Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные механизмы восприятия запахов в норме и при обучении в простой нервной системе

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы восприятия запахов в норме и при обучении в простой нервной системе"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

на правах рукописи

00306Т2Б7

САМАРОВА Елена Игоревна

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОСПРИЯТИЯ ЗАПАХОВ В НОРМЕ И ПРИ ОБУЧЕНИИ В ПРОСТОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ

03.00.13 — физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва —2006

003067267

Работа выполнена в лаборатории клеточной нейробиологии обучения (заведующий — д. б. н., профессор П.М. Балабан) Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор — д. б. н., профессор П. М. Балабан).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор П. М. Балабан.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г. X. Мержанова; доктор биологических наук А. С. Пивоваров.

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН.

Защита состоится 31 января 2007 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета (Д-002.044.01) при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва, ул. Бутлерова, 5а). Факс: (095) 338-85-00 E-mail: admin@ihna.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВНД и НФ РАН. Автореферат разослан «¿^декабря 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета . /

доктор биологических наук С-'/}7 <^_£>НХ. Кошгоянц

/

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Среди всех беспозвоночных животных спонтанная ритмическая осцилляторная активность мозга обнаружена только у наземных легочных моллюсков (улиток и слизней). Низкочастотные (~1 Гц) спонтанные осцилляции были описаны в процеребруме (ответственная за обоняние структура мозга) слизня Umax maximus (Gelperin and Tank, 1990; Kieinfeld et al, 1994), а также в процеребруме улитки Helix lucorum (Никитин и Балабан, 1999; Nikitin and Balaban, 2000).

В составе процеребрума насчитывают до 80 000 нейронов, в то время как во всех остальных ганглиях нервной системы улитки содержится всего около 20 000 нейронов. Поведение моллюсков довольно стереотипно и ограничено относительно простыми формами. Это позволяет исследовать организацию разных типов поведения на клеточном уровне, например, проследить связь активности нейронов процеребрума моллюска с идентифицированными нейронами, вовлеченными в реализацию конкурентных форм поведения (пищевого и оборонительного). Так, известно, что сокращением щупальца улитки в ответ на запах (оборонительное поведение) управляет группа мелких мотонейронов и крупный идентифицируемый метацеребральный мотонейрон щупальца (МтЦЗ). Вклад этого мотонейрона в центральный компонент рефлекса втягивания щупальца составляет -85% (Захаров и др., 1982; Prescott et al., 1997). Самый крупный нейрон церебральных ганглиев — первый метацеребральный нейрон (МтЦ1) — осуществляет модуляцию пищевого поведения у таких моллюсков как Helix (Chase and Tolloczko, 1992) и Lymnaea (Elliott and Susswein, 2002).

Считается, что осцилляции в процеребруме моллюсков играют важную роль в распознавании, запоминании и кодировании информации о запахе (Teyke and Gelperin, 1999), однако на сегодняшний день механизм участия осцилляции в этих процессах остается неизвестным. Кроме того, ни на одном объекте не изучены конкретные нейронные механизмы, регулирующие осцилляции в обонятельных структурах. Неизвестна также роль осцилляций в

запуске моторной программы поведения животного. На данный момент осцилляторная активность процеребрума наземных улиток при восприятии запахов является единственным известным физиологическим феноменом, связывающим восприятие запахов с формированием поведения и является ключом к пониманию клеточных основ поведения у наземных моллюсков и выяснению нейронного кодирования обонятельной модальности у животных.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью данной работы являлось изучение возможной роли процеребрума наземных улиток в реализации двух альтернативных форм поведения (пищевого или оборонительного поведения) в ответ на один и тот же запах (цинеол) у обученных условно-рефлекторной пищевой или оборонительной реакции и у необученных (наивных) животных.

В соответствии с поставленной целью исследования были определены следующие задачи:

1. Зарегистрировать и проанализировать осцилляторную активность процеребрума виноградных улиток in vivo и in vitro в условиях адекватной обонятельной стимуляции у необученных улиток и обученных условно-рефлекторной пищевой или аверсивной реакции на запах цинеола.

2. Зарегистрировать и сопоставить спонтанную осцилляторную активность процеребрума с активностью нейронов, вовлеченных в реализацию разных форм поведения виноградных улиток.

3. Изучить взаимоотношения между вызванной предъявлением запаха суммарной активностью клеток процеребрума и активностью мотонейрона щупальца МтЦЗ (третьего метацеребрального нейрона), принимающего участие в реализации оборонительного поведения.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Динамика изменения частоты и амплитуды спонтанных осцилляций в процеребруме в ответ на запах различается у обученных (пищевой или оборонительной реакции) и у необученных улиток, что отражает участие процеребрума в обучении и выборе поведения в ответ на запах.

2. Спонтанные изменения обонятельного ритма в процеребруме улитки коррелируют по времени с изменением активности идентифицированных нейронов в сетях управления конкурентными формами поведения (пищевым и оборонительным).

3. Активация клеток процеребрума вызывает торможение спонтанной спайковой активности мотонейрона щупальца МтЦЗ, принимающего участие в реализации оборонительного поведения. Обратного влияния со стороны мотонейрона щупальца на клетки процеребрума не обнаружено. Тормозное влияние со стороны процеребрума может уменьшать длительность оборонительной реакции животного в ответ на запах, которая определяется уровнем активности мотонейрона щупальца.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые разработана методика экстраклеточного отведения активности процеребрума in vivo и проведена регистрация суммарной спонтанной и вызванной электрической активности процеребрума in vivo у наземного моллюска Helix lucorum L, Проведен анализ вызванной осцилляторной активности процеребрума in vivo и in vitro в ответ на предъявление запаха цинеола у необученных (наивных) и обученных (условно-рефлекторной пищевой или оборонительной реакции) улиток. Впервые показана спонтанная синергичная активность процеребрума и нейронов ЦНС, вовлеченных в реализацию двух конкурентных форм поведения улитки. Впервые обнаружено тормозное влияние нейронов процеребрума на активность мотонейрона щупальца МтЦЗ (третьего метацеребрального нейрона), принимающего участие в реализации оборонительного поведения.

Описана роль процеребрума как центрального звена восприятия запахов при реализации двух конкурентных форм поведения виноградной улитки.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Анализ изменения осцилляторной активности в обонятельном мозге улитки в ответ на запах расширяет представления современной физиологии о роли сенсорной структуры в организации поведения. Описание влияния активности процеребрума на активность мотонейрона щупальца, принимающего участие в реализации оборонительного поведения, дополняет существующие представления о механизме выбора поведения животным.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации были доложены на I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Дагомыс, 2005), на 5-ом международном форуме FENS (Fifth Forum of European Neuroscience, Вена, Австрия, 2006), на 8-ой международной конференции ISIN (International Society for Invertebrate Neurobiology) "Простые нервные системы" (Казань, 2006), на конференциях молодых ученых ИВНД и НФ РАН (Москва, 2004,2005,2006).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 6 докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на •juijстраницах машинописного текста, иллюстрирована 'jfy рисунками. Список литературы содержит-/^источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Электрофизиологическая регистрация от процеребрума и нейронов ЦНС in vitro.

Работа выполнена на взрослых особях Helix lucorum L. крымской популяции. Для анестезии животных использовали изотонический раствор MgCl2. Из животного извлекали ЦНС с интактными обонятельными нервами и несущими обонятельный эпителий задними щупальцами (полуинтакгный препарат). Препарат помещали в экспериментальную ванночку с раствором Рингера для холоднокровных (Rhines et al., 1993). Для обеспечения подачи запаха на обонятельный эпителий кожу щупальца вокруг сенсорного эпителия почти полностью удаляли. Щупальце прикалывали за мышцу ретрактора к подложке из силгарда, находившейся над уровнем физиологического раствора (Egan and Gelperin, 1981). Оболочки с процеребрума удаляли полностью или частично. Оболочки с нейронов других ганглиев ЦНС удаляли полностью. Для удаления наружных грубых оболочек с ЦНС препарат обрабатывали 7 минут протеазой (тип XIV, Sigma, USA). Во время обработки ферментом обонятельный эпителий находился выше уровня физиологического раствора и не подвергался протеолитическому действию.

Электрофизиологическая регистрация.

В работе применяли синхронное экстраклеточное отведение суммарных потенциалов от процеребрума и церебро-буккальной коннективы и внутриклеточное отведение мембранного потенциала нейронов ЦНС улитки. Для электрофизиологического отведения активности в процеребруме использовали заполненный физиологическим раствором тонкий (внутренний диаметр 0,3 - 0,5 мм) стеклянный присасывающий электрод. Сигнал усиливался в 10 000 раз на усилителе (НБ-лаб, Россия) для регистрации экстраклеточной активности с предварительно установленной полосой пропускания 0,1-50 Гц.

Экстраклеточную стимуляцию процеребрума проводили с помощью стимулятора ЭСЛ-2. Электрофизиологическое отведение суммарной активности церебро-буккальной коннективы проводили через вазелиновый мостик. Регистрирующий и индифферентный электроды, две серебряные хлорированные проволоки, находились по разные стороны от вазелинового мостика. Внутриклеточное отведение проводили по стандартной методике стеклянными микроэлектродами, заполненными раствором, содержащим 1.5МКС1 и 1МКСН2СООН. Сопротивление кончика электрода составляло 1050 МОм.

Предъявление запаха.

Предъявление запаха осуществляли с помощью ольфактометра (Kauer and Moulton, 1974), который позволяет дозировать концентрацию запаха в пределах 1-100% от максимальной. Потоки измеряли двумя флоуметрами (GF-1100, Gilmont Instruments, USA). Запах цинеола (жидкость) наносили до полного увлажнения на фильтровальную бумагу, которую помещали в сменную камеру. Перед подачей на препарат поток запаха и чистого воздуха смешивали в смесителе для достижения нужной концентрации запаха. Из смесителя запах поступал в подающую пипетку, из которой с помощью вакуумного насоса откачивали содержимое со скоростью, большей чем скорость поступления смеси с запахом. Запах предъявляли путем прекращения активного отсоса запаха из кончика подающей пипетки, Длительность подачи запаха - 3 с. В качестве одоранта использовали цинеол - мономолекулярный запах. Цинеол предъявляли только в возрастающих концентрациях (1, 2, 5, 10, 20%). Время между предъявлениями запаха около 15 мин. Электрофизиологические записи осцилляторной активности процеребрума обрабатывали с помощью программ Spike2 5.0 (SED, UK), Origin 6.0 (OriginLab, USA).

Эксперименты с поведением и обучением улиток на запах.

В работе использовали протокол выработки условного рефлекса в специальной экспериментальной установке (Balaban et al., 1987). При выработке yqлoвнopeфлeктopнoй аверсивной реакции на цинеол удары током (~110мА, 0,5 с, 10 Гц) после предъявления цинеола наносили металлическим электродом, который вручную подносили к ноге. При выработке аверсии в ответ на запах цинеола удар током наносили через -10 с после начала подачи запаха. Всего в группе было 20 животных. Обучение проводили за 15-20 дней, осуществляя по два сочетания в день. При выработке условнорефлекторной пищевой реакции на цинеол обучение проводили по сходной методике, что и аверсивное обучение, только предъявление запаха цинеола подкрепляли морковным соком. Несколько капель морковного сока предъявляли через несколько секунд после предъявления запаха улитке. В группе было 20 животных. Обучение проводили в течение 15-20 дней, осуществляя по четыре-пять сочетаний в день. Тестирование выработанного условного рефлекса (пищевого или аверсивного) проводили в открытом поле с использованием слепого контроля и видеозаписью поведения животного в ответ на появление цинеола в среде. Сразу после тестирования в открытом поле улиток препарировали и на полуинтактном препарате «обонятельный орган - ЦНС» животных регистрировали осцилляторную активность процеребрума в ответ на запах цинеола, наносимый с расстояния 0,5-1,0 см от рецепторного эпителия.

Электрофизиологическая регистрация от процеребрума in vivo и проведение операций.

В экспериментах использовали половозрелых улиток Helix lucorum и Helix pomatia (п=17). Перед началом операции улиток анестезировали охлаждением, затем вводили сукцинилхолин хлорид (Sigma, USA) и MgCl2 (200 мМ, 2 мл). Сукцинилхолин хлорид разводили на изотоническом растворе

MgCl2 и вводили в тело улитки; предполагаемая конечная доза вещества внутри тела улитки составляла 0,012 мг (Balaban and Chase, 1989).

Проведение операций по вживлению хронических электродов в процеребрум улиток.

Через разрез (1-1,2 см) на коже головы позади верхних щупалец вводили тонкий платино-иридиевый проволочный электрод диаметром 20 мкм с изоляционным тефлоновым покрытием (А-М Systems, Inc., USA). Электрод проводили от внутренней стороны мантии вдоль тела и укрепляли за соединительнотканные оболочки церебральных ганглиев ЦНС улитки. Электрод устанавливали в апикальной либо центральной части процеребрума, после чего разрез на коже зашивали шовным материалом. После операции выживало около 23% животных. Регистрацию осцилляторной активности в процеребруме начинали через 18-24 ч после операции, когда улитки начинали активно ползать, и проводили (с перерывами) в течение последующих 2-3 дней. На третий-четвёртый день животное забивали и проводили морфологический контроль для выяснения точного местоположения электрода в мозге.

Регистрацию суммарной электрической активности процеребрума в ответ на аппликацию запаха проводили по стандартной методике с помощью экстраклеточного усилителя (НБ-лаб, Россия). Предъявление запаха осуществляли с помощью ольфактометра (описание см. выше). В качестве одоранта использовали цинеол. Для определения латентного периода реакции животного на запах параллельно проводили видеорегистрацию поведения на камеру JVC Fl.2 (Япония). Видеозаписи поведения обрабатывали с помощью программы Pinnacle Studio 9.0, электрофизиологические записи осцилляторной активности обрабатывали с помощью программ Spike2 5.0 (SED, UK), Origin 6.0 (OriginLab, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Спонтанные осцилляции в процеребрумеулиток.

Электррфизиологическая регистрация активности в процеребруме улиток Helix как с помощью стеклянного присасывающего электорода (in vitro регистрация), так и с использованием вживленного хронического электорода в процеребрум (in vivo регистрация) показала наличие спонтанных ритмических осцилляций в процеребруме. При экстраклеточной регистрации активности процеребрума на полуинтактном препарате (in vitro регистрация) спонтанные осцилляции демонстрируют высокую регулярность на протяжении достаточно длительного времени (час и более) и имеют более или менее постоянную частоту и амплитуду. В свободном поведении (при in vivo регистрации) амплитуда, частота и форма осцилляций у наземных улиток были менее постоянными и предсказуемыми

Частота спонтанных осцилляций в процеребруме наивной улитки в свободном поведении, в отличие от частоты обонятельного ритма на полуинтактном препарате, в большинстве случаев была больше 1 Гц. Средняя частота осцилляций, зарегистрированных in vivo, составляла 1,16 ± 0,08 Гц, что почти в два раза больше, чем частота спонтанных осцилляций до предъявления запаха на полуинтактном препарате как у наивных улиток, так и улиток, с выработанной условнорефлекторной пищевой или оборонительной реакцией на запах цинеола. При in vitro регистрации осцилляций в процеребруме наивных улиток частота осцилляций редко превышала 1 Гц, а средняя частота осцилляций составляла 0,68 ± 0,09 Гц, достоверно (р < 0,05, критерий Данна) отличаясь от частоты осцилляций при регистрации in vivo. В группе препаратов, полученных из обученных пищевой реакции на запах цинеола улиток, средняя частота осцилляций in vitro до нанесения запаха составляла 0,65 ± 0,05 Гц, достоверно не отличаясь от средней частоты осцилляций в процеребруме наивных улиток in vitro. На полуинтактных препаратах улиток,

обученных оборонительной реакции на запах цинеола, не наблюдали ни одного случая, когда частота осцилляций в фоне до момента нанесения запаха на препарат превышала 1 Гц. Средняя частота осцилляций у таких улиток составляла 0,6 ± 0,04 Гц.

Амплитуда осцилляций в процеребруме, зарегистрированных как in vivo, так и in vitro, также различалась у разных групп животных, зависела от неизвестных факторов. Средняя амплитуда осцилляций в фоне (до предъявления запаха цинеола) in vivo составляла 65,5 ± 4,07 мкВ. Средняя амплитуда осцилляций, зарегистрированных in vitro, была достоверно (р < 0,05, критерий Данна) меньше - у наивных улиток 46,8 ± 4,02 мкВ и улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, 35,2 ± 2,23 мкВ. Средняя амплитуда осцилляций, зарегистрированных in vitro у улиток с выработанной аверсией на цинеол была недостоверно больше (110,34 ± 16,44 мкВ), чем амплитуда осцилляций in vivo, что может быть связано с сильной сенситизацией улиток к данному запаху во время обучения.

Впервые спонтанная активность процеребрума in vitro была проанализирована в деталях у слизня Umax maximns (Gelperin and Tank, 1990). Позднее были зарегистрированы спонтанные ритмичные осцилляции в процеребруме у наземной улитки Helix lucorum (Chase and Hall, 1996; Никитин и Балабан, 1999). До сих пор неизвестно значение этого спонтанного осцилляторного ритма процеребрума, однако считается, что волна возбуждения вызывает синхронизацию работы большого количества клеток процеребрума и тем самым способствует более точной настройке всей системы на выделение новых, в том числе очень слабых, источников запаха из окружающей среды, содержащей множество одорантов (Laurent, 1996).

Изменение осцилляции в процеребруме под воздействием запаха.

При регистрации осцилляций в процеребруме с помощью вживленного платино-иридиевого электрода (регистрация in vivó) параметры электрической активности . обонятельного мозга наземных моллюсков претерпевают значительные изменения при появлении в обстановке нового запаха. С помощью видеорегистрации поведения улитки (изменения длины щупальца улитки в ответ на запах) синхронно с регистрацией осцилляторной активности процеребрума нам удалось сравнить электрофизиологическую регистрацию с поведением.

Достоверное изменение частоты осцилляций в процеребруме отмечено уже в первые 10 с после подачи запаха цинеола (5%), в течение которых частота снижается на 10% (р < 0,05, здесь и далее критерий Манна-Уитни). Одновременно со снижением частоты осцилляций происходит и достоверное (р < 0,01) увеличение амплитуды осцилляций на 12%. Важно отметить, что основная оборонительная реакция улитки - сокращение щупальца в ответ на запах - очень хорошо выражена именно в первые 10 с после подачи запаха. Например, максимальное сокращение длины щупальца в ответ на предъявление запаха в 5%-ной концентрации достигается уже к третьей секунде от начала подачи запаха животному, после чего происходит быстрое восстановление длины щупальца. К 9-10-ой секунде щупальце почти полностью восстанавливает свою длину (до 80%), по крайней мере, сенсорный эпителий к этому времени уже открыт и улитка может вновь воспринимать запахи.

Достоверные изменения частоты и амплитуды осцилляторного ритма в процеребруме улитки Hela при регистрации in vivo наблюдали в интервале 21-30 с и 31-40 с после подачи запаха цинеола в концентрации 5%. В эти временные периоды происходит увеличение амплитуды осцилляций на 16% (в интервале 21-30 с) и 11% (в интервале 31-40 с), а также снижение частоты осцилляций на 14% (в интервале 21-30 с) и 18% (в интервале 31-40 с).

При исследовании поведения улитки в ответ на предъявление цинеола в 20% концентрации было отмечено, что максимальное втягивание щупальца было на 4-ой с после начала подачи запаха, после чего происходило медленное увеличение длины щупальца. Надо отметить, что длина щупальца в ответ на 20% концентрацию цинеола была достоверно меньше, чем длина щупальца в ответ на5%-ный цинеол. После втягивания щупальца, повторное появление сенсорного эпителия на его поверхности (т.е. способность воспринимать запахи) происходит только на 11-12-ой с после подачи запаха. В это время вновь начинается активное сканирование пространства, т. е. появляется адекватная реакция улитки на появление нового запаха в среде.

При восприятии животным запаха цинеола (20%) достоверные изменения, как частоты так и амплитуды осцилляций в процеребруме происходят в период 11-20 с после момента предъявления запаха. При этом частота достоверно (р < 0,05) снижается на 12% по сравнению в первоначальным уровнем, а амплитуда достоверно (р < 0,01) увеличивается на 25% от фонового значения. Такие синхронные изменения частоты и амплитуды осцилляций при восприятии запаха подтверждают гипотезу о неразрывной связи этих двух параметров в механизмах распознавания запаха животным. Таким образом, частота и амплитуда осцилляций процеребрума in vivo в ответ на предъявление запаха претерпевают одновременные изменения в виде урежения осцилляций, сопровождаемого увеличением их амплитуды.

При регистрации на полуинтактном препарате (in vitro) амплитуда осцилляторного ритма в процеребруме у наивных улиток в ответ на предъявление запаха цинеола (5%) увеличивалась в интервале 21-30 с (на 7%) и 31-40 с (на 9%) от момента предъявления запаха. В интервале 1-20 с после подачи цинеола (5%) достоверных изменений амплитуды осцилляций не происходило, хотя наблюдали тенденцию к уменьшению амплитуды осцилляций. Достоверное уменьшение частоты осцилляций (р<0,01) в

процеребруме наблюдали в интервале с 1 по 20 с (на 20% и 36%) от момента начала подачи запаха (5%).

После аппликации цинеола в большой концентрации (20%) наблюдали достоверное (р < 0,001) уменьшение амплитуды осцилляций на 10% в интервале 11-20 с от момента подачи запаха. В том же самом интервале времени (11-20 с от момента предъявления запаха на препарат) наблюдали достоверное (р < 0,001) урежение осцилляций на 40%. Частота осцилляторного ритма возвращалась в норму только через 30 с после подачи запаха на препарат.

Необходимо заметить, что в случае регистрации осцилляций на полуинтактном препарате возможная длительность восприятия запаха не может быть меньше 3 с (длительность нанесения стимула), так как щупальце не может втянуться, и сенсорный эпителий открыт в течение всего времени предъявления запаха. Это может являться основой отличий в изменении амплитуды осцилляций в ответ на цинеол in vivo и in vitro. Следует также отметить, что цинеол в большой концентрации (20%) является очень сильным раздражителем, который может вызывать скорее аверсивную реакцию у животного (или препарата), нежели ориентировочно-исследовательскую.

Для выявления того, какая реакция процеребрума на запах соответствует выбору и реализации нервной системой програмы пищевого или оборонительного поведения, в дальнейших экспериментах проводили обучение улиток условнорефлекторной пищевой или оборонительной (аверсивной) реакции на запах цинеола.

В свободном поведении улитки, обученные аверсии на цинеол, в ответ на запах цинеола проявляли сильно выраженную оборонительную реакцию, которая проявляется в длительном втягивании щупалец и даже в замедлении локомоции, повороте в другую сторону для избегания встречи с источником неприятного запаха. В открытом поле такие улитки старались не приближаться к источнику неприятного запаха и, часто, уползали в другую сторону, либо

прекращали локомоцию вовсе и прятались в раковину. Улитки, обученные пищевой реакции на цинеол, наоборот, в открытом поле проявляли сильно выраженное предпочтение к данному запаху и очень быстро (5-7 мин) достигали пробирки, источающей запах цинеола.

Достоверное (р < 0,001) уменьшение амплитуды (на 16%) осцилляции в процеребруме (in vitro) улитки, обученной условнорефлекторной аверсивной реакции на запах цинеола, происходило в ответ на аппликацию цинеола (5%) в интервале 11-20 с после подачи запаха. В интервале 21-30 с после подачи цинеола (5%) также происходило достоверное снижение амплитуды осцилляции (р < 0,05), но всего на 7%. Достоверное снижение частоты осцилляций в процеребруме (р < 0,01) заметно уже в первые 10 с после начала подачи цинеола на препарат. Максимальное урежение осцилляций — на 53% — наблюдали в интервале 11-20 с после подачи запаха (5%), т. е. тогда, когда происходит и максимальное уменьшение амплитуды осцилляций (на 16%). Урежение осцилляций (на 20%) сохранялось и в интервале 21-30 с после подачи цинеола (5%), что также коррелировало со снижением амплитуды осцилляций в тот же временной период. В дальнейшем частота осцилляторного ритма постепенно возвращалась в норму по сравнению с первоначальным уровнем частоты до нанесения запаха.

После предъявления цинеола в концентрации 20% достоверное (р < 0,001) снижение амплитуды осцилляций на 23% наблюдали во второй десятисекундный интервал (11-20 с) после начала предъявления запаха. Такое снижение амплитуды осцилляций происходило синхронно (в тот же самый временной интервал) с падением частоты осцилляций практически в два раза. Достоверное снижение частоты и амплитуды осцилляций продолжалось и в интервал 21-30 с: снижение частоты на 26% и амплитуды на 9%, после чего амплитуда и частота осцилляций быстро возвращались к первоначальной величине до подачи запаха на препарат.

Максимальные изменения осцилляций в процеребруме улиток, обученных аверсивной реакции, на полуинтактном препарате отмечены во второй 10-секундный интервал (11-20 с), что, возможно, определяет время принятия решения о реализации оборонительного поведения на данный сенсорный раздражитель (запах). Длительность реакции также слабо зависит от концентрации раздражителя (цинеола) в среде, что говорит о том, что более важной является качественная характеристика раздражителя, определение которой происходит в первые секунды после нанесения одоранта на препарат. Можно сделать предположение, что данный временной период может быть существенным для принятия решения о реализации генерализованного оборонительного поведения животным для удаления от источника неприятного или опасного запаха (escape reaction).

Важно отметить, что в ответ на предъявление цинеола в большой концентрации (20%) изменения частоты осцилляций в процеребруме in vitro в группе улиток, обученных аверсивной реакции, и наивных улиток достоверно не различались ни на одном из 10 секундных интервалов. Но у улиток, обученных аверсивной реакции, изменения частоты осцилляций были недостоверно более выражены. Это обстотельство может свидетельствовать о том, что такая большая концентрация запаха (20%) может вызывать аверсию у животных обеих групп.

Поведение улиток (изменение длины щупальца), обученных пищевой реакции на запах цинеола, слабо различалось при подаче цинеола в низкой и большой концентрациях. Максимальное втягивание щупальца (в среднем на 50-55%) наблюдали уже на первой секунде от начала подачи запаха животному. При этом уже на 4-ой секунде после начала подачи запаха цинеола 5% (на 5-ой с при подаче цинеола 20%) щупальце практически полностью (до 80%) восстанавливало свою длину и сенсорный эпителий к тому времени был уже открыт. После четвёртой секунды от подачи запаха щупальца сильно

вытягиваются в длину, и улитка начинает активно двигаться к источнику запаха.

Амплитуда осцилляторного ритма в ответ на запах цинеола (5%) у улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, достоверно (р < 0,001) уменьшалась на 11% уже в первые Юс после подачи запаха. В интервал 1120 с после подачи запаха амплитуда осцилляции процеребрума уже возвращалась к исходным значениям и далее существенно не менялась. Вместе с изменениями амплитуды осцилляций изменялась и их частота, т.е. в тот же временной интервал. Достоверное урежение осцилляций на 41% наблюдали в интервале 1-10 с после подачи цинеола в концентрации 5%. В другие временные периоды не наблюдали достоверного изменения частоты осцилляций. Таким образом, изменения амплитуды (уменьшение) и частоты (урежение) осцилляций фокального потенциала в процеребруме улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, в ответ на адекватную стимуляцию происходят синхронно (в один промежуток времени).

Появление реакции процеребрума в ответ на предъявление цинеола (5%) во временном интервале 1-10 с является существенным отличием таких улиток от наивных улиток и улиток, обученных аверсивной реакции на цинеол, у которых реакция на воздействие запаха цинеола (в концентрации 5%) проявляется позже.

Изменения амплитуды осцилляций процеребрума у улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, в ответ на предъявление цинеола в концентрации 20% были более длительными. Максимальное достоверное (р < 0,001) снижение амплитуды осцилляций на 11% наблюдали в первые Юс после подачи цинеола на препарат. Амплитуда осцилляций возвращалась в норму только через 30 с после аппликации цинеола. Максимальное и достоверное учащение осцилляций процеребрума отмечено только через 20 с после начала подачи цинеола на препарат. В этот интервал (21-30 с) частота осцилляций увеличилась на 30%.

У улиток, обученных пищевой реакции, изменения обонятельного ритма процеребрума происходят в зависимости от концентрации цинеола, и характер реакции принципиально отличается от ответов улиток, обученных аверсивной реакции на цинеол и наивных улиток. Исходя из этого можно предположить, что отличия осцилляций у обученных пищевой или аверсивной реакции животных могут быть связаны с запуском разного поведения. Возможно, что десинхронизация активности нейронов (т. е. уменьшение амплитуды осцилляций) процеребрума не связана с дискриминацией (определением значимости) запаха, а только с его восприятием и, возможно, силой (концентрация запаха) и длительностью воздействия сенсорной информации. В то же время синхронизация и увеличение частоты осцилляций коррелирует с распознаванием качества обонятельного стимула и поиском пищи.

Вызванная запахом активность в нейронах ЦНСулитки.

Активность идентифицируемых нейронов, участвующих в реализации пищевого или оборонительного поведения улитки также изменялась при аппликации цинеола на препарат и зависела от концентрации запаха. Например, реакция мотонейрона щупальца МтЦЗ (третий метацеребральный нейрон) всегда имела дозозависимый характер ответа на аппликацию цинеола у всех групп улиток. Однако, у улиток, обученных оборонительной реакции на цинеол, реакция мотонейрона МтЦЗ на запах имела очень сильно выраженный характер (длительная пачечная активность) вне зависимости от концентрации запаха цинеола. Такой ответ прямо соответствует достоверным изменениям амплитуды и частоты спонтанных осцилляций процеребрума у тех же улиток вне зависимости от концентрации запаха.

На полуинтактном препарате наивной улитки было отмечено появление спайковой активности в нейроне МтЦ1 (модуляторный нейрон пищевого поведения) в ответ на предъявление цинеола в большой концентрации (20%), которая также отражается в церебро-буккальной коннективе. Увеличение

спайковой активности в нейроне МтЦ1 и церебро-буккальной коннективе наблюдали только в ответ на аппликацию цинеола в большой концентрации, в то время как при аппликации 5%-ного цинеола выраженных изменений в активности МтЦ1 у наивных улиток in vitro не отмечено.

У улиток, обученных оборонительной реакции на цинеол, не отмечена спайковая активность ни в модуляторном нейроне пищевого поведения, ни в командном нейроне оборонительного поведения (Пп1, первый плевральный нейрон) в ответ на предъявление цинеола (5%, 20%).

У улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, наблюдали появление спайковой активности в МтЦ1 нейроне через 20 с после нанесения запаха (20%) на препарат, что может свидетельствовать о пищевом поведении в ответ на предъявление цинеола в большой концентрации (20%). Такую же активность нейрона МтЦ1 в ответ на запах цинеола наблюдали и у наивных улиток.

Соотнесение осцилляции в процеребруме с активностью идентифицированных нейронов пищевого и оборонительного поведения.

В элекгрофизиологических экспериментах на полуинтактном препарате (ЦНС—ольфакторный нерв—щупальце с обонятельным эпителием) проводили синхронную экстраклеточную регистрацию от апикальной части (клеточный слой) процеребрума и внутриклеточную электрофизиологическую регистрацию от нейронов ЦНС, вовлеченных в реализацию оборонительного и пищевого поведения улитки.

Отмечена спонтанная синергичная активность мотонейрона щупальца МтЦЗ и модуляторного нейрона МтЦ1 (первый метацеребральный нейрон), которая сопровождалась изменением амплитуды и, во многих случаях, частоты спонтанных осцилляции (9 препаратов наивных улиток). Кроме того, мы наблюдали спонтанную синергичную активность нейронов, лежащих в плевральных и педальных ганглиях (Пл1, первый плевральный нейрон и Пд4, четвертый педальный нейрон), причем эта синергичность имеет реципрокный

характер. Оба эти нейрона получают синхронный гиперполяризующий вход (2 препарата наивных и 2 препарата обученных улиток).

Аналогичную спонтанную синергичную активность нейронов ЦНС и процеребрума, сопровождающуюся изменением частоты и амплитуды спонтанных осцилляций, также наблюдали и на полуинтактных препаратах улиток, обученных как пищевой, так и оборонительной реакции на запах цинеола. Эпизоды синергичной спонтанной активности на полуинтактных препаратах улиток, обученных аверсии на цинеол, наблюдали сразу в трех нейронах ЦНС (МтЦЗ, МтЦ1, Пд4), процеребруме и церебро-буккальной коннективе (2 препарата). На полуинтактных препаратах улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, была отмечена спонтанная синергичная активность нейронов ЦНС (МтЦ1, МтЦЗ, Пд5в, пятый педальный вентральный нейрон), а также процеребрума и церебро-буккальной коннективы (3 препарата обученных улиток).

Такая спонтанная синергичная активность нейронов процеребрума и нейронов ЦНС, расположенных в разных ганглиях (церебральных плевральных, педальных), скорее всего, связана с общим возбуждающим входом на эти нейроны.

Роль процеребрума в регуляции активности мотонейрона щупальца.

Для определения количества синаптических переключений между клетками процеребрума и мотонейроном щупальца (МтЦЗ, третий метацеребральный нейрон) в одной серии экспериментов мы проводили экстраклеточную стимуляцию клеток процеребрума и одновременно регистрировали активность мотонейрона МтЦЗ, а в другой проводили внутриклеточную стимуляцию мотонейрона МтЦЗ и одновременно регистрировали суммарную активность процеребрума.

При экстраклеточной стимуляции процеребрума в нормальном физиологическом растворе наблюдали уменьшение спайковой активности в

мотонейроне МтЦЗ. Для определения количества синаптических переключений между процеребрумом и мотонейроном МтЦЗ (моно- или полисинаптическая связь) мы использовали раствор с повышенным содержанием кальция и магния (Hi-Di, Зх[Са2+], 5x[Mg2+]) для блокады возможной полисинаптической связи между двумя этими структурами. После замены нормального физиологического раствора на раствор с повышенным содержанием кальция и магния (Hi-Di), экстраклеточная стимуляция процеребрума более не вызывала изменений спайковой активности МтЦЗ при такой же силе стимуляции (п = 3 эксперимента, Р = 0,89, критерий Стьюдента). Полученные данные говорят о том, что клетки процеребрума связаны с мотонейроном МтЦЗ не прямой моносинаптической связью (синапсом), а опосредованно, полисинаптически, не менее чем через два синаптических переключения.

В другой серии экспериментов мы исследовали наличие обратной связи со стороны мотонейрона щупальца на клетки процеребрума. При внутриклеточной деполяризации МтЦЗ ступенькой тока 2 нА (вызывающей многочисленные спайки) не отмечено никаких значимых изменений частоты и амплитуды осцилляции в процеребруме (п = 6 препаратов), это говорит о том, что обратного влияния со стороны МтЦЗ на клетки процеребрума нет. Дальнейшее увеличение частоты спайков (увеличением деполяризационного тока) в МтЦЗ также не приводило к изменению частоты и амплитуды осцилляции в процеребруме.

Поскольку процеребрум тормозит спайковую активность МтЦЗ, торможение осцилляторной активности процеребрума может способствовать растормаживанию мотонейрона МтЦЗ и более длительному втягиванию щупальца в ответ на обонятельный стимул. Наоборот, активация процеребрума наивной улитки пищевыми запахами может быть необходима для снижения активности мотонейрона оборонительного поведения и, как следствие, вытягивания щупальца улитки для определения положения источника запаха, то есть активации пищевого поведения.

Chase и Hall (1996) предполагали существование двух афферентных путей: один (включает процеребрум) для восприятия низких концентраций запаха или пищевых запахов, и второй (независимый от процеребрума) для восприятия запахов в большой концентрации, опасных запахов. Определяемая активностью МтЦЗ величина сокращения щупальца на слабый запах может быть основой настройки обонятельной системы наземной улитки на присутствие определенного запаха в среде. Наоборот, тормозное влияние процеребрума на мотонейрон МтЦЗ может снижать его активность в ответ на пищевые запахи. Аверсивное обучение на запахи, возможно, вызывает снижение влияния процеребрума на мотонейрон МтЦЗ (Chase and Hall, 1996).

ВЫВОДЫ.

1) Частота осцилляции электрической активности в процеребруме in vivo в отсутствие обонятельной стимуляции в два раза больше, чем частота осцилляций, зарегистрированных in vitro.

2) Частота и амплитуда осциляций в процеребруме в ответ на предъявление запаха in vivo претерпевают одновременные изменения: частота осцилляций снижается, а их амплитуда возрастает.

3) При исследовании препаратов необученных улиток in vitro, аппликация цинеола в концентрации 5% вызывает слабые, почти не отличающиеся от фонового уровня, изменения частоты и амплитуды осцилляций в процеребруме. При увеличении концентрации запаха цинеола до 20% наблюдается достоверное урежение осцилляций и уменьшение их амплитуды.

4) В группе улиток, обученных аверсивной реакции на цинеол, обнаружено, что аверсивная реакция вызывается вне зависимости от концентрации запаха и развёртывается полностью даже при малой концентрации одоранта.

5) В ответ на предъявление запаха цинеола в низкой 5%-ной концентрации улиткам, обученным пищевой реакции, происходят слабые изменения частоты и амплитуды осцилляций. При увеличении концентрации цинеола до 20% происходит достоверное увеличение частоты осцилляций.

6) Обнаружены спонтанные синергичные изменения осцилляций фокального потенциала в процеребруме и активности нейронов, участвующих в реализации пищевого и оборонительного поведения, которые, по-видимому, регулируются со стороны пока не идентифицированного центрального генератора паттернов.

7) Активация клеток процеребрума тормозит активность идентифицируемого мотонейрона щупальца МтЦЗ, участвующего в реализации оборонительного поведения и может способствовать завершению оборонительной реакции. Обратного влияния со стороны нейрона МтЦЗ на процеребрум не обнаружено.

8) Полученные данные свидетельствуют о том, что изменения частоты и амплитуды спонтанных осцилляций в процеребруме в ответ на запах отражают участие процеребрума в ольфакторном обучении и выборе поведения в ответ на запах. Механизмом участия является тормозное влияние со стороны клеток процеребрума на нейроны оборонительного поведения, которое уменьшает длительность оборонительной реакции животного в ответ на запах и позволяет реализоваться пищевому поведению.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи:

1. Nikitin E.S., Zakharov I.S., Samarova E.I., Kemenes G., Balaban P.M. Fine tuning of olfactory orientation behaviour by the interaction of oscillatory and single neuronal activity. Eur. J. Neurosci. 2005,22(11), pp. 2833-2844.

2. Самарова Е.И., Балабан П.М. Регистрация спонтанных осцилляций в процеребруме наземной улитки Helix при свободном поведении. Журн. высш. нервн деят, 2006, Т. 56, №6, с. 725-730.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА:

3. Gainutdinova Т.Н., Tagirova R.R., Ismailova A.I., Muranova L.N., Samarova E.I., Gainutdinov K.L., Balaban P.M. Reconsolidation of a context long-term memory in the terrestrial snail requires protein synthesis. Learn. Mem. 2005, 12(6), pp. 620-625.

4. Samarova E.I., Bravarenko N.I., Korshunova T.A., Gulyaeva N.V., Palotas A., Balaban P.M. Effect of (3 - amyloid peptide on behavior and synaptic plasticity in terrestrial snail. Brain Res. Bull. 2005,67(1-2), pp. 40-45.

Тезисы конференций:

1. Самарова Е.И. Нейрональные механизмы восприятия запаха у наземных улиток. «VIII Научная конференция молодых учёных», Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН., Москва, 6 октября 2004, стр. 24.

2. Самарова Е.И., Захаров И.С., Никитин Е.С., Балабан П.М. Взаимовлияние центральных нейронов и активности нейронов обонятельного анализатора у виноградной улитки Helix lucorum. Научные труды 1 Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября 2005, т. 1, стр.68.

3. Самарова Е.И. Влияние нейронов пищевого и оборонительного поведения на активность нейронов обонятельного анализатора у виноградной улитки Helix lucorum «IX Научная конференция молодых учёных», Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН., Москва, 12-13 октября 2005 стр. 41-42.

4. Samarova Е., Zakharov I., Balaban P.M. Relations of olfactory analyzer neurons with feeding and withdrawal behavior neurons in Helix lucorum. Fifth Forum of European Neuroscience (FENS), Vienna, Austria, 8-12 July, 2006. FENS Abstr., vol.3, A074.17,2006.

5. Samarova E.I., Zakharov I.S., Balaban P.M. Relations of olfactoiy neurons to feeding and withdrawal behavior neurons in Helix lucorum. Eighth East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (ISIN) "Simpler nervous systems", 13-17 September 2006, Kazan, Russia, p.69.

6. Самарова Е.И. Регистрация спонтанных осцилляций в процеребруме наземной улитки Helix в свободном поведении. «X Научная конференция молодых учёных», Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН., Москва, 11-12 октября 2006 стр.10.

Принято к исполнению 23/11/2006 Исполнено 24/11/2006

Заказ № 999 Тираж 150экз

Типогргфия «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Самарова, Елена Игоревна

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Цели и задачи исследования.

1.2. Положения, выносимые на защиту.

1.3. Научная новизна.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Значение запахов в жизни моллюсков.

2.2. Анатомия обонятельной системы наземного моллюска.

2.2.1. Периферический обонятельный орган.

2.2.2. Центральное звено обонятельного анализатора.

2.3. Спонтанная и вызванная запахом осцилляторная активность в процеребруме наземных моллюсков.

2.4. Обучение улиток запахам.

2.5. Нейроны, участвующие в реализации пищевого и оборонительного поведения улитки.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА.

3.1. Электрофизиологическая регистрация от процеребрума и нейронов ЦНС in vitro.

3.1.1. Животные и экспериментальные препараты.

3.1.2. Отведение суммарных потенциалов.

3.1.3. Внутриклеточное отведение.

3.1.4. Обработка электрофизиологических записей суммарных потенциалов от процеребрума.

3.1.5. Предъявление запаха на полуинтактный препарат.

3.2. Эксперименты с поведением.

3.2.1. Аверзивное обучение на запах цинеола.

3.2.2. Обучение пищевой реакции на запах цинеола.

3.2.3. Тестирование в открытом поле.

3.3. Электрофизиологическая регистрация от процеребрума in vivo и проведение операций.

3.3.1. Экспериментальные животные и анестезия.

3.3.2. Методика проведения операций по вживлению хронических электродов.

3.3.3. Отведение суммарных потенциалов от процеребрума in vivo и предъявление запаха животному.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Сравнение осцилляций в процеребруме in vivo и in vitro в отсутствие запаха.

4.2. Изменение осцилляций процеребрума под воздействием запаха.

4.2.1. Вызванная активность процеребрума in vivo.

4.2.2. Вызванная активность процеребрума in vitro.

4.3. Влияние характера обучения на ответ процеребрума на запах.

4.3.1. Аверсивное обучение.

4.3.2. Пищевое обучение.

4.3.3. Сравнительный анализ ответов на запаху наивных и обученных улиток.

4.4. Соотнесение осцилляций процеребрума с активностью идентифицированных нейронов пищевого и оборонительного поведения.

4.4.1. Спонтанная активность.

4.4.2. Вызванная запахом активность.

4.5. Роль процеребрума в регуляции активности мотонейрона щупальца.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Спонтанная активность процеребрума in vivo и in vitro.

5.2. Вызванная активность процеребрума in vivo и in vitro.

5.3. Влияние характера обучения на ответ процеребрума на запах.

5.4. Роль процеребрума в регуляции активности мотонейрона щупальца.

6. ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточные механизмы восприятия запахов в норме и при обучении в простой нервной системе"

Животные, способные распознавать запахи, получают информацию о пространственной локализации и качестве индивидуальных запахов с помощью обоняния. Вклад диффузии в распространении молекул запаха невелик, основное значение имеют потоки воздуха, с помощью которого молекулы запаха достигают обонятельного органа животного. Интенсивность (концентрация) запаха изменяется при перемешивании потоков воздуха. Способность к распознаванию запахов является очень важным элементом поведения многих наземных животных при поиске пищи и избегании опасности (Hopfield, 1991).

В литературе высказывается гипотеза о том, что обонятельная система должна выделять запах объекта путем определения различий в составе и концентрации пахучих веществ в потоках воздуха (Hopfield, 1999). Универсальная обонятельная система должна распознавать отдельные запахи, что отражается в паттерне активности, которую данный запах вызывает в обонятельных рецепторных клетках (Rubin and Katz, 1999; Spors and Grinvald, 2002; McGann et al., 2005). Конкретные механизмы такого распознавания до сих пор изучены недостаточно (Hopfield, 1999; Hartwell et al., 1999). Показано, что грызуны имеют около 2000 обонятельных рецепторных генов, причем каждая рецепторная клетка экспрессирует только один тип этих генов (Buck and Axel, 1991; Mombaerts et al., 1996). Викерс с соавторами (Vickers et al., 2001) продемонстрировали, что у мотылька Heliothis virescens паттерны разряда нейронов антеннальной доли мозга предсказуемо изменяются в соответствии с динамикой и интенсивностью запаха.

Многочисленными исследованиями показано, что вызванные осцилляции являются обычным явлением в обонятельной системе, как позвоночных (Delaney and Hall, 1996; Dorries and Kauer, 2000; Lam et al., 2000), так и беспозвоночных животных (Mellon and Wheller, 1999; Wehr and Laurent,

1999). Например, вызванные запахом осцилляции описаны в грибовидных телах и антеннальных долях мозга насекомых (Laurent and Davidowitz, 1994). Осциллирующие обонятельные нейроны были описаны в процеребруме речного рака (Mellon et al., 1992; Mellon and Wheller, 1999). Оптическим методом были зарегистрированы осцилляции в ольфакторной доле обонятельного мозга черепах (Lam et al., 1997; Lam et al., 2000). Каждый вдох у млекопитающих сопровождается несколькими циклами высокочастотных (60-90 Гц) осцилляций локального потенциала в гранулярном клеточном слое обонятельной луковицы (Gray and Skinner, 1988). Среди всех беспозвоночных животных спонтанная ритмическая осцилляторная активность мозга обнаружена только в процеребруме наземных легочных моллюсков (улиток и слизней, подкласс Pulmonata). Низкочастотные (~1 Гц) спонтанные осцилляции были описаны в процеребруме (обонятельном отделе мозга) слизня Umax maximus (Gelperin and Tank, 1990; Kleinfeld et al, 1994), а также в процеребруме улитки Helix lucorum (Никитин и Балабан, 1999; Nikitin and Balaban, 2000). Волны спонтанной осцилляторной активности в процеребруме распространяются от апикальной части к его основанию (Kleinfeld et al., 1994; Gelperin et al., 1993; Никитин и Балабан, 1999). В отличие от наземных моллюсков, водные легочные моллюски, такие как Lymnaea stagnalis (L.), вообще не имеют процеребрума, но они способны к восприятию химических раздражителей, растворенных в воде.

В составе процеребрума насчитывают до 80 000 нейронов, в то время как во всех остальных ганглиях нервной системы улитки содержится всего около 20 000 нейронов (Balaban, 2002). Поведение моллюсков довольно стереотипно и ограничено относительно простыми формами. Это позволяет, исследовать организацию разных типов поведения на клеточном уровне, например, проследить связь активности нейронов обонятельного мозга (процеребрума) моллюска с идентифицированными нейронами, вовлеченными в реализацию конкурентных форм поведения (пищевого и оборонительного). Так, известно, что сокращением щупальца улитки в ответ на запах (оборонительное поведение) управляет группа мелких мотонейронов и крупный идентифицируемый мотонейрон щупальца МтЦЗ (третий метацеребральный нейрон). Вклад этого мотонейрона (осуществляет ретракцию щупальца) в центральный компонент рефлекса втягивания щупальца составляет ~85% (Захаров и др., 1982; Prescott et al., 1997). Самый крупный нейрон церебральных ганглиев МтЦ1 (первый метацеребральный нейрон) осуществляет модуляцию пищевого поведения у таких моллюсков как Helix и Lymnaea (Chase and Tolloczko, 1992; Elliott and Susswein, 2002).

Считается, что осцилляции в процеребруме моллюсков играют важную роль в распознавании, запоминании и кодировании информации о запахе (Ermentrout et al., 2001; Kasai et al., 2006), однако на сегодняшний день механизм участия осцилляций в этих процессах остается неизвестным. Также ни на одном объекте не изучены конкретные нейронные механизмы, вызывающие осцилляции в обонятельных структурах и реализацию моторной программы поведения животного. На данный момент осцилляторная активность процеребрума наземных улиток при восприятии обонятельных стимулов является единственным известным физиологическим феноменом, связывающим восприятие запахов с формированием поведения. Фигурально выражаясь, исследование феномена осцилляций в процеребруме является ключом к пониманию клеточных основ поведения у наземных моллюсков и выяснению нейронного кодирования обонятельной модальности у животных.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Самарова, Елена Игоревна

6. выводы.

1) Частота осцилляций электрической активности в процеребруме in vivo в отсутствие обонятельной стимуляции в два раза больше, чем частота осцилляций, зарегистрированных in vitro.

2) Частота и амплитуда осциляций в процеребруме в ответ на предъявление запаха in vivo претерпевают одновременные изменения: частота осцилляций снижается, а их амплитуда возрастает.

3) При исследовании препаратов необученных улиток in vitro, аппликация цинеола в концентрации 5% вызывает слабые, почти не отличающиеся от фонового уровня, изменения частоты и амплитуды осцилляций в процеребруме. При увеличении концентрации запаха цинеола до 20% наблюдается достоверное урежение осцилляций и уменьшение их амплитуды.

4) В группе улиток, обученных аверсивной реакции на цинеол, обнаружено, что аверсивная реакция вызывается вне зависимости от концентрации запаха и развёртывается полностью даже при малой концентрации одоранта.

5) В ответ на предъявление запаха цинеола в низкой 5%-ной концентрации улиткам, обученным пищевой реакции, происходят слабые изменения частоты и амплитуды осцилляций. При увеличении концентрации цинеола до 20% происходит достоверное увеличение частоты осцилляций.

6) Обнаружены спонтанные синергичные изменения осцилляций фокального потенциала в процеребруме и активности нейронов, участвующих в реализации пищевого и оборонительного поведения, которые, по-видимому, регулируются со стороны пока не идентифицированного возбуждающего входа.

7) Активация клеток процеребрума тормозит активность идентифицируемого мотонейрона щупальца МтЦЗ, участвующего в реализации оборонительного поведения и может способствовать завершению оборонительной реакции. Обратного влияния со стороны нейрона МтЦЗ на процеребрум не обнаружено.

8) Полученные данные свидетельствуют о том, что изменения частоты и амплитуды спонтанных осцилляций в процеребруме в ответ на запах отражают участие процеребрума в ольфакторном обучении и выборе поведения в ответ на запах. Механизмом участия является тормозное влияние со стороны клеток процеребрума на нейроны оборонительного поведения, которое уменьшает длительность оборонительной реакции животного в ответ на запах и позволяет реализоваться пищевому поведению.

БЛАГОДАРНОСТИ.

В первую очередь мне хотелось бы поблагодарить своего научного руководителя, профессора Павла Милославовича БАЛАБАНА за помощь в подготовке диссертации. Спасибо Вам за то, что Вы в меня поверили и предоставили мне возможность проявить себя как на научной тропе, так и в стенах лаборатори. Спасибо за Ваше терпение и выдержку!

Я выражау огромную благодарность Игорю Сергеевичу ЗАХАРОВУ за помощь, советы и критику на всех этапах проведения работы над диссертацией. Спасибо за то, что Вы всегда можете реально помочь людям, особенно тогда, когда помощь особенно необходима.

Большое спасибо Наталье Ивановне БРАВАРЕНКО за помощь на начальных этапах обработки данных, за моральную поддержку в процессе обучения и жизни в таком не знакомом для меня городе как Москва, за интерес к научным результатам.

Огромная признательность Виктору Николаевичу ИЕРУСАЛИМСКОМУ за то, что научил меня некоторым основам иммуногистохимии. К сожалению, эти данные не вошли в данную работу, но знания и труд, без условно, не пропадут даром. Спасибо Вам также за моральную поддержку, интерес к работе и доброе отношение.

Хочу выразить отдельное спасибо Алексею Юрьевичу МАЛЫШЕВУ за помощь в освоении многих программ для обработки данных, ценные советы, отзывчивость, доброе и дружелюбное отношение.

Отдельное спасибо Евгению Сергеевичу НИКИТИНУ за дельные советы по обработке данных, постановке задач исследования, советы по представлению материалов диссертации и правку чернового варианта настоящей работы.

Хочется выразить respect Николаю Александровичу АСЕЕВУ за нескончаемое терпение при обучении меня премудростям работы в программах для обработки данных, за интерес к научной работе и поддержку при поступлении в аспирантуру.

Огромное спасибо моей подруге Елене Петровне КУЛЕШОВОЙ за поддержку в тяжелые минуты, за добрые советы как по научным проблемам (обработка, представление результатов), так и по личным делам. Спасибо за моральную поддержку, дружелюбное отношение и многое другое.

Выполнение любой работы не может быть полноценным без дружного и сплоченного коллектива. Я хочу выразить огромную благодарность коллективу лаборатории Клеточной нейробиологии обучения, а именно, Коршуновой Татьяне, Саложину Сергею, Лемак Марике, Шерозии Максиму, Богуславскому Дмитрию за поддержку и терпение ко мне. Спасибо большое моим друзьям: Славуцкой Анне, Бондарю Игорю, Иванову Ростиславу за поддержку и советы, за желание помочь, а также за добрую и весёлую компанию. Отдельное спасибо Фридман Марине Алексеевне за поддержку, помощь и доброе отношение ко мне. В заключении, хочется поблагодариь моих родителей и брата Назара за помощь, поддержку и веру в меня. Спасибо!

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самарова, Елена Игоревна, Москва

1. Балабан П.М., Захаров И.С. Обучение и развитие: общая основа двух явлений. М., "Наука", 1992. 152с.

2. Браваренко Н.И., Балабан П.М., Соколов E.H. (1982) Организация сенсорного входа командных нейронов. Журнал высшей нервной деятельности имени И. П. Павлова. 32(1): 94-99.

3. Верещагин С.М., Лапицкий В.П. Сравнительная физиология нервной системы беспозвоночных. Учеб. пос. Л., Изд-во Ленингр. ун-та, 1982.96 с.

4. Зайцева О.В. (1992) Структурная организация сенсорных систем улитки. Журнал высшей нервной деятельности имени И. П. Павлова. 42(6): 11321149.

5. Зайцева О.В. (2000а) Проекционные связи и гипотетическая схема структурной организации процеребрумов наземных моллюсков. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 36(5): 465-478.

6. Зайцева O.B. (2000b) Церебральные отделы хемосенсорных систем улитки: структурные основы межсенсорной интеграции. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 36(2): 147-153.

7. Зайцева О.В., Иванова И.П., Лукьянова Е.Л. (2000с) Ультраструктура области клеточных тел процеребрума улиток и слизней. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 36(4): 322-330.

8. Захаров, И.С., Мац В.Н., Балабан П.М. (1982) Роль гигантского церебрального нейрона в контроле оборонительного поведения Helix lucorum. Нейрофизиология. 14(4): 262-266.

9. Захаров И.С. (1992) Оборонительное поведение улитки. Журнал высшей нервной деятельности имени И. П. Павлова. 42(6): 1156-1169.

10. Иерусалимский В.Н., Захаров И.С., Палихова Т.А., Балабан П.М. (1992) Нервная система и картирование нейронов брюхоногого моллюска Helixlucorum L. Журнал высшей нервной деятельности имени И. П. Павлова. 42(6): 1075-1089.

11. Максимова О.А., Балабан П.М. (1979) Взаимоотношения между командными нейронами пищевого и оборонительного поведения виноградной улитки. Журнал высшей нервной деятельности имени И. П. Павлова. 29(5): 978-983.

12. Максимова О.А., Балабан П.М. (1983) Нейронные механизмы пластичности поведения. М.: Наука, 126с.

13. Никитин Е.С., Балабан П.М. (1999) Оптическая регистрация ответов на запахи в обонятельных структурах нервной системы наземного моллюска Helix. Журнал высшей нервной деятельности имени И. П. Павлова. 49(5): 817-829.

14. Никитин Е.С. (2003) Роль процеребрума наземного моллюска Helix в восприятии запахов и формировании поведения. Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук, Москва.

15. Русинов B.C., Майорчик В.Е., Гриндель О.М., Соколова А.А., Болдырева Г.Н., Галкина Н.С., Гнездицкий В.В. Клиническая энцефалография. Под редакцией Русинова B.C. Москва, "Медицина", 1973.

16. Сахаров ДА. Генеалогия нейронов. М., "Наука", 1974. 184с.

17. Balaban, P.M. (1993) Behavioral neurobiology of learning in terrestrial snails. Prog. Neurobiol. 41: 1-19

18. Balaban P.M., Vehovszky A., Maximova O.A., Zakharov I.S. (1987) Effect of 5,7-dihydroxytiyptamine on the food-aversive conditioning in the snail Helix lucorum L. Brain Res. 24; 404(1-2): 201-10

19. Balaban P.M., Chase R. (1989) Self-stimulation in snails. Neurosci. Res. Commun. 4(3): 139-146.

20. Balaban P.M. (2002) Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26: 597-630.

21. Buck L.B. (1996) Information coding in the vertebrate olfactory system. Annu. Rev. Neurosci. 19: 517-544.

22. Buck L., Axel R. (1991) A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65(1): 175-87.

23. Chase R., Tolloczko B. (1992) Synaptic innervation of the giant cerebral neuron in sated and hungry snails. J Comp Neurol. 318(1): 93-102.

24. Chase R. (1986) Lessons from snail tentacles. Chemical Senses. 11(4): 411426.

25. Chase R., Croll R. P. (1981) Tentacular function in snail olfactory orientation. J. Comp. Physiol. 143: 357-362.

26. Chase R., Tolloczko B. (1993) Tracing neural pathways in snail olfaction: from the tip of the tentacles to the brain and beyond. Microscopy Res. Tech. 24: 214-230.

27. Chase R., Tolloczko B. (1986) Synaptic glomeruli in the olfactory system of a snail, Achatina fúlica. Cell Tissue Res. 246: 567-573.

28. Chase R., Tolloczko B. (1985) Sensory glands of the snail tentacle and their relation to the olfactory organ. Zoomorphology. 105: 60-67.

29. Chase R. (1985) Responses to odors mapped in snail tentacle and brain by l4C.-2-deoxyglucose autoradiography. J. Neurosci5: 2930-2939.

30. Chase R.s Kamil R. (1983) Neuronal elements in snail tentacles as revealed by HRP backfilling. J. Neurobiol. 14: 29-42.

31. Chase R., Tolloczko B. (1989) Interganglionic dendrites constitute an output pathway from procerebrum of the snail Achatina fúlica. J. Comp. Neurol. 283: 143-152.

32. Chase R., Hall B. (1996) Nociceptive inputs to C3, a motoneuron of the tentacle withdrawal reflex in Helix aspersa. J. Comp. Phisiol. A 179:809-818.

33. Cooke I.R., Gelperin A. (2001) In vivo recording of spontaneous and odor-modulated dynamics in the Limax olfactory lobe. J. Neurobiol. 46: 126-141.

34. Cottrell G.A., Schot L.P., Dockray G.J. (1983) Identification and probable role of a single neurone containing the neuropeptide Helix FMRFamide. Nature. 304(5927): 638-640.

35. Croll R., Chase R. (1980) Plasticity of olfactory orientation to foods in snail Achatina fúlica. J. Comp. Physiol. 136:267-277.

36. Dale B. (1973) Blood pressure and its hydraulic functions in Helix pomatia L. J. Exp. Biol. 59(2): 477-490.

37. Delaney K.R., Gelperin A., Fee M.S., Flores J.A., Gervais R., Tank D.W., Kleinfeld D. (1994) Waves and stimulus-modulated dynamics in an oscillating olfactory network. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 669-673.

38. Delaney K.R., Hall J.B. (1996) An in vitro preparation of frog nose and brain for the study of odour-evoked oscillatory activity. J. Neurosci. Meth. 68: 193202.

39. Dorries K.M., Kauer J.S. (2000) Relationships between odor-elicited oscillations in the salamander olfactory epithelium and olfactory bulb. J. Neurophysiol. 83: 754-765.

40. Egan M.E., Gelperin A. (1981) Olfactory inputs to a bursting serotonergic interneuron in a terrestrial mollusc. J. moll. Stud. 47: 80-88.

41. Elliott C. J.H., Susswein A.J. (2002) Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. J. Exp. Biol 205: 877-896.

42. Ermentrout B., Flores D., Gelperin A. (1998) Minimal model of oscillation and waves in the Umax olfactory lobe with tests of model's predictive power. J. Neurophysiol. 79:2677-2689.

43. Ermentrout B., Wang J.W., Flores J., Gelperin A. (2001) Model of olfactory discrimination and learning in Umax procerebrum incorporating oscillatory dynamics and wave propagation. J. Neurophysiol. 85: 1444-1452

44. Friedrich A., Teyke T. (1998) Identification of stimuli and input pathway mediating food-attraction conditioning in the snail, Helix. J. Comp. Physiol. 183: 247-254.

45. Gelperin A. (1989) Neurons and networks for learning about odors. Perspectives in Neural Systems and Behavior. © 1989 Alan R. Liss, Inc. 121136.

46. Gelperin A. (1998) Computational analysis of olfactory learning and waves. The 2ndR.L.E.C. International Symposium. Mar. 16-18, Sendai, Japan.

47. Gelperin A., Rhines L.D., Flores J., Tank D.W. (1993) Coherent network oscillations by olfactory interneurons: modulation by endogenous amines. J. Neurophysiol. 69(6): 1930-1939.

48. Gelperin A., Flores J., (1997) Vital staining from dye-coated microprobes identifies new olfactory interneurons for optical and electrical recording. J Neurosci. Methods. 72(1):97-108.

49. Gelperin A., Tank D.W. (1990) Odour-modulated collective network oscillations of olfactory interneurons in a terrestrial mollusc. Nature, 345: 437440.

50. Gray C.M., Skinner J.E. (1988) Centrifugal regulation of neuronal activity in the olfactory bulb of the walking rabbit as revealed by reversible cryogenic blockade. Exp. Brain. Res. 69: 378-386.

51. Hartwell L.H., Hopfield J.J., Leibler S., Murray A.W. (1999) From molecular to modular cell biology. Nature. 402: c47-c52.

52. Hendin O., Horn D., Hopfield J.J. (1994) Decomposition of a mixture of signals in a model of the olfactory bulb. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 59425946.

53. Hildebrand J.G., Shepherd G.M. (1997) Mechanisms of olfactory discrimination: converging evidence for common principles across phyla. Annu. Rev. Neurosci. 20: 595-631.

54. Hopfield J.J. (1991) Olfactory computation and object perception. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 6462-6466.

55. Hopfield J.J. (1999) Odor space and olfactory processing: Collective algorithms and neural implementation. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 12506-12511.

56. Inoue T., Watanabe S., Kawahara S., Kirino Y. (2000) Phase-dependent filtering of sensory information in the oscillatory olfactory center of a terrestrial mollusk. J. Neurophisiol. 84: 1112-1115.

57. Ito I., Nakamura H., Kimura T., Suzuki H., Sekiguchi T., Kawabata K., Ito E. (2000) Neuronal components of the superior and inferior tentacles in the terrestrial slug, Umax marginatus. Neurosci. Res. 37: 191-200.

58. Kasai Y., Watanabe S., Kirino Y., Matsuo R. (2006) The procerebrum is necessary for odor-aversion learning in the terrestrial slug Umax valentianus. Lerm. Mem. 13:482-488.

59. Kauer J.S., Moulton D.G. (1974) Responses of olfactory bulb neurones to odour stimulation of small nasal areas in the salamander. J. Physiol. 243: 717737.

60. Kawahara S., Toda S., Suzuki Y., Watanabe S., Kirino Y. (1997) Comparative study on neural oscillation in the procerebrum of the terrestrial snails Indiana bilineata and Umax marginatus. J. Exp. Biol. 200: 1851-1861.

61. Kevern E. B. (1995) Olfactory learning. Curr. Opin. Neurobiol. 5:482-488.

62. Kimura T., Toda S., Sekiguchi T., Kirino Y. (1998) Behavioral modulation induced by food odor aversive conditioning and its influence on the olfactory responses of an oscillatory brain network in the slug Umax marginatus. Learn. Mem. 4(5): 365-75.

63. Kleinfeld D., Delaney K.R., Fee M.S., Flores J.A., Tank D.W., Gelperin A. (1994) Dynamics of propagating waves in the olfactory network of a terrestrial mollusc: an electrical and optical study. J. Neurophysiol. 72: 1402-1419

64. Kupfermann I., Weiss K.R. (1982) Activity of an identified serotonergic neuron in free moving Aplysia correlates with behavioral arousal. Brain Res. 241(2): 334-337.

65. Lam Y.W., Cohen L.B., Senseman D.M., Balaban P.M., Falk C.X. (1997) Voltage-sensitive dye recording of odor elicited oscillations in the turtle olfactory bulb. Abs. Soc. Neurosci. 23, 1269.

66. Lam Y.W., Cohen L.B., Wachowiak M., Zochowski M.R. (2000) Odors elicit three different oscillations in the turtle olfactory bulb. J. Neurosci. 20: 749-762.

67. Laurent G., Davidowitz H. (1994) Encoding of olfactory information with oscillating neural assemblies. Science Wash, 265:1872-1875.

68. Laurent G., Wehr M., Davidowitz H. (1996) Temporal representation of odors in an olfactory network. J. Neurosci. 16(2): 3837-3847.

69. Laurent G. (1996) Odor images and tunes. Neuron. 16: 473-476.

70. McGann J.P., Pirez N., Gainey M.A., Muratore C., Elias A.S., Wachowiak M. (2005) Odorant representation are modulated by intra- but not interglomerular presynaptic inhibition of olfactory sensory neurons. Neuron. 48: 1039-1053.

71. Mellon D.F.Jr., Sandeman D.S., Sandeman R.E. (1992) Characterization of oscillatory olfactory interneurons in the protocerebrum of the crayfish. J. Exp. Biol 167:15-38.

72. Mellon D., Wheller C.J. (1999) Coherent oscillations in membrane potential synchronize impulse bursts in central olfactory neurons of the crayfish. J. Neurophysiol. 81:1231-1241.

73. Mombaerts P. (1999) Seven-transmembrane proteins as odorant and chemosensory receptors. Science. 286, 5440: 707-711.

74. Mombaerts P., Wang F., Dulac C., Chao S.K., Nemes A., Mendelsohn M., Edmonson J., Axel R. (1996) Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87: 675-686.

75. Murakami M., Watanabe S., Inoue T., Kirino Y. (2004) Odor-evoked responses in the olfactory center neurons in the terrestrial slug. J Neurobiol. 58(3):369-378.

76. Nikitin E.S., Balaban P.M. (2000) Optical recording of odor-evoked responses in the olfactory brain of the naive and aversively trained terrestrial snails. Learn Mem. 7(6):422-432.

77. Nikitin E.S., Zakharov I.S., Samarova E.I., Kemenes G., Balaban P.M. (2005) Fine tuning of olfactory orientation behaviour by the interaction of oscillatory and single neuronal activity. Eur. J. Neurosci. 22(11): 2833-2844.

78. Prescott S.A., Gill N., Chase R. (1997) Neuronal circuit mediating tentacle withdrawal in Helix aspersa, with specific reference to the competence of the motor neuron C3. J. Neurophysiol. 78: 2951-2965.

79. Ratte, S., Chase R. (1997) Morphology of interneurons in the procerebrum of the snail. Helix aspersa. J. Comp. Neurol. 384: 359-372.

80. Ratte S., Chase R. (2000) Synapse distribution of olfactory interneurones in the procerebrum of the snail Helix aspersa J. Comp. Neurol. 417: 366-384.

81. Rhines L.D., Socolove P.G., Flores J., Tank D.W., Gelperin A. (1993) Cultured olfactory interneurons from Umax maximus: optical and electrophysiological studies of transmitter-evoked responses. J. Neurophysiol. 69(6): 1940-1947.

82. Rubin B.D., Katz L.C. (1999) Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb. Neuron. 23:499-511.

83. Sahley C., Gelperin A., Rudy J.W. (1981) One-trial associative learning modifies food preferences of a terrestrial mollusk. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 79: 640-642.

84. Spors H., Grinvald A. (2002) Spatio-temporal dynamics of odor representations in the mammalian olfactory bulb. Neuron. 34: 301-315.

85. Teyke T. Gelperin A. (1999) Olfactory oscillations augment odor discrimination not odor identification by Limax CNS. Neuroreport 10: 1061 -1068.

86. Teyke T. (1996) Nitric oxide, but not serotonin, is involved in acquisition of food-attraction conditioning in the snail Helix pomatia. Neurosci Lett. 206(1): 29-32.

87. Teyke T., Weiss K.R., Kupfermann I. (1990) Appetitive feeding behavior of Aplysia: behavioral and neural analysis of directed head turning. J. Neurosc. 10(12): 3922-3934.

88. Toda S., Kawahara S., Kirino Y. (2000) Image analisys of olfactory responses in the procerebrum of the terrestrial slug Limax marginatus. J. Exp. Biol. 203: 2895-2905.

89. Van Mol J J. (1967) Étude morphologique et phylogénétique du ganglion céreboîde des Gastéropodes Pulmonés (Mollsques). © Academie Royal de Belgique, Bruxele. 15: 104-105.

90. Vickers N.J., Christensen T.A., Baker T.C., Hildebrand J.G. (2001) Odour-plume dynamics influence the brain's olfactory code. Nature. 401: 466-470.

91. Watanabe S., Kawahara S., Kirino Y. (1998) Morphological characterization of the bursting and non-bursting neurons in the olfactory center of the terrestrial slug Limax marginatus. J. Exp. Biol. 201:925-930.

92. Watanabe S., Inoue T., Murakami M., Inokuma Y., Kawahara S., Kirino Y. (2001) Modulation of oscillatory neural activities by cholinergic activation of interneurons in the olfactory center of a terrestrial slug. Brain Res. 896:30-35.

93. Wehr M., Laurent G. (1999) Relationship between afferent and central temporal patterns in the locust olfactory system. J. Neurosci. 19: 381-390.

94. Weiss K.R., Kupfermann I., (1976) Homology of the giant serotonergic neurons (metacerebral cells) in Aplysia and pulmonate molluscs. Brain Res. 117(1): 33-49.

95. Wright B.R. (1974) Sensory structure of the tentacles of the slug Arion alter (Pulmonata, Mollusca). 1. Ultrastructure of the distal epithelium, receptor cells and tentacular ganglion. Cell Tissue Res. 151(2): 229-44.

96. Zaitseva, O.V. (1991) Structural organization of the tentacular sensory system in land pulmonates. Simpler nervous systems, © Manchester University Press. 238-257.

97. Zakharov I.S., Hayes N.L., Ierusalimsky V.N., Novakowski R.S., Balaban P.M. (1998) Postembryonic neurogenesis in the procerebrum of the terrestrial snail Helix lucorum L. J. Neurobiol. 35: 271-276.