Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформации белков в средах с умеренной низкими значениями диэлектрической постоянной и pH

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Конформации белков в средах с умеренной низкими значениями диэлектрической постоянной и pH"

^ # #

_ На правах рукописи

-о

ДЮЙСЕКИНА АЛЕКСАНДРА ЕХСАНОВНА

КОНФОРМАЦИИ БЕЛКОВ В СРЕДАХ С УМЕРЕННО НИЗКИМИ ЗНАЧЕНИЯМИ ДИЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ПОСТОЯННОЙ И рН

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО -1998 г.

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научные руководители - доктор физико-математических наук

О.Б. Птицын кандидат физико-математических наук В.Е. Бычкова

Официальные оппоненты - доктор физико-математических, наук

В.Н. Морозов

доктор биологических наук Д.А. Долгах

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии РАН г. Москва

Защита состоится « о^» /¿сОЛ ¿/тЛ 1998 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, Московская область, г. Пущино, ИТЭБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан /ГЖ-^-Г ¿рь£ 1998 г.

Ученый секретарь .

/. /

диссертационного совета 7 /_____/ .

кандидат биологических наук / / Недипович

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современное состояние исследований проблемы сворачивания белка не только позволяет сделать вывод о поэтапном механизме данного процесса, по и обеспечивает исследователя набором структурных характеристик промежуточных состояний, возникающих на пути сворачивания белка. Изучение различных физиологических процессов в клетке свидетельствуют о том, что для выполнения целого ряда функций молекуле белка необходимо принимать конформацию, отличную от нативной. Выдвинутое в 1988 году Бычковой и соавторами (Bychkova et al., 1988) предположение о том, что состояние расплавленной глобулы, наряду с другими негативными состояниями белка, может существовать в живой клетке и может быть вовлечено в целый ряд физиологических процессов, было экспериментально подтверждено в течение последних 10 лет. Так, было показано, что ненативное состояние белковой молекулы участвует в распознавании белка шаперонами (Martin et al., 1991; Van der Vies et al., 1992), проникновении белка в мембрану (Van der Goot et al., 1991; Van der Goot et al., 1992), передаче белком лигандов (Bychkova et al., 1992) и некоторых других процессах (см. также Bychkova & Ptitsyn, 1993 и Ptitsyn, 1995). Возникает вопрос - под действием каких факторов может происходить денатурация белка в живой клетке? Некоторые условия в клетке, такие как низкие рН (4.5-5.0) в лизосомах или около отрицательно заряженных мембранных поверхностей, наличие мембран и цитоскелета являются умеренно-денатурирующими условиями для белков. Мембранная поверхность с сильным электростатическим потенциалом притягивает протоны, что вызывает локальное понижение рН по крайней мере на 2 единицы на расстоянии 5-15Â от поверхности мембраны (Eisenberg et al, 1979), способное дестабилизировать на-тивную структуру бежа. Однако для большинства белков подобное понижение величины рН недостаточно для кислой денатурации белка. Поэтому было выдвинуто предположение о дополнительном денатурирующем воздействии поверхности мембраны - локальном понижении диэлектрической проницаемости и, как следствие, усилении электростатических взаимодействий вблизи ее поверхности (см. Bychkova & Ptitsyn, 1993; Ptitsyn, 1995)

Цель настоящей работы: - экспериментальная проверка предположения о том, что под влиянием умеренно низких значений диэлектрической постоянной и

рН нативный белок может быть денатурирован в живой клетке. Исследовались конформационные переходы в ало- и холо-цитохроме с и ретинол-связывающем белке в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН.

Научная новизна. Предполагаемое денатурирующее действие мембранных поверхностей на глобулярные белки, состоящее в одновременном воздействии двух факторов - понижении эффективной диэлектрической проницаемости воды вблизи органической поверхности и локальном понижении рН вблизи отрицательно заряженной поверхности - было смоделировано в водпо-спиртовых смесях при умеренно низких рН. Было показано, что цитохром с и ретинол-связывающий белок в условиях умеренно низких значений диэлектрической постоянной и рН переходят в денатурированное состояние, обладающее всеми свойствами состояния расплавленной глобулы. Показано, что совместное действие этих двух факторов способно приводить к отдаче ретинол-связывающим белком ретинола (витамина А), моделируя тем самым функцию данного белка - его участие в транспорте гидрофобного лиганда. В то же время апоцитохром с претерпевает в данной модельной системе переход из полностью развернутого состояния в некомпактное состояние, характеризующееся высоким содержанием вторичной структуры; данное состояние близко по своим структурным свойствам к состоянию апоцитохрома с, компетентному к транслокации через мембрану (de Jongh et al, 1992).

Апробация работы и научные публикации. Материалы диссертации докладывались на 23 Международном симпозиуме ФЕБО (Базель, Швецария, 1995), втором международном семинаре «Principles of Protein Architecture» (Токио, Япония, 1995), симпозиуме «Advances in Gene Technology: Biomolecular Design, Form and Function» (Лодердель, Флорида, США, 1997), Кейстоунском симпозиуме «Molecular and Cellular Biology: Protein Folding, Modification and Transport in the Early Secretory Pathway» (Taoc, Нью Мехико, США, 1997), на ежегодной научной конференции Института белка РАН, 1995 год, Пущино (Московская область). Стендовые сообщения были представлены на 2-ой Городской научной конференции молодых ученых, 1997 год, Пущино (Московская область) и на международном симпозиуме «Protein Strusture, Stability and Folding: Fundamental and Medical Aspects» (Москва, 1998); работа прошла апробацию на научных семинарах в Институте белка и Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

(Пущино). Основные результаты работы, представленной к защите, отражены в 9 публикациях, в том числе в 4 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.

пяти глав, "Заключения", "Выводов" и "Списка литературы". Во "Введении" дано краткое описание задач и результатов исследования. Глава 1 посвящена описашпо и анализу литературных данных, отражающих современное положение исследований в области сворачивания белка, возможности возникновения и функционального значения ненативпых конформаций белка в клетке. В главе 2 дано описание используемых методов и материалов. Главы 3, 4, и 5 посвящены описанию и анализу полученных результатаов. В главе 3 рассматриваются свойства молекулы цитохрома с в условиях, моделирующих окружение белка вблизи поверхности отрицательно заряженной мембраны. Глава 4 содержит результаты исследований структуры апо-формы цитохрома с в аналогичной модельной системе. В главе 5 описано применение данного модельного подхода к исследованию копформаци-онных превращений в молекуле ретинол-связывающего белка. Раздел "Заключение" содержит основные итоги данной работы. В конце диссертации приведены основные выводы из данной работы. Материал иллюстрирован 22 рисунками и 3 таблицами. Список цитируемой литературы включает 131 работу.

Простые расчеты показывают (см. Ландау и Лифшиц, 1982), что по мере приближения к границе раздела двух фаз (водной и органической) значение эффективной диэлектрической проницаемости уменьшается, достигая в предельном случае величины, почти вдвое меньшей, чем диэлектрическая проницаемость воды. Схематически условия, реализующиеся у поверхности отрицательно заряженной мембраны, представлены на рис.1.

Для проверки предположения о том, что способность отрицательно заря-женпой мембраны трансформировать белки в непативое состояние обусловлена не только понижением локального значения рН, но и (возможно, в первую оче-

состоит из "Введения",

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

8,» е.

© ©

Локально ©

©

©

© ei/2< еЭфф <е1

/IГ Я / I I ¡f /|/ у

'Л' Л'Л '/г 'Л'

/1|/ JI/ И / /| //|/ / / / /'/ ^ / V Л /»/

/////////////'///У.i f Г t / I ! lirtlltrtltZnltll/tlll'l

illtllttllt - . . ttJI/ft/ll ' ' ' ' ' • ¡ill! II ' ' / III II II I

Рис.1. Схематическое представление условий вблизи поверхности мембраны. Е1 - диэлектрическая проницаемость воды, равная 81 при 20°С; е2 - диэлектрическая проницаемость внутри липидного слоя, равная 4.

редь) влиянием гидрофобной части мембраны, проявляющемся в понижении диэлектрической проницаемости среды и усилении электростатических взаимодействий, была выбрана простая грубая модель, учитывающая понижение рН и понижение ди-

электрической проницаемости, - растворитель, обладающий одновременно двумя этими характеристиками. Нами использовались водно-спиртовые смеси при умеренно низких значениях рН, так как было показано (Wilkinson & Mayer, 1986; Dufour et al, 1993; Uversky et al., 1997), что денатурирующее действие спиртов определяется в основном понижением средней диэлектрической постоянной раствора, а не специфическими свойствами отдельных, спиртов.

В качестве объектов исследования были выбраны белки, функционирующие в клетке вблизи поверхности мембран: цитохром с в апо- и холо-форме и ре-тинол-связывающий белок.

Цитохром с. Цитохром с является характеристическим белком межмембранного пространства митоховдрии и функционирует около ее внутренней мембраны, участвуя в переносе электронов от цитохром с-редуктазы к цитохром с-оксидазе. Не будучи непосредственно связан с мембраной при физиологических условиях, данный белок тем не менее постоянно находится вблизи поверхности мембраны и неизбежно должен испытывать на себе ее предполагаемое воздействие. Для изучения конформационных переходов в цишхроме с были использования методы кругового дихроизма, флуоресценции, микрокалориметрии и диффузии (ВусЬкоуа е1 а1; 1996). На рис.2 представлены переходы в цитохроме с в зависимости от содержания метанола в 0.5 М №01 при рН 4, тестируемые по спектрам КД в ближней и дальней УФ областях. Видно, что молекула белка претерпевает два последовательных конформационных перехода, причем переходы в разных областях

Концентрация спирта (об.%)

концентрация спирта (об.%) спектра четко разнесены по

концентрации метанола, и существует область в районе 40% метанола, где переход в ближней УФ области уже завершен, а основные изменения в дальней УФ области еще не начались. На первой стадии происходит разрушение третичной структуры, на второй стадии - переход в состояние с более выраженной вторичной структурой, Рис.2. Изменение спсюров ближнего и дальнего КДци- без плотной упаковки бо-тохрома с в зависимости от концентрации метанола при рН косых групп. Аналогичное 4.0, представленное в абсолютных (А, молярные эллипгш- исследование флуоресценции

единственного в молекуле цитохрома с триптофанового остатка выявило двухстадий-ный характер изменения данного параметра, причем положения переходов на шкале концентрации метанола практически совпадают с переходами, наблюдаемыми по спектрам ближнего и дальнего КД, что свидетельствует о вкладе в этот процесс обоих переходов, наблюдаемых по спектрам КД. Эти стадии хорошо разнесены, так что можно сделать заключение о практически 100% заселенности промежуточного состояния в 40% метанола при рН 4 в 0,15 и 0,5 М №С1. При низкой ионной силе максимум заселенности промежуточного состояния сдвигается к 50% метанола. Для исследования природы переходов, обнаруженных спектральными методами, был привлечен метод сканирующей микрокалориметрии. На рис.3 представлены кривые кооперативного тегшопоглшцения цитохрома с в 0,15 М №С1 при рН4,0 для различных концентраций метанола. Видно, что добавление метанола дестабилизирует молекулу цитохрома с, причем для всех кривых калориметрическая энтальпия плавления совпадает с эффективной, то

ности [0]яо и [бЪга) и относительных (Б) единицах. Доля конечного состояния Г рассчитывалась с использованием приведенных на рисунке базовых линий.

30 50 70 Температура (°С)

есть мы наблюдаем плавление молекулы белка как целого (детальное обсуждение тепловой денатурации приведено в диссертации).

Предметом дальнейшего исследования стало

Рис.3. Зависимость избыточной теплоемкости цитохрома с _

— плаши/чл промежуточное состояние,

от температуры при рН 4.0,0.15 МНаС1 и различных концен- г '

трациях метанола, указанных цифрами около кривых. реализующееся при 40% ме-

танола, которое, наряду с отсутствием жесткой третичной структуры, характеризуется спектром дальнего КД, близким к нативному. Оценка гидродинамических размеров молекулы белка в данном состоянии была получена из экспериментов по диффузии, результаты которых представлены в таблице 1. Величина радиуса Сто-кса молекулы цитохрома с в индуцируемом метанолом интермедиате (21 А) лежит между значениями, полученными для нативного (15,2 А) и развернутого (27,9 А) белка, и близка к размерам белка в состоянии расплавленной глобулы (19,0 А). На рис.4 приведен спектр дальнего КД промежуточного состояния цитохрома с в водно-метанольной смеси, и для сравнения представлены спектры его нативного и развернутого состояний и состояния расплавленной глобулы, а также спектр в

Таблица 1. Молекулярные размеры цитохрома с в

различных »¿информационных состояниях.

Состояние Условия Коэффициент диффузии О20,„ 107 Радиус Стокса адА)

Нативное рН 4.0; 0.15М№С1 14.0 15 (1.00)

Расплавленная глобула рН 2.0; 0.5МЫаС1 11.5 19 1.22

Ингермедиат в растворе вода-метанол рН 4.0; 0.15М№С1 40% метанола 10.2 21 1.37

Развернутое рН 2.0; Н20-НС1 7.7 28 1.82

высокой концентрации метанола. Видно, что спектры цитохрома с в интересующем нас промежуточном состоянии и состоянии расплавленной глобулы наиболее близки друг к другу по форме и интенсивности (аналогичный вывод можно сделать и из сравнения спектров ближнего КД в разных состояниях). Следовательно, исследуемое промежуточное состояние при умеренных концентрациях метанола удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к состоянию расплавленной глобулы (см., например, Р^ул, 1992), а его структурные характеристики сходны с таковыми для расплавленной глобулы цитохрома с в водном растворе, описанной Огуши и Вада (0}щшЫ & \Vada, 1983). Таким образом, цитохром с может быть трансформирован из нативного состояния в состояние расплавленной глобулы в водно-метанольных смесях при умеренно низких рН, т.е. в мягких денатурирующих условиях, сходных с теми, которые можно ожидать около мембранной поверхности.

Апоцитохром с. Нативный белок, как было показано выше, может денатурировать в условиях умеренно низких значений диэлектрической проницаемости и рН, то есть в условиях, моделирующих окружение белка около поверхности отрицательно заряженной мембраны. В данной части работы рассматривается вопрос, как понижение диэлектрической проницаемости при умеренно низком рН влияет на конформацию белковой цепи, находящейся в полностью развернутом состоянии. В качестве объекта выбран цитохром с в апо-форме, который со структурной точки зрения является неупорядоченным клубком и в клетке приобретает жесткую третичную структуру только в межмембранном пространстве митохондрии после транслокации через внешнюю мембрану и присоединения гема. Было исследовано влияние различных водно-органических смесей на спектры КД апо-цитохрома с в дальней УФ области. Использовался набор органических растворителей различной природы: четыре спирта с разной длиной алифатической цепи

Рис.4: Спектры дальнего КД цитохрома с в 40% и 72% метанола в сравнении со спектрами белка в нативном (Н) и развернутом (Р) состоящих, а также в состоянии расплавленной глобулы (РГ).

Длина волны (вы)

Рис.5. Сленры дальнего КД апоцитохрома с при рН 4.0 и разных концентрациях метанола (от 0 до 80 об.%).

(метиловый, этиловый, изо-пропиловый и третичный бутиловый спирты), замещенный спирт (2,2,2-трифторэтиловый спирт, ТФЭ), и несколько органических растворителей, принадлежащих к другим классам, а именно, диоксан, тетрагидрофуран, ацетонитрил и ацетон. На рис.5 представлены спектры КД апоцитохрома с в дальней УФ области в растворах с разной концентрацией метанола при рН 4.0 и 23°С. Видно, что спектр дальнего КД апо-цитохрома с в водном растворе выглядит как типичный спектр развернутого белка. Увеличение содержания спирта вызывает значительные изменения как в форме, так и в интенсивности спектра, что отражает формирование в белке вторичной структуры, по-видимому, а-спиральной. Сходные изменения спектра апо-цитохрома с наблюдались при добавлении всех используемых органических растворителей. На рис.6 представлены зависимости молярной эллиптичности на длине волны 220 нм от концентрации органической компоненты в смеси для всех использованных растворителей. Видно, что увеличение содержания органической компоненты в растворе приводит к значительному увеличению эллиптичности спектра КД апоцитохрома с дальней УФ области во всех исследованных системах. В то же время ясно видно, что органические растворители обладают в существенной степени различной способностью индуцировать вторичную структуру в апо-цитохромес.

Как уже отмечалось выше, денатурирующее действие различных спиртов на нативные белки описывается единой зависимостью в случае, когда доля денатурированных молекул белка откладывается как функция диэлектрической постоянной водно-спиртовой смеси. Чтобы проверить, верно ли это в случае структурирующего действия спиртов, полученные для апо-цитохрома с данные были пересчитаны, и результат приведен на рис.бБ в виде зависимостей молярной эллиптичности [в] 220 от диэлектрической постоянной смеси. Видно, что структурирую-

Содержание органической Диэлектрическая постоянная

компоненты (об.%)

Рис.6. Изменение эллиптичности апо-цитохрома с на длине волны 220 нм в зависимости от содержания органической компоненты в растворе (А) и диэлектрической постоянной (Б) для разных растворителей: • . метанол, ■ - этанол, А - изопропанол, » - трет-бутанол, ^ - трифторэтанол, о - диоксан, ° - ацетон, о - тетрагидрофуран, л . ацетонитрил.

щее действие спиртов на развернутую полипептидную цепь также определяется в основном их диэлектрической постоянной, о чем свидетельствует тот факт, что изменения [0]г2о Д™ всех четырех незамещенных спиртов описываются единой зависимостью в области значений диэлектрической постоянной от 80 до ~50. Следует отметить, что теоретическая оценка величины диэлектрической проницаемости воды вблизи органической поверхности дает интервал величин между 80 < е < 40, причем диэлектрическая проницаемость воды будет уменьшаться по мере приближения к органической поверхности. Это означает, что индуцируемое спиртами образование вторичной структуры в апоцитохроме с определяется в первую очередь понижением диэлектрической проницаемости растворителя, в то время как в случае других рассмотренных органических растворителей значительную роль шрает и прямое взаимодействие между растворителем и молекулой белка. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что водно-спиртовые смеси могут служить адекватной моделью для исследования влияния диэлектрической проницаемости на процесс образования и/или стабилизации спиральной структуры в белках.

Гидродинамические размеры апоцитохрома с в спиральном состоянии были оценены при помощи вискозиметрии. В таблице 2 представлены значения характеристической вязкости для апо- и холо-цитохрома с в разных конформацион-ных состояниях. Видно, что грубая оценка величины [г]] апо-цитохрома с в 40% третичного бутилового спирта близка к значению [г]] данного белка в воде, по-

лучеппому экстраполяцией к бесконечной ионной силе при рН 2.0, то есть к размерам апо-цитохрома с в 6-растворителе. Таким образом, размеры белка в ин-

Таблица 2. Гидродинамические размеры холо- и апо-цитохрома с в в различных «информационных состояниях

Белок условия Конформационное состояние Характеристическая вязкость, [ц], см3/г

Холо-цитохром с: 0.5 М №С1, рН 4.0 Нативное 2.5

Холо-цитохром с: 0.5 М №С1, рН 2.0 Расплавленная глобула 2.5

Холо-цитохром с: рН 2.0 Развернутое 11.0

Апо-цитохром с: рН 4.0 Развернутое 15.6

Аио-цитохром с: рН 2.0, бесконечная ионная сила в-точка 11.0a

Апо-цитохром с: рН 4.0, 40% третичного бутилового спирта Спиральное (9.0)6

а Величина характеристической вязкости апоцитохрома с, экстраполированная к бесконечной ионной силе раствора.

6 Грубая оценка, основанная на величине r¡r= 11.0 и с = 2.0 мг/мл.

дуцируемом спиртами спиральном состоянии меньше, чем размеры неупорядоченного клубка в водном растворе, но при этом молекула апо-цитохрома с в данном состоянии остается в существенной степени некомпактной. На рис.7 представлены спектры дальнего КД холо-цитохрома с в этих условиях и апо-цитохрома с в 40% третичного бутилового спирта. Спектры КД в дальней УФ области обоих белков в отсутствие спирта также приведены для сравнения. Видно, что спектры ano- и холо-цитохрома с, будучи совершенно различными в водном растворе, приобретают сходный вид в водно-спиртовых смесях. Это позволяет предположить, что апо-цитохром с, полностью развернутый в водном растворе, и холо-цитохром с, имеющий нативную структуру в воде, приобретают в присутст-

и

вии спирта сходную вторичную структуру. Аналогичный результат был получен для двух данных белков в присутствии фосфолипидных везикул (с1е е1 а1, 1992). В то же время компактность обоих форм белка в водно-спиртовых смесях существенно отличается, что может быть связано с различием их функциональной роли в клетке.

Рстинол-связывающий белок. Белки могут испытывать воздействие мембран не только при связывании с ними, но и при переносе различных лигапдов к соответствующим клеткам. Ряд транспортных белков (например, ретинол-связывающий белок, р-лактоглобулин и бшшн-связывающий белок) принадлежит к структурному классу восьмичленных (3-цилиндров с антнпараллельной укладкой Р-структурных участков. Наиболее изучен из пих ретинол-связывающий белок плазмы крови (РСБ), переносящий витамин А из клеток печени к соответствующим тканям. При этом ретинол может быть передан как рецептору на поверхности клетки, так и прямо на мембрану или липосому. Со структурной точки зрения ретинол плотно упакован внутри белковой молекулы и удерживается там ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями с боковыми гидрофобными группами белка.

Исследование рН-зависимой денатурации белка (ВусЬкоуа й а!., 1995) показало, что при понижении рН до 2.0 происходит денатурация РСБ в состояние расплавленной глобулы, сопровождающаяся выходом ретинола. Мы исследовали влияние метанола на данные процессы при различных значениях рН. На рис. 8 представлены спектры КД апо- и холо-форм РСБ в дальней УФ области в отсутствие метанола и при различных концентрациях метанола при рН 8.5. Необычный для р-структурного белка вид спектров дальнего КД объясняется влиянием ароматических боковых 1рупп и в-Б-связей, поэтому в данном частном случае изме-

Длина волны (нм)

Рис.8. Спектры КД в дальней УФ области холо-РСБ (А) и апо-РСБ (Б) при рН 8.5 и различных кон-цешрациях метаыола, указанных вдфрами около кривых.

нение спектров в дальней УФ области отражает денатурацию белка. Для тестирования процесса выхода ретинола из белка использовались спектры ближнего КД и флуоресценции. На рис.9 в относительных единицах представлено сравнение переходов, отражающих денатурацию РСБ и выход ретинола в зависимости от концентрации метанола, при рН 8.5 с Концентрация метанола, % аналогичными зависи-

Рис.9. Переходы в РСБ (в относительных единицах) в зависи- мостями при рН3.5. мости от содержания метанола при рП 3.5 и рН 8.5, наблюдаемые

разными методами. Обозначения: выход ретинола, тестируемый Видно, ЧТО совместное

по полосе 325 нм спектра ближнего КД: рН 3.5 - ■ ; рН 8.5 - • ; ЙСПШе н „ ме1анола денатурация RBP, тестируемая по полосе 224 нм спектра дальнего

КД: рН 3.5 - V ; рН 8.5 - * ; денатурация ano-RBP: на 280 нм - <s (понижение диэлектри-

на224нм-П-

«м

S О

к

Цн

ческой проницаемости при умеренно низком рН) позволяет добиться выхода ретинола и денатурации РСБ в "мягких" денатурирующих условиях как относительно величины рН, так и в шкале концентраций метанола.

Мы исследовали зависимости выхода ретинола и денатурации РСБ от концентрации метанола при различных значениях рН (2.0, 3.5, 4.0 и 8.5) и рН-зависимые выход ретинола и денатурацию РСБ при разном содержании метанола (0, 30 и 40%). Результаты представлены на рис.10 в виде фазовой диаграммы, на которой сведены значения рН и концентрации метанола, при которых наблюдается выход ретинола и денатурация РСБ. Две пунктирные линии на фазовой диаграмме ограничивают область перехода, внутри которой происходят тестируемый по [0]з25 выход ретинола из РСБ и наблюдаемая по [9]224 денатурация белка. Таким образом, они служат границей между двумя состояниями белка - нативным холо-РСБ и денатурированным апо-РСБ. Открытыми символами на диаграмме обозначены экспериментально полученные минимальные денатурирующие условия (в терминах значений рН и концентраций метанола), в которых процессы выхода ретинола и денатурации РСБ полностью закончились. Заштрихованный круг указывает положение на фазовой диаграмме состояния расплавленной глобулы РСБ, реализующегося при кислых рН в отсутствие метанола.

Конформационные состояния РСБ в условиях, которые вызывают выход ретинола, могут быть оценены путем сравнения их свойств со свойствами состояния расплавленной глобулы, вызываемого кислой денатурацией РСБ в водных растворах. На рис.11 сопоставлены спектры дальнего КД ретинол-связывающего

S

о «

40

20

Денатурированный апо-РСБ

СХ-^

-а

ле9

А° / /О /

Р/

! / / / \I-X-

3 4

Нативный холо-РСБ

42.8 47.3 51.7 56.2 60.6 65.1 69.5 74.0

5

рН

а а

Рис. 10. Диаграмма состояний ЫЗР в зависимости от рН и концентрации метанола при 37°С. На вспомогательной оси указаны соответствующие разным концентрациям спирта значения диэлектрической проницаемости раствора е^. Подробное описание рисунка дано в тексте.

О

6

8

белка, денатурированного метанолом при рН 8.5 (55% метанола) и совместным действием умеренно кислых рН (3.5) и умеренной концентрации метанола (16%), со спектром рН-индуцированного состояния расплавленной глобулы РСБ (рН2.0 в отсутствие метанола), о котором говорилось ранее. На рисунке приведен

также спектр дальнего Рис. 11. Спектры РСБ в дальней УФ облает в различных условиях после выхода ретинола (условия указанны около кривых). КД нативной ало-формы Спектр нативного апо-РСБ приведен для сравнения пунктиром.

РСБ. Спектры КД в ближней УФ-области для всех денатурированных форм практически исчезают.

Данные по оцепке компактности молекул РСБ в присутствии метанола приведены в таблице 3, откуда следует, что молекулы РСБ в промежуточном состоянии достаточно компактны.

Таблица 5.1. Деполяризация триптофановой флуоресценции РСБ в различных состояниях

Состояние Условия 1/Р

Нативное рН 7.5; 5 мМ Na-фосфата, 0% метанола 12.8

Расплавленная глобула рН 2.0; 5 мМ Na-фосфата, 0% метанола 15.6

Промежуточное (совместное действие низкого рН и метанола) рН 3.3-3.5; 5 MMNa-фосфата, 19% метанола 12.3-12.9

Развернутое рН 7.0; 6М ГГХ 36.8

Длина волны (нм)

Исследование денатурации РСБ и освобождения ретинола в зависимости от рН и содержания метанола показало, что можно получить выход ретинола в мягких денатурирующих условиях (рН 3.5-5.0 и содержание метанола 20-40%, что равносильно понижению диэлектрической постоянной до 65-55). Свойства молекулы РСБ сразу после освобождения ретинола в различных условиях обнаруживают удивительное сходство между собой и свойствами состояния расплавленной глобулы, полученного в водной среде при рН 2.0.

Таким образом, ретинол может быть освобожден из своего белка-носителя РСБ при совместном действии умеренно низких рН и значений диэлектрической проницаемости, т.е. в умеренно денатурирующих условиях. Это означает, что впервые удалось смоделировать функцию РСБ - передачу ретинола - в простой искусственной системе (водно-органические смеси при умеренно низких рН). Показано также, что белок после выхода ретинола трансформируется в. состояние, сходное с расплавленной глобулой.

Имея в виду структурное сходство белков семейства РСБ и способ связывания ими лигандов, можно предположить, что механизм освобождения ретинола из РСБ может иметь общие черты с освобождением лигандов другими белками этого семейства.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что совместное действие умеренно низких значений рН и диэлектрической проницаемости среды вызывает денатурацию цитохрома с, переводя его в состояное расплавленной глобулы.

2. Ретинол-связывающий белок в мягких денатурирующих условиях (в области умеренно низких значений рН и диэлектрической проницаемости среды) способен осуществлять свою функцию - отдачу гидрофобного лиганда. Белок при этом переходит из нативного состояния в состояние расплавленной глобулы.

3. Совместное действие умеренно низких значений рН и диэлектрической проницаемости среды переводит неупорядочевую цепь апоцитохрома с в а-

спиральное не глобулярное состояние, сходное по свойствам с состоянием этого белка, компетентным к транслокации через мембрану.

Все вышеизложенное позволяет предположить, что действие мембранной поверхности (денатурирующей нативные белки и частично сворачивающей развернутый цитохром с) на белки в клетке заключается в совместном действии двух факторов: локального понижения рН и диэлектрической проницаемости среды у поверхности мембраны.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах: Статьи в отечественных журналах:

Дюйсекина А.Е., Бычкова В.Е., Фантуцци А., Росси Дж.-Л., Птицын О.Б. (1998) Молекулярная биология 32.133-140. «Освобождение гидрофобного лиганда из ретинол-связывающего белка в условиях, моделирующих поле мембраны».

Статьи в международных журналах.

1. Bychkova V.E., Dujsekina А.Е., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. (1996) Biochemistry 35, 6058-6063. «Molten globule-like state of cytochrome с under conditions simulating those near the membrane surface».

2. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Rossi G.-L., Fantuzzi, A., Uversky V.N., Tiktopulo E.I., Klenin S.I. (1997) Protein Engineering 10 (suppl.), 32. «Modeling of the molten globule state of proteins near membranes».

3. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Fantuzzi, A, Ptitsyn O.B., Rossi G.-L. (1998) Folding and Design 3, «Release of retinol and denaturation of its plasma carrier, retinol-binding protein».

Тезисы международных конференций:

1. Bychkova V.E., Fantuzzi, A., Rossi G.-L., Dujsekina A.E., Ptitsyn O.B. «Denaturation of retinol-binding protein and release of retinol». ХХШ FEBS meeting, abstracts. Basel, Switzerland. 1995. p.171.

2. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. «An equilibrium intermediate of cytochrome с under conditions simulating those near negatively charged membrane surfaces». Principles of protein architecture. П Workshop, abstracts. Tokyo. 1995. p.80.

3. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Dujsekina AJE., Rossi G.-L., Fantuzzi A., Uversky V.N., Tiktopulo E.I., Klenin S.I. «Modeling of the molten globule state of proteins near membranes». Advances in gene technology: biomolecular design, form and function. Miami nature biotechnology winter symposium. Abstracts. Ft.Lauderdale, Florida, USA. 1997. p.32.

4. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. «Molten globule-like state of cytochrome с under conditions wich may mimic

those occuring near membrane surfaces». Protein folding, modification and transport in the early secretory pathway. Keystone symposia on molecular and cellular biology. Abstracts. New Mexico, USA. 1997. p.18.

5. Dujsekina A.E., Bychkova V.E., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. «Folding of apo-cytochrome c under conditions simulationg those near membrane sufàce». International Symposium on Protein Strusture, Stability and Folding: Fundamental and Medical Aspects. Abstracts. Moscow, Russia. 1998. p.32.

Отпечатано АОЗТ

29.07.98 Тираж 100 экз. Заказ № 00431