рис. 15). В таблице 6 приведены расстояния Н1'-Н4', вычисленные нами по спектрам ЯЭО. На основании этих данных построенна гистограмма зависимости количества пуринов и пиримидинов от расстояния Н1'-Н4' (Рис. 16). Видно, что для пиримидинов характерны расстояния Н1-Н4', меньшие 3,0 А, тогда как для пуринов - больше 3,0 А. Нами были проанализированы также конформации Сахаров в кристаллических В-ДНК и модельная конформация сахара (рис. 15). Можно сделать следующий вывод: конформации дезоксирибозных Сахаров в ДНК в растворе находятся, в целом, в С2'-эндо области, при этом пиримидины характеризуются меньшим углом псевдовращения ( 90 < Р < 150), чем пурины (140 < Р < 180).

НГ - Н4'

Рис. 16. Гистограмма распределения числа Сахаров, принадлежащих пуринам и пиримидинам в зависимости от величины расстояния Н1 '-Н4' для В - ДНК в растворе.

Таблица 6. Расстояния Н1'-Н4' по данным ЯМР.

последовательность 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1. GCGTTTAAACGC 2,7 * 2,7 2,6 * 3.2 3,2 * * 3,5 *

2 GCGAAATTTCGC * 3,5 3,2 3,2 * * * * * 3,4 *

3. GCCGTTFFCGGC * * 2,6 * * 2,7 3,1 * 2,8 3,5 3,1 *

4. GCAGGATCCTGC * 2,8 * 3,2 3,4 3,4 * * * 3,0 * *

5 CGCGTATACGCG * 3,1 * 3,1 + 3,1 2,7 3,3 2,8 3,4 * *

6. CGAAAAATCGG * * * * 3,1 3,4 * * * *

7 CCGAI 1 1 1 ICG * 3,5 3,4 * * * • * * *

8. GCGTTCGAACGC * * * * * * 3,4 3,3 * * 3,2 *

9. CGAAGAATCGG * * * 3.3 3,3 3,2 * * * *

10 CCGATTCTTCG » 3,5 3,3 * * * * * * *

Расстояния, в ангстремах, для каждого нуклеотида приведены в столбцах 1, 2, 3, и т.д Последовательности 6 и 7, так же, как 9 и 10, являются двумя цепями одного дуплекса. Звездочками отмечены случаи, когда расстоянию Н1'-Н4' соответствует кросс-пик, перекрывающийся с другим.

3.2. Зависимость межпротонных расстояний АН2(п) - Н1'(т+1) и АН2(п) -Н1'(п+1), характеризующих ширину гликозидного желоба, от нуклеотидной последовательности. Корреляции между этими расстояниями и структурными параметрами ДНК.

В этом разделе приведены данные о зависимости межцепочечных расстояний АН2(п) - Н1'(т+1) и внутрицепочечных расстояний АН2(п) - Н1'(п+1) от нуклеотидной последовательности для 13 исследованных олигонуклеотидов. Для краткости далее мы будем обозначать расстояние АН2(п)-Н1'(т+1) как X и расстояние АН2(п)-Н1'(п+1) как Б. Расстояния были вычислены из спектра ЯЭО с учетом хорошо известной зависимости скорости диполярной релаксации от межпротонного расстояния, г, как 1/г6, методом линейной экстраполяции скорости роста кросс-пиков к нулевому времени смешивания. Расстояние Н5-Н6 цитозинов, равное 2,5А, использовалось в качестве реперного. На рисунке 17 представлен фрагмент двумерного спектра ЯЭО.

ррт

Рис. 17. Фрагмент двумерного спектра ЯЭО олигонукпеотида с1(еС6ТТТАААССС), содержащий Н8/Н6/Н2 - Н1'/Н5 кросс-пики. Стрелки показывают (слева направо) межцепочечные АН2(п)-Н1'(т+1) пики для оснований А9, А8 и А7. Отметим практическое отсутствие межцепочечного пика для А7, находящегося на 5'-конце А- трека по сравнению с сильным пиком Н2(А9)- Н1'(Т5) на З'-конце А-трека.

Следует отметить, что вне зависимости от точности пересчета кросс-пиков в расстояния, скорость роста объемов пиков, соответствующих расстояниям X, показывает строгую зависимость от последовательности. Надежность перевода скорости роста кросс-пиков в расстояния при двухспиновом приближении зависит от интенсивности спин-диффузии. Протоны АН2 обладают

зо

значительными временами спин-решеточной и спин-спиновой релаксации, Это означает, что они удалены от остальных протонов, которые могли бы служить дополнительными промежуточными путями переноса магнетизации. Таким образом, расстояния АН2-Н1' слабо искажаются из-за спин-диффузии вплоть до времени смешивания равного 150 ms. Этот факт подтверждается модельными расчетами различных известных кристаллических структур ДНК: расстояния X, вычисленные в рамках двух-спинового приближения из спектра, полученного при использовании полной матрицы релаксации, совпадают с исходными реальными расстояниями с точностью 0,1 А.

3.2.1. Зависимость межцепочечного расстояния X от последовательности. Межцепочечное расстояние X может характеризовать особенности конформаций на CA, ТА, GA и АА динуклеотидных степах. На рисунке 18 приведены гистограммы распределения расстояний для этих степов, при этом использованы расстояния, как вычисленные нами, так и взятые из литературы. Обнаружены определенные согласованные тенденции.

Пиримидин-пуриновые степы. Для всех пиримидин-пуриновых степоз (ТА и CA/TG) X больше 4,5 А.

Пурин-пуриновые степы. На GA-степах (и соответственно, комплементарных ТС-степах), X может быть либо большим (4,5А), либо малым (3,9А). Анализ последовательностей, приведенных в таблицах 7 и 8 приводит к определенным заключениям о влиянии соседних и даже более удаленных по цепи нуклеотидов на величину этого расстояния:

1. Сравнение последовательностей 1 и 3 с 8, 10 и 11 (таблица 8) показывает, что наличие пиримидин-пуринового степа на 5'-конце GA-степа или, соответственно, на З'-конце ТС-степа комплементарной цепи (то есть в последовательности YGNJCR) сопряжено с увеличением X на GA/TC-степе. Разница в величине X на GATC -степе в последовательностях 4 и 13, и, возможно, 5 и 7 зависит, главным образом, от наличия или отсутствия пиримидин-пуринового степа на 5'-конце GA-степа, или на З'-конце ТС-степа. Эти данные, вместе с наблюдением, что расстояние X велико на всех известных пиримидин-пуриновых степах (таблица 7), показывают не только то, что X возрастает на пиримидин-пуриновых степах, но и то. что его влияние распространяется на примыкающие с обоих концов степы. С этим выводом также хорошо согласуется и эффект возрастания расстояния X на 5'-концах А-треков

(3 и Ю из таблицы 8, а также литературные данные) который вызывается наличием пиримидин-пуринового степа, близкого или даже соседнего по цепи к 5'-концу последовательностей УЯА или ^А, где 1М- любой нуклеотид. Интересно отметить, что отсутствие возрастания X на З'-конце А-треков коррелирует с отсутствием подобного близко расположенного степа.

Таблица 7. Межцепочечные, X, и внутрицепочечные, S, расстояния.

№ Последовательность А X s

1 5-CGCGAATTCGCG А5 4.4 4.3 ' EcoRI

3-GCGCTTAAGCGC А6 4,0 *

2 5-GCCGTTAACGGC А7 >4,5 >4.5 Нра I

3 -CGGCAATTGCCG А8 4,2 4,2

3 5-GCGAAATTTCGC А4 4.3 4,3

3-CGCTTTAAAGCG А5 4,0 4,1

А6 3,7 3,6

4 5 -GCGTTTAAACGC А7 >4,5 >4,5 Aha III

3-CGCAAATTTGCG А8 4.2 4.2

А9 3,9 3,9

5 5-GCCGTATACGGC А6 • 4,0 Sha I

3-CGGCATATGCCG А8 >4,5 4,0

6 5-GCCTGATCAGGC А6 4,4 3,9 Bel I

3-CGGACTAGTCCG А9 * *

7 5 -GCAGGATCCTGC A3 * • BamHI

3-CGTCCTAGGACG А6 4,0 3,9

8 5-GCCGGATCCGGC А6 4,0 3,8 BamHI

3-CGGCCTAGGCCG

9 5-GCCGTGCACGGC AS >4,5 3.9 Hg/AI

3-CGGCACGTGCCG

10 5-CGAAAAATCGG A3 4,5 4,5

3-GCTTTTTAGCC А4 * 4,5

А5 3,9 4,5

А6 3.8 4,1

А7 3,8 4,0

А15 3,9 4,1

11 5-CGAAGAATCGG A3 * * MboW

3-GCTTCTTAGCC А4 • >4.5

А6 4,0 >4,5

А7 4.0 *

А15 3,9 3,9

12 5-GCGTTCGAACGC А8 4,4 * Asull

3-CGCAAGCTTGCG А9 4,1 4,1

13 5-GCCGATATCGGC А5 4,5 3,9 EcoRV

3 -CGGCTATAGCCG А7 * 3,9

В столбце А указаны аденины, для которых приведены расстояния. X обозначает межцепочечное расстояние АН2(п)-Н1'(т+1); в обозначает внутрицепочечное расстояние АН2(п)-Н1'(п+1); '*' ообозначает, что соответствующий кросс-пик перекрыт в спектре с другим. Выделенные нуклеотиды образуют сайт рестрикции соответствующей рестриктазы (крайний справа столбец).

2. Из сравнения расстояний на последовательностях 5, 6 и 12 из таблицы 8 можно заметить, что пурин-пиримидиновый АТ-степ в последовательностях GAT приводит к уменьшениюX на GA-степе, примыкающем с 5-конца к этому АТ-степу,

соответственно, с 3'- конца к ТС-степу. Величина X оказывается при этом меньше 4.0 А.

Таблица 8. Межцепочечные расстояния X на различных СА/ТС-степах.

№. Последовательность X

1 GCCTGATCAGGC 4.4

2 GCGTTCGAACGC 4.4

3 GCCGATATCGGC 4.5

4 GCGAATTCGC 4.4

5 GCGAAATTTCGC 4.3

6 CGAAAAATCGC 4.5

7 GGAAATTTCC 3.8

8 CTGGATCCAG 4.0

9 CCGATTCTTTCG 3.9

10 GCAGGATCCTGC 4.0

11 GCCGGATCCGGC 4.0

12 CCGATTTTTCG 3.9

13 CGAAGAATCGG 4.0

Приведены данные из таблицы 7, последовательности 7 и 8 взяты из литературы. Последовательности 6 и 12 так же, как 9 и 13, являются комплементарными цепями одного дуплекса. Расстояние в правом столбце соответствует выделенному степу GA/TC.

3. В пунктах 1 и 2 были приведены данные, свидетельствующие о влиянии на структуру GA/TC-степа со стороны оснований, прилегающих к нему с 3- или 5'-конца. Однако, сравнивая последовательности 1 и 3 с последовательностями 9 и 12 (или их комплементарные цепи) из таблицы 8, видно, что на величину X влияют замены и более удаленных оснований. Предполагается, что здесь мы наблюдаем кооперативный эффект формирования аномальной В'-конформации с зауженным гликозидным желобом на АТ-треках. Из приведенных данных можно заключить, что всего лишь трех последовательных А Т-пар (последовательности ААТ и АТТ) может быть достаточно для формирования подобной конформации. При этом значительную стабилизирующую или дестабилизирующую роль играют соседние пары оснований. Например, для стабилизации аномальной конформации необходимо отсутствие близкорасположенного пиримидин-пуринового степа.

Пурин-пуриновый АА-cmen. На всех АА/ТТ-степах X < 4,2 А (рисунок 18 и таблица 7). Однако видно, что это расстояние не постоянно, а может меняться в зависимости от контекста последовательности. В частности, присутствие пиримидина (YAA) или же YG-степа (YGAA) с 5'-конца последовательности АА приводит к увеличению X на АА-степе. В то же время присутствие тиминов с 3'-конца АА-степа влечет уменьшение X на этом степе. К аналогичному результату

приводит и наличие одновременно А с 5'-конца и Т, С или А с З'-конца (X < 3,9 А). Предполагается, что подобное уменьшение вызывается эффектом кооперативного перехода АТ- последовательности в В'-конформацию с зауженным гликозидным желобом. Необходимо отметить, что

вышеперечисленные факторы, определяющие величину X на АА-степе, аналогичным образом проявляются и на ОА/ТС-степе.

А Б

AH2-HV.A AH2-HV. А

Рис.

18. Распределение числа, Z, степов CA/TG и ТА (слева) и GA/TC-степов (справа) в зависимости от величины межцепочечного расстояния X на этих степах. Данные для 7 последовательностей, взятых из литературы, обозначены незаштрихованными колонками. Остальные данные взяты из таблицы 7. Межпротонные расстояния вычислены с точностью более, чем 0,2 А. Вариации X от последовательности могут быть описаны следующим образом. 1). На всех пиримидин-пуриновых степах X >4,5 А. 2). Если пурин предшествует GA-степу. или же последовательность тиминов (Т„, п>2) следует за ним, то X на этом степе 3,8-4,0 А, во всех других случаях Х>4,3 А, 3). На АА/ТТ-степах в YAA-контексте X ~4,2А, уменьшается до 4,0-4,1А в последовательности GAA и сокращается далее до 3,8А внутри АД^-последовательности (n+m>4).

3.2.2. Зависимость внутрицепочечного расстояния S от последовательности.

Внутрицепочечное расстояние S между протонами АН2(п) и Н1'(п+1), то есть, между Н2 аденина и Н1' следующего за ним по цепи остатка, определено для AT, АС, AG и АА динуклеотидных степов. Как видно из гистограммы ( рис. 19) на степах AT и АС S меньше 4,2А и находится в диапазоне от 3,6 до 4,2 А. В случае же АА и, возможно, AG-степов, соответствующее расстояние всегда больше 4,0 А. Верхняя граница при этом больше 4,5А и не может быть точно определена при нынешнем уровне развития техники ЯМР. Как и в случае X, величина S зависит от соседних оснований. Присутствие пиримидина с 5-конца АА-степа приводит к S равному или большему чем 4,5 А, а присутствие Т-трека с З'-конца к уменьшению S до 4,0А, что видно из сравнения последовательностей 3

и 10 из таблицы 7. Сопоставление X и Б, принадлежащих одному и тому же АА-степу, показывает, что X всегда меньше Б во всех последовательностях, то есть АН2(п)-Н1'(т+1) меньше, чем АН2(п-1)-Н1'(п) на том же самом АА-степе. На АТ-степе Б имеет тенденцию к уменьшению, когда этот степ расположен внутри А/Т-последовательности.

Б

Л.О Л ч чу 41 " •• ¿о л.о «У

А112 1(1 Л ЛН2-НГ.Л АН2-Н|',А

Рис. 19. Распределение числа АА/ТТ (А), АС/СТ (Б) и АТ (В) степов в зависимости от величины внутрицепочечного расстояния Э на этих степах. Гистограммы аналогичны приведенным на рисунке 18. Межпротонные расстояния вычислены с точностью <0,2 А. Вариации величины Э на АА-степах от последовательности могут быть описаны следующим образом: 5>4,5А, если на 5'-конце степа находится пиримидин, и уменьшается до 4,1-4,ЗА внутри А„Т „-последовательности (п+т>4). На АСЮТ-степах Э - 4,1 А и уменьшается на 0,2А в АС-последовательностях. На АТ-степах Э - 4,0А и уменьшается на 0,ЗА внутри длинного АТ-трека.

3.2.3 Корреляция между расстояниями X и структурными параметрами ДНК В-типа и возможный механизм связи между последовательностью и структурой ДНК .

Выше были описаны некоторые феноменологические закономерности зависимости межпротонных расстояний от последовательности. Теперь представляется интересным узнать, как эти расстояния связаны со структурными параметрами ДНК. Для этой цели были проанализированы 7 кристаллографических структур ДНК высокого разрешения (Р-фактор не более 2,0А): СССЗААТТСССС, ССССААТТСССб, СССАТАТАТОСб, ССААССТТСС, ССАСвССТСС, СОАТССАТСС и ССААСАТЮС. Необходимо отметить, что эти кристаллографические структуры рассматривались лишь как набор возможных конформаций В-ДНК, с помощью которых определялись корреляции. Таким образом, наши выводы могут быть лишь в минимальной степени искажены влиянием условий упаковки в кристаллах или артефактами дегидратации, которые изменяют структуру ДНК в кристалле.

Среди геометрических параметров, определенных в соответствии с соглашением о номенклатуре конформационных параметров ДНК (Dickerson et al., 1989) лишь "cup" (разность двугранных углов, образованных основаниями в соседних парах) и "slide" (относительный сдвиг двух соседних пар вдоль короткой оси лары) имеют некую корреляцию с межцепочечным расстоянием X (коэффициенты корреляции, соответственно, 0,4 и 0,76), для остальных параметров коэффициент корреляции меньше 0,2. Однако, было обнаружено, что существует очень хорошая корреляция (коэффициент корреляции 0,95) между X и межцепочечным расстоянием между ближайшими атомами Н1' противоположных цепей (рис. 20). Это расстояние является хорошей мерой ширины минорного желоба вблизи его дна. Существует также и хорошая корреляция (коэффициент 0,80) с межцепочечным расстоянием между атомами фосфора, традиционно использующимся как мера ширины желоба (рис 20). Возможно, что одной из причин наличия корреляции расстояния X с параметрами "сир" и "slide" является определенная корреляция этих структурных параметров с шириной гликозидного желоба. Внутрицепочечное расстояние S также коррелирует с шириной гликозидного желоба, хотя коэффициенты корреляции и меньше, чем в случае X, а именно, 0,7 для Н1'-Н1' и 0,6 для Р-Р. Корреляции S с какими-нибудь еще структурными параметрами найдено не было.

А Б

АН2-Н1', Л АН2-Н1',А

Рис. 20. Корреляция между расстояниями X и расстояниями между фосфорами, являющимися кратчайшими расстояниями через желоб, Р(п+2)-Р(т+2), (А); корреляция между расстояниями X и Н1'(птИ)-Н1'(п+1) справа, (Б).

Довольно просто проинтерпретировать изменения расстояния X, поскольку, как было показано выше, они хорошо коррелируют с шириной гликозидного желоба. Были также установлены, по крайней мере, три фактора,

вызывающие изменения в X, а именно: наличие пиримидин-пуринового степа, пурин-пиримидинового (по крайней мере в АД™- последовательностях) и кооперативное формирование В'-структуры в АпТп,- последовательностях. Первый и второй эффекты были предсказаны для некоторых конкретных последовательностей на основе конформационных расчетов, из которых следует, что пиримидин-пуриновые степы приводят к расширению минорного желоба. Для двух степов, содержащих те же самые основания, энергетически выгоднее создать конформацию с зауженным минорным желобом на пурин-пиримидиновом, чем на пиримидин-пуриновом степе. Было показано, что это обуславливается главным образом энергией стэкинга. Эффект влияния пурин-пиримидинового и пиримидин-пуринового степов на структуру был впервые интерпретирован Калладином (СаПасКпе, 1982). Однако, полученные здесь результаты не соответствуют правилам Калладина. Например, влияние соседних оснований не сводится к их принадлежности пиримидинам или пуринам, так как, к примеру, пурины С и А в одной и той же позиции влияют на структуру по-разному. Замена А на б в данной последоватепьности приводит к увеличению X, как видно из сравнения последовательностей 1,3,7 и 8 из таблицы 7. Этот эффект может быть приписан появлению МН-группы гуанина в гликозидном желобе и устранению кооперативного структурного перехода, возможного только на А/Т-греках. Третий эффект (кооперативный переход в В'-структуру) может быть объяснен в рамках предложенной нами концепции гидратации А/Т-треков, приводящей к заужению минорного желоба.

В подписях к рисункам 18 и 19 кратко описаны закономерности изменений расстояний X в зависимости от последовательности. Они были сформулированы на основании данных, приведенных в таблицах 7 и 8, и могут быть использованы для предсказания вариаций межпротонных расстояний в новых последовательностях.

3.3. Зависимость от последовательности расстояний между протонами соседних по цепи нуклеотидов.

В этом разделе представлены экспериментальные данные о связи между структурой ДНК, а именно, расстояниями Н6/Н8(п+1)-Н'(п) и Н6/Н8(п+1)-Н2"(п) (далее обозначаемыми Б1 и 82 соответственно) и последовательностью. В Таблице 9 приведены расстояния Э1 и Э2 для 10 дуплексов, полученные с помощью двумерного 1Н-ЯЭО.

8 6 4 2

0 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 Н6/Н8 - Н1', А

10 8 6 4 2 0

2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 Н6/Н8 - Н1', А

8 6 4 2

0 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 Н6/Н8-Н1', А

108 ■ 6 ■ 4 ■ 20.

Рис. 21. Зависимость числа степов ЯУ, УИ, и УУ от расстояний Н6/Н8(п+1)-Н1'(п) и Н6 Ч8(п+1)-Н2"(п); У - пиримидин, Я? - пурин.

0 -уу

1 ■ -яя

11 I, м .....

2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 Н6/Н8-Н1', А

На рисунке 21 представлены гистограммы распределения УК, ЯУ, ЯР, УУ степов в зависимости от величин расстояний и 52 (здесь и далее в этом разделе У обозначает пиримидин, а К - пурин). Как видно из этого рисунка все четыре группы динукпеотидов: УЯ, ЯУ, УУ, однозначно характеризуются комбинацией расстояний и Б2. Для всех УУ- и УЯ-степов расстояния Б1 больше 3,5А. и находятся в пределах 3,5-4,2А, для степов же ЯИ и Р*У меньше 3,5А (с пределами 2,8-3,5А). Что касается расстояния Б2, то оно меньше 2,7А (2,4-2,7 А) на степах УУ и ЯУ, а на степах ЯЯ и УР* это расстояние больше 2,7 А (2,7-3,2 А).

Таблица 9. Межнуклеотидные расстояния Н6/Н8(п+1)-Н1'(п) и Н6/Н8(л+1)-Н2"(п) на основании данных ЯМР.

Последовательность 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 ССЭТТТАААССС - 3,6 * * * 4,0 3,3 3,2 3,4 3.9 Т1

- 2,6 * 2,5 3,0 * * 2,5 2,9 - .

2 бСЭАААТТТССС - 4,1 3,3 * * 3,3 * * 3,7 4,0 -

- 2,9 * * * 2,4 * * 2,5 2,8 -

3 ЗСССТТААСССС * 3,5 « * 4,1 3,2 3,2 4,1 3,2 -

* 2,9 2,5 2.5 3,0 2,9 2,7 2.9 »

- 3,7 3,2 » 2,9 3,2 * » * 3,6 -

4 ССАССАТССТСС - 3,0 2,9 * * 2,7 * * 2.9 -

- 3,2 * 3,4 3.6 3.4 3,6 33 3.8 3.2 -

5 ССССТАТАСвСС * 2,9 » 2,8 2,5 2,8 • 3,0 *

- 3,2 * 3,2 3,2 3,1 3,4 4,0 * -

6 ССАААААТССС * * * • * 2,6 • 2,9 -

4.0 3,2 3.3 3.7 * * 3.6 4.0 -

7 СССАТТТТТСС * 2,8 2.5 » * * • * -

3,4 4,1 3,3 * 3.2 3,8 3.9 4.2 3.3 -

8 СОСвААТТСССС * 3.1 ♦ * 2.5 * 2.5 * *

г--со * * * 4,1 3,1 3,2 3.4 3,9 -

9 СССТТССААСвС 2,8 2,6 • * 3.1 * * 2.7 3 0 -

3,3 * * 3.1 3,3 3,4 * * -

10 ССААСААТССС * * 3,1 * * 2,5 * * -

4,1 3,1 3,1 » * * « * -

11 ССвАТТСТТСв * 2,7 2,5 * * • * * -

* 3.5 40 2.9 2.9 3.7 3.5 * *

12 СССТвАТСАвОС * 2,7 3,1 * * 2.6 3,2 * *

Расстояния (в ангстремах) для последовательных степов указаны в соответствующих колонках. Для каждой последовательности в верхней строке приведено расстояние Н6/Н8(п+1)-Н1'(л), а в нижней - Н6/Н8(п+1)-Н2"(п) Расстояния вычислены для хорошо резрешенных пиков, * - отмечены случаи, когда соответствующий пик перекрыт в спекте с другим.

Наиболее впечатляющая зависимость расстояний Б1, Б2 от типа динуклеотида представлена на рисунке 22, где по оси абсцисс и ординат отложены расстояния Б1 и Б2, соответственно. Каждый из 4-х параллелограмов представляет область изменений экспериментальных расстояний и Э2 для каждого из степов УЯ, ЯУ,

ЯЯ, УУ. При этом верхний правый параллелограмм соответствует У1Ч степу, верхний левый - нижний правый - УУ, и, наконец, нижний левый - ИУ степу. Представленные данные также свидетельствуют о том, что замена У на [Я на 5'-конце приводит к увеличению расстояния в то время, как замена на З'-конце не приводит к заметному изменению этого расстояния. Для расстояния Э2, наоборот, замена У на Я на З'-конце приводит к изменению расстояния Б2 в то время, как замена на 5'-конце - нет.

ОЭ

X

„ ■» h-П

ж : •• - ** ^

3 4

II6/H8 - HI', А

Рис 22. Зависимость расстояний H6/H8(n+1)-H1'(n) (S1) и H6/H8(n+1)-H2"(n) (S2) от типа динуклеотида (степа); каждый параллелограмм представляет область изменения этих ЯМР-расстояний; верхний левый - RR, нижний правый - УУ, нижний левый - RY и верхний правый - YR. Приведена зависимость параметра "profile sum" от расстояний S1 и S2 на основании кристаллических данных; степы, характеризующиеся малыми значениями "profile sum" (<-10), - обозначены квадратиками; промежуточными значениями (между -10 и +10), - обозначены крестиками; и, наконец, большими (>10), -обозначены кружочками.

Кроме того, нами была сделана попытка установить связь между расстояниями S1 и S2 и геометрическими параметрами ДНК. В регулярной Арнотовской В-ДНК S1, S2 расстояния на разных степах совпадают с точностью 0.1А, что свидетельствует о том, что наблюдаемые на разных степах ДНК различия в расстояниях S1 или S2 связаны с изменением геометрии ДНК. Было проанализировано несколько структур В-типа, расшифрованных методом рентгеноструктурного анализа. Эти структуры (R-фактор менее 2,2 А) были

использованы для поиска корреляций между расстояниями S1, S2 и геометрическими параметрами ДНК. Наиболее существенная корреляция (0,7) была найдена мемеду расстоянием S2 и структурным параметром "slide". Кроме того, была найдена некоторая корреляция между расстояниями S1, S2 и параметром 'profile sum", являющимся линейной комбинацией ряда параметров, определяющих взаимное положение оснований. Рисунок 22 демонстрирует эту корреляцию для кристаллических структур: степы с большой, промежуточной и небольшой величиной параметра "profile sum" занимают отдельные неперекрывающиеся области.

Как уже отмечалось выше (см. рис.21), расстояния S1, S2 измеренные методом ЯМР для олигонукпеотидов в растворе, расположены в областях, занимаемых параллелограммами. Результаты можно интерпретировать следующим образом: в растворе RY и YR-степы, в основном, должны характеризоваться большим и промежуточным значением параметра "profile sum", тогда как RR/YY с тепы - промежуточным и малым значением "profile sum".

выводы

1. Методом молекулярной механики с использованием данных ЯМР определена структура фрагментов (с!А)п(сЯ)„ дуплексов в растворе и уточнена структура ро1у(с)А) ро1у(с1Т) в волокнах.

2. Методами Монте-Карло и молекулярной динамики исследована зависимость структуры гидратной оболочки гликозидного желоба ДНК от нуклеотидной последовательности и конформации. Сравнение результатов компьютерного моделирования с экспериментальными данными указывает на важную роль водного хребта Дикерсона в образовании аномальной конформации участков ДНК, состоящих из пар А:Т, не содержащих степа Т-А. Оценены вклады взаимодействий отдельных структурных компонентов ДНК с каждым из слоев хребта в его стабилизацию.

3. Предложена модель изгибов оси спирали ДНК, содержащей А/Т-участки, объясняющая целый ряд экспериментальных данных. Объяснен, в частности, парадокс Хагермана о различной электрофоретической подвижности полинуклеотидов [са4т4с]п и [ст4 а4с]п.

4. С помощью метода молекулярной динамики, используя данные ЯМР-спектроскопии, построены модели дуплекса с!(СААТТТАААТТ.С)2 в растворе. Показано, что данным ЯМР удовлетворяет целый набор структур с разной степенью изгиба оси спирали, а также без изгиба. Использование дополнительных ограничений, следующих из анализа кристаллографических данных, однозначно приводит к структуре, изогнутой в широкий желоб, что подтверждает предложенную модель изгибов.

5. Показано, что данные ЯМР свидетельствуют о зависимости структуры ДНК в растворе от нуклеотидной последовательности. Определены зависимости от последовательности ряда структурных параметров. Показано, что дезоксирибозные остатки ДНК в растворе находятся в основном в С2'-конформации, при этом

пиримидины характеризуются меньшим углом псевдовращения (90<Р<150), чем пурины (140<Р<180). Два межпротонных расстояния Н2 аденина с Н1' соседнего (с 3'-конца) нуклеотида и Н1' нуклеотида, комплементарного соседнему, характеризуют ширину гликозидного желоба и зависят от нуклеотидной последовательности. Выявлены закономерности изменения ширины желоба от последовательности. Обнаружена зависимость от последовательности двух типов межпротонных расстояний между соседними вдоль цепи нуклеотидами, расстояний между Н6/Н8 с одной стороной Н1' и Н" предшествующего (с 5'-конца), с другой.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Chuprina, V.P. "Regularities in formation of the spine of hydration in the DNA minor groove and its influence on the DNA structure FEBS Lett. 186, 98-102 (1985); ibid. 195, 363 (1986).

2. Poltev, V.I., Teplukhin, A.V. and Chuprina, V.P. in Structure and Dynamics of Nucleic Acids, Proteins, and Membranes, Eds. E.CIementi and S.Chin, Plenum Press, N.Y. and London, 1986, pp.51-68.

3. Chuprina, V.P. "Anomalous structure and properties of poly (dA) poly(dT). Computer simulation of the polynucleotide structure with the spine of hydration in the minor groove" Nucleic Acids. Res. 15, 293-311 (1987).

4. Lipanov, A.A. and Chuprina, V.P. "The structure of poly (dA) poly (dT) in a condensed state and in solution" Nucleic Acids Res. 15, 5833-5844 (1987).

5. Chuprina, V.P. and Abagyan, R.A. "Anomalous properties of adenine-thymine tracts." Nature 332,117(1988).

6. Chuprina, V.P. and Abagyan, R.A. "Structural basis of stable bending in DNA containing An tracts. Different types of bending". J. Biomol. Struct. Dyn. 6, 121-138 (1988).

7. Poltev, V.I., Teplukhin, A.V. and Chuprina, V.P. "Monte-Carlo simulation of DNA duplex hydration. В and B' conformations of poly (dA) poly (dT) have different hydration shells" J. Biomol. Struct. Dyn. 6, 575-586 (1988).

8. Poltev, V.t., Teplukhin, A.V. and Chuprina, V.P. "Conformational behavior and water shells of different DNA duplexes. Computer simulation and biological significance" in Biological and Artificial Intelligence Systems, Eds. E.CIementi and S.Chin, ESCOM, Leiden, 1988, pp. 163-184.

9. Chuprina, V.P. "Critical comments on the one recent DNA bending model and its fit to electrophoretic data" J. Biomol. Struct. Dyn. 7, 35-39 (1989).

10. Bukin, V.A., Kankiya, В., Bulichov, N.V., Lebedev, A.V., Gukovsky, I.Ya., Chuprina, V.P., Sarvazyan, A.P. and Williams, A.R. "Measurement of anomalously high hydration of (dA)n (dT)n double helixes in dilute solution" Nature (London) 340, 321-322 (1989).

11. Беглов Д.Б., Липанов A.A. и Чуприна В.П. "Доступность поверхности ДНК для водных молекул и ионов в случае перехода из В-формы в Д-форму" Биополимеры и клетка 5, 66-70 (1989).

12. Головинская А.Г., Полтев В.И. и Чуприна В.П. "Структура и свойства полинуклеотида poly(dA)-poly(dT) и AT-сайтов ДНК. Вычисление энергии невалентных взаимодействий в системах, состоящих из регулярных полинукпеотидов и двухслойного водного хребта в их малых желобах", Биополимеры и клетка 4, 182187 (1988).

13. Липанов А.А., Скуратовский И.Я., Полтев В.И., Головинская А.Г. и Чуприна В.П. "Структура волокон poly(dА)-poly(dT), полученная рентгеноструктурным анализом, минимизацией энергии и ядерно-магнитным резонансом". Молекулярная биология 21, 1645-1654 (1987).

14. Lipanov, А.А., Beglov, D.B.,.and Chuprina, V.P. "DNA В to D transition can be explained in terms of hydration economy of the minor groove atoms" J. Mot. Biol. 210, 399409 (1989).

15. Abagyan, R. A., Mironov, V.N., Chernov, B.K., Chuprina, V.P. and Ulyanov, A.V. "Particular sequences at 5' or 3' ends of the oligo(dA) tract can modulate the curvature of DNA" Nucleic Acids Res. 18, 989-992 (1990).

16. Lipanov, A.A., Chuprina, V.P., Alexeev, D.G. and Skuratovskii, I.Ya. "Bh-DNA: Variations of the poly[d(A)] Poly[d(T)] structure within the framework of the fibre diffraction studies" J. Biomol. Struct. Dyn. 7, 811-826 (1990).

17. Chuprina, V.P., Fedoroff, O.Y. and Reid, B.R. "New insights into the structure of An-tracts and the B'-B- bends in DNA". Biochemistry 30, 561-568 (1991).

18. Chuprina, V.P., Heinemann, U., Nurislamov, A.A., Zielenkiewicz, P., Dickerson, R.E. and Saenger, W.E. "Molecular dynamics simulation of the hydration shell of a B-DNA decamer reveals two main types of minor groove hydration depending on groove width". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 593-597 (1991).

19. Chuprina, V.P., Lipanov, A.A., Fedorov, O.Yu., Kim, S.-G., Kintanar, A. and Reid, B.R. "Sequence effects on local DNA topology revealed by NMR spectroscopy". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9087-9091 (1991).

20. Teplukhin, A., Poltev, V. and Chuprina, V. "Dependence of the hydration shell structure in the minor groove nf the DNA on the groove width as revealed by Monte Carlo simulation". Biopolyr , 31, 1445-53 (1991).

21. Chou, S-H., Cheng, J-W., Fedoroff, O.Yu., Chuprina, V.P. and Reid, B.R. "Adjacent G:A Mismatch base pairs contain Bll phosphodiesters in solution". J. Am. Chem. Soc. 114, 3114-3115 (1992).

22. Nesterova, E.N. and Chuprina, V.P. "An Efficient Method of Calculating Analytical Derivatives for Direct NOE Refinement of Macromolecular Structures". J. Magn. Res. 101, 94-96 (1993).

23. Chuprina, V. P., Fedoroff, O.Yu., Sletten, E. and Reid, B.R. "Investigation of Solution Structure of d(GAATTTAAATTC)2 by 1H NMR, Moiecular Dynamics, Mechanics, Refinement by Back-Calculation of the NOESY Spectrum and Analysis of-This Structure Using X-ray Data". J. Biomol Struct. Dyn. 10,693-707 (1993).

24. Chuprina, V.P., Nerdal, W., Sletten, E., Poltev, V. I. and Fedoroff, O.Yu. " Base dependence of B-DNA sugar conformation in solution and in the solid state ". J. Biomol Struct. Dyn. 11, 671-682 (1993).

25. Fedoroff. O.Yu., Reid, B.R. ana Chuprina, V.P. " Sequence-dependence of DNA structure in solution". J. Molec. Biol. 235, 325-330 (1994).