Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Клональное микроразмножение промышленных сортов гладиолуса

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Клональное микроразмножение промышленных сортов гладиолуса"

РГ6 О*

'} Г/'«

На правах рукописи

\ и ь

ЛАПИНСКАЯ Мария Петровна

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ СОРТОВ ГЛАДИОЛУСА

Специальность - 06.01.07 - плодоводство

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА -1998

Работа выполнена во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства. Научный руководитель - кандидат биологических наук

В. А. Высоцкий.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор И. В. Дрягина, кандидат сельскохозяйственных наук Н. Я. Ипполитова. Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский

институт садоводства имени И.В. Мичурина.

Защита диссертации состоится " ^ " 1998 г. в 13

часов на заседании диссертационного совета Д 020.20.01 во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства, по адресу : 115598, Москва, ул. Загорьевская, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСТИСП. Автореферат разослан " /О " Л^ОР-^Р 1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 020.20.01 кандидат сельскохозяйственных наук

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На современном этапе возрастают требования к исходному посадочному материалу цветочно-декоративных растений, который в соответствии с последними стандартами должен быть свободен от различных вредителей и болезней. В этой связи биотехнологические методы приобретают лидирующую роль в получение высококачественного материала гладиолуса.

Гладиолус - является популярной высокодекоративной цветочной . культурой, выращиваемой по всему миру. Ускоренное размножение гладиолуса в течение последних 15-20 лет вызывает огромный интерес, как исследователей - ботаников, биотехнологов, селекционеров, так и производственников. Традиционный вегетативный метод не позволяет размножить быстро и в достаточном количестве новые сорта и гибриды. Многие гибриды имеют низкий коэффициент размножения, что препятствует их аттестации на сорт. Обычно для выведения нового сорта селекционеру требуется 10-12 лет. Все это сдерживает процесс сортосмены и обедняет ассортимент цветочной продукции.

При дефиците исходного материала значительно ускорить размножение позволяет метод клонального микроразмножения. Данный метод был использован для некоторых сортов гладиолуса, однако, при этом недостаточно полно изучено влияние стерилизующих растворов, регуляторов роста, минерального и органического состава питательной среды, условий культивирования на процессы регенерации растений. Довольно слабым звеном в технологическом процессе остается пересадка пробирочных растений в нестерильные условия. Для гладиолуса практически не изучены вопросы длительного культивирования in vitro, как эффективный прием сохранения ценных генотипов.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение особенностей регенерации и клонального микроразмножения гладиолуса, а также определение возможности использования этих приемов при производстве посадочного материала. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать эффективные методы получения стерильной культуры эксплантов;

- изучить поведение различных типов почек на клубнелуковице и клубнепочек при культивировании in vitro;

- оптимизировать состав питательных сред для всех этапов культивирования;

- изучить влияние гормональных факторов питательной среды и физических факторов выращивания на процессы микроразмножения гладиолуса;

- определить оптимальные концентрации азотнокислого кальция и изучить действие пониженных температур при длительном хранении пробирочных растений;

- разработать приемы клоналыюго микроразмножения гладиолуса для получения целых растений - регенерантов и выявить условия подготовки этих растений к высадке в почву.

Научная новизна результатов исследований. Проведенные исследования позволили установить возможность применения культуры изолированных органов и тканей для размножения гладиолуса. Разработаны эффективные приемы получения асептической культуры первичных эксплантов, выявлены наиболее благоприятные сроки изоляции in vitro изолированных почек гладиолуса семи сортов, различных по происхождению и срокам цветения, изучена реакция эксплантов на экзогенные регуляторы роста в сочетании с трофическими и физическими факторами культивирования. Установлена возможность микроразмножения гладиолуса четырьмя методами: дедифференциация интактных тканей с последующим каллусообразованием; активация роста почек возобновления; индукция образования адвентивных побегов; формирование зачатков корней в тканях экспланта.

Разработан состав питательной среды для длительного хранения, обеспечивающий наибольшую жизнеспособность пробирочных растений (А. С. № 1695854).

Практическая ценность. На основании полученных результатов предложена усовершенствованная технология клонального микроразмножения гладиолуса, позволяющая повысить выход посадочного материала в 3-5 раз, в зависимости от сорта, снизить затраты труда и себестоимость продукции по сравнению с общепринятой технологией,

Применение разработанных элементов технологии дает возможность более успешно решать проблему оздоровления и ускоренного размножения ценных сортов, сократить сроки их получения и сохранить

ценный материал.

Внедрение в практику. Растения гладиолуса, полученные методом клоналыюго микроразмножения, переданы для интродукции и сорто-изучения в коллекцию Главного ботанического сада РАН.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Республиканской конференции "Проблемы современного садоводства"

(г. Киев, 1989), на II международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы, 1993), на III конференции " Регуляторы роста и развитие растений" (Москва, 1995), на заседаниях Ученого Совета и секции ягодных культур ВСТИСП (1989 -1992, 1998), экспонировались на ВДНХ СССР, 1989 (удостоверение № 6).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано десять научных работ.

Объем работы. Диссертационнная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 8 глав, отражающих экспериментальный материал, обсуждения, выводов, рекомендаций производству. Работа содержит 25 таблиц и 18 рисунков. Список использованной литературы состоит из 172 наименований, в том числе 102 на иностранных языках.

Объекты, условия и методика проведения исследований. Исследования проводили в 1988-1992 г. в лаборатории биотехнологии отдела размножения. Для выявления сортовой специфики использовали сорта гладиолуса коллекции ГБС РАН четырех сортовых групп: ранние - Спринг. Сонг, Диксиленд, Хот-Липс; средне-ранние - Apec; средние - Бенгален, Кохинор; средне-поздние - Джестер.

Получение стерильных культур для экспериментов осуществляли по методике Р. Г. Бутенко (1964). Экспланты для введения в культуру брали в разные сроки соответствующие фазам развития клубнелукович-ных растений: началу вегетации, органического покоя, вынужденного покоя. В качестве стерилизующих растворов использовали 0,1 % сулемы, 0,1 % диацида, 0,1 % мертиолата.

Экспланты в стерильных условиях помещали на искусственные питательные среды: агаризованные, стационарные жидкие, и постоянно перемешиваемые жидкие.

Были испытаны составы: Мурасиге-Скуга, Гамборга, Ли-де Фос-сарда, Хеллера. Минеральная основа всех использовавшихся сред была дополнена тиамином, пиридоксином, никотиновой кислотой по 0,5 мг/л, аскорбиновой кислотой 1,0 мг/л.

Для выявления источника углеводов на развитие эксплантов в питательную среду добавляли сахарозу, глюкозу, лактозу, мальтозу манит и дульцит в концентрации 30 г/л. В зависимости от целей опытов на разных этапах культивирования в питательную среду вводили следующие

регуляторы роста: 6-бензнламинопурин (6-БАП), зеатин (3), кинетин (К), индолилуксусную кислоту (ИУК), нафтилуксусную кислоту (НУК), ин-долилмаслянную кислоту (ИМК), тиадиазурон (ТДг), 2-изопентиладенин (2-1Р).

Культивирование растений проводили при температуре 23-25°С, освещенности 2000 - 3000 лк и фотопериоде 16 часов.

На хранение закладывали укорененные побеги длиной 7-11 см, взятые со среды для укоренения.

Хранение проводили при температуре 4-6°С в бытовом холодильнике и в комнатных условиях (22°С).

Повторность в опытах неизолированная, число, повторностей в каждом варианте опыта от 15 до 30. Статистическую обработку данных проводили по Н.А.Плохинскому, 1970; Б.А. Доспехову, 1973; В.А. Потапову, В.И. Кашину, А.Г. Курсакову 1997, а также с использованием пакета программ "81а1^арЬ" на персональном компьютере типа РС-386 АТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Введение в культуру

Важное значение для успешного введения _ эксплантов в культуру имеет выбор стерилизующего раствора, от которого зависит инфициро-ванносгь эксплантов, их состояние и степень развития. Для подбора веществ обеспечивающих высокую степень стерильности были использованы растворы ртутных препаратов - сулемы, диацида, мертиолата в концентрации 0,1 % при экспозициях 10,15,20 минут в различных сочетаниях. Большую эффективность в подавлении сапрофитной микрофлоры при продолжительности стерилизации в 15 минут показал 0Д% раствор сулемы. Увеличение длительности стерилизации до 20 минут оказалось фитокснчным для эксплантов изученных сортов гладиолуса, практически для всех типов стерилизующих агентов. Наилучшие результаты показала комбинация 0,1 % раствора сулемы с 70% этанолом (табл.1).

Влияние вида стерилизующего агента и продолжительности обработки на инфицированность эксплантов гладиолуса

in vitro, среднее по сортам.

Стерили- Экспози- Посажено Инфициро Процент Развива-

затор ция (мин.) эксплан- -вано (шт.) инфициро- ются

тов (шт.) ванности (шт.)

10 30 17 56,6 13

Сулема 15 30 11 36,6 19

0,1% 20 30 0 0 0

10 30 22 73,3 8

Диацид 15 30 17 56,6 13

0,1 % 20 30 0 0 0

Этанол

70% + 3+10 30 5 16,6 25

Сулема 3+15 30 5 16,6 25

0,1% 3+20 30 0 0 0

Рф 15,27***

2. Развитие эксплантов в зависимости от сроков изоляции.

Регенерационная способность эксплантов зависела от срока изоляции. Наибольшее число побегов экспланты образовывали при изоляции в фазу активного роста. Экспланты, взятые в фазу вынужденного покоя занимали промежуточное положение между эксплантами, изолированными в фазы окончания роста и глубокого физиологического покоя (табл.2).

Таблица 2.

Среднее число образующихся побегов гладиолуса в первом субкультивировании, в зависимости от сроков изоляции (среда Мурасиге-Скуга, 6-

БАП - 0,5 мг/л).

Срок изоляции (фаза развития)

Ноябрь Март Апрель-Mai Октябрь

Сорт (покой) (вынужден- (активный (окончание X

ный покой) рост) роста)

Хот-Липс 3,5 4,7 5,1 3,6 4,3

Кохинор 2,0 3,2 3,7 2,1 2,7

Джестер 2,2 2,7 3,2 2,0 2,5

X 2,6 3,5 4,0 2,6

Существенность различий : сроки НСРоз=0,8; сорта НСРо5=0,7; Взаимодействие: НСРо5=1,7.

Развитие эксплантов испытанных сортов зависело от генетических особенностей. Экспланты ранних сортов развивались быстрее, чем сред-

них и среднепоздних. Темпы развития эксплантов зависели также от срока изоляции. Наиболее эффективными для изоляции эксплантов были весенние сроки по сравнению с осенне-зимним периодом.

3. Влияние минерального состава питательной среды и способов культивирования на развитие эксплантов.

Изолированные экспланты гладиолуса способны были развиваться на всех изученных средах - агаризованных, стационарных жидких и в постоянно перемешиваемых жидких, однако применение жидких сред было более эффективно.

В первом субкультивировании экспланты выращиваемые в жидкой перемешивающейся среде, формировали больше побегов, чем экспланты, выращиваемые на агаризованных и стационарных жидких (табл. 3).

Таблица 3.

Число побегов у эксплантов различных сортов гладиолуса, в зави-

симости от условий культивирования.

Способ Количество побегов (шт.) X

культивирования эксплантов Джестер Хот-Липс Спринг-Сонг

Агаризованная среда 3,1 4,3 5,7 4,7

Жидкая непере-мешивающаяся среда 1,2 1,5 2,0 1,6

Жидкая постоянно перемешивающаяся 19,7 32,8 47',3 33,2

X 8,0 12,8 18,3

Существенность различий: среда НСРоз=3,1; сорта НСРо5-5,3; Взаимодействие: НСРо5=4,8.

Данные показывают, что культивирование эксплантов в жидкой среде с выращиванием на роллере существенно увеличивало образование побегов (в среднем до 33,2 шт. на эксплант), по сравнению с контролем без вращения.

Изучение культурных сред с минеральными солями по разным рецептам (Мурасигс и Скуга. Ли и де Фоссарда, Гамборга, Хеллера) позволило выявить отношение стерильных культур гладиолуса к общей концентрации минеральных солей в среде (табл. 4)

Регенерация побегов эксплантами различных сортов гладиолусов на этапе введения в зависимости от минерального состава питательных сред _(в среднем за 1990-1991 г.)___

Минеральная Количество побегов (шт.)

основа Джес- Арес Бенга- Хот- Кохи- Спрннг Дикси- X

среды тер лец Липс нор Сонг ленд

Мурасиге-Скуга 2,8 3,2 3,3 4,1 4,3 5,9 6,1 4,2

Хеллер 2,0 2,8 2,9 3,7 3,6 5,2 5,7 3,7

Гамборг 4,3 4,2 4,6 5,2 4,9 6,8 7,2 5,3

Ли-де Фоссард 4,9 5,1 5,3 5,7 5,9 7,1 8,3 6,0

X 3,5 4,0 4,0 4,6 4,6 6,3 6,8 -

Существенность различий: среда НСРо5= 0,8; сорта НСРо5=0,9;

Взаимодействие: НСРо5=1,7.

Для всех сортов гладиолуса среда Ли-де Фоссарда и Гамборга обеспечивали наибольший коэффициент размножения. Худшие результаты получены на среде Хеллера, тогда как среда Мурасиге-Скуга занимала промежуточное положение. Вместе с тем различия по числу побегов между средами Ли-де Фоссарда и Гамборга были несущественными. По годам исследований реакция эксплантов на состав среды не изменялась. Такое поведение, показывает относительно низкую требовательность эксплантов испытанных сортов гладиолуса к минеральному составу ниппельных сред на этапе введения в культуру.

4. Действие регуляторов роста на регенеранионную способность гладиолуса.

В ходе проведенных экспериментов нами была выявлена существенная зависимость коэффициента размножения гладиолуса от содержания в кулыуральной среде 6-БАП (табл. 5).

Развитие эксплантов гладиолуса в зависимости от концентрации 6-БАП в питательной среде (минеральная основа по Мурасиге-Скуга)_

Показа- Сорт Концентрация 6-БАП, мг/л

тель 00 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 НСР05

Apec 1,8 3,9 5,4 7,7 6,6 4,3 2,3 1,2

Коэффи- Бенгален 1,4 3,5 5,0 6,6 5,2 3,8 1,1 1.0

циент Кохинор 1,1 4,1 6,3 8,3 6,8 3,7 2,2 1,1

размно- Джестер и 3,7 4,7 5,8 4,9 2,4 1.1 0,7

жения Хот-Лнпс 1,6 5,3 6,4 8,9 7,7 3,1 1,1 1,3

Диксиленд 2,4 7,7 11,2 16,7 10,6 5,7 2,9 2,2

Спринг-Сонг 2,2 7,3 9,7 15,8 9.7 6,0 2,7 2,1

X 1,7 5,1 6,9 9,9 7,4 4,1 1,9 -

Apec 6,7 12,1 22,1 35,6 31,3 24,2 21,3 5,3

Длина Бенгален 6,3 12,4 22,6 34,8 30,8 22,1 19,4 5,7

побегов, Кохинор 5,6 13,9 26,7 37,3 31,4 19,7 17,7 5,4

мм Джестер 4,9 9,4 15,7 21,8 18,6 15,2 1,1 4,3

Хот-Липс 6,8 14,2 27,8 35,8 30,9 25,3 20.3 6,2

Диксиленд 7,3 17,7 32,1 41,2 37,3 24,7 21,4 6,3

Спринг-Сонг 8,2 16,9 30,3 39,4 32,4 23,9 19,7 6.7

X 6,5 13,8 25,6 35,1 30,3 22,2 18,7 -

Использование 6-БАП показало его высокую эффективность для большинства изученных сортов. Экспланты гладиолуса характеризовались хорошим развитием при наличии в питательной среде этого препарата в широком диапазоне концентраций от 0,5 до 3 мг/л. Изученные концентрации 6-БАП оказывали влияние, как на коэффициент размножения, так и на длину побегов. Существенно было и влияние сортовых особенностей.

Во всех случаях высокие концентрации 6-БАП приводили к уменьшению образования побегов, а у сорта Джестер отмечалось бурное кал-лусообразование при концентрации 6-БАП 3 мг/л. 6-БАП в концентрации от 0.5 мг/л до 1,5 мг/л оказывал существенное влияние на число образовавшихся побегов на эксплант, при этом число регенерируемых побегов колебалось от 3,5 до 16,7 шт. Варианты с уровнем концентрации 6-ЬА11 1.0 и 1.5 мг/л были наилучшими для абсолютного большинства сорит.

Кинетин, зеатин и тидиазурон оказались менее эффективными по равнению с 6-БАП. Вместе с тем была выявлена высокая цитокинино-ая активность 2-изопентиладенина.

Коэффициент размножения на средах с 2-изопентиладенином был :ыше в 1,8 раза по сравнению с вариантами, где использовали 6-БАП.

5. Действие углеводов на развитие эксплантов гладиолуса.

Для сохранения жизнеспособности и развития изолированных ;лубнепочек гладиолуса in vitro обязательным является присутствие в штательной среде углеводов. Тип и концентрация углеводов оказывали .■ущественное влияние на развитие эксплантов испытанных сортов гла-шолуса.

Развития изолированных клубнепочек на среде, содержащей манит 1 дульиит не происходило, все экспланты гибли на начальных этапах сультивирования. Сред» эксплантов, культивируемых на средах с сахарозой, глюкозой, лактозой, гибели эксплантов не отмечали. Наибольшее увеличение числа побегов наблюдали при культивировании на средах, содержащих сахарозу и глюкозу. По комплексу двух показателей длине -:тебля и число побегов - лучшей из изученных была концентрация углеводов 30 г/л.

6.Другие факторы влияющие на процессы микроразмножения гладиолуса.

Наряду с составом питательной среды, используемыми регуляторами роста на культивируемые экспланты определенное влияние оказывали и некоторые другие факторы, в частности число субкультивирований и физические условия культивирования. В первом субкультивировании обычно происходило развитие адвентивных побегов, которые отделяли при пересадках, проводя расчет коэффициента размножения. Наиболее высокий коэффициент размножения микропобегов у изучавшихся сортов отмечали в третьем-четвертом субкультивировании Экспланты гладиолуса трех сортов не обнаруживали необратимого снижения про-лифератнвной активности культуры на протяжении шести пассажей (табл.6).

Таблица 6.

Развитие эксплантов гладиолуса в зависимости от числа суб-

культивирований (среда Мурасиге-Скуга, 6-БАП - 0,5 мг/л ___ в среднем за 2 года)___

Показатели Сорт Число субкультивирования

0 1 2 3 4 5 6 НСР05

Коэффи-

циент Хот-Липс 3,6 8,1 9,3 11,4 10,3 9,6 8,4 1,6

размно- Арес 3,4 7,2 8,4 9,6 11,1 9,3 7,8 1,4

жения Джестер 1,7 4,1 6,3 8,6 9,2 8,9 7,3 0,9

Длина Хот-Липс 29,7 43,6 48,4 57,9 57,9 57,8 55,7 5,3

побегов, Арес 19,6 32,3 47,4 53,2 53,7 50,7 49,3 5,1

мм Джестер 13,7 15,3 34,3 45,3 50,3 49,7 40,2 4,7

Одним из важнейших факторов, оказывающих влияние на процессы регенерации у растений, является свет. В среднем по трем изученным сортам выявилось преимущество красного света перед светом других спектров в отношении коэффициента размножения. Наибольшая длина побегов была отмечена при инкубировании на зеленом свете. Белый свет обеспечивал минимальные коэффициент размножения и длину побегов (табл.7).

Таблица 7.

Коэффициент размножения и длина побегов у эксплантов гладиолуса разных сортов в зависимости от качества света (среда Мурасиге-Скуга, 6-БАП - 1 мг/л в среднем за два года).___

Показатели

Коэффициент размножения

Длина иобс! ов,мм

Сорт

Хот-Липс Бенгален Джестер X

Хот-Липс Бенгален Джсстер X

КачргТВ" света

Белый

6,2 5,8 3,4 5,1

29,4 28,6 25,7 27,9

Красный

10,6

9.1

6.2

8,5

37,1 31,4 33,3 33,9

Зеленый

7.1

6.2 5,3 6,2

47,3 46,1 43,7 45,7'

Синий

6,0 5,9 3,4 5,1

3,2 29,7

26.3

29.4

НСР05

1,4 1,1

0,8

4,5

3,8 3,1

Вместе с тем. экенланты разных сортов проявляли специфическую и-акишо на свет разного спектрального состава. У эксплантов сортов

Хот-Липс, Бенгален, Джестер, лучшие результаты обеспечивали красный и зеленый свет, тогда как белый и синий свет оказались малоэффективными в отношении коэффициента размножения.

7. Размножение микропобегов гладиолуса in vitro.

На этапе собственно микроразмножения происходило образование клубнепочек и побегов. Формирование дополнительных клуб-непочек н побегов происходило двумя путями: активизация пазушных почек и формирование микропобегов непосредственно из ткани экс-планта.

Как сообщил в своих работах Ж.Хасси (G.Hussey,1976,1977), под влиянием цитокишшов у ряда однодольных растений в культуре in vitro имеет место стимуляция ветвления, как это наблюдается у двудольных. При этом автор отмечал, что виды из семейства Iridaceae более чувствительны к действию цитокишшов, по сравнению с представителями семейства Liliaceae, Amaryllidaceae. Н.В.Катаева (1981) также указывала на важную роль цитокишшов в подавлении апикального доминирования в экспериментах по микроразмножению фрезии в культуре тканей.

Для клонального микроразмножения покоящиеся клубнелуковицы высаживали на питательную среду Мурасиге-Скуга с регуляторами роста. На среде без гормонов не было отмечено каких-либо изменений в поведении клубнелуковицы. В вариантах опыта с добавлением ауксинов и цитокишшов было показано, что НУК (0,1 мг/л) в сочетании с 6-БАП (0.5 мг/л) вызывала рост апикального побега и корней, которые отличались тем, что, были не обычными нитевидными, характерными для ин-тактного растения. Сочетание 6-БАП (0,5 мг/л) и НУК (0,5 мг/л) приводило к формированию растений-регенерантов. В варианте с 1 мг/л 6-БАП и 1 мг/л НУК наблюдали процесс деднфференциации тканей клубнелуковицы, превращения их в каллусную массу. Рост корней приостанавливался, происходило их разрастание и образование неорганизованной каллусной ткани. Эта ткань обладала высоким морфогенетическим потенциалом н в последующих опытах служила исходным материалом для индукции органогенеза.

В варианте 1,0 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л НУК происходило формирование корней и рост почки возобновления. Создание высокого уровня содержания ауксинов в среде (3 мг/л НУК и 1 мг/л 6-БАП) влияло на ход отрастания целых клубнелуковиц. Через 2-3 месяца после посадки отмечали рост побегов, развившихся из почек возобновления. При этом вы-

тягивался не только побег, развивающийся из апикальной почки, но и происходил рост из пазушных боковых и нижних почек (побеги первого порядка). Следует отметить, что рост побегов был незначительным, их длина не превышала 60-80 мм. Через месяц основания побегов несколько утолщались, и происходило формирование замещающих клубнелуковиц-деток, на которых закладывались свои спящие почки. Эти пазушные почки также трог ались в рост и давали начало побегам второго порядка.

Следующий этап работы состоял в изолировании побегов второго порядка и пересадки их на питательную среду Мурасиге-Скуга для индукции ризогенеза, последующего роста и развития. Побеги отделяли и пересаживали на среды, содержащие НУК, ИМК. ИУК, либо сочетания этих регуляторов роста с 6-БАП или кинетином. Оптимальная концентрация гормонов для индукции и роста корней составила 0,5 мг/л ИМК. ИУК или НУК в сочетании с 0,1 мг/л 6-БАП. Выдерживание укорененных пробирочных растений в течении трех недель при температуре +6°С стимулировало интенсивный рост корней, максимальная длина которых достигала 30-40 мм при высоте побегов 70-80 мм. По окончании вегетации основание побегов утолщалось за счет питательных веществ ассимилирующих листьев и происходило формирование замещающих клубнелуковиц, имеющих размеры 3 мм в высоту и 0,5 мм в основании. В результате пазушного ветвления из одной исходной клубнелуковицы через 6 месяцев можно получить около 100 растений-регенерантов.

Особо следует отметить эксперименты по культивированию апикальных и пазушных почек гладиолуса на основной среде Мурасиге и Скуга. в которую добавляли низкие дозы 6-БАП и НУК (0,1-1,0 мг/л).

В вариантах опыта с 0.1 мг/л 6-БАП и 1 мг/л НУК наблюдали рост побегов, длина которых через три месяца культивирования достигала 6070 мм. От основания побегов отходили корни длиной 5-7 мм.

При обратном соотношении этих регуляторов роста (1 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л НУК) процесс был варажен ярче. В данном случае происходил активный рост побегов и развитие мощной корневой системы, разворачивались ассимилирующие листья.

Высота растений через три месяца культивирования составляла 8090 мм, а длина корней - 40-50 мм. Именно эти сочетания гормонов <1 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л НУК) являлось самым эффективным для роста побегов и корней и развития нормальных растений-регенерантов.

В дальнейшем пробирочные растения выдерживали в течение трех недель при 5°С после чего растения высаживали в сосуды со смесыо торфа и песка. При этом растения достигали 115-120 мм в высоту, максимальная длина корней 70-90 мм. Растения продолжали свое развитие до образования замещающих клубнелуковиц размером 5 мм в выану и 3 мм в ширину.

■ 8. Укоренение побегов гладиолуса.

При изучении влияния на процесс ризогенеза минеральной основы среды для укоренения была обнаружена заметная реакция побегов гладиолуса сорта Джестер на концентрацию минеральных солей в среде. Наибольший процент укоренения побегов получен на среде с половинной концентрацией минеральных солей по прописи Мурасиге и Скуга -84 %. наименьший - на среде с полной концентрацией - 36 % . Среда содержащая 1/4 концентрации солей давала результаты несущественно отличающиеся от вариантов половинной концентрации - 69 % (табл.8).

Таблица 8.

Влияние концентрации минеральных солей в питательной

среде на укорененяемость микропобегов гладиолуса сорта _Джестер и последующее развитие растений.

Концентрация минеральных солей по рецепту Му-расита-Скуга (часть) Процент укоренившихся побегов, % Высота растений.мм Длина корней, им

1 36 32,2 15,1

1/2 84 34,4 17,3

1/4 69 33,6 16,9

1/8 57 32.2 14,3

Процесс ризогенеза у побегов гладиолуса сорта Джестер интенсивнее протекал на жидкой перемешивающейся питательной среде, где побеги укоренялись на 100%.

Использование регуляторов роста ауксгшовон природы обеспечивало высокую укореняемость побегов гладиолуса через 1 месяц культивирования.

Оптимальными стимуляторами ризогенеза оказались ИМК в концентрации 0,5-1,0 мг/л (средняя укореняемость 85%), корнеобразование интенсивнее шло при введении в среду НУК в концентрации 0,5- 1,0 мг/л; процент укоренения в этих вариантах был равен 92,4 % и 97,1% соответственно. Индолилуксусная кислота во всех испытанных концентрациях обладала наименьшим ризогенным эффектом.

9. Перевод пробирочных растений в нестерильные условия.

Известно, что на первом этапе переноса пробирочных растений в нестерильные условия необходимо создать повышенную влажность воздуха. С этой целью использовали контейнеры из полиэтиленовой пленки размером 5x5x12 см, приживаемость растений в которых была значительно выше , чем в ящике размером 50x30x10 см, помещенном в пакет из полиэтиленовой пленки.

Эта операция требовала значительных затрат ручного труда, а конечный результат был ненадежен, гак как создать однотипные условия адаптации всем растениям невозможно, и как следствие, значительная часть растении погибла уже после раскрытия пакетов.

Перспективным направлением в решении проблемы адаптации, на наш взгляд, является обработка пробирочных растений перед высадкой в нестерильные условия холодом, при температуре +4+6°С в течение 3-4 недель, что повышает приживаемость и улучшает дальнейшее развитие растений. Такой способ подготовки растений-регенерантов к посадке в нестерильные условия, обеспечивал 90-100% приживаемость пробирочных растений и исключал их инфицирование.

. 10. Хранение пробирочных растений.

Весьма актуальны исследования в области создания банка ценных форм и сортов. В наших опытах при хранении пробирочных растений наибольшую жизнеспособность обеспечивало введение в питательную среду азотнокислого кальция в концентрации 1200-1600 мг/л, в отличии от стандартного использования хлористого кальция (табл.9).

Влияние различного содержания СаСЬ и Са(>Юэ)2 в питательной среде на жизнеспособность эксплантов гладиолуса сорта Диксиленд (объем варианта 90 эксплантов).

Компоненты среды Мурасиге-Скуга Температура 4-6°С

варианты питательной среды

1 2 3 4 5 6 7 X

СаС1з(мг/л) 420 440 600 _

Са(ЫОз)2(мг/л) . 1200 1400 1600 1800 .

% живых растений при сроке хранения 24 месяца 13,3а 26,ба 36,6а 78,8а 88,8а 80,0а 67,7а 56,4

12 месяцев 40,06 47,76 44,46 80,0а 91,1а 80,0а 75,5а 65,5

6 месяцев 82,Ов 70,Ов 55,5в 97,7в 1006 1006 1006 86,4

3 месяца 86, Ов 84,4г 62,2в 1006 1006 1006 1006 90,4

X 55,3 57,1 49,5 89,1 94,9 90,0 85,8 -

Исключение из питательной среды иона С1 приводило к увеличению процента жизнеспособности эксплантов гладиолуса, при двухлетнем хранении до 78,8.

■ 11. Экономическая эффективность приемов клонального микроразмно-

ження гладиолуса.

Экономическую эффективность метода мы рассчитали относительно традиционного размножения гладиолуса, который наиболее близок к микроразмножению.

Расчет был проведен на 1000 клубнелуковиц (тзбл.Ю). Как следует из таблицы, высокая эффективность микроразмножения гладиолуса обусловлена снижением себестоимости получаемых растении, вследствие высокого коэффициента размножения, что позволяет рекомендовать этот способ для промышленного размножения, особенно при дефиците исходного материала.

Ожидаемый экономический эффект от внедрения клонального микро-

размножения гладиолуса в производство.

Методы размножения

Показатели Традиционное Клональное микроразмножение

Выход посадочного материала с 1 КВ. М..ШТ 1000 5000

Затраты труда, ч. - час. 180 854

'Затраты материальных денежных средств, руб 583 2415

Себестоимость 1 шт, руб 0,58 0,48

Средняя цена реализации, руб 5,0 5,0

Выручка от реализации, руб 5000 25000

Прибыль от реализации,руб 4,417 22,585

Прибыль в расчете на 1 ч. -час.,руб 24,5 26,4

Уровень рентабельности производства, % 758 935

Годовой экономический эффект, тыс. руб 18168

ВЫВОДЫ

1. Проведенные исследования показали возможность эффективного размножения испытанных сортов гладиолуса методом культуры изолированных органов и тканей, который способствует наиболее полной реализации морфогенетических потенций растений гладиолуса в культуре in vitro.

2. Для стерилизации клубнепочек гладиолуса наиболее эффек-" тивными оказались 0,1% раствор сулемы (экспозиция 15 мин.) в сочетании с предварительной обработкой эксплантов 70% этиловым спиртом.

3. Наиболее подходящей фазой изоляции эксплантов гладиолуса для введения в культуру являются фазы вынужденного покоя и начала активного роста, обеспечивающие максимальную регенерацию побегов in vitro.

4. Сегменты клубнепочек, верхушечные почки клубнелуковицы обладают большей регенерационной способностью по сравнению с латеральными почками клубнелуковиц сортов гладиолуса, вовлеченных в эксперименты.

5. На этапах введения в культуру и микроразмножения для гладиолуса следует использовать среды на основе минеральных солей Гамбор-га, Ли и де Фоссарда и Мурасиге-Скуга.

6. Из испытанных регуляторов роста на этапе микроразмножения гладиолуса наиболее эффективны 6-бензиламинопурин в концентрации 1,0-2,0 мг/л и 2-изопентениладенин в концентрации 0,1-1,0 мг/л. Использование регуляторов роста позволило повысить коэффициент размножения гладиолуса в 2 раза.

7. Развитие эксплантов различных сортов гладиолуса in vitro зависело от генетических особенностей. Максимальным коэффициентом размножения характеризовались экспланты сортов Диксиленд, Спринг-Сонг, минимальным - сорта Apec, Хот-Липс, Джестер. Экспланты сортов Бенгален, Кохинор занимали промежуточное положение.

8. Коэффициент размножения у эксплантов гладиолуса зависел от числа субкультивирований. Коэффициент размножения возрастал до 4 пассажа, а затем наблюдалось его снижение.

9. Экспланты разных сортов проявляли специфическую реакцию на свет различного спектрального состава. Лучшие результаты обеспечивало культивирование при красном и зеленом свете, тогда как белый и синий свет оказались малоэффективными с точки зрения развития дополнительных побегов.

10. Укореняемость побегов зависела от состава питательной среды. Наиболее интенсивное развитие корневой системы происходило на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга с минеральной основой, разбавленной в 2 раза и в присутствии ИМК или НУК в концентрациях 0,5-1,0 мг/л.

11. Показана возможность сохранения пробирочных растений и отдельных органов in vitro в течении 1-2-х лет без обновления питательных сред при условии замены хлористого кальция на азотнокислый в концентрации 1400-1600 мг/л и снижении температуры до +4+6°С без

дополнительного освещения (A.C. № 1695854), что может быть исполь зовано для хранения коллекций ценных сортов.

12. Применение новых элементов технологического процесса адап тации пробирочных растений с воздействием пониженными температу рами в течение 3-4-х месяцев для формирования "микролуковиц" позво лило повысить приживаемость в нестерильных субстратах до 90-100%.

13. Усовершенствованная технология клонального микроразмно жения обеспечивает увеличение выхода единиц посадочного материал! гладиолуса в 4-5 раз по сравнению с общепринятой технологией и яв ляется экономически выгодной.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ.

При клональном микроразмножении гладиолуса в качестве иници альных эксплантов необходимо использовать сегменты клубнепочек, ил] ночки клубнелуковицы в фазе вынужденного покоя или начала ак тивного роста.

Растительный материал рекомендуется стерилизовать в 0,1 % рас творе сулемы (экспозиция 15 мин.) в сочетании с предварительной обра боткой эксплантов 70 % этиловым спиртом.

На этапах введения в культуру и микроразмножения для глаДиолу са следует использовать среды на основе минеральных солей Гамборга Мурасиге-Скуга , Ли и де Фоссарда , с включением б бензиламинопурина в концентрации 1,0-2,0 мг/л или 1 изопентениладенина в концентрации 0,1-1,0 мг/л.

Для повышения коэффициента размножения использовать ocbs щение лампами с преобладанием лучей красной и зеленой области спек тра.

Укоренение побегов рекомендуется проводить на жидкой питг тельной среде на основе половинной концентрации солей Мурасип Скуга. Для стимуляции ризогенеза следует использовать ß- индолилма< лянную кислоту и а-нафтилуксусную кислоту в концентрациях 0,5-1, мг/л.

Подготовку растений-регенерантов к посадке в нестерильные услс вия необходимо проводить по разработанному способу с адаптацией hi

посредственно в культивационном сосуде в холодильнике в течение 3-4-х месяцев для формирования луковичек.

Для хранения пробирочных растений использовать среду с азотнокислым кальцием в концентрации 1400-1600 мг/л.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Лапинская М.П. Клональное микроразмножение гладиолуса// Тез. докл. научно-практич. конф.- Киев,- 1989 - С. 119-120.

2. Лапинская М.П. Микроразмножение гладиолуса// Тез. докл. И Рес-публ. конф. Киев. - 1991. - С. 112.

3. Лапинская М.П. Факторы, влияющие на клональное микроразмножение гладиолуса//Тез. докл. II Республ. конф. Киев. - 1991. - С. 113.

4. Высоцкий В.А., Лапинская М.П. Клональное микроразмножение промышленных сортов гладиолусаЮкспресс-информация.- г. Люберцы.-1991. -№ 1679.

5. Высоцкий В.А., Лапинская М.П. Размножение гладиолуса in vitro. ■ Цветоводство. - 1991.- № 1.- С. 13-14.

6. Лапинская М.П., Высоцкий В.А. Способ микроразмножения гладио-луса//А.С. № 1695854 опубл. Б.И.- №45,- 1991.

7. Высоцкий В.А., Лапинская М.П., Шершень И.А. Клональное микроразмножение луковичных декоративных растений в жидкой питательном среде//Тез. докл. II Межд. конф. Биология культивирования клеток растений и биотехнология. - Алматы,- 1993. - С. 211.

8. Vysotskii V.A., Lapinskaia М.Р., Shershen I.A. Clonal micropropagation of Bull ornamental Plants in liouid Nutrient medium //Abstracts of reports. II International conference "Biology of plant cell cultures and biotechnolocy.-Almaty.- 1993 -C. 225.

9. Лапинская М.П, Размножение гладиолуса методом культуры изолированных тканей и органов// Тез! докл. Всероссийского совещания. -Москва,- 1995 -С. 170-171.

10. Лапинская М.П., Высоцкий В.А. Действие ауксинов и цитокишшов в культуре изолированных почек гладиолуса// III Конф. Регуляторы роста

и развития растений - Москва,- 1995.- С. 219.

Подписано в печать 25.03.98 Формат 60 х 84/16 Объем 1,25 п. л.

Заказ 250__Тираж 120

115598, Москва, ул. Ягодная, 12 Типография Россельхоэакадемии