Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов

Ведерников, Виталий Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов"

4846859

На правах рукописи

ВЕДЕРНИКОВ Виталий Евгеньевич

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСА ГЕПАТИТА С МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ И ЕГО ГЕНОТИПИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРОГЕННЫХ БИНАРНЫХ ЗОНДОВ

03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Новосибирск - 2011

4846859

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН в лаборатории структуры генома при материально-технической поддержке ЗАО Вектор-Бест.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Григорий Моисеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Карпенко Лариса Ивановна

доктор биологических наук, профессор Беклемишев Анатолий Борисович

Ведущая организация:

НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Защита состоится 10 июня 2011 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел.(8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета доктор биологических наук Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Ситуацию в значительной мере осложняет отсутствие вакцины против ГС и высокая частота протекания инфекции в скрытой бессимптомной форме. Поэтому актуальными задачами для здравоохранения всех стран являются: профилактические меры по снижению риска заражения ВГС, повышение эффективности выявления инфицированных лиц и проведение действенной противовирусной терапии. Для диагностики гепатита С в настоящее время применяется комплекс методов, включающих определение в сыворотке крови обследуемых людей антител к вирусным антигенам с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблота, а также обнаружение вирусной РНК ВГС с использованием технологий амплификационного тестирования нуклеиновых кислот (NAT).

NAT-тесты актуальны в трансфузиологии, так как позволяют выявлять РНК ВГС в ИФА-отрицательных пробах крови, полученных в период сероконверсионного окна (Жибурт и др., 2006). В современные алгоритмы первичного обследования и проведения противовирусной терапии NAT-тесты включены для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС (в зависимости от генотипа ВГС назначают дозы препаратов и продолжительность лечения).

Российские медицинские учреждения в настоящее время не располагают достаточным ассортиментом диагностических наборов отечественного производства с требуемыми аналитическими характеристиками и актуальными для лабораторной диагностики потребительскими качествами. Представленные на отечественном рынке импортные диагностические тесты ведущих мировых производителей ограниченно доступны вследствие высокой стоимости. Поэтому для существенного улучшения ситуации с NAT-тестированием ВГС в России актуальна разработка и внедрение новых отечественных диагностических наборов.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является разработка, валидация и апробация наборов реагентов для количественного определения и дифференциации генотипов 1, 2, 3 вируса гепатита С на основе ПЦР в реальном времени.

Задачи исследования

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. подобрать специфические праймеры и зонды для выявления РНК ВГС; выполнить оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени; совместить этапы обратной транскрипции и ПЦР;

2. провести оптимизацию методики проведения количественного анализа путем разработки алгоритмов обработки исходных флуоресцентных данных.

3. разработать композицию праймеров и генотип-специфичных флуорогенных зондов, обеспечивающую максимальную специфичность и позволяющую в одной пробирке одновременно выявлять генотипы 1, 2 и 3 ВГС; провести оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени;

4. на основе проведенных исследований разработать диагностические наборы для выявления РНК и генотипирования ВГС; определить их основные аналитические и диагностические характеристики; провести апробацию.

Научная новизна

В рамках разработки процедуры проведения количественного анализа предложен алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых с последующей обработкой фильтром высокочастотного шума. Такой алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.

Предложен оригинальный алгоритм введения поправки на внутренний контрольный образец (ВКО) для учета потерь НК в процессе про-боподготовки, суть которой заключается в смещении значения Сд ВГС на Д Сд ВКО относительно среднего Сд ВКО по всей постановке.

При достигнутой воспроизводимости анализа (Б0<0,3 1о§10(конц., МЕ/мл) и линейности (с эффективностью амплификации около 100%

во всем диапазоне определяемых концентраций) предложен метод определения вирусной нагрузки с одним образцом сравнения, что позволило повысить производительность теста.

Предложен оригинальный подход к дизайну генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, позволяют дифференцировать последовательности, содержащие одиночные замены. Основными преимуществами бинарных зондов является высокая специфичность и возможность типирования мононуклеотидного полиморфизма, расположенного в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов (по сути, альтернатива коротким зондам с дорогостоящими модификациями, повышающими Тш, такими как ЬШ, МвВ).

Практическая значимость

Разработанный подход для выявления и количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке (плазме) крови с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступного набора реагентов «РеалБест РНК ВГС», выпускаемого ЗАО «Векгор-Бест» и прошедшего государственную регистрацию. Разработанный тест может использоваться как для высокочувствительного скринирования донорской крови, так и в клинической практике для:

• подтверждения диагноза гепатит С,

• ведения больных с хроническим гепатитом С,

• определения активности ВГС-инфекции,

• принятия решения о начале терапии,

• прогнозирования исхода терапии и необходимости ее продолжения,

• определения вирусологического ответа на противовирусную терапию.

Разработан подход к дизайну бинарных генотип-специфичных зондов, позволяющих типировать мононуклеотидный полиморфизм, в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов.

Разработанный набор для дифференциации генотипов 1, 2 и 3 с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступных наборов реагентов «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РНК ВГС-генотип», выпускаемых ЗАО «Вектор-Бест» и прошедших государственную регистрацию.

Разработанный набор «РеалБест РНК ВГС-генотип» для комплексной ПЦР-диагностики ВГС включает реакционную смесь для выявления, количественного определения РНК и реакционную смесь для генотипирования ВГС. Набор с такой комплектацией удобен для применения в клинической практике на этапе обследования пациентов до начала проведения противовирусной терапии для комплексной ПЦР-диагностики ВГС.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный алгоритм проведения количественного анализа позволяет достигнуть высокой воспроизводимости результатов анализа за счет предложенной системы обработки исходных флуоресцентных данных и процедуры определения вирусной нагрузки с возможностью учета потерь НК в процессе пробоподготовки, а также эффективности амплификации.

2. Зонды с оригинальным дизайном, названные бинарными, позволяют дифференцировать последовательности, содержащие одиночные замены.

3. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС» обладает следующими характеристиками:

- аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл

- аналитическая специфичность-100%

- линейный диапазон измеряемых концентраций - 102-107 МЕ/мл

- сходимость (прецизионность) - коэффициент вариации количественных оценок в логарифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107 МЕ/мл и от 2,5 до 12% при концентрациях вирусной РНК 102-103 МЕ/мл.

4. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС 1/2/3» обладает следующими характеристиками:

- аналитическая чувствительность - 400 МЕ/мл

- аналитическая специфичность - 100%.

Апробация работы и публикации

Налажено серийное производство наборов, разработанных в ходе настоящего исследования на базе ЗАО «Вектор-Бест». Для наборов «РеалБест РНК ВГС», «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РНК ВГС-генотип» получены государственные регистрационные удостоверения № ФСР 2008/02288, № ФСР 2010/09021 и № ФСР 2010/09022, соответ-

ственно. По результатам исследований опубликовано 4 работы в научных журналах, 3 из которых входят в перечень ВАК. Работа была представлена на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г. в Новосибирске и на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г. в Москве, а также доложена на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН в 2009 г.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 224 страницах машинописного текста содержит 86 рисунков, 10 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы (30 отечественных, 189 иностранных источников и 4 нормативных акта) и двух приложений (23 е.).

Вклад автора

Разработка наборов реагентов и обработка результатов проводилась автором самостоятельно. Подготовка образцов к секвенированию осуществлялась совместно с И.О. Мазуниным (ИЦиГ СО РАН). Апробация разработанных наборов проводилась совместно с A.A. Сибиряковой и Т.А. Стацевич (ЗАО «Вектор-Бест»), Разработка последовательности ВКО-И осуществлялась совместно с Д.И. Тимофеевым (ЗАО «Вектор-Бест»), ИФА-анализ проводился О.Ю. Тумановой (ЗАО «Вектор-Бест»),

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемый материал

Материалом для исследования служили 1525 инактивированных проб сыворотки и плазмы крови доноров анти-ВГС-положительных по скрининговому тесту ИФА (Бест анти-ВГС, ЗАО «Вектор-Бест»), с добавлением в качестве антикоагулянта ЭДТА в конечной концентрации 2 мг/мл. Образцы были предоставлены в зашифрованном виде без персонализированной информации «Новосибирским центром крови», «Станцией переливания крови» г. Рубцовск и «Томской областной станцией переливания крови» в соответствии с приказом Минздрава РФ N 193 «О внедрении в практику работы службы крови в Российской Федерации метода карантинизации свежезамороженной плазмы» от 07.05.2003, в редакции от 19.03.2010.

Для проведения обследования больных с моноинфекцией ВГС и коин-фекцией ВИЧ/ВГС в рамках апробации разработанных тестов были использованы инактивированные образцы сыворотки крови, поступившие для анализа в НИИ скорой помощи имени Н.В. Склифосовского в 2008 г: 304 образца положительных в скрининговых тестах ИФА на анти-ВГС и 493 образца положительных в скрининговых тестах ИФА на анти-ВИЧ. Образцы были предоставлены в зашифрованном виде без персонализированной информации. Исследования проводили с соблюдением принципов добровольности и конфедициальности в соответствии с «Основами законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан», утвержденными ВС РФ 22.07.1993, в редакции от 28.09.2010.

Олигонуклеотиды

Синтез всех олигонуклеотидов был проведен в компании «Синтол», Москва.

Таблица

Последовательности олигонуклеотидов

Название последовательность длина, н комментарии

И 5 '-АСТССССТОТСАООААСТШПСТТСАСОС 31 праймеры для секве-нирования б'итя

Ш 5'-ТССЛСОСТСТАСОАОАССТШ1ЮОСАСТСО 32

Рэю 5'-АСТССССГСТСАООААСТ 18

5'-ТССАСОСТСТАСОАОАССТ 19

р 5'-СШСГАСССАГСОССТТАОТА 21 праймеры для выявления РНК ВГС

Я 5'-САСТСОСААССАСССТАТСАО 21

14С 1ЮХ-СОООАОЛСССЛ(Т-В1102) АСТЮТСТОССОААС Су5-СОСОАОАОССА(Т-ВНО-3) АСТЮТСТСКХЮААС 27 Зонд для выявления всех генотипов ВГС

У7 АТССАСОСАТТСОТТССТС 19 Праймеры для выявления ВКО (ВКО-И)

У8 СТССТТСАОСТТГССАТССТ 20

РАМ-ОАОАТГГСОЛС(Т-ВНд 1) ТССЮСТССОАСАСАСО 28 Зонд для выявления ВКО

Название последовательность длина, и комментарии

ВКО-UFA GGÄTCCGCGAATTCCTCTGTCGCATCGAAG CCCAAGATCTCAAGAGCAGAGAACAGAGC AGACAAGCTTGACTCGAG 77 последовательность стандарта

S1 ATCGAAGCCCAAGATC(T-BHQ1)CAA 20 Праймеры-зонды для выявления ирА-ВКО

S2 TCTGCTCTGTTCTCTGC(T-FAM)C 19

G1Z-4 ROX-AATC(T-BHQ2)CCAGGCAIIIIICGGGTTG ATCCAAGAAAGGACCCG 41 Зонд для выявления генотипа 1 ВГС

G2Z-2 FAM-CCACTCTA(T-BHQ1)GCCCGGCCATT-TGG 23 Зонды для выявления генотипа 2 ВГС

G2bZ2 FAM-CCACTCTA(T-BHQ 1 )GTCCGGTC АТГ-TGG 23

G3Z1 R6G-GAGATCAC(T-BHQ 1) AGCIIIIIAGTGTTGGGTC GCGAAAGGCCT 39 Зонды для выявления генотипа 3 ВГС

G3aZ3 R6G-GTCACCC(C-BHQ 1) AGCIIIIICGGTGTACTCA CCGGTTCCGC 37

Примечание инозин, FAM-карбоксифлуоресцеин,R6G-6-карбоксиро-дамин, ROX - карбокси-х-родамин, Су5 - цианиновый краситель, BHQ1, BHQ2 (black hole quenchers) - гасители флуоресценции

Контрольные образцы

Для определения характеристик разработанных наборов использовали контрольные образцы:

СОП lb. СОП 2а. СОП За - стандартные образцы предприятия (СОП) соответствующих субтипов, охарактеризованные относительно международного стандарта (WHO Second International Standard for Hepatitis С virus RNA for Genomic Amplification Technology Assay, NIBSC 96/798) в международных единицах на мл (ME/мл). Образцы приготовлены из сывороток крови с высокой концентрацией РНК ВГС, разведенных на пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров опасных вирусных инфекций.

Для изготовления панели стандартных контрольных образцов субтипов la. lb. 2а. 2Ь. За. ЗЬ ВГС использовали сыворотки крови больных ГС с концентрацией РНК 106-107 ME/мл, а для субтипов 4а, 4Ь, 5а, 6а ибЬ-сконструированныеполинуклеотидныематрицы,соответствующие к ДНК ВГС.

Положительный контрольный образен (ПКО) представляет собой смесь ампликонов, наработанных с использованием праймеров Fi, Ri на матрицах генотипов 1-3, смешанных в равных соотношениях. Образец ПКО разводли на стабилизирующем растворе, содержащем 20 мг/мл БСА, 100 мг/мл сахарозы, 5 мМ ЭДТА, pH 8,0. Концентрация ПКО была определена относительно СОП lb и составляла 15000 МЕ/мл.

Калибровочные образцы (KQ1 и KQ2) представляют собой ампли-коны, наработанные с использованием матрицы генотипа 1 и праймеров Fi, Ri и разведенные на стабилизирующем растворе. Концентрация KOI - 105,К02-108 МЕ/мл.

Внутренний контрольный образец ("ВКО) представляет собой препарат фагоподобных частиц, содержащих РНК ВКО, разведенных на стабилизирующем растворе до 10" копий/мл.

Отрицательный контрольный образец (ОКО) представляет собой пул сывороток крови здоровых доноров (не содержащих РНК ВГС).

Установление нуклеотидной последовательности

Определение нуклеотидной последовательности фрагмента 5'-UTR ВГС, длиной 298 нуклеотидов (праймеры Fi и Ri), проводили по методу Сенгера. Для установления генотипа секвенированных последовательностей проводили филогенетический анализ с помощью программы «Vector NTIV 8.0» и «Mega 4».

Выделение РНК

Выделение РНК ВГС из инактивированной сыворотки/плазмы крови проводили с использованием наборов реагентов «РеалБест экстракция 1000» и «РеалБест экстракция 100» производства ЗАО «Вектор-Бест» в соответствии с инструкциями производителя.

Проведение ОТ-ПЦР

Для проведения ОТ-ПЦР использовали амплификаторы с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени: «iQ5», «CFX96» (Bio-Rad, США); «Rotor-Gene 3000/6000» («Corbet Research», Австралия). Параметры циклирования: обратная транскрипция 45°С, 30 мин.,

45 циклов при 94°С - 10 сек., 60°С - 20 сек. Обработку флуоресцентных данных проводили с использованием программного обеспечения «РеалБест-диагностика» (ЗАО «Вектор-Бест»), В основу программы легли разработанные нами алгоритмы обработки исходных флуоресцентных данных и определения Cq.

Для выявления РНК вируса гепатита С обратную транскрипцию и ПЦР осуществляли в одном реакционном буфере (50 mM Tris-S04, рН 8,0; 10 шМ (NH4)2SO„; 3,5тМ MgCl2; 30 mM КС1; 0,01% Tween-20), содержащем два фермента: ревертазу MMLV и Taq-полимеразу в комплексе с антителами к ее активному центру (горячий старт), dNTP, БСА, трегалозу, бетаин, праймеры F, R; V7, V8 и зонды Z4C, VZ. Канал «ROX» - детекция амплификации к-ДНК ВГС, канал «FAM» - детекция амплификации кДНК ВКО.

Для дифференциации генотипов 1, 2, 3 ВГС реакционная смесь аналогичная описанной выше содержала праймеры F, R и зонды G1Z4, G2Z2, G2bZ2, G3Zl,G3aZ3.

Готовые реакционные смеси лиофильно высушивали по 50 мкл в микропробирках по 0,2 мл.

Статистическая обработка данных

Коэффициент вариации (КВ или CV), стандартное отклонение (SD), коэффициент корреляции рассчитывали с использованием программного пакета статистической обработки Microsoft Excel 2007.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы «Vector NTI v8.0», «MEGA4» и «GenDoc». Подбор и анализ праймеров и зондов осуществляли с помощью online пакета программ «SciTools», размещенных на сайте «IDT» по адресу http://eu.idtdna.com. С помощью «BLAST» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) проверяли специфичность подобранных праймеров и зондов. Пакет программ «UNAFold» использовали для анализа системы геноти-пирования в следующих условиях: [Na]=0.11 M, [Mg2+]=0.0034 M.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка набора для выявления и количественного определения РНК вируса гепатита С - «РеалБест РНК ВГС»

При разработке схемы детекции вируса гепатита С в качестве целевого регистрируемого участка вирусного генома нами был выбран консервативный участок 5' концевого нетранслируемого района (5'ШТ1). Проведено выравнивание 600 последовательностей референсных изо-лятов ВГС, относящихся ко всем известным генотипам и субтипам, а также рекомбинантам. Подобран зонд Z4C в пределах наиболее консервативного участка, полностью соответствующего подавляющему большинству имеющихся в базах штаммов ВГС.

Для выбранного сайта локализации гибридизационного зонда с помощью программного пакета «ЗаТооЬ» были подобраны праймеры Р и К, обеспечивающие при проведении ПЦР наилучшую динамику прироста флуоресценции и наименьшие значения Сц. Длина амплифициру-емого фрагмента 241 н.

Совмещение этапов обратной транскрипции и ПЦР было осуществлено за счет подбора буфера, соотношения трегалозы и бетаина, добавления в реакционную смесь БСА для стабилизации ферментов и антител к активному центру Тац-полимеразы, обеспечивающих горячий старт. Для приготовления готовых реакционных смесей (ГРС) была использована технология лиофильного высушивания, обеспечивающая высокую стабильность при транспортировке и хранении.

В систему выявления РНК ВГС был введен разработанный нами неконкурентный ВКО для контролирования этапов пробоподготов-ки и амплификации. Отсутствие конкуренции стандарта и целевой реакции было достигнуто за счет дизайна последовательности ВКО, заключающегося в пошаговом подборе олигонуклеотидов, не влияющих на амплификацию ВГС, с последующим их использованием для конструирования последовательности контроля. Для приготовления стабильного препарата ВКО была применена технология защищенной РНК.

Первичная обработка флуоресцентных данных ПЦР производится программным обеспечением, управляющим детектирующим амплифи-катором. В результате пользователь получает ряд значений дискретной зависимости флуоресценции от цикла ПЦР для каждого образца. Дальнейшую обработку флуоресцентных кривых есть возможность прово-

дить собственным способом, комбинируя подходы на различных этапах, для получения более точных и воспроизводимых результатов

В программном обеспечении «РеалБест-диагностика» реализован предложенный нами алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых и обработки с помощью фильтра высокочастотного шума (осуществляет замену значений флуоресценции в каждой точке средним по ближайшим 5 точкам) с последующим нахождением максимума второй производной (ББМ) путем аппроксимации девяти значений положительного пика полиномиальной функцией (рис. 1).

Значение ББМ используется в качестве характеристической точки (Ся), описывающей флуоресцентную кривую. Предложенный алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.

Для нахождения концентрации анализируемого образца нами реализован подход с использованием одного образца сравнения в каждой

Рис.1. Принцип действия фильтра устранения разрывов и нахождение ЭОМ Примечание - А- процедура устранения разрыва; программа проводит прямые Ы и Ь2 через две пары точек (\SDM-2, х50М-1) и (хЗОМ, х31Ж+1), соответственно, а затем строит прямую ЬЗ, проходящую через, хЭОМ-1 с усредненным наклоном между Ы и Ь2; далее рассчитывается Д между исходным значением флуоресценции и ЬЗ в ЗЮМ; основное преобразование состоит в том, что из значений флуоресценции XI > Я ОМ программа производит вычитание А, а до БЭМ значения остаются неизменными; Б - графики накопления флуоресценции до и после преобразования; В - нахождение ББМ на основе данных после устранения разрыва и обработки с помощью фильтра высокочастотного шума.

постановке. Эффективность амплификации предложено определять в одной «валидационной» постановке для серии набора реагентов с использованием калибровочных образцов. Такой подход позволил значительно сократить количество контрольных точек в индивидуальной постановке (3 ПКО, 1 ОКО), что позволило снизить себестоимость анализа. Для учета возможных потерь НК в процессе пробоподготовки нами был разработан оригинальный подход введения поправки на ВКО, суть которой заключается в смещении значения Cq ВГС на Д Cq ВКО относительно среднего по всей постановке. Такая поправка корректна только для сдвигов, вызванных потерей НК в процессе пробоподготовки, а не влиянием ингибиторов. Для подтверждения возможности использования такой поправки в серии экспериментов с двумя ВКО (UFA-BKO и ВКО-И) было показано что система «РеалБест экстракция 100»/ «РеалБест РНК ВГС» не ингибируется веществами, содержащимися в препаратах НК, выделенных из сывороток и плазм с различными физическими свойствами.

Характеристики набора «РеалБест РНК ВГС» определяли с использованием контрольных образцов. Аналитическую чувствительность определяли путем анализа серии разведений СОШЬ, приготовленных на ВГС-отрицательной ЭДТА-плазме или сыворотке человека. По результатам пробит-анализа чувствительность составила 15 МЕ/мл. Линейный диапазон составил 102-107 МЕ/мл с отклонением от теоретических значений не более 0,2 loglO. Коэффициент вариации количественных оценок как внутри индивидуальной постановки, так и между различными постановками, в логарифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107 МЕ/мл и от 2,5 до 12% при концентрациях вирусной РНК 102-103 МЕ/мл. Специфичность анализа на выборке отрицательных сывороток и ЭДТА-плазм составила 100%. На серии разведений СОШЬ, СОП2а, СОПЗа было показано, что наиболее распространенные в РФ генотипы выявляются с равной эффективностью. Коэффициент корреляции количественных оценок, полученных с использованием «РеалБест РНК ВГС» с наборами «Abbott RealTime™ HCV», «ОТ-Гепатоген-С количественный» и «АмплиСенс НСУ-Монитор-FRT» составил 0,96, 0,9 и 0,663, соответственно. Пример сопоставления результатов количественного анализа с использованием наборов «РеалБест РНК ВГС», «Abbott RealTime™ HCV» и «АмплиСенс HCV-Mohhtop-FRT» представлен на рис. 2.

у = 1,0671*-0,5858

у = 0,8385« + 0,2352

Abbott ReatTim«1" HCV, ¡в МЕ/мл

РвалБест РНК ВГС, !д МВмл

1 2 Э 4 5 6 7 в 9 10 11 12 13 14

номер образца

та Abbott ReatTimt'" HCV, lg МЕ/мл V Реалбвст РНК ВГС, lg МЕ/мл ШАмплиСенс HCV-Mohhtop-FRT, ig МЕ/мл

Рис.2. Сопоставление количественных оценок, полученных с использованием наборов трех производителей (А) и определение коэффициентов корреляции (Б, В)

Разработка набора для дифференциации генотипов 1,2 и 3 ВГС -«РеалБест РНК ВГС-1/2/3»

При разработке набора для выявления и генотипирования ВГС нами предложен подход для создания генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, структурно и функционально отличаются от стандартных зондов и состоят из 5'- и З'-сегментов, соединенных линкером (рис. 3).

Более длинный 3'-сегмент обеспечивает посадку зонда на матрицу до гибридизации праймеров, более короткий 5'-сегмент, содержащий флуорофор и гаситель, обеспечивает специфичность зонда (в участке его гибридизации содержится типируемый полиморфизм). Принцип действия бинарного зонда показан на рис. 4.

Основными преимуществами бинарных зондов является высокая специфичность и возможность типирования мононуклеотидного полиморфизма в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов (по сути, предложена альтернатива коротким зондам с до-

-Г-Ч^-У-

5'-сегмент дезоксиинозиновый З'-сегмент линкер

Рис.3. Строение бинарного зонда Примечание — И -флуорофор, Q - гаситель

Рис.4. Принцип действия бинарного зонда Примечание - А - матрица полностью соответствует зонду; Б-замены в участке посадки 5'-сегмента; В - серия замен в участке посадки 3'-сегмента

рогостоящими модификациями, повышающими Тгп, такими как 1ЛЧА, КЮВ).

В основе системы генотипирования была использована реакционная смесь «РеалБест РНК ВГС». Подбор зондов осуществляли в пределах ампликона, ограниченного праймерами ¥ и Я, зонд г4С использовали в качестве контроля для оценки эффективности расщепления генотип-специфичных зондов. На каждый генотип было подобрано 4-5 стандартных и бинарных зондов. Основные критерии, по которым проводили подбор зондов: специфичность детекции, амплитуда флуоресцентного сигнала, значение цикла для количественных оценок и расположение в пределах выбранного района. В результате были подобраны зонды для

выявления генотипов 1, 2 и 3, расположенные так в пределах ампли-кона F-R, что их можно использовать одновременно в одной реакции (каждый генотип регистрируется в отдельном канале амплификатора). Подобранные зонды обеспечивают высокую специфичность генотипи-рования (отсутствуют перекрестные реакции между генотипами). Зонд для выявления генотипа 1 уникален тем, что дискриминация генотипов 2, 3,4,5 достигается за счет мисматчей расположенных в участке посадки 5'-сегмента, а генотипа 6 - за счет инсерций в участке гибридизации 3'-сегмента (в остальных бинарных зондах специфичность определяется только 5'-сегментом).

Принцип функционирования бинарных зондов был подтвержден в серии экспериментов in silico на примере G1Z4 с использованием программного обеспечения UNA-Fold, которые заключались в моделировании дуплексов, образуемых зондом с различными генотипами, а так же в экспериментах по плавлению бинарного зонда с олигонуклеотидами, соответствующими участку посадки всего зонда и составляющих его сегментов.

Для определения надежности выявления и дифференциации генотипов ВГС с использованием разработанной комбинации зондов была проведена работа по поиску мутантных изолятов , в ходе которой была установлена нуклеотидная последовательность 5'-UTR 188 геновари-антов, циркулирующих на территории Западной Сибири, из которых была сформирована база мутантных изолятов. На основе собранной базы изолятов проверяли устойчивость разработанной схемы детекции к возможным мисматчам в участках гибридизации генотип-специфичных зондов. В базу вошли изоляты субтипа За, имеющие мононуклео-тидные полиморфизмы, не встречающиеся в Los Alamos HCV Sequence Database. С учетом именно этих геновариантов для выявления генотипа 3 ВГС было подобрано два зонда (G3Z1 и G3aZ3) на различные районы 5'-UTR. Для генотипов 1,2,3 была показана устойчивость схемы детекции к наличию мисматчей в участках гибридизации зондов.

Пример результатов, получаемых с использованием набора «Реал-Бест РНК ВГС-1/2/3» представлен на рис. 5.

Аналитическая чувствительность генотипирования составила 400 ME/мл. Для апробации системы генотипирования было использовано 188 образцов сыворотки крови инфицированных ВГС пациентов из Сибирского региона, вирусная нагрузка у которых, определенная с помощью «РеалБест РНК ВГС», варьировала в диапазоне 103-107 МБ/ мл. В результате анализа ВГС генотип 1 был выявлен в 45 % (п=85)

Рис. 5. Пример результатов, получаемых с использованием набора «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» Примечание - приведены графики накопления флуоресценции для каналов «ROX», «FAM», «НЕХ», «Су5»; F- относительные единицы флуоресценции; кружочками выделены флуоресцентные кривые амплификации кДНК ПКО

проб, генотип 2 - в 6 % (n=l 1), генотип 3 - в 49 % (n=92), а 4-6 генотипы не были обнаружены. При исследовании сывороток этой выборки с использованием референсного метода - прямого секвенирования 5'-UTR области РНК ВГС с последующим филогенетическим анализом - дискордантных результатов получено не было, что подтвердило высокую специфичность разработанной системы генотипирова-ния (100%). В рамках проведения расширенных клинических испытаний набора реагентов «РеалБест РНК ВГС-генотип» было проанализировано 885 клинических образцов (440 сывороток и 445 ЭДТА-плазм), предоставленных «Новосибирским центром крови», «Станцией переливания крови» г. Рубцовск и «Томской областной станцией переливания крови». В результате анализа ВГС генотип 1 был выявлен в 39 % проб, генотип 2 - в 7 %, генотип 3 - в 52 % и микст инфекция 1+3 в 2%, т. е. выявлено преобладание генотипа 3. Полученные данные согласуются с исследованиями по распределению генотипов ВГС в Томской области, где также показано преобладание генотипа 3.

В рамках апробации «РеалБест РНК ВГС» и «РеалБест РНК В ГС-1/2/3» было проведено обследование ВИЧ-инфицированных с ко-инфекцией ВГС. Оказалось, что среди ВИЧ-инфицированных 43,5% ко-инфицированы ВГС; 9% ВИЧ-инфицированных, у которых выявляется РНК ВГС, отрицательны по ИФА на анти-ВГС. Эти данные указывает на необходимость ранней ПЦР-диагностики ВГС у ВИЧ-инфицированных. Для всех образцов, положительных по «РеалБест РНК ВГС», удалось определить генотип, таким образом, диагностическая чувствительность «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» составила 100%. Было показано, что в выборке больных с моноинфекцией ВГС преобладает генотип 3, тогда как у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС генотипы 1 и 3 присутствуют в равном соотношении.

ВЫВОДЫ

1. Для выявления и количественного определения РНК ВГС подобраны специфические прайм еры и зонды в пределах района 5'-UTR, совмещены этапы обратной транскрипции и ПЦР; разработан подход для обработки исходных флуоресцентных данных, обеспечивающий высокую устойчивость алгоритма определения значения Cq к скачкам и разрывам в флуоресцентных кривых, а также оптимизирована процедура проведения количественного анализа с одним образцом сравнения.

2. Разработан диагностический набор «РеалБест РНК ВГС» со следующими характеристиками: аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл; аналитическая специфичность 100%; линейный диапазон измеряемых концентраций 102-107МЕ/мл; коэффициент вариации количественных оценок от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107МЕ/мл и от 2,5 до 12% при концентрациях вирусной РНК 102-103 МЕ/мл. Коэффициент корреляции количественных оценок разработанного теста с наборами «Abbott RealTime™ HCV» и «ОТ-Гепатоген-С количественный» составляет 0,96 и 0,9, соответственно.

3. Предложен оригинальный подход к дизайну генотип-специфичных бинарных зондов, позволяющих дифференцировать однонуклео-тидные замены в пределах консервативного участка 10-12 нуклеотидов.

ческий набор «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» с аналитической чувствительностью 400 ME/мл; диагностической чувствительностью 100%; аналитической и диагностической специфичностью 100%.

5. При сравнительном анализе 200 пациентов с моноинфекцией ВГС и 187 коинфицированных ВИЧ/ВГС установлено, что 9% коинфициро-ванных содержат РНК ВГС, но отрицательны по ИФА на анти-ВГС, чего не наблюдается у пациентов только с ВГС. У больных с моноинфекцией ВГС преобладает генотип 3, у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС генотипы 1 и 3 присутствуют в равном соотношении.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации основных результатов диссертации

1. Иванов М. К., Брагин А. Г., Прасолова М. А., Ведерников В. Е., Дымшиц Г. М. Разработка неконкурентного экзогенного внутреннего контроля ПЦР с детекцией в режиме реального времени по принципу UFA // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2009. № 3. С. 8-13.

2. Ведерников В.Е., Иванов М.К., Прасолова М.А., Кандрушин Е.В., Дымшиц Г.М. Генотипирование вируса гепетита С при помощи ПЦР- РВ с использованием 5'-гидролизуемых зондов с олигодезокси-инозиновыми линкерами // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2009. № 4. С. 32-38.

3. Ведерников В.Е., Туманова О.Ю., Иванов М.К., Дымшиц Г.М. Распространенность различных генотипов вируса гепатита С в Москве среди лиц, инфицированных вирусом иммунодефицита человека // Информационный Вестник ВОГиС 2010. Т. 14 № 1. С, 659-664.

Другие журналы

4. Ведерников В.Е., Иванов М.К., Трухина A.B., Кандрушин Е.В. Два новых диагностических набора: «РеалБест РНК ВГС» и «РеалБест РНК ВГС-генотип» // «Новости «Вектор-Бест» 2009. Т. 2 № 52. С. 2-8.

Сборники тезисов конференций

5. Иванов М.К., Тимофеев Д.И., Поповский A.B., Ведерников В.Е., Брагин А.Г. Разработка неконкурентного экзогенного внутреннего контроля для ПЦР с детекцией в режиме реального времени на основе ме-

тода UFA: тез. докл. IV съезда Росс, общества биохимиков и молекулярных биологов., Новосибирск., 2008. С. 348.

6. Ведерников В.Е., Прасолова М.А., Иванов М.К., Дымшиц Г.М. Генотипирование вируса гепатита С при помощи мультиплексной ПЦР-РВ с использованием 5'- гидролизуемых зондов с олигоинозиновыми линкерами: тез. докл. IV съезда Росс, общества биохимиков и молекулярных биологов., Новосибирск., 2008. С. 349.

7. Ведерников В.Е., Иванов М.К., Дымшиц Г.М. Генотипирование вируса гепатита С методом real-time PCR с использованием флуороген-ных бинарных зондов: тез. докл. V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров., М., 2009. Ч. 1. С. 398.

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность руководителю работы д.б.н., проф. Г.М. Дымшицу и глубокую благодарность своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа: к.б.н. М.К. Иванову за активное участие в обсуждении постановок экспериментов, получаемых результатов, ценные замечания и рекомендации по написанию диссертации, к.б.н. Д.И. Тимофееву, к.б.н. А.Г. Брагину, м.н.с. С.А. Глушкову, м.н.с. М.А. Прасаловой, к.б.н. С.Е. Титову, м.н.с. Е.С. Нетесовой, микробиологу Ф.З. Азаевой. Особую благодарность автор приносит д.б.н. В.А. Мордвинову, к.б.н., доц. A.B. Ко-четову, д.б.н. Л.И. Карпенко и к.б.н. В.А. Терновому за внимательное прочтение и обсуждение диссертации, ценные замечания и рекомендации, а также д.б.н., проф. В.Б. Локтеву, д.б.н., проф., член-корр. РАН С.В Нетесову, д.б.н. М.Ш. Азаеву, д.б.н. Н.Б. Рубцову и к.б.н. Г.В. Кочневой за критическое рассмотрение и обсуждение результатов работы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

Анти-ВГС - антитела к вирусу гепатита С

ВГС - вирус гепатита С

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВКО - внутренний контрольный образец

ГРС - готовая реакционная смесь

ГС - гепатит С

ИФА - иммуноферментный анализ

КО - калибровочный образец

ME - международные единицы

ОКО - отрицательный контрольный образц

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПКО - положительный контрольный образец ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

РНК - рибонуклеиновая кислота

СОП - стандартный образец предприятия

ЭДТА - этилендиаминотетраацетат

5'UTR - 5' некодирующая область

NAT - nucleic acid technologies (технологии амплификационного тестирования нуклеиновых кислот)

LNA - locked nucleic acid (модифицированный аналог нуклеотида) MGB - minor groove binder (малобороздочный лиганд) UFA - universal fluorescence amplification (схема детекции с использованием флуоресцентно-меченных праймеров)

Подписано в печать 27.04.11. Бумага офсетная. Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,5. Уч-изд. л. 1,5. Тираж 100. Отдел оперативной печати ЗАО «Вектор-Бест». 630559 Новосибирская обл., пгт. Кольцово, а/я 125.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ведерников, Виталий Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение вируса гепатита С.

1.2. Жизненный цикл ВГС.

1.3. Вариабельность генома ВГС и его генотипы.

1.4. Алгоритмы диагностики и лечения вирусного гепатита С.

1.5. Полимеразная цепная реакция с регистрацией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

1.6. ПЦР в режиме реального времени и схемы флуоресцентной детекции.

1.7. Методы анализа графиков накопления ДНК.

1.7.1. Алгоритмы сглаживания.

1.7.2. Вычитание фоновой составляющей.

1.7.3. Определение значения Сц.

1.7.4. Пороговый метод сравнения графиков накопления ДНК (О;).

1.7.5. Метод максимума второй производной - нахождение Сц по форме кривой.

1.7.6. Методы оценки эффективности амплификации.

1.7.7. Метод серийных разведений.

1.7.8. Определение Е по приросту флуоресценции в экспоненциальной фазе.

1.7.9. Аппроксимация сигмоидой или логистической функцией.

1.7.10. Оценка эффективности амплификации в экспоненциальной фазе с использованием сложных моделей.

1.7.11. Обсуждение методов определения Сц и Е.

1.8. Общий дизайн количественного ПЦР-исследования с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.

1.9. Общие рабочие характеристики тестов для выявления и количественного определения РНК ВГС.

1.10. Генотипирование ВГС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов"

Актуальность проблемы

Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые в течение многих лет службами здравоохранения большинства государств по предотвращению распространения гепатита С (ГС), эта инфекция и в настоящее время является актуальной мировой проблемой. По данным экспертов на земном шаре насчитывается более 500 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), в Российской Федерации их число приближается к 5 млн. Количество новых случаев заболевания ГС, регистрируемых в США, ежегодно достигает около 175 тыс., в Западной Европе - 170 тыс., в Японии — более 350 тыс. Только в США каждый год умирает около 10 тыс. человек, инфицированных ВГС [149; 216]. Ситуацию в значительной мере осложняют отсутствие вакцины против ГС, циркуляция большого количества разных генотипов вируса, способность его к ускользанию от иммунного контроля человека за счет непрерывного обновления антигенной структуры, а также высокая частота протекания инфекции в скрытой бессимптомной форме. Поэтому актуальными задачами для здравоохранения всех стран являются: профилактические меры по снижению риска заражения ВГС здорового населения, повышение эффективности выявления инфицированных лиц и проведение действенной противовирусной терапии.

Для диагностики гепатита С в настоящее время применяется комплекс методов, включающих определение в сыворотке крови обследуемых людей антител к вирусным антигенам с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблота, а также обнаружение вирусной РНК ВГС с использованием технологий амплификационного тестирования нуклеиновых кислот (NAT) [14]. Одним из широко распространенных NAT-методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ), благодаря простоте исполнения, высокой чувствительности, специфичности и надежной интерпретации результатов анализа. Высокая чувствительность этого метода особенно актуальна в трансфузиологии для обеспечения учреждений здравоохранения безопасной донорской кровью и ее компонентами, поскольку он (метод) позволяет выявлять нуклеиновую кислоту ВИЧ и вирусных гепатитов В (ВГВ) и С (ВГС) в ИФА-отрицательных пробах крови [44], полученных в период сероконверсионного окна [6]. Применение ПЦР в службе крови в США, Канаде, Великобритании, Франции и ряде других стран уже привело к снижению риска трансфузионной передачи ВГС в 6 раз [113]. В настоящее время ПЦР-тестирование активно внедряется в донорскую службу нашей страны. Согласно приказу Минздрава N 364 "Об утверждении Порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов" РФ от 14.09.2001 в редакции от 06.06.2008 «образцы крови с отрицательными результатами ИФА-тестов, объединенные в минипулы, должны подвергаться исследованию на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС и ВИЧ» [222].

Комплексное применение методов ИФА и ПЦР позволяет не только значительно повысить эффективность диагностики гепатита С, но также более точно дифференцировать стадии заболевания и определять репликационную активность вируса в организме больного.

Количественные тесты для определения вирусной нагрузки незаменимы при принятии решения о проведении противовирусной терапии, а также определить перинатальное заражение ребенка от матери инфицированной ВГС.

Сопоставление результатов количественного анализа РНК ВГС, полученных с использованием ЫАТ-тестов различных производителей, стало возможным после разработки и сертификации Национальным институтом биологических стандартов и контролей совместно с Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) унифицированного стандарта для измерения РНК ВГС в международных единицах (МБ) [153].

Эффективность противовирусной терапии гепатита С, как установлено в результате многочисленных исследований [154; 156; 157], зависит от генотипа вируса, которым инфицирован больной. Генотип во многих случаях определяет продолжительность терапии и дозу препаратов, именно поэтому наряду с количественным анализом необходимо проводить генотипирование ВГС [217].

Таким образом, для комплексной ПЦР-диагностики ВГС необходимы тесты для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС.

В настоящее время не разработаны нормативные документы, содержащие перечень требований, предъявляемых к диагностическим тестам с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для диагностики ВГС [5]. Тем не менее, при разработке т-Иоше тестов для диагностики ГС можно ориентироваться на параметры наборов реагентов зарубежных аналогов, прошедших широкие клинические испытания.

Представленные на Российском рынке тесты для ПЦР-диагностики ВГС уступают по чувствительности зарубежным аналогам, а также не лишены недостатков в дизайне.

Представленные на отечественном рынке импортные диагностические тесты ведущих мировых производителей ограниченно доступны вследствие высокой стоимости. Поэтому для существенного улучшения ситуации с диагностикой ВГС в России актуальна разработка и внедрение новых отечественных диагностических наборов.

Цель исследования

Задачи исследования

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

Научная новизна

Предложен оригинальный алгоритм введения поправки на внутренний контрольный образец (ВКО) для учета потерь РЖ в процессе пробоподготовки, суть которой заключается в смещении значения Сс/ ВГС на А Сд ВКО относительно среднего Cq ВКО по всей постановке.

При достигнутой воспроизводимости анализа (80<0,3 1о§ю(конц., МЕ/мл) и линейности (с эффективностью амплификации около 100% во всем диапазоне определяемых концентраций) предложен метод определения вирусной нагрузки с одним образцом сравнения, что позволило повысить производительность теста.

Практическая значимость

1. Разработанный подход для выявления и количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке (плазме) крови с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступного набора реагентов «РеалБест РНК ВГС», выпускаемого ЗАО «Вектор-Бест» и прошедшего государственную регистрацию. Разработанный тест может использоваться как для высокочувствительного скринирования донорской крови, так и в клинической практике для:

• подтверждения диагноза гепатит С,

• ведения больных с хроническим гепатитом С,

• определения активности ВГС-инфекции, принятия решения о начале терапии,

• прогнозирования исхода терапии и необходимости ее продолжения,

• определения вирусологического ответа на противовирусную терапию.

2. Разработан подход к дизайну бинарных генотип-специфичных зондов, позволяющих типировать мононуклеотидный полиморфизм, в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов.

3. Разработанный набор для дифференциации генотипов 1, 2 и 3 с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступных наборов реагентов «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РНК ВГС-генотип», выпускаемых ЗАО «Вектор-Бест» и прошедших государственную регистрацию.

4. Разработанный набор «РеалБест РНК ВГС-генотип» для комплексной ПЦР-диагностики ВГС включает реакционную смесь для выявления, количественного определения РНК и реакционную смесь для генотипирования ВГС. Набор с такой комплектацией удобен для применения в клинической практике на этапе обследования пациентов до начала проведения противовирусной терапии для комплексной ПЦР-диагностики ВГС.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный алгоритм проведения количественного анализа, позволяет достигнуть высокой воспроизводимости результатов анализа за счет предложенной системы обработки исходных флуоресцентных данных и процедуры определения вирусной нагрузки с возможностью учета потерь НК в процессе пробоподготовки, а также эффективности амплификации.

3. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС» обладает следующими характеристиками:

-аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл

-аналитическая специфичность -100%

-линейный диапазон измеряемых концентраций -10—10 МЕ/мл

-сходимость (прецизионность) - коэффициент вариации количественных оценок в логарифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107МЕ/мл и от 2,5 до 12% при концентрациях вирусной РНК 102-103 МЕ/мл.

4. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС 1/2/3» обладает следующими характеристиками:

-аналитическая чувствительность - 400 МЕ/мл -аналитическая специфичность -100%. Апробация работы и публикации

На основе разработок, проведенных в ходе настоящего исследования налажено серийное производство наборов на базе ЗАО «Вектор-Бест». Для наборов «РеалБест РНК ВГС», «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РЖ ВГС-генотип» получены государственные регистрационные удостоверения № ФСР 2008/02288, № ФСР 2010/09021 и № ФСР 2010/09022, соответственно. По результатам исследований опубликовано 4 работы в научных журналах, 3 из которых входят в перечень ВАК. Работа была представлена на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г. в Новосибирске и на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г. в Москве, а также доложена на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН в 2009 г.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Ведерников, Виталий Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. Для выявления и количественного определения РНК ВГС подобраны специфические праймеры и. зонды в пределах района 5'-UTR, совмещены этапы обратной транскрипции и ПЦР; разработан подход для; обработки исходных флуоресцентных данных, обеспечивающий высокую устойчивость алгоритма определения значения Cq к скачкам и разрывам в флуоресцентных кривых, а также оптимизирована процедура проведения количественного анализа с одним образцом сравнения.

2. , Разработан диагностический набор «РеалБест РНК ВГС» со следующими характеристиками: аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл; аналитическая специфичность 100%; линейный диапазон измеряемых

О 7 концентраций 10—10 МЕ/мл; коэффициент вариации количественных оценок от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107МЕ/мл и от 2,5 до 12%

2 3 при концентрациях вирусной РНК 10-10 МЕ/мл. Коэффициент корреляции количественных оценок разработанного теста с наборами «Abbott RealTime™ HCV» и «ОТ-Гепатоген-С количественный» составляет 0,96 и 0,9, соответственно.

3. Предложен оригинальный подход к дизайну генотип-специфичных бинарных зондов, позволяющих дифференцировать однонуклеотидные замены в пределах консервативного участка 10-12 нуклеотидов.

4. Подобраны генотип-специфичные флуорогенные зонды, обеспечивающие максимальную специфичность и позволяющие в одной пробирке одновременно выявлять генотипы 1, 2 и 3 ВГС; проведена, оптимизация условий ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Разработан диагностический набор «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» с аналитической чувствительностью 400 МЕ/мл; диагностической чувствительностью 100%; аналитической и диагностической, специфичностью 100%.

5. При сравнительном анализе 200 пациентов с моноинфекцией ВГС и 187 коинфицированных ВИЧ/ВГС установлено, что 9% коинфицированных содержат РНК ВГС, но отрицательны по ИФА на анти-ВГС, чего не наблюдается у пациентов только с ВГС. У больных с моноинфекцией ВГС преобладает генотип 3, у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС генотипы 1 и 3 присутствуют в равном соотношении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для комплексной ПЦР-диагностики ВГС необходимы тесты для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС.

Основным результатом настоящей работы является разработка наборов реагентов на основе ПЦР-РВ для комплексной диагностики ВГС: выявления, количественного определения и генотипирования.

В ходе работ по созданию теста для выявления и количественного определения РНК ВГС особое внимание было уделено:

1. Тщательному подбору праймеров и зондов, в большей степени определяющих специфичность анализа. На основании множественного выравнивания для дизайна композиции праймеров и зонда был выбран 5'-иТЯ, как наиболее консервативный участок.

2. Оптимизации состава реакционной смеси. Совмещение этапов-обратной транскрипции и ПЦР было осуществлено за счет подбора буфера, соотношения трегалозы и бетаина, добавления в реакционную смесь БСА для стабилизации ферментов и антител к активному центру Тая-полимеразы, обеспечивающих горячий старт. Для приготовления готовых реакционных смесей (ГРС) была использована технология лиофильного высушивания, обеспечивающая высокую стабильность при транспортировке и хранении.

3. Разработке алгоритма обработки исходных флуоресцентных данных. В программном обеспечении «РеалБест-диагностика» реализован предложенный нами алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых и обработки с помощью фильтра высокочастотного шума с последующим нахождением максимума второй производной (БОМ) путем аппроксимации девяти значений положительного пика полиномиальной функцией. Значение ЭОМ используется в качестве характеристической точки (Сд), описывающей флуоресцентную кривую. Предложенный алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.

4. Разработке экзогенного внутреннего контрольного образца. В систему выявления! РНК ВГС был введен неконкурентный ВКО для контролирования этапов пробоподготовки и амплификации. Отсутствие конкуренции стандарта и целевой реакции было достигнуто за счет дизайна последовательности ВКО, заключающегося в пошаговом подборе олигонуклеотидов, не влияющих на амплификацию ВГС, с последующим их использованием для конструирования последовательности контроля. Для приготовления стабильного препарата ВКО была применена технология защищенной РНК.

5. Разработке алгоритма количественного определения РНК ВГС. В программном обеспечении «РеалБест-диагностика» для нахождения концентрации анализируемого образца реализован подход с использованием одного образца сравнения в каждой постановке. Эффективность амплификации предложено определять в одной «валидационной» постановке для серии набора реагентов с использованием калибровочных образцов. Такой подход позволил значительно сократить количество контрольных точек в индивидуальной постановке (3 ПКО, 1 ОКО), что позволило снизить себестоимость анализа. Для учета возможных потерь НК в процессе пробоподготовки нами был разработан оригинальный подход введения поправки на ВКО, суть которой заключается в смещении значения Cq ВГС на А Сц ВКО относительно среднего по всей постановке. Такая поправка корректна только для сдвигов, вызванных потерей НК в процессе пробоподготовки, а не влиянием ингибиторов. Для подтверждения возможности использования такой поправки в серии экспериментов с двумя ВКО (ЦРА-ВКО и ВКО-И) было показано что система «РеалБест НК экстракция 100»/ «РеалБест РНК ВГС» не ингибируется веществами, содержащимися в препаратах НК, выделенных из сывороток и плазм с различными физическими свойствами.

6. Валидации (определению характеристик набора реагентов). Характеристики набора «РеалБест РНК ВГС» определяли с использованием контролных образцов (СОН, СОШЬ, СОП2а, СОПЗа), охарактеризованных относительно международного стандарта WHO Second International; Standard-for Hepatitis С virus RNA for Genomic Amplification Technology Assay, NIB SC 96/798. Аналитическую чувствительность определяли путем анализа, серии разведений СОП, приготовленных на ВГС-отрицательной ЭДТА-плазме или сыворотке человека. По результатам пробит-анализа чувствительность

2 7 составила 15 ME/мл. Линейный диапазон составил 10-10' ME/мл с отклонением от теоретических значений не более 0,2 log10. Коэффициент вариации количественных оценок как внутри индивидуальной постановки, так и между различными постановками, в логорифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107МЕ/мл и от 2,5 до 12%

3 2 при концентрациях вирусной РНК 10-10 ME/мл. Специфичность анализа на выборке отрицательных сывороток и ЭДТА-плазм составила 100%. На серии разведений СОШЬ, СОП2а, СОПЗа было показано, что наиболее распространенные в РФ генотипы выявляются с равной эффективностью. Количественные оценки, полученные с использованием «РеалБест РНК ВГС» хорошо согласуются с референсным набором Abbott RealTime™ HCV и набором ОТ-Гепатоген-С количественный (коэффициент корреляции 0,96 и 0,9, соответственно) и в меньшей степени согласуются с АмплиСенс HCV-Монитор-FRT (коэффициент корреляции 0,663).

В ходе работ по созданию теста для выявления РНК и генотипирования ВГС особое внимание было уделено:

1. Разработке подхода для создания генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, структурно и функционально отличаются от линейных зондов и состоят из 5'- и 3'-сегментов, соединенных линкером. Более длинный 3'-сегмент обеспечивает посадку зонда на матрицу до гибридизации праймеров, более короткий 5'-сегмент, содержащий флуорофор и гаситель, обеспечивает специфичность зонда (в участке его гибридизации содержится типируемый полиморфизм); Основными преимуществами бинарных зондов является высокая специфичность и возможность типирования мононуклеотидного полиморфизма, расположенного в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов (по сути, альтернатива коротким зондам с дорогостоящими модификациями, повышающими Тш, такими как LNA, MGB). Принцип функционирования бинарного зонда был подтвержден in sil ico с использованием программного обеспечения UNA-Fold, которые заключались в моделировании дуплексов, образуемых зондом с различными генотипами, а также в экспериментах по плавлению бинарного зонда с олигонуклеотидами, соответствующими участку посадки всего зонда и составляющих его сегментов.

2. Подбору зондов для выявления генотипов 1, 2, 3 ВГС. За основу системы генотипирования была взята реакционная смесь «РеалБест РНК BFC». Подбор зондов осуществляли в пределах ампликона, ограниченного праймерами F и R, зонд Z4C использовали в качестве контроля для оценки эффективности расщепления генотип-специфичных зондов. На каждый генотип было подобрано 4-5 стандартных и бинарных зондов. Основные критерии, по которым проводили подбор зондов: специфичность детекции, амплитуда флуоресцентного сигнала, значение цикла для количественных оценок и расположение в пределах выбранного района. В результате были подобраны зонды для выявления генотипов 1, 2 и 3, так расположенные в пределах ампликона F-R, что можно их использовать одновременно в одной реакции (каждый генотип регистрируется в отдельном канале регистрирующего амплификатора). Подобранные зонды обеспечивают высокую специфичность генотипирования (отсутствуют перекрестные реакции между генотипами). Зонд для выявления генотипа 1 уникален тем, что дискриминация генотипов 2, 3, 4, 5 достигается за счет мисматчей, расположенных в участке посадки 5'-сегмента, а генотипа 6 за счет инсерций в участке гибридизации 3'-сегмента (в остальных бинарных зондах специфичность определяется только 5'-сегментом).

3. Выявлению изолятов; имеющих мисматчи-в участках гибридизации генотип-специфичных зондов. В ходе работ по поиску мутантных изолятов, была установлена нуклеотидная последовательность 5'-UTR 188 геновариантов, циркулирующих на территории Западной Сибири. Из штаммов, имеющих мисматчи в участках посадки генотип-специфичных зондов, была собрана база, которая использовалась для проверки влияния мисматчей на амплитуду прироста флуоресценции и значение Cq при проведении генотипирования. В базу вошли штаммы субтипа За, имеющие мононуклеотидные полиморфизмы, не встречающиеся в Los Alamos HCV Sequence Database. С учетом именно этих штаммов для выявления генотипа 3 ВГС было подобрано 2 зонда на различные районы 5'-UTR. В результате для генотипов 1, 2, 3 было показано, что наличие мисматчей не приводит к значительному увеличению значения Cq и снижению амплитуды флуоресцентного сигнала.

4. Определению аналитических характеристик и апробации. Аналитическая чувствительность генотипирования составила 400 ME/мл. Для апробации системы генотипирования было использовано 188 образцов сыворотки крови инфицированных ВГС пациентов, из Сибирского региона, вирусная нагрузка у которых, определенная с помощью «РеалБест РНК ВГС», варьировала в диапазоне 10—10 ME/мл. В результате анализа ВГС генотипа 1 был выявлен в 45 % (п=85) проб, генотипа 2 — в 6 % (n=l 1), генотипа 3 — в 49 % (n=92), а 4-6 генотипы не были обнаружены. При исследовании сывороток этой выборки с использованием референсного метода — прямого секвенирования 5'-UTR области РНК ВГС с последующим филогенетическим анализом — дискордантных результатов получено не было, что подтвердило высокую специфичность разработанной системы генотипирования (100%). В рамках проведения расширенных клинических испытаний набора реагентов «РеалБест

РНК ВГС-генотип» было проанализировано 885 клинических образцов (440 сывороток и 445 ЭДТА-плазм), предоставленных «Новосибирским центром крови», «Станцией переливания крови» г. Рубцовск и «Томской областной станцией переливания- крови». В результате анализа, ВГС генотипа 1 был выявлен в 39 % проб, генотипа 2 — в 7 %, генотипа 3 — в 52 % и микст инфекция 1+3 в 2%, т. е. выявлено преобладание генотипа 3. Полученные данные согласуются с исследованиями по распределению генотипов в Томской области, где также показано преобладание генотипа 3.

В рамках апробации «РеалБест РНК ВГС» и «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» было проведено обследование ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС. Оказалось, что среди ВИЧ-инфицированных 43,5% коинфицированы ВГС; 9% ВИЧ-инфицированных, у которых выявляется РНК ВГС, отрицательны по ИФА на анти-ВГС. Эти данные указывает на необходимость ранней ПЦР-диагностики ВГС у ВИЧ-инфицированных. Для всех образцов, положительных по «РеалБест РНК ВГС», удалось определить генотип, таким образом, диагностическая чувствительность «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» составила 100%. Было показано, что в выборке больных с моноинфекцией ВГС преобладает генотип 3, тогда как у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС генотипы 1 и 3 присутствуют в равном соотношении.

В результате настоящей работы были разработаны, наборы для-комплексной ПЦР-диагностики ГС с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени: набора для выявления и количественного определения вирусной РНК и набора для дифференциации генотипов 1, 2, 3. Предложен вариант набора для комплексной диагностики ВГС - «РеалБест РНК ВГС-генотип», который укомплектован реакционной смесью для выявления и количественного определения РНК ВГС, соответствующей ГРС

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ведерников, Виталий Евгеньевич, Новосибирск

1. Брагин A.F. Стехиометрия минорных последовательностей; и гетероплазмия митохондриального. генома Beta Vulgaris: дис. . канд. биологических наук. Новосибирск., 2010. 145с.

2. Генотипирование вируса гепетита С при помощи ПЦР-РВ с использованием 5'-гидролизуемых зондов с олигодезоксиинозиновыми линкерами / В.Е. Ведерников и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2009. Т. 4. С. 32 38.

3. Глинщикова O.A. Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора: дис. . канд. биологических наук. М., 2004. 96 с.

4. Елов A.A., Федоров H.A. и Суханов Ю.С. Критерии для отбора систем генотестирования, используемых при контроле вирусной безопасности крови и ее продуктов // Вестн. службы крови России. 1998. № 1. С. 18-20.

5. Жибурт Е.Б., Федоров H.A., Рейзман П.В. NAT скрининг вирусных инфекций у доноров повышает безопасность крови // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. № 12. С. 22-23.

6. Иванов А. В., Кузякин А. О., Кочетков С. Н. Молекулярная биология вируса гепатита С // Успехи'биологической химии. 2005. Т. 45. С. 3786

7. HCV в рутинной лабораторной практике / О.Ю. Шипулина и др.: тез. докл. 6iй всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика»., М., 2007. Т. 1. С. 289-293.

8. Маркеры вируса гепатита С при коинфицировании ВИЧ у больных из пермского края / Л.И. Николаева и др.: тез. докл. 6-й всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика», М., 2007. Т. 1. С. 132-134.

9. Метод повышения точности ПЦР «в реальном времени» Д.Ю. Трофимов и др. // Доклады академии наук, 2008. Т. 419. № 3. С. 421-424.

10. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции / В.В. Покровский и др.. М., 1995. 5с.

11. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С (серологические маркеры и методы их выявления) // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. Информационный бюллетень. 2001. Т. 2. № 12.

12. Момыналиев К.Т, Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. //Клиническая лабораторная диагностика. 2000. № 4. С.25-32.

13. Никонова A.A. Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени: дис. . канд. биологических наук. М., 2008. 141 с.

14. Окончательны ли результаты скрининга антител к вирусу гепатита С у доноров крови? / Е.Б. Жибурт и др. // Вестн. службы крови России. 2004. № 4. С. 17-19.

15. Определение ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-зависимых полимераз с использованием флуоресцентной детекции в режимереального времени / А.Г. Брагин и др. // Биохимия. 2008. Т. 73. №. 9. С. 12521264.

16. Плясунова И.В. Изучение генетического разнообразия изолятов вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гепатитами в Новосибирске: автореф. дис. . канд. медицинских наук. Кольцово., 2009. 23 с.

17. Потапова Н.И. разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПНР) в реальном времени для диагностики туберкулеза: дис. . канд. биологических наук. М., 2006. 163 с.

18. ПЦР "в реальном времени" / Д.В. Ребриков и др.. М.-.БИНОМ, 2009. 223с.

19. Разработка неконкурентного экзогенного внутреннего контроля ПЦР с детекцией в режиме реального времени по принципу UFA / М.К. Иванов и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2009. № 3. С. 813.

20. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях Северо-Западной и Центральной частей России/ Д.К. Львов и др. //Вопросы вирусологии. 1995. № 6. С. 251-253.

21. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса. / С.Н. Кузин и др. // Вопросы вирусологии. 1999. № 2. С.79-82.

22. Ребриков Д. В., Трофимов Д. Ю. ПЦР «в реальном времени»: подходы к анализу данных // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. С. 520-528.

23. Спектр генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территории томской области / С.В. Вожаков и др.: тез. докл. 7-й всероссийской* научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика»., М., 2010, Т. 1. С. 206-208.

24. Шустов А.В. Генотипическое разнообразие изолятов и молекулярная вариабельность вируса гепатита С у населения новосибирской области: дис. . канд. биологических наук. Кольцово., 2003. 209 с.

25. Щербаков Д.Н. Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени: автореф. дис. . канд. биологических наук. Кольцово., 2010. 27 с.

26. A data-driven clustering method for time course gene expression data / P. Ma et al. //Nucleic Acids Res. 2006. 34. (4). P. 1261-1269.

27. A novel sequence found at the 3' terminus of hepatitis С virus genome / T. Tanaka et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. 215. (2). P. 744-749.

28. A real-time Taqman method for hepatitis С virus genotyping / K.J. Rolfe et al. // Methods Mol. Biol. 2009. 510. P. 55-71

29. Ailenberg M., Silverman M. Controlled hot start and improved specificity in carrying out PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers (TULIPS) // Biotechniques 2000. 29. P. 1018-1024.

30. Alfaresi M.S., Elkoush A.A. Determination of hepatitis C virus genotypes by melting-curve analysis of quantitative polymerase chain reaction products // Indian J Med-Microbiol. 2007. 25. (3). P. 249-252.

31. Alter J. Epidemiology of viral hepatitis and HIV coinfection // J. Hepatol. 2006. 44. P. 56-59.

32. Amplification efficiency of thermostable DNA polymerases / B. Arezi et al. // Anal Biochem., 2003. 321. (2). P. 226-235.

33. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data / J.M. Ruijter // Nucleic Acids Res. 2009. 37. (6) P. e45.

34. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression / A. Giulietti et al. // Methods. 2001. 25. (4). P. 386-401.

35. Andonov A., Chaudhary R. K. Genotyping of Canadian Hepatitis C Virus Isolates by PCR // Journal Of Clinical Microbiology 1994. 32. (8). P. 20312034.

36. Assessment of spontaneous fluctuations of viral load in untreated patients with chronic hepatitis C by two standardized quantitation methods: branched DNA and Amplicor Monitor / P. Halfon et al. // J. Clin. Microbiol. 1998. 36. (7). P. 2073-2075.

37. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data / C. Ramakers et al. //Neurosci. Lett. 2003. 339. (1). P. 62-66.

38. At least five related, but distinct, hepatitis C viral genotypes exist / T.A. Cha et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. 89. (15). P. 7144-7148.

39. Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA / Q. Meng et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. 39. (8). P: 29372945.

40. Ball T.B., Plummer F.A., HayGlass K.T. Improved mRNA quantitation in LightCycler RT-PCR// Int. Arch. Allergy Immunol. 2003. 130. (1). P. 82-86.

41. Berger A., Preiser W., Doerr H.W. The role of viral load determination for the management of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus and hepatitis C virus infection // Journal of Clinical Virology 2001. 20. (.1-2). P. 23-30.

42. Bergstrom D.E., Zhang P., Johnson W.T. Comparison of the base pairing properties of a series of nitroazole nucleobase analogs in the oligodeoxyribonucleotide sequence 5'- d(CGCXAATTYGCG)-3' // Nucleic Acids Res. 1997. 25. (10). P. 1935-1942.

43. Bhagani S. HIV/hepatitis C co-infection and hepatic fibrosis: looking beyond HIV-associated immune suppression; the contribution of hepatic steatosis and insulin resistance// Gut. 2009. 58. (12). P. 1579-1581.

44. Bostan N., Mahmood T. An overview about hepatitis C: a devastating virus // Crit. Rev. Microbiol. 2010. 36. (2). P. 91-133.

45. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. // Semin. Liver Dis. 1995. 15. (1). P. 41-63.

46. Bukh J., Purcell R.H, Miller R.H. Importance of primer selection for the detection of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reaction assay // Proc. Natl. Acad. ScL USA. 1992. 89. (1). P. 187-191.

47. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates collected worldwide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. 90. (17). P. 8234-8238

48. Bullock G.C., Bruns D.E., Haverstick D.M. Hepatitis C Genotype Determination by Melting Curve Analysis with a Single Set of Fluorescence Resonance Energy Transfer Probes // Clinical Chemistry. 2002. 48. (12). 2147-2154.

49. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J. Mol. Endocrinol. 2000. 25. (2). P." 169-193.

50. Caruntu F.A., Benea L. Acute hepatitis C virus infection: Diagnosis, pathogenesis, treatment // J. Gastrointestin Liver Dis. 2006. 15. (3). 249-256.

51. Cellular glycosaminoglycans and low density lipoprotein receptor are involved in hepatitis C virus adsorption / R. Germi et al. // J. Med. Virol. 2002. 68. (2). P. 206-215.

52. Chayama K. Genotyping Hepatitis C Virus by type-specific primers for PCR based on NS5 region. // Hepatitis C Protocols, Edited by Johnson Yiu-Nam Lau, MD, Humana Press. 1998. P. 165-173.

53. Chen Z., Week K.E. Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5' untranslated region cannot accurately distinguish genotypes la and lb // J. Clin. Microbiol. 2002. 40. (9). P. 3127-3134.

54. Chevaliez S., Pawlotsky J.M. Hepatitis C virus: Virology, diagnosis and management of antiviral therapy // World J. Gastroenterol. 2007. 13. (17). P. 24612466.

55. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1993. 74. (Pt 11). P. 2391-2399

56. Clinical evaluation of the COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan for HCV RNA quantitation in comparison with the branched-DNA assay / F. Pittaluga et al. // J. Med. Virol. 2008. 80. (2). P. 254-260.

57. Clinical evaluation of two methods for genotyping Hepatitis C virus based on analysis of the 5'noncoding region / F.S. Nolte et al. // J. Clin. Microbiol. 2003.41.(4). P. 1558-1564.

58. Comparison of conventional PCR with real-time PCR and branched DNA-based assays for hepatitis C virus RNA quantification and clinical significance for genotypes 1 to 5 / C. Sarrazin et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. 44. (3). P. 729737.

59. Comparison of performance characteristics of three real-time reverse transcription-PCR test systems for detection and quantification of hepatitis C virus / M.F. Sábato et al. //J. Clin. Microbiol. 2007. 45. (8). P. 2529-2536.

60. Complete 5' noncoding region is necessary for the efficient internal initiation of hepatitis C virus RNA / S. Fukushi et al. // Biochem. Biophys. Res, Commun. 1994. 199. (2). P. 425-432.

61. Consensus proposals for wunified system of nomenclature of hepatitis-G virus genotypes / P. Simmond's et al. // Hepatology. 2005. 42. (4). P.962-973.

62. Cooper J.P., Hagerman P.J. Analysis of fluorescence energy transfer in duplex and branched DNA molecules // Biochemistry. 1990. 29. (39). P. 9261-9268.

63. Correlates of hepatitis C virus (HCV) RNA negativity among HCV-seropositive blood donors / M.P. Busch et al. // Transfusion 2006. 46. (3). P. 46975.

64. Definition of false positive reaction in screening for hepatitis C virus antibodies / M. Schröter et al. // J. Clin. Microbiol. 1999:37. (1). P. 233-234.

65. Delayed anti-HCV antibody response in HIV-positive men acutely infected with HCV/E.C. Thomson et al.//AIDS. 2009. 23. (1). P. 89-93.

66. Detection of multiple hepatitis C virus genotypes in a cohort of injecting drug users / S. Bowden et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2005. 12. (3). P. 322-324.

67. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluoresence resonance energy transfer / R.A. Cardullo et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. 85. (23). P. 8790-8794.

68. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence / D. Whitcombe et al. //Nat. Biotechnol. 1999. 17. P. 804-807.

69. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase / P.M. Holland et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. 88. (16) P. 7276-7280.

70. Determination of hepatitis C virus genotype by Pyrosequencing / E. Elahi et al. //J. Virol. Methods. 2003. 109. (2). P. 171-176.

71. Development of a simple restriction fragment length polymorphism (RFLP) based assay for HCV genotyping and comparative analysis with geno-typing and serotyping tests / V. Thiers et al. // J. Virol. Methods. 1997. 65. (1). P. 9-17

72. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C: an update / M.G. Ghany et al. //Hepatology. 2009. 49. (4). P. 1335-1374.

73. Differences in virological response to pegylated interferon and ribavirin between hepatitis C (HCV)-monoinfected and HTV-HCV coinfected patients / C. Tural et al. // Antivir. Ther. 2008. 13. (8). P. 1047-1055.

74. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency / J.A. Sikorsky et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. 355.(2). P. 431-437.

75. Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene / J.Y. Chun et al. // Nucleic Acids Res. 2007. 35. (6). P. 1-6.

76. Effect of Hepatitis C Virus (HCV) Genotype on HCV and HIV-1 Disease / T.W. Yoo et al. // J. Infect. Dis. 2005. 191. (1). P. 4-10.

77. Evaluation of absolute quantitation by nonlinear regression in probe-based real-time PCR / R. Göll et al. // BMC Bioinfonnatics. 2006. 7. P. 107.

78. Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COB AS Ampliprep/COBAS TaqMan) for quantification of HCV RNA / C. Sarrazin et al. // J. Clin. Virol. 2008. 43. (2). P.162-168.

79. Evaluation of the COBAS TaqMan HCV test with automated sample processing using the MagNA pure LC instrument / J.J. Germer et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (1). P. 293-298.

80. Evolutionary analysis of variants of hepatitis C virus found in South-East Asia: Comparison with classifications based upon sequence similarity / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1996. 77 (Pt 12). P. 3013-3024

81. Experience of mandatory nucleic acid test (NAT) screening across all blood organizations in Germany: NAT yield versus breakthrough transmissions / CM. Nübling et al. // Transfusion, 2009. 49. (9). P. 1850-1858.

82. Expression of hepatitis C virus non-structural 5A protein in the liver of transgenic mice / M. Majumder et al. // FEBS Lett. 2003. 555. (3). P. 528-532.

83. False-positive reaction between syphilis and hepatitis C infection / Sonmez E. et al. // Isr. J. Med. Sei. 1997. 33. (11). P. 724-727.

84. False-positive tests for syphilis associated with human immunodeficiency virus and hepatitis B virus infection among intravenous drug abusers / I. Hernandez-Aguado et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998. 17.(11). P. 784-787.

85. Genotype 3 is associated with accelerated fibrosis progression in chronic hepatitis C / P.Y. Bochud et al. // J Hepatol. 2009. 51. (4). P. 655-666.

86. Genotypic and Epidemiologic Characteristics of Hepatitis C Virus Infections among Recent Injection Drug User and Nonuser Populations / L. Krekulova et al. // The Journal of Infectious Diseases, 2001. 33. (8). P. 1435-1438.

87. Genotyping Hepatitis C Virus by Heteroduplex Mobility Analysis Using Temperature Gradient Capillary Electrophoresis / R.L. Margraf et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. 42. (10). P. 4545-4551.

88. Genotyping of hepatitis C virus by melting curve analysis with SYBR Green I / H. Fujigaki et al. // Ann. Clin. Biochem. 2004. 41. (Pt 2). P. 130-132.

89. Genotyping of hepatitis C virus types 1, 2, 3 and 4 by a one-step LightCycler method using three different pairs of hybridization probes / M. Schröter et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. 40. (6). P. 246-250.

90. Gentle A., Anastasopoulos F., McBrien N.A. High-resolution semiquantitative real-time PCR without the use of a standard curve // Biotechniques. 2001. 31(3). P. 502, 504-506, 508.

91. Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors: An international collaborative survey / F. McOmish et al. // J. Clin. Microbiol. 1994. 32(4). P. 884-892.

92. Germer J.J., Zeindoi N.N. Advances in the molecular diagnosis of hepatitis C and their clinical implications // Mayo Clin. Proc. 2001. 76. (9). P. 911920.

93. Haverstick D.M., Bullock G.C., Bruns D.E. Genotyping of hepatitis C virus by melting curve analysis: analytical characteristics and performance // Clin. Chem. 2004. 50. (12). 2405-2407.

94. Hepatitis C prevalence among Australian injecting drug users in the 1970s and profiles of virus genotypes in the 1970s and 1990s / A J. Freeman et al. // Med. J. Aust. 2000. 172. (12). P. 588-591.

95. Hepatitis C Viral Kinetics During Treatment With Peg IFN-alpha-2b in HIV/HCV Coinfected Patients as a Function of Baseline CD4+ T-Cell Counts / N.U. Avidan et al. // Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes 2009. 52. (4). P. 452-458.

96. Hepatitis C virus genotypes and hepatitis G virus in hemodialysis patients from Syria: identification of two novel hepatitis C virus subtypes / A.S. Abdulkarim et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. 59. (4). P. 571-576.

97. Hepatitis C virus genotypes: An investigation of type-specific differences in geographic origin and disease / G. Dusheiko et al. // Hepatology. 1994. 19. (1). P. 13-18.

98. Hepatitis C virus load in associated with human immunodeficiency virus type 1 disease progression in hemophiliacs / E.S. Daar et al. // J.Infect.Dis. 2001. 183.(4). P. 589-595.

99. Hepatitis C virus types 7, 8 and 9 should be classified as type 6 subtypes / M. Mizokami et al. // J. Hepatol. 1996. 24. (5). P. 622-624.

100. Hepatitis C virus variants from Jakarta, Indonesia classifiable into novel genotypes in the second (2e and 2f), tenth (10a) and eleventh (11a) genetic groups / H. Tokita etal. //J. Gen. Virol. 1996. 77. (Pt2 ). P. 293-301.

101. Hepatitis C virus variants from Vietnam are classifiable into the seventh, eighth, and. ninth major genetic groups / H. Tokita et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91. (23). P. 11022-11026

102. Higher rate of sustained virologic response in chronic hepatitis C genotype 6 treated with 48 weeks versus 24 weeks of peginterferon plus ribavirin / M.H. Nguyen et al. // Am. J. Gastroenterol. 2008. 103. (5). P. 1131-1135.

103. Humoral immune response in acute hepatitis C virus infection / D.M. Netski et al. // Clin. Infect. Dis. 2005. V. 41. (5). P. 667-675.

104. Identification of genotypes of hepatitis C virus by sequence comparisons in the core, El and NS-5 regions / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1994. 75. (Pt 5) P. 1053-1061.

105. Impact of HCV 3.0 EIA Relative to HCV 2.0 EIA on Blood-Donor Screening / L.H. Tobler et al. // Transfusion. 2003. 43. (10) P. 1452-1459.

106. Incidence and estimated rates of residual risk for HIV, hepatitis C, hepatitis B and human T-cell lymphotropic viruses in blood donors in Canada, 19902000 / J.A. Chiavetta et al. // Canadian Medical Association Journal. 2003. 169. (8). P. 767-773.

107. Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA / K. Tsukiyama-Kohara et al. //J. Virol. 1992. 66. (3). P. 1476-1483.

108. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome / Q.L. Choo et al. // Science. 1989. 244. P. 359-362.

109. Jayaraj S., Reid R., Santi D.V. GeMS: an advanced software package for designing synthetic genes // Nuc. Acids Res. 2005. 33. (9). P. 3011-3016.

110. Jorgensen, P.A., Neuwald, P.D. Standardized hepatitis C virus RNA panels for nucleic acid testing assays// J. Clin. Virol. 2001. 20. P. 35-40.

111. Khuroo M.S., Khuroo M.S., Dahab-S.T. Meta-analysis: a randomized trial of peginterferon plus ribavirin for the initial treatment of chronic hepatitis C genotype 4 // Aliment Pharmacol. Ther. 2004. 20. (9). P. 931-938.

112. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions / R. Higuchi et al. // Biotechnology (N Y). 1993. 11. (9). P. 1026-1030.

113. Koch J.O., Bartenschlager R. Modulation of hepatitis C virus NS5A hyperphosphorylation by nonstructural proteins NS3, NS4A, and NS4B // J. Virol. 1999. 73. (9). P. 7138-7146.

114. Larionov A, Krause A, Miller W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing // BMC Bioinformatics. 2005. 6. P. 62.

115. Laughlin T.S., Nuccie B., Rothberg P.G. Genotyping of Hepatitis C Virus by Sequence Analysis of the Amplicon from the Roche Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Viral Load Assay // J. Clin. Microbiol. 2010. 48. (2). P 671 672.

116. Le Guillou-Guillemette H., Lunel-Fabiani F. Detection and Quantification of Serum or Plasma HCV RNA: Mini Review of Commercially Available Assays // Methods Mol. Biol. 2009. 510. P. 3-14.

117. LightCycler qPCR optimisation for low copy number target DNA / I.A. Teo et al. // J. Immunol. Methods. 2002. 270. (1). P. 119-133.

118. Lindh M., Hannoun C. Genotyping of hepatitis C virus by Taqman realtime PCR// J. Clin. Virol. 2005. 34. (2). P. 108-114.

119. Liu W., Saint D.A. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics // Anal. Biochem. 2002. 302. (1). P. 52-59.

120. Liu W., Saint D.A. Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics // Biochem. Biophys. Res .Commun. 2002. 294. (2). P. 347-353.

121. Livak K.J. Relative quantification of gene expression // User Bulletin №2. 1997. 36 p.

122. Liver fibrosis progression in human immunodeficiency virus and hepatitis C virus coinfected patients. The Multiviric Group / Y. Benhamou et al. // Hepatology. 1999. 30. (4). P. 1054-1058.

123. Lyamichev V., Brow M.A.D., Dahlberg J.E. Structure-Specific Endonucleolytic Cleavage of Nucleic Acids by Eubacterial DNA Polymerases // Science. 1993. 260. (5109). P. 778-783

124. Mackay I.M. Real-Time PCR in Microbiology. Norfolk, UK: Caister Academic Press 2007. 454 p.

125. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology // Nucleic Acids Res. 2002. 30. (6). P. 1292-1305.

126. Maertens G., Stuyever L. HCV Genotyping by the Line Probe Assay INNO-LiPA HCV II // Hepatitis C Protocols, Edited by Johnson Yiu-Nam Lau M.D., Humana Press. 1998. P. 183-198

127. Marino J.H., Cook P., Miller K.S. Accurate and statistically verified quantification of relative mRNA abundances using SYBR Green I and real-time RT-PCR // J. Immunol. Methods. 2003. 283. (1-2). P.291-306.

128. Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C viruses / N. Kato et al. // Virus Res. 1992. 22. (2). P. 107-123.

129. Marras S.A. Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes // Methods Mol. Biol. 2006. 335. P. 3-16.

130. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (Mass Spectrometry) for Hepatitis C Virus Genotyping / E.N. Ilina et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (6). P. 2810-2815.

131. Meta-Analysis: Increased Mortality Associated with Hepatitis C in HIV-infected Persons Is Unrelated to HIV Disease Progression / T.Y. Chen et al. // Clinical Infectious Diseases. 2009. 49. (10). P. 1605-1615.

132. Method of detecting specific fragments of DNA or RNA with the aid of a polymerase chain reaction. / A.V. Chemeris et al. // European Patent EP1780291. 2007.

133. Moradpour D., Penin F., Rice C.M. Replication of hepatitis C virus // Nat. Rev. Microbiol. 2007. 5. (6). P. 453-463

134. Morrison L.E., Haider T.C., Stols L.M. Solution-phase detection of polynucleotides using interacting fluorescent labels and competitive hybridization // Anal. Biochem. 1989 183. (2). P. 231-244.

135. Morrison T.M., Weis J.J., Wittwer C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR green I monitoring during amplification // Biotechniques. 1998. 24. (6). P. 954-962.

136. Mortality from liver cancer and liver disease in hemophilic men and boys in UK given blood products contaminated with hepatitis C. UK Hemophilia Center Director's Organization / S.C. Darby et al. // Lancet. 1997. 350. (9089). P. 1425-1431.

137. Multiplex Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay for Determination of Hepatitis C Virus Genotypes / L. Cook et al. // Journal Of Clinical Microbiology. 2006. 44. (11). P. 4149-4156.

138. Nazarenko I.A., Bhatnager S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. 25.(12). P. 2516-2521.

139. Neddermann P., Clementi A., De Francesco R. Hyperphosphorylation of the Hepatitis C Virus NS5A Protein Requires an Active NS3 Protease, NS4A, NS4B, and NS5A Encoded on the Same Polyprotein // J. Virol. 1999. 73. (12). P. 9984-9991.

140. New hepatitis C virus (HCV) genotyping system that allows for identification of HCV genotypes la, lb, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5a, and 6a / O. Ohno et al. //J. Clin. Microbiol. 1997. 35. (1). P. 201-207.

141. Nizar N.Z. Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes // Clin. Microbiol. Rev. 2000. 13. (2). P. 223-235.

142. Orland J.R., Wright T.L., Cooper S. Acute hepatitis C // Hepatology. 2001.33.(2). P. 321-327.

143. Overestimation and underestimation of hepatitis C virus RNA levels in a widely used real-time polymerase chain reaction-based method. / S. Chevaliez et al. // Hepatology. 2007. 46. P. 22-31.

144. Pawlotsky J.M. Measuring hepatitis C viremia in clinical samples: can we trust the assays? // Hepatology. 1997. 26. (1). P. 1-4.

145. Pawlotsky J.M., Bouvier-Alias M., Hezode C., Darthuy F., Remire J., Dhumeaux D. Standardization of hepatitis C virus RNA quantification. // Hepatology. 2000. 32. (3). P. 654-659.

146. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection / M.W. Fried et al. //N. Engl. J. Med. 2002. 347. (13). P. 975-982.

147. Peginterferon alfa-2b and weight-based or flat-dose ribavirin in chronic hepatitis C patients: a randomized trial / I.M. Jacobson et al. // Hepatology. 2007. 46. (4). P. 971-981.

148. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial / M.P. Manns et al. // Lancet. 2001. V. 358. (9286). P. 958-965.

149. Peginterferon-alpha2a and ribavirin combination therapy in chronic hepatitis C: a randomized study of treatment duration and ribavirin dose / S.J. Hadziyannis et al. // Ann Intern Med. 2004. 140. (5). P. 346-355.

150. Pegylated interferon alpha-2b plus ribavirin in patients with genotype 4 chronic hepatitis C: The role of rapid and early virologic response / S.M. Kamal et al. //Hepatology. 2007. 46. (6). P. 1732-1740.

151. Peirson S.N., Butler J.N., Foster R.G. Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis // Nucleic Acids Res. 2003. 31. (14). P. e73.

152. Performance characteristics of a quantitative TaqMan hepatitis C virus RNA analyte-specific reagent / J.M. Barbeau et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. 42. (8). P. 3739-3746.

153. Performance evaluation of the Abbott RealTime HCV Genotype II for hepatitis C virus genotyping / Y.H. Sohn et al. // Clin. Chem. Lab. Med. 2010. 48. (4). P. 469-474.

154. Peterson M., Wengel J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics // Trends Biotechnol. 2003. 21. (2). P. 74-81.

155. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR//Nucleic Acids Res. 2001. 29. (9). P. e45.

156. Polymerase chain reaction for the detection of HCV-RNA: cryoglobulinaemia as a cause for false negative results / A. Colantoni et al. // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. 1997. 29. (3). P. 273-274.

157. Population genotyping of hepatitis C virus by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis of short DNA fragments/Kim Y.J. et al.//Clin. Chem. 2005.51.(7). P. 1123-31.

158. Prevalence and route of transmission of infection with a novel DNA virus (TTV), hepatitis C virus, and hepatitis G virus in patients infected with HIV / F. Puig-Basagoiti et al. // J.Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2000. 23. (1). P. 89-94.

159. Prince A.M., Huima-Byron T., Parker T.S., Levine D.M. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral. Hepat. 1996. 3. (1). P. 11-17.

160. Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR / P.Y. Muller et al. // Biotechniques 2002. 32. (6). P. 1372-1378.

161. Rapid genotyping of hepatitis C virus by primer-specific extension analysis / N.A. Antonishyn et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (10). P. 51585163.

162. Real-Time PCR / edited by M.T. Dorak. UK: Taylor & Francis Group, 2006. 333 p.

163. Real-time PCR assays for hepatitis C virus (HCV) RNA quantitation are adequate for clinical management of patients with chronic HCV infection / P. Halfon et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. 44, 2507-2511.

164. Rutledge R.G. Sigmoidal curve-fitting redefines quantitative real-time PCR with the prospective of developing automated high-throughput applications // Nucleic Acids Res. 2004. 32. (22). P. el78.

165. Rutledge R.G., Cóté C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves //Nucleic Acids Res. 2003. 31. (16). P. e93.

166. SantaLucia J Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design // Methods Mol. Biol. 2007. 402. P. 3-34.

167. SantaLucia J.Jr., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. 33. P. 415-440

168. Savitzky A., Golay MJ. Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures // Anal. Chem. 1964. 36. (8). P. 1627-1639.

169. Scott J.D., Gretch D.R. Molecular diagnostics of hepatitis C virus infection: a systematic review // JAMA. 2007. 297. (7). P. 724-732.

170. Sensitivity of second-generation enzyme immunoassay for detection of hepatitis C virus infection-among oncology patients / A. Macedo de Oliveira et al:. // J. Clin. Virol. 2006 Jan;35. (1). P. 21-25.

171. Simmonds P. Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus 15 years on //J. Gen. Virol. 2004. 85. (Pt 11). P. 3173-3188

172. Simplified hepatitis C virus genotyping by heteroduplex mobility analysis / P.A. White et al.7/ J. Clin. Microbiol. 2000. 38. (2). P. 477-482.

173. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences / R. Higuchi et ah. //Biotechnology. 1992. 10. P. 413-417.

174. Simultaneous fitting of real-time PCR data with efficiency of amplification modeled as Gaussian function of target fluorescence / A. Batsch et al. // BMC Bioinformatics 2008. 9. P. 95.

175. Standardization of hepatitis C virus RNA quantification / J.M. Pawlotsky et al. //Hepatology, 2000. 32. (3). P. 654-659.

176. Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up / A. Tichopad et al. //Nucleic acids Res. 2003. 31. (20). P. el22.

177. Storage conditions of-blood samples and primer selection affect the yield of cDNA polymerase chain reaction products of hepatitis C virus. / H.T. Cuypers et al. // J. Clin. Microbiol. 1992. 30. (12). P.3220-3224.

178. Structure of the 3' terminus of the hepatitis C virus genome / T. Tanaka et al. //J. Virol. 1996. 70. (5). P. 3307-3312.

179. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the 5' non-coding region / F. Davidson et al. // J. Gen; Virol. 1995. 76. P. 1197-1204.

180. Sy T., Jamal M. Epidemiology of Hepatitis C Virus (HCV) Infection // Int. J. Med. Sei. 2006. 3. (2). P. 41-46.

181. The association between hepatitis C virus genotype and human immunodeficiency virus disease progression in a cohort of hemophilic men / C.A. Sabin et al.//J. Infect. Dis. 1997. 175.(1). P. 164-168.

182. The complete coding sequence of hepatitis C virus genotype 5a, the predominant genotype in South Africa / R.W. Chamberlain et al. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997. 236. (1). P. 44-49.

183. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR / J. Brownie et al. //Nucleic Acids Res. 1997. 25. (16). P.3235-3241.

184. The impact of chronic hepatitis C virus infection on HIV disease and progression in intravenous drug users / G.H. Haydon et al. // Eur.J.Gastroenterol.Hepatol. 1998. 10. (6). P. 485-489.

185. The management of chronic viral hepatitis: a Canadian consensus conference / M. Sherman et al. // Can. J. Gastroenterol. 2004. 18. (12). P. 715-728.

186. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments / S.A. Bustin et al. // Clin. Chem. 2009. 55. (4). P. 611-622.

187. The particle size of hepatitis C virus estimated by filtration through microporous regenerated cellulose fibre / T. Yuasa et al. // J. Gen. Virol. 1991. 72. (Pt 8). P. 2021-2024.

188. The prognostic value of a single hepatitis C virus RNA load measurement taken early after human immunodeficiency virus seroconversion / E. Herrero-Martinez et al. //J. Infect. Dis. 2002. 186. (4). P. 470-476.

189. The significance of third-generation HCV RIBA-indeterminate, RNA-negative results in voluntary blood donors screened with sequential third-generation immunoassays / P. Kiely et al. // Transfusion. 2004. 44. (3). P. 349-358.

190. The unique HCV genotype distribution and the discovery of a novel subtype 6u among IDUs co-infected with HIV-1 in Yunnan, China / X. Xia et al. // J. Med. Virol. 2008. 80. (7). P. 1142-1152.

191. The use of a thermally activated DNA polymerase PCR gives improved specificity, sensitivity and product yield without additives or extra process steps / D.E. Birch et al. //Nature 1996. 381. P. 445-446.

192. Tichopad A., Didier A., Pfaffl M.W. Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue specific contaminants // Mol. Cel. Probes, 2004. 18. (1) P: 45-50.

193. Tissue donation and virus safety: more nucleic acid amplification testing is needed / A. Pruss et al. // Transpl. Infect. Dis. 2010. 12. (5). P. 375-386.

194. Tyagi S., Bratu D.P., Kramer F.R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination//Nat. Biotechnol. 1998. 16. (1). P. 49-53.

195. Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and* tracing infectious sources / H. Okamoto et al. // J. Gen. Virology. 1992. 73 (Pt3). P. 673-679.

196. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay / L. Stuyver et al. // J. Gen. Virol. 1993. 74. P. 10931102.

197. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins / A.M. Prince et al. // J. Viral. Hepat. 1996.3.(1). P. 11-17.

198. Walter N.G., Burke J.M. Real-time monitoring of hairpin ribozyme kinetics through base-specific quenching of fluorescein-labeled substrates // RNA. 1997. 3. (4). P. 392-404.

199. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A. Translation of human hepatitis C virus RNA in cultured cells is mediated by an internal ribosome-binding mechanism // J.Virol. 1993. 67. (6). P. 3338-3344.

200. Watkins N.E. Jr., SantaLucia J. Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of deoxyinosine pairs in DNA duplexes // Nucleic Acids Res. 2005. 33. (19). P. 62586267.

201. Wetmur,J.G. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991. 26. (3-4). P. 227-259.

202. Wilhelm J., Pingoud A., Hahn M. SoFAR: software for fully automatic evaluation of real-time PCR data // Biotechniques. 2003. 34. (2). P. 324-332.

203. Wittwer C.T., Gutekunst M., Lohmann S. Method for quantification of an analyte US patent 6503720 B2.

204. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantitation // Biotechniques. 2005. 39. (1). P. 75-85.

205. Wong T., Lee S.S. Hepatitis C: a review for primary care physicians // CMAJ. 2006. 174. (5). P. 649-659

206. Yoo< H.Y., Maheshwari A., Thuluvath P.J. Retransplantation of liver: primary graft nonfunction and hepatitis С virus are associated with worse outcome // Liver Transpl. 2003. 9. (9). P. 897-904.

207. Zein N.N. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes // Clin. Microbiol. Rev. 2000. 13. (2). P. 223-235

208. Zhao S., Fernald R.D. Comprehensive algorithm for quantitative realtime polymerase chain reaction // J. Comput. Biol. 2005. 12. (8). P. 1047-64.

Информация о работе

Ведерников, Виталий Евгеньевич
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы