Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексная оценка безопасности продукции и почвы рисовых полей Вьетнама

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Комплексная оценка безопасности продукции и почвы рисовых полей Вьетнама"

005060119

На правах рукописи

Май Тху Лан

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРОДУКЦИИ И ПОЧВЫ РИСОВЫХ ПОЛЕЙ ВЬЕТНАМА

Специальность 03.02.08 - экология (биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г з 2013

Владимир - 2013

005060119

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств».

Научные руководители:

кандидат технических наук доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, ГНУ Владимирский НИИСХ Россельхозакадемии, заведующий отделом агрофизики почвы

доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии

сельскохозяйственных наук, заведующий лабораторией ветеринарно-санитарной

экспертизы мяса, рыбы и других пищевых продуктов

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева

Защита состоится « /3 » ^НУИ^х 2013 г. в «-/■/ » часов на заседании диссертационного совета Д 212.025.07 во Владимирском государственном университете имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых по адресу: 600000, г. Владимир, ул. Горького, 87, корп. 1, ауд. 335.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых».

Автореферат разослан «03 » НбА/ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Черемных Елена Григорьевна Воронина Людмила Петровна

Зинченко Сергей Иванович

Долгов Виктор Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Рис для Вьетнама является основным продуктом питания, также он экспортируется во многие другие страны, в том числе и Россию. Поэтому очень важно иметь объективную оценку степени безопасности этого продукта, которая может быть получена из химических, биологических исследований и анализа современной экологической ситуации во Вьетнаме.

На фоне загрязнения диоксинами и разнообразными продуктами их трансформации во Вьетнаме используют разнообразные пестициды и регуляторы роста растений, которые могут модифицироваться и вступать в различные физико-химические взаимодействия. При среднегодовых температурах до +22 - +25°С и около 200 солнечных дней в году эти процессы проходят очень интенсивно. Еше больший вклад в преобразование таких компонентов вносят метаболические процессы почвенной биоты.

С одной стороны эти процессы приводят к детоксикации и очищению почв, но в некоторых случаях в результате метаболических процессов чужеродных соединений в микроорганизмах могут синтезироваться еше более опасные соединения, нежели исходные.

В связи с возможными разнообразными метаболитами, как диоксинов, так и используемых пестицидов на рисовых полях не представляется возможным оценить реальную картину загрязнений почв и опасности выращиваемой продукции с помощью лишь химико-аналитических методов. Поэтому для получения объективной оценки экологической ситуации во Вьетнаме необходимо использовать комплекс методов с использованием биотестирования, позволяющего экспрессно оценить всю совокупность токсических соединений как гидрофильных, так и гидрофобных.

Цель работы

Комплексная оценка безопасности продукции и почвы рисовых полей Вьетнама методами биотестирования и хроматомасс-спектрометрией.

Основные задачи исследования:

— модификация метода биотестирования, состоящая в оптимизации культивирования простейших для получения рабочей культуры со стабильной чувствительностью, а также разработка способа оптимальной подготовки проб почвы и риса;

— определение чувствительности тест-организмов к некоторым пестицидам и их комбинациям;

— сравнение образцов почвы со слабой средней и высокой токсичностью с результатами хроматомасс-спектрометрии для оценки адекватности биотестирования;

— проведение экологической оценю! образцов почвы на трех биотестах;

— анализ качества продукции рисовых агроценозов автоматизированным методом

(БиоЛаТ) на инфузориях Tetrahymena pyriformis;

- создание проекта рабочей методики биотестирования для оценки безопасности продукции рисовых агроценозов.

Научная новизна работы

Впервые на территории Вьетнама ранжированы агроценозы с учетом химической нагрузки пестицидами и проведен анализ токсичности почвы и продукции рисовых полей с помощью автоматизированного биотестирования на инфузориях Tetrahymena pyriformis.

Для получения объективной оценки степени безопасности продукции агроценозов установлен и теоретически обоснован комплекс методов, состоящий из трех биотестов - на Tetrahymena pyriformis, Daphnia magna Straus, Raphanus surivus, и хроматомасс-спектрометрии.

Разработаны научные основы для методических работ по биотестированию, позволяющие увеличить стабильность и чувствительность культуры Tetrahymena pyriformis.

Выявлена специфика оценки токсичности с учетом совокупного действия на тест-организмы Tetrahymena pyriformis гидрофильных и гидрофобных ксенобиотиков.

Практическая значимость работы

Разработанный комплексный метод позволяет быстро и воспроизводимо определять степень безопасности растительного сырья и уровень загрязнения почв селькохозяйственных полей. Биологическая оценка с использованием трех биотестов - на инфузориях, дафниях и семенах редиса представляется экспрессной, достоверной и не требует дорогах расходных материалов. Разработан новый способ экстракции из почв жирорастворимых соединений с помощью комплексного экстрагента, состоящего из ацетона и раствора желчи в этаноле, позволяющий повысить достоверность исследований.

Личный вклад автора

Все этапы работы были проведены лично автором или при его непосредственном участии: отбор и биотестирование на инфузориях Tetrahymena pyriformis образцов риса и почв, а также обработка полученных результатов.

Апробация работы

Основные положения и результаты диссертационного исследования докладывались и прошли апробацию на конференциях «Современные проблемы биомониторинга и биоиндикации» (Киров, 2010), «Физическая химия - Теория, эксперимент, практика» (Коломна, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (Москва, 2011). «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 4 статьей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.

Благодарности

Я глубоко признательна научным руководителям к.т.н., Е.Г. Черемных и д.б.н. Л.П. Ворониной за неоценимую помощь в проведении работы, поддержку и советы. Особую благодарность выражаю д.х.н. Е.С. Бродскому, к.х.н. A.C. Баранову и к.б.н. Т.О. Попутниковои за помощь в выполнении аналитических исследований и биотестировании.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 110 страницах, содержит 22 таблицы и 56 рисунков. Список литературы включает 148 наименований, из них 80 зарубежных.

Защищаемые положения:

1. Комплексная оценка объективно отражает загрязнение агроценозов поллютантами.

2. Модификация способа культивирования простейших позволяет повысить их чувствительность.

3. Применение разработанного способа пробоподготовки почвенных образцов для биотеста на инфузориях повышает информативность результатов биотестирования и позволяет оценивать не только водорастворимые поллютанты, но и гидрофобные соединения, к которым принадлежит большинство используемых во Вьетнаме пестицидов.

4. Автоматизированное биотестирование на инфузориях может быть основой экологического мониторинга состояния почв и продукции рисовых агроценозов, т.к. характеризуется экспрессностью, объективностью и технологичностью.

5. Результаты комплексного биологического исследования на трех тест-организмах, принадлежащих к разным таксонам, объективно отражают загрязнение агроценозов пестицидами и другими антропогенными поллютантами (ПАУ, алканы).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

1. Район, материалы, объекты и методы исследования

Район исследования. Пробы были отобраны на полях 11 районов Вьетнама в период 2010-2012гг. В таблице 1 и на рисунке 1 указаны районы отбора проб на сельскохозяйственных полях, а также используемые пестициды на этих полях.

Таблица 1

Пестициды, используемые на полях отбора проб почвы и риса

№ пробы Район отбора проб Коммерческие названия используемых пестицидов Активные вещества используемых пестицидов

1 Бинь Динь - Тйи фыок - Винь Тхань Mullai 100WG Bensulfuron methyl 100г./кг

2 Куанг Нам - Куе Шон - Куе Фу Vitrako 40WG Chlorantraniliprole 200г/кг и Thiamethoxam 200г/кг

3 Тхань Хоа - Ха Чунг - Ха Лонг Trione 750WDG Kamsu 2SL Dantac 500SP Sachray 200wp Afumin 400WP Tricyclazole: 750 г/кг Kasugamycin 2%, Cartap(97%), Acetamiprid 70г/кг + Imidacloprid 130г/кг, Iprobenfos 10г/кг+ Isoprothiolane 390 г/кг

4 Тхань Хоа - Ха Чунг - Ха Занг Prevathon 5SC Annongaplau 100WP Abatimec 1.8 Chlorantraniliprole (min 93%) Buprofezin (min 98 %) Abamectin 1.8%

5 Бинь Зыонг - Тан Хйеп - Там Ной Apphe 66EC Alpha-cypermethrin 1.6% + Chlorpyrifos Ethyl 65 %

6 Нинь Тхуан - Нинь Шон - Лыонг Шон Daphavil 50SC Motox 5 ЕС Viben-C 50BTN Victory 585EC Kisaigon 50DN Carbendazim (min 98%), Alpha Cypermethrin 5%, Chlorpyrifos ethyl ,Benomyl 25%+Copper oxychlorid 25%, Chlorpyrifos ethyl 530g/l+cypermethrin 55g/l, Iprobenfos 50%

7 Куанг Бинь -Донг Хой-Дык Нинь -Тан Шон Sutin 5ec Validan 3dd Acetaminprid 3%(r/,T)+Imidac1oprid 2% (г/л), Validamycin А: 3%

8 Бак Лйеу - Фылк Лонг - Фонг Тхак -Таи А Annong Manco 300SC Viben-C 50BTN, Hinosan 30EC Mancozeb(min 85%) Benomyl 25%+Copper oxychlorid 25% Edifenphos 30%

9 Бинь Фыок - Хон Куанг -Ан Хыонг Nativo 750WG Bassa 50EC Trifloxystrobin 250г/л+ТеЬисопаго1е 500г/л Penobucarb 50%

10 Хо Ши Минь - Кы Чи - Фу Чунг - Фук Лой Lorsban 30EC, Wavesuper 15SC Chlorpyrifos ethyl 30% Indoxacarb 150 г/л

11 Куан Чи -Винь Линь -ХоСа Ammate 150 SC Indoxacarb 150г/л

Объекты исследования - пробы почвы и риса с участков частных фермеров 11 районов Вьетнама.

Предмет исследования - особенность экологического состояния почв в контексте безопасности продукции сельскохозяйственных полей при регулярной неконтролируемой пестицидной нагрузке.

Методы исследования. В диссертации использовали следующие методы:

- Метод биотестнрования на инфузориях с помощью прибора «БиоЛаТ 3». Принцип работы этого прибора состоит в программной обработке изображения лунок с инфузориями и пробами, для подсчета живых тест-организмов (Методические рекомендации «Автоматизированный методоиенки токсичности продовольственного сырья и кормов, объектов окружающей среды на инфузориях Paramecium caudatitm, Tetrahymena piriformis»

утв. РАСХН. 2009г).

- Метод биотестпрования на дафниях. Исследование на дафниях проводили по методике биотестирования по гибели ракообразных Daplmia magna Slraus (ПНД ФТ14.1:2:4.12-06). В соответствии с этой методикой устанавливается различие между количеством погибших дафний в пробе и контроле (культивационной воде).

- Метод фитотестирования. Использование этого метода для определения суммарной токсичности. Фитотест основан на высокой отзывчивости семян редиса и ячменя на токсические вещества. Расчет ведется путем учета снижения длины корней проростков семян в растворах препаратов вытяжек из анализируемых образцов почвы по сравнению с контролем, выраженное в процентах (Практикум по агрохимии. Уч. пособие -2изд, под ред. Ак.РАСХН В.Г. Минеева из-во МГУ, 2001).

- Хромато-масс-спектрометрия. Анализ экстрактов проводили на хромато-масс-спектрометрической системы Polaris Q (ThermoFinnigan) в режиме деления потока 1:20. Условия анализа: кварцевая капиллярная колонка 30 м х 0,25 мм с неподвижной фазой SGE ВРХ-5 (слой 0,25 мкм), программирование температуры от 60°С (выдержка 2 мин) до 300°С со скоростью 10°С/мин (выдержка 6 мин), температура инжектора 240°С, интерфейса - 240°С. ионизация электронным ударом при энергии электронов 70 эВ, в режиме сканирования полного масс-спектра в интервале 41-550 а.е.м. Газ-носитель Не 0,8 мл/мнн. Идентификацию производили по характеристическим ионам и временам удерживания, оценку содержания компонентов — по методу внутреннего стандарта.

- Для обработки результатов биотестпрования использованы статистические методы в соответствии с «Руководство по определению методом биотестпрования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов» РЭФИА, НИА-Природа Москва-2002.

2. Результаты исследования и обсуждение 2.1 Оптимизация культивирования инфузорий Tetrahymenapyriformis

Стабильная чувствительность тест-организмов для биотестирования имеет важнейшее значение, кроме того, технология получения тест-организмов должна быть простой и воспроизводимой в широкой практике. Основные факторы, влияющие на метаболизм простейших и их чувствительность к поллютантам это - температурные условия, фаза развития культуры и пищевой рацион.

Выбраны следующие условия культивироваши:

- Температурные условия: 25СС;

- Фаза развития культуры: фаза роста культуры;

— Пищевой рацион: 4-х компонентная среда, в которой на 100мл дистиллированной воды вносят пептона (от 0,1 до 4г). глюкозы (0,5г). дрожжевого экстракта (0,1 г) и №С1 (0,1 г).

Вместо пептона мы использовали панкреатический гидролизат казеина (триптон), его оптимальную концентрацию находили опытным путем, культивируя инфузорий на среде с 0; 0,01; 0,1; 0,5; 1,0; 2.0 и 4% этого компонента среды. Кривые роста культуры в течение 8 суток на средах с разной концентрацией гидролизата казеина показаны на рис.2.

-Ог/1 ООмл -1 г/1 ООмл

-0.01 г/1 ООмл —2г/1 ООмл

~0,1 г/1 ООмл -Дг/1 ООмл

0,5г/100мл

Рис. 2. Изменение количества клеток ТеггаНутепа руп/оти при культивировании в среде с разными концентрациями триптона

Для регулярного обеспечения исследований тест-организмами со стабильной чувствительностью хранили маточную культуру в холодильнике при температуре +Ю°С. Рабочую культуру получали на 3-5 сутки после пересева из маточной культуры и культивирования в термостате при температуре +25°С.

Чувствительность инфузорий, культивированных в среде с разной концентрацией пептона, оценивали по их реакции на растворы сульфата меди после культивирования в термостате через 3, 4 и 5 суток. После отмывания водой инфузорий ТеггаНутепа руп/огтй, выращенных на средах с разной концентрацией триптона помещали их в лунки планшета прибора БиоЛаТ (около 100 клеток в лунку), добавляли ЗООмкл раствора сульфата меди в концентрации 0,0001 и 0.00005 мг/мл. Через 24 часа оценивали суточные относительные коэффициенты роста по сравнению с коэффициентом роста в дистиллированной воде:

тн— К-пробы / КводЫ _ ГД£. КВОды — 2,42

Таблица 2

Коэффициенты суточного роста инфузорий в растворах сульфата меди, при культивировании их в средах с разными концентрациями пептона

Концентрация Си804 0,0001мг/мл

Концентрации Возраст культуры, сутки ср.кв.откл.,

триптона, % 3 4 5 & КОТп

0 0 0.22 0 0.127017

0,1 0 0.27 0 0,155885

0,5 0,43 0,47 0,44 0,020817

1 0,48 0.55 0.64 0,080208

2 0,55 0,56 0.68 0,072342

4 0 0,12 0 0,069282

Концентрация СивО^ 0,00005мг/мл

Концентрация триптона, % Возраст культуры, сутки ср.кв.откл., 5 К,мм

3 4 5

0 0,39 0,18 0,18 0,121244

0,1 0,51 0,37 0,37 0,080829

0,5 0,78 0,76 0,76 0,011547

1 0.8 0,86 0,86 0.034641

2 0,84 0,80 0,85 0,057741

4 0.23 0,35 0,35 0.069282

Очевидно, что в среде с концентрацией триптона 0,5% чувствительность 3, 4, и 5 суточных инфузорий наиболее близкая, т.к. относительные коэффициенты роста в растворах сульфата меди в этих разновозрастных тест-организмов имеют наименьшее среднее квадратичное отклонение.

Прием пересадки культуры из маточной, хранимой в холодильнике, стабильная температура культивирования (+25°С) рабочей культуры, искусственная среда с концентрацией триптона 0,5% позволяют иметь культуру со стабильной чувствительностью каждый день.

2.2 Чувствительность инфузорий к некоторым пестицидам и их комбинациям

Для оценю! чувствительности Тагакутепа руг1/огт:$ к пестицидам были исследованы следующие пестициды: циперметрин(1) (ПДК 0,02мг/кг), диметоат(2) (ПДК 0,1мг/кг), диазинон(З) (ПДК 0,1мг/кг), у-ГХЦГ(4) (ПДК 0,1мг/кг), имидаклоприд(5) (ПДК 0,1мг/кг), 4,4 ДЦТ(6) (ПДК 0,1 мг/кг), и глифосат(7) (ПДК 0,5мг/кг). Пестициды 1-6 являются гидрофобными соединениям», растворимыми в ацетоне, а глифосат хорошо растворим в воде. Пестициды 1-6 были отдельно растворены в ацетоне с концентрацией по пестициду 2% в каждом растворе. 5мл каждого раствора разбавлены 5мл раствора желчи в этаноле (комплексный растворитель). Затем 0,2мл каждого раствора введены в 10мл дистиллированной воды, эти растворы, их разведения, кратные 10 и комбинации пестицидов в растворах оценивали в опыте на инфузориях. При этом в каждой комбинации пестицидов начальная суммарная их концентрация составляла 1%, а в кратные разведения водой добавляли комплексный растворитель до 2%. Глифосат растворяли в воде в разных концентрациях. Коэффициенты суточного роста показаны в таблице 3. Контроль для водно-ацетоновых растворов пестицидов — 2% раствор комплексного растворителя в дистиллированной воде и коэффициент суточного роста инфузорий в этом растворе: Кг,гп1=

2,28±0,105, а для глифосата контроль - дистиллированная вода (КВОд.=2,43+0,064).

Растворы отдельных пестицидов 1, 2, 4, 6 в концентрации пестицида 0,2мг/л вызывают рост клеток выше, чем в контроле. А пестицид 6 (4,4-ДДТ) оказывает такое же действие и в концентрации 0,02мг/л. Такая стимуляция метаболизма клеток малыми дозами токсикантов является закономерной и характеризует индуцированный синтез ферментов, участвующих в метаболизме гидрофобных соединений. Для большинства комбинаций из двух пестицидов коэффициент роста культуры при концентрации токсикантов 0,2мг/л меньше, чем в контроле, эффект стимуляции метаболизм наблюдается только для сочетаний: диметоат - у-ГХЦГ и у-ГХЦГ—имидаклоприд. Комбинация из шести гидрофобных пестицидов является гораздо более токсичной, чем комбинации пар и отдельных пестицидов. Скорее всего, имеет место синергическое действие этих токсикантов. Глифосат в концентрации 0,2мг/л вызывает снижение роста культуры (68% от контроля), а в концентрации 0,02мг/л снижение незначительное - 89% от контроля.

Таблица 3

Коэффициенты суточного роста инфузорий в растворах пестицидов

Растворы пестицидов Разведения проб

1:10 | 1:100 | 1:1000 | 1:10000

Концентрация пестицида в пробе

20мг/л 2мг/л 0.2мг/л 0,02мг/л

циперметрин (1) 1.25+0.074 2.06±0.01 3.5±0,088 2,23±0,024

диметоат (2) 0,83+0,091 2,18+0,009 3,65+0,031 2,34+0,09

диазинон (3) 0,63+0,039 1.7+0,024 2,23+0,048 2,33+0,043

у-ГХЦГ (4) 1,27+0,011 2,29+0,053 2,48+0,11 2,24+0,047

имидаклоприд (5) 0,95+0,08 2,17+0,081 2.37+0,072 2,28+0.065

4,4 ДДТ (6) 0,83±0,076 2,35+0,045 2,9+0.034 2,84+0,081

(1 )+(2) 0,24+0,003 1,03+0,08 1.75+0.006 2,23+0.005

(1)+(3) 0 0 0.98+0.011 2,14+0,073

П)+(4) 0,46+0,012 1,08+0,03 1.62+0.033 2,31+0,055

(1 )+(5) 0.67+0,008 1.54+0,062 1,94+0.09 2,29±0,012

(1)+(6) 0.68+0.073 1,02±0.09 1,86±0,024 2.44±0,04

(2)+(3) 0.11+0.01 0 1.37+0.07 1,78+0,061

Г2)+(4) 0 2,01+0,093 2,38±0,082 2,29±0,033

(2)+(5) 0 1,84+0,044 2,15+0,061 2,19±0,018

(2)+(6) 0,13±0,009 0,19+0,74 1,62+0,09 2,41+0,06

(3)+(4) 0 0 1,74+0,035 2,09+0,017

(3)+(5) 0 0 1.68+0.061 2±0,01

(3)+(6) 0 0 1,42+0.07 2,11+0,043

(4)+(5) 0,77+0,018 1,21+0,095 2.36+0.042 2,45+0.022

(4)+(6) 0,69+0,025 1,93±0,042 2.12+0.081 2.28+0.08

(5)+(6) 0,25+0,007 1,17+0,052 1,59+0,084 2,46+0,035

(1)+(2)+(3)+(4)+С5)+(6) 0 0 0,83±0,007 2,07±0,092

глифосат (7) 0 0 1,57+0,023 2,03+0,095

23 Оценка водорастворимых и гидрофобных поллютантов почвы рисовых полей по реакции тест-организмов Tetrahymena pyriformis

23.1 Подготовка проб почвы

Из анализа растворимости активных веществ пестицидов разрешенных во Вьетнаме пестицидов следует что, хорошо растворимых соединений в ацетоне - 78,5%, растворимых в воде - 16,1%, растворимых в других растворителях - 5,4%. Кроме того, в почве и поверхностных водах этой страны обнаруживаются такие гидрофобные пестициды, как ДЦТ, у-ГХЦГ и алдрин, разрешенные до 1998 года. Поэтому для получения объективной картины загрязнения использовали 2 способа подготовки проб почвы — водная экстракция и экстракция комплексным экстрагентом, состоящим из равных количеств ацетона, раствора желчи крупного рогатого скота (КРС) в этаноле и 20% воды (8мл ацетона + 8мл раствора желчи в этаноле + 4мл дист.воды). Получали водные экстракты почвы при соотношении 1:10 (измельченная почва/дистиллированная вода), а экстракты с комплексным экстрагентом при соотношении Юг измельченной почвы на 20мл экстрагента.

Эффективность экстракции из почвы гидрофобных соединений комплексным экстрагентом оценили с помощью хромато-масс-спектрометрической системы Polaris Q, на которой исследовали модельные пробы, содержащие ДДТ и y-ГХЦГ. Модельные пробы готовили на основе образца почвы №1, в которую добавляли по 1мкг указанных пестицидов на 5г измельченной почвы (табл.4). Экстракция предложенным экстрагентом гидрофобных соединений из почвы по отношению к стандартному экстрагенту — дихлорметану составляет для у-ГХЦГ и ДЦТ 88,3% и 71,5%, соответственно.

Таблица 4

Результат аналитического определения пестицидов в модельных пробах

№ модельн ой пробы Экстрагент Y-ГХЦГ ДДТ

Внесено пестицида, мкг/5г почвы Количественн ая оценка, отн.ед. Внесено пестицид , мкг/5г почвы Количестве иная оценка, отн. ед.

1м Дихлорметан 1 0,883+0.004 1 0,283±0.002

2м Комплексный (ацетон + р-р желчи в этаноле) 1 0,685±0,051 1 0.215+0,018

Зм Комплексный (ацетон + р-р желчи в этаноле) 1 0.875±0,064 - -

4м Комплексный (ацетон + р-р желчи в этаноле) - - 1 0,19+0,024

Среднее при экстракции комплексным экстрагентом 0,78 0,203

Эффективность по отношению к пробе с экстрагентом - дихлорметаном (1м) 88,3% 71,5%

Таким образом, эффективность экстракции комплексным экстрагентом на основе ацетона и раствора желчи в этаноле для гидрофобных пестицидов составляет 88,3% для у-ГХЦГ и 71,5% для ДЦТ. Поэтому эти гидрофобные соединения целесообразно оценивать с помощью биотестов, используя в качестве проб растворы в воде экстрактов почв с предлагаемым комплексным экстрагентом.

2.3.2 Биотестирование на инфузориях модельных образцов

Модельные образцы почвы 2м, Зм. 4м были оценены с помощью биотеста на инфузориях ТеггаНутегт руг'фугпйх с экспозицией 24 часа. Первым контролем служил образец почвы №1 (контроль 1) без дополнительного внесения пестицидов, на основе которого получены модельные образцы, а вторым контролем служил комплексный экстрагент (контроль 2). Все образцы почвы экстрагировали в течение 2х часов на шейкере, полученный экстракт разбавляли дистиллированной водой до 1% по растворителю. Результаты показаны на диаграмме рис.3.

Во всех модельных пробах с пестицидами суточный рост клеток меньше, чем в первой и второй контрольных пробах. Разница между пробами и контролем незначительная, но и содержание пестицидов в 1% водном растворе экстрактов также невелико - около 8x104 мг/мл.

Рис. 3. Рост культуры клеток ТеНхЖутепа руг'ф>пт,ч в модельных пробах

Биологическая оценка на инфузориях проб почвы при подготовке проб с помощью комплексного экстрагента позволяет выявить поллютанты нерастворимые в воде. Эти соединения, как правило, не доступны растениям и, соответственно, не могут загрязнять сельскохозяйственную продукцию, но почвенная биота постепенно метаболизирует и такие стойкие поллютанты, превращая их в доступные для растений соединения. Поэтому, оценивая на ннфузориях не только водорастворимые, но и гидрофобные соединения, получаем общую картину загрязнения, доступными и потенциально доступными для растений и человека поллютантами, которые могут аккумулироваться в зерне в последующие вегетационные периоды.

2.3.3 Оценка токсичности 11 образцов почвы на инфузориях ТешИутепа руг'фтшк

Пробы для оценки образцов почвы, отобранной в 2010г с 11 полей в разных районах Вьетнама (табл. 1) готовили в 2х вариантах - в виде водного экстракта (Юг почвы на 100мл воды) и в виде 2% водного раствора комплексного экстракта (8мл ацетона+8мл раствора желчи в этаноле+4мл воды). Экстрагировали 2 часа на шейкере.

Величина коэффициента роста культуры в водном растворе комплексного экстрагента служит контрольной при оценке растворов экстрактов образцов почвы. Контролем для водных экстрактов является коэффициент роста культуры в дистиллированной воде - Ккв.

Показатель токсичности исследуемых образцов определяли по формулам: Т„ол„ = ((К„- Ков )/Ков) 100% (1) Тэгар= ((Ккэ-Ко,)/ Ко ) 100% (2)

Где: Твоял - показатель токсичности образцов почвы при подготовке проб для биотеста с помощью водной экстракции; Тзкстр - показатель токсичности образцов почвы при подготовке проб для биотеста с помощью комплексного экстрагента; К^,- коэффициент роста в дистиллированной воде (контроль 1); Кк,- коэффициент роста в водном растворе комплексного экстрагента (контроль 2); К>в - коэффициент роста в пробе почвы при экстракции водой; Ко» - коэффициент роста в пробе почвы при экстракции комплексным экстрагентом.

Коэффициенты роста в водных пробах 11 образцов почвы и водных растворах комплексных экстрактов представлены на диаграммах рис.4, 5. Горизонтальная линия обозначает уровень коэффициента роста в контроле, для водных экстрактов контролем является суточная экспозиция тест-организмов в воде, а для водных растворов экстрактов комплексным экстрагентом образцов почвы - в водном растворе комплексного экстрагента.

Показатели токсичности, соответствующие водным и комплексным экстрактам, и вычисленные по формулам 1. 2, показаны на диаграммах рис.6, 7.

123456789 10 11

_№ пробы_

Рис. 4. Коэффициент роста культуры ТеНакутепа руп/оптя в водных экстрактах проб почвы рисовых полей Вьетнама

Рис. 5. Коэффициент роста культуры Теткутепа руп$опти в водных растворах комплексных экстрактов почвы рисовых полей Вьетнама

N2 пробы

Рис. 6. Показатель токсичности водных экстрактов образцов почвы

Рис. 7. Показатель токсичности водных растворов комплексных экстрактов образцов

почвы

Критерием токсичности в соответствии с методом на дафниях (ПНД ФТ14.1:2:4.12-06), считается, что при отношении результатов биотеста «проба/контроль» больше или равным 10% исследуемая проба токсична.

Отрицательная токсичность отражает более высокий рост культуры в образцах почвы по сравнению с контролем, для водных экстрактов контроль — дистиллированная вода, для водных растворов комплексных экстрактов контроль — 2% водный раствор комплексного экстр агента.

При сравнении диаграмм рис. 6, 7 водных и растворов комплексных экстрактов обнаружена разница между уровнями токсичности проб 7, 8, 9. Разные уровни токсичности говорят о разных соотношениях гидрофильных и гидрофобных токсикантов, присутствующих в пробах.

2.3.4 Биотестирование на дафниях

Для подтверждения полученных результатов токсичности на инфузориях образцы почвы оценивали с помощью биотестирования на дафниях. Результаты показаны на рис.8.

№ 11 ( > . > I > 1 .1

Рис. 8. Токсичность образцов почвы для дафний

По этому биотесту самым токсичным является образец 6, далее по убыванию токсичности — 8 и 3. Остальные образцы нетоксичны. Поскольку экстракцию почвенных образцов осуществляли только водную, то сравнение с результатами на инфузориях можно проводить по результатам биотеста на инфузориях также на водных пробах. Эти образцы (№6, 8, и 3) оказались самыми токсичными и для инфузорий.

2.3.5 Определение агрохимической характеристики почв и фитотестирование образцов почвы

Результаты фитотестирования зависят не только от токсичных соединений, но и от количества питательных элементов (углерода, фосфора, калия) и рН образцов почвы. Поэтому для учета влияния этих факторов определяли агрохимическую характеристику всех образцов (таблица 5). Анализ результатов почвенной кислотности колеблется в пределах от 4 до 5, т.е. почвы слабо-кислые, причем самое низкое значение рН имеет образец №6 - 3,79. а самое высокое образец №3 - 5.12. Процентное содержание органического углерода самое низкое в образцах №6 и 10 (менее 1,0), а самое высокое в образце №4 - 3,35%, в других значение колеблется от 1,35 до 1,92%. Все образцы с №1 по 7 очень слабо обеспечены подвижным фосфором (менее 5.0мг/) ООг почвы), слабо обеспечены этим элементом образцы 10 и 11 (с 5 — до 10), и очень высокая обеспеченность установлена в образцах 8 (146мг/кг) и 9 (201мг/кг). Результаты суммарной фитотоксичность по ддинне корней тест-культуры редиса представлены в таблице 6.

Таблица 5

Агрохимическая характеристика

№ на карте Агрохимическая характеристика

рН (солев.) С. % Р205, мг/МОг К20, мг/100г

1 3.86 1.92 0,97 48.2

2 4.07 1,58 1,74 29,0

3 5.12 1,71 0.17 30,5

4 4,98 3.35 5.24 49.4

5 4,27 1,37 2.90 32,5

6 3.79 0,76 0,88 15,3

7 3,9 1,35 0.35 41,2

8 4,01 1,62 14,60 34,1

9 4,21 1,45 20,10 113,7

10 3.97 0.73 7,90 76.5

11 4,14 1.68 8.19 64,3

Таблица 6

Интегральная оценка фитотоксичности (% по отношению к контролю) образцов почвы

№ Корень (редис) Корень (ячмень) Колеоптиль (ячмень) Интегральный коэффициент

1 87 100 78 88

2 85 49 86 73

3 68 61 37 56

4 93 93

5 88 100 85 91

6 100 83 100 94

7 82 82

8 85 59 100 81

9 87 87

10 76 67 92 78

11 86 71 73 77

Анализ результатов по фитотестированию с использованием семян редиса

свидетельствует, что изменения в агрохимических показателях не отразились на результатах токсичности, проявляющейся в водных вытяжках анализируемых почвенных образцов. Согласно представленным в таблице результатам образцы по фитотоксичности можно ранжировать следующим образом: 3>2>10-11>8.

Результаты 3-х биотестов почвы оценили с помощью корреляционного анализа. Результаты биотеста на инфузориях (водные экстракты) достаточно хорошо коррелируют (табл.7), а биотест на проростках с биотестом на дафниях и инфузориях имеют отрицательную корреляцию (табл. 7). Наиболее загрязненными почвенными образцами, характеризующимися выраженной фитотоксичностью явились образцы №3, 2 и №10. Эта оценка степени токсичности существенно отличается от результатов биотестирования на дафниях и инфузориях. Это связано с особенностями растительных тест-организмов, для которых некоторые органические поллютанты (в частности, диоксины) присутствующие в пробах почв, могут обладать гормоноподобным стимулирующим действием.

Комплексная оценка почвы с помощью Зх биотестов дифференцированно выявляет образцы токсичные для животных организмов и растительных. Это может служить для дальнейшего выбора растений при ремедитации загрязненных почв.

Таблица 7

Корреляционный анализ результатов Зх биотестов

№ пробы Биотест на инфузориях, коэф. суточного роста (И) Биотест на дафниях, кол-во выживших дафний (Д) Фитотест, длина корня редиса по сравнению с контролем,% (Ф)

1 2.9 9,7 87

2 2,6 9.3 85

3 1.8 7 68

4 2,4 9 93

5 2.3 8 88

6 1,7 3.7 100

7 2.1 9 82

8 1,8 6.7 85

9 2.5 9.3 87

10 2,7 9.3 76

11 2.5 9,3 86

Коэффициент корреляции г(И:Д) = 0,8485 г (Д:Ф) =-0,3177 г (И:Ф) = -0,0376

23.6 Оценка образцов почвы хромато-масс-спектрометрическим методом и анализ результатов биотестирования на разных тест-организмах

Результат хроматомасс-спектрометрии показан в таблице 8.

Таблица 8

Относительное содержание токсических соединений в Зх образцах исследуемых почв

Компонент (мкг/г) Образцы

1 3 4

Фенол 0.02 0,14 <0,01

Фенол-ацетат 0.26 0,12

Бензофенон 0,12 0,62 0,19

Диметилфталат 0,004 0,08 0,01

Диэтилфталат 0,01 0,1 0,04

Диизобутилфталат 0,28 1,45 1,06

Дибутилфталат 0.67 1.91 1.24

Ди (2-этилгексил) фталат 2.85 2.6 0.64

2.6-дитретбутилфенол 0,02 0.53 0,04

Толуол 0.13 0.09 0.06

Этилбензол 0.002 0.01 0,01

М- и п-ксилолы 0,02 0,05 0,04

О-ксилол 0.03 0,02 0,02

Ди- и полиметилбензолы 0,08 0.12 0,13

Стирол <0.002 <0.002 0,004

Нафталин 0,02 0.09 0,03

Метилнафталины 0,1 0,05 0,01

Ди- и пролнметилнафталины 0.003 0.03 0,01

Фенантрен 0,08 0,28 0,07

Антрацен 0,003 0,01 0

Метилфенантрены 0,09 0,2 0,13

Аценафтен 0,03 0,06 0,01

Аценафтилен <0,001 0,58 0,001

Флуорен 0.01 0.13 0.004

Флуорантен 0,05 0,07 0,02

Пирен 0.03 0,05 0,01

Хризен 0,01 0.02 <0.01

Сумма ПАУ, фталатов н фенолов 4.662 9,55 3,899

Пестициды и их метаболиты

•у-гексахлорциклогексан <0.01 0.06 0,21

Гексахлорбензол 0,04 0,16 0,08

Тетрахлорфенол 0.02 0.28 0,03

Трихлорфенол 0.001 0.03 0,01

Дихлорфенол <0,01 0,01 0.01

ддт <0,01 0.01 <0.01

ДДД <0.01 0.03 0,01

ДДЕ 0,01 0,02 0.02

Сумма пестицидов 0,071 0,6 0,37

П-алканы

Н-алканы < С20

СЮ 0.03 0,03

С11 0,04 0,01

С12 0,03 0.01

С13 0.02 0.07 0.02

С14 0,03 0,53 0,1

С15 0.03 0.61 0,07

С1б 0,09 1,46 0,22

С17 0,37 0,45 0,16

С18 0.07 0.69 0,13

С19 0,02 0.09 0,05

С20 0,07 0,41 0,06

Сумма алканов <С20 0,7 4,41 0,86

Н-алканы > С20

С21 0,05 0,28 0,1

С22 0.07 0.23 0,05

С23 0,26 0,31 0,11

С24 0,09 0,15 0,04

С25 0.54 0.48 0,1

С26 0,12 0,2 0,04

С27 0,55 0.81 0,14

С28 0,12 0,17 0,04

С29 0.61 1.16 0,25

СЗО 0,09 0,14 0,03

С31 0,49 0,58 0,25

С32 0.05 0.04 0,04

СЗЗ 0.21 0.28 0.18

С34 0.01 0.01

С35 0,05 0.05

Сумма алканов >С20 3,31 4,83 1,43

Частичные суммы токсических соединений четырех групп использованы для

обобщенного анализа результатов биотестирования. В таблице 9 показаны обобщенные результаты биотестирования и аналитических результатов по 3 образцам почв.

Таблица 9

Результаты биотестирования и аналитического определения токсических соединений в

Зх образцах почв рисовых полей Вьетнама

№ образ ца Биотести рование Хромато-масс-спектрометрия

Инфузории Токсичность, % Дафнии Токсичность, % Фитотест Длина корня, % Сумма ПАУ, относ, ед. Сумма пестицидов, относ, ед Сумма алкано в <С20, относ, ед Сумма алкано в >С20, относ, ед

Водные экстракты Водные растворы комплекс, экстрактов Водные экстракты Водные экстракты

1 -10 -5 3 87 4,660 0,071 0,70 3.31

3 15 10 17 68 9,550 0.610 4,41 4,83

4 10 7 7 93 3,899 0,370 0.86 1.43

По результатам биотестировання на инфузориях и дафниях шкала безопасности

образцов почвы от нетоксичного к токсичному: 1-4-3. Эта шкала коррелирует с содержанием пестицидов. Аналогичная шкала по фитотесту: 4 — 1—3 коррелирует с содержанием ПАУ и алканов.

Таким образом, используя комплекс биотестов на инфузориях и фитотест можно определять суммарную токсичность выделять причины, обуславливающие ингибирующее действие разных групп токсикантов на тест-организмы. Для более детального исследования и понимания причин токсичности выявленных загрязненных участков после биотестирования целесообразно использовать аналитические методы. Таким образом, повышается эффективность оценки токсичности почв и уменьшается себестоимость исследований.

2.4 Биотестирование образцов риса на инфузориях Тей-аЬутепа руп/пгт1$

Для зерновых объектов, таких как рис, содержащих большое количество крахмала и мало липидов, оценить совокупное биологическое действие логично с помощью водных

экстрактов образцов. При подготовке проб концентрация размолотого риса в воде составляет 3%. Для нивелирования разного содержания бедка в образцах (0.4-2%) в пробы добавлен триптон в концентрации 0,1%. Результат показан на диаграмме рис.9. Номера проб риса соответствуют номерам проб почвы.

Рис. 9. Количество клеток в ЮОмкл проб после 8 суток культивирования с добавлением

триптона

По результатам опыта (рис. 10) составить шкалу «Степень безопасности» образцов риса:

Пробы 10,11 Пробы 1,4,3,9 Пробы 2,7,3,8 Проба 6

->

Увеличение токсичности Рис. 10. Шкала токсичности образцов водных экстрактов риса

Максимальный рост культуры инфузорий наблюдается в пробах 1, 4. 5, 9, 10 и 11 (подмножество 1). Минимальный - в образцах 2. 3, 6, 7, 8 (подмножество 2). Таким образом, все образцы зерна можно разбить на 2 группы: с положительным и ингибируюшим действием на клеточный метаболизм. Поскольку кроме токсичных элементов пищевые компоненты зерна являются еще одним фактором, воздействующим на рост культуры, необходимо результаты биотестирования продукции анализировать вместе с результатами биотестирования почв, на которых данная продукция выращена. Тем самым повышается достоверность биотестирования.

Анализ результатов биотестирования образцов риса и почв, на которых рис выращен, показывает, что почвы полей, с которых отобраны образцы 3, 6 и 8 являются наиболее загрязненными, а продукция этих полей может содержать токсические соединения.

2.5 Алгоритмы подготовки проб почвы и риса при комплексном биотестировании

на инфузориях

Способы подготовки проб, изложенные в предыдущих разделах, сформулированы в алгоритмах подготовки проб (рис.11, 12 и 13) и служат основой для создания методики мониторинга агроценозов с помощью биотестирования на инфузориях, а прибор БиоЛаТ позволяет реализовать разработанную технологию исследования.

Измельчение проб почвы на лабораторной мельнице

Просеивание сквозь сито с ячеей 250мкм

Экстрагирование в воде 2 часа на шейкере. Концентрация почвы 1:10

Центрифугирование 20 минут при ЗОООоб/мин

Отделение надосадочной жидкости

Рис. 11. Алгоритм подготовки водных проб почвы рисовых полей Вьетнама.

Измельчение проб почвы на лабораторной мельнице

Просеивание сквозь сито с ячеей 250мкм

Экстрагирование в комбинированном экстрагенте 2 часа на шейкере. Концентрация почвы 1:2

Нагрев проб до 78,3°С в течение 1 минуты

Центрифугирование 20 минут при ЗОООоб/мин

Отделение надосадочной жидкости и разведение в 2% водном растворе комплексного

экстрагента

Рис. 12. Алгоритм подготовки проб почвы с помощью комбинированного экстрагента

Измельчение риса на лабораторной мельнице

Просеивание сквозь сито с ячеей 250мкм

Экстрагирование в воде 2 часа на шейкере с нагревом до 50°С. Концентрация размолотого

вместе с шелухой риса - 3%.

Центрифугирование 20 минут при ЗОООоб/мин

Отделение надосадочной жидкости и добавление 0,1% гидролизата

Рис. 13. Алгоритм подготовки проб риса

ВЫВОДЫ

1. Комплексное биотестнрованне на инфузориях продукции и почвы рисовых полей позволяет получить объективную картину степени загрязнения этих объектов и сделать вывод о характере загрязнения исследованных объектов.

2. Чувствительность инфузорий ТеЛгаЬутспа рхп/опт.ч сопоставима с предельно допустимыми концентрациями пестицидов в почве, а при оценке действия комбинаций препаратов они оказываются более токсичными, чем отдельные пестициды.

3. Результаты исследования на инфузориях Те!га1гутепа руп/огтЫ и дафниях коррелирют между собой и отражают наличие пестицидов в образцах почвы, установленное хроматомасс-спектрометрией. Результаты фитотеста коррелируют с содержанием других групп антропогенных поллютантов (ПАУ и алканы).

4. По результатам биотестирования 11 образцов почвы на трех биотестах проведено ранжирование всех образцов и выявлены три самых загрязненных участка и эти результаты совпадают с пестицидной историей полей.

5. Результаты исследования риса позволили выделить две группы: с положительным и ингибирующим действием на клеточный метаболизм. Эти результаты дополняют экологическую оценку почвы и повышают достоверность биотестирования.

6. Комплексный подход, состоящий в сочетании биологических и аналитических методов анализа почвы и продукции с использованием разработанных алгоритмов подготовки проб почвы является основой для создания рабочей методики для экологического контроля рисовых агроценозов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ*

1. Воронина Л.П., Май Тху Лан, Черемных Е.Г. Оценка фитотоксичности почв рисовых полей Вьетнама// Проблемы агрохимии и экологии. - Январь-март 2012.- № 1.-С. 47-52.

2. Май Тху Лан. Биотестирование на инфузориях образцов риса// Химия 2011. Физическая химия - Теория, эксперимент, практика: Материалы 2-ой научной региональной конференции с международным участием, г. Коломна. - 2011.- С. 90-94.

3. Май Тху Лан. Комплексная оценка почвы рисовых полей Вьетнама// Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2013. - № 3.

4. Май Тху Лан. Оптимизация культивирования инфузорий Tetrahymena pyriformis// Бизнес. Наука. Экология родного края: проблемы и пути их решения. Материалы Всероссийской научно-практической конференции—выставки экологических проектов с международным участием, г. Киров. - 2013. — С. 110-112.

5. Черемных Е.Г., Козлов Л.В., Май Тху Лан, Кулешнна О.Н. Возможности биотестирования на инфузориях// Международная конференция «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред», г. Москва. — 2013. — С. 236.

6. Черемных Е.Г., Май Тху Лан. Биотестирование риса из Вьетнама на приборе БиоЛат// Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2011. - № 4. - С. 65-71.

7. Черемных Е.Г., Май Тху Лан. Исследование почв и продукции рисовых полей Вьетнама с помощью автоматизированного биотеста на инфузориях Tetrahymena pyriformis// Труды Ш Всероссийской конференции «Научные аспекты глобальных экологических проблем», г. Москва. - 2011.

8. Черемных Е.Г., Май Т.Л. Пестициды на фоне диоксиновых загрязнений во Вьетнаме// Современные проблемы биомониторинга и биоиндикации: Сб. Материалов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Выпуск VIII, часть 2, г. Киров,- 2010. - С. 139.

9. Moracgevskay E.V., Voronina L.P., Cheremnykh E.G., Lan May Th. Complex bioassay for environmental of the estimate agricultural lands// The 20th International Conference on Environmental Indicators 16-19 September 2013, Trier University, Campus II, Germany. - 2013.

Жирным шрифтом выделены публикации в издагатях. рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов диссертационных работ.

Подписано в печать 07.05.2013г. Усл.п.л. - 1.5 Заказ №13890 Тираж: 70 экз. Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Май Тху Лан, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ

ПРОИЗВОДСТВ»

На правах рукописи

04201360703

Май Тху Лан

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРОДУКЦИИ И ПОЧВЫ

РИСОВЫХ ПОЛЕЙ ВЬЕТНАМА

Специальность 03.02.08 - экология (биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители кандидат технических наук Черемных Е.Г., доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Воронина Л.П.

Москва 2013 г.

Содержание

Введение..................................................................................................................4

Глава 1. Литературный обзор.............................................................................7

1.1 Общая характеристика природных условий и почвенного покрова Вьетнама...................................................................................................................7

1.2 Особенности агротехники риса во Вьетнаме.................................................8

1.3 Пестициды используемые во Вьетнаме........................................................10

1.3.1 Препараты защиты растений, используемых во Вьетнаме на рисовых полях.......................................................................................................................10

1.3.2 Анализ некоторых пестицидов и путей их метаболизма в растениях и в почвах.....................................................................................................................13

1.4 Биологическая оценка агросистем................................................................30

1.4.1 Биотестирование как альтернатива опытам на животных...........................30

1.4.2 Биотестирование на инфузориях...................................................................31

1.4.3 Инфузории рода ТейаЪутепа - уникальные тест-организмы в биологических исследованиях.............................................................................34

Глава 2. Материалы, методы и объекты исследования..............................42

2.1 Отбор проб почвы...........................................................................................42

2.2 Отбор проб риса..............................................................................................42

2.3 Биотестирование на инфузориях................................................................... 42

2.3.1 Необходимое оборудование, посуда и реактивы......................................42

2.3.2 Культивирование инфузорий ТейаИутепа рупГопшБ..............................43

2.3.3 Проведение исследования...........................................................................43

2.3.4 Прибор БиоЛаТ-3.........................................................................................44

2.4 Биотестирование на дафниях.........................................................................45

2.5 Фитотестирование...........................................................................................47

2.6 Хромато-масс-спектрометрия........................................................................47

2.7 Объекты исследования...................................................................................48

Глава 3. Экспериментальная часть.................................................................50

3.1 Оптимизация культивирования инфузорий Те^аИутепа руиАотш.........50

3.2 Чувствительность инфузорий к некоторым пестицидам и их комбинациям..........................................................................................................53

I ||

3.3 Оценка водорастворимых и гидрофобных поллютантов почвы рисовых

полей по реакции тест-организмов Те^акутепаруп/огтгз..............................55

3.3.1 Подготовка проб почвы.................................................................................55

3.3.2 Биотестирование на инфузориях модельных образцов...............................63

3.3.3 Оценка токсичности 11 образцов почвы...................................................64

3.3.4 Оценка на инфузориях образцов почвы отобранных в 2010, 2011 и 2012 годах...............................................................................................................70

3.3.5 Оценка образцов почвы на дафниях..........................................................75

3.3.6 Фитотестирование образцов почвы............................................................76

3.3.7 Оценка образцов почвы хромато-масс-спектрометрическим методом и анализ результатов биотестирования на разных тест-организмах .................81

3.4 Биотестирование образцов риса....................................................................84

3.4.1 Подготовка проб образцов рис...................................................................84

Заключение...........................................................................................................92

Библиографический список..............................................................................95

времени диоксин трансформировался - в почвах образовались квазиколлоидные, пока малоизученные его формы. Они обладают в десятки раз большей растворимостью в воде [65,126]. Время попадания диоксинов в море совпало с массовой гибелью коралловых сообществ, заилением дна и системным химическим загрязнением ила и гидробионтов.

На фоне загрязнения диоксинами и разнообразными веществами их трансформации при интенсивном сельскохозяйственном производстве во Вьетнаме используют разнообразные пестициды и регуляторы роста растений, которые могут модифицироваться и вступать в различные физико-химические взаимодействия [99]. При среднегодовых температурах до +25°С и около 200 солнечных дней в году эти процессы проходят очень интенсивно. Но еще больший вклад в преобразование таких компонентов вносят метаболические процессы почвенной биоты.

Как правило, в почвенных микроорганизмах метаболизм диоксина и пестицидов происходит с участием монооксигеназных ферментных систем, в том числе Р-450. В результате чего происходит увеличение их активности, например экспрессия Р-450 1А1, может увеличиваться в 100 раз [38,40,41]. С одной стороны этот процесс приводит к детоксикации и очищению почв, но в некоторых случаях в результате метаболических процессов чужеродных соединений в микроорганизмах могут синтезироваться еще более опасные соединения, нежели исходные.

Кроме того, цели пестицидов - насекомые-паразиты, микрогрибы и сорные растения, также адаптируются к новому химическому составу среды, причем, обладая высоким приспособительным потенциалом, осуществляют это очень быстро. В результате существующие нормы внесения пестицидов оказываются неэффективными и дозы внесения приходиться увеличивать. Это приводит к новым виткам эскалации войны против природы и, соответственно, здоровья людей.

В связи с возможными разнообразными метаболитами, как диоксинов, так и используемых пестицидов на рисовых полях не представляется

Глава 1. Литературный обзор 1.1 Общая характеристика природных условий и почвенного покрова

Вьетнама

Б-образная территория Вьетнама находится на востоке полуострова Индокитай и протянулась на 1650 км с юга на север от 8°30 с.ш. до 23°22 с. ш. и на 600 км с запада на восток от 102° 10 до 109°21 в.д. Общая площадь Вьетнама составляет 329600км2. Положение Вьетнама на стыке нескольких природных зон, а также наличие древней геологической структуры определяют разнообразие его природных условий. Рельеф страны большей частью горный. Более трех четвертей территории занимают горы, плато и плоскогорья [58]. На равнины во Вьетнаме приходится всего четверть всей территории, но именно там сосредоточена основная хозяйственная деятельность. Наиболее обширные равнины сформированы дельтами рек Хонгха - на севере, и Меконг - на юге. Между ними тянется цепочка узких береговых равнин и дельт относительно небольших рек.

Климат Вьетнама влажный, тропический, муссонный. Природные условия благоприятны для получения нескольких урожаев сельскохозяйственных культур [117]. Вьетнам делится на три климатических района: Северный, Центральный и Южный.

Северный район характеризуется влажным жарким летом в период экваториального муссона, дующего с Тихого океана, и сырой прохладной зимой, когда сказывается действие холодных северо-западных ветров.

Южный район отличается типичным тропическим муссонным климатом. В южный Вьетнам не проникают северные ветры, поэтому температурный режим стабилен в течение всего года, например в дельте Меконга, средние годовые температуры около +27°С. По влагообеспеченности выделяют два сезона - влажный и сухой. Во время первого, начинающегося в апреле-мае и заканчивающегося в октябре-ноябре, обычно выпадает более 90% годовой нормы осадков, а во время второго -

всего 7%. Иногда бывают засухи. Порой на побережье обрушиваются тайфуны.

На климат Центрального района существенное влияние оказывают горы Чыонгшон и их отроги, служащие барьером, который летом препятствует проникновению влажных юго-западных ветров. Дожди начинаются в августе и достигают максимальной интенсивности в октябре-ноябре, когда в остальных областях страны устанавливается ясная погода.

Процессы почвообразования во Вьетнаме в условиях влажного тропического климата протекают очень интенсивно и на протяжении всего года. В результате формируются почвенные профили мощностью в несколько метров. Зональные почвы Вьетнама - различные типы латеритов (красноземы, желтоземы, горные латериты) [61,62]. Самые плодородные почвы формируются на вулканических породах. Наибольшее хозяйственное значение имеют азональные аллювиальные почвы равнин, особенно дельты Меконга и Хонгха. Многие низменные районы заболочены и там распространены болотные почвы. Наибольшие площади таких почв сосредоточены в дельте Меконга.

Длительная история землепользования во Вьетнаме, высокая освоенность почв в сельском хозяйстве, благоприятные климатические условия создают предпосылки для получения значительной сельскохозяйственной продукции, которая является одной из основных источников национального дохода страны.

1.2 Особенности агротехники риса во Вьетнаме

Сельское население во Вьетнаме составляет 80 процентов, и сконцентрировано вокруг двух главных зон выращивания риса, который занимает 74 процента пахотной земли.

Рисовые поля, в виде небольших орошаемых участков, принадлежащих мелким фермерам, в основном расположены вокруг дельты реки Меконг, на юге, и дельта Хонгхана севере, и составляют около 70% всех рисовых полей

*

'к,

Вьетнама. В дельте реки Меконг снимают 3 урожая риса в год, в дельте РедРивер - 2. На севере страны, на орошаемых полях (30% от всех полей) выращивают 1 урожай риса в год. Интенсивность рисового земледелия во Вьетнаме является самой высокой в мире [119].

Большие площади обводненных земель имеют положительное влияние на климат страны - снижается средняя годовая температура, существенно уменьшается эрозия почв в дельтах рек и увеличивается биоразнообразие водной и почвенной флоры и фауны [73].

В то же время сущесвуют отрицательные последствия выращивания монокультуры риса на больших площадях. На орошаемых территориях с кротким паровым периодом нередко почва подвергается эрозийным процессам, а также уменьшается число видов почвенной биоты. На заболоченных полях в дельтах рек выделяется метан, являющийся одним из факторов глобального потепления [107].

Самое негативное действие на природные системы и здоровье человека оказывают минеральные удобрения и пестициды, обязательно используемые при интенсивном земледелии. Всего лишь 30-40% азота, вносимого с удобрениями, утилизируется рисом [106], остальной азот является фактором загрязнения природных вод и способствует бурному росту патогенной флоры [5,24,26].

Сегодня на рисовых полях применяют многочисленные инсектициды, гербициды и фунгициды. Массовое их использование не слишком грамотными фермерами наносит большой ущерб и природе и их собственному здоровью [127]. Так, по оценкам ФАО-ВОЗ, в 1998г во Вьетнаме было закуплено 40 000т пестицидов, а число отравлений пестицидами с последующей госпитализацией возросло до 840 случаев.

Проблема неконтролируемого внесения пестицидово сложняется еще загрязнением почв диоксинами. Основной причиной диоксинового загрязнения на данный период остается их содержание в дефолиантах, распылявшихся армией США во время войны, а также диоксиновое

загрязнение обусловлено сжиганием соломы, древесины и растительных остатков, загрязненных хлорсодержащими пестицидами и продуктами их разложения [3,16,18,50,51,52,104].

Таким образом, в почву рисовых полей, с учетом технологий выращивания этой культуры попадает большое количество химикатов, которые могут накапливаться и превращаться в более токсичные метаболиты [23]. Климатические условия, повышенное количество атмосферных осадков во Вьетнаме (до 3000 мм/год), тайфуны, наводнения являются природными факторами, повышающими риск процессов деградации почв (эрозия, вымывание основных элементов питательных веществ, снижение рН и др.).

Биохимический механизм пагубного действия диоксинов связан с особенностью трехмерной конфигурации молекул, которые способны связываться с эстрогенными рецепторами на поверхности клеток живых организмов и изменять нормальную последовательность течения биохимических процессов [17,37,134,135,137]. Это приводит к образованию токсичных метаболитов, повреждающих клетки.

1.3 Пестициды используемые во Вьетнаме

1.3.1 Препараты защиты растений, используемых во Вьетнаме на

рисовых полях

В таблице 1.1 большинство используемых разрешенных препаратов относятся к инсектицидам к фунгицидам, наиболее опасным пестицидам и для человека, относятся 19 разных соединений и в этот список входят 10 гербициды [19, 32].

За последние 20 лет в условиях коммерциализации аграрного сектора экономики кроме указанных пестицидов вполне вероятно использование неразрешенных и даже запрещенных препаратов. Учесть и оценить последствия их применения достаточно сложно [12].

Поэтому ограничимся изучением лишь некоторых препаратов из списка, для того, чтобы доказать тезис о непрогнозируемости химического состава почв и их продукции, а также, чтобы доказать необходимость оценки

безопасности продукции и почвы рисовых полей с помощью интегральных методов биотестирования.

Таблица 1.1

Список препаратов, защиты растений, разрешенных для использования

во Вьетнаме на рисовых полях [42]

№ Активное вещество Коммерческое название (COMMONNAME) (TRADENAME)

Инсектициды

1 Abamectin Ababetter 3.6EC, 5EC, Abapro 5.8EC

2 Abamectin 3% + Emamectin benzoate 2% Daiwantin 5EC

3 Abamectin 18 g/l + Pyridaben 150 g/1 Aben 168EC

4 Acephate Mace 75SP

5 Acetamiprid Daiwance 200SP

6 Acetamiprid 150g/kg + Buprofezin 150g/kg Ba Dâng 300WP

7 Alpha-cypermethrin FM-tox 25EC

8 Alpha-cypermethrin 1.6% + Chlorpyrifos Ethyl 65% Apphe 666EC

9 Alpha-cypermethrin 35g/l + Quinalphos 215g/l Focotoc 250EC

10 Alpha-cypermethrin 30g/l+ Phoxim 400g/l Kasakiusa 430EC

11 Beta-cypermethrin 10 g/kg + Buprofezin 300g/kg Okamex 310WP

12 Buprofezin Annongaplau 100WP, 400WDG, Butai 10WP, 25 WP

13 Buprofezin 150g/kg + Imidacloprid 100g/kg Cytoc 250WP, Map spin 350WP

14 Carbosulfan Coral 200SC

15 Cartap Dantac 500SP, Badanong 95SP

16 Chlorpyrifos Ethyl Genotox 55.5EC, Hoban 30EC

17 Chlorpyrifos Ethyl 500 g/l + Cypermethrin 50g/l + Emamectin benzoate 10g/l Acgoldfly 560EC

18 Chlorpyrifos Ethyl 48% + Imidacloprid 7% Dizorin super 55EC

19 Chlorpyrifos Ethyl 53.0% + Cypermethrin 5.5 % Dragon 585EC

20 Chlorfenapyr Secure 10EC

21 Chlorantraniliprole 20% + Thiamethoxam 20% Virtako 40WG

22 Cypermethrin 20g/l + Dimethoate 200g/l + Fenvalerate 30g/l Antricis 250EC

23 Deltamethrin 1.0% + Fipronil 2.5% Samourai 35 EC

24 Diazinon Diazan 40EC, 50ND

25 Dinotefuran Ondosol 750WP

26 Dinotefuran 50g/kg + Imidacloprid 150g/kg Explorer 200WP

27 Emamectin benzoate Homectin 1.9EC

28 Emamectin benzoate Kinomec 3.8EC

29 Imidacloprid Admire 2000D

30 Indoxacarb Ameta 150SC, Indosuper 150SC

31 Imidacloprid 100g/l + Thiamethoxam 200g/l NOSOT Super 300SC

32 Fenobucarb 415g/l + Imidacloprid 35g/l Javipas 450EC

33 Fenobucarb 5g/kg + Isoprocarb 195g/kg Anbas 200WP

34 Fipronil 4g/kg + Tricyclazole 40g/kg Latini 44G

35 Metox 809 8EC Metox 809 8EC

36 Thiamethoxam 262.5g/l + Difenoconazole 25g/l + Fludioxonil 25g/l Cruiser plus 312.5FS

37 Thiamethoxam Actara 25WG

Фунгициды

1 Azoxystrobin Altista 300SC

2 Azoxystrobin 200g/l + Difenoconazole 125g/l Amistar top 325SC

3 Difenoconazole 150g/l + Propiconazole 150g/l Bretil Super 300EC

4 Carbendazim Daphavil 50SC

5 Carbendazim 9.2% + Tricyclazole 5.8% + Validamycin 5% Carzole 20 WP

6 Carbendazim lOOg/kg + Isoprothiolane 200g/kg + Tricyclazole 400g/kg Ricesilk 700WP

7 Difenoconazole 150g/kg + Isoprothiolane 400g/kg + Propiconazole 150g/kg Alfavin 700WP

8 Flusilazole anRUTA 400EW

9 Gentamicin Sulfate 2% + Oxytetracycline Hydrocloride 6% Avalon 8WP

10 Iprodione Citione 350SC, 500WP

11 Iprodione 400 g/kg + Sulfur 350 g/kg Rollone 750WP

12 Isoprothiolane Funhat 40EC, Kara-one 400WP

13 Kasugamycin 1.2% + Tricyclazole 20% Kansui 21.2WP

14 Mancozeb Annong Manco 300SC

15 Oxolinic acid Oka 20WP

16 Propiconazole 150g/l + Tricyclazole 400g/l Bimtil 550SE

17 Tebuconazole 500g/kg + Trifloxystrobin 250g/kg Nativo 750WG

18 Tricyclazole Bimdowmy 750WP, Dolazole 80WP

19 Tebuconazole Fozeni 250EW

Гербициды

1 Bensulfuron Methyl 0.16g/kg + Butachlor 3.04g/kg Rinonil 3.2GR

2 Bispyribac-sodium Camini 10SC

3 Bispyribac-sodium 100g/l + Fenoxaprop-P-Ethyl 50g/l Morclean 150SC

4 Cyhalofop-butyl 50g/l + Penoxsulam 10g/l Linchor top 60 OD

5 Cyhalofop-butyl 50g/l + Penoxsulam 10g/l Stopusamy 60EC

6 Cyhalofop Butyl 50g/l + Ethoxysulfuron 20g/l Supershot 70 OD

7 Quinclorac Adore 25SC

8 Glyphosate IPA Salt Vifosat 240DD

9 Pretilachlor 500g/l + Fenclorim 150g/l Wind-up 500EC

10 Pyrazosulfuron Ethyl Rus - annong 200SC

1.3.2 Анализ некоторых пестицидов и путей их метаболизма в растениях

и в почвах

Абамектин (Abamectin) - общее название смеси авермектин В 1а и Bib, смесь обладает инсектицидным и акарицидным действием. Авермектины это - метаболиты почвенных грибов Streptomyces avermitilis [140].

1. Название по IUPAC: mixture of 80% (2aE,4E,8E)-(5,S,6S,6'R, 7S,11R, 13S, 15S, 17aR,20R,20aR,20bS)-6'-[(S)-sec-butyl]-5,,6,6',7,10,11, 14,15,17a, 20,20a, 20b-dodecahydro-20,20b-dihydroxy-5', 6, 8, 19 - tetramethyl - 17 -oxospiro [11, 15-methano - 2H, 13H, 17H - furo[4,3,2-pq] [2,6] benzodioxacyclooctadecin - 13,2'-[2H]pyran] - 7 - yl 2,6 - dideoxy-4-0-(2,6 -dideoxy - 3 - О - methyl - a - L - arabino-hexopyranosyl)-3-0- methyl - a - L-arabino - hexopyranoside, 20% (2aE, 4E, 8E)-(5'S,6S,6'R, 7S, 11R, 13S, 15S, 17aR,20R,20aR,20bS) 5', 6, 6' ,7, 10,11,14, 15, 17a,20, 20a,20b-dodecahydro-20,20b-dihydroxy-6'-isopropyl - 5', 6, 8, 19 - tetramethyl - 17-oxospiro[ 11,15-methano-2H, 13H, 17H-furo[4,3,2-pq][2,6] benzodioxacyclooctadecin-13,2'-[2H] pyran] -7-yl 2,6-dideoxy-4-0-(2,6-dideoxy-3 -0-methyl-a-L-arabino-hexopyranosyl)-3 -O-methyl-a-L-arabino-hexopyranoside[2].

2. Структурная формула:

4. Растворимость в воде при 20°С (мг/л): 1.21 Растворимость в этилацетате при 20°С (мг/л): 160000 Растворимость в толуоле при 20°С (мг/л): 23000 Растворимость в ацетоне при 20°С (мг/л):72000

Коэффициент распределения в системе октанол/вода при рН 7 и температуре 20°С: 4,4.

5. Токсичность (IV класс опасности):

- острая для крыс ЛД50 - 8,7 г/кг;

- острая для птиц (утка кряква) ЛД50 - 77 мг/кг;

- острая для рыб (радужная форель) 96 час СК50 - 0,0036мг/л;

- острая для водных беспозвоночных (дафния магна 48 час) СК50 -0,01 мг/л;

- хроническая для водных беспозвоночных (дафния магна 21день)-0,00012мг/л.

Авермектины могут подвергаться фотодеградации, метаболиты, образ�