Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изыскание средств терапии при сочетанном воздействии на организм внешнего и внутреннего облучения

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Изыскание средств терапии при сочетанном воздействии на организм внешнего и внутреннего облучения"

На правах рукопи

Сычев Константин Владимирович

ИЗЫСКАНИЕ СРЕДСТВ ТЕРАПИИ ПРИ СОЧЕТАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ИА ОРГАНИЗМ ВНЕШНЕГО И ВНУТРЕННЕГО

ОБЛУЧЕНИЯ

03.01.01 - радиобиология 06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 Ц ['' П

1 ' ./ I ,

Казань-2014

005548057

005548057

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») г. Казань.

Научные руководители: Низамов Рамзи Низамович

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РТ. Гайзатуллин Ринат Рауфовнч доктор биологических наук.

Официальные оппоненты: Данилова Надежда Ивановна

доктор биологических наук, доцент

кафедры зоогигиены Казанской

государственной академии ветеринарной

медицины им. Н.Э. Баумана;

Тюменев Рустем Сагитович

кандидат биологических наук, старший научный

сотрудник Института экологии и географии

Казанского (Поволжского) Федерального

Университета.

Ведущее учреждение: ФГБОУ ВПО «Ижевская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится «17» июня 2014 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности».

(420075, г. Казань, Научный городок - 2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размешен на официальных сайтах ВАК РФ wwv.vak.ed.RQv.ru; полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного руководителя - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru. Автореферат разослан «» 14 года.

Учёный секретарь диссертационного ш&ета,

кандидат ветеринарных наук Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования. В реальных условиях животные и человек могут подвергаться не только изолированному внешнему или внутреннему облучению, но и сочетанному воздействию обоих факторов (Москалев Ю.И., Егорова Г.М., Шишкин В.Ф., Биологическое действие при сочетанном действии у-лучей б0Со и mI // Сб. работ под редакцией проф. Л.А. Ильина, Ю.И. Москалева - М.: Медицина, 1970. С.173-177.). Предполагается, что внешнее и внутреннее облучение во всех случаях суммируются (Корнеев H.A., Сироткин А.Н., Основы радиоэкологии сельскохозяйственных животных. - М.: Энергоатомиздат, 1987. - 208 е.). Вместе с тем, в литературе имеется ряд сообщений о взаимоослабляющем действии общего гамма-облучения и местного облучения щитовидной железы радиоактивным йодом (Козлова A.B. Последствия взрывов атомных бомб в Херосиме и Нагасаки и водородной бомбы в Бикини. - М.: Медгиз, 1957. 230 е.). Однако другие данные об особенностях биологического действия ионизирующей радиации при сочетанном воздействии общего гамма-облучения и дополнительного изолированного облучения организма инкорпорированными радионуклидами опровергают это положение. По данным японских и отечественных исследователей в случае сочетанного внешнего и внутреннего облучения лучевое поражение протекает тяжелее, чем при общем облучении. При этом поражение желудочно-кишечного тракта и системы иммуногемопоэза несет более выраженный характер, сопровождающийся возникновением острого лучевого синдрома, обусловленного, главным образом, внешним облучением (Василенко И.Я., Классовский Ю.А., Малахов Н.Ф. и др. Особенности течения острой лучевой болезни при общем влиянии у -облучения в сочетании с местным облучением щитовидной железы радиоактивным йодом. // Распределение, кинетика обмена и биологическое действие радиоактивных изотопов йода: Сб. работ под ред. проф. Л.А. Ильина, Ю.И.Москалева - М.: Медицина, 1970. С.227-231.; Калистратова B.C., Оксентюк Г.С., Крюк В.Ф. К вопросу о биологическом действии 1311 и сочетанных формах их поражения П Распределение, кинетика обмена и биологическое действие радиоактивных изотопов йода. - М.: Медицина, 1970. С.190-196.).

Полиорганная и полисистемная радиационная патология, вызванная сочетанным действием на организм животных внешнего и инкорпорированного облучения создает существенные трудности для терапии таких поражений, что диктует необходимость изыскания более эффективных методов и средств противорадиационной защиты.

Степень разработанности проблемы. В результате целенаправленных исследований по изысканию средств противорадиационной защиты сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в последние годы разработана технология изготовления радиозащитных средств на основе веществ зоогенного (сыворотка крови, лимфа, глобулины), микробного (радиозащитный полиантиген), апифитогенного (Вита-Форце) и детоксико-десорбирующих

веществ (высокодисперсные фракции бентонита) (Иванов A.B., Низамов Р.Н., Конюхов Г.В. и др. Способ получения препарата для профилактики и лечения радиационных поражений организма: Патент РФ № 2338546 от 10.09.2006 г.; Иванов A.B., Низамов Р.Н., Конюхов Г.В. и др. Натуральная биологически активная кормовая добавка «Вита-Форце» // Патент РФ № 2324361 от 20 мая 2008 г.).

Учитывая, что разработанные в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» препараты обладают высоким радиотерапевтическим эффектом при изолированном внешнем облучении (противорадиационный иммуноглобулин, апифитопре-парат «Вита-Форце»), а минеральный сорбент (бентонит) - декорпори-рующим действием, была выдвинута идея, что сочетанное применение этих препаратов может оказывать лечебное действие при комбинированном радиационном поражении, сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» проведены исследования по изучению лечебного действия этих препаратов при сочетанном применении их на фоне комбинированного радиационно-токсического (Фатерахманов JI.P. Комбинированное поражение животных гамма-радиацией и кадмием и применение средств терапии: Автореф. дисс... канд. биол. наук. - Казань, 2008 - 21с.), и радиационно-биологического (Гайзатуллин P.P. Иммунологические подходы к разработке средств экстраиммунной терапии при многофакторной экопатологии. Афтореф. дисс. д-ра биол. наук - Казань, 2012 - 35с.) поражений.

При этом важным, с точки зрения создания многофункционального монопрепарата, является то, что радиотерапевтический эффект противорадиационного лечебно-профилактического иммуноглобулина усиливается при комбинации его с фито («Эра-Н», «Эраконд») - и апипрепаратами («Вита-Форце»), а сочетание его с природным сорбентом - бентонитом, придает ему совершенно иное - сорбционно-детоксикационное (декорпори-рующее) свойство, усиливая не только радиотерапевтическое, но и декор-порирующее действие (Иванов A.B. Низамов Р.Н. Конюхов Г.В. и др. Способ лечения радиационно-кадмиевого поражения и способ получения препарата для лечения радиационно-кадмиевого поражения // Патент РФ № 2484830 от 20 июня 2013 г.).

С учетом отсутствия в литературе сведений о терапии сочетанных радиационных поражений, вызванных одновременно воздействием на организм внешнего (гамма-излучение) и инкорпорированного (цезий -137) облучения и в связи с актуальностью данной проблемы , с учетом установленной сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» принципиальной возможности конструирования полифункционального лечебно-диагностического композиционного препарата, были проведены настоящие исследования.

Цель и задачи. Целью работы является разработка технологии получения полифункционального лечебно-декорпорирующего композиционного препарата для лечения внешнего и инкорпорированного радиационного поражения организма.

Исходя из вышесказанного на решения были поставлены следующие задачи:

1. Теоретически обосновать возможность получения композиционного лечебно-декорпорирующего препарата при сочетанном воздействии на организм внешнего (у-лучи) и инкорпорированного (цезий-137) облучения.

2. Изготовить сыворотку и тканевые глобулины.

3. Получить высокодисперсную фракцию природного сорбента-бентонита.

4. Изготовить композиционный сорбент на основе глобулинов и бентонита.

5. Оценить безопасность применения препарата «Ледеком», включая токсичность при подкожном, пероральном применении и отдаленные последствия (эмбриотоксичность, тератогенность, постнатальное развитие и др.) на лабораторных животных по принятым критериям.

6. Провести оценку иммуно-фармакологического лечебно-декорпорирующего действия препарата в in vitro и in vivo тест-системе.

Научная новизна. На основании изучения биологической совместимости препаратов глобулинов, апипродуктов и сорбционно-декор-порирующего агента впервые сконструирован лечебно-декорпорирующий композиционный препарат «Ледеком» (глобулин+аписоген+бентонит) для лечения поражений внешним (у-лучи) и инкорпорированным (цезий-137) облучением животных; в модельных (культивируемые клетки крови и контаминированные пробы воды) и в опытах in vivo (лабораторные животные) установлена высокая радиотерапевтическая и декорпорирующая активности препарата как при изолированном, так и сочетанном действии на организм электромагнитного (у-лучи) и корпускулярного излучений; показано, что радиофармакологическое действие разработанного препарата на пораженных внешним и инкорпорированным облучением животных реализуется посредством гемопротекторного, детоксицирующего, иммуно-протекторного действий глобулинов, антиоксидантного и антибактериального действий апипродуктов, сорбционно-детоксикационного и декорпори-рующего действий микрочастиц природного минерала - бентонита.

Теоретическая и праетическая значимость. Полученные данные указывают на фундаментальность концепции радиационной фармакологии о том, что многокомпонентные смеси на основе веществ различных классов соединений (фито-, зоо- и минерального происхождения) обладают полифункциональными свойствами, значительно расширяя спектр биологического действия отдельных компонентов радиозащитных средств. Выбранная модель конструирования лечебно-декорпорирующего препарата может быть использована для направленного поиска радиозащитных средств из различных классов и создания многофункциональных монопрепаратов.

Практическая значимость работы заключается в том, что для лечения подвергнутых сочетанному внешнему и инкорпорированному облучению животных предложено композиционное лечебно-декорпорирующее средство

«Ледеком», оказывающее как радиотерапевтическое, так и декорпорирующее действие на пораженный двумя видами ионизирующих излучений организм.

Получение и применение радио-фармакологического препарата регламентируется разработанной нормативно-методической документацией, утвержденной в установленном порядке.

Методология и методы исследований. Исследования выполнены в 2010-2013 гг. в лаборатории радиационной иммунологии ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» г. КазаЕ1ь, в соответствии с планом НИР (№ государственной регистрации - 01200202604). Методологической основой проведенных исследований являлось обоснование возможности конструирования монопрепарата, сочетающего в себе свойства отдельных компонентов, приводящих не только к аддитивному, но и потенцирующему действию составляющих его компонентов.

Исследования проводились на 120 белых мышах живой массой 18-20 г., 78 белых крысах живой массой 180-200 г., 10 кроликах. Животных подбирали по принципу аналогов с учетом породы, возраста, пола и массы. Условия проведения опытов, схемы, вид и количество используемых животных, дозировки, кратность применения препарата приведены в соответствующих разделах. Кормление животных осуществляли с общепринятыми нормами с учетом технологических особенностей для разных видов животных

Моделирование внешнего облучения, вызывающего острую лучевую болезнь легкой, средней и тяжелой степени осуществляли путем облучения лабораторных животных на установке «Пума» в дозах соответственно: 6,08,0 Гр (белые мыши), 7,0-9,0 Гр (белые крысы). Моделирование внутреннего облучения осуществлялось путем подкожного введения водного раствора цезия-137 с удельной активностью 0,19 кБк/см3 животным в дозе: 0,2 мл белым мышам (30 Бк/г) и 0,5 мл (95 Бк/г) белым крысам что соответствует 0,01 ЛД5о для данного изотопа. Моделирование сочетанного внешнего и внутреннего облучения осуществлялось путем облучения белых мышей и белых крыс на гамма-установке «Пума» в дозах 6,0-8,0 Гр и 7,0-9,0 Гр соответственно и после этого животным подкожно вводили водный раствор цезия-137 в дозах 30 Бк (0,2 мг/гол белым мышам) и 95 Бк (0,5 мг/гол белым крысам).

Накопление, распределение и выведение радиоцезия из организма контрольных и подверженных воздействию потенциальных лечебно-декорпорирующих композиций осуществляли путем радиометрирования проб из органов и тканей убитых животных в различные сроки после облучения, затравки изотопом и применения исследуемых препаратов животных с использованием гамма-счетчика «Компьюгамма».

Получение сывороток и антисывороток от подвергнутых различному физико-биологическому воздействию (иммунизация, облучение, лечение) животных-доноров, а так же выделение глобулинов из сывороток

осуществляли в соответствии с общепринятыми в иммунологии методами (Кэбот Е„ Мейер М.,1968)

Для получения тканевых глобулинов (гистоглобулинов) использовали методы гомогенизации и элюирования гемогенатов с последующим осаждением глобулинов сульфатом аммония и фракционированием, которые осуществлялись в соответствии с методическими указаниями Н.Н. Клемпарской (1972) в модификации Г.Фримеля (1987).

При изучении возможности усиления терапевтической эффективности испытуемых средств, с целью составления многокомпонентных смесей и композиций на основе веществ фито-зоо-аписогенного и минерального происхождения, определяли их совместимость, безвредность, токсичность, раздражающие свойства, эмбриотоксичность и тератогенность в соответствии с общепринятыми в токсикологии, иммунологии, вакциино-сывороточном деле сертифицированными методами.

Лечебно-декорпорирующее действие испытуемого средства оценивали по степени коррекции клинико-иммунологических показателей, интегральному показателю - 30 суточной выживаемости и их декорпорирующей активности.

Коррекцию клинического статуса пораженных двумя видами ионизирующих излучений и леченных испытуемыми средствами животных оценивали по степени модификации течения лучевой болезни, гемопротекторному (ингибирование панцитопении), иммунорегуляторному индексу (Th/Ts), по И.П. Кондрахину (2004), состояние гуморального иммунитета (синтез иммуноглобулинов, бласт-трансформации лимфоцитов) оценивали по Д.К. Новикову (1993), состояние клеточного иммунитета- по уровню Т- и В - лимфоцитов, субпопуляции Т-лимфоцитов - по Г.Фримелю (1987), уровень липидных радиотоксинов (МДА)- по М.С.Гончаренко и А.М Латиновой (1985), хиноидных радиотоксинов - в РБФ тест-системе - по P.P. Гайнуллину (2009), содержание общего белка рефрактометрическим методом, фракции белков и глобулинов - турбодиметрическим, состояние факторов неспецифической резистентности (лизоцимной активности сывороток крови) - по В.Г.Дорофейчуку (1968), бактерицидной активности сывороток крови в отношении E.coli шт.18 - нефелометрически по О.В.Бухарину (1979), фагоцитарную активность крови - по Е.А.Кост и М.И. Стенко (1975), состояние прооксидантно-антиоксидантной системы (ПАОС) - по уровню супероксидазных радикалов и антирадикальных ферментов (супероксиддисмутазы - СОД и каталазы - КАТ) по М.А.Королюк (1988), уровню декорпорации '"Сз-радиометрически по общепринятой в радиобиологии методике (Москалев Ю.И.,1970).

Полученный в ходе экспериментов цифровой материал подвергали статистической обработке с использованием общепринятых математических методов, степень достоверности различий между сравнительными показателями определяли по критерию Стьюдента с применением программ «Microsoft Word 2007», «Microsoft Excel 2007».

Для проведения исследований использовали следующие сыворотки и глобулины: антисыворотка к радиозащитному микробному полиантигену (МПАГ), антисыворотка к лучевому антигену (радиотоксину), сыворотка животных - реконвалесцентов, выживших после облучения в полулетальных дозах, сыворотка животных, выживших после облучения в летальной дозе, сыворотка выживших животных после летального облучения и лечения противорадиационным лечебно-профилактическим глобулином, сыворотка животных, подвергнутых двукратному облучению в сублетальной и летальной дозах животных, элюаты из органов и тканей (печени, почек, селезенки, лимфатических узлов, кожи, мышц, толстого и тонкого отдела кишечника, яичников, семенников, костного мозга), взятые от животных-доноров сывороток и антисывороток вышеперечисленных животных; глобулины, выделенные из вышеперечисленных сывороток и глобулинов, выделенных из элюатов органов и тканей животных - доноров вышеперечисленных сывороток и антисывороток.

В качестве лечебно-профилактических средств были использованы средства фитогенного и микробного происхождения: апифитопрепараты «Вита-Форце», «Вита-Форце М», «Эра-Н», «Эраконд», противорадиационный лечебно-профилактический иммуноглобулин (ПЛПИ), экспериментальная серия лечебно-декорпорирующей композиции ПЛПИ + бентонит, ПЛПИ + «Вита-Форце» + бентонит.

В качестве потенциальных сорбентов использовали: ХЖ-90, «Бифеж», цеолит, хитозан, апизан, бентонит, метаболиты В.5иЫШз, травяную, хвойную муку, пчелиный подмор, чагу, прополис, воск, восковую моль, маточное молочко, трутневый и пчелиный расплод, обножку, пергу, 17 вариантов композиций на основе веществ растительного, животного, микробного и минерального происхождения.

В выполнении отдельных этапов диссертационной работы принимали участие к.б.н., с.н.с. К.Т. Ишмухаметов, к.б.н. с.н.с. М.М. Шакуров., к.б.н., с.н.с. И.Р. Юнусов, которым автор выражает искреннюю благодарность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Технология получения композиционного препарата с полифункциональными свойствами.

2. Радиофармакологическое действие препарата при изолированном воздействии внешнего и внутреннего облучения.

3. Иммунофармакологическое действие препарата при сочетанном двухфакторном радиационном поражении.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждена комплексными исследованиями. Акт комиссионных испытаний утвержден директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Статистическая обработка, расчеты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов гематологических, биохимических и радиометрических исследований,

положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументированно отражают содержание диссертации.

Материалы по теме диссертации доложены на ежегодных сессиях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по рассмотрению отчетов и НИР (Казань. 2010-2013), а также на Международном симпозиуме «Биохимия -основа наук о жизни», посвященном 150-летию кафедры биохимии КФУ (ноябрь, 2013 г., Казань).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, списка использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 24 таблицами. Список литературы включает 171 литературный источник, в том числе 48 зарубежных авторов.

2.0СН0ВН0Е СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 Получение препаратов иммуноглобулинов - одного из основных компонентов композиционного лечебно-декорпорирующего средства

Для получения сывороточных глобулинов животных однократно подкожно иммунизировали радиозащитным полиантигеном в дозе 0,5 см (1-ая группа), подвергали двукратному (0,1+10,9 Гр) гамма-облучению (2 группа), облучению в летальной дозе (11,0 Гр) и через 24 ч лечению противорадиационным лечебно-профилактическим иммуноглобулином (ПЛПИ) путем однократного подкожного введения препарата в дозе 1,0 см (3-я группа).

Для получения тканевых глобулинов (гистоглобулинов), животных всех групп, подвергнутых вышеперечисленным воздействиям (иммунизация, облучение, лечение), убивали, извлекали внутренние органы (печень, почки, селезенка, лимфатические узлы, сердце, мышцы, кожа, толстый и тонкий отдел кишечника, яичники, семенники, костный мозг). Из сывороток крови и тканевых экстрактов вышеуказанных животных выделяли глобулины путем высаливания сульфатом аммония.

Условия и количество полученных глобулинов приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, в результате проведенных в этой серии опытов нами были получены 37 вариантов сывороточных и тканевых глобулинов.

Полученные на первом этапе работы сыворотки и тканевые глобулины в следующей серии опытов были испытаны на противолучевые свойства в модельной ¡п-укго тест системе.

Для моделирования радиационного поражения, лимфоциты подвергали облучению в различных дозах у-лучей. Установлено, что полное ингиби-рование роста и развития клеток модельной тест-системы (лимфоцитов периферической крови) происходит при облучении их в дозе 5,0 Гр.

Таблица 1 - Физико-биологическое воздействие на доноров иммуноглобулинов_______________

Группа Кол-во животных (кролики) Характер воздействия на донора

I 5 1-кратная подкожная иммунизация кроликов МПАГ (микробный полиантиген) в дозе 0,5 см и взятие крови через 10, 20 и 30 дней

II 5 2-кратное (0,1+10,9 Гр) гамма-облучение и взятие крови через 10, 20, 30 дней

III 5 Лечение противорадиационным лечебно-профилактическим иммуноглобулином (ПЛПИ) через 24 ч после легального (11,0 Гр) облучения животных путем однократного п/к введения препарата в дозе 25 мг/кг

Результаты скрининговых исследований в первой серии опытов данного этапа работы показали, что из испытанных 37 потенциальных иммунопротекторов, 3 препарата обладали достаточно высокими радиозащитными свойствами, обеспечивая выживаемость 69,7-74,9 % летально облученных лимфоцитов (табл. 2).

Таблица 2 - Радиозащитная активность сывороточных и тканевых глобулинов на облученных в дозе 5,0 Гр лимфоцитах (время инкубации-48 ч)

Вариант Инкубирование лимфоцитов на среде, содержащей Выживаемость лимфоцитов, (%)

I Глобулины из антисывороток к микробному полиантигену (ГАС МПАГ) 74,9

II Глобулины из сывороток леченных ПЛПИ летально облученных животных 74,5

III Глобулины из тонкого отдела кишечника иммунизированных МПАГ животных 69,7

Контроль Противорадиационный лечебно-профилактический глобулин (ПЛПИ) 75,0

Из таблицы 2 видно, что наиболее активными радиозащитными свойствами обладали: глобулины из антисывороток к МПАГ (ГАС МПАГ), глобулины из сывороток леченных ПЛПИ летально облученных животных, глобулины из тонкого отдела кишечника иммунизированных МПАГ животных, которые были в дальнейшем использованы в качестве потенциальных компонентов лечебно-декорпорирующего средства.

2.2 Получение и подготовка технологического сырья для изготовления сорбентов радиоцезия

Учитывая, что в настоящее время уделяется значительное внимание использованию сорбентов фитогенного, микробного и зоогенного происхождения, провели испытания декорпорирующей активности препаратов в

отношении цезия-137. Были испытаны отобранные потенциальные сорбенты растительного (люцерна, травяная, хвойная мука, препараты «Эра-Н», «Эраконд», березовый гриб - чага), животного (кровяная мука, хитозан из крабовых), аписогенного (продукты пчеловодства: прополис, перга, обножка, пчелиный расплод, маточное молочко, восковая моль, пчелиный подмор, композиция, включающая продукты пчеловодства - «Вита Форце»), микробного (порошки B.subtilis, B.bifidum) и минерального (бентонит) происхождения, а в качестве контрольных регламентированных сорбентов использовали препараты «Бифеж» и «ХЖ-90». Из перечисленных потенциальных сорбентов готовили навески в количествах, рекомендованных для их оценки в условиях in vitro - от 0,1 до 1,0 г.

Сорбционную активность испытуемых препаратов определяли по формуле: Са = ( А|/А0)-100, где: Са- сорбционная способность, %;

А0- активность эталонного раствора 137Cs, равная 6,16 кБк/мл; А| — активность n7Cs в фильтрате, Бк/мг.

Результаты определения сорбционной способности, взятых в опыт сорбентов в отношениях радионуклида l37Cs, представлены в таблице 3.

Из данных таблицы видно, что наиболее активными из фитопрепаратов оказались «Вита-Форце», а из минеральных сорбентов очищенная фракция бентонита.

Таблица 3 - Сорбционная способность потенциальных сорбентов в отношении радиоцезия в ¡п-уИхо тест системе __

Исходная Остаточная Сорбционная

Сорбент активность активность активность,%

растворов, кБк/мл растворов, кБк/мл

1 2 3 4

Порошок люцерны 6,16 5,75 6,71 ±0,59

Травяная мука 6,16 5,84 5,19 ±0,32

Хвойная мука 6,16 5,79 5,93 ±0,51

Порошок препарата «Эра-Н» 6,16 5,78 6,01 ± 0,77

Порошокпрепарата «Эраконд» 6,16 5,81 5,57 ±0,81

Порошок чаги 6,16 5,74 6,79 ± 0,75

Кровяная мука 6,16 5,86 4,72 ± 0,33

Хитозан из крабовых 6,16 5,75 6,65 ±0,41

Хитозан из пчел - апизан 6,16 5,71 7.25 ±0,63

Прополис 6,16 5,84 5,15 ±0,21

Перга 6,16 5,91 4,12 ±0,45

Пчелиный подмор 6,16 5,66 8,11 ±0,95

Маточное молочко 6,16 5,85 5,03 ±0,71

Воск 6.16 5,90 4,21 ±0,19

Восковая моль 6,16 5,89 4,33 ± 0,25

Препарат «Вита-Форие» 6,16 5.61 8,85 ±0.13

Порошок В.subtil is 6,16 5.84 5,15 ±0,55

Продолжение таблицы 3

1 2 3 4

Порошок B.bifidum 6,16 5,92 3,93 ±0,47

Бентонит нативный (контроль I) 6,16 2,03 67,01 ± 0,85

Бентонит очищенный 6,16 1,42 77,00 ±0,93

Препарат «Бифеж» (контроль И) 6,16 0,91 85,19 ±2,35

Препарат «ХЖ-90» (контроль III) 6,16 1,65 73,25 ± 0,76

2.3 Конструирование экспериментального образца полифункционального лечебно-декорпорирующего биорадиопротектора

Полученные данные по изучению активности иммуноглобулинов и сорбентов фитозоогенного и минерального происхождения послужили основанием для использования их при конструировании лечебно-декорпорирующего средства. При составлении лечебно-декорпорирующей композиции руководствовались тем, что составление композиции сывороточных и гистоглобулинов в определенных соотношениях могло бы привести к снижению расхода сывороточных глобулинов, с одной стороны и, вероятному повышению радиозащитной активности смеси глобулинов - с другой.

Для этой цели готовили различные объемные соотношения сывороточных и тканевых глобулинов, полученных из сывороток и элюатов тонкого отдела кишечника иммунизированных радиозащитным полиантигеном (МПАГ) кроликов, которые составляли следующие соотношения: ГАС МПАГ [I] : ГЭТОК МПАГ [И]: 0,9:0,1; 0,8:0,2; 0,7;0,3; 0,6:0,4; 0,5:0,5; 0,4:0,6; 0,3:0,7;0,2:0,8;0,1:0,9.

Полученные смеси сывороточных (СГ) и тканевых (ТГ) в указанных соотношениях были испытаны на радиозащитную активность в in vitro тест-системе с использованием облученных у-лучами глобулинов в дозе 5,0 Гр. Результаты опытов в in-vitro тест-системе показали, что наиболее оптимальной является композиция, состоящая из 0,7 объема ГАС МПАГ и 0,3 объема ГЭТОК МПАГ, которая обеспечивала выживаемость 76,8% пораженных у -лучами лимфоцитов. Кроме того, учитывая, что при сочетании иммуноглобулиновых препаратов с фитозооэкстрактами происходит усиление фармакологической активности иммуноглобулинов, провели опыты по сочетанию их с препаратом «Вита-Форце». Установлено, что наиболее активной оказалась композиция, состоящая из 0,6 объема глобулинов (ГАС МПАГ + ГЭТОК МПАГ, соотношение 0,7:0,3) и 0,4 объема 4% - ного раствора этанолового экстракта «Внта-Форце», которая обеспечивала 77,1% -ную выживаемость летально облученных лимфоцитов в in vitro тест-системе.

Учитывая, что сочетание иммуноглобулинов с минеральными сорбентами, в частности бентонитом, приводит к расширению их фармакологического действия (терапевтический и декорпорирующий эффект), провели исследования по составлению иммуноглобулино-бентонитового комплекса. Для перевода бентонита в суспензиеобразующее состояние провели очистку последнего методом селективного фракционирования с выделением микрочастиц размером 600-900 мкм.

Высокодисперсную фракцию бентонита растворяли в иммуноглобулине, получая композиционный препарат глобулин + очищенная фракция бентонита (ОФБ). Экспериментальным путем установлено, что оптимальное соотношение глобулина к бентониту составляет 9,8:0,2.

На основании полученных данных составлена инъекционная лечебно-декорпорирующая композиция «Ледеком», включающая: 0,6 частей смеси сывороточных и тканевых глобулинов (7:3), 0,4 частей - 4%-ного этанолового экстракта «Вита-Форце», в которой растворены высокодисперсные фракции бентонита (СОФБ) из расчета 2% к общему объему.

Учитывая, что в зависимости от радиоэкологической ситуации, при пролонгированном воздействии на организм экологических факторов (внешнее и внутреннее облучение) возникает необходимость длительного перорального использования препаратов сорбентов, параллельно готовили пероральную (порошковую) форму лечебно - декорпорирующего препарата. Для составления порошковой (пероральной) формы препарата «Ледеком» в расчете на 1 кг (масс. %) брали 600 г порошка «Вита-Форце», 150 г кровяной, 150 г - хвойной муки и 100 г бентонита (нативного, неочищенного).

2.4 Оценка безвредности и токсичности препарата «Ледеком» на лабораторных животных.

Перед испытанием препарата на лечебно - декорпорирующую активность провели оценку безвредности и токсичности (ЛД50, тератогенность, эмбриотоксичность, аллергезирующие и раздражающие свойства) препарата. Установлено, что при подкожном введении инъекционной формы препарата белым мышам, ЛД50 составляла 3283 мг/кг, а при парентеральном -2761 мг/кг. Полученные данные свидетельствуют о низкой токсичности препарата и согласно ГОСТу 12.1.00.7-76 он соответствует IV классу токсичности, не обладает тератогенным, эмбриотоксическим и аллергизирующим действием.

Таблица 4- Эмбриотоксичность препарата «Ледеком» для белых крыс

Показ атель Группы животных

Опытная Контрольная

Количество желтых тел 12,30 ± 0,33 12,35 ±0,21

Количество живых плодов 10,14 ± 0,15 10,10 ± 0.17

Продолжение таблицы 4

1 2 3

Количество мертвых плодов 0,97 ± 0,25 1,03 ±0,31

Доимплантационная гибель 9,93 ± 0,55 10,15± 0,43

Постимплантационная гибель 8,71 ±0,37 8,93 ± 0,57

Общая эмбриональная смертность,% 17,08 ±0,43 17,98 ±0,29

Выживаемость,% 81,23 ± 1,01 79,88 ± 1,27

Масса плода, г 2,91±0,13 2,88 ± 0,19

Дефекты развития нет нет

Использование в рационах взрослых животных и молодняка препарата «Ледеком» благоприятно влияет на потомство, повышает физиологический и иммунологический статус, росто-весовые качества животных, обладает стресспротективным и антиоксидантным действием, оказывает стимулирующее влияние на факторы неспецифической резистентности организма

2.4.1 Оценка радиозащитной активности препарата «Ледеком» на белых мышах

Для оценки радиозащитных свойств испытуемого препарата на основе глобулинов, апипрепарата «Вита-Форце» и очищенной фракции бентонита (ОФБ) («Ледеком»), опыты проводили на 108 былых мышах живой массой 18-20 г, разделенных на 9 групп по 12 животных в каждой. Животным 1-й группы за 24 ч до облучения однократно подкожно вводили инъекционную форму препарата «Ледеком» в дозе 25 мг/кг (0,5 мг/мышь) в объеме 0,1см3, предварительно разбавляя исходный (10%-ный) раствор в 20 раз, получая 0,5%-ный рабочий раствор с концентрацией сухого вещества 5 мг/см3; животным 2-й группы в идентичных условиях препарат вводили через 24 ч после облучения; 3-й группе в течение 15 дней до облучения скармливали порошковую форму препарата путем добавления ее в рацион из расчета 0,1 г/кг; 4-й группе в аналогичных условиях препарат скармливали в течение 15 сут после облучения; животным 5-й группы за 15 дней до и в течение 15 сут после облучения скармливали порошкообразную форму препарата из расчета по 0,1 г/кг корма; 6-й группе 1-кратно вводили инъекционную форму препарата и скармливали порошковую форму в течение 15 сут после облучения; 7-й группе однократно перорально вводили противорадиационный лечебно-профилактический иммуноглобулин (ПЛПИ) в дозе 0,1 см3 (0,5 мг/мышь, 25 мг/кг); животным 8-й группы препарат не вводили - они

служили контролем облучения; животных 9-й группы не облучали и препарат не вводили (биологический контроль). Моделирование острого радиационного поражения у животных осуществляли путем однократного внешнего облучения на гамма-установке «Пума» в летальной дозе (7,7 гр, ЛД 100/30). Контрольных, облученных и леченных животных содержали в идентичных условиях, ведя за ними динамическое клиническое наблюдение, регистрируя число павших и выживших животных.

Результаты экспериментов показали, что применение инъекционной и порошковой форм препарата «Ледеком» в 6 вариантах опыта оказывало радиозащитный эффект, обеспечивая выживаемость 50% (скарм-ливание порошковой формы в течение 15 сут до облучения), 58,3 (скармливание порошковой формы препарата в течение 15 сут после облучения), 61,6 (1-кратное п/к введение препарата за 24 ч до облучения), 75% (1-кратное п/к введение препарата через 24 ч после облучения) и 83,3% (1-кратное п/к введение инъекционной формы препарата и скармливание порошковой формы в течение 15 сут после облучения) случаев при радиационной гибели всех облученных животных в контрольной группе.

Результаты сопоставительного анализа данных показывают, что наиболее удобным и достаточно эффективным является парентеральный (подкожный) способ применения препарата, который обеспечивает выживаемость 75% летально облученных животных при 1-кратном подкожном введении препарата через 24 ч после облучения (лечебный вариант применения). Наиболее высокий лечебный эффект был достигнут при комбинированном парентеральном (1-кратное подкожное введение инъекционной формы препарата) и пероральном (скармливание порошковой формы препарата в течение 15 сут после облучения животных) применении препарата, который обеспечивал выживаемость 83,3% летально-облученных животных от радиационной гибели.

2.4.2 Изучение декориорируюшей активности препарата «Ледеком» и его компонентов при инкорпорации 137Сх в организм белых мышей

Для изучения сорбционной активности вышеуказанных веществ апи-фито- зоогенного происхождения (компонентов препарата «Ледеком») и композиционного препарата «Ледеком», опыты проводились на 160 белых мышах, разделенных на 8 групп по 20 - в каждой. Животные всех групп подвергали цезиевой затравке путем трехкратного с интервалом в 1 сут внутрижелудочного введения водного раствора цезия-137 с активностью 0,19 кБк/см3 (суммарная активность 0,57 кБк /животное или 4,0 кБк/кг).

Животным 1-й группы через 24 ч после последней затравки радиоцезием в течение 20 дней скармливали порошок «Апизан+бентонит» (АП+Б) из расчета 0,1 г/кг корма; животные 2-й группы в аналогичных условиях получали корм с добавлением композиции «пчелиный подмор + бентонит» (ПП+Б); 3-й группы - «Вита-Форце + бентонит» (ВФ+Б): 4-й

группы - очищенную фракцию бентонита (СОФБ); 5-я группа - «Вита-Форце» + очищенная фракция бентонита (ВФ + СОФБ); 6-я группа -композиционный препарат «Ледеком»; 7-я группа - регламентированный сорбент «Бифеж» (контроль сорбента); 8-я группа получала в аналогичных условиях и количествах дистиллированную воду (контроль изотопа).

Через 10 и 20 сут после затравки и кормления животных потенциальными сорбентами были убиты по 10 мышей из каждой группы, извлечены внутренние органы и взяты пробы для радиометрирования на предмет распределения, накопления и выведения радиоцезия из организма. Из испытанных 6 потенциальных сорбентов, приготовленных на основе апизана, подмора пчел, «Вита-Форце», бентонита, очищенной (суспензие-образующей) фракции бентонита и их композиции («Ледеком»), наиболее высокой сорбционной активностью обладал композиционный препарат «Ледеком», который обеспечивал выведение изотопа из печени на 70%, из легких - на 49,70%, из мышц - на 51,48%, из селезенки - 45,01%, из сердца на 27,87 и из почек на 28,57%. При этом, к концу 10 сут после затравки и кормления животных рационом, содержащим препарат «Ледеком», остаточная радиоактивность в организме составляет 54,3% от введенного количества изотопа. Результаты сопоставительного анализа результатов радиометрирования показали, что при использовании контрольного (регламентированного) сорбента («Бифеж») остаточная радиоактивность через 10 дней после кормления животных составляла 71,5 % от введенного количества изотопа, что уступает по сорбционной активности испытуемому сорбенту «Ледеком» в 1,32 раза(Р<0,01).

20-суточное кормление затравленных '"Се белых мышей испытуемым препаратом вызывало существенное изменение метаболизма изотопа в организме, активно связывая радионуклид и ускоряя выведение его из организма. К концу опыта остаточная радиоактивность в организме 3-хкратно затравленных мышей на фоне кормления препаратом «Ледеком» составляла 42,7% от контрольных значений, что в 2,34 раза меньше, чем у затравленных животных. При этом радиоактивность органов образовывала следующий убывающий ряд: почки > сердце > селезенка >легкие > мышцы печень. В отличие от опытной группы, распределение изотопа в органах контрольной группы (контроль сорбента) на фоне применения регламентированного сорбента «Бифеж» имело следующий характер: сердце > почки > селезенка > легкие > мышцы > печень. При параллельном изучении распределения, накопления и выведения радиоизотопа из организма установлено, что метаболизм радионуклида имел некоторые отличительные особенности от таковых опытной и 1-й контрольной групп. Так, органы и ткани животных 2-й контрольной группы по радиоактивности образовывали следующий убывающий ряд: селезенка> легкие > сердце > почки > мышцы > печень.

2.4.3 Оценка лечебно-декорпорирующей способности препарата «Ледеком» при сочетанном внешнем и инкорпорированном облучении

организма животных

Опыты проводились на 108 белых крысах живой массой 180-200 г, разделенных на 12 групп по 9 - в каждой. Животных 1-й группы облучали на гамма-установке «Пума» в дозе 8,7 Гр; животным 2-й группы внутри-желудочно вводили водный раствор цезия - 137 в дозе 1,44 кБк/кг; 3-ю группу облучали в дозе 7,0 Гр и вводили '"Сб (1,44 кБк/кг); 4-ю подвергали аналогичному сочетанному воздействию и в течение 30 дней задавали порошковую (пероральную) форму препарата «Ледеком» из расчета 0,1 г/кг корма; облученным (у-лучи) и затравленным ('"Се) в вышеуказанных дозах животным 5-й группы через 24 ч после радиационного воздействия вводили 1-кратно подкожно инъекционную форму препарата «Ледеком» в дозе 25 мг/кг по сухому веществу; облученным (у-лучи) и затравленным ( Сб) в вышеуказанных дозах животным 6-й группы однократно подкожно вводили композицию «Глобулин + суспензиеобразующая фракция бентонита» (ОФБ) в дозе 25 мг/кг по сухому веществу; облученным (у-лучи) и затравленным ('"Сэ) в вышеуказанных дозах животным 7-й группы через 24 ч после радиационного воздействия 1-кратно подкожно в вышеуказанной дозе вводили инъекционную форму препарата «Ледеком», в течение 15 сут кормили рационом, содержащим порошковую форму указанного препарата из расчета 0,1 г/кг корма; животным 8-й группы за 5 дней до сочетанного радиационного воздействия задавали с кормом порошок «Ледеком» (0,1 г/кг) и через 24 часа после облучения и затравки 1-кратно подкожно вводили инъекционную форму препарата и в течение 10 дней задавали с кормом порошок «Ледеком» (0,1 г/кг); животным 9-й группы за 24 ч до сочетанного радиационного воздействия 1-кратно подкожно вводили инъекционную форму препарата «Ледеком» (25 мг/кг) и в течение 15 сут после облучения (улучи 8,7 Гр) и затравки (П7Ся, 1,44 кБк/кг) кормили порошковой формой препарата (0,1 г/кг); животным 10-й группы через 24 ч после сочетанного радиационного воздействия в вышеуказанных условиях 1-кратно подкожно вводили противорадиационный лечебно-профилактический иммуноглобулин

(ПЛПИ) в дозе 25 мг/кг (контроль лечебного препарата); облученным (улучи) и затравленным ('"Сб) животным 11-й группы в течение 30 сут после сочетанного радиационного воздействия задавали корм, содержащий регламентированный сорбент «Бифеж» по 0,1 г/кг корма (контроль сорбента); животных 12-й группы не облучали, не затравливали, никакие препараты не давали - они служили биологическим контролем (табл.5).

Из данных таблицы видно, что из всех испытанных схем применения препарата «Ледеком» на фоне сочетанного (внешнее и внутреннее) радиационного поражения организма оптимальной является схема (вариант IX) предполагающая 1-кратное подкожное введение инъекционной формы препарата (25 мг/кг) за 24 ч до и кормление в течение 15 сут порошковой

формой препарата (0,1 г/кг корма) после внешнего (у-лучи) и внутреннего (137 Сэ) облучения животных.

Таблица 5 — Лечебно-декорпорирующая активность препарата «Ледеком» в зависимости от схемы применения препарата на подверженных сочетанному радиационному воздействию животных

п=9

Вариант опыта Группа животных. Условия воздействия и лечения Выживаемость, % Степень декорпораци и,изотопа,%

I 1-я (у-лучи-8,7 Гр) П,1 0

II 2-я ('3' Cs, 1,44 кБк/кг) 88,8 3,17

III 3-я (у-лучи -7,0 Гр +'■" Cs, 1,44 кБк/кг) 0 2,01

IV 4-я (у-лучи -8,7 Гр+'~" Cs, 1,44 кБк/кг + порошок препарата «Ледеком»-0,1 г/кг корма в течение 30 дней) 66,6 62,7

V 5-я (у-лучи -8,7 Гр+И' Cs, 1,44 кБк/кг +1-кратное подкожное введение через 24 ч после радиационного воздействия инъек-ционной формы препарата «Ледеком» в дозе 25 мг/кг по сухому веществу 55,5 59,3

VI 6-я (сочетанное радиационное воздействие по варианту III + 1-кратно п/к композиция «Глобулин + суспензиеобра-зующая фракция бентонита (СОФБ) в дозе 25 мг/кг 66,6 69,5

VII 7-ая (облучение + затравка по варианту III+1 кратно п/к введение «Ледеком» и в течение 15 сут кормление пероральной формой препарата в дозе 0,1 г/кг корма 77,7 76,9

VIII 8-я (кормление порошком «Ледеком» в течение 5 дней до радиационного воздействия по варианту III + через 24 ч после сочетанного радиационного воздействия 1-кр. п/к введение инъек-ционной формы препарата «Ледеком» (25 мг/кг) + в течение 10 сут кормили порошком препарата по 0,1 г/кг корма. 77,7 79,3

IX 9-я (за 24 ч до сочетанного рад. воздействия 1-кр. п/к вводили препарат «Ледеком» (25 мг/кг) и втеч. 15 сут после рад. воздействия кормление порошковой формой препарата (0,1 г/кг) 88,8 80,9

X 10-я (через 24 ч после сочет. рад. воздействия 1-кратно п/к вводили ПЛПИ (25 мг/кг) - контроль лечебного препарата 55,5 19,8

XI 11-я (в течение 30-сут после сочетанного радиационного воздействия задавали корм с регламентированным сорбентом «Бифеж» по 0,1 г/кг корма (контроль сорбента) 22,2 33,5

XII 12-я - биологический контроль 100 0

п/к - подкожное введение, ПЛПИ - противорадиационный лечебно-профилактический иммуноглобулин.

Выживаемость легально облученных животных при указанном варианте применения препарата составила 88,8% при 100% гибели подверженных сочетанному радиационному воздействию животных Степень декорпорации изотопа 137 Сз при этом составила 80,9% против 33,5 /о в контроле (регламентированный препарат «Бифеж»), а выживаемость пораженных двумя различными видами ионизирующих лучей животных на фоне применения известного сорбента составляла 22,2%.

2.4.3.1 Модификация сочетанного радиационного поражения на фоне применения препарата «Ледеком»

Результаты динамического наблюдения за облученными (у-лучи), затравленными ('"Сз) и леченными испытуемыми средствами животными показали, что применение препарата «Ледеком» и его компонентов оказывало существенное влияние как на течение, так и исход сочетанного радиационного поражения. Сочетанное внешнее и внутреннее облучение белых крыс оказывало гемотоксический эффект, сопровождавшийся угнетением гемопоэза с подавлением всех основных ростков костномозгового кроветворения: эритроидного, нейтрофильного и лимфоидного. При этом у облученных и затравленных 137С5 крыс к 28-м сут количество гемоглобина снизилось в 2,46 раза (Р<0,001), эритроцитов - в 4,0 раза (Р<0,001) , лейкоцитов - в 2,33 раза (Р<0,01), нейтрофилов - в 2,9 раза (Р<0 001) количество эозинофилов увеличилось в 2 раза (Р<0,01) и количество лимфоцитов снизилось в 2,28 раза (Р<0,01).Применение препарата «Ледеком» на фоне сочетанного двухфакторного радиационного поражения оказывало гемопротекторный эффект, предупреждая развитие пострадиа-ционного панцитопенического и миелосупрессорного эффекта -снижение количества клеток как эритроидного, так и нейтрофильного и лимфоидного ростка имели недостоверные отличия от контрольных (необлученных) животных. Также были проведены исследования по изучению факторов неспецифической резистентности организма (НРО) на фоне двухфакторного радиационного поражения и применения радиофармакологического препарата «Ледеком». Сочетанное воздействие на организм внешнего (у-лучи) и внутреннего (,3 Сз) облучения оказывало иммунотоксический эффект, подавляя все изученные факторы НРО. При этом значения бактери-цидной активности сыворотки (БАСК) были снижены в 2 78 раза (Р < 0,001), лизоцимная активность - в 2,0 раза (Р < 0,01), фагоцитарный индекс - в 1,85 раза (Р < 0,05). Однократное подкожное введение инъекционной формы препарата «Ледеком» (25 мг/кг) и кормление порошковой формой препарата в течение 15 дней после сочетанного радиационного воздействия оказывало иммуно-протекторное действие, сохраняя стабильность показаний БАСК, ЛАСК и ФИ, значение которых к исследованному сроку недостоверно отличались от контрольных значении (Р >0,05).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Разработанны инъекционная (в виде 10%-ного раствора глобулинов и водно-этанолового экстракта) и оральная (порошковая) формы металлофитоглобулиновой композиции «Ледеком», состоящей из 4,2 частей сывороточных, 1,8 частей тканевых глобулинов, 3,8 частей 4%-ного этанолового экстракта апифитопрепарата «Вита-Форце» и 0,2 частей высокодисперсной фракции монтморрилонита, обладающие гемопротекторным, иммунокоррегирующим, антиоксидантным и радиозащитным эффектами.

2. В опытах на белых мышах, белых крысятах и кроликах установлено, что при пероральном и подкожном введении препарат является малотоксичным (ЛД50 для белых мышей при пероральном поступлении составляет 3950 мг/кг, а при парентеральном - 2761 мг/кг), не обладает тератогенным, эмбриотоксическим и раздражающим действиями, в дозе 25 мг/кг (по сухому веществу) препарат оказывает лечебно-декорпорирующее действие на пораженных внешним и инкорпорированным облучением, а также стимулирующее действие на интактных животных.

3. При длительном (в течении 30 суток) скармливании препарата «Ледеком» в дозе 0,1 г/кг корма у животных наблюдалось увеличение живой массы на 12,4 %, привесов - на 13,9 %, гемоглобина - на 1,05%, лейкоцитов -на 1,01%, эритроцитов - на 1,05%, нейтрофилов на 4,7 %, субпопуляционного (иммунорегуляторного ТЬ/Тб) индекса в 1,14 раза.

4. Пероральное поступление препарата в организм крыс в течение 10 сут в дозе 25 мг/кг оказывало стимулирующее действие на факторы неспецифической защиты, увеличивая содержание общего белка в 1,19 раза, альбуминов - в 1,13 раза, а-глобулинов - в 1,14 раза, Р-глобулинов - в 1,24 раза, у-глобулинов - в 1,24 раза, бактериальной активности сывороток крови -в 1,06 раза, лизоцимной -в 1,09 раза, фагоцитарной активности нейтрофилов - в 1,04 раза по сравнению с контролем.

5. Предварительное (за 7 дней до иммобилизации) пероральное применение препарата в дозе 25 мг/кг оказывало стресспротективное действие, уменьшая выраженность деструктивных изменений внутренних органов белых крыс, снижая концентрацию пероксирадикапов на 35 % при одновременном сохранении концентрации антиоксидантного фермента -супероксиддисмутазы (СОД).

6. Однократное подкожное введение инъекционной формы (25 мг/кг по сухому веществу) за 24 ч до и кормление пероральной (порошковой) формой (0,1 г/кг корма) препарата в течение 15 сут после внешнего (у-лучи, 8,7 Гр) и внутреннего ('"Сб, 1,44 Бк/кг) облучения обеспечивало 88,8 % - ную выживаемость облученных и затравленных белых крыс при 80,9 %-ной декорпорации изотопа из организма

7. Повышение выживаемости пораженных внешним (у-лучи) и внутренним ('"Сэ) облучением животных на фоне применения препарата

«Ледеком» сопровождалось более легким клиническим течением острой лучевой болезни , блокированием радиоиндуцированной панцитопении ( в среднем - в 1,45 раза), повышением факторов неспецифической резистентности в 1,04 - 1,24 раза, иммунокоррецией (повышение иммунорегуляторного индекса в 1,14 раза), ингибированием активности супероксидных радикалов в 2,35 раза и изменением метаболизма "'Сэ путем ионообменной десорбции изотопа монтморрилонитом и хитозаном , входящих в состав препарата «Ледеком».

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для лечения радиопатологии, вызванной раздельным или сочетанным действием на организм различных по природе ионизирующих излучений (внешнее и внутреннее облучение) для фармакотерапии лучевой болезни и декорпорации радиоцезия из организма предложен композиционный препарат «Ледеком», обладающий высоким лечебно-декорпорирующим потенциалом, обеспечивающий 83,3%-ную выживаемость летально облученных животных и ускоряющий выведение радионуклида из организма.

Для лечения одного или двухфакторного поражения организма организма у -радиацией и инкорпорацией радиоцезия, препарат вводят однократно подкожно за 24 ч до или через 24 ч после облучения, а при сочетанием внешнем и внутреннем облучении дополнительно скармливают пероральную (порошковую) форму препарата в течении 15 сут после облучения в количестве 0,1 г/кг корма.

2. Получение и применение препарата регламентируется разработанной нами инструкцией «По изготовлению и контролю радиозащитного препарата на основе специфических антител и природного сорбента», утвержденной зам. директора ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Конюхов Г.В.. К проблеме поиска средств защиты при поражении животных ионизирующим излучением/ Г.В.Конюхов, Р.Д.Гареев, Р.М.Асланов, Н.Б.Тарасова, В.И.Великанов, К.В.Сычев // Ветеринарный врач.-2012.-№6-С.20-23. *

Сычев К.В. Влияние гетерологичного глобулина на метаболизм радионуклидов в организме / К.В.Сычев, Г.В. Конюхов, Р.Н. Низамов, Н.Б. Тарасова // Сборник трудов международного симпозиума «Биохимия-основа наук о жизни», посвященного 150-летию образования кафедры биохимии Казанского университета (21-23 ноября 2013 г., Казань)-С.124-125.

Сычев K.B. Оценка токсичности и безвредности натуральной биологически активной кормовой добавки «Вита-Форце» / К.В.Сычев, Р.Н.Низамов, Г.В.Конюхов//Ветеринарный врач.-2013.-№6-С.6-7. *

Сычев К.В. Препарат на основе иммуноглобулинов, обладающий иммуностимулирующим действием / К.В. Сычев, Н.Б. Тарасова, Г.В. Конюхов, К.Н. Вагин // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - 2014.-Т.217.- С.255-260. *

Сычев К.В. Получение композиционного препарата «Ледеком» для лечения сочетанного внешнего и внутреннего радиационного поражения / К.В. Сычев //Сборник трудов молодежной научно-практической конференции «Биомедицина, биотехнология и экологическая безопасность: достижение молодых ученых и специалистов Евразии» (11 апреля 2014 г., Казань) — принято в печать

Иванов A.B. Модификация сочетанного радиационного поражения на фоне применения препарата «Ледеком» / A.B. Иванов, Р.Н. Низамов, К.В. Сычев, P.P. Гайзатуллин // Тезисы докладов VII съезда по радиационным исследованиям (21-24 октября 2014 г., Москва) - принято в печать.

^-статьи, рекомендуемые ВАК РФ

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36,564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 17.04.2014 г Печл. 1,4 Заказ М К-7387. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сычев, Константин Владимирович, Казань

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ

И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

ИЗЫСКАНИЕ СРЕДСТВ ТЕРАПИИ ПРИ СОЧЕТАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ ВНЕШНЕГО И ВНУТРЕННЕГО ОБЛУЧЕНИЯ

03.01.01 - радиобиология 06.02.03 -ветеринарная фармакология с токсикологией

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

04201459555 СЫЧЕВ КОНСТАНТИН ВЛАДИМ

à правах рукописи

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук, профессор Низамов Р.Н. доктор биологических наук Гайзатуллин P.P.

Казань-2014

1.ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

В реальных условиях животные и человек могут подвергаться не только изолированному внешнему или внутреннему облучению, но и сочетанному воздействию обоих факторов (Москалев Ю.И., Егорова Г.М., Шишкин В.Ф., Биологическое действие при сочетанном действии у-лучей 60Со и 13'i // Сб. работ под редакцией проф. JI.A. Ильина, Ю.И. Москалева - М.: Медицина, 1970. С.173-177.). Предполагается, что внешнее и внутреннее облучение во всех случаях суммируются (Корнеев H.A., Сироткин А.Н., Основы радиоэкологии сельскохозяйственных животных. - М.: Энергоатомиздат, 1987. - 208 е.). Вместе с тем, в литературе имеется ряд сообщений о взаимоослабляющем действии общего гамма-облучения и местного облучения щитовидной железы радиоактивным йодом (Козлова A.B. Последствия взрывов атомных бомб в Херосиме и Нагасаки и водородной бомбы в Бикини. - М.: Медгиз, 1957. - 230 е.). Однако другие данные об особенностях биологического действия ионизирующей радиации при сочетанном воздействии общего гамма-облучения и дополнительного изолированного облучения организма инкорпорированными радионуклеидами опровергают это положение. По данным японских и отечественных исследователей в случае сочетанного внешнего и внутреннего облучения лучевое поражение протекает тяжелее, чем при общем облучении. При этом поражение желудочно-кишечного тракта и системы иммуногемопоэза несет более выраженный характер, сопровождающийся возникновением острого лучевого синдрома, обусловленного, главным образом, внешним облучением (Василенко И.Я., Классовский Ю.А., Малахов Н.Ф. и др. Особенности течения острой лучевой болезни при общем влиянии у - облучения в сочетании с местным облучением щитовидной железы радиоактивным йодом. // Распределение, кинетика обмена и биологическое действие радиоактивных изотопов йода: Сб. работ под ред. проф. JI.A. Ильина, Ю.И.Москалева - М.: Медицина, 1970. С.221-

231. Калистратова B.C., Оксентюк Г.С., Крюк В.Ф. К вопросу о биологическом действии 13,1 и сочетанных формах их поражения // Распределение, кинетика обмена и биологическое действие радиоактивных изотопов йода. — М.: Медицина, 1970. - С.190-196.).

Полиорганная и полисистемная радиационная патология, вызванная сочетанным действием на организм животных внешнего и инкорпорированного облучения создает существенные трудности для терапии таких поражений, что диктует необходимость изыскания более эффективных методов и средств противорадиационной защиты.

Степень разработанности проблемы

В результате целенаправленных исследований по изысканию средств противорадиационной защиты сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в последние годы разработана технология изготовления радиозащитных средств на основе веществ зоогенного (сыворотка крови, лимфа, глобулины), микробного (радиозащитный полиантиген), апифитогенного (Вита-Форце) и детоксико-десорбирующих веществ (высокодисперсные фракции бентонита) (Иванов A.B., Низамов Р.Н., Конюхов Г.В. и др. Способ получения препарата для профилактики и лечения радиационных поражений организма: Патент РФ № 2338546 от 10.09.2006 г.; Иванов A.B., Низамов Р.Н., Конюхов Г.В. и др. Натуральная биологически активная кормовая добавка «Вита-Форце» // Патент РФ № 2324361 от 20 мая 2008 г.).

Учитывая, что разработанные в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» препараты обладают высоким радиотерапевтическим эффектом при изолированном внешнем облучении (противорадиационный иммуноглобулин, апифитопрепарат «Вита-Форце»), а минеральный сорбент (бентонит) - декорпорирующим действием было выдвинута научная идея, что сочетанное применение этих препаратов может

оказывать лечебное действие при комбинированном радиационном поражении, сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» проведены исследования по изучению лечебного действия этих препаратов при сочетанном применении их на фоне комбинированного радиационно-токсического (Фатерахманов JI.P. Комбинированное поражение животных гамма-радиацией и кадмием и применение средств терапии: Автореф. дисс...канд. биол. наук. - Казань, 2008 - 21с.), и радиационно-биологического (Гайзатуллин P.P. Иммунологические подходы к разработке средств экстраиммунной терапии при многофакторной экопатологии. Афтореф. Дисс. д-ра биол. наук - Казань, 2012 - 35с.) поражения.

При этом важным, с точки зрения создания многофункционального монопрепарата, является то, что радиотерапевтический эффект противорадиационного лечебно-профилактического иммуноглобулина усиливается при комбинации его с фито («Эра-Н», «Эраконд») - и апипрепаратами («Вита-Форце»), а сочетание его с природным сорбентом - бентонитом, придает ему совершенно иное - сорбционно-детоксикационное (декорпорирующее) свойство, усиливая не только радиотерапевтическое, но и декорпорирующее свойство (Иванов A.B. Низамов Р.Н. Конюхов Г.В. и др. Способ лечения радиационно-кадмиевого поражения и способ получения препарата для лечения радиационно-кадмиевого поражения // Патент РФ № 2484830 от 20 июня 2013 г.).

С учетом отсутствия в литературе сведений о терапии сочетанных радиационных поражений, вызванных одновременно воздействием на организм внешнего (гамма-излучение) и инкорпорированного (цезий -137) облучения и в связи с актуальностью данной проблемы и, с учетом установленной сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» принципиальной возможности конструирования полифункционального лечебно-диагностического композиционного препарата, нами были проведены настоящие исследования.

Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка технологии получения полифункционального лечебно-декорпорирующего композиционного препарата для лечения внешнего и инкорпорированного радиационного поражения организма.

Исходя из вышесказанного на решения были поставлены следующие задачи:

1 .Теоретически обосновать возможность получения композиционного лечебно-декорпорирующего препарата при сочетанном воздействии на организм внешнего (у-лучи) и инкорпорированного (цезий-13 7) облучения.

2. Изготовить сыворотку и тканевые глобулины.

3. Получить высокодисперсную фракцию природного сорбента-бентонита.

4. Изготовить композиционный сорбент на основе глобулинов и бентонита.

5. Оценить безопасность препарата «Ледеком», включая токсичность при подкожном, пероральном применении и отдаленные последствия (эмбриотоксичность, тератогенность, постнатальное развитие и др.) на лабораторных животных по принятым критериям.

6.Провести оценку иммуно-фармакологического лечебно-декорпорирующего действия препарата в т-укго и тлауо тест-системе.

Научная новизна работы

На основании изучения биологической совместимости препаратов глобулинов, апипродуктов и сорбционно-декорпорирующего агента впервые сконструирован лечебно-декорпорирующий композиционный препарат «Ледеком» (глобулин+аписоген+бентонит) для лечения поражений внешним (у-

лучи) и инкорпорированным (цезий-13 7) облучением животных; в модельных (культивируемые клетки крови и контаминированные пробы воды) и в опытах т-у1уо (лабораторные животные) установлена высокая радиотерапевтическая и декорпорирующая активности препарата как при изолированном, так и сочетанном действии на организм электромагнитного (у-лучи) и корпускулярного излучений; показано, что радио-фармакологическое действие разработанного препарата на пораженных внешним и инкорпорированным облучением животных реализуется посредством гемопротекторного, детоксицирующего, иммунопротекторного действий глобулинов, антиоксидантного и антибактериального действий апипродуктов, сорбционно-детоксикационного и декорпорирующего действий микрочастиц природного минерала - бентонита.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные указывают на фундаментальность концепции радиационной фармакологии о том, что многокомпонентные смеси на основе веществ различных классов соединений (фито-, зоо- и минерального происхождения) обладают полифункциональными свойствами, значительно расширяя спектр биологического действия отдельных компонентов радиозащитных средств. Выбранная модель конструирования лечебно-декорпорирующего препарата может быть использована для направленного поиска радиозащитных средств из различных классов и создания многофункциональных монопрепаратов.

Практическая значимость работы заключается в том, что для лечения подвергнутых сочетанному внешнему и инкорпорированному облучению животных предложено композиционное лечебно-декорпорирующее средство «Ледеком», оказывающее как радиотерапевтическое, так и декорпорирующее действие на пораженный двумя видами ионизирующего излучения на организм.

Получение и применение радиофармакологического препарата регламентируется разработанной нами нормативно-методической документацией, утвержденной в установленном порядке.

Методология и методы исследований

Методологической основой проведенных исследований являлось обоснование возможности конструирования монопрепарата, сочетающего в себе свойства отдельных компонентов, приводящих не только к аддитивному, но и потенцирующему действию составляющих его компонентов (веществ).

Методы исследований, использованные для решения поставленных задач, включали клинико-гематологические, токсикологические, биохимические, иммунологические, радиометрические и статистические.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Технология получения композитного препарата с полифункциональными свойствами.

2. Радио-фармакологическое действие препарата при изолированном воздействии внешнего и внутреннего облучения.

3. Иммуно-фармакологическое действие препарата при сочетанном двухфакторном радиационном поражении.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждена комплексными исследованиями. Акт комплексных испытаний утвержден директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Статистическая обработка, расчеты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов гематологических, биохимических и радиометрических исследований, положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументированно отражают содержание диссертации.

Материалы по теме диссертации доложены на ежегодных сессиях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по рассмотрению отчетов и НИР (Казань. 20102013), а также на Международном симпозиуме «Биохимия - основа наук о жизни», посвященном 150-летию кафедры биохимии КФУ (ноябрь, 2013 г., Казань).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Радиационная патология, вызванная ионизирующим излучением

В настоящее время атомная энергия и радиоактивные вещества находят все большее применение в самых разнообразных областях практической и научной деятельности человека. Соответственно возрастает и риск воздействия на людей различных видов ионизирующих излучений (Иванов А.Е., Куршакова H.H., Шиходыров В.В. Патологическая анатомиялучевой болезни. - М.: Медицина, 1981. - 304с.; Zweiach, В. Resistance to whole body X-irradiation in rats made tolerant to bacterial endotoxins /B.Zweiach, E.Kivy-Rosenberg, N.Nageer //Am. J. Physiol. -1959.-№6. - P. 1364-1370). Источники ионизирующих излучений рассматриваются в экологическом плане как один из существенных факторов загрязнения окружающей среды, что связано с интенсивным развитием атомной промышленности и энергетики, с широким применением меченых атомов и ионизирующих излучений в биологии медицинской и ветеринарной практике, с появлением зон повышенного фона радиации. Аварии на атомных электростанциях и их последствия особо подчеркнули необходимость проведения фундаментальных исследований по проблеме действия ионизирующих излучений на организм животных. В радиобиологии накоплен огромный экспериментальный материал, свидетельствующий о весьма высокой биологической активности ионизирующих излучений на млекопитающих. На дозы радиации, не превышающие допустимый уровень, отдельные организмы в определенных условиях реагируют усилением роста и ускорением развития (радиостимуляция, радиофизиология) (Кузин A.M. Природный радиоактивный фон и его значение для биосферы Земли. -М.: Наука, 1991. -177с.; Kindt A., Sattler E.L., Schraub А. Radiation-indiced anorexia in Syrian hamsters //Radiat. and Environ. Biophys. - 1980. -V. 18. - N 2. - P. 149-155.), однако на дозы, превышающие этот уровень, в организме возникает повреждающий эффект, обуславливая развитие лучевой болезни и гибель организма (радиопатология) (Бонд В., Флиднер И., Аршамбо Д.

Радиационная гибель млекопитающих / Пер. с англ. А.Г. Свердлова и др.-М.:Атомиздат, 1971. - 317с.). Исходя из этого, всестороннее изучение и анализ особенностей биологического действия внешних и инкорпорированных источников ионизирующей радиации на животных и человека является важнейшей задачей радиационной ветеринарии и медицины (Воккен Г.Г. Радиобиология / Учебное пособие для ветеринарных институтов и факультетов. -М.: Высшая школа, 1967. - 381с; Danied С, Brown D.V.M, Robert A., Raynolds M.S. et al. Lato Effects in Cattle Exposed to Radioactive Falout // American Journal of veterinary research, Njv. -1966.P. 1509-1514.).

2.1.1. Молекулярно-клеточные механизмы поражения организма при

внешнем облучении

Первые сведения о биологическом действии ионизирующих излучений появились после открытия Рентгеном Х-лучей и Беккерелем естественной радиоактивности. К настоящему времени определилась нозологическая единица особого заболевания - лучевая болезнь (Киршин В.А., Бобрышев К.П., Бударков В.А. и др. Радиобиологические эффекты у животных. - М.: МГАВМиБ. - 1999. -196 е.; Ярмоненко С. П. Радиобиология человека и животных. - Изд. 2-е. - М.: Высшая школа, 1988. - 424с.).

Радиационное воздействие представляет собой сочетание прямого эффекта, произведенного излучением на вещество тканей организма, с прямым, вторичным поражением различных регуляторных механизмов, реагирующих на облучение. Именно поэтому радиобиология исследует действие излучений на молекулярном, клеточном, тканевом и организменном уровнях (Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. Основы радиационной биофизики. - М.: Изд-воМГУ, 1982.- 302с.). Действие радиации на молекулярном уровне, в конечном счете сводится к поглощению энергии излучения облучаемой средой (структурные компоненты клеток -

макромолекулы, Н2О, метаболиты), приводя к возбуждению и ионизации молекул с образованием активных форм радикалов и ионов (Уланова A.M. Выявление клеточной лучевой аутоаллергии у мышей с помощью метода ингибиции миграции лимфоцитов // Радиобиология. - 1974. -Т. 14.- Вып. 1. - С.88-91.; Ainsworth, Е. Effect of microbial antigens on irradiation mortality in mice /E.Ainsworth, H.Chase //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1959. - V. 102. - P. 483-488.).

Важную роль в развитии первичного эффекта в живой ткани играют радикальные формы воды, индуцированные в результате ее радиолиза и являющиеся сильнейшими окислителями (перекись водорода - Н2О2, гидропироксид -НОг и высший пероксид - Н2О4), вступающими в необычные для клеток реакции с различными молекулами, формирующими компоненты клеточных структур (Кудряшов Ю.Б. Лучевое поражение "критических систем" // Лучевое поражение / Сб. под ред. Ю.Б. Кудряшова. - М: Изд-во МГУ, 1987. - С.5-72.). Результаты многочисленных фундаментальных последующих исследований свидетельствуют о том, что в основе поражающего эффекта ионизирующих излучений лежат совершенно иные механизмы типа цепных, самоповторяющихся реакций, ведущих к изменению структурно-функциональной организации биологической системы (Кудряшов Ю.Б., Киршин В.А., Бударков В.А. Ветеринарная противорадиационная защита. - М.: Агропромиздат, 1990. - 158с.; Squire Н.М. et. al. International Conference on Radioisotopes in Scientific Research UNESCO/NSRIC 3, 1957. - p. 143). За стадией первичного (прямого) действия радиации на клеточные структуры, радиолизом воды и аминокислот с образованием активных форм радикалов и ионов, следует стадия непрямого (опосредованного) действия облучения, длящегося от нескольких секунд до нескольких недель и месяцев (Bond V. P., Robinson С V. A mortality determinant in nonuniform exposures of the mannual. - Schweiz, med Wschz. - 1967, Sappl., - V.7. - P.265 - 275). Начальным этапом этой стадии является формирование первичных повреждений в критических структурах или "мишенях" радиационного поражения клеток

Большой фактический материал по радиочувствительности клеточных структур позволяет сделать общий вывод о главенствующей роли повреждения

ядерного аппарата, а именно критических структур хроматина. По цитологическим тестам клетку считают погибшей, если в ней обнаружены конденсация или лизис ядра, которые коррелир