Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение стабильности и сворачивания белков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ермоленко, Дмитрий Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

0 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ВКЛАД ПОВЕРХНОСТНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В

СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКА.

1.1. Взаимодействия поверхностных аминокислотных остатков, важные для стабильности 6 белка.

1.2. Поверхностные остатки и образование вторичной структуры.

1.3. Аминокислотные замены в петлях и поворотах основной цепочки.

1.4. Взаимодействие заряженных аминокислот на поверхности белка. Солевые мостики.

1.5. Гидрофобные остатки на белковой поверхности и обратный гидрофобный эффект.

ГЛАВА 2. ПОВЕРХНОСТНЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ И ФОЛДИНГ

БЕЛКОВ.

4 2.1. Сопряжение связывания и сворачивания для неструктурированных белков.

2.2. Влияние антител на сворачивание.

ГЛАВА 3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ОБЪЕКТОВ - УБИКВИТИНА И ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА.

3.1. Термодинамическая стабильность и фолдинг убиквитина.

3.2. Фолдинг пероксидазы хрена.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение стабильности и сворачивания белков"

Сворачивание белков является одной из фундаментальных проблем, находящихся на стыке молекулярной биологии, физической химии и химии полимеров. Со времени классических работ Анфинсена и сотрудников [1] известно, что аминокислотная цепочка белка сворачивается в одну уникальную пространственную структуру; иными словами, последовательность аминокислот однозначно определяет третичную структуру белка. Это значит, что гипотетически возможно предсказать пространственную структуру белка, зная его последовательность. Однако принцип соответствия между последовательностью аминокислот и пространственной структурой белка остается неизвестным. Очевидно, что поиск этой "второй половины генетического кода" и понимание механизма сворачивания очень важны не только в фундаментальном аспекте, но и как потенциальный инструмент для предсказания структуры (а значит, во многих случаях, и функции) белков, основываясь на известной последовательности ДНК. В настоящий момент, когда секвенированы геномы человека и ряда других организмов, актуальность предсказания структуры белка по последовательности ДНК (которая транслируется с помощью генетического кода в последовательность аминокислот) трудно переоценить.

Спрятанные в гидрофобном ядре остатки считаются ключевыми в фолдинге белка. Ранее предполагалось, что поверхностные остатки практически не вносят вклад в стабильность белка и не важны для сворачивания [2].

Роль взаимодействий поверхностных остатков в сворачивании и их влияние на стабильность белка только недавно привлекли внимание исследователей [3]. Установлено, что, по крайней мере, в некоторых случаях, остатки на поверхности могут вносить существенный вклад в термодинамическую стабильность бежа и участвовать в сворачивании. Мы предполагаем, что роль поверхности в стабильности и сворачивании белка была в значительной степени недооценена и требует дальнейшего изучения.

Исходя из вышеизложенного, в данной работе были поставлены следующие задачи:

1) Систематизировать литературные данные о вкладе поверхностных остатков в стабильность и сворачивание белка.

2) Охарактеризовать вклад взаимодействий поверхностных остатков в стабильность бежа на примере молекулы дрожжевого убиквитина.

3) Изучить роль белковой поверхности в сворачивании на примере влияния антител на ренатурацию пероксидазы хрена из гуанидин-гидрохлорида.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ермоленко, Дмитрий Николаевич

ВЫВОДЫ

На основании сравнения термодинамических параметров сворачивания мутантных форм дрожжевого убиквитина установлено, что поверхностные аминокислотные остатки вносят существенный вклад в стабильность белка. Так, разница в энергии Гиббса и температуре плавления между наименее и наиболее стабильными вариантами на позициях 32-34 убиквитина варьировалась от 4 до 22 кДж/моль и от 8 до 45 °С.

Сравнение эффектов аминокислотных замен на стабильность белка на конце ос-спирали убиквитина с данными, полученными для замен в середине спирали белков и пептидов, показало отсутствие достоверных различий между шкалами энергии образования а-спирали в расчете на один остаток для незаряженных аминокислот в середине и на С-конце а-спирали.

На примере остатков 33 и 34 в молекуле убиквитина установлено, что неполярные аминокислоты, частично экспонированные на белковой поверхности, существенно стабилизируют белок за счет гидрофобных взаимодействий. Показана возможность аддитивного действия множественных гидрофобных замен на поверхности.

На примере пероксидазы хрена продемонстрировано, что взаимодействие белковой поверхности с моноклональными антителами может способствовать сворачиванию бежа, увеличивая выход активного фермента при ренатурации.

Показано, что неполное восстановление каталитической активности пероксидазы при ренатурации обусловлено степенью встраивания гема в фермент. Моноклональные антитела, увеличивающие выход активного фермента при ренатурации, по-видимому, облегчают встраивание гема в неактивную форму фермента, структурно отличную от нативной конформации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя литературные данные, приведенные в предыдущих разделах, можно сделать вывод, что поверхностные остатки могут существенно влиять на стабильность белка. Несколько факторов, по-видимому, ответственны за изменения стабильности после аминокислотных замен на поверхности белка: а) разная способность аминокислот к образованию а-спирали, р-структуры и петель в белках; б) взаимодействие заряженных остатков между собой; в) образование стабилизирующих гидрофобных контактов между остатками на поверхности; г) обратный гидрофобный эффект; д) разная конформационная подвижность аминокислот в поворотах и петлях основной цепочки.

Ряд данных позволяет предположить, что эволюционными тенденциями, поддерживаемыми естественным отбором, являются оптимизация взаимодействия заряженных аминокислот [90], уменьшение структурной подвижности петель и поворотов основной цепочки [79] и образование гидрофобных контактов [124] на поверхности белка для стабилизации термофильных белков, не затрагивая гидрофобное ядро молекулы.

Большое число белков в клетке малоструктурировано в свободном состоянии и сворачивается в высокоупорядоченную структуру только во время связывания с другим

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННА 41 БИБЛИ0ТШ1 « белком, молекулой ДНК или РНК [32-34]. Таким образом, поверхностные остатки, участвующие в связывании, оказываются ключевыми для сворачивания.

Хотя в самые последние годы достигнут существенный прогресс в изучении роли поверхности белка в сворачивании, ряд вопросов остается открытым. Вклад поверхностных остатков в стабильность белка должен быть охарактеризован для значительного числа белков, прежде чем станет понятно, насколько универсальны эффекты, к настоящему времени описанные для отдельных белков, и будет полностью оценена важность белковой поверхности для сворачивания и стабильности. Неясно, какие типы взаимодействий аминокислот на белковой поверхности вносят существенный вклад в стабильность белка и в чем особенность таких взаимодействий по сравнению с со спрятанными остатками. Малоизученной остается роль поверхности в сворачивании, в частности, сопряжение сворачивания белка со связыванием с макромолекулярными лигандами.

В экспериментальной части данной работы было продолжено изучение роли поверхностных остаков в сворачивании и их вклада в термодинамическую стабильность белка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1 Материалы

Пероксидазу хрена (изофермент С, К2=А4оз/А28о=3,0) получали от компании Вюгуте, Великобритания. Концентрацию пероксидазы определяли спектрофотометрически при длине волны 403 нм, используя коэффициент экстинции, равный 1,02*105 см^М"1 [206]. В работе использовались тритон Х-100, 2-меркалтоэтанол, полиэтиленгликоль (все - Serva, США), гуанидин-гидрохлорид, 2,2'-азино-бис-3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота (АБТС), адьювант Фрейнда, р-нитрофенил фосфат, хлорид гемина, о-дианизидин, меченные щелочной фосфатазой антитела против мышиных антител (все — ICN, США), Сефадексы G-25 и G-50, цианбромид-активированная сефароза 4В (все - Amersham-Pharmacia, Швеция), метилэтилкетон (Fisher, США), прозрачные полистироловые 96-луночные планшеты (Nunc, Дания и Costar, США). Все буферные компоненты были аналитической чистоты.

4.2 Методы

4.2.1 Мутагенез и экспрессия мутантных вариантов убиквитина

Ген дрожжевого убиквитина был клонирован в плазмиду, прозводную вектора pVEX. В полученной конструкции ген убиквитина с присоединенным к С-концу гексагистидиновым тагом находился под контролем изопропил-Р-Б-тиогалактозид (ИПТГ) индуцируемого Т7 промотора. Аминокислотные замены на каждой из изучаемых в убиквитине позиций были произведены по методу, основанному на ПЦР с помощью Quick-Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, США). Наличие каждой мутации подтверждалось секвенированием с помощью дидезоксинуклеотидной терминации цепи на ДНК секвенаторе ABI PRISM 377. Экспрессию мутантных вариантов убиквитина проводили в штамме BL 21 (DE3) Escherichia coli. Плазмиду, содержащую ген мутантного убиквитина, трансформировали в клетки E.coli. Клетки наращивали в среде на триптоне и дрожжевом экстракте (2YT), содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Индукцию убиквитина производили 1 мМ ИПТГ, когда оптическая плотность культуры при 600 нм достигала 0,8. Клетки осаждали центрифугированием после 6 часов индукции и ресуспендировали в буфере, содержащем 100 мМ NaH2P04, 10 мМ Трис, 6 М мочевину, рН 8,0. Лизис производили с помощью Френч пресса. Лизат осветляли центрифугированием при 25000 g течение часа при 4°С. Супернатант наносили на Ni-NTA аффинную колонку (Novogene, США). Связавшийся убиквитин элюировали с понижением рН буфера до 4,5. Белок диализовали, лиофилизировали, растворяли в 5% уксусной кислоте и наносили на колонку с сефадексом G-50 (2,5*120 см), уравновешенную 5% уксусной кислотой. Фракции, содержащие убиквитин, собирали и лиофилизировали. Гомогенность белка проверяли SDS-электрофорезом в трициновой системе [229].

4.2.2 Измерение термодинамической стабильности вариантов убиквитина с помощью микрокалориметрии

Калориметрические эксперименты производили с помощью калориметра VP-DSC (MicroCal, Northampton, США) согласно [230]. Белок в концентрации 1,8-3,0 мг/мл диализовали против 30 мМ глицинового буфера, рН 2,0-3,5. Концентрацию убиквитина определяли спектрофотометрически, исходя из оптической плотности Агво^ДЗб для раствора белка 1 мг/мл. Все эксперименты проводили при скорости сканирования 1,5 °С в минуту. Обратимость тепловой денатурации проверяли повторным сканированием. Для всех вариантов убиквитина обратимость была выше 90%. Калориметрические данные анализировали, используя программу NLREG (Phillip Н. Sherrod, Нешвилл, США, http://www.sandh.com/sherrod). Сворачивание убиквитина рассматривалось как переход первого рода, при котором детектируются только два состояния - развернутое и нативное [230]. Экспериментально измеренная кажущаяся теплоемкость пересчитывалась в парциальную молярную теплоемкость, как это описано [230, 231].

Далее в тексте диссертации преведеиы значения только парциальной молярной теплоемкости.

Максимум калориметрической кривой приблизительно соответствует температуре плавления белка Тт, при которой 50% белка развернуто, а 50% находится в нативной конформации. Точным же значением температуры плавления или температуры перехода является таковое, при котором площадь под калориметрической кривой слева от Тт равна площади под кривой справа от Тт. Площадь под калориметрической кривой равна непосредственно измеренной в эксперименте энтальпии сворачивания ДНсаь Каждая калориметрическая кривая приближалась с помощью моделей двух состояний с энтальпией разворачивания (ДНы), изменением теплоемкости разворачивания (ДСр) и температурой плавления (Тт) как независимыми параметрами. Термодинамические параметры сворачивания вычислялись в соответствии со следующими уравнениями:

AHcal(T) = АН(Тт) + АСр (Т-Тт) (1)

AS(T) = AS(Tm) + ACp-dln(T/Tm) = ^^ + ACp-d\n(T/Tm) (2)

AG(T) = (Tm-Т)-(АНса1(Тт)/Тт-АСр)-ТАСр -ЩТ/Тт) (3) где AS(í) и AG(í) - функции энтропии и свободной энергии Гиббса.

Все приведенные ниже термодинамические параметры вычислены для «стандартных условий» — рН 3,0,65 °С. Выбранная температура минимизирует ошибку вычислений, так как она является близкой к средней температуре плавления большинства вариантов убиквитина. Для модифицированного дикого типа убиквитина (см. раздел Результаты и Обсуждение) значение ДСр было равно 2,9 кДж/моль*К.

4.2.3 Измерение спектров кругового дихроизма (КД)

Структурные изменил в различных вариантах убиквитина, а также рефолдинг пероксидазы хрена после денатурации в гуанидин-гидрохлориде изучали с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Все спектры снимали с помощью Jasco-715 спектрофотометра (Jasco Corporation, Япония) с использованием 1 см (ренатурированная пероксидаза) и 1 мм (убиквитин, нативная пероксидаза) кварцевых кювет. Концентрация нативной пероксидазы была 2,5 Ц.М, ренатурированной и развернутой пероксидазы, а также убиквитина - 1 JJ.M. Измеренное значение эллиптичности, ©, конвертировалось в эллиптичность на один аминокислотный остаток, [©], в соответствии с формулой: = —:---(4)

1-е где / - длина оптического пути кюветы, с - концентрация белка в мг/мл, MWR -средняя масса аминокислоты в белке, равная 114,6 для убиквитина с гистидиновым тагом и 110,1 для пероксидазы.

4.2.4 Получение и очистка моиоклональных антител против пероксидазы хрена

Моноклональные антитела против пероксидазы хрена получали по стандартной процедуре [232, 233]. Мышей линии BALB/c иммунизировали нативной пероксидазой, после четырех иммунизаций клетки селезенки сливали с клетками миеломы линии Sp2/0 и отбирали клоны, секретирующие специфические антитела. Иммуноглобулин G преципитировали в 40% сульфате аммония и осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 15 минут. Осадок растворяли в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 100 мМ хлорида натрия, (PBS) и диализовали против того же буфера. Дальнейшую очистку проводили на аффинной колонке — цианбромид-сефароза, модифицированная нативной пероксидазой хрена и уравновешенная PBS с 0,05% Тритона Х-100 (PBST). Неспецифически связавшиеся компоненты удаляли промывкой колонки PBST, антитела элюировали натрий-цитратным буфером, рН 2,7, содержащим 0,5 М хлорида натрия. Очищенные антитела обессоливали с помощью хроматографии на сефадексе G-25, уравновешенном PBS, и хранили при -20°С. Гомогенность полученного белка была подтверждена с помощью SDS-электрофореза по Леммли [234].

4.2.5 Денатурация и ренатурация пероксидазы хрена

Пероксидазу хрена (изофермент С) денатурировали в PBS, содержащем 6 М гуанидин-гидрохлорид (Гуан-HCl), в течение ночи при комнатной температуре при концентрации белка 4-40 цМ. Ренатурацию инициировали 40 или 100-кратным разведением препарата в буфере PBS или в 125 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, в присутствии антител или без них.

4.2.6 Измерение каталитической активности пероксидазы

Образцы ренатурированной или нативной пероксидазы в 8-12 разведениях инкубировали с субстратом в течение 15 минут при комнатой температуре в 96-луночном планшете. Субстратом для реакции служили 0,5 мМ о-дианизидин + 1 мМ пероксид водорода в PBS или 0,35 мМ АБТС +1,4 мМ пероксид водорода в 62,5 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5. Оптическую плостность продукта реакции измеряли при 450 нм в случае о-дианизидина или 405 нм в случае АБТС с помощью вертикального фотометра Multiscan EX (Labsystem, Финляндия). Оптическую плотность для разведений одного образца пероксидазы анализировали как функцию концентрации фермента; угол наклона полученной прямой использовали как характеристику относительной активности пероксидазы в образце.

4.2.7 Конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ

В 96-луночном планшете инкубировали в течение 16 часов при 4°С 100 мкл раствора пероксидазы в концентрации 4 мкг/мл в каждой лунке, после чего планшет промывали РВвТ. Нативную или ренатурированную пероксидазу в концентрации 0,1100 нМ добавляли в лунки планшета и инкубировали в присутствии моноклональных антител (2,5 мкг/мл в РВБТ) в течение часа при 37°С. После этого планшет снова промывали РВвТ. Раствор в РВБТ антител против иммуноглобулинов мыши, меченных щелочной фосфатазой, добавляли во все лунки планшета, который затем инкубировали 1 час при 37°С. Далее планшет отмывали РВБТ и детектировали количество связанной ферментативной метки с помощью раствора р-нитрофенил фосфата в концентрации 1 мг/мл в Трис-НС1 буфере, рН 9,5, содержащем 1 мМ сульфата магния. Оптическую плотность продукта реакции измеряли с помощью вертикального фотометра МиШвсап ЕХ.

4.2.8 Титрование апо-пероксидазы гемом

Апо-пероксидазу получали из холо-фермента путем частичной денатурации при рН 2,5 и последующей экстракции гема с помощью метилэтилкетона, как описано в [235]. Затем апо-фермент диализовали против РВв. Концентрацию апо-пероксидазы определяли спектрофотометрически при 280 нм, используя коэффициент экстинции 13450 см^М"1, вычисленный по аминокислотной последовательности [236]. Стоковой раствор гемина (1-5 мМ) готовили в 0,1 М гидроксиде натрия. Концентрацию гемина определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинции при 385 нм, равный 58400 слГ'М"1 [131]. Разведения гема до конечных концентраций 0,01-20 цМ готовили в PBS или 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 100 мМ цианида натрия. Ко всем разведениям добавляли апо-фермент до конечной концентрации белка 0,3 или 1,0 цМ. Образцы инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, после чего измеряли каталитическую активность образованого холо-фермента (только для опытов в PBS) и интенсивность триптофановой флуоресценции.

Измерение активности проводили, как описано выше. Отношения количества образованного холо-фермента к общему количеству белка вычисляли как процент максимальной активности, предполагая, что максимум активности достигался при стопроцентном образовании холо-фермента.

Измерения флуоресценции производили с помощью флуориметра FluoroMax с программным обеспечением DM3000F (SPEX Industries, США). Интенсивность триптофановой флуоресценции измеряли в 1 см кювете, возбуждение флуоресценции производили при 295 нм, эмиссию регистрировали при 340 нм. Для каждого образца производили двадцать пять независимых измерений, после чего определяли среднее значение интесивности флуоресценции и вычитали из него интесивность флуоресценции буфера в присутствии соответствующего количества гема. Отношение количества образовавшегося холофермента к общей концентрации белка вычисляли, используя формулу:

Доля холофермента = 1 - Шо (5) где I - интенсивность флуоресценции образца, 1о - интенсивность флуоресценции в отсутствие гема.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 5. ЭФФЕКТ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН НА ПОВЕРХНОСТИ УБИКВИТИНА НА СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКА

5.1 Экспериментальная стратегия исследования вклада поверхностных остатков в стабильность убиквитина

На основании приведенных в обзоре литературы соображений в качестве модельного объекта для исследования вклада поверхностных остатков в стабильность белка был выбран дрожжевой убиквитин. Мы выбрали три остатка, расположенных друг за другом на поверхности убиквитина: аспарагиновая кислота в позиции 32, лизин в позиции 33 и глутаминовая кислота в позиции 34. На каждой из этих позиций был сделан ряд аминокислотных замен с помощью сайт-направленного мутагенеза: на позиции 32 - 11 замен (А, F, G, I, L, М, N, Q, S, Т, V); на позиции 33 -12 замен (А, Е, F, G, I, L, М, N, Q, S, Т, V); на позиции 34-19 замен (все природные аминокислоты). Изученный набор охватывает практически весь спектр различий между остатками в химической природе, геометрии и размере боковой цепи, а также способности образовывать а-спираль. Рекомбинантные белки были экспрессированы в клетках E.coli; термодинамическую стабильность различных вариантов убиквитина измеряли методом дифференциальнойой сканирующей калориметрии. Бели выбранные поверхностные остатки влияют на термодинамическую стабильность белка, то эта характеристика должна существенно изменяться в результате аминокислотных замен. Мы также искали корреляцию между наблюдаемыми изменениями в стабильности и свойствами аминокислот для того, чтобы выявить, какие факторы и какие типы взаимодействий влияют на термодинамическую стабильность белка для каждой из изучаемых позиций.

Рассмотрим особенности позиций на поверхности убиквитина, выбранных для аминокислотных замен. Аспарагиновая кислота 32 находится на экспонированной в воду стороне С-конца единственной а-спирали убиквитина (рис. 6), боковая цепочка остатка на позиции 32 полностью доступна для растворителя в соответствии с проведенными вычислениями с использованием программы ИАССЕББ [237] на основании известной кристаллической структуры убиквитина Лизин 33 является последним остатком а-спирали убиквитина. Этот остаток, как и аспарагиновая кислота 32, расположен на поверхности убиквитина (рис. 6), однако только 50% поверхности его боковой цепочки доступно для растворителя. Наконец, глутаминовая кислота 34 является первым промежуточным остатком между а-спиралью и следующим за ней поворотом основной цепочки (см. рис. 6). Для растворителя доступно только 30% поверхности боковой цепочки глутаминовой кислоты 34. Таким образом, три позиции, выбранные в убиквитине, охватывают широкий спектр экспонированности поверхностных остатков: от полностью экспонированного остатка 32 до спрятанного на 70% остатка 34. Это позволяет ответить на вопрос, как изменение в степени экспонированности остатка влияет на его вклад в стабильность белка.

Вклад взаимодействий между заряженными аминокислотами в стабильность белка был детально охарактеризован на примере убиквитина ранее [22,25,201]. Основываясь на этих исследованиях, можно было предположить, что локальные взаимодействия положительно заряженного лизина 33 и отрицательно заряженных аспарагиновой и глутаминовой кислот 32 и 34 могут существенно влиять на стабильность убиквитина. Кроме того, глутаминовая кислота 34 образует солевой мостик с лизином 11. На основании сравнительного анализа стабильности мутантных вариантов убиквитина было показано, что данный солевой мостик стабилизирует белок на 3,6 кДж/моль [114]. Также было обнаружено, что лизин невыгодно взаимодействует с остальными заряженными остатками убиквитина на обеих позициях 11 и 34, тогда как глутаминовая кислота выгодно взаимодействует с остальными заряженными аминокислотами также на обеих позициях [114].

Рис. б. Позиции на поверхности убиквитина, выбранные для аминокислотных замен (выделены зеленым цветом). Слева - схематичная структура убиквитина ф-слои обозначены стрелками, а-спираль -цилиндром), справа - изображение его поверхности. Сверху вниз: аспарагиновая кислота 32, лизин 33 и глутаминовая кислота 34.

Влияют ли на стабильность белка другие типы взаимодействий на выбранных позициях, помимо взаимодействия зарядов? Чтобы ответить на этот вопрос, был получен вариант убиквитина, в котором вклад локальных взаимодействий зарядов был минимизирован. В качестве белка дикого типа для всех мутаций на позициях 32, 33 и 34 мы использовали вариант, названный WTAAA, в котором вместо последовательности с солевым мостиком между глутаминовой кислотой 34 и лизином 11

Lysl 1 .ПеЗО - Gln31 - Asp32 - Lys33 - Glu34 - Gly35.

II была создана последовательность

Alai 1 .ПеЗО - Gln31 - Ala32 - А1аЗЗ - А1а34 - Gly35 -.

Таким образом, в варианте WTAAA отсутствует солевой мостик и взаимодействия между заряженными аминокислотами вблизи выбранных для замен позиций. Вариант ^угрААА 0Казался стабильнее убиквитина дикого типа на 4 кДж/моль. Структура варианта WTAAA была исследована с помощью ЯМР спектроскопии совместно с группой Анжелы Гроненборн (Angela Gronenborn, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). Расположение резонансов амидных групп у меченных изотопом N15 убиквитина дикого типа и белка варианта WT4^ полностью совпадают. Это позволяет сделать вывод о практически полной идентичности структур данных белков. В последующих экспериментах стабильность всех мутантных вариантов убиквитина для позиций 32,33 и 34 сравнивалась со стабильностью варианта WTAAA.

Термодинамическую стабильность убиквитина анализировали с помощью тепловой денатурации. За плавлением белка следили, измеряя изменения в теплоемкости белка посредством калориметра. Калориметрия является уникальным методом, позволяющим непосредственно определять основные термодинамические параметры сворачивания [230]. Типичные калориметрические кривые представлены на рис. 3; их анализ, описанный в главе Материалы и Методы, позволяет вычислять термодинамические параметры сворачивания, такие как энергия Гиббса (АО), энтальпия (ДН), энтропия (ДБ) и теплоемкость (ДСр).

45

40

Ц

О

35

5 30 л г* о о 25

20 ф о с; с ф 15

I-

10 -I

20 40 60 80 100 120 Температура, °С

Рис. 3. Калориметрические кривые для нескольких рекомбинантных вариантов убиквитина с мутациями на позиции 34, измеренные при рН 3,0. Замены обозначены однобуквенным кодом для аминокислот над максимумом каждой из кривых.

Все измерения производились при нескольких значениях рН. На рис. 4 можно видеть, как с понижением рН стабильность белка уменьшается. Так как для большинства мутаций характер зависимости стабильности белка от рН не изменяется, калориметрия убиквитина при нескольких рН позволяет проверить воспроизводимость разницы в стабильности между мутантными вариантами. Из экспериментов при различных рН можно вычислить величину стандартного отклонения для величины АЛО, поскольку последняя не зависит от рН. Кроме того, становится возможным построение прямой зависимости энтальпии от температуры плавления (рис. 5), угол наклона которой равен АСр сворачивания. Все сделанные в работе мутации не меняли теплоемкости разворачивания, АСр, равнявшейся 2,9 кДж/моль*К.

Эффект аминокислотных замен в позициях 32, 33 и 34 на структуру убиквитина анализировался с помощью КД-спектроскопии в дальнем ультрафиолете, позволяющей следить за изменениями во вторичной структуре белка. Во всех случаях, кроме одного варианта для позиции 34 (см. ниже), изменений в спектрах КД отмечено не было. Это хорошо согласуется с большим числом литературных данных, свидетельствующих о том, что одиночная аминокислотная замена, в особенности локализованная на его поверхности, крайне редко ведет к изменениям в структуре белка, [2,238,239].

35

10

0 20 40 60 80 100 120 температура, °С

Рис. 4. Калориметрические кривые для варианта убиквитина ЛЛГГААА при нескольких значениях рН: синяя кривая соответствует рН 3,25, желтая - 3,0, зеленая - 2,75, красная - 2,5, черная - 2,25.

Тт, °С

Рис. 5. Зависимость энтальпии от температуры плавления для варианта убиквитина ^ЧУТ4**.

5.2 Вклад разной способности аминокислот образовывать а-спираль в стабильность убиквитина

С помощью генной инженерии были созданы И вариантов убиквитина с различными аминокислотами на позиции 32 (А, Б, в, I, Ь, М, Ы, (}, Б, Т, V) . Эффект аминокислотных замен на стабильность убиквитина представлен в таблице 1. Термодинамические параметры сворачивания представляют собой разницу между нативным и развернутым состояниями белка в энергии Гиббса, энтальпии, энтропии и теплоемкости. Для удобства во всех таблицах и рисунках фигурируют параметры разворачивания, которые являются положительными величинами. Термодинамическая стабильность белка характеризуется свободной энергией сворачивания (AG), чем больше ее абсолютное значение - тем стабильнее белок. Разница в стабильности между различными мутантными вариантами убиквитина и белком дикого типа (или вариантом, принятым условно за белок дикого типа) соответствует величине AAG. Температура плавления характеризует температурную стабильность белка. Изменения в свободной энергии разворачивания в результате мутации вычислялись относительно варианта с аланином на позиции 32 по следующим причинам: аланин является исходной аминокислотой в «модифицированном» убиквитине дикого типа WT*** (см. выше). Кроме того, поскольку позиция 32 расположена на конце а-спирали, сравнение с наиболее стабилизирующей а-спираль аминокислотой, аланином (Расе and Scholtz 1998), дает информацию о вкладе разной способности аминокислот образовывать а-спираль в стабильность белка на данной позиции. Как видно из таблицы 1, аминокислотные замены на поверхности убиквитина в позиции 32 ведут к существенным изменениям в стабильности белка. Самыми стабильными вариантами являются аланин и глутамин, наименее стабильным из числа выбранных аминокислот — наихудший остаток для формирования спирали после пролина, глицин. Разница между этими вариантами весьма значительна — больше семи градусов в температуре плавления и около 4,5 кДж/моль в терминах свободной энергии сворачивания.

Таким образом, остатки в экспонированной на поверхности убиквитина позиции 32 влияют на стабильность белка. Поскольку позиция 32 расположена на конце ос-спирали, можно предполагать, что хорошо известная разная способность аминокислот образовывать а-спираль ответственна за изменения в стабильности убиквитина в результате аминокислотных замен. Действительно, увеличение стабильности в ряду вариантов от глицина к аланину (G<N<T<F<S<V<I<L<M<A<Q) хорошо соотвествует известным шкалам энергии спиралеобразования [41]. Едиственным исключением явлется вариант с глутамином, который практически так же стабилен, как и аланиновый вариант (см. табл.1). Глутамин имеет более низкую способность образовывать спираль, чем аланин [41]. Чем может обусловлена высокая стабильность глутаминового варианта? В а-спирали убиквитина позиция 28, которая находится в положении / - 4 по отношению к глутамину 32, занята остаком серина. Серин 28 расположен на экспонированной в раствор поверхности а-спирали и соседствует с глутамином 32, что делает возможным взаимодействие между боковыми цепочками этих остатков. Чтобы исследовать энергию взаимодействия между серином 28 и глутамином 32, была измерена стабильность вариантов с аланином и глутамином в позиции 32 в контексте замены серина 28 на аланин. Вариант 32<3/28А оказался на 0,4 кДж/моль менее стабильным по сравнению с вариантом 32А/28А. Это свидетельствует о выгодном взаимодействии между 32(3 и 28Б, вклад которого делает вариант 32(^/288 таким же стабильным, как и вариант 32А/288 (см. табл.1). Значение ДАв, равное -0,4 кДж/моль для варианта 32<3, использовалось для дальнейшего анализа.

Экспериментально определенные изменения стабильности в результате аминокислотных замен на предпоследней позиции в а-спирали убиквитина (позиции 32) очень хорошо коррелируют со шкалой энергии образования а-спирали (рис. 7). Это позволяет сделать вывод о том, что изменения стабильности в результате аминокислотных замен на позиции 32 определяет разная тенденция аминокислот образовывать а-спираль.

Аминокислотный остаток ДАв,

А 66,8 0±0,2

66,6 0,1± 0,1

• (66,1)* (-0,4±0,2)*

М 65,9 -0,4±0,1 ь 65,5 -0,6±0,2

I 65,3 -0,9±0,1

V 63,7 -1,7±0,4

63,2 -2,0±0,1

Р 62,7 -2,4±0,4 т 62,2 -2,5±0,1

N 61,9 -2,8±0,1 в 58,9 -4,3±0,4