Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Количественный анализ результатов флуориметрического исследования хромосом человека в потоке и оптимизация условий их сортировки

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Кузнецова, Анна Вадимовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Цитометрия в потоке - общие сведения.

2.1.1.Анализ клеток и хромосом в потоке.

2.1.2.Принцип сортировки объектов в потоке.

2.2.Объект исследований - хромосомы.

2.2.1.Выделение хромосом.-.

2.2.2.0крашивание хромосом.

2.3.Флуориметрический анализ и сортировка хромосом в потоке.

2.3.1 .Однопараметрический и двухпараметрический анализ.

2.3.2.Сортировка хромосом.

2.4. Количественный анализ проточных кариотипов.

2.4.1 .Количественное описание проточных кариотипов.

2.4.2.Вычислительные методы анализа проточных кариотипов.

2.4.3.3адачи и проблемы количественного анализа проточных кариотипов.

3. МЕТОДЫ.

3.1. Процедура разложения распределений на компоненты, соответствующие отдельным хромосомам.

3.1.1 .Предварительная обработка данных.

3.1.2. Удаление загрязняющих сигналов.

3.1.3.Разложение экспериментальных распределений на составляющие компоненты.

3.2. Процедура определения чистоты и эффективности сортировки.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1.Этапы количественного анализа проточных кариотипов человека.

4.1.1.Аппроксимация примесных сигналов.

4.1.2.Выделение хромосомных компонент в однопараметрических распределениях.

4.1.3. Оценка точности разложения и эксперимента в целом.

4.2.Анализ однопараметрических распределений.

4.2.1.Серийный анализ последовательных однотипных экспериментов.

4.2.2.Анализ результатов, полученных с использованием различных красителей.

4.2.3.Анализ кариотипов, имеющих аберрации.

4.3.Анализ экспериментальных двупараметрических распределений.

4.3.1.Анализ двупараметрического распределения хромосом человека, выделенных из клеточной линии BOLD.

4.3.2.Количественный анализ данных по фракционированию в градиенте плотности сахарозы.

4.4.0птимизация условий выделения хромосом при их сортировке в потоке

4.4.1.Факторы, влияющие на чистоту и эффективность сортировки при однопараметрических исследованиях хромосом в потоке.

4.4.2.Применение процедуры расчет* параметров чистоты и эффективности сортировки к однопараметрическим экспериментальным данным.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Количественный анализ результатов флуориметрического исследования хромосом человека в потоке и оптимизация условий их сортировки"

Цитометрия и сортировка в потоке является одной из базовых технологий, использующихся в клеточной и молекулярной биологии. Метод проточной цитометрии первоначально разрабатывался для анализа клеток различной природы и происхождения, затем его стали применять к исследованию вирусов и клеточных органелл (Melamed, 1990), в частности, хромосом (Gray, 1975). Принцип метода проточной цитометрии базируется на достаточно простой идее: подаче объекта исследования в зону анализа с помощью потока жидкости. При прохождении через освещенную зону у исследованного объекта автоматически измеряются одна или несколько оптических характеристик: величина светорассеяния под определенными углами, интенсивности флуоресценции в заданных интервалах длин волн, а иногда также другие параметры, например, временной профиль оптических сигналов. На основе проведенных измерений строятся статистические распределения, которые позволяют проводить классификацию микрообъектов исследуемого образца. Высокая скорость анализа такого типа, его объективность, а также, не в последнюю очередь, возможность выделения интересующих объектов - сортировка - определили быстрое развитие этого метода и его современную популярность. Как приборные, так и методические аспекты цитометрии и сортировки в потоке достаточно быстро развивались и совершенствовались, и в результате ее возможности значительно расширились (van den Engh, 1993). В настоящее время проточная цитометрия с успехом применяется для исследований различных структурных и функциональных параметров клеток, клеточных органелл и других микрообъектов, а также их выделения (Полетаев, 1989). Объектом рассмотрения в настоящей работе будут, в основном, те применения проточной цитометрии, которые касаются во-первых, анализа хромосом, в особенности, хромосом человека, и вовторых, сортировки, то есть выделения фракций индивидуальных хромосом.

Хромосомы человека как объект цитометрии различаются между собой как по суммарному количеству ДНК (размеру), так и по относительному содержанию в них доступных для связывания с красителями AT- и GC-nap. Все исследования хромосом с помощью метода цитометрии в потоке осуществляются с использованием того или иного ДНК-специфичного красителя (красителей), способного флуоресцировать при возбуждении определенными линиями лазера или ртутной лампы (Gray et al., 1990, Metezeau et al, 1993). В том случае, когда используется только один краситель, в результате анализа могут быть получены гистограммы - распределения исследуемой выборки суспендированных хромосом по интенсивностям их флуоресценции, пропорциональных относительной длине хромосомы. Если же для анализа использовалась комбинация двух флуоресцирующих красителей, один из которых специфически связывается с АТ-парами, а другой с GC-парами, то получаемые статистические распределения могут быть представлены в виде цитограмм - двумерных распределений, отражающих интенсивности флуоресценции каждого из использованных красителей на хромосомах. Эти интенсивности зависят как от общего количества ДНК в хромосомах, так и от соотношения концентраций AT/GC-nap, доступных для связывания с красителями. Двупараметрические распределения более информативны по сравнению с однопараметрическими (Gray et al., 1979, Gray et al., 1990, Green et al, 1990).

Получаемые экспериментально распределения содержат информацию об объекте: размерах хромосом из клеток исследуемого типа, о наличии и частоте хромосомных аномалий, а также ряде других параметров, которые будут обсуждаться ниже. Поскольку проточная цитометрия при анализе позволяет достичь скоростей анализа до 1-3 тыс. объектов в секунду, объем исследуемых выборок может быть велик, а статистическая достоверность получаемых результатов высока. На основе экспериментальных распределений можно как детектировать хромосомные аберрации, которые проявляются в виде характерных изменений в характере распределений, так и проводить сортировку фракций индивидуальных хромосом, что крайне ценно для исследования генома на молекулярном уровне.

Количественные методы анализа позволяют получить максимум информации из экспериментальных распределений. Ранее в нашей группе была создана программа по обработке данных флуориметрического исследования хромосом в потоке (Кравацкий, 1994), ориентированная на проведение количественного анализа результатов с целью детектирования хромосомных аберраций. В отличие от других подобных программ, использующих мощные компьютеры класса «mainframe» или «workstation», эта процедура работает на базе IBM PC i80386 и выше, что делает ее доступной для подавляющего большинства исследователей. Однако для практического использования указанной процедуры в научных и клинических целях необходимо было выработать общие и практические рекомендации по обработке экспериментальных распределений, которые часто весьма различаются по своему внешнему виду. Кроме того, необходимо выработать принципы оптимизации условий сортировки с целью получения хромосомного материала с контролируемыми характеристиками. Именно разработка методики анализа хромосомных распределений с оценкой точности и достоверности получаемых данных, а также оценка эффективности выделения хромосом, на основе последовательного применения процедуры количественного анализа, и является основной целью настоящей работы. Все рекомендации по количественному анализу хромосомных распределений, сформулированные в этой работе, были применены для анализа реальных однопараметрических и двупараметрических экспериментальных данных, а сделанные цитогенетические выводы проверены независимыми методами исследования.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кузнецова, Анна Вадимовна

5. ВЫВОДЫ

1. Последовательное применение ранее созданной программы количественной обработки данных по флуориметрическому анализу хромосом человека в потоке позволило сформулировать методику анализа хромосомных распределений, а также оценить точность и достоверность получаемых данных.

2. Показано, что статистическая ошибка в определении относительного числа хромосом в экспериментальных выборках составляет не более 5%, а относительное количество ДНК определяется с точностью 0.3-0.5%, что соответствует 0,25-0,80 млн. нуклеотидных пар в зависимости от размера хромосомы. Подобная точность не обеспечивается ни одним из альтернативных подходов.

3. Показано, что результаты разложения экспериментальных распределений, полученные с использованием различных по специфичности связывания с ДНК красителей, не зависят от типа использованного красителя.

4. Количественный анализ хромосомных распределений клеточной линии ROM показал наличие аберраций по содержанию половых хромосом, а также поликлональность самой клеточной линии. Эти результаты были подтверждены последующим цитогенетическим анализом.

5. Анализ двупараметрических распределений для образцов, полученных путем фракционирования по размеру хромосом в градиенте плотности сахарозы показал, что использование предобогащенных образцов может увеличить скорость сортировки хромосом в 1.5-2.5 раз без существенного снижения чистоты выделяемых хромосомных фракций.

6. Анализ факторов, влияющих на эффективность и чистоту сортировки хромосом в потоке, позволил сформулировать условия для достижения максимальной чистоты получаемой фракции, максимальной эффективности сортировки или оптимального соотношения между этими двумя требованиями в зависимости от типа поставленной задачи. Полученные рекомендации равным образом применимы к одно- или двупараметрическим хромосомным распределениям, а также могут быть использованы при оптимизации сортировки объектов других типов.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Создана законченная методика количественного анализа проточных кариотипов и определения эффективности сортировки хромосом человека на базе PC класса 180386/25 MHz и выше, охватывающая все стадии анализа проточных кариотипов от идентификации и определения параметров хромосомных распределений до определения ворот сортировки с целью получения фракций индивидуальных хромосом с заданными характеристиками.

Мелодика создана в применении к хромосомам человека, однако может использоваться для исследования кариотипов и анализа эффективности сортировки хромосом других объектов, использующихся в проточной цитометрии - мышей, хомяков, обезьян, собак и др. В настоящее время быстро развивается направление, связанное изучением проточных кариотипов различных домашних животных, особенно свиньи в силу ее генетической близости к человеку и хорошего разрешения ее хромосом при двумерном флуориметрическом исследовании в потоке (Dixon et al, 1992, Archibald et al., 1991). Разработанную методику возможно использовать и при оптимизации сортировки хромосом домашних животных для создания геномной карты в рамках проекта PiGMaP.

Отметим также, что хотя проточная цитометрия традиционно использует животные клетки, в последнее время активно развивается исследование этим методом хромосом культурных растений, в частности, томатов (Arumuganathan et al., 1994)), и пшеницы (Lucretti et al., 1997),. ячменя (Lysak et al., 1999) и др. Применение разработанной методики количественного анализа к детекции хромосомных аберраций, а также оптимизации процесса сортировки представляется возможным и в случае исследования растительных клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Кузнецова, Анна Вадимовна, Москва

1. Баев А.А., 1990. Программа "Геном Человека", ее возникновение, содержание и развитие. Итоги науки и техники, серия "Гэном Человека", Москва, 1.

2. Зеленин А.В., Полетаев А.И, 1991. Клетки и хромосомы как исходный объект молекулярных исследований генома человека. Итоги науки и техники. Сер. "Геном человека" (Под ред. Баева АЛ.). М.:ВИНИТИ, 1: 34-59.

3. Карл де Бор, 1989. Интерполяция сплайнами. Москва, Радио и Связь.

4. Кравацкий Ю.В., Полетаев А.И., 1994. "Количественная обработка результатов однопараметрического флуоресцентного анализа хромосом человека в потоке". Молекулярная Биология, 28(4): 887-899.

5. Кравацкий Ю.В., Полетаев А.И., 1998. Двупараметрический флуоресцентный анализ хромосом человека в потоке. Количественная обработка. Биофизика, 43(2), 264-275.

6. Морозов Ю.В., Боковой В.А., 1989. Физические основы спектральных разложений. Журнал физической химии, LXIII (3): 662-668.

7. Наседкина ТВ, Полторыхин СА, Слезингер СИ, Полетаев АИ, 1994. Молекуляр биология, 28: 184-190.

8. Полетаев А.И., Гнучев Н.В., Зеленин А.В., 1987. Проточная цитометрия и сортировка клеток: современное состояние и перспективы использования в молекулярной биологии. Молекулярная биология. 21:23-27.

9. Полетаев А.И., 1989. Проточная цитометрия и сортировка в цитологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. Итоги науки и техники. Серия "Общие проблемы физико-химической биологии" (Под ред. Зеленина А.В.). М.ВИНИТИ, 12.

10. Полетаев А.И., 1989. Выделение индивидуальных хромосом и их использование для изучения геномов человека и животных. Молекулярная биология. 23(4):917-923.

11. Шатрова А.Н., Аксенов Н.Д., Тесленко Л.В., Зенин В.В., 1994. Фракционирование хромосом в градиенте плотности сахарозы для последующей проточной сортировки. Цитология, 36(7): 708-12

12. Archibald A, Hatey CS, Andersson L, Gustavson I, Bosrna AA, Davies V, Fredholm M, Geldermann H, Gellin G, Groenen M, Olliver L, Tucker EM, van den Wegh A, 1991. PiGMaP: a European initiative to map the porcine genome. Anim. Genet. 22:82-83.

13. Arndt-Jovin DJ, Jovin TM, 1977. Analysis and Sorting of living cells according to DNA content. J Histochem Cytochem 25:585-589.

14. Aten J.A., Kooi M.W., Bijman J.Th., Kipp J.B.A. and Barendsen G.W, 1984. Biological Dosimetry: Cytometric Approaches to Mammalian Systems. (Eisert W.G., Mendeison M.L., ed.) Berlin.: Springer-Verlag, pp.51-59.

15. Bernheim A, Metezeau P, Guellaen G, Fellous M, Goldberg ME, Berger R, 1983. Direct hybridization of sorted human chromosomes: localization of Y chromosome on the flow karyotype. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:5771-5775.

16. Bijman JT, 1983. Optimization of mammalian chromosome suspension preparations employed in a flow cytometric analysis. Cytometry 3:354-358.

17. Boshman GA, Manders EM, Rens W, Slater R, Aten JA, 1992. Semi-automated detection of aberrant chromosomes in bivariate humen karyotypes. Cytometry 13: 469477.

18. Carrano A.V., Gray J.W., Langlois R.G., Burkhart-Schultz K.J., Van Dilla M.A., 1979. Measurement and purification of human chromosomes by flow cytometry and sorting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1382-1384.

19. Carrano A.V., Lebo R.V., Yu L.C., Kan Y.W., 1981. Regional gene mapping of human chromosomes by flow sorting. In: Modern trends in Human leukemia. (Neth R, Gallo R., Graf Т., Mannweiler К., Winkler К., eds.), Berlin Springer-Verlag, IV, pp. 156-159.

20. Collard J.G., Philippus E.,Tulp A., Lebo R.V., Gray J.W, 1984. Separation and analysis of human chromosomes by combined velocity sedimentation and flow sorting applying single- and dual-laser flow cytometry. Cytometry, 5:9-19.

21. Collard J.G., Tulp A., Stegeman J., Boezeman J., 1981. Separation of human metaphase chromosomes at neutral pH by velocity sedimentation at twenty times gravity. Exp. Cell. Res. 133: 341-346.

22. Cotter FE, Das S, Douek E, Carter N, Young BD, 1991. The generetion of DNA probes to chromosome 11q23 by Alu PCR on small numbers of flow sorted 22q-deriviate chromosomes. Genomics, 2:473-480.

23. Cram L.S., Bartholdi M.F., Ray F.A., Cassidy M., Kraemer P.M., 1989. Flow Cytogenetics. GrayJ.M., ed. L: Acad. Press, 1-13.

24. Darzienkevich Z, Traganos F, Kapuscinsky J, Staiano-Coico L, Melamed M, 1984. Accessibility of DNA in situ to vatios fluorochromes: Relationaship to chromatin charges during erythriod differentiation of Friebd leukemic cells. Cytometry 5:355-363.

25. Dean P.N., Kolla S.,Van Dilla M.A., 1989. Analysis of Bivariate Flow Karyotypes. Cytometry. 10: 109-123.

26. Deaven LL, Hildebrandd CE, Fuscoe JC, Van Dilla MA, 1986. Construction of human chromosome-specific DNA libraries from flow sorted chromosomes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 159-168.

27. Fawsett JJ, Longmire JL, Martin JC, Deaven LL,. Cram LS. 1994. Large-Scale Chomosome Sorting. In "Methods in Cell Biology" (ed. by Darzynkievich Z, Robinson J.P., Crissman H.A.), 42, pp. 319-330. San Diego, CA: Academic Press.

28. Fletcher R., Reeves C.M., 1964. Function minimization by conjugate gradients. Computer J., 7(2): 149-153

29. Gray J, Dean P, Fuscoe JC, Peters DC, Trask B, Van den Engh GJ, Van Dilla M, 1987. High-speed chromosome sorting. Science 245: 1434-1435.

30. Gray JW, Carrano AV, Moore il DH, Steinmtz LL, Minker J, Mayall BH, Mendelson ML, and Van Dilla MA, 1975. High speed quantitive karyotyping by flow cytometry. Clin. Chem. 21:1258-1262.

31. Gray JW, Carrano AV, Steinmtz LL, Van Dilla MA, Moore II DH, Mayall BH, and Mendelson ML, 1975. Chromosome measurement and sorting by flow systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1231-1234.

32. Gray JW, Cram L.S., 1990. Flow Karyotyping and Chromosome Sorting. In "Flow Cytometry and Sorting" (Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds.) N.Y. Wiley-Liss, 503-529.

33. Gray JW, Langlois R.G., Carrano A.V., Burkhart-Schultz K., Van Dilla M.A., 1979. High resolution chromosome analysis: One and two parameter flow cytometry. Chromosoma, 73: 9-27.

34. Gray JW, Lucas J, Yu L-C, Langlois R, 1984. Flow cytometric detection of aberrant chromosomes. In "Biological dosimetry: Cytometric Approaches to Mammalian Systems."(Eisert WG, Mendelsohn ML, eds.). Heidelberg:Springer-Verlag, 25-35.

35. Gray JW, Trask B, van den Engh G, Silva A, Lozes C, Grell S, Schoenberg S, Yu L-C, 1988. Application of flow karyotyping in prenatal detection of chromosome aberrations. Am.J.Hum.Genet. 42:49-59.

36. Green D.K., 1990. Analyzing and sorting of human chromosomes. Jornal of Microscopy, 159(3), 237-244.

37. Grunwald D, Frelat G, Vainman M, 1989. Animal flow cytogenetics. In "Advanced Research and Clinical Applications", Vol. 1, chapt. 7 (Yen A, ed.), CRC Press Inc.Boca Raton USA, 131-142.

38. Harris P., Cook A., Boyd E., Young B.D. and Ferguson-Smith M.A., 1987. The potential of family flow karyotyping for the detection of chromosome abnormalities. Hum. Genet, 76: 129-133.

39. Hilwig I, Gropp A, 1975. pH-dependent fluorescence of DNA and RNA in cytologic staining with "33258 Hoehsf. Exp. Cell Res. 91:457-460.

40. Kamiyama M, 1968. Mechanism of action of chromomycin A3. J. Biochem. 63: 566572.

41. Krumlauf R., Jeanpierre M., Young B.D., 1982. Construction and characterization of genomic libraries of specific human chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 2971-2975.

42. Kruth HS, 1982. Flow cytometry: Rapid biochemical analysis of single cells. Anal. Biochem. 125:225-242.

43. Lalande M., Shreck R.R., Hoffman R. and Latt S.A., 1985. Identification of inverted duplicated 15 chromosomes using bivariate chromosome flow analysis. Cytometry, 6: 1-6.

44. Langlois R.G., Carrano A.V. Gray J.W. and Van Dilla M.A., 1980. Cytochemicai studies ofmetaphase chromosomes by flow cytometry. Chromosoma, 77:229-251.

45. Langlois R.G., Yu L, Carrano A.V., Gray J.W, 1982. Quantitative karyotyping of human chromosomes by dual beam flow cytometry. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 79: 7876-7880.

46. Latt S.A., Sahar E., Eisenhard M.E. and Juergens L.A., 1980. Interactions between pairs of DNA binding dyes: results and implications of chromosome analysis. Cytometry, 1:2-12.

47. Latt SA, 1977. Fluorescent probes of chromosome structure and replication. Can.J Genet Cytol. 19:603-623.

48. Latt SA, Sahar E, Eisenhard ME, 1979. Pairs of fluorescent dyes as probes for DNA and chromosomes. J Histochem.Cytochem 27:65-71.

49. Latt SE, Wohleb JC, 1975. Optical studies of the interactions of 33258 Hoehst with DNA, chromatin and metaphase chromosomes. Chromosoma 52:297-316.

50. Leary, JF., 1994. Strategies for Rare Cell detection and isolation. In "Methods in Cell Biology" (ed. by Darzynkievich Z, Robinson J.P., Crissman H.A.), 42, pp. 332-358. San Diego, CA: Academic Press.

51. Lebo R, Anderson L, Lau Y-F, Flandermeyer R, Kan YW, 1986. Flow sorting analysis of normal and abnormal human genomes. Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biof. 51: 169-176.

52. Lidmo T, Peters DC, Sweet RG, 1990. Flow soeters for biological cells. In "Flow Cytometry and Sorting" (Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds.) N.Y. Wiley-Liss, pp. 145-171.

53. Lin MS, Comings DE, Alfi OS, 1977. Optical studies of the interactions of 4'-6-diamidino-Z-phenylindole with DNA and metaphase chromosomes. Chromosoma 60:15-25.

54. Ludecke HJ, Senger G, Claussen U, Horsthemke B, 1989. Cloning defined regions of the humen genome be microdissection of banded chromosomes and enzymatic amplification. Nature 338:348-350.

55. Matsson P., Rydberg В., 1981. Analysis of chromosomes from human perypheral lymphocites by flow cytometry. Cytometry. 1: 369-307.

56. McCormick MK, Buckler A, Bruno W, Campbell E, Shera K, Torney D, Deaven L, Moyzis R, 1993. Construction and characterization of a YAC library with a low frequency of chimeric clones from flow-sorted human chromosome 9. Genomics 18(3):553-558

57. Melamed M.R., Mullaney P.F., Shapiro H.M., 1990. An historical review of the development of flow cytometers and sorters, in "Flow Cytometry and Sorting" (Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds.) N.Y. Wiley-Liss, pp. 1-9.

58. Metezeau P, Schmitz A, Frelat G, 1993. Analysis and sorting of chromosomes by flow cytometry: new trends. Biol Cell, 78(1-2):31-9

59. Meyne J., Bartholid M., Travis G., Cram L.S., 1984. Counterstaining human chromosomes for flow karyology. Cytometry, 5:580-583.

60. Monard S.P., 1998. Chromosome sorting and analysis by FACS. In Methods in Molecular Biology, Aaron Diamond AIDS Research Center for the City of New York, NY, USA, 91:239-54

61. Moore D.H. II, and Joe W. Gray, 1993. Derivative domain fitting: a new method for resolving a mixture of normal distributions in the presence of a contaminating background.Cytometry, 14:510-518

62. Moore II D.H., 1979. A template method for decomposing flow cytometry hystograms of human chromosomes. J. Histochem. Cytochem. 27:305-310.

63. Moore II D.H., 1989. Methods for Estimating Components of Multipeaked flow hystogram. Flow Cytogenetics (Gray J. M., ed.) L.: Acad. Press, 83-111.

64. Muirehead К, Ho ran PK, Poste G, 1985. Flow cytometry: Present and future. Bio/Tech 3:337-356.

65. Otto F, Tsou КС, 1985. A compatible study of DAPI, DIPI, and Hoehst 33258 and 33342 as chromosomal DNA stains. Stain Techn. 60: 7-11.

66. Peters D, Branscomb E, Dean P, Merrill T, Pinkel D, Van Dilla M, Gray JW, 1985. The LLNL high-speed sorter: Design features, operational characteristics, and biological utility. Cytometry, 6:290-301.

67. Pohl FM, Jovin TM, Baehr W, Holbrollk JJ, 1972. Ethidium bromide as a cooperative effector of DNA structure. Proc Natl Acad Sci USA 69:3805-3809.

68. Press W.H., Flannery B.P., Teukolsky S.A., Vetterling W.T., 1986. Numerical recipes. The Art of Scientific Computing. Cambridge University Press.

69. Robinson J.A., Buckton K.E., Spowart G., Newton M., Jacobs P.A., Evans H.J. and Hill R., 1986. The segregation of human chromosome polymorphysms. Am. Hum. Genet, 40:113-121.

70. Shapiro H.M., 1985. Practical Flow Cytometry, Alan R.Liss, NY.

71. Shay JW, Cram LS, 1985. Cell fusion and chromosome sorting. In "Molecular Cell Genetics. The Chinise hamster cells." (ed. Goettsman MM). New York: J Wiley & Sons, 155-180.

72. Sillar R, Young BD, 1981. A new method for the preparation of methaphase chromosomes for flow analysis. Cytochem. 29:74-78.

73. Steen H.B., 1990. Characteristics of flow cytometers. In "Flow Cytometry and Sorting" (Melamed M.R:, Lindmo Т., Mendelson M.L., eds.) N.Y. Wiley-Liss, 11-25.

74. Suijkerbuijk R, Matthopoulus D, Kearney L, Monard S, Dhut S, Cotter F, Herbergs J, Gerts van Kessel A, Young B, 1992. Fluorescent in situ hybridization of human marker chromosomes using flow sorting and Alu element-mediated DNA. Genomics, 2: 473480.

75. Telinius H, Pelmear A, Tunnaclife A, Carter N, Behmet A, Ferguson-Smith ME, Nordenskjold M, Pfragner, R, Ponder B, 1992. Cytogenetic analysis by chromosome paining using DOP-PCR amplifies flow sorted chromosomes. Genes. Chromosomes Cancer 4:257-263.

76. Trask B, van den Engh G, Gray, JW., 1989. Inheritance of chromosome heteromorfism analyzed by high resolution bivariate flow karyotyping. Am. J. Hum. Genet., 45: 753760.

77. Trask B, van den Engh G, Mayall B, Gray, JW, 1989. Chromosome geteromorfism quantifiefied by high-resolution bivariate flow karyotyping. Am. J. Hum. Genet., 45: 739-752.

78. Van den Engh, G., 1993. New applications of flow cytometry. Cur Op. in Biotech, 4:6368.

79. Van Dilla MA, Deaven LL, 1990. Construction of gene libraries for each human chromosome. Cytometry 11(1):208-18

80. Van Dyke MW, Dervan PB, 1983. Chromomycin, mithramycin, and olivomycin binding sites on heterogeneous deoyribonucleatic acid footprinting with (metidiumpropyl-EDTA iron II). Biochemistry 22:2373-2377.

81. VanDevanter DR, Choongkittaworn NM, Dyer KA, Aten J, Otto P, BehlerC, BryantEM, Rabinovitch PS, 1994. Pure chromosome-specific PCR libraries from single sorted chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA 91(13):5858-62

82. Waggoner A.S., 1990. Fluorescent probes for cytometry. Flow Cytometry and Sorting (Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds.), Wiley-Liss NY, 209-225.

83. Wagner MJ, Ledbetter SA, Nelson DL, Warren ST, Ledbetter DH, 1990. Rapid isolation of DNA probes by within specific chromosome regions by unterspersed repetitive sequence polymerase chain reaction. Genomics, 6:475-481.

84. Walleweerd J., Wilder M.E., Carpenter S.G., Raji M.R., 1984. Flow Cytometric determinationof radiation induced chromosome damage and its correlation with cell survival. Radiat.Res. 99:44-51.

85. Yoneda A, Yoneda Y, Kaneda Y, Hayes H, Uchida T, Okada Y, 1991. Monoclonal antibodies specific for human chromosome 5 obtained with amonochromosomal hybrid can be used to sort out cells containing the chromosome with a FACS. Chromosoma 100(3) :187-92

86. Young B.D., Ferguson-Smith M.A., Sillar R., Boyd E., 1987. High resolution analysis of human peripheral lymphocyte chromosomes by flow cytometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7727-7731.

87. Young B.D.,1989. Human Chromosome Analysis by Flow Cytometry, In "Flow Cytogenetics". (Gray J.M., ed.), Acad.Press, 83-111.