Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и молекулярный анализ нового гена TAG7, экспрессирующегосяв опухолях линии VMR и проявляющего сходство с генами TNF семейства

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и молекулярный анализ нового гена TAG7, экспрессирующегосяв опухолях линии VMR и проявляющего сходство с генами TNF семейства"

■п Г Б ОД

1 1 MAP Ш

На правах рукописи

КУСТИКОВА Ольга Сергеевна

КЛОНИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ НОВОГО ГЕНА ТА (77, ЭКСПРЕССИРУЮШЕГОСЯ В ОПУХОЛЯХ ЛИНИИ VMR И ПРОЯВЛЯЮЩЕГО СХОДСТВО С ГЕНАМИ TNF СЕМЕЙСТВА

специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996 ,

Работа выполнена и лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Н. В. Гнучев,-

кандитат биологических наук С.- Л. Киселев

Официальные оппоненты:

чл-корр. РАЛ, доктор медицинских наук, проф. Л. И. Корочкин, кандидат биологических наук Е. П. Дельвер

Ведущая организация :

Институт молекулярной биологии им. Bi А. Энгельгардта РАН

оо

Защита диссертации состоится " i"."..1996 года в час. на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться л библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. • нге,-. rap, .• i РАН

Автореферат разослан " " 1996 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета .'.'.. <■

канд. фарм.наук Грабовская JI.C.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность задачи В последние годы одной из наиболее актуальных проблем биологии и медицины остается изучение молекулярных процессов, лежащих в основе превращения нормальной клетки в опухолевую. Особое место занимает исследование механизмов становления метастатического потенциала опухолевых клеток. Образование очагов метастазирования - это наиболее угрожающий жизни аспект злокачественной неоплазии. Скрытые метастазирующие опухолевые клетки могут циркулировать в бездействующем состоянии в течение нескольких лет после резекции опухоли (Meitzer, 1990; Zajicek, 1987). Затем они могут быть активированы какими-то еще неидентифицированными стимулами, в результате чего метастатические очаги внезапно развиваются в "взрывную" форму, результатом которой является быстрая смерть ракового пациента. Изучение генетических изменений, ассоциированных с опухолевой прогрессией человека, внесло большой вклад в понимание процессов онкогенеза (Bishop, 1991; Fearon and Vogelstein, 1990; Fidler and Radinsky, 1990). Это изучение ясно показало, что опухолевое развитие и последующее метастатическое поведение (злокачественный потенциал) находятся под различным генетическим контролем (Garbisa et al, 1987; Muschel et al, 1985). К настоящему моменту не идентифицирован один единственный ген, который бы регулировал весь процесс.метастазирования..Однако, поскольку метастазирование является многостадийным процессом, генетический подход требует изоляции и независимой характеристики множественных генетических изменений, которые могут происходить на каждой стадии.

В связи с вышеизложенным, несомненный интерес представляет клонирование и характеристика генов, экспрессирующихся в . опухолях с высоким метастатическим потенциалом и являющимися возможными участниками процесса мегастазирования.

Цедь.работм.

Основная цель настоящей работы состояла в клонировании генов, имеющих различный уровень экспрессии, в опухолях общего происхождения с противоположными метастатическими свойствами.

В ходе исследования предполагалось решение следующих экспериментальных задач:

1. Клонирование гена, специфически экспрессируюшегося в опухоли с высоким метастатическим потенциалом.

2. Изучение структуры клонированного гена.

3. Изучение уровня транскрипции мРНК данного гена в клеточных опухолевых линиях мышей, различающихся своими метастатическими характеристиками.

4. Изучение экспрессии гена в нормальных органах мыши и человека.

5. Определение возможной функции клонированного гена.

Научная новизна и практическое значение работы.

В насгояшей работе был применен метод дифференциального дисплея мРНК для идентификации генов, специфически экспрессирующихся в'высоко • метасгазирующей (УМЯ-Ыу) и неметастазируюшей (УМЛ-О) аденокарциноме молочной железы мыши. Клонирован новый ген /¿#7, экспрессирующийся в мегастазируюших опухолях линии УМЛ. Изучен уровень экспрессии мРНК этого гена в нескольких клеточных линиях,

обладающих различным метастатическим потенциалом. Обнаружены изменения в уровне транскрипции этого гена в первичных опухолях и соответствующих клеточных линиях. Экспрессия гена обнаружена в нормальных мышиных легких, тимусе, селезенке, а также в специфических отделах коры головного мозга, шппокампе и клетках Пуркинье мозжечка. Человеческий гомолог гена tag7 транскрибируется во взрослом и фетальном сердце, печени и поперечнополосатой маскулатуре. Открытая рамка считывания кодирует полипептид, состоящий из 151 аминокислотного остатка, не имеющий значительных гомологий с известными белками. N-конец белка Tag7 содержит лейцин-богатый трансмембранный домен, а С-концевая последовательность обнаруживает гомологию с членами Tí ¡F семейства. Определена геномная структура гена. Промоторная. область гена tag? обнаруживает значительную гомологию с мышиным и человеческим лимфотоксином ß.

.Апробация работы.

Материалы диссертации бьши представлены на следующих симпозиумах: Школа молодых ученых в Риге, (ноябрь-декабрь, 1994); Энгельгардтовские чтения (декабрь, 1995); Bio Тес Symposium 1995, (Denmark; 1995); Annual meeting of Molecular Biology Department of Danish Cancer Socicty (november,1995).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано три печатные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя

источников. Работа проиллюстрирована рисунками и......

таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Идентификация генов, дифференциально экспрессируюшихся в опухолях с различным метастатическим потенциалом.

Для изучения дифференциально экспрессируюшихся генов популяцию мРНК из неметасгазирующей первичной опухоли VMR-0 сравнивали с мРНК из высоко метастазируюшей опухоли VMR-Liv (Сенин, 1984) методом' дифференциального дисплея (Liang and Pardi, 1992), используя множественные комбинации праймеров. На рисунке 1 представлены 8 дорожек, показывающих спектры фрагментов кДНК, полученных методом дифференциального дисплея для неметасгазирующей (VMR-0) и метастазируюшей в печень (VMR-Liv) опухолей. В основном спектр кДНК фрагментов, амплифицированных в присутствии одной и той же пары праймеров, идентичен для обоих опухолевых линий. Фрагменты ДНК, не имеющие аналогов в соседней дорожке, элюировались из геля, амплифицировались в присутствии той же пары праймеров и клонировались. Различия в уровне экспрессии последовательностей РНК в двух анализируемых линиях опухолей проверялись при помощи Нозерн гибридизации клонированных фрагментов с тотальной РНК из этих опухолей. Анализ большинства полученных таким образом фрагментов позволил отнести их к классу повторяющихся последовательностей (IAP-элемент и др.), • но некоторые представляли несомненный интерес. Наиболее подробно мы изучили новый ген tag? (Рис.2). Транскрипт этого гена очень хорошо представлен в популяции мРНК опухоли VMR-Liv, что не является удивительным: метод дифференциального дисплея дает возможность в первую очередь детектировать наиболее существенные различия в популяциях РНК, то есть среди преобладающих классов. Размер молекулы РНК tag7 по результатам Нозерн гибридизации составляет примерно 700 нуклеотидов. Определение

ТцСА

Т12АС

о _1

£ С > >

1

о -1

£ £ > >

о £ £

2 5 > >

4

!

т

й •л

«э 1

К и

*

Ц 6л

> I

* «

И"

а*.

•1ад7

Рис.1. Дифференциальный дисплей матричных РНК нсметастазируюшсй (УМК-О) и высоко мегастазкрующей (УМЯ-Ьу) адсноирциномы молочной железы мыши. кДНК получали из 0.2 мкг мРНК' в ходе реакции обратной транскрипции, катализируемой ММЬУ обратной транскрютгазой в присутствии праймера ТцСА или ТнАС. Полученные кДНК амплифицировали в присутствии использованного в реакции обратной транскрипции алкго(<ГГ)прэДмсра и огного ил праймеров 10-членников; 1: З'СТТОАТТОССЗ'; 1 5'СТОАТССАТСЗ'; 3: 5'АОТСАОССАСЗ"; 4: З'ААТСССОСТОЗ'. Стрелками указаны-различия в популяциях мРНК.

> 6 О "Jj

Pnc.2. Нозсрн-блот шбрилизашш рсамгишфицнровашкж кДНК пробы tag! с суммарной РНК, полученной га первичной опухоли VMR-Liv и VMR-0. Относительное колнчсстсо материала на дорожке оценивали * по интенсивности сигнала гибридизации с кДНК гена глицеральдсгил-3-фосфат депирогеназы (GAPDH), (нижнее фото).

нуклеотидной последовательности полученного в результате ПЦР фрагмента tag! показало, что данная последовательность фланкирована с обеих сторон 5'-праймером №4 (5'AATCGGGCTG3') (Рис.3). 2.Клонирование полнооазмепной кДНК.

Для конструирования кДНК библиотеки была использована полиаденилированная РНК из первичной опухоли VMR-Liv. кДНК была синтезирована на основе реагентов фирмы "Stratagene" и клонирована в вектор Lambda Zap II. С высеянной библиотеки были сняты реплики, содержащие суммарно около 800000 клонов. Для скрининга библиотеки использовали фрагмент tag7 гена, полученный при помощи дифференциального дисплея мРНК. Гибридизация проводилась в стандартных условиях. Более чем 50 независимых клонов было изолировано и шесть из них было секвенировано. Наиболее протяженный клон (679 п.н.) имеет композицию нуклеиновых ■ кислот такую же, как и исходный кДНК фрагмент, за исключением 44 нуклеотидов на 5' конце амплифшшрованного фрагмента и нуклеотидов в позиции 527, 697, 698 (Рис.3).

Г-..Ч

1 '.Г '

: т Ч- 0.7 кВ

< . ■ 17? \

GAPDH щт

agcccttgtgcctctgatgagagagctctctcccacctactgacactagcaaggctccac -134 ■

catggccnacctctggttaaggdqaaagctgggcctggqtcaoaaaatcccgcccaggtg - 74

—-5 —

tgaagcaagcccctcctctqcccacacccttcaccacgcccagaaqataaagcacacagg - 14 ' S 7

acgagggccagccCATACACAGCCCTGCAGTCCTGTGCGGCACGTCCAGCATOTTCTTTG 4 7

M L F

<----TAG PI--------

CCTGTGCTCTCCTTGCCCTCCTGGGTCTGGCAACCTCCTSC AGTTTC ATCGTGCCCCGC A 107 ACALLALLGLATSCSFIVPR

GTGAGTGGAGGGCCCTGCCATCCGACTGCTCTAGCCGCCTCGGGCACCCAGTTCGCTACG 167 SEWRALPSECSSRLGHPVRY

TGGTGATCTCACACACAGCCGGCAGCTTCTGCAACAGCCCGGACTCCTGTGAAC AGCAGG 227 VVI SHTAGSFCNSPDSCEQQ

aatcgggctgtggaagcatagqacctgagctctcqctcccetttcctjtctqag

CCCGCAATGTGCAGCATTACCACAAGAATGAGCTGGGCTSGTGCGATGTAGCCTACAAgt 287 ARNVQHYHKNELGWCDVAYN

caagta -6l.n.H.-tccaCCCCLCCti:cacagCTTCCTTATTGGAGAGGACGGTCATGTC 3 47

"fligedghv

TATGAAGGCCGAGGCTGGAACATCAAGGGTGACCACACAGGGCCCATCTGGAATCCCATG 407

YEGRGWN IKGDHTG P I W N PM --TAG7P2-

TCTATTGGCATCACCTTCATGGGGAACTTCATGGgt aag tac - 6 0 0П.Н. - tgtccctcc 467 SIGITFMGNFM

g

COCttgcagGACCGGGTACGCAAAGCGGGCCCTCCGTGCTGCCCTAAATCTTCTGGAATC 527 DRVRKAGPPCCPASSG.I

TGGGGTGTCTCGGGGCTTCCTGAGATCCAACTATGAAGTCAAAGGACACCGGGATGTGCA 587 WGVSGLPEIQL

AAGCACTCTCTCTCCAGGTGACCAACTCTATCAGGTCATCCAAAGCTGGGAACACTACCG 647

oagcccgatt

AGAGTGAGAGACCrTGAGACCTAGTGAGAATCCCCCCCCCCCAGCCCGAAATCCCTCCTG 707

CCACCTGCTTCTTCCCATTGACCCCC AATAAAGACTC AGCACC 750

Рис.3. Нуклеотидная последовательность мышиного tag! гена и предполагаемая аминокислотная последовательность белка TAG7. Подчеркнуты: предполагаемые участии связывания с транскрипционными факторами - 1- Etsi, 2- NF-icB, 3- Spl, 4-MyoD; 5- TATA бокс; 6.7- позиции для стартов транскрипции мРНК; последовательность кДНК фрагмента tag7, определенного дифференциальным дисплеем; сигнал полиаденилнрования. Жирными буксами выделены; ATG- старт Трансляции; TGA- -терминирующий тодон. Три эюона выделены большими буквами. Маленькими буквами выделены интроны и нуклеотиды фрагмеюа ia¡7, определенного дифференциальным дисплеем, несовпадающие с последовательностью геномного и кДНК клопов ta¡7. TAGР1. TAGP2 соответствуют олигонуклеогидиьш праймерам, использованным в методе наращивания цепи ДНК к для • определения 5' конца кДНК, соответственно. Праймсры, использеванные в дифференциальном дисплее, взяты в рамку. Позиция +1 соответствует первому старту транскрипции.

Данные расхождения вполне можно объяснить погрешностью самой реакции ПЦР, т. к. количество циклов реакции, которые прошел данный фрагмент, превышает 80.

Для определения 5'-конш кДНК был применен метод RACE, описанный Frohman et al. (19SS). 156 клонов были проанализированы при помоши in situ гибридизации колоний с 32Р-меченой г ag7 пробой. 5 позитивных клонов были секвенированы. Последовательность одного из них оказалась на 17 п.н. длиннее (нуклеотиды в позиции 1-18), чем последовательность клона, полученного в результате скрининга кДНК библиотеки (Рис.3).

В составе нуклеотидной последовательности наиболее протяженного клона обнаружены две открытые рамки считывания (ОРС), соответстгуШщую 151 и 91 аминокислотному остатку. Начаю трансляции в первой рамке (151 а. к.) совпадает с метиониновым кодоном (37п.н.), которому предшествует консенсусная последовательность Козак (Kozak,1989): пурин в позиции -3 от старта трансляции, который является наиболее консервативным основанием, и цитозин в позициях -1, -4, -5, -8 н. п. от старта трансляции. Не смотря на наличие еше одного возможного сайта инициации трансляции (308 п. н.), наиболее предположительным является метионин в позиции 37 п. н., так как для второго инициаторного кодона критерий Козак является менее строгим.

На наличие белкового продукта гена lagl указывает тот факт, что в лолисомносвязанной фракции мРНК присутствует транскрипт гена, хотя количество мРНК гена в полисомной фракции не превосходит 10 % от всей шггоплазматической мРНК гена tag 7. Из этого можно сделать вывод о том, что регуляция синтеза белкового продукта гена происходит на трансляционном уровне или же это отражает только тот факт, что время жизни мРНК гена достаточно велико.

Поиск нуклеотидной и аминокислотной

последовательностей клонированного гена в GENBANK, EMBL, GENE и SWISSPROT банках данных не обнаружил никаких существенных гомологий с уже известными генами. Однако, при детальном анализе аминокислотной последовательности, оказалось, что она содержит мотивы, которые характерны для белков семейства TNF. Как видно из рисунка 4, наибольшая гомология с членами этого семейства наблюдается в С-концевом домене, а также доменах которые, предположительна принимают участие в тримеризаиии белков TNF, LT-ß, LT-a (Browning, 1993; Lawton, 1995).

hTNF ее PVAHW 93 102 LQW 204 Í30 GLYLIYSQVLF 140

hLT-a 63 PAAHLI 6 Б TI LLW 79 105 GIYFVYSQWF 115

hLT-b BS PAAHLI 93 102 LGW 104 131 GLYYLYCLVGY 141

hCD4 OL 122 IAAHVI 127 13В LQW 140 1C7 GLYYIYAQVTF 177

mLT-b 154 PAAHLI 159 ICS LSW 170 97 GVYYLYCHVGY 107

tag7 40 PVRYW 45 75 LGW 77 90 GVHYEGRGWNI 100

hTNF 1,9 P-WY-EPIY--LGGVFQLEKGDRLSAE 111

hLT-a lt3 P-WY-HSMY--HGAAFQLTQGDQLSTH 1B<

hLT-b 1®8GPLWY-TSVG--FGGLVQLRRGERVYVN 323

hCD40L 333 SIH--LGGVFELQPGA.SVFVN 340

mLT-b 560 GSLWY-TSVG—FGGLAQLRSGERVYVN 181

tag7 106 GPIWNPMSIGITFMGHF-M---DRV-RK

'не.4. Области гомологии аминокислотной последовательности белка TAG7 с юнеернатипними районами членои TNF семейства.

N-кониевой домен белка Tag 7 имеет лейцин-аланиновый мотив, который также япляется достаточно консервативным для этого семейства. Наличие сигнальной последовательности (2-12 а. к.), а также ■ гидрофобный характер N-кониевого домена, позволяют предположить, что белок Tag7 может иметь трансмембранную локализацию или являться секреторным.

Инишиторныи ко до и находится очень близко к 5' концу мРНК, как это было отмечено для генов лимфотокеннов, что является дополнительным указанием на то, . что предположение о принадлежности клонированного гена к классу цнтотоксических белков, весьма вероятно.

3. Геномная организация гена las; 7.

Для изучения геномной организации гена была сконструирована и проанализирована геномная библиотека из ДНК печени мыши в векторе X FIX II. Скрининг библиотеки позволил выделить несколько перекрывающихся клонов. Участок генома соответствующий наиболее протяженному из них и содержащий копию гена lag 7 приведен на рисунке 5.

А А

В R

-ж-в 1 11

HXR J. S АХ В R I B! R

4-4—f+0-Ь-

lkb

-4;.>с.5. Геномная организация гена lug7. Черные прямоугольники соответствуют экзонам. Н- HiudlU, Х- Xbal, R- EcoRl, А- Apal, В- BamHI, S- SaiGI.

Проведенный анализ геномной организации гена позволил установить, что ген lag 7 состоит из трех экзонов и двух интронов . Экзон 1 содержит 285 п.н. и старт инициации трансляции. Экзон 3 несет сигнал полиаденилирования ААТААА на расстоянии 11 нуоеотидов. от сайта полиаденилирования. Размеры первого и второго интрона около 6000 п. н. и 600 п.н. соответственно.

.Участки слияния интронов и экзонов были секвенированы и продемонстрированы на рисунке 3. С помощью специфического праимера, используя метод наращивания цепи

ДНК (Brown 1993) , Сил определен старт начала транскрипции мРНК гена lag 7(Рис.6).

119Ьр 115Ьр

Рис.6. Картироиание 5'конца мРНК Ю','7 методом наращивании цепи ДНК. Дорожки 1-4 : определение нуклеотиднои последонатсльности

5'КАСЕ клона метолом Сэнгера; 5-наращиианне цепи ДНК и присутстипн суммарной РНК УМЛ-Оу; 6-нараиднваннс цепи ДНК и присутстшш матричной РНК. УМЯ-иу. Стрелкам» обозначены предполагаемые стдшы транскрипции мРНК.

Оказалось, что мРНК гена имеет два старта транскрипции, разделенные четырьмя нуклеотидами. Интересен также тот факт, что ген tag7содержит мутированный TATA бокс, следствием чего и может являться наличие множественных стартов транскрипции. Аналогичная картина наблюдается для некоторых

генов TNF семейства, например LT-ß (Browning, 1993; Pokliolok, 1995). Это еще раз указывает на то, что клонированный ген может представлять собой весьма отдаленный гомолог лимфотоксинов. Более того, последующий анализ промоторной области геномной копии гена выявил наличие в ней последовательностей, которые могут являться потенциальными участками узнавания таких активаторов транскрипции как Ets 1, NF-kB, Spl, Myo D (Jankneclit, 1993; Grilli, 1993; Weimraub,1993), причем их взаиморасположение и удаленность от старта начала транскрипции практически полностью совпадает с аналогичным районом лимфотоксина ß мыши. Вероятно, особый интерес может представлять собой короткая последовательность, расположенная на 5' нетранслируемом конце мРНК гена. Она с большой стсг-иью гомологии на уровне нуклеотидной последовательности совпадает с аналогичным районом мышиного лимфотоксина р. К сожалению, компьютерный поиск на гомологию с этой последовательностью не привел в настоящее время ни к какому результату, но тем не менее эта последовательность может отражать родство этих генов и иметь функциональное значение (стабильность РНК, регуляция трансляции и т.д.).

4. Дифференциальная экспрессия клонированного гена.

Экспрессия гена tag7 была изучена в различных нормальных органах мыши. Максимальная экспрессия гена обнаруживается в легких и селезенке, однако он присутствует также в тимусе и головном мозге (Рис.7). Результаты гибридизации in situ согласуются с результатами гибридизаций по Нозерну. Кроме того гибридизация in situ позволила детектировать экспрессию гена tag! в специфических кортикальных областях мозга, гиппокампе и клетках Пуркинье мозжечка (Рис.8). И опять совершенно необходимо отмстить тот факт, что характер распределения транскриптов гена lag 7 по

Рис.7. Блот-гибридизацмя тотальной РНК., выделенной из разных органов здоровой мыши с Ир-мсЧснной днк гена щ7. GAPDH-мсчсньт зонд Был использован в качестве контроля (нижнее фото).

Рис.И. /и 51Ш гнрилизация срсзон опухолей и нормальных мышиных тканей с меченным» щ7 пробами. Гибридизация с аитасмыслоиой РНК срсзои: а-опухоли УМЯ-иу. с-опухолн СБМЬ-О. ¿-опухоли СБ МП 00. е-мозжечка, £-п1ппокампуса, Ь-коры головного мозга. Ь.[ - гибридизация со смислоиоН РНК в качсстис хо!п;ххля срсзои опухали УМЯ-Уу п мозжечка, соотистстиенно.

различным нормальным органам мыши и особенно его экспрессия в кортикальных областях мозга и клетках Пуркннье, практически полность идентичен картине транскрибирования мышиного лимфотоксина р (Pokholok, 1995). Это еще олно косвенное доказательство тому, что клонированный нами ген принадлежит к семейству токсинов и наиболее близок к мышиному представителю этого семейства.

Транскрипция гена tag7 не является специфической только для опухоли VMR-Liv. РНК log7 обнаруживается также и в других высокометастазирующих линиях опухолей семейства VMR, в частности, в опухоли VMR-Ov. Для выяснения связи клонированного гена с процессом метастазирования была проведена гибридизация РНК из различных культур клеток опухолей разного происхождения с фрагментом кДНК гена iag7. Данные по результатам анализа и свойствам опухолей сведены в таблицу 1. Для анализа были взяты различные клеточные опухолевые линии мышей, различающиеся по своему метастатическому потенциалу, органной специфичности метастазирования, происхождению и т. п.

При переводе опухолевых штаммов в линии перевиваемых культур in vitro наблюдается изменение уровня. транскрипции гена tag?, в клеточной линии VMR-Liv транскрипция гена tag7 сильно снижается по сравнению с первичной опухолью, в клеточной линии CSML-0 наблюдается обратная ситуация (Рис.9). Тот факт, что уровень экспрессии tag7 в первичных метастазирующих опухолях много выше, чем в тех же клетках в культуре, можно объяснить предположением, что это является ответом на взаимодействие опухолевых клеток с клетками хозяина, например в процессе прорастания опухолевыми клетками базальной мембраны. Нельзя также исключтъ и участие клеток стромы в экспрессии гена iag7, как это, например, имеет место в случае гена стромелизин 3 (Basset et

Табл.1 Исследованные клеточные линии. Уровен« транскрипции гена tmsl в данных линиях.

Культура клеток Частота (%) метастазирования (органоспецифич-ность) Уровень • транскрипции г пш1

1 VMR-0 - культура, полученная из опухоли VMR-0 0 нет

2 VMR-Liv - культура, полученная из опухоли VMR-Liv 97 (печень) невысокий

3 CSML-0 - культура, полученная из аденокарциномы молочной железы мыши 5 (легкие) очень высок}

4 CSML-100 - культура, полученная из карциносаркомы молочной железы мыши 100 (легкие) нет

5 Line 1 - легочная карцинома 100 (легкие) нет

6 LL Met - легочная карцинома Льюиса 100 (легкие) нет

7 10 Т1/2 - иммортализованные фибробласты - нет

8 МТ1 ТС1 - культура, полученная из первичной аденокарциномы молочной железы мыши 10-25(легкие) высокий

9 МТ1 ТСЗ - см.п.8 100 (легкие, печень, почки, сердце, л/у, надпочечники, яичники) нет

10 RAC 5Е - культура, полученная из первичной аденокарциномы, индуцированной RIII родом MMTV спонтанно не метастазирует нет

И RAC 34 Е - см .п. 10 спонтанно не метастазирует нет

12 RAC ЮР- см.п.Ю спонтанно не метастазирует нет

13 RAC3UC- см. п.Ю спонтанно не метастазирует кет

Рис.9. Блат-гибридизация тотальной РНК, выделенной из первичных, опухолей и соответствующих клеточных линий с 32Р-меченной ДНК клона lag], GAPDH-меченый зонд был использован в качестве контроля.

al.,1990). In situ гибридизационный анализ на парафиновых срезах опухолей' подтвердил; ' что максимальный уровень транскрипции мРНК. гена tag? детектируется в опухолевых клетках VMR-Liv и CSML-0. Замечательным является то обстоятельство, что сильный позитивный сигнал был обнаружен

и в отдельных клетках на границе инвазивного фронта, опухоли VMR-Liv, а также в единичных клетках паренхимы опухоли CSML-100 или ее стромальных областей (Рис.8). Следует отметить, что процент позитивных CSML-100 клеток ничтожно мал, чтобы его можно было детектировать при помощи Nothem гибридизации.

6. Представленность гена в других высших организмах, его возможное функциональное значение.

Поскольку клонированный ген представлял непосредственный интерес в таком объекте как мышь, то было решено исследовать его экспрессию в других высших организмах. Было обнаружено, что картина транскрипции гена tag7 во взрослых и фетальных органах человека отличается от таковой для мыши (Рис.10). Транскрипты нормального размера (700п.н.) присутствуют во взрослом сердце, печени и поперечнополосатых мышцах, однако в сердце обнаруживается также более тяжелый транскрипт (2000 п. н.). В эмбриональном сердце картина меняется: транскрипт большего размера становится более представленным.

Из 14 изученных клеточных линий с различными метастатическими свойствами, только в клетках линии VMR-Liv транскрипция гена tag 7 коррелировала с сильным метастатическим потенциалом этой опухоли. Для гена mtsl (Григорян и др., 1989) роль в процессе метастазирования продемонстрирована достаточно надежно. В то же время в клетках опухолей группы VMR ген mtsl вообще не экспрессирустся, вне зависимости от метастатического потенциала. То же справедливо и для ряда других опухолей. Можно предположить, что в разных конкретных случаях роль в индукции процесса метастазирования принадлежит различным генам, как это имеет место и при самом канцерогенезе.

Рис.10. Нозерн-блот гибридизация матричной РНК эмбриональных тканей (А) и органов взрослого человека (В) с 32Р-ысчсноЛ ДНК клона log?.

Нельзя оставлять без внимания также гомологию отдельных аминокислотных мотивов белка TAG7 с наиболее консервативными районами членов TNF семейства, роль которых в иммуных реакциях организма и воспалительном процессе показана достаточно хорошо и продолжает активно изучаться..

Таким образом, дальнейшее исследование гена tag7 представляет несомненный интерес, как возможного кандидата на участие в контроле процессов метастазирования.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован новый ген, экспрсссируюшийся в метастазирующих опухолях линии VMR.

2. Анализ промоторной области нового гена tog7, а также аминокислотной последовательности белка Tag7 обнаружил ряд черт, позволяющих предположить, что данный ген может представлять собой весьма отдаленный гомолог членов TNF семейства.

3. Ген экспрессируется также в некоторых неметасгазируюших и слабометастазирующих опухолях, причем уровень транскрипции его мРНК в системах in vivo и in vitro для метасгазируюших и неметасгазируюших опухолей различен.

4. Картина экспрессии гена tag 7 в нормальных органах мыши и особенно в специфических районах головного мозга еще раз подтверждает родство данного гена с членами семейства TNF.

5. Ген транскрибируется во взрослых и фетальных органах человека, что указывает на его эволюционную консервативность и функциональную значимость.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. О. С. Кустикова, С. JI. Киселев, О. Р. Бородулина, В. М. Сенин, А. В. Афанасьева, А. А. Кабишев. Клонирование гена tag7,' экспрессируюшегося в метасгазируюших опухолях. Генетика, 1996, №.5, стр. ...

2. А. Лучник, М. Шлезингер, М. Телков, О. Кустикова, А. Кутуева. Предварительный результат в пользу бинемной структуры человеческих хромосом. Доклады Академии Наук, 1993, Т.328, N,0 5, стр. 622т624.'

3. О. Kustikova, S. Kiselev, A. Kabishev, N. Ambartsumyan, D. Kramerov, E. Lukanidin, G. Georgiev. Cloning and preliminary characterization of new gene tag7. Pharmacology and toxicology, 194<i

V.77, Suppl. II, pp. 38.