Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Клеточные взрывы у растений в условиях дефицита кальция

ВАК РФ 06.01.14, Агрофизика

Автореферат диссертации по теме "Клеточные взрывы у растений в условиях дефицита кальция"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК АГРОФИЗИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

, Го о '

7 -» пцт

Скобелева Ольга Викторовна

КЛЕТОЧНЫЕ ВЗРЫВЫ У РАСТЕНИЙ 8 УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ Специальность - 06.01.14 - агрофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

РОССИЙСКАЯ АКАДЕШИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК АГРОФИЗИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Скобелева Ольга Викторовна

КЛЕТОЧНЫЕ ВЗРЫВЫ У РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ Специальность - 06.01.14 - агрофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Агрофизическом научно-исследовательском институте. Научные руководители:

- кандидат биологических наук И.Н.Кгиторова,

- доктор химических наук Ю.А.Кокотов.

Официальные оппоненты:

- кандидат биологических наук А.Н.Зубов,

- доктор биологических наук, профессор Н.Ф.Батыгин.

Ведущее учреждение - Институт теоретической и экспериментальной биологии Российской Академии Наук.

Защита диссертации состоится "//" //лж^л 1998 г. в /£час. на заседании диссертационного совета Д 020.21.01 в Агрофизическом научно-исследовательском институте по адресу: 195220, г. Санкт-Петербург, Гражданский пр., 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Агрофизического научно-исследовательского института.

Автореферат разослан аяЪг^я 1998 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные гербовой печатью учревдения, просим направить по адресу:

195220, г. Санкт-Петербург, Гражданский пр., 14, АФИ.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на то, что Ca является одним из основ-шх элементов почвенного раствора, в последние десятилетия возросло шсло сообщений о физиологических нарушениях растений, вызванных не-юстаточным поступлением Ca в отдельные органы и ткани. К ним относятся горькая ямчатость яблок, пробковая пятнистость груш, пятна внутрен-тей ржавчины и пустоты у картофеля, черная сердцевина сельдерея, ле-гестковая гниль у томатов, внутренние пустоты у моркови, внутренняя горичневатость у брюссельской капусты и ожог кончиков листьев латука и ф. ( Simon, 1978; Kirkbey, Pilbeam, 1984). Для возникновения "болез-1ей Са-дефицита" есть внешние и внутренние причины. К первым относится ^достаточное внесение кальциевых удобрений, которое происходит вынуж-[енно в нашей стране, в частности, в Ленинградской области, в послед-iee десятилетие. Та же тенденция отмечается западными исследователями, юдчеркивающими, что рост урожайности при интенсивном земледелии увешивает потребность растений в почвенном Ca. Внутренние причины сос-'оят в особенностях транспорта и распределения Ca внутри растения, ко-■орые приводят к возникновению локального Са-дефицита в запасающих |рганах и развивающихся меристемах. Механизмы повреждения на клеточном ровне остаются неясными. Наиболее распространенной является гипотеза развитии неспецифической проницаемости плазмалеммы (ПМ) при замеще-ии на ее поверхности ионов Са2+ на ионы Na+ или К+ (Kauss, 1987; Сга-er et al.,1985; Demarty et al., 1984; Kirkbey, Pilbeam, 1984). Однако ти представления, развитые ранее для животных клеток, не учитывают пецифических особенностей растительных клеток, которые окружены а-содержащей клеточной стенкой (КС), во многом определяющей потреб-ость растений в кальции. Впервые на возможность альтернативных путей овреждения растительной клетки: с опережающим повреждением ПМ путем лавной потери тургора, либо с опережающим повреждением КС путем кле-очного взрыва (cell burst) - указал Simon (1978). Однако его взгляды е имели достаточного экспериментального подтверждения и не получили альнейшего развития. Немногочисленные исследования, проведенные к астоящему времени на клеточном уровне, в условиях, моделирующих усло-ия Са-дефицита, выполнены на клеточных суспензиях и интерпретированы

рамках гипотезы о развитии неспецифической проницаемости ПМ, хотя го не позволяло объяснить наблюдавшийся эффект защиты осмотиками Gramer et al.,1985; Enoch, Glinka, 1983). В этой ситуации представляюсь актуальным проследить за динамикой физиологического состояния и арактером повреждения индивидуальной растительной клетки в процессе азвития Са-дефицита, уделяя особое внимание свойствам ее ПМ и КС.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы было исследовать механизмы повреждения клето? харовой водоросли ШЬеПа зупсагра и корневых волосков высшего водногс растения Тг1апеа Ьода1епэ15 в условиях развивающегося Са-дефицита.

В ходе исследования решался ряд последовательных задач:

1). охарактеризовать динамику физиологического состояния клеток N1-1е11а б. в процессе развития Са-дефицита, используя наблюдения за цикловом и регистрацию электрических параметров Ш и тонопласта (Т);

2). исследовать возможность воспроизведения нового обнаруженной явления - клеточных взрывов - на корневых волосках Тг1апеа Ь.;

3). исследовать динамику тургорного давления при клеточных взрыва И^еПа б. и проанализировать причины возникновения взрывов, использу: существующие представления о механической устойчивости мембран;

4). дать количественную оценку уровня десорбции Са из фазы КС и > наружной поверхности ПМ к моменту клеточного взрыва МИеПа з.;

5). проанализировать естественные ситуации, в которых могут возни кать взрывы растительных клеток, и их возможные последствия.

Научная новизна.

1. Впервые в опытах на растительных клетках (междоузлия (11Ле11а б и корневые волоски Тг1апеа Ь.) систематически наблюдали и исследовал новое явление: возникновение серии клеточных взрывов, завершающейс гибелью клетки. Таким образом, впервые экспериментально продемонстри рован один из возможных типов гибели растительной клетки, связанный нарушением структуры ее клеточной стенки. Показано, что клетка восстё навливает жизнеспособность после единичных взрывов и сохраняет ее, ее ли причина взрывов устранена.

2. Впервые с помощью микроэлектродной техники зарегистрированы иг менения электрического потенциала и сопротивления ПМ и Т растительнс клетки в условиях развивающегося Са-дефицита. При этом показано, чз клеточный взрыв сопровождается временным повышением концентрации сбс бодного цитозольного Са2+ до уровня ССац24"] > 1СГ5М.

3. Впервые зарегистрированы изменения линейных размеров и тургорнс го давления растительной клетки во время серии клеточных взрыве вплоть до необратимой потери тургора при гибели клетки. При этом пок; зано, что выброс цитоплазмы происходит за доли секунды и завершает! формированием пробки и входом воды в клетку, который продолжается течение секунд, в соответствии с параметрами водного обмена клетки.

4. Впервые проведен анализ механического состояния двухслойной с» темы плазмалемма-клеточная стенка с позиций теории мембранного лизи (Козлов, Маркин, 1984). Показано, что взрыв растительной клетки и о

отический лизис животной клетки имеют общую физическую природу. Пока-аяо, что механическая устойчивость ПМ растительной клетки при данном начении тургорного давления зависит от радиуса пор КС.

На защиту выносятся следующие положения:

1). Са-дефицит в клеточных стенках Ы^еПа я. и корневых волосков ггапеа Ь., появляющийся в результате Са2+/Ма+(К+) обмена, может при-ести к гибели растущих клеток вследствие клеточных взрывов, проявляются как серия выбросов цитоплазмы в наружную среду. Са-дефицит, разевающийся вследствие Са2+/Н+ обмена, не приводит к клеточным взрывам.

2). Взрыв клеток 1Ше11а з. сопровождается выбросом Са2+ в цитозоль [3 внутренних депо, при этом [Сац2+] превышает Ю-5 М. Временный рост Сац2+] способствует коагуляции цитоплазмы, формированию пробки и заучиванию раны. После первых взрывов гомеостаз [Сац2+3 восстанавливается и жизнеспособность сохраняется. Серия взрывов приводит к потере >ункциональных элементов клетки, повреждению цитоплазматических орга-[елл и нарушению гомеостаза [Сац2+], что приводит клетку к гибели.

3). Взрывы молодых клеток Ni.tel.la з. в условиях Са'2+/Ыа+(К+) обмена гроисходят, когда общее содержание кальция в КС становится на порядок 1иже емкости катионного обмена стенки (ЕКО). Причиной взрыва является )ост радиуса поры КС до критического значения, зависящего от тургора, три котором нарушается механическая устойчивость ПМ.

4). Прекратившие рост клетки ИзЛеПа и корневые волоски Тпапеа дольше сохраняют жизнеспособность в условиях Са-дефицита, сопряженного : Са^/Ма+(К+) обменом, и погибают без взрывов, постепенно теряя тур-лор вследствие роста неспецифической проницаемости ПМ.

Практическая ценность. Проведенные эксперименты в сочетании с литературными данными позволяют утверждать, что клеточные взрывы являются эдним из механизмов повреждения растительных клеток, в определенном смысле, альтернативным развитию неспецифической проницаемости ПМ. В эстественных условиях клеточный взрыв у растений может быть результатом совокупности причин, включая микробную и грибную инфекцию, механические нагрузки и ранения. В условиях относительного Са-дефицита, возникающего при интенсивном земледелии, а также на засоленных почвах, реализации клеточных взрывов способствует физическое разрыхление структуры КС, возникающее вследствие Са2+/Ыа+(К+) обмена. Выявление КС в качестве мишени повреждающего действия Са-дефицита существенно для выбора способа защиты растения и прогнозирования устойчивости разных видов растений, отличающихся свойствами КС и их способностью к адаптации. Представления о взрывах растительных клеток могут быть использованы при направленном поиске устойчивых сортов сельскохозяйственных

растений и при разработке экспресс-методов оценки устойчивости, бази-

i

рующхся на сравнительном анализе свойств их КС.

Апробация работы Основные результаты работы доложены на II съезд« ВОФР (Минск, 1989), на III съезде ВОФР (С-Петербург, 1993); на Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт и регуляция функций клетки"(Ленинград, 1990); на совещании "Мембранный транспорт и функции клетки" (С-Пе-тербург, 1994); на 4-ом и 5-ом международных симпозиумах "Structun and function of roots"(Bratislava, 1993, 1998); на 9-ом конгрессе Европейского общества физиологов растений (FESPP) (Brno, 1994).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации . Диссертация состоит из введения, i глав, заключения, выводов и списка литературы. Расчеты вынесены в приложения. Работа изложена на 199. страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 147 источнико:

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследования служили клетки междоузлий харово: водоросли Nitella syncarpa, а .также их "тени", полученные из клето путем замещения мягко выдавленного протопласта на непроникающий чере КС раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ мол.м.20000, 200 мг/л) (Лялин и др. 1994). Гигантское междоузлие . Nitella традиционно используется в ка честве модели фотосинтезирующей клетки высших растений и достаточн хорошо изучено, чтобы по изменению электрических параметров мембран скорости циклоза судить о нарушениях ионного гомеостаза клетки и об суждать их причины и следствия. Катионообменные свойства КС харовы водорослей близки к свойствам КС двудольных растений, как по величин ЕКО, так и по величине констант диссоциации Ca (Кса) и Н (Кн) из фаг КС. Корневые волоски высшего водного растения Trianea bogatensis выС раны в качестве вспомогательного объекта для сравнения путей повреждб ния клеток водоросли и высшего растения в условиях Са-дефицита.

Контрольным раствором служила аквариумная вода, либо искусственна прудовая вода (ИПВ) состава: 0,1 мм KCl; 0,1 mi*i СаС12; 1,0 мМ NaCI Десорбция ионов Са2+ с клеточной поверхности достигалась двумя путям! экспозицией клеток в децимолярных растворах солей KCl или NaCI, hj воздействием комплексообразователя МагЭДТА (динатриевой соли этиленд! аминтетрауксусной кислоты), который применялся в виде водных раствор! или в составе Са-ЭДТА буферов, рассчитанных по Portzehl et al. (1964;

Скорость циклоза измеряли, наблюдая за движением сферосом в цитоз< ле, с помощью светового микроскопа с окуляр-микрометром и секундомер;

Установка для электрофизиологических исследований создана в АФИ

лногократно использовалась в исследованиях возбудимых ионных каналов Ше11а, выполненных под руководством Г.А.Волкова при участии автора диссертации (Волков, Платонова, Скобелева, 1974; Волков, Платонова, Скобелева, 1982). В опытах регистрировали напряжение на ПМ и Т и /дельное сопротивление обеих мембран, используя прямоугольные биполярные импульсы тока. Удельное сопротивление каждой мембраны рассчитывали по закону Ома как отношение амплитуд импульсов напряжения и плотности гока. Положение микроэлектродов, введенных в вакуоль и цитоплазму N1-Ье11а э., контролировали по относительной величине сопротивлений ПМ и Г и типичной для каждой мембраны форме потенциала действия (ПД).

.Установка для регистрации динамики линейных размеров растительных объектов создана Г.А.Маричевым в лаборатории фитомониторинга АФИ и использовалась ранее б работах, выполненных под руководством О.О.Лялина (Лялин я др., 1994). Основным элементом установки является индукционный датчик малых перемещений, подвижный элемент которого при регистрации диаметра цилиндрической клетки опирался на клетку, лежащую в кювете. При регистрации изменений длины клетка вертикально крепилась одним концом ко дну кюветы, другим - к плечу уравновешенного коромысла, а датчик, опирался на коромысло в месте крепления клетки.

Все опыты выполнены с 5-10 - кратной биологической повторностью, на рисунках приведены типичные примеры экспериментальных записей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ВИЗУАЛЬНЫХ НАБЛЮДЕНИЙ ЗА ОБЪЕКТАМИ.

Визуальные наблюдения показали, что в условиях Са-дефицита прежде всего погибают молодые клетки N^611а б. и Тг1апеа Ь., претерпевая клеточные взрывы. Клетки, прекратившие рост, дольше сохраняют жизнеспособность и погибают без взрывов, постепенно замедляя циклоз и теряя тургор. Последний тип повреждения может быть связан с развитием неспецифической проницаемости ПМ, и ему уделено достаточное внимание в литературе. Клеточные взрывы на живой метаболизирующей клетке наблюдались впервые, поэтому нас прежде всего интересовала их феноменология и условия их возникновения, которые изучались на молодых клетках.

Клетки междоузлия Ш1е11а з. реагируют на погружение в водные растворы ЭДТА временной остановкой циклоза с последующим его восстановлением, которое обязательно предшествует первому клеточному взрыву. Если клетка не закреплена в кювете, взрыву сопутствуют ярко выраженные реактивные движения. Если взрыв происходит в сторону узла, то клетка отскакивает в противоположную сторону; если взрыв происходит на середине цилиндрической клетки, то перед взрывом клетка изгибается и "выстреливает" комочком цитоплазмы в зоне максимальной кривизны. На

рис. la показаны последствия первого клеточного взрыва междоузлия N1-tella: внутри клетки видна светлая зона, обедненная хлоропластами, выброшенными вовне гидродинамическим толчком, снаружи - комок коагулировавшей цитоплазмы, первоначально окрашенный за счет хлорофилла в зеленый цвет. В результате взрыва нормальное ротационное движение цитоплазмы, свойственное интактным клеткам, нарушается: в момент выброса поток цитоплазматических включений устремлен к пробоине, затем цитоплазма становится неподвижной и формируется пробка. Если молодая клетка Nitella остается в растворе ЭДТА, то можно наблюдать до десятка выбросов цитоплазмы на разных ее участках, каждому из которых предшествует локальное восстановление циклоза в зоне будущего взрыва.

Гибель в результате серии взрывов регистрируется по необратимой остановке циклоза и последующему через 0-30 мин. плазмолизу. Если после одного из первых взрывов клетку перенести в контрольный раствор, возможно сохранение жизнеспособности, что подтверждается восстановлением ротационного движения цитоплазмы с нормальной скоростью ( 30- 50 мкм/сек, в зависимости от сезона).

Феноменология взрывов молодых корневых волосков Trianea Ь. отличается только тем, что взрывы происходят исключительно в полусферической зоне апекса, что, по-види-Рис.1а - фрагмент клетки Nitella мому, связано с верхушечным типом через 30 с. после взрыва; роста волосков и рыхлой структурой

б - корневые волоски Trianea че- стенки в этой зоне (рис.16). рез 5 мин. после первого взрыва. При экспозиции клеток в раство-

Раствор - 5 мМ ЭДТА, рН 7,1. pax МагЭДТА следует ожидать, что в

КС, представляющей собой катионо-обменник, происходит Ca2+/Na+ обмен. Мы предположили, что взрыв происходит, когда в процессе Ca2+/Na+ обмена в КС общее содержание Са в ней (Саксобщ) падает ниже критического уровня (Саксобщ) и попытались оценить этот уровень количественно. В водных растворах ЭДТА взрывы молодых клеток Nitella регистрировались при [ЭДТА] >/ 0,5 мМ и не наблюдались при [ЭДТА] \< 0,1 мМ. Для уточнения граничных для развития взры-

- а -

ов условий среды были поставлены опыты в Са-ЭДТА буферах, позволяющих онтролировать концентрацию ионизованного кальция в среде [Сао2+]. Со-ержание общего и ионизованного кальция в КС (Сакс2+) рассчитывали по одели Sentenag-Gringion (1981), учитывающей доннановское распределе-ие свободных ионов между стенкой и раствором, и связывание Н+ и Са2+ карбоксильными группами стенки. Значения параметров КС Nitella при-имали согласно литературным данным: ЕКО = 800 мг-экв/л (Dainty et 1., 1960); КН = 10"3 М (Demarty et al.,1984); КСа = 2-10 ~2 М (расчет втора по данным Dainty, Норе (1961)).

Таблица 1. Расчет содержания Ca в КО Hitella в равновесии со средой.

Компоненты раствора Компоненты КС

Название Саобщ ЭДТА Са2+ Na+A~ Саксобщ Сакс2+

раствора ММ мМ М мМ Z ЕКО мМ

ИПВ 0,1 - 10~4 1,0 98,2 72

Водные растворы ЭДТА:

Э, 1мМ ЭДТА 0,01 0,1 3,6"10"9 0,29 32,4 9,7

0,5мМ ЭДТА 0,01 0,5 6,6 10 1,45 0,9 0,2

1,0мМ ЭДТА 0,01 1,0 3,3-ю-10 2,9 0,1 0,02

1,0мМ ЭДТА + 20мМ PIPES 0,01 1,0 з,з-ю-10 37,0 10~3 10"4

20,0мМ ЭДТА 0,01 20,0 1,6-кг11 58,0 10"5 10~б

0,08 U NaCl (КС1) 0,01 - 10~5 80,0 4,6 0,9

Са-ЭДТА буферы: 2-Ю-7

2"10_7М Са2+± 5мМ PIPES 1 1,16 10,0 5,6 1

5-10~7М Са2++ 5мМ PIPES 1 1,06 5-Ю-7 10,0 11,5 2,5

2-10~7М Са2++50мМ PIPES 1 1,161 2-Ю""7 60,0 0,2 0,03

Примечания: PIPES - Piperazine-N.N'-bis-[2-ethanesulfonic acid]; A~-одновалентный анион: Cl~, либо PIPES"; у всех растворов pH = 7,1.

Две серии опытов, выполненных на молодых клетках Nitella s. весной осенью (табл.2), показали, что критическим для появления клеточных

зрывов является снижение [Сао2+] от 5-10_7М до 2'10-7М (в присутствии

Э-2 М Na+ и при рН 7,1). Соответствующие расчеты ( табл.1 ) показали,

то Саксоб1Д " (11,5 - 5,6) % ЕКО. Учитывая приблизительность расчета,

ожно говорить о том, что для взрыва молодой клетки Nitella s. необхо-

имо снижение Саксобщ на порядок по сравнению с нормой, когда ЕКО

рактически полностью заполнена кальцием.

Расчет показал, что к моменту взрыва примембранная концентрация

кальция [Сакс 1 снижается до 2,5-1 мМ, оставаясь существенно выше известных по литературе значений [Сао2+1 = 10-300 мкМ, при которых возможна гибель вследствие развития неспецифической проницаемости Ш (Cheung et al.. 1992; Crevey et al, 1977; Bihler, Chandrabaer, 1977). Этого и следовало ожидать, поскольку сохранение барьерных свойств ПМ и поддержание тургора составляют необходимое условие клеточного взрыва.

Опыты с молодыми клетками Nitella s. показали, что взрыв можно вызвать экспозицией (> 10 мин.) в "децимолярных" растворах NaCl или КС1 (0,03 М -• 0,13 М), при условии последующего возвращения клетки в контрольный раствор, где после восстановления тургора и развиваются взрывы. Развитие взрывов соответствует предсказанию теории, т.к. для этих растворов расчет по выбранной модели дает значение Саксобщ < 5 Z.

Наши опыты показали, что время ожидания первого взрыва на клетках Nitella (t0) зависит от состава раствора и скорости его протока, от наличия буфера, и от физиологического состояния клетки. Последнее зависит от сезона и от степени зрелости клетки, которая увеличивается с порядковым номером (п) от верхушки побега. В опытах на молодых клетка> Nitella (табл.2) t0 менялось от 9 секунд (20 мМ ЭДТА, проток) до 3 суток (Са-ЭДТА буфер: 2'10~7М Са2+,10_2М Na2+; без протока).

Время ожидания взрыва можно оценить теоретически, полагая, что онс совпадает с временем достижения критического уровня Са в стенке. Mi провели соответствующий расчет, предполагая, что процесс ионного обмена контролируется диффузией кальция в формах Са2+ и Са-ЭДТА2" в наружном неперемешиваемом слое (НС). Изменениями [Na+] и рН в НС пренебрегали, что допустимо при достаточной буферной емкости среды и соответственно, высоком содержании CNa+] (см.табл.1). Использовали известну* формулу, связывающую стационарный диффузионный поток вещества в цилиндрическом НС со скачком его концентрации в НС (Кокотов, Пасечник 1970, С.217). Связь между концентрацией Са2+на внутренней границе НС : Сакс064 устанавливали согласно модели Sentenac-Grignon. Строили графи; зависимости обратной величины Са-потока от Саксобщ. по которому пуге: численного интегрирования определяли время снижения Саксовщ до значе ний 11,5-5,6% ЕКО. Результаты, представленные в табл.2, показывают что используемая модель позволяет объяснить изменение t0 в диапазон от секунд до часов, но не суток, как в весенних опытах в Са-ЭДТА буфе ре, содержащем 2-10~7М Са2+. В последнем случае расхождение опыта расчета можно объяснить отсутствием буфера в среде и высокой сезонно активностью Н+-помпы, что может привести к закислению в НС и снижени концентрации заряженных форм ЭДТА, с которыми связывается Са2+. Бы проведен дополнительный расчет в предположении, что закисление в Н

- И -

Таблица 2. Время ожлдашга взрива клеток Nitella (опыт и расчет).

Название раствора Время ожидания взрыва

без протока на протоке

опыт расчет опыт расчет

D,1 М NaCl(KCl) >/ 10 мин. 8-18 мин. >/ 2 мин. 2-5 мин.

Зодные растворы ЭДТА:

20,0 мМ ЭДТА 0,5-3,5 мин. 0,5 мин. 9 с.-1 мин. 7 с.

1 мМ ЭДТА >/ 20 мин. 13-14 мин. 3-5 мин. 3-4 мин.

1мМ ЭДТА + 20мМ PIPES >/2 мин. 4-5 мин. - -

За-ЭДТА буферы:

2-10"7М Са2++50мМ PIPES 10-30 мин. 11-14 мин. - -

2110~7М Са2+ (весна) 1-3 суток >/14-72 ч.* - -

" - " (осень) < 4 ч. >/1 ч. - -

5-10~7М Са2+ оо со — со

примечания. Опыты выполнены с 5-10 биологической повторностью на мо-аодых клетках Nitella (п < 3) в мае и сентябре. Скорость протока -3 см/сек. При расчете принято: толщина НС в отсутствие протока: LHc= 1 мм (Grignon, Sentenac, 1991), на протоке: 1 нс= 0,1 мм; голщина КС - 5 мкм (Green,1958). * - расчет для рН(Гкл) = 6.0.

эиводит к снижению рН(гКл) до значения 6,0. Показано, что время дос-якения критического уровня Сакс06щ в этих условиях может достигать -х суток (расчет для приближения к равновесию с точностью 0,5%). Пройденный анализ позволяет заключить, что условиях Са2+/Ма+(К+) обмена эемя ожидания первого взрыва молодых клеток ЫИе11а определяется вре-гнем достижения критического уровня кальция в стенке и зависит от ус-эвий диффузии кальция в наружном неперемешиваемом слое.

ч<>чч1 п»тчгтп**т|*п»птт|тгтя№ ттпчтттоп IтЛ г/*гтпг/ иттг! I к ГСОЛ.'ШхАхм <ию\1 гтпашшлпишша ишхдимллп нисил

Электрофизиологические опыты показали, что первичной реакцией кле-ж ЫИеПа б. на экспозицию в опытных растворах, является генерация эрии ПД (рис.2а,б). Это предсказуемое событие, т.к. известно, что де-эрбция Са2+ с поверхности ПМ приводит к сдвигу порога активации воз-/димых каналов (Ходоров, 1975, С.362), в данном случае - потенци-1-зависимых Са2+- каналов ИМ. Возбуждение ПМ в клетках харовых водо-эслей сопряжено с возбуждением Т, который также содержит Са2+- кана-II. В результате, Са2+ входит в цитозоль как из внешней среды, так и з вакуоли, и [Са2+Ц] повышается до уровня ~ 10~5М, что приводит к ак-

{иМЭДТА

ыау*«^

? I !

¿зры£

■аглхлг №

| I ( «и.чл.»

-S0 ~<го

WV^ г

VT,«B о

-го -40 -ео

а

V

2нин.

7" джстяаожязазжяае; па 3 Змк4/tu *

Ут»В

-m

-iùO -го -м -1/0 -го

V -w

-го

¿ООмММггСС

п

го мин.

ипв

к

,мВ

6)рыВ|

плазмолиз

Рис.2. Динамика электрических параметров плазмалеммы и тонопласта Nitel1а в процессе развития Са-дефицита. УП(т) - напряжение на плазмалемме (тоно-пласте); I - ток; С - циклоз: светлые зоны - нормальный, штриховка - медленный, темные - нет циклоза; стрелки - период гидродинамических толчков при взрывах.

тивации Са2+-зависимых С1~-каналов на обеих мембранах (Ьипеузку et а1., 1983) и остановке движения цитоплазмы (Тошепада et а1.,1985). Последующая инактивация Са2+- каналов и откачка Са из цитоплазмы системами [Сац2+]- гомеос-таза приводит к восстановлению [Са2+Ц] ка уровне -10_7М и закрыванию С1~-каналов. Возобновление циклоза отстает от восстановления [Са2+Ц] на 1-2 минуты (Тошепа§а et а1., 1985), поэтому циклоз не возобновляется в паузах между ПД.

Из рис.2 а,б видно, как амплитуда ПД на обеих мембранах постепенно уменьшается. Динамика электрических ответов мембран связана с истощением примемб-ранного кальция, и соответствующей перестройкой структуры плазмалеммы. Последовательность событий при этом такова: прекращение входа Са2+ снаружи через возбудимые каналы, потеря возбудимости и переход ПМ в высокопроводящее состояние близкое по сопротивлению к состояния возбуждения (р~ 1ком-см2). Состояние тонопласта пере; клеточным взрывом ш электрическим характерно-

с

гикам не отличается от интактного, что, так же как возобновление движения цитоплазмы, свидетельствует о восстановлении гомеостаза [Сац2+].

Клеточный взрыв регистрируется как скачок напряжения на обеих клеточных мембранах с деполяризацией ПМ и гиперполяризацией Т (рис.2а). Здновременно исчезают ступенчатые отклики мембранного напряжения на фопускаемые импульсы тока, что говорит о спаде электрического сопротивления обеих мембран ниже 0,1 ком-см2. Уровень гиперполяризации Т :юсле взрыва во всех опытах лежит в пределах -50 -г- -70 мВ (п = 20). пиперполяризация Т при клеточном взрыве указывает на активацию Са2+-зависимых С1~-каналов, которые имеют равновесный потенциал на Т от -40 цо -70 мВ (Ьипеуэку еЬ а1., 1983). Поскольку ионы Са2+ осуществляют' эдинственный известный способ управления данными каналами, можно рассматривать наблюдаемую электрическую реакцию как указание на рост концентрации Сац2+ при клеточном взрыве. Та же причина могла привести и к остановке движения цитоплазмы после взрыва ( Тотег^а е! а1., 1985). Эгметим, что активация С1~-каналов на Т и остановка циклоза требуют повышения концентрации Са1(2+ до уровня ~ 10~5М (Тошепа^а еЬ а1., 1985; ЗЬПпа, Тагана, 1988; Ьипеувку еЬ а1., 1983).

На рис.26, иллюстрирующем опыты в децимолярных растворах МаС1, электрические ответы обеих мембран при клеточном взрыве скорее напоминают ПД, хотя после второго пика ПД наблюдается длительная (~10 мин.) гиперполяризация Т. Наши наблюдения показывают, что характер электрического ответа зависит от того, происходит ли клеточный взрыв на том участке мембраны, с которого снимаются электрические характеристики (зона центрального отсека кюветы), или вне его. Рис.2а соответствует взрыву в зоне электрических измерений, рис.26 - взрыву вне зоны измерений. В последнем случае мы действительно регистрируем ПД, распространяющийся от места взрыва, а затем нарастающие нарушения ионного гомеостаза, постепенно захватывающие всю клетку.

Если после первых выбросов цитоплазмы молодую клетку перенести в контрольный раствор, возможно сохранение жизнеспособности, о чем свидетельствует восстановление возбудимости ПМ (через 20 мин.), возобновление циклоза (через 30 мин.), восстановление сопротивления покоя и потенциала покоя обеих мембран (2-3 ч.). Если клетку оставить в растворе ОДТА до окончания серии клеточных взрывов, то перенос в ИПВ не приводит к восстановлению жизнеспособности. Напротив, через 10 мин. регистрируется дальнейший спад сопротивления Г, сопровождающийся его деполяризацией, так что клеточной гибели сопутствует переход обеих мембран в высокопроводящее состояние с низким потенциалом.

РЕЗУЛЬТАТЫ РЕГИСТРАЦИИ

% t? ! /т н/h I

Oft $+5**tS

Врепя,мин.

h.NKH

sso г

I | 3,0

iSOtiMKCC ¿ода

зоа

290

_Цг tfl—J-1

t г з " ~ to п и а ¡1 is tr и и го и гг гз Время, nuh.

АР, шмншсе

кн к Па |

ЛИНЕЙНЫХ РАЗМЕРОВ И ГУРГОРА КЛЕТОК ШТЕИА

В предварительных калибровочных опытах регистрировали реакции клеток на изменение осмотического давления наружной среды, которое варьировали с помощью сахарозы. Для дальнейшего существенно, что кинетика набухания клеток при малых изменениях тургора была близка к экспоненциальной и характеризовалась полупериодом 1*1/2 = = 1-2 с., что соответствует литературным данным, полученным с помощью тургорных датчиков (БЬеис}-1е,1989). Целью калибровки было получить шкалу изменений тургора, соответствующую шкале изменений линейных размеров клетки. Клеточные взрывы регистрируются как пульсации толщины (длины) клетки, по которым в соответствии с калибровкой можно оценить пульсации тургорного давления ДР (рис.За-к).

f,SB

fQsHs

6

k

¿ода

■O.S

0,гмПа Вода

в i и ts /? и Ii to Время, ним.

m ш

Рис.3. Динамика линейных размеров и тургорного давления (Р) клеток Nitella при клеточных взрывах: а - в растворе ЭДТА, б - после экспозиции в KCl, в - после экспозиции в NaCl. На вставке к рис За: теоретическая кривая динамики объема (V) липидной везикулы при осмотическом лизисе (Козлов, Маркин,1984). h - толщина, 1 - длина клетки.

Крутой передний фронт каждого импульса соответствует выбросу цитоплазмы, вершина импульса - формированию пробки, которое происходит за доли секунды, прежде чем тургор спадает до нуля. Затем'тургор-восстанавливается, причем для первых импульсов тургора малой амплитуды наб-

людается экспоненциальная кинетика набухания с полупериодом twi/2 = - 1-2 с., свойственным интактным клеткам. Причиной входа воды после взрыва является сброс тургорного давления после выброса порции цитоплазмы, тогда как осмотическое давление в этот момент неизменно и незначительно снижается в дальнейшем в результате входа воды. Поскольку объем первых выбросов цитоплазмы составляет около 5Z объема клетки, гургор восстанавливается почти полностью. К концу серии взрывов фаза набухания становится все более длительной, и серия заканчивается восстановлением тургора до уровня Р = 0,05-0,3 Ша, который может поддерживаться до 30 мин. Затем происходит плавное уменьшение тургора вплоть до нуля, отражающее процесс клеточной гибели.

Рис.3 б,в показывает, что введение децимолярного раствора соли вызывало осмотическое сокращение диаметра и длины клетки, а возврат к аквариумной воде сопровождался восстановлением тургора и клеточными взрывами, которые регистрировались через 5с,- 20 мин. после смены раствора соли на воду. Зрелые клетки в подобных опытах не взрывались, несмотря на увеличение времени экспозиции в растворе соли до часов. Используя датчик малых перемещений, мы убедились, что замещение в фазе стенки ионов Са2+ на Мд2+ или Н+ не приводит к клеточным взрывам. В растворах соляной кислоты (рН 3) клетка постепенно замедляла вдклоз и теряла тургор, погибая без признаков клеточных взрывов.

Регистрируя толщину клеток Nitella, различающихся порядковым номером от верхушки побега, мы убедились, что остановка роста сопровождается сменой типа клеточной гибели в условиях Са-дефицита.

700-, .

| {0мMЗДТА

foo-

300*

я'S

п*б

л

I

9о ira

Время, мин.

¿Я1

/sa

П'З

Рис.4. Смена типа гибели в условиях Са-дефицита у клеток ШЬеПа после остановки роста. Ь - толщина клетки, п - порядковый номер от верхушки.

60

¿ОмМЭДТД

ПЗГ /л, ПЭГ* нее

jr\ | HCW

SSCh

Z 3

Время; мин.

30

Рис.5. Регистрация толщины "тени" КШеПа (И) в условиях Са-дефицита: а - Са2+/Ма+ обмен в КС, б - Са2+/Н+ обмен в КС.

Анализируя физическую природу клеточных взрывов с точки зрения теории мембранного лизиса (см. Обсуждение), мы пришли к заключению, что причиной клеточного взрыва может быть увеличение размера водной поры КС выше некоторого критического значения. Чтобы подтвердить такую возможность в условиях Ca2+/Na+ обмена в КС , мы поставили опыты на клеточных тенях. В воде клеточные тени, заполненные ПЭГ мол.м.20000, сохраняют тургор в течение недель. Опыт, представленный на рис.5 , демонстрирует потерю тургора клеточной тенью в растворе ЭДТА и поддержание тургора в растворе HCl, pH 2,5. Потеря тургора тенью указывает на рост проницаемости КС к ПЭГ и подтверждает, что размер пор КС Nitella увеличивается в результате Ca2+/Na+, но не Са2+/Н+ обмена.

ОБСУЖДЕНИЕ

Физическая природа взрывов растительных клеток

Обычно считается, что в клетках растений тургорное давление прижимает ГОЛ к КС, причем последняя рассматривается как однородная оболочка, несущая нагрузку (Нобел,1973,С.39). В действительности КС пронизана множеством водных пор, и физические взаимодействия в системе ПМ-КС можно детализировать, используя теоретический подход, предложенный в работе Козлова и Маркина (1984). Мы полагаем, что ПМ в зоне водной поры КС растягивается и изгибается под действием тургорного давления подобно мембране везикулы, набухающей в гипотоническом растворе (рис.6). Допустим, что контур водной поры КС является окружностью радиуса г. Тогда участок ПМ в зоне поры представится частью сферической поверхности радиуса Я ( И > г ), и к нему, как и к мембране липидной везикулы, применима формула (Козлов, Маркин,1984):

цитогшазпа

Р = 26/R (1)

где б - натяжение ПМ, Р - тургорное давление. Теория предсказывает, что если натяжение мембраны превысит значение бл, называемое натяжением лизиса, то в мембране сформируется водная пора с начальным диаметром > 50 Ä, через которую произойдет гидродинамический выброс содержимого везикулы (Козлов, Маркин, 1984). Наблюдая этот процесс на растительных клетках, мы сохраняем за ним термин "клеточный взрыв", предложенный Simon (1978), хотя в сущности, это лизис, вызванный не сдвигом тоничности среды, как при осмотическом лизисе животных клеток и везикул, а изменением устойчивости системы ГОЛ-КС. Из формулы (1) видно, что при данном тургоре натяжение (б) тем меньше, чем меньше локальный радиус кривизны ПМ (R) в зоне поры. Радиус R ограничен снизу радиусом поры г, поэтому можно утверждать, что чем меньше размер водных пор КС, тем юльшее тургорное давление Р может выдержать клетка. Наши опыты на слеточных тенях показали, что размер водных пор КС увеличивается в ре-¡ультате Ca2+/Na+ обмена в фазе КС (рис.5а). Логично предположить, что неточный взрыв происходит, когда радиус одной из водных пор КС дости-'ает критического значения г, при котором становится возможным лизис Ы. Теория мембранного лизиса позволяет рассчитать зависимость Т от ?ургорного давления Р, которая представлена графически на рис.66. Рас-[ет устанавливает теоретический верхний предел диаметра водной поры в >20-920 А для тургорных давлений, соответственно, от 0,8 до 0,1 МПа. 'аким образом, теория мембранного лизиса предсказывает взрыв расти-?ельной клетки, когда в ее КС появляется пора диаметром на порядок иэлыпе среднего диаметра пор, который для клеток Nitella, так же как и 1ля клеток высших растений (Carpita et al.,1979), не превышает 50 А.

Увеличение размера водных пор КС может происходить как за счет ее ¡абухания, так и вследствие ее дополнительного растяжения, вызванного

Рис.6. Физическая модель юстояния плазмалеммы в зоне ¡одной поры клеточной стенки. I - схематическая геометрия :истемы и действующие силы. ) - натяжение ПМ, г - радиус кривизны гаи, ~ - радиус поры стенки. ) - теоретическая зависимость сритического радиуса поры (г) )т тургорного давления.

"разрыхлением структуры". Действительно, если рассматривать КС как ка-тионообменник с поперечными сшивками, то становится ясно, что Са2+/№+(К+) обмен в фазе КС должен привести к некоторому набуханию КС (Либинсон,1969, С.62). Движущей силой набухания является рост осмотического давления в фазе КС при замене двухвалентных катионов Са2+ на эквивалентное по заряду число одновалентных катионов Иа+(К+). Рост осмотического давления связан и с тем обстоятельством, что Са присутствует в КС как в свободной, так и в связанной форме, тогда как №(К) можно считать полностью свободным (БегЛепас, 6г1^поп, 1981). Таким образом, Са2+/Ма+(К+) обмен в фазе КС приводит к ослаблен™ взаимодействий между полимерами КС не только за счет исчезновения Са2+-мостиков, но и вследствие набухания матрикса. При этом можно ожидать изменения механических свойств КС , и поскольку КС натянута под действием тур-горного давления - дополнительного ее растяжения. Изгиб клетки перед взрывом указывает на увеличение растяжимости КС, которое неоднородно. Клеточный взрыв всегда происходит на участке максимального растяжения КС, где, по-видимому, и достигается критическое значение диаметра водной поры.

Отсутствие взрывов при десорбции Са2+в обмен на Н+ можно объяснить с тех же позиций, поскольку нейтрализация фиксированных отрицательных зарядов в фазе КС при их протонировании снижает энергию "расталкивания" карбоксильных групп. Одновременно снижается осмотическое давление в фазе КС, что приводит к уменьшению ее оводнения.

Режим лизиса растительной клетки в условиях десорбции наружного Са2+ подобен пульсирующему режиму лизиса везикул, предсказанному теоретически в работе Козлова, Маркина (1984) (рис.За, вставка). Отличие состоит в разбросе амплитуд импульсов и интервалов времени между ним* в серии клеточных взрывов. По-видимому,это следствие неоднородности I структуре стенки и элемента случайности при формировании пробок. Такго образом, можно утверждать единство физической природы осмотическоп лизиса животных клеток и клеточных взрывов растений: в обоих случая; клетки повреждаются вследствие механического разрыва мембраны.

Восстановительные процессы после одиночного клеточного взрыва.

Хотя конкретные реакции заживления ран у клеток растений, принадле жащих разным видам, требуют дальнейшего изучения, эти реакции можн разделить на неспецифические и специфические, причем для тех и други существенным условием оказывается обнаруженный нами рост [Сац2+].

Мы полагаем, что неспецифический защитный эффект выброса Са2+ в иу топлазму реализуется благодаря переходу цитоплазмы в состояние геля

По нашим наблюдениям, клеточному взрыву непременно предшествует возвращение цитоплазмы в состояние золя. Гель можно рассматривать как твердообразную структуру, обладающую упругостью (Фридрихсберг, 1984, C.2G8-269). При переходе золь-гель в цитоплазме гидростатическое давление вакуоли оказывается приложенным к трехслойной системе: цито-гель-плазмалемма-клеточная стенка. Логично предположить, что при этом механическая нагрузка перераспределяется и натяжение ПМ в зоне водных пор стенки оказывается меньше, чем в интактной клетке.

Можно полагать, что все растения в той или иной мере обладают возможностями репарации ПМ и КС после клеточного взрыва, которая может происходить так же, как после ранения, нанесенного иглой. Последнее изучалось в опытах на харовых водорослях (Foissner,1987) и высших растениях (Russo,Bushnell,1989). Показано, что у высших растений основным компонентом раневой пробки является каллоза, синтезируемая Са2+-зави-симой 1,3 е-глюкансинтетазой. У харовых водорослей раневая пробка состоит, главным образом, из везикул с полисахаридным материалом, которые запасены в вакуоли и, по-видимому, специально предназначены, чтобы! быстро закрыть брешь, к которой они увлекаются гидродинамическим потоком. И в этой ситуации рост ССац2+] необходим для слипания (образопа-1 ния непроницаемого контакта) везикул и краев разорванной ПМ и КС. Авторы упомянутых работ предполагали, что Са2+ входит в клетку снаружи через поврежденный участок, что практически невозможно в момент выброса цитоплазмы, и следовательно, не может быть причиной коагуляции цитоплазмы и образования пробки. Наши опыты показывают, что возможен выброс Са2+ из внутренних депо. Действительно, вход Са2+ извне при клеточных взрывах в условиях Са-дефицита представляется маловероятным, т.к. входящие Са2+- токи через возбудимые каналы прекращаются незадолго до взрыва (рис.2), что свидетельствует об истощении Са2+ в фазе КС. Рост ССац2+], регистрируемый по гиперполяризации Т , происходит одновременно со сбросом напряжения и сопротивления ПМ, свидетельствующими о ее разрыве, т.е. в те доли секунды, когда происходит выброс цитоплазмы, я диффузионный вход Са2+ через рану можно исключить. Причиной выброса Са2+ из депо при взрыве может быть механический стресс мембран при резком сбросе давления в цитозоле. Так, выброс Са2+ из вакуоли Nitella может происходить одновременно с выбросом везикул. Взрывы корневых волосков Trianea также сопровождались остановкой циклоза, что указывает на рост ССац2+]. Таким образом, есть основания полагать, что выброс Са2+из депо при клеточном взрыве не составляет особенности возбудимых клеток, и его можно рассматривать как защитную реакцию, способствующую залечиванию раны, благодаря чему клетка сохраняет жизнес-

пособность после нескольких взрывов при условии устранения их причины.

Клеточная гибель после серии взрывов.

Наши опыты показали, что клетка погибает в результате серии клеточных взрывов. Каждый взрыв сопровождается формированием пробки и восстановлением движения цитоплазмы, кроме последнего взрыва, когда цикло: более не возобновляется. При каждом взрыве клетка выбрасывает наруж; часть своих органелл и функциональных единиц - ферментов, элементо: цитоскелета и др.. Оставшиеся органеллы могут повреждаться в результа те гидродинамического стресса. Это, в первую очередь, должно привест к нарушению энергопродукции и осложнить восстановление гомеостаз 1Сац2+] после каждого следующего взрыва. Для животных клеток показано что длительное превышение уровня [Сац2+]~ 10_5М вызывает нарушени транспорта и метаболизма, активацию фосфолипаз, нарушения компартмен тализации и, в итоге, некроз (Campbell, Luzio, 1981; Farber, 1982). Н растительных клетках до сих пор не описана конкретная ситуация, в ко торой нарушение гомеостаза [Сац2+] вело бы к клеточной гибели. Однако алементы, чувствительные к повреждающему действию высоких концентраци [Сац2+], присутствуют как в животных, так и в растительных клетках Это дает основания некоторым авторам справедливо полагать, что в слу чаях, когда следует ожидать нарушения гомеостаза [Сац2+], в частности при холодовом стрессе растений, рост ГСац2+] может быть непосредствен ной причиной клеточной гибели (Minorsky,1985). В качестве первичнь реакций рассматриваются ингибирование ферментов цикла Кальвина, акта вация липаз, разрушение системы микрофиламентов. В наших опытах г окончании серии клеточных взрывов регистрируется необратимая останова циклоза, постепенное снижение напряжения и сопротивления обеих мембрг и плавная потеря тургора. Причиной может быть устойчивое нарушение гс меостаза [Са2+Ц], приводящее к активации мембранных фосфолипаз.

Альтернативные пути клеточной гибели в условиях Ca-дефицита.

Факт возникновения клеточных взрывов свидетельствует, что для моле дых клеток Nitella в условиях Ca2+/Na+(K+) обмена на поверхности ра; витие критических повреждений КС опережает развитие критических noi реждений ПМ. Анализируя немногочисленные количественные оценки, имен щиеся в литературе, мы пришли к заключению, что возможность появлеш клеточных взрывов обусловлена тем, что Ca связывается с ПМ по крайш мере на порядок прочнее, чем с КС. Действительно, согласно данныг суммированным в книге Ивкова, Берестовского (1981, С.132-134) для 1 можно ожидать Кса-Ф < 1 мМ, тогда как для КС растений Кса > Ю i

(Grignon, Sentenac, 1991). Таким образом, в условиях Са-дефицита следует ожидать, что десорбция Ca из фазы КС растительной клетки будет опережать десорбцию Ca с наружной поверхности ПМ. В этих условиях тип клеточного повреждения должен зависеть от значимости Са-мостиков для поддержания структуры КС. Для двудольных растений, так же как и харо-вых водорослей, есть основания полагать, что "Са-мостики" между полимерами являются "связями, несущими нагрузку" в КС (Virk, Cleland, 1990). Следовательно, в первую очередь, для двудольных растений есть все основания ожидать увеличения размера пор КС и клеточных взрывов в условиях Са-дефицита. Возникновением клеточных взрывов можно объяснить и появление разрывов в стенках высших растений (Simon, 1978), и факт зашиты осмотиками, обнаруженный в опытах на суспензии клеток моркови в условиях Са-дефицита (Enoch, Glinka, 1983).

Мы показали, что прекратившие рост клетки Nitella и корневых волосков Trianea дольше сохраняют жизнеспособность в условиях Са-дефицита, вызванного Ca2+/Na+(K+) обменом и погибают с плавной потерей тургора вследствие развития неспецифической проницаемости ПМ. В наших опытах впервые на растительных клетках зарегистрирована динамика электрического сопротивления ПМ в условиях Ca2+/Na+ обмена на ее поверхности. Перед клеточным взрывом сопротивление ПМ Nitella снижается до уровня, типичного для состояния возбуждения. При .этом ионный гомеостаз цитозо-ля поддерживается, о чем свидетельствует сохранение электрических параметров тонопласта и скорости циклоза. Это подтверждается и опытами с датчиками малых перемещений, которые показали, что тургор к моменту первого взрыва не снижается. Следовательно, увеличение в определенных пределах пассивных ионных потоков через ПМ компенсируется работой систем активного транспорта. Благодаря этому обстоятельству, зрелые клетки относительно долго сохраняют жизнеспособность. Однако со временем неспецифическая проницаемость ПМ нарастает, циклоз прекращается, и клетка постепенно теряет тургор, погибая без признаков клеточных взрывов. Отсутствие взрывов в зрелых клетках Nitella и Trianea можно объяснить упрочением структуры КС, которая становится менее растяжимой и способной к набуханию в условиях Ca2+/Na+(K+) обмена.

Можно предположить, что различия по типу гибели между старыми и молодыми клетками, обнаруженные как для харовой водоросли Nitella, так и для высшего водного растения Trianea, свойственны клеткам многих растений в условиях Са-дефицита. Этого следует ожидать, поскольку упрочение КС на стадии остановки роста представляет собой общее явление. С этой точки зрения удается объяснить преимущественное повреждение развивающихся меристем корней высших растений в условиях Са-дефицита.

выводы

1. Впервые в опытах на растительных клетках ( междоузлия Ы1Ъе11 эупсагра и корневые волоски Тгчапеа Ьоеа1епз1з) систематически наблю дали и исследовали новое явление: возникновение серии клеточных взры вов, приводящей к клеточной гибели. Показано, что клетка восстанавли вает жизнеспособность после единичных взрывов и сохраняет ее, есл: причина взрывов устранена. Взрывы вызываются дефицитом Са2+в клеточно: стенке, появляющимся в результате Са2+/Ыа+ и Са2+/К+ обмена при экспо зиции клеток в растворах На-соли комплексообразователя (водные раство ры ИагЭДТА и Са-ЭДТА буферы ) или децимолярных растворах МаС1 и КС1. ] этих условиях взрывы возникают, когда содержание кальция в клеточно: стенке оказывается на порядок ниже содержания одновалентных катионо: (Иа, К). Клеточные взрывы наблюдаются только у молодых растущих клето] и корневых волосков. На зрелых клетках клеточные взрывы не наблюдаются. Показано, что дефицит Са2+в клеточной стенке, появляющийся в ре зультате Са2+/Н+ обмена при экспозиции в миллимолярных растворах кислоты, не приводит к клеточным взрывам.

2. С помощью датчика малых перемещений исследована динамика тургор-ного давления и объема клеток ЫИеПа в процессе возникновения Са-дефицита и в течение всей серии клеточных взрывов вплоть до плазмолиз; клетки. Показано, что при клеточном взрыве фаза сброса тургорного давления продолжается доли секунды и завершается формированием пробки после чего тургор восстанавливается за несколько секунд. Окончание серии клеточных взрывов сопровождается необратимой остановкой движени; цитоплазмы, вслед за которой после лаг-периода длительностью до получаса развивается плазмолиз (клеточная гибель). Показано, что зрельп клетки 1Ше11а дольше сохраняют жизнеспособность в условиях Са-дефици-та, а их повреждение проявляется как монотонное уменьшение тургора связанное с развитием неспецифической проницаемости плазмалеммы, которое зарегистрировано в электрофизиологических опытах.

3. Проведены электрофизиологические исследования динамики разност) потенциалов и электрического сопротивления плазмалеммы к топопласт; ¡-слеток 'ПоеПа в процессе возникновения Са-дефицита и клеточных взрывов вплоть до клеточной гибели либо восстановления мембранных параметров и сохранения жизнеспособности при условии своевременного перенос; клетки в контрольный раствор. Показано, что возникновение Са-дефицит; в клеточной стенке возбудимых клеток ЫИеПа сопровождается спонтанно] генерацией серии потенциалов действия, в течение которой движение ци топлазмы отсутствует. Окончание фазы электрической активности сопровождается переходом плазмалеммы в высокопроводящее состояние, близко!

сопротивлению к состоянию возбуждения (менее 1 ком -см2) и восста-лением движения цитоплазмы. Из этого состояния молодые клетки N1-1а взрываются. Взрыв сопровождается сбросом сопротивления обеих бран (ниже 0,1 ком-см2), деполяризацией плазмалеммы, гиперполяляри-ией тонопласта до уровня ~ - 60 мВ и остановкой движения цитоплаз-Два последних факта удовлетворительно объясняются выбросом кальция итоплазму из внутренних депо до превышения уровня свободного цито-ьного кальция Саи2+ > 10 мкМ, при котором на клетках харовых водолей наблюдается активация Са2+-зависимых С1"-каналов тонопласта и ановка движения цитоплазмы. Временное повышение концентрации Сац2+ ает защитную роль, способствуя коагуляции цитоплазмы и формированию бки, закрывающей отверстие в двухслойной системе плазмалемма-кле-ная стенка. Неспособность клетки восстановить после серии клеточных ывов низкую концентрацию Сац2+ (-0,1 мкМ). свойственную интактным ткам, может быть одной из причин клеточной гибели.

4. Проведен анализ механизма клеточных взрывов с позиций теории ос-ического лизиса везикул (Козлов, Маркин, 1984), Клеточный взрыв никает при постоянном тургорном давлении в результате увеличения иуса водной поры стенки до некоторого критического значения, при ором нарушается механическая устойчивость мембраны. Вывод подтверж-тся опытами на тенях клеток ИНеПа, заполненных раствором полиэти-гликоля мол.м. 20000, с использованием датчика малых перемещений, азано, что Са2+/Ма+ обмен в стенке вызывает постепенное снижение гора тени вплоть до нуля, что указывает на увеличение размера вод-

пор стенки, приводящее к выходу полиэтиленгликоля из тени. Показа-что экспозиция теней в сантимолярном растворе кислоты, когда +клеточной стенки практически полностью обменивается на Н+, не при-иг к увеличению размера водных пор стенки.

5. Обосновано представление о клеточном взрыве как одном из возмож-путей повреждения и гибели тургесцентых клеток растений в природе,

заннсм с нарушением структуры клеточной стенки, несущей механичес-нагрузку. Вероятность клеточных взрывов в условиях дефицита Са личивается благодаря физическому разрыхлению структуры стенки, ко-ое может усугубляться ферментативным разрыхлением вследствие облег-ного проникновения патогенов в этих условиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скобелева О.В. Внутриклеточное гидростатическое давление, ei регуляция и роль в развитии повреждений клеточной поверхности // Цит< логия. -1990.- Т.32.- N 9.- С.948-949.

2. Скобелева О.В. Критическое состояние растительной клетки, возн! кащее в условиях десорбции кальция с ее поверхности // Тезисы докл. дов на II Делегатском съезде ВОФР, 24-27 сентября 1989 г., Минск, Т. Москва.- 1992.- С.194.

3. Скобелева О.В., Ктиторова И.Н. Альтернативные пути поврежден растительной клетки в условиях кальциевого дефицита // Тезисы доклад III съезда ВОФР. - С-Петербург. - 1993. - Т.7. - С.727.

4. Ктиторова И.Н., Скобелева О.В., Лялин 0.0. Защитные свойства г миновых веществ и некоторых фенолов при повреждении клеток, вызван* десорбцией наружного кальция // Тезисы докладов III съезда ВОФР. С-Петербург. - 1993. - Т.6. - С.633.

5. Лялин 0.0., Скобелева О.В., Ктиторова И.Н., Маричев Г.А. Осмоч чеекий лизис тургесцентных растительных клеток // Цитология. - 1995, Т.37 - N 4 - С.380-381.

6. Ktitorova I.N., Skobeleva O.V., Lyalin 0.0. The role of huí substances for the prevention of cell damage induced by calcium ■ sorption from the cell surface // Abstracts of The 4th Internatio; Congress "Structure and function of roots", Slovacia. - 1993. - P.6

7. Lyalin 0.0., Skobeleva O.V., Ktitorova I.N., Marichev G.A. possible ways of plant cell injury under salt stress conditions Biología Plantarum (Prague). - 1994. - V.36 (Suppl.). - S.243.

8. Скобелева O.B., Ктиторова И.Н., Маричев Г.А., Лялин 0.0. Локг ные разрывы тургесцентных растительных клеток, вызванные десорбг ионов Са2+ с клеточной поверхности // ДАН. - 1994. - Т.337.- N А С.555-558.

9. Скобелева О.В., Ктиторова И.Н., Лялин 0.0. Клеточный взрыв один из типов повреждения растительной клетки. I. Визуальные набли ния и электрофизиологическая регистрация клеточных взрывов в уело.' дефицита Са2+ // Физиология растений.- 1996.- Т.43.- N 4.- С.501-5:

10. Скобелева О.В., Ктиторова И.Н., Маричев Г.А., Лялин 0.0. Кле' ный взрыв как один из типов повреждения растительной клетки. II. точный взрыв с точки зрения теории мембранного лизиса // Физиол растений. - 1996. - Т.43. - N 4. - С.511-518.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Скобелева, Ольга Викторовна, Санкт-Петербург

¿//¿{р- - < ' ■ ч?

С- " ......у

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК АГРОФИЗИЧЕСКИЙ НАУЧНО-МССЖДОВАТЕЙЬСКЙМ ШСТЙТУТ

На правах рукописи

Скобелева Ольга Викторовна

КЛЕТОЧНЫЕ ВЗРЫВЫ У РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ Специальность - 08.01.14 - агрофизика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

канд. биол. 'наук Ктиторова МЛ.

доктор хим. наук Кокотов Ю.А.

Санкт-Петербург 1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

С.

7

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. РОЛЬ КАЛЫЩЯ В СТРУКТУРЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ И ШЕАЗМАЛЕММЫ РАСТЕНИЙ

1.1. Характерные повреждения тканей растений при Са-дефиците. 11

1.2. Представления о путях клеточного повреждения в условиях 13

Са.....дефицита.

1.3. Анализ возможной роли Са в формировании механических свойств стенки на разных этапах ее развития. 15

1.8.1. Динамика механических свойств стенки в процессе 15 жизнедеятельности клетки.

1.3.2. Микрофибриллярная и матриксная фазы стенки с точки зрения ее механики. Понятие о связях, несущих нагрузку. 18

1.3.3. Тины связей между полимерами клеточной стенки. Распад 20 полисахаридов матрикса и разрыхление структуры стенки.

1.3.4. Первичная стенка растягивающейся клетки. 23 Роль нековалентных взаимодействий.

1.3.5. Модель первичной стенки двудольных и возможности 25 включения в структуру ионов Са2+.

1.3.6. Экспансины - белки, контролирующие рИ-зависимую

реологию клеточной стенки. 28

1.3.7. Механизмы ужесточения клеточной стенки. 31

1.3.8. Механизм разрыхления ткани при созревании плодов. 34

1.4. Причины накопления кальция в клеточной стенке. Возможности количественных оценок. 36

1,4Л. Понятие о свободном и связанном состоянии иона в стенке. 36 Емкость катионного обмена.

1.4.2. Клеточная стенка как доннановская система: 39

информативность и ограничения физического описания. Водные поры клеточной стенки.

1.4.3. Связывание протона и кальция в клеточной стенке. 44 Оценки кажущихся и истинных констант диссоциации.

1.4.4. Ограничения равновесного подхода к ионному балансу 47 в клеточных стенках.

1.5. Роль наружного кальция в поддержании нативных свойств 52 плазмалеммы.

1РШКЖЕНЙЕ 1.1. Модель, описывающая равновесное 56

распределение ионов в системе клеточная стенка--среда. ПРИЛОЖЕНИЕ 1.2. Использование модели Sentenac-Grignon 58

для оценки Кса клеточных стенок эпикотилей гороха. ПРИЛОЖЕНИЕ 1.3. Использование модели Sentenac-Grignon 59

для оценки Кса клеточной стенки Chara australis.

ГЛАВА 2. ВИЗУАЛЬНЫЕ НАБЛЮДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ВЗРЫВОВ.

2.1. Объекты исследования и состав растворов 61

2.2. Результаты визуальных наблюдений.

2.2.1. Феноменология взрыва клеток Mitella. 61

2.2.2. Феноменология взрывов корневых волосков 68 Tri anеа bogat ensi s.

2.3. Обсуждение результатов визуальных наблюдений. 71

ГЛАВА 3. аПЕКТРШЕЗШЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК N1TELIA В УСЛОВИЯХ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ КАЛЬЦИЕВОГО ДЕФИЦИТА.

3.1. Методика электрофизиологических опытов. 73

3.2. Результаты электрофизиологических опытов. 75

3.2.1. Опыты в растворах комплексообразователя (ЭДТА). 75

3.2.2. Опыты в децимолярных растворах соли (NaCl). 78 3.3. Обсуждение результатов электрофизиологических опытов. 84

3.3.1. Состояние клетки в процессе развивающегося 84 кальциевого дефицита до взрыва.

3.3.2. Состояние клетки в контрольном растворе 90 после экспозиции в децимолярном растворе NaCl.

3.3.3. Изменение состояния мембран и нарушения ионного 91 гомеостаза в момент взрыва.

3.3.4. Причины поступления Са в цитоплазму при клеточном 92 взрыве.

3.3.5. Последствия повышения концентрации свободного Са2+ 94 в цитоплазме.

3.3.5.1. Восстановительные процессы после одиночного 95 клеточного взрыва.

3.3.5.2. Клеточная гибель после серии взрывов. 98

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ КЛЕТОЧНОГО ОБЪЕМА И 'ГУРГОРА

ПРИ КЛЕТОЧНЫХ ВЗРЫВАХ. КЛЕТОЧНЫЙ ВЗРЫВ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ТЕОРИИ МЕМБРАННОГО ЛИЗИСА. 4.1. Методика измерения диаметра и длины клетки Nitella. 101

Метод расчета параметров водного обмена клетки.

4.1.1. Характеристика измерительной системы. 102

4.1.2. Измерение диаметра клетки. 102

4.1.3. Измерение длины клетки. 106

4.1.4. Расчет параметров водного обмена клетки. 107

4.1.4.1. Расчет объемного модуля упругости клетки Nitella. 108

4.1.4.2. Оценка полупериода водного обмена и 109 расчет гидравлической проводимости клеток Nitella

4.1.5. Приготовление "теней" междоузлий Ш1е11а и измерение 113 толщины клеточной стенки.

4.2. Результаты регистрации динамики линейных размеров 114 клеток и "теней" М11.е11а в условиях десорбции Са2+

с поверхности.

4.3. Обсуждение результатов регистрации линейных размеров 12? клетки N11,611а в условиях десорбции Са2+ с клеточной поверхности.

4.. 3.1. Физическая природа взрывов растительных клеток 127

4.3.2. Пульсирующий режим клеточного лизиса. 133

4.3.3. Альтернативные пути гибели клетки в условиях 139 десорбции кальция с ее поверхности.

ПРИЛОЖЕНИЕ 4. Расчет зависимости критического радиуса 143

водной поры клеточной стенки от тургорного давления.

ГЛАВА 5. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ОЦЕНКИ ИОННОГО РАВНОВЕСИЯ 146

И КИНЕТИКИ ИОННОГО ОБМЕНА НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК ШТЕЕЬА.

5.1. Характеристика ионного состава клеточной стенки, находящейся в равновесии с наружным раствором. 146

5.2. Опыты по экспозиции клеток Ш1е11а в Са-ЭДТА буферах. Оценка критического для взрыва содержания кальция в стенке. 151

5.3. Сравнение уровней десорбции кальция из клеточной 156 стенки Nite.Ha и с поверхности плазмалеммы перед

клеточным взрывом.

5.4. Сопоставление экспериментального времени ожидания клеточного взрыва с расчетом времени диффузии кальция из клеточной стенки. 159 5.4.1. Диффузия кальция в неперемешиваемом слое раствора. 160

5.4.1.1. Допущение о квазиравновесноети ионного обмена

в стенке. 161

5.4.1.2. Допущение о квазистационарности процесса диффузии.

5.4.1.3. Расчет времени достижения критического уровня кальция в клеточной стенке Nitella. 163

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 171

ВЫВОДЫ 182

ЛИТЕРАТУРА 185

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на то, что кальций является одним из основных элементов почвенного раствора, в последние десятилетия возросло число сообщений о физиологических нарушениях растений, вызванных недостаточным поступлением кальция в отдельные органы и ткани. Для возникновения "болезней Са-дефицита" есть внешние и внутренние причины. К первым относится недостаточное внесение кальциевых удобрений, которое происходит вынужденно в напей стране, в частности, в Ленинградской области, в последнее десятилетие. Та же тенденция отмечается западными исследователями, подчеркивающими, что рост урожайности при интенсивном земледелии увеличивает потребность растений в почвенном кальции ( Simon, 1978; Kirkbey, Pi1beam, 1984). Относительный дефицит кальция возникает также при выращивании растений на засоленных и кислых почвах ( Орлов, 1985, С. 133; Cramer et ah, 1985). Внутренние причины "болезней Са-дефицита" состоят в особенностях транспорта и распределения кальция внутри растения, которые приводят к возникновению локального Са-дефицита в запасающих органах и развивающихся меристемах.

Механизмы повреждения растительных клеток в условиях Са-дефицита остаются неясными. Наиболее распространенной остается гипотеза о развитии неспецифической проницаемости плазмалеммы при замещении на ее поверхности ионов СаЕ+ на ионы Na+ или К4' ( Kauss.,1987; Cramer et al.,1985; Demarty et al.,1984; Kirkbey, Pilbeam,1984). Однако эти представления, развитые ранее для животных клеток, не учитывают специфических особенностей растительных клеток, которые окружены Са-еодержащей клеточной стенкой, во многом определяющей потребность растении в почвенном кальции. Впервые на возможность альтернативных путей повреждения растительной клетки - либо с опережающим повреждением плазмалеммы путем плавной потери тургора, либо с опережающим

повреждением стенки путем клеточного взрыва (cell burst) - указал Simon (1978). Однако его взгляды не имели достаточного экспериментального подтверждения и не получили дальнейшего развития. Немногочисленные исследования, проведенные к настоящему времени на клеточном уровне, в условиях, моделирующих условия Ca- дефицита, выполнены на клеточных суспензиях. При этом выявлена десорбция кальция с плазмалеммы» как возможная первична?! реакция и утечка калия из клеток как поздний неспецифический признак гибели (Cramer et al.,1985; Enoch, Glinka, 1983), Результаты интерпретированы авторами в рамках гипотезы о развитии неспецифической проницаемости плазмалеммы, хотя это не позволяло объяснить наблюдавшийся эффект защита осмотиками. Исследования, выполненные на отдельных клетках, отсутствовали. В этой ситуации представлялось актуальным проследить за динамикой физиологического состояния индивидуальной растительной клетки в процессе развивающегося Ca-дефицита, уделяя особое внимание свойствам ее плазматической мембраны и клеточной стенки.

Основными объектами исследования были клетки харовой водоросли Nitella syncarpa. Гигантское междоузлие Nitella традиционно используется в качестве модели фотосинтезирующей клетки высших растений и достаточно хорошо изучено, чтобы по изменению электрических параметров мембран и скорости движения цитоплазмы судить о нарушениях ионного гомеостаза клетки и обсуждать их причины и следствия. Кати-онообменные свойства, клеточных стенок харовых водорослей близки к свойствам стенок двудольных растений, как по величине емкости кати™ онного обмена стенки, так и по величине констант диссоциации кальция и протона, из фазы стенки. Корневые волоски высшего водного растения Trianea bogatensis выбраны в качестве вспомогательного объекта для сравнения путей повреждения клеток водоросли и высшего растения в условиях Ca-дефицита.

Целью данной работы было исследовать механизмы повреждения клеток харовой водоросли М:Шз11а з. и корневых волосков высшего водного растения Тгхапеа Ьода1епз1з в условиях развивающегося Са~дефицита. Главы представленной диссертации отражают этапы исследования, посвященные решению ряда последовательных задач.

Задачей первого этапа работы было подобрать условия проведения экспериментов (состав растворов), наблюдая за клеточными повреждениями в световой микроскоп. При этом было впервые показано, что молодые клетки Nit.el.Ia з. и корневые волоски Тг1апеа Ь. "взрываются" через несколько минут экспозиции в нейтральных растворах комплексо-образователя (ЗДТА.) или в аквариумной воде после 10-минутной экспозиции в децимолярных растворах солей Ма01 или КС1. Клетки, прекратившие рост, в тех же условиях дольше сохраняют жизнеспособность и погибают без признаков клеточных взрывов.

Задачей второго этапа работы было охарактеризовать динамику физиологического состояния клеток ЫИеПа б.в процессе развивающегося Са-дефицита, используя наблюдения за движением цитоплазмы и непрерывную регистрацию электрических параметров плазмалеммы и тоноплас-та. При этом впервые с помощью микроэлектродной техники зарегистрированы изменения электрического потенциала и сопротивления плазма-леммы и тонопласта растительной клетки в условиях развивающегося Са-дефицита. Показано, что клеточный взрыв сопровождается мобилизацией эндогенного кальция, которая может иметь двоякий смысл для дальнейшей судьбы клетки: в качестве кратковременного сигнала рост концентрации свободного цитозольного Са2+ способствует заживлению раны, но устойчивое нарушение кальциевого гомеостаза цитозоля (при повторяющихся взрывах) может быть одной из причин клеточной гибели.

Задачей третьего этапа работы было исследовать динамику тургор-ного давления при клеточных взрывах ИгЬеПа з. и проанализировать

причины возникновения взрывов, используя существующие теоретические представления о механической устойчивости мембран. При этом впервые зарегистрирован пульсирующий режим клеточного лизиса и показано, что клеточные взрывы растений имеют ту же физическую природу, что и осмотический лизис животных клеток: в обоих случаях происходит нарушение механической устойчивости плазмалеммы. Если на животных клетках при прочих равных условиях устойчивость плазмалеммы зависит от радиуса клетки, то на клетках растений механическая устойчивость плазмалеммы зависит от радиуса пор клеточной стенки.

Задачей четвертого этапа, работы было дать некоторые количественные оценки, характеризующие условия возникновения клеточных взрывов МН;е11а б.. Проведенные опыты и расчеты показали, что к моменту взрыва содержание кальция в клеточной стенке 1Ше11а б. становится на порядок меньше емкости катионного обмена стенки, которая в норме практически полностью заполнена кальцием. Показано, что время ожидания первого клеточного взрыва М11е11а б., которое можно варьировать в опыте в пределах от секунд до суток, зависит от условий диффузии кальция в наружном неперемешиваемом слое раствора.

В заключении обсуждается возможность использования результатов, полученных в модельных условиях, для анализа событий, развивающихся в клетках высших растений в условиях Са-дефицита.

ГЛАВА i. ЛЙТЕРАТШШЙ ОБЗОР.

РОЛЬ КАЛЬЦИЯ В СТРУКТУРЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ И ПЛАЗМАЛЕШЫ РАСТЕНИЙ.

1.1. Характерные повреждения тканей растений при Ca-дефиците.

К настоящему времени в литературе описаны характерные повреждения тканей растений, испытывающих дефицит кальция. К ним относятся горькая ямчатость яблок, пробковая пятнистость груш, пятна внутренней ржавчины у картофеля, черная сердцевина сельдерея, лепестковая гниль у томатов, внутренние пустоты у моркови, внутренняя коричне-ватость у брюссельской капусты и ожог кончиков листьев латука и др. С Simon, 1978; Kirkbey, Pi1beam, 1984). По мнению авторов, эти повреждения отчасти вызваны современной тенденцией к уменьшению внесения неорганических кальциевых удобрений относительно других питательных веществ, а также тем обстоятельством, что рост урожайности при интенсивном сельском хозяйстве и садоводстве увеличивает потребность в почвенном кальции.

В целом отмечается, что повреждения характерны для развивающихся меристем - кончиков корня, точек роста наземных частей растения, а также для плодов и запасающих органов, в которых содержание кальция естественно низкое и в норме, особенно по сравнению со старыми листьями. Сложившееся общее мнение, сформулированное в обзорах (Simon, 1978; Kirkbey, Pealbeam, 1984) , сводится к тому, что причина болезней растений, связанных с кальциевым дефицитом, кроется в особенностях распределения и транспорта кальция в растении. Так, в листья кальций поступает от корней по ксилеме и накапливается с возрастом. С другой стороны, фрукты, например, яблоки, получают кальций по ксилеме только в первые несколько недель развития, затем скорость транспирации падает и дальнейшее поступление питания идет по флоэме, по которой кальций практически не перемещается. При дальнейшем росте плода концентрация кальция в нем падает. Поэтому

lie

плоды фруктовых деревьев могут проявлять признаки кальциевого дефи......

цита, тогда как смежные с ними листья здоровы.

'Симптомом кальциевого дефицита является растрескивание фруктов (яблок, томатов, вишен, слив), причем в каждом случае обработка содержащими кальций растворами ( опрыскивания или инъекции) уменьшает степень повреждения (Simon, 1978:, Conway, 1989). В некоторых случаях межклетники ткани плода или стебля заполняются жидкостью, образуются пропитанные влагой, полупрозрачные ткани. У яблок мякоть затем превращается в мягкую водянистую массу. Интересно, что подобный эффект может вызвать как дефицит кальция, так и инфекция возбудителями мягкой гнили плодов » грибами и бактериями (Simon, 1978; Conway, 1989). Эти паразиты поражают паренхимную ткань - яблоко, картофель, лист "'превращая ее в мягкую водянистую массу.

Главным симптомом Саг+--дефицита у растений считается некроз молодых тканей. Гибель точки роста, побега оказывается характерным признаком недостатка кальция у многих сельскохозяйственных культур (Simon, 1978). Затрагивается также корневая система: сначала медленнее развивается, затем рост полностью останавливается, корни становятся коричневыми и инфицируются.

Таким образом, по-видимому, можно сделать вывод, что дефицит кальция может быть как непосредственной причиной повреждения растительной ткани, так и косвенной, облегчая процесс инфицирования патогенами.

Какие же процессы развиваются в условиях кальциевого дефицита на клеточном уровне? Какие внутриклеточные структуры оказываются наиболее уязвимыми и повреждаются в первую очередь?

1.2. Представления о путях клеточного поврелдония в условиях

Знакомство с литературой, посвященной повреждениям растительных клеток в условиях дефицита Са2+, приводит к заключению, что исследователи физиологии растительных клеток при интерпретации полученных результатов, как правило, остаются в круге идей, развитых ранее применительно к животным клеткам. Так, в качестве первопричины клеточной гибели обычно указывают на потерю селективности и рост неспецифической проницаемости плазмалеммы в результате десорбции ионов Са2+ с ее поверхности (Bashford et al.,1988; Kauss, 1987; Kirkbey, Pi1beam, 1984). В заключ�